KR20210110818A - Rank 길항제 및 이에 대한 용도 - Google Patents

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빌 두갈
엘리자베스 아헌
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더 카운실 오브 더 퀸즐랜드 인스티튜트 오브 메디컬 리서치
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Abstract

본 발명은 NF-κB의 수용체 활성화제(RANK)의 하나 이상의 기능을 길항하는 항원-결합 분자 및 이의 제조방법 및 용도를 기재하고 있다. RANK 리간드(RANKL)/RANK 시그널링 경로의 활성화와 관련된 상태의 발병을 치료 또는 억제하기 위해, 면역을 자극 또는 증가시키기 위해, 종양에 대한 면역억제 또는 내성의 발생 또는 진행을 억제하기 위해, 또는 암의 발병, 진행 또는 재발을 억제하기 위해 조성물 및 방법에서 이들 길항제 항원-결합 분자를 사용하는 적용이 또한 기재되어 있다.

Description

RANK 길항제 및 이에 대한 용도
본 출원은 2018년 12월 5일에 출원된 "길항제 및 이에 대한 용도"라는 제목의 미국 가출원 제62/775,803호에 우선권을 주장하며, 그 내용은 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 발명은 일반적으로 길항제 항원-결합 분자에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 NF-κB 수용체 활성화제(RANK)의 하나 이상의 기능을 길항하는 항원-결합 분자 및 이의 제조방법 및 용도에 관한 것이다. 특정 실시 양태에서, 길항제 항원-결합 분자는 단독으로 또는 다른 제제와 함께, RANK 리간드(RANKL)/RANK 시그널링 경로의 활성화와 관련된 상태의 발병을 치료 또는 억제하기 위해, 면역을 자극 또는 증가시키기 위해, 종양에 대한 면역억제 또는 내성의 발생 또는 진행을 억제하기 위해, 또는 암의 발병, 진행 또는 재발을 억제하기 위해서 사용한다.
RANK 및 RANKL은 각각 종양 괴사 인자 수용체 및 리간드 수퍼패밀리의 멤버로서 CD40 및 CD40L에 가장 가까운 상동성을 갖는다. RANK (TNFRSF11a) 및 RANKL (TNFSF11)은 현재 뼈 항상성에 있어서 이들의 역할에 대해 임상 실험에서 가장 잘 공지되어 있으며, 단핵구-대식세포 계통에서 파골세포를 분화하려면 골수성 파골세포 전구체에서 발현된 RANK와 RANKL의 상호 작용이 필요하다(참조문헌: Dougall 외, 1999. Genes Dev. 13(18):2412-2424; Kong 외, 1999. Nature 397(6717):315-323). 그러나 RANKL은 처음에는 활성화된 T 세포에 의해 상향 조절되고 세포 자멸을 방지하기 위해 성숙한 수지상 세포 (DC) 표면에서 RANK와 상호 작용하는 수지상 세포-특이적인 생존 인자로 확인되었다(Anderson 외, 1997. Nature 390:175-179; Wong 외, 1997. J. Exp. Med. 186(12):2075-2080). 완전 인간형 IgG2 항-RANKL 항체(데노수맙: denosumab)는 뼈 전이로 인해 발생하는 골격-관련된 이벤트를 예방하고 뼈의 거대 세포 종양 및 골다공증을 관리하기 위한 강력하면서도 상당히 내성이 좋은 항-골흡수제로서 임상 실험에서 널리 사용된다(Branstetter 외, 2012. Clin. Cancer Research 18(16):4415-4424; Fizazi 외, 2011. Lancet (London, England) 377(9768):813-822).
RANK 단백질은 다양한 TNF 수용체 관련 인자(TRAF)와 상호 작용함으로써 세포 내 이벤트를 개시한다 (참조 문헌: Galibert 외, 1998 J Biol Chem 273(51):34120-27) RANKL과의 상호 작용과 같은 RANK의 유발은 RANK의 다중화로 이어져 RANK의 세포질 도메인에 TRAF를 동원하고 TRAF-매개 세포내 이벤트를 활성화하여 NF-κB를 포함한 전사 인자를 상향 조절하는 결과를 가져온다(참조 문헌: Anderson 외, 1997, 상기 참조). RANK/RANKL 상호 작용에 의해 매개되는 신호는 골 흡수(bone resorption)를 담당하는 세포인 파골세포의 분화 및 기능을 자극하는데 관여한다(참조문헌, 예를 들어, Lacey 외, 1998. Cell 93:165-7; Yasuda 외, 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3597-3602).
RANKL은 파골세포 분화, 활성, 및 생존의 자극을 통한 골전이, 다발성 골수종, 류마티스 관절염, 마모 파편-유도된 골 용해, 글루코코르티코이드-유도된 골다공증, 호르몬 결핍 요법으로 인한 골감소증, 골 거대 세포종(GCTB) 및 폐경기후 골다공증(PMO)에 있어서 병리학적 골 파괴의 핵심 매개체이다(Lacey 외, 1998. Cell 93, 165-176; Boyce and Xing,2008. Arch. Biochem. Biophys. 473:139-146). 뼈 항상성이 RANKL-RANK 신호에 의해 결정적으로 조절된다는 인식은 다른 RANKL 억제제에 비해 강력한 RANKL-중화 활성 및 우수한 약리학적 특성을 가진 완전-인간 IgG2 단일 클론 항체(MAb)인 데노수맙의 개발을 촉발시켰다(Lacey 외, 2012. Nat. Rev. Drug Discov. 11:401-419).데노수맙의 효능은 이후 이러한 질병 환경에서 입증되었으며 골수 계통에 속하는 RANK-발현 전구체를 골-흡수 파골세포로 분화 및 기능적 자극하는데 있어서 RANKL의 절대역할과 관련이 있다(Dougall 외, 1999, 상기 참조).
최근 RANK/RANKL 시스템은 BRCA1-돌연변이 관련 유방암과 호르몬-수용체 음성 및 삼중 음성(ER-, PR-, HER2-) 유방암(Gonzalez-Suarez 외, 2010. Nature 468(7320):103-107; Nolan 외, 2016. Nat Med 22(8):933-939; Widschwendter 외, 2015, EBioMedicine 2(10):1331-1339; Pfitzner 외, 2014, Breast Cancer Res Treat. 145(2):307-315; Palafox 외, 2012. Cancer Res. 72(11):2879-2888; Reyes 외, 2017, Breast Cancer Res Treat. 164(1):57-67; Blake 외, 2014. Clin Exp Metastasis 31(2):233-245; Yoldi 외, 2016, Cancer Res. 76(19):5857-5869)을 포함하는 유방암, 전립선 암(Ohtaka 외, 2017. Int J Surg Case Rep. 30 : 106-107; Li 외, 2014. Oncol Rep. 32 (6) : 2605-2611), KRAS 돌연변이 또는 KRAS 및 LKB1 돌연변이 서브타입을 포함한 비-소세포 폐암(NSCLC) (Branstetter 외, 2013, Abstract World Conference on Lung Cancer; Rao 외, 2017. Genes Dev. 31, 2099-2112; Faget 외, 2017, J. Thorac. Oncol. 13, 387-398) 및 투명 세포 RCC(ccRCC)를 포함한 신 세포 암종(RCC)(Steven 외, 2018. Urol Oncol. 36, 502.e15-502)과 같은 특정 암의 기원 및 진행에 기능적으로 중요한 것으로 밝혀졌다. 이에 따라, 이러한 암을 치료하기 위해 RANK/RANKL 활성을 차단하는 치료 전략이 제안되었다.
치료학적 치료제로서 RANKL/RANK 길항제를 개발하기 위해 다양한 전략이 사용되어왔다. 예를 들어, 문헌(Lacey 외, 2012, 상기 참조)에서 검토된 바와 같이 RANKL/RANK 길항제 및 책임으로서 다른 효능 또는 부작용 프로필을 나타내는 여러 가지 상이한 디코이 수용체가 개발되었다. 한 유형의 디코이 수용체에는 인간 IgG Fc(RANK-Fc)에 융합된 RANK 세포외 도메인 (ECD)을 포괄하는 키메라 단백질이 포함되어 있었다. 이 분자는 전임상 모델에서 유망한 효능을 보였지만, 인간이 아닌 영장류에서 인간 RANK-Fc를 반복적으로 투여한 후, RANK에 반하는 자가 항체 역가가 활성화되어 고칼슘 혈증을 유발하는 것으로 밝혀졌다(Lacey 외, 2012, 상기 참조). 천연 전장 오스테오프로테게린(osteoprotegerin: OPG)이 RANKL의 효과적인 결합제 및 억제제로 입증되었지만, 치료제를 개발하기 위해서는 동물에서 이러한 분자의 약동학 및 생물활성을 개선하기 위해 수백 가지 재조합 변이체에 대한 테스트가 요구되었다. 아미노 말단에서 인간 면역글로불린 G1(IgG1) Fc 영역(Fc-OPG)에 융합된 인간 OPG의 아미노산 잔기 22-194번을 포함하는 재조합 단백질이 제1상 임상 시험에서 테스트되었고 골 턴오버 마커(bone turnover marker)에서 급격한 용량-관련 감소를 입증하였으며, 이는 Fc-OPG가 인간에서 RANKL/RANK 길항제임을 나타낸다. RANKL/RANK 길항제를 개선하기 위해, 인간 OPG의 22-194번 잔기가 카복실 말단에서 포유류 세포 숙주(중국 햄스터 난소 세포)에서 발현된 인간 IgG1 Fc에 융합된 대체 OPG-Fc(AMGN-0007)는 Fc-OPG에 비해 약 10배 더 긴 반감기와 3 내지 10배 더 높은 효능을 갖는 것으로 입증되었다(Lacey 외, 2012, 상기 참조).
그러나 데노수맙을, 턱뼈 괴사(ONJ), 피부 발진, 저 칼슘 혈증 또는 신장 독성과 같은 부작용의 위험을 포함하여 치료법으로 적용하는데에는 중요한 한계가 남아있다[프롤리아(Prolia) 패키지 삽입물, 엑스지바(Xgeva) 패키지 삽입물). 또한, 심각한 감염, 피부 이상 반응 또는 비정형 골절(후자는 '동결된 뼈'로 인해 파골세포 골 재형성을 완전히 억제하면 미세 골절과 취약골이 축적으로 이어지는 과정)은 데노수맙을 사용한 RANKL 억제의 각각의 독성 결과이다(Schwarz 및 Ritchlin, 2007. Res Ther. 9 Suppl 1:S7; 프롤리아 패키지 삽입물; 엑스지바 패키지 삽입물). RANKL/RANK 길항제의 효능 및/또는 안전성은 적절한 조직/세포 구획에 선택적으로 표적화함으로써 개선될 수 있다. 예를 들어, 뼈, 유방, 종양 또는 종양 미세환경에 대한 RANK/RANKL 길항제의 분포를 증가시키면 더 큰 효능을 달성하고 동시에 전신 노출 및 관련 독성을 감소시킬 수 있다. 따라서 RANKL/RANK 길항제의 개발을 위한 대안적인 전략은 향상된 효능과 안전성을 제공할 수 있다.
인간 RANKL로 IgG2 XenoMouse 균주를 면역화하면 AMG 162(a/k/a 데노수맙)의 동정으로 이어졌는데, 이는 높은 친화도를 가지며, 중요하게는 평형 결합에서 RANKL에 대한 느린 결합 오프 속도를 나타낸다(Lacey 외, 2012, 상기 참조). 결정적으로, AMG 162/데노수맙을 이용한 RANKL 활성의 억제는 세포-기반 파골세포 형성 검정에서 입증되었다. 데노수맙은 재조합 OPG 형태에 비해 인간 RANKL에 대해 다소 낮은 친화성을 가졌으나, 이러한 친화성의 차이는 생체 내에서 데노수맙의 상당히 더 긴 순환 반감기에 의해 보상된 것 이상으로서 상당한 효능을 제공한다.
개발되어온 다른 항-RANKL 항체는 ALX-0141로 명명된 카밀리드(Camillidae: 파리과)에서 유래된 중쇄 전용(VHH) 항체 형태를 포함한다(Van de Wetering de Rooij 외, 2011. Ann. Rheum. Dis. 70(3):136; 및 WO제2012163887호에 기재되어 있음). 이 항-RANKL 항체는 폐경 후 환자를 대상으로 한 1상 시험에서 평가되었으며, 골 흡수 마커에 대한 강력하고 지속적인 억제 효과를 나타낸다. 또한, ALX-0141은 내약성이 우수하여 다양한 범위의 용량으로 안전하게 투여할 수 있다.
다른 항-RANKL 항체 또는 항체 유도체는 인간 Fab 박테리오파지 라이브러리로부터 유래된 Fabs "AT", "Y", "P" 및 "S"를 포함한다(유럽 특허 제1257648호). 항-RANKL Fabs "AT", "Y", "P"는 세포-기반 파골세포 검정을 사용하여 RANKL/RANK를 길항하는 것으로 입증되었다. 다른 항-RANKL 항체는, 항원으로서 대장균 또는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에서 유래된 정제된 재조합 RANKL로 HuMab 트랜스제닉 마우스 균주 HCo7, HCo12 및 HCo7+HCo12를 면역화 시킴으로써 생성된 16El, 2D8, 2E11, 18B2, 22B3, 또는 9H7를 포함한다(미국 특허 제8,455,629호). 또한, 항-RANKL 항체는 세포-기반 파골세포 검정을 사용하여 RANKL/RANK를 길항하는 것으로 입증된 XPA12.004, XPA12.020, XPA12.039, XPA12.041 및 XPA12.042를 포함한다(WO제2011017294호).
RANKL/RANK 길항제에 대한 다른 전략으로는 RANKL을 표적화하는 제형화된 siRNA를 포함하는데, 이는 종양-관련 골 용해 치료에서 유망한 결과를 입증하였다(Rousseau 외, 2011. J Bone Miner Res. 26(10):2452-2462).
또 다른 치료적 대안은, RANK와 RANKL 상호 작용을 차단하거나 RANK의 형태를 변경하여 활성 및 후속 생화학적 신호 전달을 감소시키는 억제 펩타이드, 단백질-단백질 상호 작용의 펩타이드 모방체 또는 항체를 사용하는 것이다. 예를 들어, 합리적으로 설계된 OPG("수용체") 또는 RANKL("리간드")의 소분자 모방체를 시험관 내 파골세포 형성 검정에서 테스트하였다(Cheng 외, 2004. J Biol Chem. 2004;279(9):8269-8277). 흥미롭게도, OPG에서 설계된 펩타이드는 RANKL에서 설계된 것보다 더 큰 억제 효과를 나타내는데, 이는 수용체-유래 모방체가 리간드 모방체와는 다르게 수용체에 결합하는 리간드를 차단함을 시사한다. 하나의 OPG 모방체(OP3-4)는 RANKL 및 RANK에 결합하고, RANK에 대한 RANKL 결합을 감소시키고, 시험관내 및 생체 내 파골세포 형성을 억제하여 RANKL/RANK 길항제로서 작용하는 것으로 나타났다. 이러한 길항 작용에 대한 하나의 잠재적 메커니즘은 RANK/RANKL 수용체 복합체의 변경을 통한 것으로, OP3-4는 수용체 배향을 변경하거나 "스페이서" 역할을 수행하여 세포질 도메인 상호 작용을 방지함으로써 결함있는 복합체를 매개하여 다운스트림 시그널링을 감소시킬 수 있다.
RANKL/RANK 길항제를 확인하기 위해 RANK에 반하는 수용체 결합에 대해 가변 길이의 무작위 펩타이드 라이브러리를 스크리닝하였다(Teletchea 외, 2014. J Bone Miner Res. 29(6): 1466-1477). 이 실험은 두 개의 펩타이드, 즉 Pep501 및 Pep8이 세포-기반 파골세포 형성 검정에서 강한 활성을 나타냄을 입증하였다. 문헌[Aoki 외 (2006, J Clin Invest. 116(6):1525-1534)]은 TNF에 결합하는 TNFR의 CRD3 리간드 접촉 표면을 모방하도록 설계된 고리형 펩타이드를 보고하였으며; 또한 WP9QY 펩타이드가 RANKL-유도된 시그널링을 억제한다는 것을 입증했다. 펩타이드 WP9QY는 RANKL-유도된 시그널링을 억제하지만 RANK에 대한 RANKL의 결합을 차단하지는 않았다. 이러한 명백한 불일치를 설명하기 위해, 분자 모델링은 RANK CRD3에 대한 결합 부위에 국부적인 펩타이드 WP9QY가 수용체 세포질 도메인의 제안된 리간드-유도된 클러스터링을 잠재적으로 방해하여 RANKL/RANK 길항제로서 작용할 것이라고 예측하였다.
길항적 항-RANK 항체를 사용하는 의도하지 않은 수용체 작용의 가능성을 감안할 때, RANKL을 표적으로 하는 항체가 선호되었다(Lacey 외, 2012, 상기 참조). 그러나, 파지 디스플레이 기술을 이용하여 RANK ECD에 대한 단일 사슬 Fv(scFv) 항체가 식별되었다(Newa 외, 2014. Mol Pharm. 11(1):81-89). 또한, 항-RANK scFv는 (마우스) RAW264.7 검정에서 RANKL-의존성 파골세포 형성 활성을 차단했다. 그러나, 항-RANK scFv가 RANK에 대한 RANKL 결합에 영향을 주었는지 또는 대안적으로 RANK 수용체 복합체 및 다운스트림 신호 전달을 변경했는지에 대한 여부는 명확하지 않았다. 이후, Chypre 외(2016, Immunol Lett. 171:5-14)는 카밧(Kabat) 82번 위치에 누락된 코돈을 삽입하여 항-RANK scFv(현재 RANK-02로 개명됨)를 조작하고 인간 IgG1 중쇄 및 경쇄 백본에서 발현시켜 결합 특성 뿐만 아니라 시험관내 및 생체 내 검정을 비교하여 작용적 대비 길항적 특성을 다룬다. RANK-02가 RANKL을 차단하는 능력은 효소결합면역흡착검정[이하, ELISA로 기재함]에서 확인되었지만 Jurkat huRANK:Fas 검정에서 항체의 활성을 테스트했을 때 RANK-02의 작용 활성은 실망스러운 것으로 나타났다. 생체 내 테스트에서 RANK-02는 파골세포 TRAP 형성에 있어서 RANKL-의존적 증가를 차단하거나 강화하지 않음을 나타냈다. 이들 데이터는 RANK ECD에 대한 항체의 결합 또는 시험관내 RANKL 차단 능력이 세포-기반 또는 생체 내 검정에서 길항 활성을 예측하지 않음을 보여준다.
본 발명은 RANK에 결합하고 RANKL/RANK 시그널링 경로를 길항하는 항원-결합 분자의 개발을 일부 전제로 하고 있다. 이들 길항제 항원-결합 분자는 단독으로 또는 다른 제제와 조합하여, 이후 기재되는 바와 같은 RANKL/RANK 시그널링 경로의 활성화와 관련된 상태의 발병을 치료 또는 억제하기 위해, 면역을 자극 또는 증가시키기 위해, 종양에 대한 면역억제 또는 내성의 발생 또는 진행을 억제하기 위해, 또는 암의 발병, 진행 또는 재발을 억제하는데 유용하다.
따라서, 하나의 국면에서, 본 발명은 RANK에 적절하게 결합하고 RANKL/RANK 시그널링 경로를 길항하는 항원-결합 분자를 제공한다. 이들 항원-결합 분자는 일반적으로 다음을 포함한다:
(1) 서열 번호 3에 제시된 VHCDR1 아미노산 서열, 서열 번호 4에 제시된 VHCDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호 5에 제시된 VHCDR3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH), 및 서열 번호 6에 제시된 VLCDR1 아미노산 서열, 서열 번호 7에 제시된 VLCDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호 8에 제시된 VLCDR3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL);
(2) 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH;
(3) 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(적어도 91% 내지 99% 및 이들 사이의 모든 정수 백분율을 포함함)의 서열 동일성을 갖는 VH, 및 서열 번호 2의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(적어도 91% 내지 99% 및 이들 사이의 모든 정수 백분율을 포함함)의 서열 동일성을 갖는 VL;
(4) 서열 번호 1의 아미노산 서열 내 각 CDR 이외의 프레임워크 영역의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(적어도 91% 내지 99% 및 이들 사이의 모든 정수 백분율을 포함함)의 서열 동일성을 갖는 VH, 및 서열 번호 2의 아미노산 서열 내 각 CDR 이외의 프레임워크 영역의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(적어도 91% 내지 99% 및 이들 사이의 모든 정수 백분율을 포함함)의 서열 동일성을 갖는 VL; 또는
(5) 서열 번호 1의 아미노산 서열 내 각 CDR 이외의 프레임워크 영역의 서열에서 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5)의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호 2의 아미노산 서열 내 각 CDR 이외의 프레임워크 영역의 서열에서 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5)의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VL.
항원-결합 분자는 분리, 정제, 합성 또는 재조합 형태일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 항원-결합 분자는 1가 항원-결합 분자(예를 들어, Fab, scFab, Fab', scFv, 외팔 항체(one-armed antibodies) 등)이다.
항원-결합 분자는 다음 활성 중 임의의 하나 이상을 적절하게 포함한다: (a) RANK에 대한 RANKL의 결합 억제; (b) RANK 활성화 억제; (c) 다운스트림 RANK-매개 분자 시그널링(예를 들어, TRAF 단백질의 RANK 모집)의 억제; (d) RANK 다중화 억제; (e) 파골세포 분화 감소; (f) 파골세포 활성화 감소; (g) 파골세포 생존 감소; (h) 골 손실 억제 및 골밀도 증가; (i) 종양 미세환경(TME)에서 골수 세포 또는 다른 면역 세포의 면역억제 활성의 억제; 및 (j) 종양 세포(예를 들어, 삼중 음성 유방암(TNBC) 세포를 포함하는 호르몬-수용체 음성(예를 들어, ER-; PR-; HER2-; ER-, PR-; ER-, HER2-; PR-, HER2-; 및 ER-, PR-, HER2-) 유방암 세포 및/또는 BRCA-1 돌연변이 양성 유방암 세포를 포함하는 유방암 세포, 전립선 암 세포, KRAS 돌연변이 또는 KRAS 및 LKB1 돌연변이 NSCLC 종양 서브타입을 포함하는 NSCLC 세포, 및 ccRCC 세포를 포함하는 RCC 세포)의 증식, 이동, 생존 및/또는 형태형성(morphogenesis)의 억제.
일부 실시 양태에서, RANK 길항제 항원-결합 분자는 전달 비히클(예를 들어, 리포솜, 나노입자, 마이크로입자, 덴드리머(dendrimer) 또는 사이클로덱스트린)에 함유된다.
본 발명의 또 다른 국면은 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 국면은 하나 이상의 제어 서열과 작동 가능하게 연결되어 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 작제물(construct)을 제공한다. 적합한 작제물은 바람직하게는 발현 작제물의 형태이며, 대표적인 예는 플라스미드, 코스미드, 파지 및 바이러스를 포함한다.
다른 국면에서, 본 발명은 하나 이상의 제어 서열과 작동 가능하게 연결되어 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 작제물을 함유하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 국면은 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 실시 양태에서, 조성물은 항-골흡수제(예를 들어, 특히 부갑상선 호르몬, BMP2, 비타민 D, 항염증제로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 신진대사 증강제; 및 특히 비스포스포네이트, 카텝신 K 억제제, p38 억제제, JNK 억제제, IKK 억제제, NF-κB 억제제, 칼시뉴린 억제제, NFAT 억제제, PI3K 억제제로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 이화 작용 억제제) 및 화학요법제(예를 들어, 항증식성/항신생물 약물, 세포 증식 억제제, 암세포 침입을 억제하는 제제, 성장 인자 기능 억제제, 항-혈관 신생제, 혈관 손상제 등) 또는 면역요법제(예를 들어, 사이토카인, 사이토카인-발현 세포, 항체 등)로부터 선택된 적어도 하나의 보조제를 추가로 포함한다.
본 발명의 추가의 국면은 RANK-발현 세포에 대한 RANKL의 결합을 억제하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 일반적으로, RANK-발현 세포를 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자와 접촉시킴으로써 RANK 발현 세포에 대한 RANK의 결합을 억제하는 단계를 포함한다.
관련된 국면에서, 본 발명은 RANK-발현 세포에서 RANK의 활성화를 억제하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 일반적으로, RANK-발현 세포를 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자와 접촉시킴으로써 RANK 발현 세포에 대한 RANK의 활성화를 억제하는 단계를 포함한다.
또 다른 관련된 국면에서, 본 발명은 RANK-발현 세포에서 RANK-매개 분자 시그널링(예를 들어, TRAF 단백질의 RANK 동원)을 억제하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 일반적으로, RANK-발현 세포를 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자와 접촉시킴으로써 RANK 발현 세포에서 RANK-매개 분자 시그널링을 억제하는 단계를 포함한다.
또 다른 관련된 국면에서, 본 발명은 RANK-발현 세포에서 RANK 다중화를 억제하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 일반적으로 RANK-발현 세포를 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자와 접촉시킴으로써 RANK 발현 세포에서 RANK의 다중화를 억제하는 단계를 포함한다.
대표적인 RANK-발현 세포는 파골세포, 항원-제시 세포(antigen-presenting cells)(예를 들어, 단핵구 및 수지상 세포) 및 이펙터 면역 세포(effector immune cells)(예를 들어, T 세포)와 같은 면역 세포, 조혈 전구체 및 종양 세포(예를 들어, 삼중 음성 유방암(TNBC) 세포를 포함하는 호르몬-수용체(HR) 음성(예를 들어, ER-; PR-; HER2-; ER-, PR-; ER-, HER2-; PR-, HER2-; 및 ER-, PR-, HER2-) 유방암 세포, 및/또는 BRCA-1 돌연변이 양성 유방암 세포를 포함하는 유방암 세포, 전립선 암 세포, KRAS 돌연변이 또는 KRAS 및 LKB1 돌연변이 NSCLC 종양 서브타입을 포함하는 NSCLC 세포, 및 ccRCC 세포를 포함하는 RCC 세포)를 포함한다.
또 다른 관련된 국면에서, 본 발명은 파골세포의 분화, 활성화 및/또는 생존을 억제하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 일반적으로 파골세포를 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자와 접촉시킴으로써 파골세포의 분화, 활성화 및/또는 생존을 억제하는 단계를 포함한다.
다른 관련된 국면에서, 본 발명은 면역 세포(예를 들어, 골수 세포 또는 Treg)의 면역억제 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 일반적으로 면역 세포를 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자와 접촉시킴으로써 면역 세포의 면역억제 활성을 억제하는 단계를 포함한다.
또 다른 관련된 국면에서, 본 발명은 종양세포의 증식, 생존 또는 이동을 억제하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 일반적으로 종양 세포를 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자와 접촉시킴으로써 종양 세포의 증식, 생존 또는 이동을 억제하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 국면은 대상체에서 RANKL/RANK 시그널링 경로의 활성화와 관련된 상태의 발병을 치료 또는 억제하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 일반적으로 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자의 유효량을 대상체에게 투여함으로써 상태의 발병을 치료 또는 억제하는 단계를 포함한다. 특정 실시 양태에서, RANKL/RANK 시그널링 경로 활성화와 관련된 병태는 골감소 장애, 근병증 및 암으로부터 선택된다.
관련된 국면에서, 본 발명은 대상체에서 골 손실의 발생을 치료 또는 억제하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 일반적으로 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자의 유효량을 대상체에게 투여함으로써 골 손실의 발생을 치료 또는 억제하는 단계를 포함한다.
또 다른 관련된 국면에서, 본 발명은 대상체에서 RANKL/RANK 시그널링 경로의 활성화와 관련되는 암의 발병을 치료 또는 억제하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 일반적으로 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자의 유효량을 대상체에게 투여함으로써 암의 발병을 치료 또는 억제하는 단계를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 암은 HR 음성(예를 들어, ER-; PR-; HER2-; ER-, PR-; ER-, HER2-; PR-, HER2-; 및 ER-, PR-, HER2-) 유방암, BRCA-1 돌연변이 양성 유방암, HR 음성(예를 들어, ER-; PR-; HER2-; ER-, PR-; ER-, HER2-; PR-, HER2-; 및 ER-, PR-, HER2-) 및 BRCA-1 돌연변이 양성 유방암을 포함하는 유방암, 전립선 암, KRAS 돌연변이 또는 KRAS 및 LKB1 돌연변이 NSCLC를 포함하는 NSCLC, 및 ccRCC를 포함하는 RCC 세포로부터 선택된다.
본 발명자들은 2018 년 6월 5일에 출원되어 공동-계류중인 국제 출원 번호 PCT/AU2018/050557(전문이 본 명세서에 참조로 포함됨)에서 RANKL/RANK 및 면역 관문 분자(ICM: immune checkpoint molecule)를 공동-길항하는 것은 암에 대한 면역 반응에서 시너지 향상이라는 결과를 생성함을 개시하고 있다.
따라서, 또 다른 국면에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자 및 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자를 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성되는 치료학적 조합물을 제공한다. 치료학적 조합물은 RANK 길항제 항원-결합 분자 및 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자 각각을 포함하는 단일 조성물(예를 들어, 혼합물)의 형태일 수 있다. 대안적으로, RANK 길항제 항원-결합 분자 및 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자는 별도의 조성물에서 별개의 성분으로서 제공될 수 있다.
적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자는 다음으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 ICM을 적절하게 길항한다: 예정된 사멸 1 수용체(PD-1), 예정된 사멸 리간드 1(PD-L1), 예정된 사멸 리간드 2(PD-L2), 세포독성 T-림프구-관련 항원 4(CTLA-4), A2A 아데노신 수용체(A2AR), A2B 아데노신 수용체(A2BR), B7-H3 (CD276), V-세트 도메인-함유 T-세포 활성화 억제제 1(VTCN1), B- 및 T-림프구 감쇠제(BTLA), 인돌아민 2,3-다이옥시게나제(IDO), 살해-세포 면역글로불린-유사 수용체(KIR), 림프구 활성화 유전자-3 (LAG3), T 세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3(TIM-3), T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제제(VISTA), 5'-뉴클레오티다제(CD73), 택타일(TACTILE: CD96), 폴리오바이러스 수용체(CD155), DNAX 액세서리 분자-1(DNAM-1), 폴리오바이러스 수용체-관련 2(CD112), 세포독성 및 조절성 T-세포 분자(CRTAM), 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 멤버 4(TNFRS4; 0X40; CD134), 종양 괴사 인자 (리간드) 수퍼패밀리 멤버 4(TNFSF4; 0X40 리간드 (OX40L), 자연 살해 세포 수용체 2B4(CD244), CD160, 글루코코르티코이드-유도된 TNFR-관련 단백질(GITR), 글루코코르티코이드-유도된 TNFR-관련 단백질 리간드(GITRL), 유도성 공동 자극제(ICOS), 갈렉틴 9(GAL-9), 4-1BB 리간드(4-1BBL; CD137L), 4-1BB(4-1BB; CD137), CD70(CD27 리간드(CD27L)), CD28, B7-1(CD80), B7-2(CD86), 신호-조절 단백질(SIRP-1), 인테그린 관련 단백질(IAP; CD47); B-림프구 활성화 마커(BLAST-1; CD48), 자연 살해 세포 수용체 2B4(CD244); CD40, CD40 리간드(CD40L), 헤르페스바이러스 진입 매개체(HVEM), 막관통 및 면역글로불린 도메인 함유 2(TMIGD2), HERV-H LTR-연관 2(HHLA2), 혈관 내피 성장 억제제(VEGI), 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 멤버 25(TNFRS25), 유도성 T-세포 공동 자극 리간드(ICOLG; B7RP1) 및 Ig 및 ITIM(면역수용체 티로신-기반 억제 모티프) 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT). 일부 실시 양태에서, 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자는 PD-1 길항제 항원-결합 분자, PD-L1 길항제 항원-결합 분자 및 CTLA4 길항제 항원-결합 분자로부터 선택된다. 일부 실시 양태에서, 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자는 PD-1 길항제 항원-결합 분자를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자는 PD-L1 길항제 항원-결합 분자를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자는 PD-1 길항제 항원-결합 분자 및 PD-L1 길항제 항원-결합 분자를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자는 CTLA4 길항제 항원-결합 분자를 포함한다. 기타 실시 양태에서, 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자는 PD-1 길항제 항원-결합 분자 및 CTLA4 길항제 항원-결합 분자를 포함한다. 기타 실시 양태에서, 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자는 PD-L1 길항제 항원-결합 분자 및 CTLA4 길항제를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 항-ICM 항원-결합 분자는 Treg 세포가 발현이 부족하거나 낮은 수준으로 발현하는 ICM에 길항한다. 일부의 동일한 기타 실시 양태에서, 항-ICM 항원-결합 분자는 CTLA4보다 Treg에서 더 낮은 수준으로 발현되는 ICM(예를 들어, PD-1 또는 PD-L1)에 길항한다. 일부의 동일한 기타 실시 양태에서, 항-ICM 항원 결합 분자는 Treg보다 면역 이펙터 세포(예를 들어, 이펙터 T 세포, 대식세포, 수지상 세포, B 세포 등)에서 더 높은 수준으로 발현되는 ICM(예를 들어, PD-1 또는 PD-L1)을 길항한다. 이들 실시 양태의 대표적인 예에서, 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자는 PD-1 및 PD-L1 중 하나 또는 둘 모두로부터 선택된 ICM을 길항한다. 다수의 항-ICM 항원-결합 분자가 당업계에 공지되어 있으며, 이들 중 임의의 분자가 본 발명의 실시에서 사용될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 항 ICM 항원-결합 분자는 항 PD-1 항원-결합 분자, 항 PD-L1 항원-결합 분자 및 항 CTLA4 항원-결합 분자로부터 선택된다.
항 PD-1 항원-결합 분자는 MAb(이의 비-제한적인 예로는 니볼루맙(nivolumab), 펨브롤리주맙(pembrolizumab), 피딜리주맙(pidilizumab) 및 MEDI-0680(AMP-514), AMP-224, JS001-PD-1, SHR-1210, Gendor PD-1, PDR001, CT-011, REGN2810, BGB-317을 포함함) 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다. 대안적으로, 항 PD-1 항원-결합 분자는 PD-1에 결합하기 위해 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙 또는 MEDI-0680과 경쟁하는 분자일 수 있다.
일부 실시 양태에서, 항-PD-1 항원-결합 분자는 서열 번호 9(즉, 서열 번호 10에 제시된 천연 PD-1 서열의 62 내지 86번 잔기)에 제시된 아미노산 서열 및/또는 서열 번호 11(즉, 서열 번호 10에 제시된 천연 PD-1 서열의 118 내지 136번 잔기)에 제시된 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산에 특이적으로 결합한다. 동일한 실시 양태 및 다른 실시 양태 중 일부에서, 항-PD-1 항원-결합 분자는 서열 번호 12(즉, 서열 번호 10에 제시된 천연 PD-1 서열의 66 내지 97번 잔기에 상응함)에 제시된 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산에 특이적으로 결합한다.
일부 실시 양태에서, 항-PD-L1 항원 결합 분자는 MAb이고, 이의 비-제한적인 예로는 더발루맙(durvalumab: MEDI4736), 아테졸리주맙(atezolizumab, 티센트릭: Tecentriq), 아벨루맙(avelumab), BMS-936559/MDX-1105, MSB0010718C, LY3300054, CA-170, GNS-1480 및 MPDL3280A, 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 이러한 유형의 구체적인 예에서, 항-PD-L1 항원 결합 분자는 서열 번호 13(즉, 전장 천연 PD-의 279 내지 290번 잔기)에 제시된 아미노산 서열에 있는 하나 이상의 아미노산에 특이적으로 결합한다. 대안적으로, 항-PD-L1 항원-결합 분자는 PD-L에 결합하기 위해 더발루맙(MEDI4736), 아테졸리주맙(Tecentriq), 아벨루맙, BMS-936559/MDX-1105, MSB0010718C, LY3300054, CA-170, GNS-1480 및 MPDL3280A 중 임의의 하나와 경쟁하는 분자일 수 있다.
일부 실시 양태에서, 항-CTLA4 항원-결합 분자는 MAb이고, 대표적인 예로는 이필리무맙 및 트레멜리무맙 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 대안적으로, 항-CTLA4 항원-결합 분자는 CTLA4에 결합하기 위해 이필리무맙 또는 트레멜리무맙과 경쟁하는 분자일 수 있다. 이러한 유형의 구체적인 예에서, 항-CTLA4 항원-결합 분자는 서열 번호 15(즉, 서열 번호 16에 제시된 전장 천연 CTLA4 아미노산 서열의 25 내지 42번 잔기), 서열 번호 17(즉, 서열 번호 16에 제시된 천연 CTLA4 서열의 43 내지 65번 잔기), 및 서열 번호 18(즉, 서열 번호 16에 제시된 천연 CTLA4 서열의 96 내지 109번 잔기) 중 임의의 하나에 제시된 서열로부터 선택된 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산에 특이적으로 결합한다.
일부 실시 양태에서, 치료학적 조합물은 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자 및 항-PD-1 항원-결합 분자를 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 본질적으로 구성된다. 기타 실시 양태에서, 치료학적 조합물은 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자 및 항-PD-L1 항원-결합 분자를 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 본질적으로 구성된다. 또 다른 실시 양태에서, 치료학적 조합물은 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자, 항-PD-1 항원-결합 분자 및 항-PD-L1 항원-결합 분자를 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 본질적으로 구성된다. 또 다른 실시 양태에서, 치료학적 조합물은 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자, 항-PD-1 항원-결합 분자 및 항-CTLA4 항원-결합 분자를 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 본질적으로 구성된다. 기타 실시 양태에서, 치료학적 조합물은 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자 및 항-PD-L1 항원-결합 분자를 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 본질적으로 구성된다.
일부 실시 양태에서, RANK 또는 ICM 항원-결합 분자가 면역글로불린 불변 사슬(예를 들어, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 또는 IgG4 불변 사슬)에 링크된다. 면역 글로불린 불변 사슬은 κ 경쇄 또는 λ 경쇄로부터 선택된 경쇄; 및 γ1 중쇄, γ2 중쇄, γ3 중쇄 및 γ4 중쇄로부터 선택된 중쇄를 포함할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 치료학적 조합물은 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자 및 2개 이상의 상이한 항-ICM 항원-결합 분자를 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 본질적으로 구성된다. 이 유형의 대표적인 예에서, 치료학적 조합물이 본 명세서에 기술된 RANK 길항제 항원-결합 분자 및 항-CTLA4 항원-결합 분자, 항-PD-1 항원-결합 분자 및 항 PD-L1 항원-결합 분자 중 적어도 2개를 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 본질적으로 구성된다.
치료학적 조합물의 성분은 별개의 성분의 형태일 수 있다. 대안적으로, 성분들은 서로 융합되거나 그렇지 않으면(직접적으로 또는 간접적으로) 접합될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 치료학적 조합물은 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자 및 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자를 포함하는 다중특이적 길항제의 형태이다. 다중특이적 제제는 둘 이상의 폴리펩타이드의 복합체일 수 있다. 대안적으로, 다중특이적 제제는 단일 사슬 폴리펩타이드일 수 있다. RANK 길항제 항원-결합 분자는 개별 항-ICM 항원-결합 분자의 N-말단 또는 C-말단에 접합될 수 있다. RANK 길항제 항원-결합 분자 및 항-ICM 항원-결합 분자는 직접 또는 개입 링커(예를 들어, 폴리펩타이드 링커)에 의해 연결될 수 있다. 유리한 실시 양태에서, 다중특이적 길항제는 적어도 2개의 항원-결합 분자를 포함한다. 적합하게는, 다중특이적 항원-결합 분자의 별개의 성분은 키메라, 인간화 및 인간 항원-결합 분자를 포함하는 재조합 분자의 형태이다.
관련 국면에서, 본 발명은 RANK 및 적어도 하나의 ICM을 공동 길항하기 위한 다중특이적 항원-결합 분자를 제공한다. 이들 다중특이적 항원-결합 분자는 일반적으로 본 명세서에 기술된 RANK 길항제 항원-결합 분자 및 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자를 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 본질적으로 구성된다. RANK 길항제 항원-결합 분자는 적절하게는 RANK에 특이적으로 결합하고 길항하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 개별 항-ICM 항원-결합 분자는 상응하는 ICM에 특이적으로 결합하고 길항하는 항체 또는 항원-결합 단편으로부터 적절하게 선택된다. 항체 및/또는 항원-결합 단편은 직접 또는 개입 링커(예를 들어, 화학적 링커 또는 폴리펩타이드 링커)에 의해 연결될 수 있다. 개별 다중특이적 항원-결합 분자는 항체 또는 항원-결합 단편이 작동 가능하게 연결된 단일 사슬 폴리펩타이드의 형태일 수 있다. 대안적으로, 상기 분자는 복합체를 형성하기 위해 서로 링크되거나 그렇지 않으면 결합된 복수의 개별 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수 있다. 일부의 동일한 기타 실시 양태에서, 다중특이적 항원-결합 분자는 2가, 3가 또는 4가이다.
다중특이적 항원-결합 분자에서 사용하기 위해 고려되는 항원-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 분자 및 상보성 결정 영역 (CDR)에서 선택될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 개별 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IgG, IgM, IgD, IgA 및 IgE로 구성되는 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 불변 도메인을 포함한다. 다중-특이적 항원-결합 분자의 비-제한적인 예로는 탠덤 scFv(taFv or scFv2), 디아바디, dAb2/VHH2, 놉-인-홀(knobs-in-holes) 유도체, Seedcod-IgG, 헤테로Fc-scFv, Fab-scFv, scFv-Jun/Fos, Fab'-Jun/Fos, 트라이바디(tribody), DNL-F(ab)3, scFv3-CH1/CL, Fab-scFv2, IgG-scFab, IgG-scFv, scFv-IgG, scFv2-Fc, F(ab')2-scFv2, scDB-Fc, scDb-CH3, Db-Fc, scFv2-H/L, DVD-Ig, tandAb, scFv-dhlx-scFv, dAb2-IgG, dAb-IgG, dAb-Fc-dAb, tandab, DART, BiKE, TriKE, mFc-VH, 가교(crosslinked) MAbs, Cross MAbs, MAb2, FIT-Ig, 정전기적으로 매칭된 항체(electrostatically matched antibodies), 대칭형 IgG 유사 항체, LUZ-Y, Fab-교환 항체(Fab-exchanged antibodies) 또는 이들의 조합물을 적합하게 포함한다.
적합한 항원-결합 단편은 면역글로불린 불변 사슬(예를 들어, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 및 IgG4)에 링크될 수 있다. 이러한 유형의 대표적인 예에서, 면역 글로불린 불변 사슬은 κ 경쇄 또는 λ 경쇄로부터 선택된 경쇄; 및/또는 γ1 중쇄, γ2 중쇄, γ3 중쇄 및 γ4 중쇄로부터 선택된 중쇄를 포함할 수 있다.
다중특이적 항원-결합 분자가 PD-1을 길항하는 일부 실시 양태에서, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 9(즉, 서열 번호 10에 제시된 천연 인간 PD-1 서열의 62 내지 86 번 잔기), 서열 번호 11(즉, 서열 번호 10에 제시된 천연 인간 PD-1 서열의 118 내지 136번 잔기) 및 서열 번호 12(즉, 서열 번호 10에 제시된 천연 인간 PD-1 서열의 66 내지 97번 잔기에 상응함)로부터 선택되는 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산에 특이적으로 결합한다.
일부의 동일한 기타 실시 양태에서, 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, 및 MEDI-0680 (AMP-514), AMP-224, JS001-PD-1, SHR-1210, Gendor PD-1, PDR001, CT-011, REGN2810, BGB-317로부터 선택된 MAb의 중쇄 및 경쇄, 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
다중특이적 항원-결합 분자가 PD-L1에 길항하는 일부 실시 양태에서, 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 13에 제시된 아미노산 서열(즉, 서열 번호 14에 제시된 천연 인간 PD-L1 아미노산 서열의 279 내지 290번 잔기)의 하나 이상의 아미노산에 특이적으로 결합한다. 이러한 유형의 구체적인 항체 및 항원-결합 단편은 더발루맙(MEDI4736), 아테졸리주맙 (Tecentriq), 아벨루맙, BMS-936559/MDX-1105, MSB0010718C, LY3300054, CA-170, GNS-1480 및 MPDL3280A로부터 선택된 MAb의 중쇄 및 경쇄, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항체 및 항원-결합 단편을 포함한다.
다중특이적 항원-결합 분자는 CTLA4에 길항하는 일부 실시 양태에서, 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열 번호 15(즉, 서열 번호 16에 제시된 전장 천연 PD-CTLA4 아미노산 서열의 25 내지 42번 잔기), 서열 번호 17(즉, 서열 번호 16에 제시된 천연 CTLA4 서열의 43 내지 65번 잔기), 및 서열 번호 18(즉, 서열 번호 16에 제시된 천연 CTLA4 서열의 96 내지 109번 잔기)로부터 선택된 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산에 특이적으로 결합한다. 이러한 유형의 구체적인 항체 및 항원-결합 단편은 이필리무맙 및 트레멜리무맙으로부터 선택된 MAb의 중쇄 및 경쇄, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
일부 실시 양태에서, 다중특이적 항원-결합 분자는 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자 및 항-PD-1 항원-결합 분자를 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 본질적으로 구성된다. 기타 실시 양태에서, 다중특이적 항원-결합 분자는 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자 및 항-PD-L1 항원-결합 분자를 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 본질적으로 구성된다. 또 다른 기타 실시 양태에서, 다중특이적 항원-결합 분자는 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자, 항-PD-1 항원-결합 분자 및 항-PD-L1 항원-결합 분자를 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 본질적으로 구성된다. 또 다른 기타 실시 양태에서, 다중특이적 항원-결합 분자는 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자, 항-PD-1 항원-결합 분자 및 항-CTLA4 항원-결합 분자를 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 본질적으로 구성된다. 기타 실시 양태에서, 다중특이적 항원-결합 분자는 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자 및 항-PD-L1 항원-결합 분자를 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 본질적으로 구성된다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 상기 및 본 명세서의 다른 부분에서 광범위하게 기재된 바와 같은 치료학적 조합물을 생산하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 일반적으로 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자와 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자를 조합하여 치료학적 조합물을 생산하는 단계를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 상기 방법은 치료학적 조합물의 표적 폴리펩타이드(예를 들어, RANK 또는 ICM)에 특이적으로 결합하고 길항하는 항원 결합 분자를 생성(예를 들어, 표적 폴리펩타이드에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 면역화 폴리펩타이드로 동물을 면역화함으로써; 및 표적 폴리펩타이드 또는 이의 적어도 하나의 영역에 특이적으로 결합하는 B 세포를 동물로부터 식별 및/또는 분리함으로써; 및 B 세포에 의해 발현되는 항원-결합 분자를 생산함으로써)하는 단계를 포함한다. 비-제한적인 예에서, 상기 방법은 이와 같이 생성된 항원-결합 분자를 유도체화하여 항원-결합 분자와 동일한 에피토프-결합 특이성을 갖는 유도체 항원-결합 분자를 생산하는 단계를 추가로 포함한다. 유도체 항원-결합 분자는 항체 단편(구체적인 예는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 단일 사슬 (scFv), 외팔 및 도메인 항체(예를 들어, 샤크(shark) 및 카멜리드(camelid) 항체를 포함함) 및 항체를 포함하는 융합 단백질을 포함함), 및 항원 결합/인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 기타 변형된 구성으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시 양태에서, 치료학적 조합물 또는 다중특이적 항원-결합 분자는 전달 비히클(예를 들어, 리포솜, 나노입자, 마이크로입자, 덴드리머(dendrimer) 또는 사이클로덱스트린)에 함유된다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 하나 이상의 제어 서열과 작동 가능하게 연결되어 본 명세서에 기재된 다중특이적 항원-결합 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 작제물(construct)을 제공한다. 적합한 작제물은 바람직하게는 발현 작제물의 형태이며, 대표적인 예는 플라스미드, 코스미드, 파지 및 바이러스를 포함한다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 하나 이상의 제어 서열과 작동 가능하게 연결되어 본 명세서에 기재된 다중특이적 항원-결합 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 작제물을 함유하는 숙주 세포를 제공한다.
다른 국면에서, 본 발명은 상기 광범위하게 기재된 바와 같은 치료학적 조합물 또는 다중특이적 항원-결합 분자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 실시 양태에서, 조성물은 화학요법제(예를 들어, 항증식성/항신생물 약물, 세포 증식 억제제, 암세포 침입을 억제하는 제제, 성장 인자 기능 억제제, 항-혈관신생제, 혈관 손상 제제 등으로부터 선택됨) 또는 면역요법제(예를 들어, 사이토카인, 사이토카인-발현 세포, 항체 등)로부터 선택되는 적어도 하나의 보조제를 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 국면은 대상체에서 면역을 자극하거나 증가시키는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 일반적으로 본 명세서에 기재된 치료학적 조합물, 또는 다중특이적 항원-결합 분자의 유효량을 대상체에게 투여하여 대상체에서 면역을 자극 또는 증가시킬 수 있는 단계를 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 본질적으로 구성된다. 실시 양태에서, 치료학적 조합물의 RANK 길항제 항원-결합 분자 및 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자는 별개의 성분으로서 제공되고, 성분은 대상체에게 동시에 적절하게 투여된다. 이러한 유형의 구체적인 실시 양태에서, RANK 길항제 항원-결합 분자는 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자와 동시에 투여된다. 기타 구체적인 실시 양태에서, RANK 길항제 항원-결합 분자 및 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자는 순차적으로 투여된다. 예를 들어, RANK 길항제 항원-결합 분자는 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자의 투여 전에 투여될 수 있다. 적합하게는, RANK 길항제 항원-결합 분자는 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자의 투여 후에 투여된다.
전형적으로, 자극된 또는 증가된 면역은, 유익한 숙주 면역 반응(구체적인 예로, 종양 크기 감소; 종양 부담 감소; 질병의 안정화; 내인성 또는 외인성 항원에 대한 항체 생산; 면역계 유도; 면역계의 하나 이상의 성분의 유도; 세포-매개 면역 및 이의 생산에 관여하는 분자; 체액성 면역 및 이의 생산에 관여하는 분자; 항체-의존성 세포독성(ADCC) 면역 및 이의 생산에 관여하는 분자; 보체-매개 세포독성(complement-mediated cytotoxicity, CDC) 면역 및 이의 생산에 관여하는 분자; 자연 살해 세포; 사이토카인 및 케모카인, 및 이의 생산에 관여하는 분자와 세포; 항체-의존성 세포독성; 보체-의존성 세포독성; 자연 살해 세포 활성; 및 항원-강화 세포독성 중 임의의 하나 이상을 포함함)을 포함한다. 이러한 유형의 대표적인 예에서, 자극된 또는 증가된 면역이 전-염증성 면역 반응을 포함한다.
본 발명의 또 다른 국면은 대상체에서 종양에 대한 면역억제 또는 내성의 발생 또는 진행을 억제하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 종양을 본 명세서에 기술된 치료학적 조합물 또는 다중특이적 항원-결합 분자와 접촉시켜 대상체에서 종양에 대한 면역억제 또는 내성의 발생 또는 진행을 억제하는 단계를 일반적으로 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성된다. 적절하게는, 치료학적 조합물 또는 다중특이적 항원-결합 분자는 또한, 종양 항원을 면역계에 제시하는 항원-제시 세포(예를 들어, 수지상 세포)와 접촉한다.
본 발명의 추가의 국면은 대상체에서 암의 발병, 진행 또는 재발을 억제하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 일반적으로 본 명세서에 기재된 치료학적 조합물, 또는 다중특이적 항원-결합 분자의 유효량을 대상체에게 투여하여 대상체에서 암의 발병, 진행 또는 재발을 억제하는 단계를 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 본질적으로 구성된다.
관련 국면에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 본 명세서에 기재된 치료학적 조합물, 또는 다중특이적 항원-결합 분자의 유효량을 대상체에게 투여함으로써 암을 치료하는 단계를 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 본질적으로 구성된다.
본 발명에 따라 치료할 수 있는 암의 비-제한적인 예는 흑색종(melanoma), 유방암(breast cancer), 대장암(colon cancer), 난소암(ovarian cancer), 자궁 내막 및 자궁암(endometrial and uterine carcinoma), 위장암 또는 위암(gastric or stomach cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 전립선암(prostate cancer), 침샘암(salivary gland cancer), 폐암(lung cancer), 간세포암(hepatocellular cancer), 교모세포종(glioblastoma), 자궁 경부암(cervical cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer), 간종양(hepatoma), 직장암(rectal cancer), 결장암(colorectal cancer), 신장암(kidney cancer), 외음부암(vulval cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 간암(hepatic carcinoma), 항문암(anal carcinoma), 음경암(penile carcinoma), 고환암(testicular cancer), 식도암(esophageal cancer), 담도 종양(tumors of the biliary tract), 두경부암(head and neck cancer), 및 편평세포암종(squamous cell carcinoma)을 포함한다. 일부 특정 실시 양태에서, 암은 전이성 암(metastatic cancer)이다.
대상체에서 치료학적 조합물 또는 다중특이적 항원-결합 분자를 투여하는 것을 포함하는 임의의 상기 국면에서, 대상체에서 면역조절제에 대한 반응성을 적절하게 감소 또는 손상시키는 것으로, 예를 들어 대상체에서 ICM 분자 길항제(예를 들어, 항-PD-1 또는 항-PD-Ll 면역요법)에 대한 반응성을 감소 또는 손상시킨다.
본 발명의 일부 방법에서, 유효량의 보조 항암제를 대상체에게 동시에 투여한다. 일부 적합한 보조 항암제는 화학요법제, 외부 빔 방사선, 표적 방사성 동위원소 및 신호 전달 억제제를 포함한다. 그러나, 기타의 공지되어 있는 항암제가 본 발명의 방법과 함께 사용하는데 있어서 동일하게 적용가능하다.
추가의 국면에서, 본 발명은 대상체에서 면역을 자극 또는 증가하기 위한, 면역억제 또는 종양에 대한 내성의 발생 또는 진행을 억제하기 위한, 또는 암을 치료하기 위한 키트를 제공한다. 이들 키트는 상기 및 본 명세서의 다른 곳에서 광범위하게 기재된 바와 같은 치료학적 조합, 약제학적 조성물 및 다중특이적 항원-결합 분자 중 임의의 하나 이상을 포함한다.
도 1은 인간 RANK-Fc[RANK AA 서열 30-212] 또는 마우스 RANK-Fc[RANK AA 서열 31-214]에 대한 항-RANK 파지미드 클론의 반응성의 효소결합면역흡착검정(ELISA)을 도시하는 그래프이다. 단일점 분석은 ELISA에서 웰당 100 μL/웰의 파지 용액을 사용하여 수행되었다(파누시스(Panousis) 외에 따른 ELISA 방법, 2016, 아래 참조). Y 축은 흡광도 A450nm을 나타낸다. 파지미드-Fab 클론은 ELISA에 의한 표적 결합에 대해 테스트되었다. 정제된 RANK-Fc 또는 무관한 인간 IgG 항체를 MTPBS 2 ㎍/mL로 피복하였으며; 96-웰 MaxiSorpTM ELISA(써모피셔사이언티픽:Thermo Fischer Scientific 439454) 플레이트 상에 pH 7.3으로 4℃에서 밤새 두었다. 200 μL/웰의 5% 탈지유/PBST로 37℃에서 2시간 동안 차단하였고, 실온에서 90분 동안 파지 상청액(100 μL/웰)과 인큐베이션하기 전에 플레이트를 PBST로 두 번 세척하였다. 파지 상청액을 탈지유/PBST로 1:2로 희석하였다. PBST 중에 1:10,000으로 희석한 항-M13-HRP 항체(시노 바이올로지컬(Sino biological)사/Jomar 11973-MM05-100)와 인큐베이션하기 전에 플레이트를 PBST로 5회 세척 하였다. 플레이트를 PBST로 6회 세척하고 100 μL TMB/E 기질(머크 밀리포어(Merck Millipore)사 ES001-500ML)로 신호를 발생시켰다. 반응을 2M 인산(50μL 웰)으로 정지시키고 450 nm에서 측정하였다.
도 2는 RANKL에 의한 인간 RANK-Fc에 대한 항-RANK 파지미드 R03A03 결합의 억제를 도시하는 그래프이다. 재조합 가용성 인간 RANKL을 최종 농도가 1 μM인 웰에 첨가하였다. 경쟁적 파지 ELISA는 50 μL/웰의 파지 상청액을 첨가하기 전을 제외하고는 앞서 설명한 바와 같이 수행되었으며, 4% 탈지유/PBST에 웰당 2 μM의 동일한 부피의 경쟁자 RANKL 단백질이 첨가되었다. 중복 측정하여 평균값을 사용하였다.
도 3은 인간 RANKL-유도된 시험관내 파골세포 형성에 대한 항-RANK 3A3 항체의 억제 효과를 도시하는 그래프이다. 양성 대조군으로서 RANK-Fc, IgG2a 동형(isotype) 대조군, 비-차단 항-RANK 3B10 mAb 또는 차단, 항-RANK 3A3 항체의 존재 또는 부재하에 1000 ng/mL 내지 7.8 ng/mL 농도로 생쥐 BM 세포를 배양하였다. BM 세포를 CSF-1 및 인간 RANKL이 보충된 DMEM에서 배양하였다. 7일 후, TRAP+ 다핵(3개 이상의 핵) 세포를 계수하였다. 3중 배양물의 평균 ± 주사전자현미경(SEM)으로 데이터를 분석하였다.
도 4는 마우스 RANKL-유도된 시험관내 파골세포 형성에 대한 항-RANK 3A3 항체의 억제 효과를 도시하는 그래프이다. 양성 대조군으로서 항-muRANKL IK22-5 mAb, IgG2a 동형 대조군, 비-차단 항-RANK 3B10 mAb 또는 차단, 항-RANK 3A3 항체의 존재 또는 부재하에 1000 ng/mL 내지 7.8 ng/mL 농도로 생쥐 BM 세포를 배양하였다. BM 세포를 CSF-1 및 마우스 RANKL이 보충된 DMEM에서 배양하였다. 7일 후, TRAP + 다핵(3개 이상의 핵) 세포를 계수하였다. 3중 배양물의 평균값 ± 주사전자현미경(SEM)으로 데이터를 분석하였다.
도 5는 항-PD-L1 및 항-RANK(3A3) mAb의 조합물이 종양의 피하 성장을 억제함을 도시하는 그래프이다. C57BL/6 WT 마우스 그룹에 0 일에 MCA1956(1 x 106 세포)을 피하 주사하였다. 이후, 마우스를 10, 14, 18 및 22 일에 cIg(2A3 200 μg 복강내 주입); 항-PD-L1 단독(10F9G2 랫트 IgG2b, 50 ㎍ 복강내 주입); 항-RANK 단독(3A3 마우스 IgG1D265A, 200 μg 복강내 주입) 또는 표시된대로 이들의 조합물로 복강내 주입으로 처리하였다. 디지털 캘리퍼(digital caliper)를 사용하여 종양 성장을 측정하고, 종양 크기는 그룹당 5 내지 6마리 마우스에 대해 평균 ± SEM으로 나타내었다.
도 6은 항-PD-L1 및 항-RANK(3A3) mAb의 조합물이 종양의 피하 성장을 억제함을 도시하는 그래프이다. C57BL/6 WT 마우스 그룹에 0 일에 MC38-ovadim (1 x 106 세포)을 피하 주사하였다. 이후, 마우스를 12, 16, 20 및 24 일에 cIg(2A3 200 μg 복강내 주입); 항-PD-L1 단독(10F9G2 랫트 IgG2b, 50 ㎍ 복강내 주입); 항-RANK 단독(3A3 마우스 IgG1D265A, 200 μg 복강내 주입) 또는 표시된대로 이들의 조합물로 복강내 주입으로 처리하였다. 디지털 캘리퍼를 사용하여 종양 성장을 측정하고, 종양 크기는 그룹당 5 마리 마우스에 대해 평균 ± SEM으로 나타내었다.
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1. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있으나, 바람직한 방법 및 물질을 아래에 기재한다. 본 발명의 목적을 위해, 다음 용어를 아래에 정의한다.
관사 "일" 및 "하나"는 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하기 위해 본 발명에서 사용된다. 예를 들어, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
"약"은 기준 수량, 레벨, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 무게 또는 길이에 대해 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 수량, 레벨, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 무게 또는 길이를 의미한다.
용어 "동시 투여" 또는 "동시에 투여하는" 또는 "공동-투여" 등은 2개 이상의 활성제를 함유하는 단일 조성물의 투여, 또는 각 활성제가 별도의 조성물로서 및/또는 별도의 경로에 의해, 이러한 모든 활성제가 단일 조성물로 투여될 때 얻은 결과와 동등할 정도로 효과적인 결과가 동일한 충분히 짧은 시간 내에, 같은 시기에 또는 동시에 또는 순차적으로 전달되는 각 활성제의 투여를 지칭한다. "동시에"는 활성제가 실질적으로 동시에, 바람직하게는 동일한 제형으로 함께 투여됨을 의미한다. "같은 시기에"는 활성제가 제 시간에 밀접하게 투여됨을 의미하며, 예를 들어, 하나의 제제가 약 1분 내지 약 하루 전 후에 투여되는 것을 의미한다. 같은 시기에 발생하는 시간이면 모두 유용하다. 그러나, 동시에 투여되지 않는 경우, 약제가 약 1분 내지 약 8 시간 이내, 적절하게는 약 1 내지 약 4 시간 이내로 투여되는 경우가 자주 발생할 것이다. 같은 시기에 투여되는 경우, 제제는 대상체의 동일한 부위에 적절하게 투여된다. 용어 "동일 부위"는 정확한 위치를 포함하지만 약 0.5 내지 약 15 cm 이내, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 5 cm 이내일 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "별도로"는 간격, 예를 들어 약 1일 내지 수주 또는 수개월의 간격으로 제제를 투여함을 의미한다. 활성제는 어느 순서로든 투여할 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "순차적으로"는 제제가 예를 들어 분, 시간, 일 또는 주 간격으로 순차적으로 투여됨을 의미한다. 적절한 경우, 활성제는 규칙적인 반복 주기로 투여될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "및/또는"은 하나 이상의 관련된 나열된 항목의 임의의 및 모든 가능한 조합 뿐만 아니라 대안(또는)으로 해석될 때의 조합의 결여를 지칭하고 포괄한다.
용어 "길항제"는 가장 넓은 의미로 사용되며, RANK 또는 ICM의 시험관 내, 현장 내 또는 생체 내를 포함한 모든 설정에서의 결합, 시그널링, 복합체의 형성, 증식, 이동, 침입, 생존 또는 생존 가능성에 제한되지 않은 하나 이상의 생물학적 활성 또는 기능을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제, 중지, 축소, 감소, 지연, 손상 또는 중화시키는 모든 분자를 포함한다. 마찬가지로, 용어 "길항하다", "길항" 등은 예를 들어 상기 및 본 명세서의 기타에서 설명된 바와 같이 활성 또는 기능을 차단, 억제, 중지, 축소, 감소, 방해, 손상 또는 중화시키는 것을 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다. 예를 들어, "길항하다"는 활동 또는 기능에서 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 감소를 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항체"는 특정 항원(예를 들어, RANK 또는 ICM)에 특이적으로 결합하거나 또는 상호 작용하는 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 임의의 항원-결합 분자 또는 분자 복합체를 의미한다. 용어 "항체"는 4개의 폴리펩타이드 사슬, 즉 이황화 결합에 의해 상호-연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L) 뿐만 아니라 이의 다량체(예를 들어, IgM)를 포함하는 면역글로불린 분자를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(HCVR 또는 VH로 축약될 수 있음) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개의 도메인을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(LCVR 또는 VL로 축약될 수 있음) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인(CL1)을 포함한다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라고 명칭되는 보다 보존된 영역이 산재되어있는 상보성 결정 영역(CDR)이라고 명칭되는 초가변영역으로 더 세분화될 수 있다. 각 VH 및 VL은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 아미노-말단에서 카복시-말단으로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성된다. 본 발명의 다른 실시 양태에서, 본 발명의 항체(또는 이의 항원-결합 부분)의 FR은 인간 생식계열 서열과 동일할 수 있거나, 또는 자연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 아미노산 컨센서스 서열은 둘 이상의 CDR의 병렬 분석을 기반으로 정의될 수 있다.
항체는 IgG, IgA 또는 IgM(또는 이의 하위 부류)과 같은 모든 부류의 항체를 포함하며, 이러한 항체는 특정 부류일 필요는 없다. 중쇄 불변 영역의 항체 아미노산 서열에 따라 면역글로불린은 다른 부류에 할당될 수 있다. 면역글로불린에는 5 가지 주요 부류인 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM가 있고, 이들 중 일부는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2와 같은 하위 부류(동형)로 추가로 나눌 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 해당하는 중쇄 불변 영역을 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라고 명명한다. 상이한 부류의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3 차원 배열은 잘 공지되어 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "항원" 및 이와 문법적으로 동등한 표현(예: "항원성")은 항체 분자 또는 T 세포 수용체와 같은 특정 체액성 또는 세포성 면역의 산물에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 화합물, 조성물 또는 물질을 지칭한다. 항원은 예를 들어 합텐(hapten), 단순 중간 대사 산물, 당(예를 들어, 올리고당), 지질 및 호르몬 분자 뿐만 아니라 복합 탄수화물(예를 들어, 다당류), 인지질 및 단백질과 같은 거대 분자를 포함하는 모든 유형의 분자일 수 있다. 항원의 일반적인 범주에는 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 원생 동물 및 기타 기생 항원, 종양 항원, 자가 면역 질환, 알레르기 및 이식 거부에 관련된 항원, 독소 및 기타 여러가지 종류의 항원이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "항원-결합 단편", "항원-결합 부분", "항원-결합 도메인" 및 "항원-결합 부위"는 본 명세서에서 항원-결합에 참여하는 항원-결합 분자의 일부를 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용된다. 이들 용어는 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 자연적으로 발생하는, 효소적으로 획득 가능한, 합성적인, 또는 유전적으로 조작된 폴리펩타이드 또는 당 단백질을 포함한다. 항체의 항원-결합 단편은, 예를 들어 항체 가변 및 임의로 불변 도메인을 인코딩하는 DNA의 조작 및 발현을 포함하는 단백질 가수분해 소화 또는 재조합 유전 공학 기술과 같은 임의의 적합한 표준 기술을 사용하여 전체 항체 분자로부터 유도될 수 있다. 이러한 DNA는 공지되어 있고/있거나 예를 들어 상업적 공급원, DNA 라이브러리(예를 들어, 파지-항체 라이브러리를 포함함)로부터 쉽게 이용가능하거나 또는 합성될 수 있다. DNA는 화학적으로 또는 분자 생물학 기술을 사용하여 서열화 및 조작될 수 있는데, 예를 들어 하나 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 적절한 구성으로 배열하거나 코돈을 도입하고 시스테인 잔기를 생성하고, 아미노산을 변형, 추가 또는 삭제할 수 있다.
항원-결합 단편의 비-제한적인 예는 다음을 포함한다: (i) Fab 단편; (ii) F(ab')2 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단일 사슬 Fv (scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 및 (vii) 항체의 초가변 영역[예를 들어, CDR3 펩타이드와 같은 분리된 상보성 결정 영역(CDR)] 또는 제한된 FR3-CDR3-FR4 펩타이드를 모방하는 아미노산 잔기로 구성된 최소 인식 단위. 도메인-특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인-결실된 항체, 키메라 항체, CDR-이식된 항체, 외팔 항체(one-armed antibodies), 디아바디(diabodies), 트라이바디(triabodies), 테트라바디(tetrabodies), 미니 바디(minibodies), 나노 바디(nanobodies)(예를 들어, 1가 나노 바디(monovalent nanobodies), 2가 나노 바디(bivalent nanobodies) 등), 소형 모듈 면역 의약품(small module immunopharmaceuticals: SMIP) 및 샤크 가변 IgNAR 도메인(shark variable IgNAR domains)과 같은 기타 조작된 분자도 본 명세서에서 사용되는 "항원-결합 단편"이라는 표현 내에 포괄된다.
항체의 항원-결합 단편은 전형적으로 적어도 하나의 가변 도메인을 포함할 것이다. 가변 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성을 가질 수 있으며 일반적으로 하나 이상의 프레임워크 서열에 인접하거나 프레임 내에 있는 적어도 하나의 CDR을 포함할 것이다. VL 도메인과 관련된 VH 도메인을 갖는 항원-결합 단편에서, VH 및 VL 도메인은 임의의 적합한 배열로 서로에 대해 위치할 수 있다. 예를 들어, 가변 영역은 이량체일 수 있고, VH-VH, VH-VL 또는 VL-VL 이량체를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체의 항원-결합 단편은 단량체 VH 또는 VL 도메인을 함유할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 항체의 항원-결합 단편은 적어도 하나의 불변 도메인에 공유적으로 연결된 적어도 하나의 가변 도메인을 함유할 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편 내에서 발견될 수 있는 가변 및 불변 도메인의 비-제한적이고 예시적인 구성은 다음을 포함한다: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; 및 (xiv) VL-CL. 상기 나열된 예시적인 구성을 포함하는 가변 및 불변 도메인의 임의의 구성에서, 가변 및 불변 도메인은 서로 직접 연결될 수 있거나 또는 전체 또는 부분 힌지 또는 링커 영역에 의해 연결될 수 있다. 힌지 영역은 적어도 2 개(예를 들어, 5, 10, 15, 20, 40, 60 또는 그 이상)의 아미노산으로 구성될 수 있으며, 이는 단일 폴리펩타이드 분자에서 인접한 가변 및/또는 불변 도메인 사이에 가요성 또는 반-가요성 연결을 생성한다. 더욱이, 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 서로 및/또는 하나 이상의 단량체 VH 또는 VL 도메인(예를 들어, 이황화 결합(들)에 의해)과 함께 비공유 결합된 상기 나열된 임의의 가변 및 불변 도메인 구성의 동종-이량체 또는 이종-이량체(또는 다른 다량체)를 포함할 수 있다. 다중특이적 항원-결합 분자는 전형적으로 적어도 2 개의 상이한 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서 각각의 가변 도메인은 별개의 항원 또는 동일한 항원상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 명세서에 개시된 예시적인 이중특이적 항원-결합 분자 형식을 포함하는 임의의 다중특이적 항원-결합 분자 형식은 당업계에서 이용 가능한 통상적인 기술을 사용하여 본 발명의 항체의 항원-결합 단편과 관련하여 사용하기 위해서 조정할 수 있다.
"항원-결합 분자"는 표적 항원에 대한 결합 친화성을 갖는 분자를 의미한다. 이 용어는 항원-결합 활성을 나타내는 면역글로불린, 면역글로불린 단편 및 비-면역글로불린 유래된 단백질 프레임워크로 확장되는 것으로 이해될 것이다. 본 발명의 실시에 유용한 대표적인 항원-결합 분자는 항체 및 이들의 항원-결합 단편을 포함한다. 용어 "항원-결합 분자"는 항체 및 항체의 항원-결합 단편을 포함한다.
용어 "이중특이적 항원-결합 분자"는 동일한 항원 또는 2 개의 상이한 항원 상의 2 개의 별개의 에피토프에 결합하는 능력을 갖는 다중특이적 항원-결합 분자를 지칭한다. 이중특이적 항원-결합 분자는 2가, 3가 또는 4 가일 수 있다. 본 명세서에 사용된 "가", "원자가", "원자가들" 또는 이의 기타 문법적 변형은 항원-결합 분자에서 항원-결합 부위의 수를 의미한다. 이들 항원 인식 부위는 동일한 에피토프 또는 상이한 에피토프를 인식할 수 있다. 2가 및 이중특이적 분자는 예를 들어 문헌[Kostelny 외 J Immunol 148 (1992):1547, Pack and Pl
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ckthun Biochemistry 31 (1992) 1579, Gruber 외 J Immunol (1994) 5368, Zhu 외 Protein Sci 6 (1997):781, Hu 외 Cancer Res. 56 (1996):3055, Adams 외 Cancer Res. 53 (1993):4026, and McCartney, 외 Protein Eng. 8 (1995):301]에 기재되어 있다. 3가 이중특이적 항원-결합 분자 및 4가 이중특이적 항원-결합 분자도 당업계에 공지되어있으며, 예를 들어, 문헌[Kontermann RE (ed.), Springer Heidelberg Dordrecht London New York, 199-216 페이지 (2011)]을 참조한다. 이중특이적 항원-결합 분자는 또한 4가 보다 높은 원자가를 가질 수 있고 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 이러한 항원-결합 분자는 예를 들어 독 앤 록 접합법(dock and lock conjugation method}에 의해 생성될 수 있다(Chang, C.-H. 외 In: Bispecific Antibodies. Kontermann RE (2011), 상기 참조).
대조적으로, 용어 "1가 항원-결합 분자"는 항원의 단일 에피토프에 결합하는 항원-결합 분자를 지칭한다. 1가 항원-결합 분자는 전형적으로 항원-가교가 불가능하다.
"항원-결합 부위"는 항원과의 상호 작용을 제공하는 항원-결합 분자의 부위, 즉 하나 이상의 아미노산 잔기를 지칭한다. 예를 들어, 항체의 항원 결합 부위는 상보성 결정 영역(CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. 천연 면역글로불린 분자는 전형적으로 2개의 항원 결합 부위를 갖고, Fab 분자는 전형적으로 단일 항원 결합 부위를 갖는다. 본 명세서에 기재된 항원-결합 분자의 항원-결합 부위는 전형적으로 항원, 보다 구체적으로는 항원의 에피토프에 특이적으로 결합한다.
문구 "특이적으로 결합한다" 또는 "특이적 결합"은 생리학적 조건 하에서 배경의 적어도 2 배이고, 보다 전형적으로 배경 분자 결합의 10 내지 100 배를 초과하는 두 분자 간의 결합 반응을 지칭한다. 단백질인 하나 이상의 검출 가능한 결합제를 사용하는 경우, 특이적 결합은 단백질 및 기타 생물학적 제제의 이질적인 집단에서 단백질의 존재를 결정한다. 따라서 지정된 면역검정 조건 하에서, 특정화된 항원-결합 분자는 특정 항원 결정기에 결합하여 이의 존재를 식별한다. 이러한 조건 하에서 항원 결정기에 대한 특이적 결합은 이 결정기에 대한 특이성을 위해 선택된 항원-결합 분자를 요구한다. 이 선택은 다른 분자와 교차-반응하는 항원-결합 분자를 제감함으로써 달성할 수있다. 특정 항원과 특이적으로 면역 반응하도록 면역글로불린과 같은 항원-결합 분자를 선택하기 위해 다양한 면역검정 형식이 사용될 수 있다. 예를 들어, 고체상 ELISA 면역검정은 단백질과 특이적으로 면역 반응하는 항체를 선택하기 위해 일상적으로 사용된다(예를 들어, 특정 면역반응성을 결정하는데 사용할 수 있는 면역검정 형식 및 조건에 대한 설명은 문헌: Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988)을 참조한다). 결합 친화도 및 특이성을 결정하는 방법은 또한 당업계에 잘 공지되어 있다(예를 들어, Harlow and Lane, 상기 참조); Friefelder, "Physical Biochemistry: Applications to biochemistry and molecular biology" (W.H. Freeman and Co. 1976).
분자와 참조하여 사용되는 용어 "키메라"는 분자가 둘 이상의 상이한 기원 또는 공급원으로부터 유래되거나, 수득되거나, 분리되거나, 이에 기초한 부분을 함유함을 의미한다. 따라서, 폴리펩타이드는 상이한 기원의 2개 이상의 아미노산 서열을 포함하는 경우 키메라이고, (1) 자연에서 함께 발견되지 않는 폴리펩타이드 서열(즉, 적어도 하나의 아미노산 서열은 다른 아미노산 서열 중 적어도 하나와 관련하여 이종기원임), 또는 (2) 자연적으로 인접하지 않은 아미노산 서열을 포함한다.
"분화 클러스터 38"(CD38)(환형 ADP 리보스 가수분해효소, ADPRC1 및 ADPRC 1이라고도 함)는 CD4+, CD8+, B 림프구, 골수성 및 자연 살해 세포를 포함하는, 다수의 면역 세포(백혈구)의 표면에서 발견되는 당단백질이다. CD38은 또한 세포 부착, 신호전달 및 칼슘 시그널링의 기능을 수행한다. CD38은 NADP+에서 NAADP를 합성하는 것 외에도 NAD+에서 ADP-리보스로의 사이클릭 ADP-리보스(cADPR)의 합성 및 가수 분해를 촉매하는 다기능 외부효소이다. 용어 "CD38"은 CD38의 단편 뿐만 아니라 대립 유전자 변이체, 스플라이스 변이체, 유도체 변이체, 치환 변이체, 결실 변이체 및/또는 삽입 변이체, 융합 폴리펩타이드, 및 종간 상동체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 관련 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 실시 양태에서, CD38 폴리펩타이드는 리더 서열 잔기, 표적화 잔기, 아미노 말단 메티오닌 잔기, 리신 잔기, 태그 잔기 및/또는 융합 단백질 잔기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 말단 잔기를 포함한다. 바람직한 실시 양태에서, 본 명세서에 사용된 "CD38"은 인간 CD38(hCD38), hCD38의 변이체, 아형 및 종상동체, 및 hCD38과 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 전체 hCD38 서열은 UniProt 수탁번호 P28907로 찾을 수 있다.
"분화 클러스터 103"(CD103)(인테그린, 알파 E(ITGAE), HUMINAE, 인테그린 서브유닛 알파 E로도 공지되어 있음)은 인간에서 ITGAE 유전자에 의해 인코딩되는 인테그린 단백질이다. CD103은 인테그린 베타 7(β7-ITGB7)에 결합하여 완전한 이종이량체 인테그린 분자 αEβ7을 형성한다. 용어 "CD103"은 CD103의 단편 뿐만 아니라 대립 유전자 변이체, 스플라이스 변이체, 유도체 변이체, 치환 변이체, 결실 변이체 및/또는 삽입 변이체, 융합 폴리펩타이드, 및 종간 상동체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 관련 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 실시 양태에서, CD103 폴리펩타이드는 리더 서열 잔기, 표적화 잔기, 아미노 말단 메티오닌 잔기, 리신 잔기, 태그 잔기 및/또는 융합 단백질 잔기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 말단 잔기를 포함한다. 바람직한 실시 양태에서, 본 명세서에 사용된 "CD103"은 인간 CD103(hCD103), hCD103의 변이체, 아형 및 종상동체, 및 hCD103과 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 전체 hCD103 서열은 UniProt 수탁번호 P3850로 찾을 수 있다.
"분화 클러스터 163"(CD163)(M130, MM130, SCARI1로도 공지되어 있음)은 헤모글로빈-합토글로빈 복합체에 대한 고친화성 스캐빈저 수용체이며, 헤모글로빈 단독으로 합토글로빈이 부재한 경우에는 친화도가 낮다. 또한 단핵구/대식세포 계통의 세포의 마커이며, 특히 M2-유사 면역억제 골수 세포의 마커이다. CD163은 그람 양성균과 그람 음성균에 대한 선천적 면역 센서로서 기능을 수행한다. 용어 "CD163"은 CD163의 단편 뿐만 아니라 대립 유전자 변이체, 스플라이스 변이체, 유도체 변이체, 치환 변이체, 결실 변이체 및/또는 삽입 변이체, 융합 폴리펩타이드, 및 종간 상동체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 관련 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 실시 양태에서, CD163 폴리펩타이드는 리더 서열 잔기, 표적화 잔기, 아미노 말단 메티오닌 잔기, 리신 잔기, 태그 잔기 및/또는 융합 단백질 잔기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 말단 잔기를 포함한다. 바람직한 실시 양태에서, 본 명세서에 사용된 "CD163"은 인간 CD163(hCD163), hCD163의 변이체, 아형 및 종상동체, 및 hCD163과 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 전체 hCD163 서열은 UniProt 수탁번호 Q86VB7로 찾을 수 있다.
"분화 클러스터 200"(CD200)(또한 OX-2 멤브레인 당단백질, MOX1, MOX2, MRC, OX-2)은 CD200 유전자에 의해 인코딩된 인간 단백질이다. 이 유전자에 의해 인코딩된 단백질은 2개의 면역글로불린 도메인을 함유하는 1형 멤브레인 당단백질이므로 면역글로불린 수퍼패밀리에 속한다. 이 유전자는 골수 세포 활동을 조절하고 다양한 조직에서 대식세포 계통에 대한 억제 신호를 전달한다. 용어 "CD200"은 CD200의 단편 뿐만 아니라 대립 유전자 변이체, 스플라이스 변이체, 유도체 변이체, 치환 변이체, 결실 변이체 및/또는 삽입 변이체, 융합 폴리펩타이드, 및 종간 상동체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 관련 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 실시 양태에서, CD200 폴리펩타이드는 리더 서열 잔기, 표적화 잔기, 아미노 말단 메티오닌 잔기, 리신 잔기, 태그 잔기 및/또는 융합 단백질 잔기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 말단 잔기를 포함한다. 바람직한 실시 양태에서, 본 명세서에 사용된 "CD200"은 인간 CD200(hCD200), hCD200의 변이체, 아형 및 종상동체, 및 hCD200과 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 전체 hCD200 서열은 UniProt 수탁번호 P41217로 찾을 수 있다.
"분화 클러스터 206"(CD206)(만노스 수용체로도 공지되어 있음)은 대식세포 및 미성숙 수지상 세포를 포함하는 골수 세포의 표면에 주로 존재하는 C형 렉틴이다. 수용체는 일부 미생물의 표면에서 발견되는 단백질에 부착된 글리칸 상에서 말단 만노스, N-아세틸글루코사민 및 푸코스 잔기를 인식하여 선천형 면역계와 적응형 면역계 모두에서 역할을 수행한다. 병리학적 사건에 대한 반응으로 방출되는 황산화 당단백질 호르몬 및 당단백질을 포함하여 순환에서 당단백질을 제거하는 기능을 추가로 포함한다. 만노스 수용체는 클라트린(clathrin)-의존 방식으로 원형질막과 엔도좀 구획 사이에서 지속적으로 재순환된다. 용어 "CD206"은 CD206의 단편 뿐만 아니라 대립 유전자 변이체, 스플라이스 변이체, 유도체 변이체, 치환 변이체, 결실 변이체 및/또는 삽입 변이체, 융합 폴리펩타이드, 및 종간 상동체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 관련 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 실시 양태에서, CD206 폴리펩타이드는 리더 서열 잔기, 표적화 잔기, 아미노 말단 메티오닌 잔기, 리신 잔기, 태그 잔기 및/또는 융합 단백질 잔기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 말단 잔기를 포함한다. 바람직한 실시 양태에서, 본 명세서에 사용된 "CD206"은 인간 CD206(hCD206), hCD206의 변이체, 아형 및 종상동체, 및 hCD206과 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 전체 hCD206 서열은 UniProt 수탁번호 P22897로 찾을 수 있다.
"코딩 서열"은 유전자의 폴리펩타이드 산물 또는 유전자의 최종 mRNA 산물(예를 들어, 스플라이싱 후 유전자의 mRNA 산물)에 대한 코드에 기여하는 임의의 핵산 서열을 의미한다. 대조적으로, 용어 "비-코딩 서열"은 유전자의 폴리펩타이드 산물 또는 유전자의 최종 mRNA 산물에 대한 코드에 기여하지 않는 임의의 핵산 서열을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "상보성 결정 영역"(CDR; 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3)은 항원 결합에 필요한 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각 가변 도메인에는 전형적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 식별되는 3개의 CDR 영역이 있다. 각각의 상보성 결정 영역은 예를 들어 카밧(Kabat)에 의해 정의된 "상보성 결정 영역"의 아미노산 잔기(즉, 경쇄 가변 도메인에서 대략 24 내지 34번(L1), 50 내지 56번(L2) 및 89 내지 97번(L3) 잔기 및 중쇄 가변 도메인에서 31 내지 35번(H1), 50 내지 65번(H2) 및 95 내지 102번(H3) 잔기; Kabat 외, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) 및/또는 "초가변루프"의 아미노산 잔기(즉, 경쇄 가변 도메인에서 대략 26 내지 32번(L1), 50 내지 52번(L2) 및 91 내지 96번(L3) 잔기 및 중쇄 가변 도메인에서 26 내지 32번(H1), 53 내지 55번(H2) 및 96 내지 101번(H3) 잔기; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 상보성 결정 영역은 카밧에 따라 정의된 CDR 영역 및 초가변루프 둘 다의 아미노산을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "복합체"는 서로 직접 및/또는 간접적으로 접촉하는 분자(예를 들어, 펩타이드, 폴리펩타이드 등)의 군집체 또는 집합체를 지칭한다. 특정 실시 양태에서, "접촉", 또는 보다 구체적으로, "직접 접촉"은 반데르발스 힘, 수소 결합, 이온 및 소수성 상호 작용 등과 같은 인력성 비공유 상호 작용이 분자의 상호 작용을 지배할 수 있도록 둘 이상의 분자가 충분히 가깝다는 것을 의미한다. 이러한 실시 양태에서, 분자 복합체(예를 들어, 펩타이드 및 폴리펩타이드)는 복합체가 열역학적으로 선호되는 조건(예를 들어, 구성 분자의 비-응집 또는 비-복합 상태와의 비교) 하에서 형성된다. 본 명세서에 사용된 용어 "폴리펩타이드 복합체"또는 "단백질 복합체"는 트라이머, 테트라머, 펜타머, 헥사머, 헵타머, 옥타머, 노나머, 데카머, 운데카머, 도데카머, 또는 고차 올리고머를 지칭한다.
본 명세서 전체에서 문맥상 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함", "포함하다" 및 "포함하는"은 언급된 단계 또는 요소 또는 단계 또는 요소의 그룹을 포함하지만, 다른 단계 또는 요소 또는 단계 또는 요소의 그룹을 제외하지는 않는 것으로 이해될 것이다. 따라서, "포함하는" 등의 용어의 사용은 나열된 요소가 필수이거나 의무적이지만, 다른 요소는 선택 사항이며, 존재하거나 존재하지 않을 수 있음을 시사한다. "구성된(consisting of)"은 문구 "구성된" 다음에 오는 모든 것을 포함하고 이에 제한되는 것을 의미한다. 따라서, "구성된"이라는 문구는 나열된 요소가 필수 또는 의무이며 다른 요소가 존재할 수 없음을 시사한다. "본질적으로 구성되는"은 문구 뒤에 나열된 임의의 요소를 포함하고 나열된 요소에 대한 개시 내용에 명시된 활성 또는 작용을 방해하거나 기여하지 않는 다른 요소로 제한됨을 의미한다. 따라서, "본질적으로 구성되는"이라는 문구는 나열된 요소가 필수 또는 의무이지만 다른 요소는 선택 사항이며 나열된 요소의 활성 또는 작용에 영향을 미치는지 여부에 따라 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있음을 시사한다. 일부 실시 양태에서, 언급된 서브유닛 서열(예를 들어, 아미노산 서열)에 대하여 "필수적으로 구성되는"이라는 문구는 서열이 적어도 하나의 추가 업스트림 서브유닛(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 업스트림 서브유닛, 예를 들어 아미노산) 및/또는 적어도 하나의 추가 다운스트림 서브유닛(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 이상의 업스트림 서브유닛, 예를 들어 아미노산)을 포함할 수 있음을 시사하고, 여기서 업스트림 서브유닛의 수 및 다운스트림 서브유닛의 수는 독립적으로 선택 가능하다.
본 명세서에 사용된 용어 "접합된", "연결된", "융합된" 또는 "융합" 및 이들의 문법적 등가물은, 화학적 접합 또는 재조합 수단(예를 들어, 유전적 융합에 의함)을 포함하는 모든 수단에 의해 2개 이상의 요소 또는 구성요소 또는 도메인을 함께 결합하는 맥락으로 상호 교환적으로 사용된다. 화학적 접합 방법(예를 들어, 이종 이기능성 가교제 사용)은 당업계에 공지되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "일정한 도메인" 또는 "일정한 영역"은 가변 영역 이외의 항체 도메인의 합을 나타낸다. 불변 영역은 항원의 결합에 직접 관여하지 않지만 다양한 면역 이펙터 기능을 나타낸다.
용어 "작제물"은 상이한 공급원으로부터의 하나 이상의 분리된 핵산 서열을 포함하는 재조합 유전 분자를 지칭한다. 따라서, 작제물은 서로 다른 기원의 2개 이상의 핵산 서열이 단일 핵산 분자로 조립되고, (1) 자연에서 함께 발견되지 않는 조절 및 코딩 서열을 포함하는 핵산 서열(즉, 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열이 적어도 하나의 다른 뉴클레오타이드 서열에 대해 이종성임), 또는 (2) 자연적으로 인접되지 않은 기능적 RNA 분자 또는 단백질의 일부를 인코딩하는 서열, 또는 (3) 자연적으로 인접되지 않은 프로모터의 일부를 함유하는 임의의 작제물을 포함하는, 키메라 분자이다. 대표적인 작제물은 임의의 공급원로부터 유래되고, 게놈 통합 또는 자율 복제가 가능하며, 하나 이상의 핵산 분자가 작동 가능하게 링크된 핵산 분자를 포함하는 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 자율 복제 폴리뉴클레오타이드 분자, 파지, 또는 선형 또는 원형 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA 핵산 분자와 같은 임의의 재조합 핵산 분자를 포함한다. 본 발명의 작제물은 일반적으로 작제물에 함유된 관심 핵산 서열의 발현을 지시하는 데 필요한 요소, 예를 들어 표적 핵산 서열 또는 조절자 핵산 서열을 일반적으로 포함할 것이다. 이러한 요소는 관심 핵산 서열에 (이의 직접 전사를 위해서) 작동 가능하게 링크된 프로모터와 같은 제어 요소를 포함할 수 있으며, 흔히 폴리아데닐화 서열도 포함한다. 본 발명의 특정 실시 양태 내에서, 작제물은 벡터 내에 함유될 수 있다. 작제물의 성분에 더하여, 벡터는 숙주 세포의 게놈에 작제물을 안정적으로 통합하는데 용이하도록 예를 들어 하나 이상의 선택 가능한 마커, 원핵 및 진핵 기원과 같은 하나 이상의 복제 기원, 적어도 하나의 다중 클로닝 부위 및/또는 요소를 포함할 수 있다. 2 개 이상의 작제물은 단일 벡터와 같은 단일 핵산 분자 내에 함유될 수 있거나, 또는 2 개 이상의 개별 벡터와 같은 2개 이상의 개별 핵산 분자 내에 함유될 수 있다. "발현 구조"는 일반적으로 관심 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 링크된 적어도 하나의 제어 서열을 포함한다. 이러한 방식으로, 예를 들어, 발현될 뉴클레오타이드 서열과 작동 가능하게 연결된 프로모터는 숙주 세포를 포함하는 유기체 또는 이의 일부에서 발현하기 위한 발현 작제물에 제공된다. 본 발명을 실행하기 위해서, 작제물 및 숙주 세포를 제조하고 사용하기 위한 통상적인 조성물 및 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다(예를 들어, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition Volumes 1, 2, and 3. J. F. Sambrook, D. W. Russell, and N. Irwin, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000).
"제어 요소" 또는 "제어 서열"은 특정 숙주 세포에서 작동 가능하게 링크된 코딩 서열의 발현에 필요한 핵산 서열(예를 들어, DNA)을 의미한다. 예를 들어 원핵 세포에 적합한 제어 서열은 프로모터, 및 선택적으로 오퍼레이터 서열 및 리보솜 결합 부위와 같은 시스-작용 서열을 포함한다. 진핵 세포에 적합한 제어 서열은, 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 전사 인핸서와 같은 전사 제어 서열, 번역 인핸서 및 내부 리보솜 결합 부위(IRES)와 같은 번역 제어 서열, mRNA 안정성을 조절하는 핵산 서열, 뿐만 아니라 전사된 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 산물을 세포 내부의 세포 내 구획 또는 세포 외 환경으로 표적화하는 표적 서열을 포함한다.
"에 상응하다" 또는 "에 상응하는"은 참조 핵산 서열에 대해 실질적인 서열 동일성을 나타내는 핵산 서열(예를 들어, 참조 핵산 서열의 전부 또는 일부에 대해 적어도 약 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 97, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 또는 최대 100%의 서열 동일성을 가짐) 또는 참조 아미노산 서열에 대해 실질적인 서열 유사성 또는 동일성을 나타내는 아미노산 서열(예를 들어, 참조 핵산 서열의 전부 또는 일부에 대해 적어도 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 97, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 또는 최대 100%의 서열 유사성 또는 동일성을 가짐)을 의미한다.
"세포 독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA4)"(ALPS5, CD, CD152, CELIAC3, CTLA-4, GRD4, GSE, IDDM12로도 공지됨)는 면역 관문으로 기능하여 면역 반응을 하향 조절하는 단백질 수용체를 지칭한다. CTLA4는 T 조절 세포(Tregs)에서 구성적으로 발현되지만 활성화 후 통상적인 T 세포에서만 상향 조절된다. 항원-제시 세포의 표면에 있는 CD80 또는 CD86에 결합될 때 "오프" 스위치로서 작용한다. 본 명세서에 사용된 용어 "CTLA4"은 인간 CTLA4(hCTLA4), hCTLA4의 변이체, 아형 및 종상동체, 및 hCTLA4와 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 전체 hCTLA4 서열은 UniProt 수탁번호 P16410로 찾을 수 있다.
용어 "DART" (이중친화성 재표적화 시약)은, 동일하거나 상이한 에피토프를 인식할 수 있다 2 개 이상의 에피토프 결합 부위를 형성하도록 (특히 공유 상호 작용을 통해) 회합하는 적어도 2개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 면역글로불린 분자를 지칭한다. DART의 각각의 폴리펩타이드 사슬은 면역글로불린 경쇄 가변 영역 및 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하지만, 이들 영역은 상호 작용하여 에피토프 결합 부위를 형성하지 않는다. 오히려, DART 폴리펩타이드 사슬 중 하나(예를 들어, 첫 번째)의 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 상이한(예를 들어, 두 번째) DART 폴리펩타이드 사슬의 면역글로불린 경쇄 가변 영역과 상호 작용하여 에피토프 결합 부위를 형성한다. 유사하게, DART 폴리펩타이드 사슬 중 하나(예를 들어, 첫 번째)의 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 상이한(예를 들어, 두 번째) DART 폴리펩타이드 사슬의 면역글로불린 중쇄 가변 영역과 상호 작용하여 에피토프 결합 부위를 형성한다. DART는 단일특이적, 이중특이적, 삼중특이적 등일 수 있고, 따라서 1, 2, 3개 또는 그 이상의 다른 에피토프(동일하거나 다른 항원일 수 있음)에 동시에 결합가능할 수 있다. DART는 추가로 1가, 2가, 3가, 4가, 5가, 6가 등일 수 있고, 따라서 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 이상의 분자를 동시에 결합가능할 수 있다. DART의 이러한 두 가지 속성(즉, 특이성 및 원자가의 정도)은 예를 들어 4가(즉, 4 세트의 에피토프를 결합할 수 있음) 등인 이중특이적 항체(즉, 2 개의 에피토프를 결합할 수 있음)를 생산하기 위해 결합될 수 있다.
DART 분자는 국제 PCT 국제공개공보 WO제2006/113665호, WO제2008/157379호 및 WO제2010/080538호에 보다 상세히 개시되어 있다.
질병 또는 병태(예를 들어, 암)의 치료 또는 예방에 대하여 "유효량"은 질환 또는 병태의 치료 또는 예방에 유효한 단일 용량으로 또는 일련의 또는 서방성 체계의 일부로서 대상체에게 일정량의 활성제를 투여하는 것을 의미한다. 유효량은 피험자의 건강 및 신체 조건 및 치료할 개인의 분류군 그룹, 조성의 제형, 의학적 상황 평가 및 기타 관련 요인에 따라 달라질 것이다.
본 명세서에 사용된 용어 "인코드", "인코딩" 등은 다른 핵산 또는 폴리펩타이드를 제공하는 핵산의 능력을 지칭한다. 예를 들어, 핵산 서열은 폴리펩타이드를 생산하기 위해 전사 및/또는 번역될 수 있거나 폴리펩타이드를 생산하기 위해 전사 및/또는 번역될 수 있는 형태로 처리될 수 있는 경우 폴리펩타이드를 "인코딩"한다고 한다. 이러한 핵산 서열은 코딩 서열 또는 코딩 서열 및 비-코딩 서열 둘 다를 포함할 수 있다. 따라서, 용어 "인코드", "인코딩" 등은 DNA 분자의 전사로 생성된 RNA 산물, RNA 분자의 번역으로 생성된 단백질, RNA 산물을 형성하는 DNA 분자의 전사 및 RNA 산물의 후속 번역으로 생성된 단백질, 또는 RNA 산물을 처리하여 처리된 RNA 산물(예를 들어, mRNA)을 제공하는 DNA 분자의 전사 및 처리된 RNA 산물의 후속 번역으로 생성된 단백질을 포함한다.
용어 "에피토프" 및 "항원 결정 인자"는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되어 항원-결합 분자 또는 이의 항원-결합 단편에 의해 결합된 항원의 영역을 지칭한다. 에피토프는 연속 아미노산(선형 에피토프) 또는 단백질의 3차 폴딩(구조적 에피토프)에 의해 병치된 비-연속 아미노산 둘 다에서 형성될 수 있다. 연속 아미노산으로 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 노출될 때 유지되는 반면 3 차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매로 처리할 때 손실된다. 에피토프는 전형적으로 고유한 공간적 형태로 적어도 3개, 보다 일반적으로 적어도 5개 또는 8 내지 10개의 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간적 형태를 결정하는 방법은 예를 들어 x-선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명을 포함한다(예를 들어, Morris G.E., Epitope Mapping Protocols, Meth Mol Biol, 66 (1996) 참조). 에피토프 매핑을 위한 바람직한 방법은 표면 플라즈몬 공명이다. 이중특이적 항체는 2가, 3가 또는 4가일 수 있다. 이중특이적 항체에 대하여 본 명세서에서 사용되는 용어 "가", "원자가", "원자가들" 또는 이의 기타 문법적 변형은 항원-결합 분자에서 항원-결합 부위의 수를 의미한다. 이들 항원 인식 부위는 동일한 에피토프 또는 상이한 에피토프를 인식할 수 있다. 2가 및 이중특이적 분자는 예를 들어 참조문헌[Kostelny 외, (1992) J Immunol 148:1547; Pack and Pl
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ckthun (1992) Biochemistry 31:1579; Hollinger 외, 1993, supra, Gruber 외, (1994) J Immunol 5368, Zhu 외, (1997) Protein Sci 6:781; Hu 외, (1996) Cancer Res 56:3055; Adams 외, (1993) Cancer Res 53:4026; and McCartney 외, (1995) Protein Eng 8:301. Trivalent bispecific antibodies and tetravalent bispecific antibodies are also known in the art (see, e.g., Kontermann R E (ed.), Springer Heidelberg Dordrecht London New York, 199-216 (2011))]에 기재되어 있다. 이중특이적 항체는 또한 4가 보다 높은 원자가를 가질 수 있고 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 이러한 항체는 예를 들어 독 앤 록 접합법[참조 문헌: Chang, C.-H. 외 In: Bispecific Antibodies. Kontermann R E (ed.), Springer Heidelberg Dordrecht London New York, 199-216 페이지 (2011)]에 의해 생성될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "기능", "기능적" 등은 리간드-결합, 다량체화, 활성화, 시그널링, 생물학적, 병리학적 또는 치료적 기능을 지칭한다.
"프레임워크 영역"(FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각 가변 도메인은 전형적으로 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 식별되는 4 개의 FR을 갖는다. CDR이 카밧(Kabat)에 따라 정의된 경우, 경쇄 FR 잔기는 약 1-23(LCFR1), 35-49(LCFR2), 57-88(LCFR3) 및 98-107(LCFR4)번 잔기에 위치하고, 중쇄 FR 잔기는 중쇄 잔기에서 약 1-30(HCFR1), 36-49(HCFR2), 66-94(HCFR3) 및 103-113(HCFR4)번 잔기에 위치한다. CDR이 초가변 루프의 아미노산 잔기를 포함하는 경우, 경쇄 FR 잔기는 경쇄에서 약 1-25(LCFR1), 33-49(LCFR2), 53-90(LCFR3) 및 97-107(LCFR4)번 잔기에 위치하고, 중쇄 FR 잔기는 중쇄 잔기에서 약 1-25(HCFR1), 33-52(HCFR2), 56-95(HCFR3) 및 102-113(HCFR4)번 잔기에 위치한다. 일부 예에서, CDR이 Kabat에 의해 정의된 CDR과 초가변루프 둘 다의 아미노산을 포함하는 경우, FR 잔기는 이에 따라 조정될 것이다. 예를 들어, CDRH1이 아미노산 H26-H35를 포함하는 경우, 중쇄 FR1 잔기는 1-25번 위치에 있고, FR2 잔기는 36-49번 위치에 있다.
"갈렉틴(Galectin)-9"(Gal9) (또한, LGALS9, HUAT, LGALS9A라고도 지칭함)는 2 개의 탄수화물-인식 도메인이 있는 탠덤-반복형 갈렉틴으로, 종양 세포의 세포 응집 및 접착을 포함하는 다양한 생물학적 기능, 뿐만 아니라 세포 자멸을 조절한다. 갈렉틴-9는 또한 암세포에 항-증식 효과가 있으며 T 세포 면역글로불린 뮤신-3 (Tim-3)과 상호 작용하여 CD8+ T 세포 고갈을 촉진하고 골수성-유래 억제 세포의 확장을 유도함으로써 T 세포 반응을 부정적으로 조절한다. 이러한 메커니즘은 종양 성장에 관여하고 면역에서 도피한다. 많은 고형암에서, 갈렉틴-9 발현의 손실은 전이 진행과 밀접한 관련이 있으며, 재조합 갈렉틴-9로 치료하면 다양한 전임상 암 모델에서 전이성 확산을 방지하게 된다. 용어 "Gal9"은 Gal9의 단편 뿐만 아니라 대립 유전자 변이체, 스플라이스(splice) 변이체, 유도체 변이체, 치환 변이체, 결실 변이체 및/또는 삽입 변이체, 융합 폴리펩타이드, 및 종간 상동체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 관련 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 실시 양태에서, Gal9 폴리펩타이드는 리더 서열 잔기, 표적화 잔기, 아미노 말단 메티오닌 잔기, 리신 잔기, 태그 잔기 및/또는 융합 단백질 잔기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 말단 잔기를 포함한다. 바람직한 실시 양태에서, 본 명세서에 사용된 "Gal9"은 인간 Gal9(hGal9), hGal9의 변이체, 아형 및 종상동체, 및 hGal9과 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 전체 hGal9 서열은 UniProt 수탁번호 O00182로 찾을 수 있다.
"헤르페스바이러스 진입 매개체"(HVEM)(종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 멤버 14(TNFRSF14), ATAR, CD270, HVEA, HVEM, LIGHTR, TR2, 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 멤버 14, TNF 수용체 수퍼패밀리 멤버 14로도 공지됨)는 TNF-수용체 수퍼패밀리의 인간 세포 표면 수용체이다. 이 수용체는 단순 헤르페스바이러스(HSV) 진입의 세포 매개체로 식별되었다. HSV 바이러스 외피 당단백질 D(gD)와 상기 수용체 단백질의 결합은 바이러스 진입 메커니즘의 일부인 것으로 나타났다. 이 수용체의 세포질 영역은 면역 반응을 활성화하는 신호 전달 경로를 매개할 수 있는 여러 TRAF 패밀리 멤버와 결합하는 것으로 밝혀졌다. 용어 "HVEM"은 HVEM의 단편 뿐만 아니라 대립 유전자 변이체, 스플라이스 변이체, 유도체 변이체, 치환 변이체, 결실 변이체 및/또는 삽입 변이체, 융합 폴리펩타이드, 및 종간 상동체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 관련 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 실시 양태에서, HVEM 폴리펩타이드는 리더 서열 잔기, 표적화 잔기, 아미노 말단 메티오닌 잔기, 리신 잔기, 태그 잔기 및/또는 융합 단백질 잔기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 말단 잔기를 포함한다. 바람직한 실시 양태에서, 본 명세서에 사용된 "HVEM"은 인간 HVEM(hHVEM), hHVEM의 변이체, 아형 및 종상동체, 및 hHVEM과 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 전체 hHVEM 서열은 UniProt 수탁번호 Q92956으로 찾을 수 있다.
본 명세서에 사용된 세포 마커 또는 바이오 마커의 측정에 관한 용어 "더 높은"은, 바이오 마커 측정이 기준 수준과 비교하여 기준 수준보다 큰 바이오 마커 측정 수준에서 통계적으로 유의하고 측정 가능한 차이를 지칭한다. 상기 차이는 적합하게는 적어도 약 10%, 또는 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%이다.
용어 "면역 관문 분자(immune checkpoint molecule)"는 면역 관문으로 기능하는 수용체 및 리간드 둘 다를 포함한다. 면역 관문은 면역계가 자신의 신체를 공격하는 것을 방지하는 면역 도피 메커니즘이다. 면역 관문 수용체는 T 세포에 존재하며 항원-제시 세포에서 발현되는 면역 관문 리간드와 상호 작용한다. T 세포는 MHC 분자에 존재하는 항원을 인식하고 활성화되어 면역 반응을 발생시키는 반면, 상기와 병행하여 발생하는 면역 관문 수용체와 리간드 간의 상호 작용은 T 세포의 활성화를 제어한다. 예시적인 면역 관문 분자는 PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, A2AR, A2BR, B7-H3 CD276, VTCN1, BTLA, IDO, KIR, LAG3, TIM-3, VISTA, CD73, CD96, CD155, DNAM-1, CD112, CRTAM, TNFRS4 (OX40, CD134), TNFSF4 (OX40L), CD244, CD160, GITR, GITRL, ICOS, GAL-9, 4-1BBL (CD137L), 4-1BB (CD137), CD70, CD27L, CD28, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), SIRP-1, IAP (CD47), BLAST-1 (CD48), CD244; CD40, CD40L, HVEM, TMIGD2, HHLA2, VEGI, TNFRS25, ICOLG (B7RP1) 및 TIGIT을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시 양태에서, 면역 관문 분자는 PD-1, PD-L1 또는 CTLA-4이다.
본 발명과 관련하여 용어 "면역 이펙터 세포"는 면역 반응 동안 이펙터 기능을 발휘하는 세포에 관한 것이다. 예를 들어, 이러한 세포는 사이토카인 및/또는 케모카인을 분비하고, 미생물을 사멸시키고, 항체를 분비하고, 감염된 세포 또는 암 세포를 인식하며, 이러한 세포를 선택적으로 제거한다. 예를 들어, 면역 이펙터 세포는 T 세포(세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 종양 침윤 T 세포), B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 림포카인-활성화 살해(LAK) 세포, 호중구, 대식세포 및 수지상 세포를 포함한다.
본 발명과 관련하여 용어 "면역 이펙터 기능"은 예를 들어 바이러스로 감염된 세포 또는 종양 세포의 사멸, 또는 종양 성장 및/또는 종양 전파 및 전이의 억제를 포함하여 종양 성장의 억제 및/또는 종양 발달의 억제를 가져오는 면역계의 성분에 의해 매개되는 임의의 기능을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 대한 면역 이펙터 기능은 T-세포 매개 이펙터 기능이다. 이러한 기능은, 헬퍼 T-세포(CD4+ T-세포)의 경우 T-세포 수용체에 의한 MHC 클래스 II 분자에 대하여 항원 또는 항원으로부터 유래된 항원 펩타이드의 인식, 사이토카인의 방출 및/또는 CD8+ 림프구(CTL) 및/또는 B-세포의 활성화를 포함하고, CTL의 경우, T 세포 수용체에 의한 MHC 클래스 I 분자에 대하여 항원 또는 항원으로부터 유래된 항원 펩타이드의 인식, MHC 클래스 I 분자에 대하여 제시된 세포, 즉 예를 들어 세포자멸 또는 퍼포린(perforin)-매개 세포 용해를 통한 MHC 클래스 I를 갖는 항원의 제시를 특징으로 하는 세포의 제거, IFN-γ 및 TNF-α와 같은 사이토카인의 생산 및 표적 세포를 발현하는 항원의 특이적 세포 용해 사멸을 포함한다.
용어 "면역계"는 손상 및 공격 및 물질에 대한 방어를 제공하는 적응형 및 선천형 면역계의 항원-특이적 및 비특이적 범주를 각각 포함하는 세포, 분자 구성요소 및 메커니즘을 지칭하는 것으로, 후자는 종양, 병원체 및 자기-반응성 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 항원성 분자로 구성된다. "적응형 면역계"는 며칠에 걸쳐 나타나고 특정 항원과 반응하여 제거하는 항원-특이적 세포, 분자 구성요소 및 메커니즘을 지칭한다. 적응형 면역계는 숙주의 평생 동안 발달한다. 적응형 면역계는 백혈구를 기반으로 하며 두 가지 주요 섹션으로 구분된다: B 세포에 의해 생산된 면역 글로불린을 통해 주로 작용하는 체액성 면역계 및 T 세포를 통해 주로 기능하는 세포-매개 면역계.
"링커"는 두 분자를 연결하고 종종 두 분자를 바람직한 구성으로 배치하는 역할을 하는 분자 또는 분자 그룹(예를 들어, 단량체 또는 중합체)을 의미한다. 특정 실시 양태에서, "펩타이드 링커"는 2개의 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 도메인, 영역 또는 모티프를 연결하고, 이들의 동족 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있도록 항원-결합 단편의 간격과 호환되는 스페이서 기능을 제공할 수 있는 아미노산 서열을 지칭한다. 특정 실시 양태에서, 링커는 약 2개 내지 약 35개의 아미노산, 예를 들어, 약 4개 내지 약 20개의 아미노산 또는 약 8개 내지 약 15개의 아미노산 또는 약 15개 내지 약 25개의 아미노산으로 구성된다.
본 명세서에 사용된 세포 마커 또는 바이오 마커의 측정에 관한 용어 "더 낮은"은 바이오 마커 측정이 기준 수준과 비교하여 기준 수준보다 낮은 바이오 마커 측정 수준에서 통계적으로 유의하고 측정 가능한 차이를 지칭한다. 상기 차이는 적합하게는 적어도 약 10%, 또는 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%이다.
마커에 적용되는 "음성", "양성" 및 "낮은" 발현 수준은 다음과 같이 정의된다. 음성 발현(즉, "-") 또는 "결핍 발현"을 갖는 세포는 형광 방출의 추가 채널에서 관심 기타 단백질에 대한 완전한 항체 염색 칵테일 표지화의 존재하에 형광 채널에서 동형 대조군 항체로 관찰된 발현의 제95 백분위수 이하를 발현하는 세포로서 본 명세서에서 정의된다. 당업자는 음성 이벤트를 정의하기 위한 이러한 절차가 "형광 마이너스 1" 또는 "FMO" 염색으로 지칭된다는 것을 이해할 것이다. 위에 기재된 FMO 염색 절차를 사용하여 동형 대조군 항체로 관찰된 발현의 제95 백분위수를 초과하는 발현을 갖는 세포는 본 명세서에서 "양성"(즉, "+")으로 정의된다. 광범위하게 "양성"으로 정의되는 다양한 세포 집단이 있다. 예를 들어, 낮은 발현(즉, "낮음(low)" 또는 "lo")을 갖는 세포는 일반적으로 동형 대조군 항체를 이용한 FMO 염색을 사용하여 결정된 제95 백분위수를 넘고 상기 기술된 FMO 염색 절차를 사용하여 동형 대조군 항체로 관찰된 발현의 제95 백분위수의 1 표준 편차 이내로 관찰된 발현을 갖는 세포로 정의된다. ICM(예를 들어, PD-1, PD-L1 등)과 관련하여 용어 "낮음(low)" 또는 "lo"는, 하나 이상의 다른 별개의 세포 또는 세포 집단(예를 들어, T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포, NK T(NKT) 세포, 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포 (DC)와 같은 면역 이펙터 세포; 뿐만 아니라 종양 세포) 보다 낮은 수준에서 ICM을 발현하는 세포 또는 세포 집단(예를 들어, 종양 미세환경에서 T 세포를 포함하는 Treg 세포)을 지칭한다. 예를 들어, 종양 미세환경에서 CTLA4는 PD-1보다 Treg에서 훨씬 더 높은 수준으로 발현되고 PD-1은 Treg보다 이펙터 T 세포를 포함한 면역 이펙터 세포에서 훨씬 더 높은 수준으로 발현되는 것으로 공지되어 있다(참조문헌: Jacobs 외, 2009. Neuro-Oncology 11(4): 394-402).
"콜라겐 구조를 갖는 대식세포 수용체"(MARCO) (SCARA2 및 SR-A6로도 공지됨)는 대식세포의 특정 하위 집합에서 발견되는 클래스 A 스캐빈저 수용체(class A scavenger receptor)이다. 스캐빈저 수용체는 패턴 인식 수용체(PRR)이며 면역 세포에서 가장 흔하게 발견된다. 이들을 정의하는 특징으로는 다가음이온 및 저밀도 지단백질(LDL)로 명명되는 콜레스테롤 유형의 변형된 형태에 결합한다는 점이다. MARCO는 이러한 리간드와 병원체-관련 분자 패턴(PAMP)에 결합하고 포식작용을 하여 병원균을 제거할 뿐만 아니라 염증을 유발하는 세포에서 다운스트림 효과를 유발한다. 타고난 면역계의 일부로서 MARCO는 병원균을 제거하거나 청소하고 염증 반응을 유도한다. MARCO의 세포외 측 끝에 있는 SRCR(스캐빈저 수용체 시스테인-풍부: scavenger receptor cysteine-rich) 도메인은 리간드 결합 및 후속 면역 반응을 담당한다. 알츠하이머 병은 리간드가 MARCO에 결합할 때 세포 내 감소된 반응과 관련이 있기 때문에 대식세포에 대한 MARCO 발현은 질병과도 관련이 있다. 용어 "MARCO"은 MARCO의 단편 뿐만 아니라 대립 유전자 변이체, 스플라이스 변이체, 유도체 변이체, 치환 변이체, 결실 변이체 및/또는 삽입 변이체, 융합 폴리펩타이드, 및 종간 상동체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 관련 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 실시 양태에서, MARCO 폴리펩타이드는 리더 서열 잔기, 표적화 잔기, 아미노 말단 메티오닌 잔기, 리신 잔기, 태그 잔기 및/또는 융합 단백질 잔기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 말단 잔기를 포함한다. 바람직한 실시 양태에서, 본 명세서에 사용된 "MARCO"은 인간 MARCO(hMARCO), hMARCO의 변이체, 아형 및 종상동체, 및 hMARCO과 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 전체 hMARCO 서열은 UniProt 수탁번호 Q9UEW3로 찾을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "미세환경"은 생물학적 세포, 조직 또는 기관의 연결적, 지지적 프레임워크를 지칭한다. 본 명세서에 사용된 용어 "종양 미세환경" 또는 "TME"는 악성 과정이 생존 및/또는 확장 및/또는 확산되는 구조적 및 또는 기능적 환경을 생성하는 임의의 및 모든 요소의 종양 환경을 지칭한다. 일반적으로, 용어 "종양 미세환경" 또는 "TME"는 섬유 아세포, 백혈구 및 내피 세포 및 세포외 기질(ECM)을 가까이에 둘러싸는 영역을 포함하여 종양이 존재하는 세포 환경을 지칭한다. 따라서, 종양 미세환경의 세포는 성장 및 생존을 지지하는 비-악성 세포와 관련된 악성 세포를 포함한다. 기질 세포라고도 불리는 비-악성 세포는 악성 세포와 동일한 세포 공간 또는 악성 세포에 인접하거나 근접한 세포 공간을 점유하거나 이러한 공간에 축적되어 종양 세포 성장 또는 생존을 조절한다. 용어 "기질 세포"는 섬유 아세포, 백혈구 및 혈관 세포를 포함한다. 종양 미세환경의 비-악성 세포는 섬유 아세포, 상피 세포, 혈관 세포(혈액 및 림프관 내피 세포 및 혈관주위세포를 포함함), 상주하고/상주하거나 동원된 염증 및 면역(예를 들어, 대식세포, 수지상 세포, 과립구, 림프구 등)을 포함한다. 이들 세포 및 특히 활성화된 섬유 아세포는 전이 발달에 적극적으로 참여한다.
본 명세서에 사용된 용어 "단일 클론 항체"(Mab)는 실질적으로 균질한 항체 집단(즉, 집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고 동일함)으로부터 얻은 항체를 지칭한다. 단일 클론 항체는 매우 특이적이며 단일 항원성 에피토프에 지시를 받는다. 수식어구 "단일 클론"은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단일 클론 항체는 문헌 [Kohler 외, Nature 256:495 (1975)]에 의해 처음 기술된 융합세포 방법에 의해 제조되고 상기 기술된 체세포 혼성화 방법에 의해 변형되거나; 또는 다른 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국 특허 번호 제4,816,567호에 설명된 방법)에 의해 제조될 수 있다.
용어 "다중특이적 항원-결합 분자"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 적어도 2개(예를 들어, 2, 3, 4개 등)의 상이한 에피토프에 대한 특이성(즉, 하나의 항원상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하거나 2개 이상의 상이한 항원상의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있음)을 갖는 항원-결합 분자를 특이적으로 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "골수 세포"는 골수 계통의 세포 또는 그로부터 유래된 세포를 지칭한다. 골수 계통은 과립구(호중구, 호산구 및 호염기구), 단핵구, 대식세포, 적혈구, 거핵구 및 비만 세포의 다양한 하위 집합을 포함하여 형태학적, 표현형 및 기능적으로 구별되는 다수의 세포 유형을 포함한다. 특정 실시 양태에서, 골수 세포는 골수 계통의 세포주로부터 유래된 세포이다.
본 명세서에 사용된 용어 "근병증(myopathy)"은 근육 섬유가 제대로 기능하지 않아 일반적으로 근육 약화를 초래하는 근육 질환을 의미한다. 근병증은 본질적으로 신경근 또는 근골격인 근육 질환을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 근병증은 유전성 근병증이다. 유전성 근병증에는 영양장애, 근긴장증, 선천성 근병증(예를 들어, 네말린 근병증, 멀티/미니 코어 근병증 및 중심핵 근병증), 미토콘드리아 근병증, 가족성 주기성 근병증, 염증성 근병증 및 대사성 근병증(예를 들어, 글리코겐 저장 질환 및 지질 저장 장애)이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시 양태에서, 근병증은 후천성 근병증이다. 후천성 근병증에는 외부 물질 유도된 근병증(예를 들어, 약물 유발성 근병증 및 글루코코르티코이드 근병증, 알코올성 근병증 및 기타 독성 물질로 인한 근병증), 근염(예를 들어, 피부근염, 다발근염 및 봉입체 근염), 골수 근염, 횡문근 융해증 및 미오글로빈뇨 및 비활동성 위축을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시 양태에서, 근병증은 골절(예를 들어, 고관절 골절) 또는 신경 손상(예를 들어, 척수 손상(SCI))에 의해 유발될 수 있는 비활동성 위축이다. 일부 실시 양태에서, 근병증은 근 위축성 측삭 경화증(ALS), 척수성근위축(SMA), 신부전으로 인한 악액질 증후군, AIDS, 심장 질환 및/또는 암과 같은 질환 또는 장애와 관련된다. 일부 실시 양태에서, 근병증은 노화와 관련된다.
본 명세서에 사용된 용어 "작동 가능하게 연결된" 또는 "작동 가능하게 링크된"은 이렇게 기재된 구성 요소가 의도된 방식으로 기능하도록 허용하는 관계에 있는 병렬(juxtaposition)을 지칭한다. 예를 들어, 관심 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 코딩 및/또는 비-코딩 서열)에 "작동 가능하게 링크된" 조절 서열(예를 들어, 프로모터)은, 제어 서열과 호환되는 조건에서 해당 서열의 발현을 허용하는 관심 뉴클레오타이드 서열에 대한 제어 서열의 위치결정 및/또는 배향을 지칭한다. 제어 서열은 발현을 지시하는 기능을 하는 한 관심 뉴클레오타이드 서열과 인접할 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 개입 비-코딩 서열(intervening non-coding sequences)(예를 들어, 번역되지는 않았으나 전사된 서열)은 프로모터와 코딩 서열 사이에 존재할 수 있으며, 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동 가능하게 링크된" 것으로 간주할 수 있다. 마찬가지로, 제1 항원-결합 단편을 제2 항원-결합 단편에 "작동 가능하게 연결"하는 것은 각각의 항원-결합 단편이 이의 동족 에피토프에 결합하는 것을 허용하는 방식으로 항원-결합 단편의 위치결정 및/또는 배향을 포괄한다.
용어 "골감소 장애"는 석회화 및/또는 골밀도가 감소된 병태를 지칭하며 이러한 병태가 알려진 모든 골격계를 지칭하는데 사용된다. 대표적인 골감소 장애로는 골다공증, 골감소증, 파제트병(Paget's disease), 용해성 골 전이, 치주염, 류마티스성 관절염 및 부동화로 인한 골 손실이 있다. 이들 골 질환 외에도 특정 암은 파골세포 활성을 증가시키고 유방, 전립선 및 다발성 골수종과 같은 골 흡수를 유도하는 것으로 공지되어 있다. 이들 암은 뼈에서 RANKL의 과발현을 유발하고 파골세포 수와 활성을 증가시키는 요인을 생산하는 것으로 현재 공지되어 있다
"약제학적으로 허용되는 담체"는 생물학적으로 또는 기타 바람직한 물질, 즉 임의의 또는 실질적인 부작용을 야기하지 않고 선택된 활성제와 함께 대상체에게 투여될 수 있는 물질로 구성된 약제학적 비히클을 의미한다. 담체는 희석제, 세제, 착색제, 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 보존제 등과 같은 부형제 및 기타 첨가제를 포함할 수 있다.
"예정된(Programmed) 사멸-1(PD-1)"(CD279, PD1, SLEB2, hPD-1, hPD-I 및 hSLE1로도 공지됨)은 CD28 패밀리에 속하는 면역-억제 수용체를 지칭한다. PD-1은 생체 내에서 이전에 활성화된 T 세포에서 주로 발현되며 두 리간드인 PD-L1 및 PD-L2에 결합한다. 용어 "PD-1"은 PD-1의 단편 뿐만 아니라 대립 유전자 변이체, 스플라이스 변이체, 유도체 변이체, 치환 변이체, 결실 변이체 및/또는 삽입 변이체, 융합 폴리펩타이드, 및 종간 상동체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 관련 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 실시 양태에서, PD-1 폴리펩타이드는 리더 서열 잔기, 표적화 잔기, 아미노 말단 메티오닌 잔기, 리신 잔기, 태그 잔기 및/또는 융합 단백질 잔기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 말단 잔기를 포함한다. 바람직한 실시 양태에서, "PD-1"은 인간 PD-1(hPD-1), hPD-1의 변이체, 아형 및 종상동체, 및 hPD-1과 하나 이상의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 전체 hPD-1 서열은 진뱅크(GenBank) 수탁번호 U64863으로 찾을 수 있다.
"예정된 사멸 리간드-1(PD-L1)"(CD274, B7-H, B7H1, PDCD1L1, PDCD1LG1, PDL1 및 CD274 분자로도 공지됨)은 PD-1에 결합시 T 세포 활성화 및 사이토카인 분비를 하향조절하는 PD-1(다른 하나는 PD-L2임)에 대한 두 개의 세포 표면 당단백질 리간드 중 하나이다. 용어 "PD-L1"은 PD-L1의 단편 뿐만 아니라 대립 유전자 변이체, 스플라이스 변이체, 유도체 변이체, 치환 변이체, 결실 변이체 및/또는 삽입 변이체, 융합 폴리펩타이드, 및 종간 상동체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 관련 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 실시 양태에서, PD-1 폴리펩타이드는 리더 서열 잔기, 표적화 잔기, 아미노 말단 메티오닌 잔기, 리신 잔기, 태그 잔기 및/또는 융합 단백질 잔기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 말단 잔기를 포함한다. 바람직한 실시 양태에서, 본 명세서에 사용된 "PD-L1"은 인간 PD-L1(hPD-L1), hPD-L1의 변이체, 아형 및 종상동체, 및 hPD-L1과 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 전체 hPD-L1서열은 진뱅크(GenBank) 수탁번호 Q9NZQ7로 찾을 수 있다.
용어 "폴리펩타이드", "단백질성 분자", "펩타이드"및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체 및 이의 변이체 및 합성 유사체를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다. 따라서 이들 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 합성적 비-천연 발생 아미노산인 아미노산 중합체, 예를 들어 상응하는 자연 발생 아미노산의 화학적 유사체, 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산 중합체에 적용된다. 이들 용어는 변형, 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등을 제외하지 않는다. 대상이 되는 단백질성 분자의 가용성 형태가 특히 유용하다. 예를 들어, 치환된 연결을 갖는 비천연 아미노산 또는 폴리펩타이드를 포함하는 아미노산의 하나 이상의 유사체를 함유하는 폴리펩타이드가 정의에 포함된다.
NF-κB 수용체 활성화제 리간드(RANKL)"(종양 괴사 인자 리간드 슈퍼패밀리 멤버 11(TNFSF11), TNF-관련 활성화-유도 사이토카인(TRANCE), 오스테오프로테게린 리간드(OPGL) 및 파골세포 분화 인자(ODF)라고 공지됨)는 특히 NF-κB 수용체 활성화제(RANK)에 대한 결합을 통해 파골세포의 형성을 촉진하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 용어 "RANKL"은 RANKL의 단편 뿐만 아니라 대립 유전자 변이체, 스플라이스 변이체, 유도체 변이체, 치환 변이체, 결실 변이체 및/또는 삽입 변이체, 융합 폴리펩타이드, 및 종간 상동체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 관련 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 실시 양태에서, RANKL 폴리펩타이드는 리더 서열 잔기, 표적화 잔기, 아미노 말단 메티오닌 잔기, 라이신 잔기, 태그 잔기 및/또는 융합 단백질 잔기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 말단 잔기를 포함한다. 용어 RANKL은 인간 RANKL(hRANKL), hRANKL의 변이체, 아형 및 종상동체, 및 hRANKL와 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 전체 hRANKL 서열은 UniProt 수탁번호 O14788로 찾을 수 있다.
"NF-κB 수용체 활성화제(RANK)"(종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리, 멤버 11a, NF-κB 활성화제, CD265, FEO, LOH18CR1, ODFR, OFE, OPTB7, OSTS, PDB2 및 TRANCER로도 공지됨)는 RANK-리간드(RANKL)에 대한 수용체이자 파골세포 분화 및 활성화를 조절하는 RANK/RANKL/오스테오프로테게린(OPG) 시그널링 경로의 일부인 폴리펩타이드이다. 골 재형성 및 복구, 면역 세포 기능, 림프절 발달, 열 조절 및 유선 발달과 관련이 있다. 용어 "RANK"은 RANK의 단편 뿐만 아니라 대립 유전자 변이체, 스플라이스 변이체, 유도체 변이체, 치환 변이체, 결실 변이체 및/또는 삽입 변이체, 융합 폴리펩타이드, 및 종간 상동체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 관련 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 실시 양태에서, RANK 폴리펩타이드는 리더 서열 잔기, 표적화 잔기, 아미노 말단 메티오닌 잔기, 라이신 잔기, 태그 잔기 및/또는 융합 단백질 잔기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 말단 잔기를 포함한다. 용어 RANK은 인간 RANK(hRANK), hRANK의 변이체, 아형 및 종상동체, 및 hRANK와 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 전체 hRANK 서열은 UniProt 수탁번호 Q9Y6Q6로 찾을 수 있다.
본 명세서에 사용된 "재조합" 항원-결합 분자는, 분자의 생산이 유기체에서 목적하는 항체 구조를 인코딩하는 비-천연 DNA 서열의 발현을 포함하는 임의의 항원-결합 분자를 의미하며, 이의 비-제한적인 예는 탠덤 scFv(taFv or scFv2), 디아바디, dAb2/VHH2, 놉-인투-홀(knob-into-hole) 유도체, SEED-IgG, 헤테로Fc-scFv, Fab-scFv, scFv-Jun/Fos, Fab'-Jun/Fos, 트라이바디, DNL-F(ab)3, scFv3-CH1/CL, Fab-scFv2, IgG-scFab, IgG-scFv, scFv-IgG, scFv2-Fc, F(ab')2-scFv2, scDB-Fc, scDb-CH3, Db-Fc, scFv2-H/L, DVD-lg, tandAb, scFv-dhlx-scFv, dAb2-IgG, dAb-IgG, dAb-Fc-dAb, CrossMabs, MAb2, FIT-Ig, 및 이들의 조합물을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "조절 T 세포" 또는 "Treg"는 이펙터 T 세포를 포함하는 기타 T 세포 뿐만 아니라 선천형 면역계 세포의 활성화를 부정적으로 조절하는 T 세포를 지칭한다. Treg 세포는 이펙터 T 세포 반응의 지속적인 억제를 특징으로 한다. 일부 국면에서, Treg는 CD4+CD25+Foxp3+ T 세포이다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "대상체", "환자", "숙주" 또는 "개체"는 치료 또는 예방이 목적인 임의의 대상체, 특히 척추 동물 대상체, 더욱 특히 포유동물 대상체를 지칭한다. 본 발명의 범위에 속하는 적합한 척추 동물은 영장류(예를 들어, 인간, 원숭이 및 유인원으로, 마카크 속(Macaca)(예를 들어, 필리핀원숭이(Macaca fascicularis)와 같은 게먹이원숭이(cynomolgus monkey), 및/또는 붉은털원숭이(벵골원숭이: Macaca mulatta)) 및 개코원숭이(차크마개코원숭이: Papio ursinus), 뿐만 아니라 마모셋(비단마모셋(Callithrix) 속의 종), 다람쥐 원숭이(Saimiri 속의 종) 및 타마린(tamarin)(Saguinus 속의 종)의 원숭이 종, 뿐만 아니라 침팬지(동부 침팬지: Pan troglodytes)와 같은 유인원 종을 포함함), 설치류(예를 들어, 생쥐, 랫트, 기니피그), 토끼목(예를 들어, 래빗, 산토끼), 소류(예를 들어, 소), 양류(예를 들어, 양), 염소류(예를 들어, 염소), 돼지류(예를 들어, 돼지), 말류(예를 들어, 말), 개류(예를 들어, 개), 고양이류(예를 들어, 고양이), 조류(예를 들어, 닭, 칠면조, 오리, 거위, 카나리아, 잉꼬와 같은 반려 새 등), 해양 포유류(예를 들어, 돌고래, 고래), 파충류(뱀, 개구리, 도마뱀 등) 및 어류를 포함하는 아문 척색동물(subphylum Chordata)의 모든 멤버를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 대상체는 암에 대한 면역 반응을 유도할 필요가 있는 인간이다. 그러나, 상기 용어가 증상이 존재함을 암시하는 것은 아님 이해될 것이다.
본 발명의 제제(예를 들어, RANK 길항제 항원-결합 분자, 항-ICM 항원-결합 분자, 항-AMA 항원-결합 분자 등)와 관련하여, 용어 "치료학적 조합물", "조합하여" 등은 제제가 물리적으로 연결(예를 들어, 단일 폴리펩타이드에서 공유적으로 연결되거나 또는 복합체에서 비-공유적으로 연결)되거나, 또는 단일 조성물 또는 요법의 일부로 동시에, 함께 또는 별도로 또는 서로 다른 시간에 별도로 투여되는 상이한 조성물에서 별개의 성분으로 존재하는 조합물을 포함하는 임의의 조합물을 포함한다. 전형적으로, 본 발명의 치료학적 조합물에서 이러한 각각의 제제는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 존재할 것이다. 본 발명의 치료학적 조합물에서 제제는 각 제제의 유익한 효과가 목적하는 시간에 대상체에 의해 실현되는 투여 형태로 제공된다.
"치료", "치료하다", "치료된" 등은, 대상체에게 보호 면역을 부여하는 것을 포함하여, (1) 표적 항원의 존재 또는 비정상적인 발현과 관련된 질병 또는 병태, 또는 (2) 질병 또는 병태의 증상, 또는 (3) 질병 또는 병태에 대한 소인을 예방, 완화, 변경, 반전, 영향, 발달 또는 진행의 억제, 개선 또는 치료하는 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는 예방학적 및 치료학적 치료를 모두 포함하는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "삼중특이적 항체"는 제1 에피토프에 대한 특이성을 갖는 제1 항원-결합 도메인, 제2 에피토프에 대한 특이성을 갖는 제2 항원-결합 도메인 및 제3 에피토프에 대한 특이성을 갖는 제3 항원-결합 도메인, 예를 들어, RANK 및 CTLA4, PD-1 및 PD-L1 중 임의의 2개를 적어도 포함하는 항체를 지칭한다. 제1, 제2, 및 제3 에피토프는 동일하지 않지만(즉, 서로 다른 표적(예를 들어, 단백질)) 단일 세포 또는 적어도 두 개의 세포에 모두 존재(예를 들어, 공동-발현됨)할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "종양"은 악성 또는 양성, 모든 전-암성 및 암성 세포 및 조직이든 간에 모든 신생물 세포 성장 및 증식을 의미한다. 용어 "암" 및 "암성"은 부분적으로 조절되지 않은 세포 성장을 전형적으로 특징으로 하는 포유 동물의 생리학적 병태를 지칭하거나 설명한다. 본 명세서에 사용된 용어 "암"은 초기 단계 및 후기 단계 암을 포함하는 비-전이성 및 전이성 암을 지칭한다. 용어 "전-암성"은 전형적으로 암을 선행하거나 암으로 발전하는 병태 또는 성장을 지칭한다. "비-전이성"은 양성이거나 또는 일차 부위에 남아 있고 림프계나 혈관계 또는 일차 부위 이외의 조직으로 침투하지 않은 암을 의미한다. 일반적으로, 비-전이성 암은 0 기, I 기 또는 II 기 암이며 때로는 III 기인 임의의 암이다. "초기 암"은 침습성 또는 전이성이 아니거나 0 기, I 기 또는 II 기 암으로 분류되는 암을 의미한다. 용어 "말기 암"은 일반적으로 III 기 또는 IV 기 암을 지칭하지만, II 기 암 또는 II 기 암의 하위 단계를 지칭할 수도 있다. 당업자는 초기 암 또는 후기 암으로서의 II 기 암의 분류가 특정 유형의 암에 따라 좌우된다는 것을 이해할 것이다. 암의 구체적인 예로는 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁 경부암, 췌장암, 결장암, 폐암, 간세포암, 위암, 간암, 방광암, 요로암, 갑상선암, 신장암, 암종, 흑색종, 뇌암, 비-소세포 폐암, 두경부 편평 세포암, 자궁 내막암, 다발성 골수종, 직장암 및 식도암을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 실시 양태에서, 암은 전립선암, 폐암, 췌장암, 유방암, 난소암 및 골암으로부터 선택된다.
"벡터"는 핵산 분자, 바람직하게는 예를 들어 플라스미드, 박테리오파지 또는 식물 바이러스로부터 유래된 DNA 분자를 의미하며, 여기에 핵산 서열이 삽입되거나 클로닝될 수 있다. 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 고유한 제한 부위를 함유하고 표적 세포 또는 조직 또는 이의 전구 세포 또는 조직을 포함하는 정의된 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있거나, 또는 클로닝된 서열이 재현 가능하도록 정의된 숙주의 게놈과 통합가능할 수 있다. 이에 따라, 벡터는 자율 복제 벡터, 즉 염색체 복제와 독립적인 염색체 외 개체로 존재하는 벡터로, 예를 들어 선형 또는 폐쇄 원형 플라스미드, 염색체 외 요소, 미니 염색체 또는 인공 염색체이다. 벡터는 자가-복제를 보장하는 임의의 수단을 함유할 수 있다. 대안적으로, 벡터는 숙주 세포에 도입될 때 게놈에 통합되고 통합되는 염색체(들)와 함께 복제되는 것일 수 있다. 벡터 시스템은 단일 벡터 또는 플라스미드, 둘 이상의 벡터 또는 플라스미드를 포함할 수 있으며, 이들은 함께 숙주 세포의 게놈으로 도입될 전체 DNA 또는 트랜스포존(transposon)을 함유한다. 벡터의 선택은 전형적으로 벡터가 도입될 숙주 세포와 벡터의 호환성에 따라 좌우된다. 벡터는 또한 적합한 형질 전환체의 선택을 위해 사용할 수 있는 항생제 내성 유전자와 같은 선택 마커를 포함할 수 있다. 이러한 저항성 유전자의 예는 당업자에게 잘 공지되어 있다.
본 명세서에 기재된 각각의 실시 양태는 특별히 달리 언급되지 않는 한 각각의 모든 실시 양태에 준용된다.
2. 약어
다음 약어가 본 출원 전체에서 사용된다:
Figure pct00003
3. RANK 길항제 항원-결합 분자
본 발명은 RANKL/RANK 시그널링 경로를 길항하는 것을 포함하여 RANK 기능에 결합하고 길항하는 항원-결합 분자를 개시한다. 이들 길항제 항원-결합 분자는 골감소 장애, 근병증 및 암의 치료 또는 예방을 포함하는 다양한 적용에서 단독으로 또는 다른 제제와 조합하여 사용될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본 명세서에 개시된 항원-결합 분자는 다음을 포함한다:
(1) GFTFSSYAMH[서열 번호 3]의 VHCDR1 아미노산 서열, VVSYDGSTKS[서열 번호 4]의 VHCDR2 아미노산 서열, 및 DPALRYFDWGYFQH[서열 번호 5]의 VHCDR3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 SGDKLGDKYVC[서열 번호 6]의 VLCDR1 아미노산 서열, GDSERPS[서열 번호 7]의 VLCDR2 아미노산 서열, 및 QAWDSTTPL[서열 번호 8]의 VLCDR3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
(2) EVQLVESGGGVVQPGTSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVVSYDGSTKSYADSMKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPALRYFDWGYFQHWGQGTLVTVSS [서열 번호 1]의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYVCWYQQKPGQSPVLVIYGDSERPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTRAVDEADYYCQAWDSTTPLFGGGTNLTVL[서열 번호 2]의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(3) 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(적어도 91% 내지 99% 및 이들 사이의 모든 정수 백분율을 포함함)의 서열 동일성을 갖는 VH, 및 서열 번호 2의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(적어도 91% 내지 99% 및 이들 사이의 모든 정수 백분율을 포함함)의 서열 동일성을 갖는 VL;
(4) 서열 번호 1의 아미노산 서열 내 각 CDR 이외의 프레임워크 영역의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(적어도 91% 내지 99% 및 이들 사이의 모든 정수 백분율을 포함함)의 서열 동일성을 갖는 VH, 및 서열 번호 2의 아미노산 서열 내 각 CDR 이외의 프레임워크 영역의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(적어도 91% 내지 99% 및 이들 사이의 모든 정수 백분율을 포함함)의 서열 동일성을 갖는 VL; 또는
(5) 서열 번호 1의 아미노산 서열 내 각 CDR 이외의 프레임워크 영역의 서열에서 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5)의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호 2의 아미노산 서열 내 각 CDR 이외의 프레임워크 영역의 서열에서 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5)의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VL.
RANK 멤버인 TNFR 슈퍼패밀리(TNFRSF) 멤버는 일반적으로 TNFRSF를 올리고머화하는 각각의 리간드에 결합하여 활성화됨으로써 활성화를 유도한다. 리간드와 수용체 사이의 이러한 구조적 상호작용은 항체의 2가 특성이 의도된 표적을 길항하는 것이 아니라 이량체화하고 작용할 수 있기 때문에 치료학적 항체에 대한 도전을 북돋우게 한다. 실제로, RANK가 하나의 멤버인 TNFR 수퍼패밀리(TNFRSF)의 올리고머화는 작용 활성을 유발할 수 있으며(Wajant, H., 2015, Cell Death Differ. 22(11):1727-1741), 이는 작용 활성화로 이어지는 RANK의 항체-매개 올리고머화의 예를 포함한다(Chypre, 2016, 상기 참조). 따라서, 일부 실시 양태에서, 항원-결합 분자는 1가이고, RANK를 가교 또는 다중화하는 것은 불가능하다. 1가 항원-결합 분자는 하나의 항원 분자에만 결합할 수 있는 능력을 가짐으로써 수용체-가교 및 활성화의 위험을 피하거나 감소시킨다. 본 명세서에서 사용되는 용어인 1가 항원-결합 분자는 또한 하나 이상의 항원 결합 부위, 예를 들어 2개의 항원 결합 부위를 포함할 수 있으나, 결합 부위는 항원-결합 분자가 한 번에 하나의 RANK 분자에만 결합할 수 있도록 서로 다른 항원에 대한 결합 부위이어야한다. 1가 항원-결합 분자의 항원-결합 도메인은 VH 및 VL 도메인을 포함할 수 있지만, 일부 실시 양태에서 각각 상응하는 VL 또는 VH 도메인을 필요로 하지 않고 RANKL에 결합하는 능력을 갖는 단일 면역글로불린 가변 도메인, 즉 VH 또는 VL 도메인만을 포함할 수 있다.
항원-결합 분자의 비-제한적인 예는 다음을 포함한다: VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 Fab 단편; VL, VH, CL 및 CH1 도메인 및 CH2 도메인의 일부로 구성된 Fab' 단편; VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; 항체의 외팔의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; 단일 사슬 항체 분자(예를 들어, scFab 및 scFv); VH 도메인으로 구성된 단일 도메인 항체 (dAb) 단편(Ward 외, 1989 Nature 341: 544-546); 및 미국특허출원번호 제20080063641호 (출원인: 제넨텍(Genentech))에 기재된 것과 같은 외팔 항체 또는 예를 들어 국제공개공보 WO제2007048037호(출원인: 암젠(Amgen))에 기재된 것과 같은 다른 1가 항체.
특정 실시 양태에서, 길항제 항원-결합 분자는 Fv 단편을 포함한다. Fv 단편은 항원-결합 활성 기능을 가진 면역글로불린 분자의 가장 작은 단위이다. scFv(단일 사슬 단편 가변) 형식의 항원-결합 분자는 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역으로 구성되며, 이는 대장균(E. coli) 및 포유류 세포와 같은 발현 숙주에서 기능적 형태로 쉽게 발현될 수 있는 가요성 펩타이드 링커에 의해 함께 연결되어 단백질 공학이 친화성 증가 및 특이성 변경과 같은 scFv의 특성을 개선할 수 있도록 한다(Ahmed 외, 2012. Clin Dev Immunol. 2012: 980250). scFv 구성에서, 도메인의 순서는 VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH 중의 하나일 수 있으며 두 방향 모두 적용가능하다.
scFv에 사용되는 대부분의 링커 서열은 펜타펩타이드 GGGGS(또는 G4S 또는 Gly4Ser)의 다량체이다. 이들 다량체는 15-mer (G4S)3(참조문헌: Huston 외, 1988. Proc Natl Acad Sci U S A. 85(16), 5879-83), 18-mer GGSSRSSSSGGGGSGGGG(참조문헌: Andris-Widhopf 외, "Generation of human scFv antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences." Cold Spring Harbor Protocols, 2011(9)) 및 20-mer (G4S)4(참조문헌: Schaefer 외, "Construction of scFv Fragments from Hybridoma or Spleen Cells by PCR Assembly." In: Antibody Engineering, R. Kontermann and S. Dubel, Springer Verlag, Heidelberg, Germany (2010) 21-44 페이지)를 포함한다. 기능이 추가된 서열, 예를 들어, 흔히 특정 항체 서열과 관련하여 Cre-Lox 재조합 부위 또는 scFv 특성을 개선하는 서열을 함유하는 에피토프 태그 또는 인코딩 서열을 포함하여 많은 다른 서열이 제안되어 왔다.
scFv의 클로닝은 문헌(Schaefer 외, 2010, 상기 참조)에 기재된 바와 같이 2단계 오버랩핑 PCR(Splicing by Overlap Extension 또는 SOE-PCR이라고도 공지되어 있음)에 의해 일반적으로 수행된다. VH 및 VL 도메인은 먼저 증폭되고 겔-정제되며, 이차적으로 단일 단계의 조립 PCR에서 조립된다. 링커는 두 개의 내부 프라이머를 겹치거나 서열이 전체 링커 또는 그 이상을 커버하는 링커 프라이머를 추가하여 생성된다(3-단편 어셈블리 PCR).
일부 실시 양태에서, RANK 길항제 scFv 분자는 표 1에 제시된 바와 같은 본 명세서에 기재된 항-RANK 파지미드 클론 3A3의 VH 및 VL 서열로부터 유래된 CDR 서열을 포함한다.
중쇄 경쇄
CDR1 GFTFSSYAMH [서열 번호 3] CDR1 SGDKLGDKYVC [서열 번호 6]
CDR2 VVSYDGSTKS [서열 번호 4] CDR2 GDSERPS [서열 번호 7]
CDR3 DPALRYFDWGYFQH [서열 번호 5] CDR3 QAWDSTTPL [서열 번호 8]
이러한 유형의 대표적인 예에서, RANK 길항제 항원-결합 분자는 다음 서열을 포함한다:
EVQLVESGGGVVQPGTSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVVSYDGSTKSYADSMKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPALRYFDWGYFQHWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSsyeltqppsvsvspgqtasitcsgdklgdkyvcwyqqkpgqspvlviygdserpsgiperfsgsnsgntatltisgtravdeadyycqawdsttplfgggtnltvl [서열 번호 17],
여기서,
* 일반 대문자는 항-RANK MAb 3A3의 가변 중쇄 아미노산 서열에 상응한다.
* GGGGSGGGGSGGGGS [서열 번호 18]은 가요성 링커이다.
* 일반 소문자는 항-RANK MAb 3A3의 가변 경쇄 아미노산 서열에 상응한다.
ScFv는, 적절한 번역, 전사 시작 부위 및 포유 동물 발현의 경우 신호 펩타이드 서열이 있는 적절한 발현 벡터에 대하여, scFv에 대한 단백질 코딩 서열의 클로닝 공정시, 예를 들어 대장균 또는 포유 동물 숙주에서 재조합으로 생산될 수 있다.
다른 실시 양태에서, RANK 길항제 항원-결합 분자는 단일 항원-결합 단편(Fab) 및 Fc 영역으로 구성되거나 본질적으로 구성되며, 여기서 Fc 영역은 제1 및 제2 Fc 폴리펩타이드를 포함하고, 제1 및 제2 Fc 폴리펩타이드는 복합체로 존재한다. 이러한 전략은 예를 들어 문헌[Merchant 외 (2013. Proc Natl Acad Sci USA. 110(32):E2987-96)]에 기재된 바와 같이, c-MET에 대한 1가 결합을 입증하고 c-MET 작용을 피하는 항-c-MET 항체에 성공적으로 적용되어왔다.
Fc-함유 1가 항원-결합 분자의 재조합 발현은 종종 바람직하지 않은 2가 동종이량체 오염물을 초래할 수 있다. 돌연변이를 면역글로불린 불변 영역에 도입함으로써 폴리펩타이드 사슬 사이의 불리한 상호 작용을 지원하고 목적하지 않는 Fc 동종이량체 형성을 억제하는 변경된 구조를 생성하는 방법을 포함하여 동종이량체의 형성을 억제하는 전략이 공지되어 있다 이종이량체화를 촉진하는 이러한 전략의 비-제한적인 예는, 놉-인투-홀(KIH) 구조를 두 개의 폴리펩타이드에 도입하고 CL 및 CH1 도메인의 자연 발생 이종이량체화를 활용함을 포함한다(참조: Kontermann, 상기 참조, 1-28 페이지 (2011) Ridgway 외, 1996. Protein Eng. 9(7):617-21; Atwell 외, 1997. J Mol Biol. 270(1):26-35; WO제2005/063816호에 기재된 바와 같음). 이러한 KIH 돌연변이는 Fc를 함유하는 놉과 중쇄를 함유하는 홀의 이종이량체화를 촉진하여 1가 항체의 조립을 개선시키고 목적하지 않은 2가 항체의 수준을 감소시킨다.
상기 기재된 바와 같은 길항적 항-RANK 인간 항체의 Fc 도메인에서의 변형은 Fc 수용체 결합을 감소시킬 것이고 이에 따라 RANK의 작용적 가교에 대한 잠재력을 감소시킬 것이다. RANK에 대한 높은 상동성을 갖는 또 다른 TNFR 수퍼패밀리(TNFRSF) 멤버인 CD40 단백질에 대한 상이한 항체는 상이한 기능적 길항적 특성 대비 작용적 특성을 가지며, TNFRS의 작용성이 Fc-매개 가교시 항-TNFR 항체에 의해 부여될 수 있음을 시사한다. 예를 들어, 동형과 조합된 CD40 상의 정밀한 TNFR CRD 에피토프는 CRD1 결합 mAb가 IgG2로서 또는 FcgRIIB 가교와 함께 작용하도록 항-CD40 mAb 활성을 지시하는 것으로 나타났다(Yu 외, 2018, Cancer Cell 33:664-675). 인간 IgG(IgG1을 포함함)에서 소위 'LALA' 이중 돌연변이(Leu235Ala과 함께 Leu234Ala)는 Fc 수용체 결합 및 이펙터 기능을 크게 손상시킬 것이다(참조문헌: Lund 외, 1991, J. Immunol. 147, 2657-2662; Lund 외, 1992, Mol. Immunol. 29:53-59). 인간 IgG4의 경우, 조작 돌연변이 S228P/L235E 변이체(SPLE)는 최소한의 FcγR 결합을 앞서 입증하였다(참조문헌: Newman 외, 2001, Clin. Immunol. 98, 164-174). IgG1 또는 IgG4 Fc 도메인의 돌연변이는 결합될 수 있는데, 예를 들어 인간 IgG1의 LALA 돌연변이를 P329G의 돌연변이와 결합하거나 또는 인간 IgG4의 SPLE 돌연변이를 P329G의 돌연변이와 결합하는 것은 FcγR 및 C1q 상호 작용을 완전히 폐기할 것이다(참조문헌: Schlothauer 외, 2016, Protein Eng Des. Sel. 29, 457-466).
일부 실시 양태에서, RANK 길항제는 항-RANK 항원-결합 분자(예를 들어, MAb 또는 이의 항원-결합 단편)이고, 여기서 항체의 목적하지 않는 가교 또는 면역 이펙터 기능, 예를 들어 항체 의존성 세포-명상 세포독성(ADCC), 식균 작용(ADCP) 및 보체 의존성 세포독성(CDC)을 폐기하기 위해서, 항체의 IgG1 Fc 사슬 각각은 P329G, L235A, L234A (P329G LALA) 돌연변이를 포함하거나 또는 IgG4 Fc 사슬 각각은 P329G, S228P, L235E 돌연변이를 포함한다.
따라서, 일부 실시 양태에서, 본 발명은 경쇄, 중쇄 및 절단된 Fc 도메인의 공동 발현에 의해 생산된 1가 RANK 길항제 항원-결합 분자를 고려한다. 적합하게는, 중쇄는 홀 돌연변이 및 P329G LALA 돌연변이를 혼입하는 반면, 절단된 Fc 도메인은 놉 돌연변이 및 P329G LALA 돌연변이를 혼입한다. 일부 실시 양태에서, 항-RANK 항체는 (a) 서열 번호 1의 아미노산 서열(3A3 VH 서열), CH1 서열 및 제1 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 제1 폴리펩타이드, 및 (b) 서열 번호 2의 아미노산 서열(3A3 VL 서열), 및 CL1 서열을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 항-RANK 항체는 (c) 제2 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 제3 폴리펩타이드를 추가로 포함한다.
항-RANK 암(arm)을 포함하는 RANK 길항제 항원-결합 분자의 작용 활성에 대한 시험관내 스크리닝은 참조문헌(Schneider 외, 2014, 상기 참조; Chypre 외, 2016, 상기참조)에 기재된 바와 같이 RANK-Fas Jurkat 검정에서 RANK 길항제 항원-결합 분자의 2가 또는 1가 항체 형태를 사용하여 수행할 수 있다.
1가 RANK 길항제 항원-결합 분자를 구성하는 일 실시 형태에서, 3개의 작제물이 제조된다. 첫째, 3A3의 중쇄(VH) 도메인은 NH2-말단에서 인간 IgG1 분자(예를 들어, 아테졸리주맙)의 절단된 중쇄(CH1-CH2-CH3)와 일렬로 직접 융합되며, 여기서 중쇄 CH3 도메인은 중쇄의 KiH 이종이량체화를 촉진하기 위해 "홀(hole)"이라고 명명된 407번 위치(Y407A)에서 변경된다. 제2 작제물은 인간 IgG1 분자(예를 들어, 아테졸리주맙)의 CL과 일렬로 직접 융합된 3A3의 VL이고, 제3 작제물은 인간 IgG1 분자(예를 들어, 아테졸리주맙)의 절단된 중쇄(CH2-CH3)이며, 중쇄 CH3 도메인 중 하나는 중쇄의 KiH 이종이량체화를 촉진하기 위해 "놉"으로 명명된 366번 위치(T366W)에서 변경된다. 두 중쇄 작제물은 감소된 FcγR 및 C1q 상호 작용을 위한 L234A, L235A, P329G 치환을 포함한다.
비-제한적인 예에서,
제1 작제물은 아테졸리주맙의 절단된 중쇄(CH1-CH2-CH3)와 일렬로 직접 융합된 3A3의 중쇄(VH) 도메인으로 구성되며, 여기서 중쇄 CH3 도메인은 중쇄의 KiH 이종이량체화를 촉진하기 위해 "홀"이라고 명명된 407번 위치(Y407A)에서 변경되며, 다음 아미노산 서열을 갖는다:
EVQLVESGGGVVQPGTSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVVSYDGSTKSYADSMKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPALRYFDWGYFQHWGQGTLVTVSSastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeAAggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyastyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalGapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflAskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk [서열 번호 19],
여기서,
* 항-RANK 항체(3A3) VH 서열의 성숙한 아미노산 서열은 대문자로 표시되어 있고,
* 아테졸리주맙의 불변 영역(CH1-CH2-CH3)은 소문자로 표시되어 있고,
* 감소된 FcγR 및 C1q 상호 작용에 대한 L234A, L235A, P329G 치환 및 Y407A "홀" 치환은 굵은 대문자로 표시된다.
제2 작제물은 아테졸리주맙의 CL과 일렬로 직접 융합된 3A3의 VL이며 다음 아미노산 서열을 갖는다:
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYVCWYQQKPGQSPVLVIYGDSERPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTRAVDEADYYCQAWDSTTPLFGGGTNLTVLrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec [서열 번호 20],
여기서,
* 항-RANK 항체(3A3) VL 서열의 성숙한 아미노산 서열은 대문자로 표시되어 있고,
* 아테졸리주맙 경쇄의 불변 영역(CL)은 소문자로 표시된다.
제3 작제물은 중쇄 CH3 도메인이 아테졸리주맙의 절단된 중쇄(CH2-CH3)이며, 여기서 중쇄 CH3 도메인은 중쇄의 KiH 이종이량체화를 촉진하기 위해 "놉(knob)"으로 명명된 366번 위치(T366W)에서 변경되고, 다음 아미노산 서열을 갖는다:
CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK [서열 번호 21],
여기서,
* 아테졸리주맙의 불변 영역(CH2-CH3)의 성숙한 아미노산 서열은 대문자로 표시되어 있고,
* 감소된 FcγR 및 C1q 상호 작용에 대한 L234A, L235A, P329G 치환 및 T366W "놉" 치환은 굵은 대문자로 표시되어 있다.
RANK에 결합하고 길항하는 이러한 1가 분자는 적절한 번역, 전사 시작 부위 및 포유 동물 발현의 경우 신호 펩타이드 서열이 있는 적절한 발현 벡터와 관련하여, 작제물의 단백질 코딩 서열의 클로닝 공정시 예를 들어 대장균 또는 포유 동물 숙주에서 발현될 수 있다. 이러한 작제물의 발현 및 정제가 문헌(Merchant 외, 2013, 상기 참조)에 기재되어 있다.
1가 결합 상호 작용의 가교를 피하는 또 다른 전략은 Fc/scFv-Fc 제제에 대하여 Fc 변이체의 생성을 포함하는 것이다. 단 하나의 Fc 사슬의 N-말단에 scFv를 융합(Fc/scFv-Fc)함으로써 1가 항원 결합을 갖는 이종이량체 Fc-기반 단일특이적 항체(mAb)가 생성되었다(참조문헌: Moore 외, 2011. MAbs. 3(6): 546-557; Ha 외, 2016. Front Immunol. 7: 394). 이종이량체이고 1가인 Fc/scFv-Fc 제제를 생산하기 위해, DNA 작제물은 두 가지 다른 면역글로불린 폴리펩타이드를 인코딩하여 설계되었다. (i) Fc(힌지-CH2-CH3") 및 (ii) scFv-Fc(VH-링커-VL-힌지-CH2-CH3'). 여기서 두 개의 서로 다른 CH3 도메인인 CH3' 및 CH3"는 "놉-인투-홀" 구조를 생성하는 비대칭 변경을 나타내며, 이는 큰 아미노산(놉)을 목적하는 이종이량체의 한 사슬에 도입하고 작은 아미노산(홀)을 목적하는 이종이량체의 다른 사슬에 도입합으로써 폴리펩타이드 사슬의 이종이량체화를 촉진한다. 두 작제물은 감소된 FcγR 및 C1q 상호 작용을 위한 L234A, L235A, P329G 치환을 포함한다.
1가이고 이종이량체 Fc/scFv-Fc 항-RANK 길항제를 생성하는 일 실시 양태에서, 2개의 상이한 면역글로불린 폴리펩타이드를 인코딩하는 2개의 작제물이 설계된다:
제1 작제물은 인간 IgG1(예를 들어, 아테졸리주맙)의 절단된 중쇄(Hinge-CH2-CH3)로 구성되며, 여기서 중쇄 CH3 도메인은 중쇄의 KiH 이종이량체화를 촉진하기 위해 "홀"이라고 명명된 407번 위치(Y407A)에서 변경되며, L234A, L235A, P329G 치환을 포함하며, 다음 아미노산 서열을 갖는다:
EPKSCDKTHTastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapeAAggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyastyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalGapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflAskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk [서열 번호 22],
여기서,
* 아테졸리주맙의 CH2-CH3 서열은 소문자로 표시되며,
* 아테졸리주맙의 힌지 영역 AA 서열은 밑줄 친 대문자로 표시되며,
* 감소된 FcγR 및 C1q 상호 작용에 대한 L234A, L235A, P329G 치환 및 Y407A "홀" 치환은 굵은 대문자로 표시된다.
제2 작제물은 인간 IgG1(예를 들어, 아테졸리주맙)의 절단된 중쇄(Hinge-CH2-CH3') 서열과 일렬로 직접 융합된 항-RANK 3A3의 VH 및 VL 서열로부터 유래된 scFv 부분(VH-링커-VL)으로 구성되며, 여기서 중쇄 CH3 도메인은 중쇄의 KiH 이종이량체화를 촉진하기 위해 "놉"이라고 명명된 366번 위치(T366W)에서 변경되며, L234A, L235A, P329G 치환을 포함하며, 다음 아미노산 서열을 갖는다:
EVQLVESGGGVVQPGTSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVVSYDGSTKSYADSMKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPALRYFDWGYFQHWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSsyeltqppsvsvspgqtasitcsgdklgdkyvcwyqqkpgqspvlviygdserpsgiperfsgsnsgntatltisgtravdeadyycqawdsttplfgggtnltvlEPKSCDKTHTASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK [서열 번호 23],
여기서,
* 일반 대문자는 항-RANK MAb 3A3의 가변 중쇄 아미노산 서열에 상응하고,
* GGGGSGGGGSGGGGS [서열 번호 18]은 가요성 링커이며,
* 소문자는 항-RANK MAb 3A3의 가변 경쇄 아미노산 서열에 상응하고,
* 아테졸리주맙의 힌지 및 불변 영역(CH2-CH3)의 아미노산 서열은 밑줄 친 대문자로 표시되고,
* 감소된 FcγR 및 C1q 상호 작용에 대한 L234A, L235A, P329G 치환 및 T366W "놉" 치환은 굵은 대문자로 표시되어 있다.
1가, 이종이량체 Fc/scFv-Fc 항-RANK 길항제의 발현 및 정제는, 상기 구조를 인코딩하는 cDNA를 적절한 신호 펩타이드 인코딩 서열을 포함하고 포유류 세포, 예를 들어, 문헌(Moore 외, 2011., MAbs 3, 546-557)에 기재된 바와 같은 HEK-293 세포에서 생성된 적절한 포유류 발현 벡터로 서브-클로닝함으로써 달성될 수 있다.
4. 치료학적 조합물
본 발명자들은 2018 년 6월 5일에 출원되어 공동-계류중인 국제 출원 번호 PCT/AU2018/050557에서 RANKL/RANK 및 면역 관문 분자(ICM)를 공동-길항하는 것은 암에 대한 면역 반응에서 시너지 향상이라는 결과를 생성함을 개시하고 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 RANK 길항제 항원-결합 분자 및 항-ICM 항원-결합 분자는 대상체에서 암에 대한 면역 반응을 자극 또는 증가시키기 위한 조성물에 사용하는 것이 고려된다. 본 조성물은 일반적으로 (1) 본 명세서에 개시된 RANK 길항제 항원-결합 분자 및 (2) 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자를 사용한다. 이 조성물은 RANKL/RANK 및 ICM 경로 사이에서 새로 확인된 시너지 효과를 이용하여 종양 또는 암 부위에서 CD8+ T-세포의 국소화를 증가시킨다. 유리하게는, 상승작용적 조성물은 예를 들어, Th1-유형 사이토카인(예를 들어, IFN-γ 및/또는 IL-2)의 생산 및 증가된 비율의 다기능성 T-세포를 포함하는 향상된 이펙터 T-세포 기능을 포함하여 이펙터 세포 기능의 향상을 적절하게 자극한다.
본 발명자들은 또한 PCT/AU2018/050557에서 BatF3가 결여된 마우스에서 항-RANKL mAb IK22/5의 항-종양 효능이 제거됨을 보여주었으며, 이는 CD103+ DC-매개 교차-제시에 필수적인 역할을 시사한다. 또한 종양에서 CD11c+/MHCII+DC의 유세포 분석 결과 RANK-양성 DC의 100%가 PDL-1 및 CD103도 발현하는 것으로 나타났다. 유사 분석에서, RANK-양성 종양-침윤 대식세포에서 CD206 발현이 상당히 농축되어 있음이 나타났다. 이러한 데이터는 RANK/RANKL을 차단하면 RANK-발현 골수 세포(예를 들어, DC 또는 대식세포) 및 종양 세포, 림프구, 림프절 세포 또는 기타 기질 구성요소와 같은 RANKL-발현 세포 사이의 TME에서 면역억제 또는 관용성 축(tolerogenic axis)을 파괴하는 작용 메커니즘과 일치한다.
인간 암의 골수 세포에서 RANK 시그널링의 관용성 특성은 실험적 관찰에 의해 입증되었다. 생식기 편평 세포 암종(SCC)에서 유래된 RANKL-발현 암 세포주와 함께 배양된 인간 DC는 보다 미성숙하고 관용성의 표현형을 가졌다(참고문헌: Demoulin 외, 2015. Oncoimmunology 4, e1008334). 이들 DC는 정상적인 각질형성세포와 함께 배양된 것보다 더 높은 수준의 면역글로불린-유사 전사체 3 및 면역조절 사이토카인 IL-10을 특징으로 한다. RANKL-RANK 상호 작용은 가용성 RANKL 디코이 수용체 OPG를 공동 배양에 추가함으로써 부분적으로 가역적이기 때문에 이 표현형을 유도하는데 부분적으로 책임이 있다. 흔하지 않은 상피내 선암종인 인간 유방외파제트병(EMPD)에서 종양 내 RANK 발현은 대부분 대식세포 마커 CD163(스캐빈저 수용체 시스테인-풍부 1형 단백질 M130이라고도 공지됨), 아르기나제-1(Arg1) 및 CD206(대식세포 만노스 수용체 1)과 함께 공동 국소화되며, RANK-발현 세포가 면역억제성 M2형 종양-관련 대식세포(TAM)임을 시사한다 (Kambayashi 외, 2015. J. Invest. Dermatol. 135, 2547-2550). 따라서, 본 발명자들은 (1) 본 명세서에 기술된 RANK 길항제 항원-결합 분자 및 (2) 골수 세포의 표면에 RANK와 공동 발현되는 항원[예를 들어, An 외, 2016. Blood 128(12):1590-603; Fujimura 외, 2015. J. Invest. Dermatol. 135:2884-2887; Matsushita 외, 2010. Cancer Immunol Immunother 59:875; Georgoudaki 외, 2016. Cell Rep. 15(9):2000-2011, 대표적인 예로 PD-L1, CD206, CD103, CD200, Gal9, HVEM, CD38, CD163 및 MARCO(또한, 본 명세서에서 "보조 골수 항원"(AMA)으로 상호 교환적으로 지칭됨)를 포함한다]에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 항원-결합 분자를 포함하는 치료학적 조합물을 추가로 제안한다. 따라서, 본 명세서에 개시된 RANK 길항제 항원-결합 분자는 또한 면역(예를 들어, 암에 대한)을 자극하거나 증가시키기 위해, 면역억제 또는 내성(예를 들어, 종양에 대한)의 발생 또는 진행을 억제하거나 또는 암의 발병, 진행 또는 재발을 억제하기 위해 조성물 및 방법에서 하나 이상의 항-AMA 항원-결합 분자와 조합하여 사용하는 것이 고려된다. 이들 방법은 하나 이상의 항-AMA 항원-결합 분자와 조합하여 본 명세서에 개시된 RANK 길항제 항원-결합 분자를 포함하는 치료학적 조합물과 골수 세포를 접촉시키는 것을 적절하게 포함한다.
치료학적 조합물은 RANK 길항제 항원-결합 분자 및 적어도 하나의 항-ICM 또는 AMA 항원-결합 분자 각각을 포함하는 단일 조성물(예를 들어, 혼합물)의 형태일 수 있다. 대안적으로, RANK 길항제 항원-결합 분자 및 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자는 별도의 조성물에서 별개의 성분으로서 제공될 수 있다.
적합한 항-ICM 또는 AMA 항원-결합 분자는 재조합 항체, 모노클로날 항체(MAb), 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체 및 이러한 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 항체 및 이들의 항원-결합 단편으로부터 선택될 수 있다.
인간에게 적용하기 위해, 마우스와 같은 다른 종에서 원래 유래된 항체의 면역원성을 감소시키는 것이 흔히 바람직하다. 이것은 키메라 항체의 작제 또는 "인간화"라는 과정에 의해 수행될 수 있다. 이와 관련하여, "키메라 항체"는 상이한 종(예를 들어, 인간)으로부터 유래된 도메인(예를 들어, 불변 도메인)에 융합된 하나의 종(예를 들어, 마우스)으로부터 유래된 도메인(예를 들어, 가변 도메인)을 포함하는 항체로 이해된다.
"인간화 항체"는 인간 항체뿐만 아니라 비인간(예를 들어, 생쥐) 항체로부터의 서열을 함유하는 항체의 형태를 지칭한다. 이러한 항체는 비-인간 면역글로불린에서 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1 개, 전형적으로 2 개의 가변 도메인을 실질적으로 전부 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 루프에 상응하고, 전부 또는 실질적으로 전부의 프레임워크(FR) 영역은 인간 면역글로불린 서열의 영역이다. 또한, 인간화 항체는 선택적으로 적어도 일부의 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 일부를 포함할 것이다(참조: Jones 외, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann 외, Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr Op Struct Biol 2:593-596 (1992)). 인간화는 본질적으로 Winter 외(참조 문헌 Jones 외, supra; Riechmann 외, 상기 참조); 및 Verhoeyen 외, Science 239:1534-1536 (1988))의 방법을 따라 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 대체함으로써 수행할 수 있다. 또한, 인간 게놈으로부터 유래된 서열을 기반으로 하는 항체를 생성하는 기술, 예를 들어 파지 디스플레이 또는 형질 전환 동물을 사용하는 기술이 개발되었다(참조문헌: 국제 특허 공보 WO제90/05144호; Marks 외, (1991) By-passing immunization. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage, J Mol Biol, 222, 581-597; Knappik 외, J Mol Biol 296: 57-86, 2000; Carmen and Jermutus, Concepts in antibody phage display, Briefings in Functional Genomics and Proteomics 2002 1(2):189-203; Lonberg and Huszar, Human antibodies from transgenic mice. Int Rev Immunol 1995; 13(1):65-93; Bruggemann and Taussig, Production of human antibody repertoires in transgenic mice, Curr Opin Biotechnol 1997 8(4): 455-8). 이러한 항체는 본 발명과 관련하여 "인간 항체"이다.
치료에 사용될 수 있는 임의의 적합한 항-ICM 항원-결합 분자는 본 발명의 실시에 사용하기 위해 고려된다. 본 발명의 치료학적 조합물에 의해 길항되는 ICM은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 억제 ICM을 포함한다: PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA-4, A2AR, A2BR, CD276, VTCN1, BTLA, IDO, KIR, LAG3, TIM-3, VISTA, CD73, CD96, CD155, DNAM-1, CD112, CRTAM, OX40, OX40L, CD244, CD160, GITR, GITRL, ICOS, GAL-9, 4-1BBL, 4-1BB, CD27L, CD28, CD80, CD86, SIRP-1, CD47, CD48, CD244, CD40, CD40L, HVEM, TMIGD2, HHLA2, VEGI, TNFRS25 및 ICOLG. 적합하게는, 치료학적 조합물이 RANKL 길항제 및 단일 ICM 길항제를 포함하는 실시 양태에서, ICM은 CTLA-4 이외의 것이다.
일부 바람직한 실시 형태에서, 치료학적 조합물에 포함되는 항-ICM 항원-결합 분자는 항-PD-1 항원-결합 분자이다. 이와 관련하여, "항-PD-1 항원-결합 분자"는 면역 세포(예를 들어, T 세포, B 세포 또는 NKT 세포)에서 발현되는 PD-1에 대한 PD-L1(예를 들어, PD-L1이 암세포 표면을 발현함)의 결합을 차단하는 항원-결합 분자를 포함한다. PD-1을 대체하는 명칭 또는 동의어에는 PDCD1, PD1, CD279 및 SLEB2을 포함한다. 인간 PD-1(UniProt 수탁 번호 Q15116)의 대표적인 성숙 아미노산 서열은 아래에 제시되어 있다:
PGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL [서열 번호 10].
인간 PD-1에 결합하여 본 발명에 사용되는 MAb의 예는 다음 미국 특허 공보 US제2003/0039653호, US제2004/0213795호, US제2006/0110383호, US제2007/0065427호, US제2007/0122378호, US제2012/237522호, 및 국제 PCT 공개공보 WO제2004/072286호, WO제2006/121168호, WO제2006/133396호, WO제2007/005874호, WO제2008/083174호, WO제2008/156712호, WO제2009/024531호, WO제2009/014708호, WO제2009/114335호, WO제2010/027828호, WO제2010/027423호, WO제2010/036959호, WO제2010/029435호, WO제2010/029434호, WO제2010/063011호, WO제2010/089411호, WO제2011/066342호, WO제2011/110604호, WO제2011/110621호, 및 WO제2012/145493호(이들 전문이 본 명세서에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 본 발명의 목적에 유용한 특정 MAb는 국제 특허 공보 WO제2008/156712호에 기재된 인간화 항-PD-1 항체 h409A11, h409A16 및 h409A17 뿐만 아니라 항-PD-1 MAb 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 피딜리주맙을 포함한다.
본 발명의 항 PD-1 항원-결합 분자는 바람직하게는 PD-1의 세포외 도메인 영역에 결합한다. 예를 들어, 항 PD-1 항원-결합 분자는 아미노산 서열 SFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDR[서열 번호 9] (즉, 서열 번호 10에 제시된 천연 PD-1 서열의 62 내지 86 번 잔기) 및 SGTYLCGAISLAPKAQIKE [서열 번호 11] (즉, 서열 번호 10에 제시된 천연 PD-1 서열의 118 내지 136 번 잔기) 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 인간 PD-1의 세포외 도메인의 영역에 특이적으로 결합할 수 있다. 또 다른 예에서, 항-PD-1 항원-결합 분자는 아미노산 서열 NWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRV [서열 번호 12] (즉, 서열 번호 10에 제시된 천연 인간 PD-1 서열의 66 내지 97번 잔기에 상응함)을 포함하는 인간 PD-1의 세포외 도메인의 영역에 결합한다.
특정 실시 양태에서, 항-PD-1 항원-결합 분자는 완전 인간화 IgG4 MAb 니볼루맙(전문이 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 번호 제8,008,449호("5C4"로 지칭됨)에 상세하게 기재된 바와 같음) 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 이러한 유형의 대표적인 예에서, 항 PD-1 항원-결합 분자는 표 2에 제시된 CDR 서열을 포함한다.
중쇄 경쇄
CDR1 NSGMH [서열 번호 24] CDR1 RASQSVSSYLA [서열 번호 27]
CDR2 VIWYDGSKRYYADSVKG
[서열 번호 25]		 CDR2 DASNRAT [서열 번호 28]
CDR3 NDDYW [서열 번호 26] CDR3 QQSSNWPRT [서열 번호 29]
기타 특정 실시 양태에서, 항 PD-1 항원-결합 분자는 예를 들어 하기에 제시된 니볼루맙의 중쇄 아미노산 서열:
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK [서열 번호 30];
또는 다음의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성되는 이의 항원-결합 단편을 포함한다:
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS [서열 번호 31].
일부의 동일한 기타 실시 양태에서, 항-PD-1 항원-결합 분자는 예를 들어 하기에 제시된 니볼루맙의 경쇄 아미노산 서열:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC [서열 번호 32];
또는 다음의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성되는 이의 항원-결합 단편을 포함한다:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK [서열 번호 33].
대안적인 실시 양태에서, 항 PD-1 항원-결합 분자는 인간화 IgG4 MAb 펨브롤리주맙 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 이러한 유형의 비-제한적인 예에서, 항 PD-1 항원-결합 분자는 표 3에 제시된 CDR 서열을 포함한다.
중쇄 경쇄
CDR1 NYYMY [서열 번호 34] CDR1 RASKGVSTSGYSYLH
[서열 번호 37]
CDR2 GINPSNGGTNFNEKFKN
[서열 번호 35]		 CDR2 LASYLES [서열 번호 38]
CDR3 RDYRFDMGFDY [서열 번호 36] CDR3 QHSRDLPLT
[서열 번호 39]
일부 실시 양태에서, 항 PD-1 항원-결합 분자는 PD-1에 결합하기 위해 MAb 펨브롤리주맙과 경쟁한다.
추가의 실시 양태에서, 항 PD-1 항원-결합 분자는 예를 들어 하기에 제시된 펨브롤리주맙의 중쇄 아미노산 서열:
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK [서열 번호 40];
또는 다음의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성되는 이의 항원-결합 단편을 포함한다:
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS [서열 번호 41].
유사하게는, 항 PD-1 항원-결합 분자는 예를 들어 하기에 제시된 펨브롤리주맙의 경쇄 아미노산 서열:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC [서열 번호 42];
또는 다음의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성되는 이의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK [서열 번호 43].
이러한 유형의 또 다른 실시 양태에서, 항-PD-1 항원 결합 분자는 MAb 피딜리주맙 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 관련 실시 양태에서, 항-PD-1 항원-결합 분자는 표 4에 제시된 CDR 서열을 포함한다.
중쇄 경쇄
CDR1 NYGMN [서열 번호 44] CDR1 SARSSVSYMH [서열 번호 47]
CDR2 WINTDSGESTYAEEFKG
[서열 번호 45]		 CDR2 RTSNLAS [서열 번호 48]
CDR3 VGYDALDY [서열 번호 46] CDR3 QQRSSFPLT [서열 번호 49]
보다 구체적인 실시 양태에서, 항 PD-1 항원-결합 분자는 예를 들어 하기에 제시된 피딜리주맙의 중쇄 아미노산 서열:
QVQLVQSGSELKKPGASVKISCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLQWMGWINTDSGESTYAEEFKGRFVFSLDTSVNTAYLQITSLTAEDTGMYFCVRVGYDALDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK [서열 번호 50];
또는 다음의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성되는 이의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다:
QVQLVQSGSELKKPGASVKISCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLQWMGWINTDSGESTYAEEFKGRFVFSLDTSVNTAYLQITSLTAEDTGMYFCVRVGYDALDYWGQGTLVTVSS [서열 번호 51].
일부의 동일한 기타 실시 양태에서, 항-PD-1 항원-결합 분자는 예를 들어 하기에 제시된 피딜리주맙의 경쇄 아미노산 서열:
EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCSARSSVSYMHWFQQKPGKAPKLWIYRTSNLASGVPSRFSGSGSGTSYCLTINSLQPEDFATYYCQQRSSFPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC [서열 번호 52],
또는 다음의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성되는 이의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다:
EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCSARSSVSYMHWFQQKPGKAPKLWIYRTSNLASGVPSRFSGSGSGTSYCLTINSLQPEDFATYYCQQRSSFPLTFGGGTKLEIK [서열 번호 53].
기타 적합한 MAb는 국제 특허 공보 WO제2015/026634호에 기재되어 있으며, 이는 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. MAb 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하고, 이는 (a) 아미노산 서열: RASKSVSTSGFSYLH [서열 번호 54], LASNLES [서열 번호 55], 및 QHSWELPLT [서열 번호 56](각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3)을 갖는 경쇄 CDR 및 아미노산 서열 SYYLY [서열 번호 57], GVNPSNGGTNFSEKFKS [서열 번호 58] 및 RDSNYDGGFDY [서열 번호 59] (각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3)을 갖는 중쇄 CDR; 또는 (b) 아미노산 서열 RASKGVSTSGYSYLH [서열 번호 60], LASYLES [서열 번호 61], 및 QHSRDLPLT [서열 번호 62] (각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3)을 갖는 경쇄 CDR, 및 아미노산 서열 NYYMY [서열 번호 63], GINPSNGGTNFNEKFKN [서열 번호 64], 및 RDYRFDMGFDY [서열 번호 65] (각각 CDR1, CDR2, 및 CDR3)을 갖는 중쇄 CDR을 포함한다.
예를 들자면, 이러한 MAb는 (a) 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역 또는 이의 변이체 또는 항원-결합 단편;
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS [서열 번호 66]; 및
다음으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 또는 이의 변이체 또는 항원-결합 단편을 포함할 수 있다:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK [서열 번호 67],
IVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRASKGVSTSGYSYLHWYLQKPGQSPQLLIYLASYLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQHSRDLPLTFGQGTKLEIK [서열 번호 68], 또는
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRASKGVSTSGYSYLHWYLQKPGQSPQLLIYLASYLESGVPDRFSGSGSGTAFTLKISRVEAEDVGLYYCQHSRDLPLTFGQGTKLEIK [서열 번호 69].
추가의 예시적인 실시 양태에서, 항-PD-1 MAb는 다음을 포함하는 IgG1 중쇄, 또는 이의 변이체 또는 항원-결합 단편:
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK [서열 번호 70]; 및
다음 중 임의의 하나를 포함하는 경쇄, 또는 이의 변이체 또는 항원-결합 단편을 포함할 수 있다:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC [서열 번호 71],
EIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRASKGVSTSGYSYLHWYLQKPGQSPQLLIYLASYLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQHSRDLPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC [서열 번호 72]
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRASKGVSTSGYSYLHWYLQKPGQSPQLLIYLASYLESGVPDRFSGSGSGTAFTLKISRVEAEDVGLYYCQHSRDLPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC [서열 번호 73].
기타 실시 양태에서, ICM 길항제는 PD-L1 길항제이다. PD-L1을 대체하는 명칭 또는 동의어는 PDCD1L1, PDL1, B7H1, B7-4, CD274 및 B7-H을 포함한다. 일반적으로, PD-L1 길항제는 아래에 제시된 인간 PD-L1 (UniProt 수탁 번호 Q9NZQ7)의 천연 아미노산 서열에 특이적으로 결합한다:
MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET [서열 번호 14].
적절하게는 PD-L1 길항제는 항-PD-L1 항원-결합 분자이다. 예를 들어, 본 발명에 사용하기에 적합한 항 PD-L1 항원-결합 분자는 항-PD-L1 MAbs 더발루맙(MEDI4736), 아테졸리주맙(Tecentriq), BMS-936559/MDX-1105, MSB0010718C, LY3300054, CA-170, GNS-1480, MPDL3280A, 및 아벨루맙을 포함한다. 이들 및 기타 항-PD-L1 항체는 국제 공보 WO제2007/005874호 및 WO제2010/077634호, 및 미국 특허 제8,217,149호 및 제8,779,108호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 추가의 항-PD-L1 MAb는 국제 PCT 특허 공보 WO제2016/007,235호에 기재되어 있으며, 이의 전문이 또한 본 명세서에 참조로 포함된다.
항 PD-L1 항원-결합 분자는 PD-L1의 세포외 도메인 영역에 적합하게 결합한다. 예를 들어, 항-PD-L1 항원-결합 분자는 아미노산 서열 SKKQSDTHLEET [서열 번호 13] (즉, 서열 번호 14에 제시된 천연 PD-L1 서열의 279 내지 290 번 잔기)을 포함하는 인간 PD-L1의 세포외 도메인의 영역에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 항-PD-L1 항원-결합 분자는 완전 인간화 IgG1 MAb 더발루맙("MEDI4736"과 관련하여 국제 PCT 공개공보 WO제2011/066389호 및 미국 특허 공보 제2013/034559호에 기술되어 있고, 이의 전문이 참고로 본 명세서에 포함됨) 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 이러한 유형의 대표적인 실시 양태에서, 항-PD-L1 항원-결합 분자는 표 5에 제시된 CDR 서열을 포함한다.
중쇄 경쇄
CDR1 RYWMS [서열 번호 74] CDR1 RASQRVSSSYLA
[서열 번호 77]
CDR2 NIKQDGSEKYYVDSVK
[서열 번호 75]		 CDR2 DASSRATGIPD
[서열 번호 78]
CDR3 EGGWFGELAFDY [서열 번호 76] CDR3 QQYGSLPWT [서열 번호 79]
보다 구체적인 실시 양태에서, 항-PD-L1 항원-결합 분자는 예를 들어 하기에 제시된 더발루맙의 중쇄 아미노산 서열:
VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG [서열 번호 80],
또는 다음의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성되는 이의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다:
VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSS [서열 번호 81].
일부의 동일한 기타 실시 양태에서, 항-PD-L1 항원-결합 분자는 경쇄 아미노산 서열:
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC [서열 번호 82],
또는 다음의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성되는 이의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다:
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPWTFGQGTKVEIK [서열 번호 83].
대안적으로, 항-PD-L1 항원-결합 분자는 PD-L1에 결합하기 위해 MAb 더발루맙과 경쟁한다.
기타 실시 양태에서, 항-PD-L1 항원-결합 분자는 완전 인간화 IgG1 MAb 아테졸리주맙(전문이 본 명세서에 참고로 포함되어 있는 미국 특허 제8,217148호에 기재된 바와 같음) 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 이러한 유형의 대표적인 실시 양태에서, 항-PD-L1 항원-결합 분자는 표 6에 제시된 CDR 서열을 포함한다.
중쇄 경쇄
CDR1 GFTFSX1SWIH [서열 번호 84] CDR1 RASQX4X5X6TX7X8A
[서열 번호 87]
CDR2 AWIX2PYGGSX3YYADSVKG
[서열 번호 85]		 CDR2 SASX9LX10S [서열 번호 88]
CDR3 RHWPGGFDY [서열 번호 86] CDR3 QQX11X12X13X14PX15T
[서열 번호 89]
X1은 D 또는 G; X2는 S 또는 L; X3은 T 또는 S; X4는 D 또는 V; X5는 V 또는 I; X6은 S 또는 N; X7은 A 또는 F; X8은 V 또는 L; X9는 F 또는 T; X10은 Y 또는 A; X11은 Y, G, 또는 F; X12는 L, Y, 또는 F; X13은 Y, N, T, G, F 또는 I; X14는 H, V, P, T, 또는 I이며; X15는 A, W, R, P, 또는 T이다.
보다 구체적인 실시 양태에서, 항-PD-L1 항원-결합 분자는 예를 들어 하기에 제시된 아테졸리주맙의 중쇄 아미노산 서열:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK [서열 번호 90],
또는 다음의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성되는 이의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS [서열 번호 91].
일부의 동일한 기타 실시 양태에서, 항-PD-L1 항원-결합 분자는 예를 들어 하기에 제시된 바와 같은 아테졸리주맙의 경쇄 아미노산 서열:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC [서열 번호 92],
또는 다음의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성되는 이의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIK [서열 번호 93].
대안적으로, 항-PD-L1 항원-결합 분자는 PD-L1에 결합하기 위해 MAb 아테졸리주맙과 경쟁한다.
기타 실시 양태에서, 항-PD-L1 항원-결합 분자는 완전 인간화 IgG1 MAb 아벨루맙(전문이 본 명세서에 참고로 포함되어 있는 미국 특허 제8,217148호에 기재된 바와 같음) 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 이러한 유형의 대표적인 실시 양태에서, 항-PD-L1 항원-결합 분자는 표 7에 제시된 CDR 서열을 포함한다.
중쇄 경쇄
CDR1 X1YX2MX3 [서열 번호 94] CDR1 TGTX7X8DVGX9YNYVS
[서열 번호 97]
CDR2 SIYPSGGX4TFYADX5VKG
[서열 번호 95]		 CDR2 X10VX11X12RPS
[서열 번호 98]
CDR3 IKLGTVTTVX6Y [서열 번호 96] CDR3 SSX13X14X15X16X17RV
[서열 번호 99]
X1은 M, I, 또는 S; X2는 R, K, L, M, 또는 I; X3은 F 또는 M; X4는 F 또는 I; X5는 S 또는 T; X6은 E 또는 D; X7은 N 또는 S; X8은 T, R, 또는 S; X9는 A 또는 G; X10은 E 또는 D; X11은 I, N, 또는 S; X12는 D, H, 또는 N; X13은 F 또는 Y; X14는 N 또는 S; X15는 R, T, 또는 S, X16은 G 또는 S이고, X17은 I 또는 T이다.
구체적인 실시 양태에서, 항-PD-L1 항원-결합 분자는 예를 들어 하기에 제시된 아벨루맙의 중쇄 아미노산 서열:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK [서열 번호 100],
또는 다음의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성되는 이의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSS [서열 번호 101].
일부의 동일한 기타 실시 양태에서, 항-PD-L1 항원-결합 분자는 예를 들어 하기에 제시된 바와 같은 아벨루맙의 경쇄 아미노산 서열:
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS [서열 번호 102],
또는 다음의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성되는 이의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다:
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVL [서열 번호 103].
대안적으로, 항-PD-L1 항원-결합 분자는 PD-L1에 결합하기 위해 MAb 아벨루맙과 경쟁한다.
일부 실시 양태에서, ICM 길항제는 CTLA4의 길항제이다. CTLA4을 대체하는 명칭 또는 동의어는 ALPS5, CD, CD152, CELIAC3, CTLA-4, GRD4, GSE, IDDM12를 포함한다. 일반적으로, CTLA4 길항제는 예를 들어 아래에 제시된 인간 CTLA4(UniProt 수탁 번호 P16410)의 성숙한 아미노산 서열에 특이적으로 결합한다:
KAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN [서열 번호 16].
적절하게는 CTLA4 길항제는 항-CTLA4 항원-결합 분자이다. 예를 들어, 본 발명에 사용하기에 적합한 항-CTLA4 항원-결합 분자는 항-CTLA4 MAb 이필리무맙(BMS-734016, MDX-010, MDX-101) 및 트레멜리무맙(티실리무맙: ticilimumab, CP-675,206)을 포함한다.
항-CTLA4 항원-결합 분자는 CTLA4의 세포외 도메인 영역에 적합하게 결합한다. 예를 들어, 항-CTLA4 항원-결합 분자는 아미노산 서열 YASPGKATEVRVTVLRQA [서열 번호 15] (즉, 서열 번호 16에 제시된 천연 CTLA4 서열의 26 내지 42번 잔기), DSQVTEVCAATYMMGNELTFLDD [서열 번호 17] (즉, 서열 번호 16에 제시된 천연 CTLA4 서열의 43 내지 65번 잔기), 및 VELMYPPPYYLGIG [서열 번호 18] (즉, 서열 번호 16에 제시된 천연 CTLA4 서열의 96 내지 109번 잔기) 중 임의의 하나 이상을 포함하는 인간 CTLA4의 세포외 도메인의 영역에 특이적으로 결합할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항-CTLA4 항원-결합 분자는 성숙형 CTLA4의 다음 잔기 중 임의의 하나 이상 및 바람직하게는 모두를 포함하는 인간 CTLA4의 세포외 도메인의 영역에 특이적으로 결합할 수 있다: K1, A2, M3, E33, R35, Q41, S44, Q45, V46, E48, L91, I93, K95, E97, M99, P102, P103, Y104, Y105, L106, I108, N110.
특정 실시 양태에서, 항-CTLA4 항원-결합 분자는 인간 IgG1 MAb 이필리무맙(예를 들어, 전문이 본 명세서에 참고로 포함되어 있는 국제 공보 WO제2014/209804호 및 미국 특허 공보 제2015/0283234호에 기재된 바와 같음) 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 이러한 유형의 대표적인 예에서, 항-CTLA4 항원-결합 분자는 표 8에 제시된 CDR 서열을 포함한다.
중쇄 경쇄
CDR1 SYTMH [서열 번호 104] CDR1 RASQSVGSSYLA
[서열 번호 107]
CDR2 FISYDGNNKYYADSVKG
[서열 번호 105]		 CDR2 GAFSRAT [서열 번호 108]
CDR3 TGWLGPFDY [서열 번호 106] CDR3 QQYGSSPWT [서열 번호 109]
보다 구체적인 실시 양태에서, 항-CTLA4 항원-결합 분자는 예를 들어 하기에 제시된 바와 같은 이필리무맙의 중쇄 아미노산 서열:
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK [서열 번호 110],
또는 비-제한적인 예로, 다음 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성되는 이의 항원 결합 단편을 포함한다:
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS [서열 번호 111].
일부의 동일한 기타 실시 양태에서, 항-CTLA4 항원-결합 분자는 예를 들어 하기에 제시된 이필리무맙의 경쇄 아미노산 서열:
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC [서열 번호 112],
또는 대표적인 예로, 다음 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성되는 이의 항원 결합 단편을 포함한다:
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK [서열 번호 113].
항-CTLA4 항원-결합 분자는 인간 IgG2 MAb 트레멜리무맙(예를 들어, 전문이 본 명세서에 참고로 포함되어 있는 미국 특허 공보 제2009/0074787호에 기재된 바와 같음) 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 이러한 유형의 대표적인 예에서, 항-CTLA4 항원-결합 분자는 표 9에 제시된 CDR 서열을 포함한다.
중쇄 경쇄
CDR1 GFTFSSYGMH [서열 번호 114] CDR1 RASQSINSYLD
[서열 번호 117]
CDR2 VIWYDGSNKYYADSV
[서열 번호 115]		 CDR2 AASSLQS [서열 번호 118]
CDR3 DPRGATLYYYYYGMDV
[서열 번호 116]		 CDR3 QQYYSTPFT [서열 번호 119]
보다 구체적인 실시 양태에서, 항-CTLA4 항원-결합 분자는 예를 들어 하기에 제시된 트레멜리무맙의 중쇄 아미노산 서열:
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYIQMNSLRAEDTAVYYCARDPRGATLYYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK [서열 번호 120],
또는 대표적인 예로, 다음 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성되는 이의 항원 결합 단편을 포함한다:
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS [서열 번호 121].
일부의 동일한 기타 실시 양태에서, 항-CTLA4 항원-결합 분자는 예를 들어 하기에 제시된 트레멜리무맙의 경쇄 아미노산 서열:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINSYLDWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPFTFGPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC [서열 번호 122],
또는 대표적인 예로, 다음 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성되는 이의 항원 결합 단편을 포함한다:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINSYLDWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPFTFGPGTKVEIK [서열 번호 123].
기타 실시 양태에서, 항-ICM 항원-결합 분자는 항-B7-H3 항원-결합 분자이다. 일반적으로, B7-H3 항원-결합 분자는 예를 들어 하기에 제시된 인간 B7-H3 (UniProt 수탁 번호 Q5ZPR3)의 천연 아미노산 서열에 특이적으로 결합한다:
MLRRRGSPGMGVHVGAALGALWFCLTGALEVQVPEDPVVALVGTDATLCCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQLVHSFAEGQDQGSAYANRTALFPDLLAQGNASLRLQRVRVADEGSFTCFVSIRDFGSAAVSLQVAAPYSKPSMTLEPNKDLRPGDTVTITCSSYQGYPEAEVFWQDGQGVPLTGNVTTSQMANEQGLFDVHSILRVVLGANGTYSCLVRNPVLQQDAHSSVTITPQRSPTGAVEVQVPEDPVVALVGTDATLRCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQLVHSFTEGRDQGSAYANRTALFPDLLAQGNASLRLQRVRVADEGSFTCFVSIRDFGSAAVSLQVAAPYSKPSMTLEPNKDLRPGDTVTITCSSYRGYPEAEVFWQDGQGVPLTGNVTTSQMANEQGLFDVHSVLRVVLGANGTYSCLVRNPVLQQDAHGSVTITGQPMTFPPEALWVTVGLSVCLIALLVALAFVCWRKIKQSCEEENAGAEDQDGEGEGSKTALQPLKHSDSKEDDGQEIA [서열 번호 124].
적합하게는, 본 발명에 사용하기에 적합한 항-B7-H3 항원-결합 분자는 MAb 에노블리투주맙(enoblituzumab) 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 실시 양태에서, 항-B7-H3 항원-결합 분자는 표 10에 제시된 CDR 서열을 포함한다.
중쇄 경쇄
CDR1 FGMH [서열 번호 125] CDR1 KASQNVDTNVA
[서열 번호 128]
CDR2 YISSDSSAIYYADTVK
[서열 번호 126]		 CDR2 SASYRYS [서열 번호 129]
CDR3 GRENIYYGSRLDY [서열 번호 127] CDR3 QQYNNYPFT [서열 번호 130]
보다 구체적인 실시 양태에서, 항-B7-H3 항원-결합 분자는 예를 들어 하기에 제시된 에노블리투주맙의 중쇄 아미노산 서열:
VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSDSSAIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCGRGRENIYYGSRLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELVGGPSVFLLPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTLRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPLVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK [서열 번호 131],
또는 대표적인 예로, 다음 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성되는 이의 항원 결합 단편을 포함한다:
VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSDSSAIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCGRGRENIYYGSRLDYWGQGTTVTVSS [서열 번호 132].
일부의 동일한 기타 실시 양태에서, 항-B7-H3 항원-결합 분자는 예를 들어 하기에 제시된 에노블리투주맙의 경쇄 아미노산 서열:
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNNYPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC [서열 번호 133],
또는 대표적인 예로, 다음 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성되는 이의 항원 결합 단편을 포함한다:
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNNYPFTFGQGTKLEIK [서열 번호 134].
일부 대안적인 실시 양태에서, 항-B7-H3 항원-결합 분자는 B7-H3에 결합하기 위해 MAb 에노블리투주맙과 경쟁한다.
일부 실시 양태에서, 항-ICM 항원-결합 분자는 항-KIR 항원-결합 분자이다. 이러한 유형의 바람직한 실시 양태에서, 항-KIR 항원-결합 분자는 KIR2-DL-1, -2 및 -3과 이들의 리간드 사이의 상호 작용을 차단한다. 예를 들어, 인간 KIR의 성숙 아미노산 서열, 즉 KIR2-DL1 (UniProt 수탁 번호 P43626)은 아래에 제공되어 있다:
HEGVHRKPSLLAHPGPLVKSEETVILQCWSDVMFEHFLLHREGMFNDTLRLIGEHHDGVSKANFSISRMTQDLAGTYRCYGSVTHSPYQVSAPSDPLDIVIIGLYEKPSLSAQPGPTVLAGENVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHERRLPAGPKVNGTFQADFPLGPATHGGTYRCFGSFHDSPYEWSKSSDPLLVSVTGNPSNSWPSPTEPSSKTGNPRHLHILIGTSVVIILFILLFFLLHRWCSNKKNAAVMDQESAGNRTANSEDSDEQDPQEVTYTQLNHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDIIVYTELPNAESRSKVVSCP [서열 번호 135].
본 발명에 사용하기에 적합한 항-KIR 항원-결합 분자는 당업계에 잘 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 대안적으로, 당업계에서 인정된 KIR 항원-결합 분자를 사용할 수 있다. 예를 들어, 항-KIR 항원-결합 분자는 예를 들어 전문이 본 명세서에 참조로 포함되는 WO제2014/066532호에 기재된 바와 같이 완전 인간화 MAb 리릴루맙(lirilumab) 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 적합하게는, 항-KIR 항원-결합 분자는 표 11에 제시된 CDR 영역을 포함한다.
중쇄 경쇄
CDR1 FYAIS [서열 번호 136] CDR1 RASQSVSSYLA [서열 번호 139]
CDR2 GFIPIFGAANYAQKFQ
[서열 번호 137]		 CDR2 DASNRAT [서열 번호 140]
CDR3 IPSGSYYYDYDMDV
[서열 번호 138]		 CDR3 QQRSNWMYT [서열 번호 141]
이러한 유형의 대표적인 실시 양태에서, 항-KIR 항원-결합 분자는 예를 들어 하기에 제시된 리릴루맙의 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열:
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSFYAISWVRQAPGQGLEWMGGFIPIFGAANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSDDTAVYYCARIPSGSYYYDYDMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK [서열 번호 142],
또는 대표적인 예로 다음 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성되는 이의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다:
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSFYAISWVRQAPGQGLEWMGGFIPIFGAANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSDDTAVYYCARIPSGSYYYDYDMDVWGQGTTVTVSS [서열 번호 143].
일부의 동일한 기타 실시 양태에서, 항-KIR 항원-결합 분자는 예를 들어 하기에 제시된 리릴루맙의 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열:
EIVLTQSPVTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWMYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC [서열 번호 144],
또는 대표적인 예로, 다음 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성되는 이의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다:
EIVLTQSPVTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWMYTFGQGTKLEIKRT [서열 번호 145].
대안적인 실시 양태에서, 항-ICM 항원-결합 분자는 항-LAG-3 항원-결합 분자이다. LAG-3은 4 개의 세포외 Ig-유사 도메인이 있는 503 아미노산 유형 I 막관통(transmembrane) 단백질이다. LAG-3은 활성화된 T-세포, NK 세포, B-세포 및 형질세포양 DC에서 발현된다. 인간 LAG-3(UniProt 수탁 번호 P18627)의 대표적인 성숙 아미노산 서열은 아래에 제시되어 있다:
LQPGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPPTPLTVYAGAGSRVGLPCRLPAGVGTRSFLTAKWTPPGGGPDLLVTGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYTCHIHLQEQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPVSGQERFVWSSLDTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLYQGERLLGAAVYFTELSSPGAQRSGRAPGALPAGHLLLFLILGVLSLLLLVTGAFGFHLWRRQWRPRRFSALEQGIHPPQAQSKIEELEQEPEPEPEPEPEPEPEPEPEQL [서열 번호 146].
일부 실시 양태에서, 항-LAG-3 항원-결합 분자는 적합하게는 항-LAG3 인간화 MAb, BMS-986016이다. 다른 항-LAG-3 항체는 각각의 전문이 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 공보 제2011/0150892호 및 국제 PCT 공개공보 WO제2010/019570호 및 WO제2014/008218호에 기재되어 있다.
일부 실시 양태에서, 항-LAG-3 항원-결합 분자는 표 12에 제시된 CDR 서열을 포함한다.
중쇄 경쇄
CDR1 DYYWN [서열 번호 147] CDR1 RASQSISSYLA
[서열 번호 150]
CDR2 EINHRGSTNSNPSLKS
[서열 번호 148]		 CDR2 DASNRAT [서열 번호 151]
CDR3 GYSDYEYNWFDP [서열 번호149] CDR3 QQRSNWPLT
[서열 번호 152]
항-LAG-3 항원-결합 분자는 적합하게는 MAb BMS-986016 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 보다 구체적으로, 일부 실시 양태에서, 항-LAG-3 항원-결합 분자는 예를 들어 하기에 제시된 BMS-986016의 중쇄 아미노산 서열:
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSDYYWNWIRQPPGKGLEWIGEINHRGSTNSNPSLKSRVTLSLDTSKNQFSLKLRSVTAADTAVYYCAFGYSDYEYNWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK [서열 번호 153],
또는 대표적인 예로, 다음 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성되는 이의 항원 결합 단편을 갖는다:
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSDYYWNWIRQPPGKGLEWIGEINHRGSTNSNPSLKSRVTLSLDTSKNQFSLKLRSVTAADTAVYYCAFGYSDYEYNWFDPWGQGTLVTVSS [서열 번호 154].
유사하게는, 항-LAG-3 항원-결합 분자는 이의 항원-결합 단편의 서열 번호 45에 제시되고 하기에 제공된 바와 같은 BMS-986016의 경쇄 아미노산 서열:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTNLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC [서열 번호 156]
또는 대표적인 예로 다음 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성되는 이의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTNLEIK [서열 번호 157].
치료에 사용될 수 있는 임의의 적합한 항-AMA 항원-결합 분자가 또한 본 발명의 RANK 길항제 항원-결합 분자와 조합하여 사용하는 것이 고려된다.
5. 다중특이적 항원-결합 분자
RANK 길항제 항원-결합 분자와 항-ICM 또는 항-AMA 항원-결합 분자가 동일한 조성물에서 제공되는 일부 실시 양태에서, 이들 분자는 다중-특이적 항원-결합 분자의 형태로 함께 접합된다.
다중-특이적 항원-결합 분자의 대표적인 예로는 탠덤(tandem) scFv(taFv 또는 scFv2), 디아바디, dAb2/VHH2, 놉-인투-홀 유도체, SEED-IgG, 헤테로Fc-scFv, Fab-scFv, scFv-Jun/Fos, Fab'-Jun/Fos, 트라이바디, DNL-F(ab)3, scFv3-CH1/CL, Fab-scFv2, IgG-scFab, IgG-scFv, scFv-IgG, scFv2-Fc, F(ab')2-scFv2, scDB-Fc, scDb-CH3, Db-Fc, scFv2-H/L, DVD-Ig, tandAb, scFv-dhlx-scFv, dAb2-IgG, dAb-IgG, dAb-Fc-dAb 및 이들의 조합물을 포함한다. 특정 실시 양태에서, 합성 또는 재조합 항원-결합 분자는 IgG-유사 항체(예를 들어, 트리오맙(triomab)/쿼드로마(quadroma), 트리온 파마(Trion Pharma)사/프레제니우스 바이오테크(Fresenius Biotech)사); 놉-인투-홀, 제넨텍(Genentech)사; 크로스맙, 로슈(Roche)사; 정전기적으로 매칭된 항체, 암젠(AMGEN)사; LUZ-Y, 제넨텍사; 가닥 교환 조작된 도메인(SEED) 본체, EMD 세로노(Serono)사; 바이오로닉, 메루스(Merus)사; 및 Fab-교환된 항체, 젠맵(Genmab)사), 대칭 IgG-유사 항체(예를 들어, 이중 표적화(DT)-Ig, GSK/도만티스(Domantis)사; 투-인-원 항체, 제넨텍사; 가교된 MAb, 카르마노스 암 센터; MAb2, F-스타(star)사; 및 코이 엑스-바디(Coy X-body), 코이 엑스(Coy X)/화이자(Pfizer)사), IgG 융합체(예를 들어, 이중 가변 도메인(DVD)-Ig, 애보트(Abbott)사; IgG-유사 이중특이적 항체, 일라이 릴리(Eli Lilly)사; Ts2Ab, 메드이뮨(Medimmune)/AZ사; BsAb, 자이모제네틱스(ZymoGenetics)사; HERCULES, 바이오젠 아이덱(Biogen Idec)사; TvAb, 로슈사), Fc 융합체(예를 들어, ScFv/Fc 융합체, 아카데믹 인스티튜션(Academic Institution); 스콜피온(SCORPION), 이머전트 바이오솔루션스(Emergent BioSolutions)사/트루비온(Trubion)사, 자이모제네틱스(ZymoGenetics)사/BMS사; 이중 친화성 리타겟팅 기술(Fc-DART), 매크로제닉스(MacroGenics)사; 듀얼 (ScFv)2-Fab, 국립 항체 의학 연구 센터), Fab 융합체(예를 들어, F(ab)2, 메다렉스(Medarex)사/암젠사; 듀얼 액션 또는 Bis-Fab, 제넨텍사; 독-앤-록(Dock-and-Lock: DNL), 이뮤노메딕스(ImmunoMedics)사; 2가 이중특이적, 바이오테크놀(Biotechnol)사; 및 Fab-Fv, UCB-셀텍(Celltech)사), ScFv-및 디아바디-기반 항체(예를 들어, 이중특이적 T 세포 관여자(BiTE)), 마이크로멧(Micromet)사; 탠덤 디아바디(Tandab), 어피메드(Affimed)사; DART, 매크로제닉스(MacroGenics)사; 단일 사슬 디아바디, 아카데믹(Academic); TCR-유사 항체, AIT, 리셉터로직스(Receptor Logics)사; 인간 혈청 알부민 ScFv 융합체, 메리맥(Merrimack)사; 및 콤보디스(COMBODIES), 에피겐 바이오테크(Epigen Biotech)사), IgG/비-IgG 융합체(예를 들어, 면역사이토킨, EMD세로노사, 필로젠(Philogen)사, 이뮤진(ImmunGene)사, 이뮤노메딕스사; 초항원 융합 단백질, 액티브 바이오테크(Active Biotech)사; 및 암에 대한 면역 동원 mTCR, ImmTAC) 및 올리고클론 항체(예를 들어, 심포젠(Symphogen)사 및 메루스사)로부터 선택된다.
다중-특이적 항원-결합 분자의 다른 비-제한적 예는 FIT-Ig (Fabs-in-tandem immunoglobulin)(참조문헌: Gong 외, 2017. MAbs. 9(7):1118-1128. doi: 10.1080/19420862.2017.1345401. Epub 2017 Jul 10. PubMedPMID: 28692328; PubMed Central PMCID: PMC5627593)을 포함하고, 둘 이상의 항원을 결합할 수 있다. FIT-Ig 분자의 설계에서, 모 mAb의 두 Fab 도메인은 십자 방향으로 일렬로 직접 융합된다. 포유류 세포에서 공동-발현될 때 3개의 단편이 조립되어 4가 다중-특이적인 FIT-Ig 분자를 형성한다. 예를 들어, 이중특이적 결합 단백질은 두 개의 모 단일클론 항체, mAb A(항원 A에 결합함) 및 mAb B(항원 B에 결합함)를 사용하여 FIT-Ig로 작제될 수 있다. FIT-Ig 분자의 설계에서, 모 mAb의 두 Fab 도메인은 십자 방향으로 일렬로 직접 융합된다. 포유류 세포에서 공동-발현될 때 3개의 단편이 조립되어 4가 다중-특이적인 FIT-Ig 분자를 형성한다. 대표적인 실시 양태에서, FIT-Ig는 RANK 및 적어도 하나의 ICM 또는 적어도 하나의 AMA를 길항하기 위한 다중-특이적 항원-결합 분자를 제공한다. 이러한 다중-특이적 항원-결합 분자는 RANK에 대해 특이적으로 결합하고 길항하는 이의 FIT-Ig 분자로서 구성된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 각각의 ICM 또는 AMA의 경우, ICM 또는 AMA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 일반적으로 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 본질적으로 구성되어 있다. 적어도 하나의 항-ICM 항체 또는 항원-결합 단편은 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 단편, 항-PD-L1 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 항-CTLA-4 항체 또는 항원-결합 단편으로부터 적절하게 선택되고, FIT-Ig 분자에 혼입된다. 다중-특이적 항원-결합 분자가 PD-1에 길항하는 일부 실시 양태에서, 다중-특이적 항원-결합 분자는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 다중-특이적 항원-결합 분자가 PD-L1에 길항하는 일부 실시 양태에서, 다중-특이적 항원-결합 분자는 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 다중-특이적 항원-결합 분자가 CTLA4에 길항하는 일부 실시 양태에서, 다중-특이적 항원-결합 분자는 항-CTLA4 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
추가로, 적어도 하나의 항-AMA 항체 또는 항원-결합 단편은 항-PD-L1 항체 또는 항원-결합 단편, 항-CD206 항체 또는 항원-결합 단편, 항-CD103 항체 또는 항원-결합 단편, 항-CD200 항체 또는 항원-결합 단편, 항-CD200 항체 또는 항원-결합 단편, 항-Gal9 항체 또는 항원-결합 단편, 항-HVEM 항체 또는 항원-결합 단편, 항-CD38 항체 또는 항원-결합 단편, 항-CD163 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 항-MARCO 항체 또는 항원-결합 단편으로부터 적절하게 선택되고, FIT-Ig 분자에 혼입된다. 따라서, 다중-특이적 항원-결합 분자가 CD206에 길항하는 일부 실시 양태에서, 다중-특이적 항원-결합 분자는 항-CD206 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 다중-특이적 항원-결합 분자가 PD-L1에 길항하는 일부 실시 양태에서, 다중-특이적 항원-결합 분자는 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 다중-특이적 항원-결합 분자가 CD103에 길항하는 일부 실시 양태에서, 다중-특이적 항원-결합 분자는 항-CD103 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 다중-특이적 항원-결합 분자가 CD200에 길항하는 일부 실시 양태에서, 다중-특이적 항원-결합 분자는 항-CD200 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 다중-특이적 항원-결합 분자가 HVEM에 길항하는 일부 실시 양태에서, 다중-특이적 항원-결합 분자는 항-HVEM 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 다중-특이적 항원-결합 분자가 CD38에 길항하는 일부 실시 양태에서, 다중-특이적 항원-결합 분자는 항-CD38 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 다중-특이적 항원-결합 분자가 CD163에 길항하는 일부 실시 양태에서, 다중-특이적 항원-결합 분자는 항-CD163 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 다중-특이적 항원-결합 분자가 MARCO에 길항하는 일부 실시 양태에서, 다중-특이적 항원-결합 분자는 항-MARCO 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 제1 항원 결합 특이성을 갖는 항원-결합 분자는 하나 이상의 다른 분자 개체, 예를 들어 이중특이적 항원-결합 분자를 생성하기 위한 제2 항원-결합 특이성을 갖는 또 다른 항원-결합 분자에 기능적으로 연결(예를 들어, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 회합 등에 의함)될 수 있다. 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 특정 예시적인 다중특이적 형식은, 단일 사슬 디아바디(scDb), 탠덤 scDb(Tandab), 선형 이량체 scDb(LD-scDb), 원형 이량체 scDb(CD-scDb), 이중특이적 T-세포 참여자(BiTE; 탠덤 di-scFv), 이황화-안정화 Fv 단편 (Brinkmann 외, Proc Natl Acad Sci USA. 1993; 90: 7538-7542), 탠덤 tri-scFv, 트라이바디, 이중특이적 Fab2, 디-미니항체, 테트라바디, scFv-Fc-scFv 융합, 디-디아바디, DVD-Ig, IgG-scFab, scFab-dsscFv, Fv2-Fc, IgG-scFv 융합, 예를 들어 bsAb(경쇄의 C-말단에 연결된 scFv), Bs1Ab(경쇄의 N-말단에 연결된 scFv), Bs2Ab(중쇄의 N-말단에 연결된 scFv), Bs3Ab(중쇄의 C-말단에 연결된 scFv), Ts1Ab(중쇄 및 경쇄의 N-말단에 연결된 scFv), Ts2Ab(중쇄의 C-말단에 연결된 dsscFv) 및 놉-인투-홀(KiHs)(KiH 기술에 의해 제조된 이중특이적 IgG) SEED 기술(SEED-IgG) 및 듀오바디(DuoBodies: DuoBody 기술에 의해 제조된 이중특이적 IgG), VH 및 VL 도메인을 제한없이 포함하며, 각각은 하나의 기능적 Fv 도메인이 형성되도록 KiH 또는 듀오바디의 2 개의 상이한 중쇄의 하나의 C-말단에 융합된다. 본 명세서에서 사용하기에 특히 적합한 것은 단일 사슬 디아바디(scDb), 특히 이중특이적 단량체 scDb이다. 다양한 다중특이적 구조를 논의하고 제시하는 검토용 문헌은 예를 들어 문헌(Chan Carter, Nature Reviews Immunology 10 (2010) 301-316; Klein 외, MAbs 4(2012) 1-11; Schubert 외, Antibodies 1 (2012) 2-18; Byrne 외, Trends in Biotechnology 31 (2013) 621; Metz 외, Protein Engineering Design & Selection 25(2012) 571-580)이 있으며, 이들은 본 명세서에 참조로 인용되어 있다.
특정 실시 양태에서, 본 발명은 RANK에 특이적으로 결합하고 길항하는 제1 항원-결합 분자(예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편) 및 ICM에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 분자(예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편)을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자를 제공한다. 이중특이적 항원-결합 분자는 적절하게는 상기 및 본 명세서의 다른 부분에서 상세히 기재된 임의의 항원-결합 분자를 포함한다.
예를 들자면, 제1 항원-결합 분자는 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자이고, 제2 항원-결합 분자는 인간 PD-1의 영역, 바람직하게는 인간 PD-1의 세포외 도메인 영역에 특이적으로 결합할 수 있다.
이들 실시 양태의 비-제한적인 예는 표 1에 제시된 CDR 서열을 포함하는 제1 항원-결합 분자를 포함한다. 제2 항원-결합 분자는 표 2 내지 4 중 임의의 하나에 기재된 CDR 서열을 적절하게 포함한다. 이러한 유형의 특정 예에서, 제2 항원-결합 분자는 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 피딜리주맙으로부터 선택된 MAb 중 임의의 하나의 항원-결합 단편을 적어도 포함할 수 있다.
다른 실시 양태에서, 제2 항원-결합 분자는 인간 PD-L1의 영역, 바람직하게는 인간 PD-L1의 세포외 도메인 영역에 특이적으로 결합한다. 따라서, 일부 실시 양태에서, 제2 항원-결합 분자는 PD-L1의 영역에 특이적으로 결합하고 표 5 내지 7 중 임의의 하나에 제시된 CDR 서열을 포함한다. 이러한 유형의 구체적인 예에서, 제2 항원-결합 분자는 더발루맙, 아테졸리주맙 및 아벨루맙으로부터 선택된 MAb 중 임의의 하나의 항원-결합 단편을 적어도 포함할 수 있다.
또 다른 실시 양태에서, 제2 항원-결합 분자는 인간 CTLA4의 영역에 특이적으로 결합한다. 따라서, 일부 실시 양태에서, 제2 항원-결합 분자는 CTLA4에 특이적으로 결합하고 표 8 내지 9 중 임의의 하나에 제시된 CDR 서열을 포함한다. 이러한 유형의 구체적인 예에서, 제2 항원-결합 분자는 이필리무맙 및 트레멜리무맙으로부터 선택된 MAb 중 임의의 하나의 항원-결합 단편을 적어도 포함할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본 발명은 RANK에 특이적으로 결합하고 길항하는 제1 항원-결합 분자(예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편) 및 AMA에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 분자(예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편)을 포함하는 이중특이적 항원-결합 분자를 제공한다.
이들 실시 양태의 대표적인 예에서, 제1 항원-결합 분자는 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자이고, 제2 항원-결합 분자는 인간 PD-1의 영역, 바람직하게는 인간 PD-1의 세포외 도메인의 영역에 특이적으로 결합할 수 있다.
다른 대표적인 예에서, 제1 항원-결합 분자는 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자이고, 제2 항원-결합 분자는 인간 CD206의 영역, 바람직하게는 인간 CD206의 세포외 도메인의 영역에 특이적으로 결합할 수 있다.
다른 대표적인 예에서, 제1 항원-결합 분자는 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자이고, 제2 항원-결합 분자는 인간 CD103의 영역, 바람직하게는 인간 CD103의 세포외 도메인의 영역에 특이적으로 결합할 수 있다.
또 다른 대표적인 예에서, 제1 항원-결합 분자는 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자이고, 제2 항원-결합 분자는 인간 CD200의 영역, 바람직하게는 인간 CD200의 세포외 도메인의 영역에 특이적으로 결합할 수 있다.
다른 대표적인 예에서, 제1 항원-결합 분자는 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자이고, 제2 항원-결합 분자는 인간 Gal9의 영역, 바람직하게는 인간 Gal9의 세포외 도메인의 영역에 특이적으로 결합할 수 있다.
다른 대표적인 예에서, 제1 항원-결합 분자는 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자이고, 제2 항원-결합 분자는 인간 HVEM의 영역, 바람직하게는 인간 HVEM의 세포외 도메인의 영역에 특이적으로 결합할 수 있다.
추가의 대표적인 예에서, 제1 항원-결합 분자는 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자이고, 제2 항원-결합 분자는 인간 CD38의 영역, 바람직하게는 인간 CD38의 세포외 도메인의 영역에 특이적으로 결합할 수 있다.
다른 대표적인 예에서, 제1 항원-결합 분자는 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자이고, 제2 항원-결합 분자는 인간 CD163의 영역, 바람직하게는 인간 CD163의 세포외 도메인의 영역에 특이적으로 결합할 수 있다.
또 다른 대표적인 예에서, 제1 항원-결합 분자는 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자이고, 제2 항원-결합 분자는 인간 MARCO의 영역, 바람직하게는 인간 MARCO의 세포외 도메인의 영역에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명은 또한 RANK 길항제 항원-결합 분자 및 2개 이상의 ICM에 대한 특이성을 갖는 복수의 ICM 길항제 항원-결합 분자를 포함하는 다중특이적 작제물을 제공한다. 비-제한적인 예에서, 복수의 ICM 길항제 항원-결합 분자는 (1) PD-1 및 PD-L1, (2) PD-1 및 CTLA4, (3) PD-L1 및 CTLA4 및 (4) PD-1, PD-L1 및 CTLA4로부터 선택된 ICM 조합물에 대한 특이성을 갖는다. 다중특이적 작제물은 본 명세서에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하여, 특정 ICM 조합물에 대한 특이성을 갖는 임의의 적합한 항체 또는 항원-결합 단편을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 RANK 길항제 항원-결합 분자 및 2개 이상의 AMA에 대한 특이성을 갖는 복수의 AMA 길항제 항원-결합 분자를 포함하는 다중특이적 작제물을 제공한다. 비-제한적인 예에서, 복수의 AMA 길항제 항원-결합 분자는, (1) PD-L1 및 CD206, (2) PD-L1 및 CD103, (3) PD-L1 및 CD200, (4) PD-L1 및 Gal9, (5) PD-L1 및 HVEM, (6) PD-L1 및 CD38, (7) PD-L1 및 CD163, (8) PD-L1 및 MARCO, (9) CD206 및 CD103, (10) CD206 및 CD200, (11) CD206 및 Gal9, (12) CD206 및 HVEM, (13) CD206 및 CD38, (14) CD206 및 CD163, (15) CD206 및 MARCO, (16) CD103 및 CD200, (17) CD103 및 Gal9, (18) CD103 및 HVEM, (19) CD103 및 CD38, (20) CD103 및 CD163, (21) CD103 및 MARCO, (22) CD200 및 Gal9, (23) CD200 및 HVEM, (24) CD200 및 CD38, (25) CD200 및 CD163, (26) CD200 및 MARCO, (27) Gal9 및 HVEM, (28) Gal9 및 CD38, (29) Gal9 및 CD163, (30) Gal9 및 MARCO, (31) HVEM 및 CD38, (32) HVEM 및 CD163, (33) HVEM 및 MARCO, (34) CD38 및 CD163, (35) CD38 및 MARCO, (36) CD163 및 MARCO, (37) PD-L1, CD206 및 CD103, (38) PD-L1, CD206 및 CD200, (39) PD-L1, CD206 및 Gal9, (40) PD-L1, CD206 및 HVEM, (41) PD-L1, CD206 및 CD38, (42) PD-L1, CD206 및 CD163, (43) PD-L1, CD206 및 MARCO, (44) CD206, CD103 및 CD200, (45) CD206, CD103 및 Gal9, (46) CD206, CD103 및 HVEM, (47) CD206, CD103 및 CD38, (48) CD206, CD103 및 CD163, (49) CD206, CD103 및 MARCO, (50) CD103, CD200 및 Gal9, (51) CD103, CD200 및 HVEM, (52) CD103, CD200 및 CD38, (53) CD103, CD200 및 CD163, (54) CD103, CD200 및 MARCO, (55) CD200, Gal9 및 HVEM, (56) CD200, Gal9 및 CD38, (57) CD200, Gal9 및 CD163, (58) CD200, Gal9 및 MARCO, (59) Gal9, HVEM 및 CD38, (60) Gal9, HVEM 및 CD163, (61) Gal9, HVEM 및 MARCO, (62) HVEM, CD38 및 CD163, (63) HVEM, CD38 및 MARCO, (64) CD38, CD163 및 MARCO에서 선택된 AMA 조합물에 대한 특이성을 갖는다. 다중특이적 작제물은 본 명세서에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하여, 특정 ICM 조합물에 대한 특이성을 갖는 임의의 적합한 항체 또는 항원-결합 단편을 포함할 수 있다.
본 발명의 다중특이적 항원-결합 분자는 당업계에 널리 공지된 임의의 수의 방법에 의해 생성될 수 있다. 적합한 방법으로는 생물학적 방법(예를 들어, 체세포 혼성화), 유전적 방법(예를 들어, 유기체에서 목적하는 항체 구조를 인코딩하는 비 천연 DNA 서열의 발현), 화학적 방법(예를 들어, 두 항체의 화학적 접합) 또는 이들의 조합을 포함한다(참조문헌: Kontermann R E (ed.), Bispecific Antibodies, Springer Heidelberg Dordrecht London New York, 1-28 (2011)).
5.1 이중특이적 항원-결합 분자를 생산하는 화학적 방법.
화학적으로 접합된 이중특이적 항원-결합 분자는 상기 및 본 명세서의 다른 부분에 기재된 바와 같은 2 개의 기존 항체 또는 항체 단편의 화학적 커플링으로 발생한다. 전형적인 커플링에는 두 개의 상이한 전장 항체를 가교하고, 두 개의 상이한 Fab' 단편을 가교하여 이중특이적 F(ab')2를 생산하고, F(ab')2 단편을 상이한 Fab' 단편과 가교하여 이중특이적 F(ab')3을 생산함을 포함한다. 화학적 접합의 경우, 산화적 재-회합(re-association) 전략을 사용할 수 있다. 현재의 방법은 동종- 또는 이종 이기능성 가교 시약(상동)을 사용하는 것을 포함한다.
이종 이기능성 가교 시약은 예를 들어 항체 분자에서 두 개의 별개의 반응성 그룹에 대한 반응성을 가지고 있다. 이종 이기능성 가교 시약의 예는, SPDP(N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트), SATA(숙신이미딜 아세틸티오아세테이트), SMCC(숙신이미딜 트랜스-4-(말레이미딜메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트), EDAC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드), PEAS(N-((2-피리딜디티오)에틸)-4-아지도살리실아미드), ATFB-SE(4-아지도-2,3,5,6-테트라플루오로벤조산, 숙신이미딜에스테르), 벤조페논-4-말레이미드, 벤조페논-4-이소티오시아네이트, 4-벤조일벤조산, 숙신이미딜 에스테르, 요오도아세트아미드 아지드, 요오도아세트아미드 알킨, Click-iT 말레이미드 DIBO 알킨, 아지도 (PEO)4 프로피온산, 숙신이미딜 에스테르, 알킨, 숙신이미딜 에스테르, Click_iT 숙신이미딜 에스테르 DIBO 알킨, Sulfo-SBED (설포-N-하이드록시숙신이미딜-2-(6-[비오티나미도]-2-(p-아지도 벤즈아미도)-헥사노아미도)에틸-1,3'-디티오프로피오네이트), 광 반응성 아미노산(예를 들어, L-광-류신 및 L-광-메티오닌), NHS-할로아세틸 가교제(예를 들어, 설포-SIAB), SIAB, SBAP, SIA, NHS-말레이미드 가교 결합제(예를 들어, 설포-SMCC), SM(PEG)n 계열 가교제, SMCC, LC-SMCC, sulfo-EMCS, EMCS, 설포-GMBS, GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, MBS, 설포-SMPB, SMPB, AMAS, BMPS, SMPH, PEG12-SPDP, PEG4-SPDP, 설포-LC-SPDP, LC-SPDP, SMPT, DCC (N,N'-디사이클로헥실카보디이미드), EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드), NHS (N-하이드록시숙신이미드), 설포-NHS (N-하이드록시설포숙신이미드), BMPH, EMCH, KMUH, MPBH, PDPH 및 PMPI을 포함한다.
동종 이기능성 가교 시약은 예를 들어 항체와 같은 분자에서 동일한 반응성 그룹에 대한 반응성을 가지고 있다. 동종 이기능성 가교 시약의 예는, DTNB(5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산), o-PDM(o-페닐렌디말레이미드), DMA(디메틸 아디피미데이트), DMP(디메틸 피멜리미데이트), DMS(디메틸 수베리미데이트), DTBP(디티오비스프로피오니미데이트), BS(PEG)5, BS(PEG)9, BS3, BSOCOES, DSG, DSP, DSS, DST, DTSSP, EGS, 설포-EGS, TSAT, DFDNB, BM(PEG)n 가교 결합제, BMB, BMDB, BMH, BMOE, DTME 및 TMEA를 포함한다.
5.2 이중특이적 항원-결합 분자를 생산하는 생물학적 방법
체세포 혼성화는 두 개의 별개의 융합세포 세포주의 융합(특정 항체를 생성하는 B 세포 및 및 골수종 세포의 융합)하는 것으로, 두 개의 상이한 항체 중쇄(즉, VHA 및 VHB) 및 경쇄(즉, VLA 및 VLB)를 발생시킬 수 있는 쿼드로마(quadroma)를 생산한다. (Kontermann, 상기 참조). 이들 중쇄 및 경쇄는 세포 내에서 무작위로 결합하여 이중특이적 항원-결합 분자(예를 들어, VLA 사슬과 결합된 VHA 사슬 및 VLB 사슬과 결합된 VHB 사슬), 뿐만 아니라 일부 비기능적(예를 들어, 2 개의 VLB 사슬과 결합된 2 개의 VHA 사슬) 및 단일특이적(예를 들어, 2 개의 VHA 사슬과 결합된 2 개의 VHA 사슬) 항원-결합 분자를 생성한다. 이중특이적 항원-결합 분자는 제대로 확립된 방법, 예를 들어 2 개의 상이한 친화성 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 정제될 수 있다.
단일특이적 항원-결합 분자와 유사하게, 이중특이적 항원-결합 분자는 항원 결합의 다운스트림에 Fc-매개 효과를 유발하는 Fc 영역을 함유할 수도 있다. 이러한 효과는, 예를 들어 펩신 분해에 의해 이중특이적 항체로부터의 Fc 영역을 단백질 분해하여 절단하여 이중특이적 F(ab')2 분자(상동)를 생성함으로써 감소시킬 수 있다.
5.3 다중특이적 항원-결합 분자를 생산하는 유전적 방법
다중특이적 항원-결합 분자는 또한 당업계에 제대로 확립된 유전적 수단, 예를 들어 목적하는 항체 구조에 상응하는 DNA 서열을 함유하는 플라스미드의 시험관내 발현에 의해 생성할 수 있다(예를 들어, 문헌: Kontermann 상기 참조).
5.4 디아바디
일부 실시 양태에서, 다중특이적 항원-결합 분자는 디아바디이다. 디아바디는 예를 들어, RANK 및 ICM에 결합하고 길항하는 항체로부터의 2 개의 개별 폴리펩타이드 사슬로 구성되며, 각 사슬은 2 개의 가변 도메인(VHA-VLB 및 VHB-VLA 또는 VLA-VHB 및 VLB-VHA)을 보유한다. 전형적으로, 가변 도메인에 연결되는 폴리펩타이드 링커는 짧다(즉, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산 잔기). 짧은 폴리펩타이드 링커는 동일한 사슬에서 VH 및 VL 도메인의 회합을 방지하므로 다른 사슬에서 VH 및 VL 도메인의 회합을 촉진한다. 형성되는 이종이량체는 두 개의 표적 항원(예를 들어, VHB-VLA와 VHA-VLB 또는 VLB-VHA와 VLA-VHB)에 대해 기능적이다. 그러나, 비-기능적 분자를 유도하는 동종이량체(예를 들어, VHA-VLB와 VHA-VLB, VHB-VLA과 VHB-VLA 등)가 또한 형성될 수 있다. 이황화 결합을 도입하여 두 개의 폴리펩타이드 사슬을 공유적으로 연결하는 방법, 하나의 사슬에 큰 아미노산을 포함하고 다른 사슬(상기 및 본 명세서의 다른 부분에서 논의된 바와 같은 놉-인-홀 구조)에 작은 아미노산을 포함하도록 폴리펩타이드 사슬을 변형하는 방법, 및 C-말단 연장에서 시스테인 잔기를 첨가하는 방법을 포함하여 동종이량체화를 방지하기위한 여러 전략이 당업계에 공지되어 있다. 또 다른 전략은 폴리펩타이드 링커 서열에 의해 두 개의 폴리펩타이드 사슬을 연결하여 taFv보다 더 조밀한 구조를 나타내는 단일 사슬 디아바디 분자(scDb)를 생성하는 것이다. ScDb 또는 디아바디는 또한 IgG1 CH3 도메인 또는 Fc 영역에 융합되어 디-디아바디를 생성할 수 있다. 디-디아바디의 예는 scDb-Fc, Db-Fc, scDb-CH3, 및 Db-CH3를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 또한, scDb는 4가 이중특이적 분자를 제조하는 데 사용할 수 있다. scDb의 폴리펩타이드 링커 서열을 약 15개 아미노산에서 약 5개 아미노산으로 단축시킴으로써 TandAbs(참조문헌: Muller and Kontermann, in Bispecific Antibodies Kontermann R E (ed.), Springer Heidelberg Dordrecht London New York, 83-100 (2011)에 기재됨)로 공지된 이량체 단일 사슬 디아바디 분자가 생성된다.
5.5 항원-결합 분자 생성을 위한 기타 접합 기술
본 발명에 따른 다중특이적 항원-결합 분자를 생성하기 위한 또 다른 적합한 전략은 항체 분자(예를 들어, scFv 또는 Fab)의 C-말단에 이종이량체화 펩타이드를 접합하거나 또는 연결하는 방법을 포함한다.
이 전략의 비-제한적인 예는 jun-fos 류신 지퍼(jun-fos leucine zipper)(예를 들어, scFv-Jun/Fos 및 Fab'-Jun/Fos)에 연결된 항체 단편의 사용이다.
이중특이적 항원-결합 분자를 생성하기 위한 추가적 방법은 상이한 항원 결합 단편을 갖는 2 개의 항체를 비오틴으로 유도체화한 다음 스트렙타비딘을 통해 2 개의 항체를 연결한 후, 생성된 이중특이적 항체의 정제 및 분리하는 방법을 포함한다.
본 발명에 따른 추가적인 유형의 이중특이적 항원-결합 분자는 각 항원에 대해 하나 이상의 항원-결합 부위를 함유하는 분자들을 포함한다. 예를 들어, 추가 VH 및 VL 도메인은 기존 항체의 VH 및 VL 도메인의 N-말단에 융합되어 항원-결합 부위를 효과적으로 일렬로 배열할 수 있다. 이러한 유형의 항체는 이중-가변-도메인 항체(DVD-Ig)로 공지되어 있다(참조문헌: Tarcsa, E. 외, in Bispecific Antibodies. Kontermann, 상기 참조, 171-185 페이지) 항원에 대해 하나 이상의 항원-합 부위를 함유하는 항체를 생산하는 또 다른 방법은 scFv 단편을 중쇄의 N-말단 또는 경쇄의 C-말단에 융합하는 것이다(이후 더 자세히 논의됨).
다중특이적 항원-결합 분자 복합체 또는 작제물의 항체 또는 항원-결합 단편은 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 의해 서로 구별되는 IgM, IgG, IgD, IgA, IgE 또는 이들의 단편으로 구성되는 그룹으로부터 독립적으로 선택된다. 이러한 Ig 부류 중 일부는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4, IgA1 및 IgA2와 같은 하위 부류로 추가 분류된다. 상이한 부류의 항체에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라고 불린다. 5 가지 항체 부류 모두에서 발견될 수 있는 경쇄 불변 영역(CL)은 κ (카파) 및 λ (람다)에서 선택된다. 항원 인식 및 결합 능력을 유지하는 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편이다. 또한, 제1 및 제2 항원 결합 단편은 직접 또는 링커(예를 들어, 폴리펩타이드 링커)에 의해 연결된다.
5.6 IgG 스캐폴드를 사용하는 이중특이적 항원-결합 분자의 생성.
불변 면역글로불린 도메인은 2 개의 폴리펩타이드 사슬(예를 들어, IgG-유사 항체)의 이종이량체화를 촉진하는데 적합하게 사용될 수 있다. 이중특이적 항체를 생산하는 이러한 전략의 비-제한적인 예는, 놉-인투-홀 구조를 두 개의 폴리펩타이드에 도입하고 CL 및 CH1 도메인의 자연 발생 이종이량체화를 활용함을 포함한다(참조: Kontermann, supra, 1-28 페이지 (2011) Ridgway 외, Protein Eng. 1996 Jul;9(7):617-21; Atwell 외, J Mol Biol.1997 Jul 4;270(1):26-35).
본 발명에 따른 재조합 항원-결합 분자의 대부분은 IgG 유사하게 조작될 수 있으며, 이는 Fc 도메인도 포함한다는 것을 의미한다. 조작된 폴리펩타이드 사슬의 이종이량체화를 요구하는 디아바디와 유사하게, IgG-유사 항원-결합 분자는 또한 다른 특이성을 가진 두 항체로부터 유사한 중쇄 또는 중쇄 및 경쇄의 상호 작용을 방지하기 위해 이종이량체화를 요구한다(참조문헌: Jin, P. and Zhu, Z. In: Bispecific Antibodies. Kontermann RE (ed.), Springer Heidelberg Dordrecht London New York, 151-169 페이지 (2011)).
놉-인투-홀 구조는 목적하는 이종이량체의 한 사슬에 큰 아미노산(놉)을 도입하고 목적하는 이종이량체의 다른 사슬에 작은 아미노산(홀)을 도입함으로써 폴리펩타이드 사슬의 이종이량체화를 촉진한다. 입체적 상호작용은 놉을 가진 놉 또는 홀을 가진 홀보다는 홀을 가진 놉의 상호작용을 선호한다. 이중특이적 IgG-유사 항체와 관련하여, 유사 중쇄는 놉-인투-홀(KiH) 구조를 Fc 영역의 CH3 도메인에 도입함으로써 동종이량체화되는 것을 방지할 수 있다. 유사하게, 동일한 항원에 특이적인 중쇄 및 경쇄의 상호 작용을 촉진하는 것은 VH-VL 인터페이스에서 KiH 구조를 조작함으로써 달성될 수 있다. 구체적으로는, KiH 방법론에서 큰 아미노산 측쇄는 중쇄 중 하나의 CH3 도메인에 도입되며, 이 측쇄는 다른 중쇄의 CH3 도메인에서 적절하게 설계된 캐비티에 적합하다(예를 들어, Ridgeway 외, Protein Eng. 9(1996), 617-621 and Atwell 외, J. Mol. Biol. 270(1997), 677-681, 이는 본 명세서에 참조로 포함됨). 따라서 중쇄의 이종이량체는 동종이량체보다 더 안정한 경향이 있으며 발현된 폴리펩타이드를 더 많은 비율로 형성한다. 또한, 목적하는 경쇄/중쇄 쌍의 회합은 경쇄와 중쇄 사이의 불변 또는 불변 및 가변 영역을 "스왑(swap)"하기 위해 이중특이적 항체(Fab 영역)의 하나의 Fab의 변형에 의해 유도될 수 있다. 따라서, 변형된 Fab 도메인에서, 중쇄는 예를 들어 CL-VH 또는 CL-VL 도메인을 포함하고 경쇄는 CHI-VL 또는 CHI-VH 도메인을 각각 포함할 것이다. 이는 변형된 사슬(즉, 변형된 경쇄 또는 중쇄)의 중쇄/경쇄 Fab 부분 및 표준/비-변형된 암의 중쇄/경쇄 Fab 부분과의 상호 작용을 방지한다. 설명하자면, CL 도메인을 포함하는 변형된 암의 Fab 도메인에 있는 중쇄는 CL 도메인을 또한 포함하는 비-변형된 암/Fab 도메인의 경쇄와 우선적으로 상호 작용하지 않는다("부적절한" 또는 목적하지 않는 중쇄/경쇄 쌍을 방지함). "부적절한" 경쇄/중쇄의 회합을 방지하기 위한 이 기술을 "크로스맙(CrossMAb)" 기술이라고 명명하며, KiH 기술과 결합하면 목적하는 이중특이적 분자의 발현이 현저하게 향상된다(예를 들어, Schaefer 외 Proc Natl Acad Sci U S A. 2011; 108(27):11187-92; 및 미국 특허 공보 제2010/0159587호, 이는 전문이 본 명세서에 참조로 포함됨). KiH 구조의 다른 예가 존재하며 위에서 논의된 예로 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. Fc 영역의 이종이량체화를 촉진하는 다른 방법으로는 Fc 도메인으로의 전하 극성 조작(참조문헌: Gunasikaran 외, 2010) 및 SEED 기술(SEED-IgG)(참조문헌: Davis 외, Protein Eng Des Sel. 2010 Apr;23(4):195-202, 2010)을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 다중특이적 항원-결합 분자는, 항체 도메인 교환이 KiH 방법론을 기반으로 한 독립적인 모 항체로부터 유래된 크로스맙이다. 경쇄 미스페어링(mispairing)은 도메인 크로스오버(domain crossover) 및 KIH 방법을 사용하여 이종이량체화된 중쇄를 사용하여 극복된다. 도메인 크로스오버를 위해, 가변 도메인 또는 불변 도메인은 경쇄와 중쇄 사이에서 스왑되어 두 개의 비대칭 Fab 암을 생성하여 경쇄 미스페어링을 방지하며 "크로스오버"는 항원-결합 친화성을 유지한다. 천연 항체와 비교하여 크로스맙은 더 높은 안정성을 보여준다. 서로 다른 지역에서 교환되는 Fab, VH-VL 및 CH1-CL과 같은 상이한 여러가지 크로스맙 형식이 존재한다. 바람직한 실시 양태에서, 다중특이적 항원-결합 분자는 이중특이적 항체의 CH1 및 CL 영역을 교환하는 크로스맙MAbCH1-CL 형식을 기반으로 한다.
추가의 이종이량체화된 IgG-유사 항원-결합 분자는 헤테로Fc-scFv, Fab-scFv, IgG-scFv, 및 scFv-IgG를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 헤테로Fc-scFv는 2 개의 별개의 scFv를 이종이량체화 가능한 Fc 도메인에 연결하는 반면 Fab-scFv는 다른 에피토프에 특이적인 scFv에 연결된 하나의 에피토프에 특이적인 Fab 도메인을 함유한다. IgG-scFv 및 scFv-IgG는 각각 C-말단 및 N-말단에 연결된 scFv를 가진 Ig-유사 항체이다(참조문헌: Kontermann RE (ed.), 상기 참조 151-169 페이지).
대표적인 크로스맙 실시 양태는 CH3 도메인 내에서 첫 번째 IgG-유사 폴리펩타이드의 계면에서 폴리펩타이드의 적어도 하나의 접촉 잔기를 대체함으로써 조작된 돌기(engineered protuberance)가 생성되는 양태를 포괄한다. 특히, 첫 번째 폴리펩타이드에서 대체될 접촉 잔기는 366번 위치의 IgG 잔기에 해당하고(잔기 넘버링은 Fc 결정 구조(Deisenhofer, Biochem. 20:2361 [1981])에 따름), 여기서 조작된 돌기는 원래 잔기를 인코딩하는 핵산을 원래 잔기보다 더 큰 측쇄 부피를 갖는 임포트 잔기를 인코딩하는 핵산으로 대체하는 것을 포함한다. 구체적으로, 366번 위치의 트레오닌(T) 잔기는 트립토판(W)으로 돌연변이된다. 제2 단계에서는, CH3 도메인 내에서 제2 폴리펩타이드의 계면에서 폴리펩타이드의 적어도 하나의 접촉 잔기를 대체함으로써 조작된 캐비티가 생성되며, 여기서 조작된 캐비티는 원래 잔기를 인코딩하는 핵산을 원래 잔기보다 더 큰 측쇄 부피를 갖는 임포트 잔기를 인코딩하는 핵산으로 대체하는 것을 포함한다. 구체적으로, 제2 폴리펩타이드에서 대체될 접촉 잔기는 407번 위치의 IgG 잔기에 상응한다. 구체적으로, 407번 위치의 티로신(Y) 잔기는 알라닌(A)으로 돌연변이된다. 이 절차는 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 및 IgG4로 구성되는 그룹으로부터 선택된 다른 IgG 서브타입에서 조작될 수 있다.
크로스맙 기술의 또 다른 구체적인 예에서, 다중특이적 항원-결합 분자는 예를 들어 WO제2008119353호 및 WO제2011131746호(이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 듀오바디 플랫폼/cFAE(젠맵: GenMAb)에 기반할 수 있으며, 여기서, 이중특이적 항체는 2 개의 상이한 숙주 세포에서 성분 항체를 개별적으로 발현한 다음 정제시키고, 2 개의 단일특이적 항체 사이에서 제어된 Fab-암 교환을 통해 이중특이적 이종이량체 항체로 조립함으로써 생성된다. Fab-암 교환과 유사하게, 2 개의 단일특이적 시작 단백질의 CH3 영역에 비대칭, 매칭 돌연변이(예를 들어, 유럽 넘버링 인덱스에 따라 F405L 및 K409R)를 도입함으로써 방향성을 강제하여 환원 조건하에 안정적인 이종이량체 쌍을 생성할 수 있다(예를 들어, Labrijn 외, Proc Natl Acad Sci U S A 2013;110(13):5145-5150; Gramer 외 MAbs 2013;5(6): 962-973; Labrijn 외 Nature Protocols 2014;9(10):2450-63에 기재된 바와 같고, 이의 전문은 본 명세서에 참조로 포함됨). 실제로, 이중특이적 인간 IgG1 Ab는 각각이 각각의 단일 상보적 돌연변이인 K409R 또는 F405L을 갖는 2개의 정제된 2가 모 항체로부터 생산될 수 있다. 이와 동일한 전략은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 백본에서 수행될 수 있다(Labrijn 2013, 상기 참조).
다중특이적 항원-결합 분자의 또 다른 비-제한적 예는 람다 사슬 폴리펩타이드 및 카파 경쇄 폴리펩타이드(WO제2018/057955호에 기재된 바와 같음)를 포함하고 둘 이상의 항원을 결합할 수 있는 다중특이적, 예를 들어 이중특이적인 항체 분자를 포함한다. 이 접근법의 기초는 하나의 카파 경쇄 폴리펩타이드와 하나의 람다 경쇄 폴리펩타이드를 사용함으로써 다중특이적 항체 분자에 대하여 경쇄의 잘못된 중쇄에 대한 미스페어링을 방지한다는 점이다. 람다 사슬 폴리펩타이드 및 카파 경쇄 폴리펩타이드를 포함하고 RANK 및 항-ICM 항원-결합 분자를 포함하는 2개의 항원에 결합하는 다중특이적 항체 분자의 설계에서, 4 개의 작제물이 생성된다. 두 개의 서로 다른 CH3 도메인에서 "놉-인투-홀" 구조를 생성하는 추가 비대칭 변경은 큰 아미노산(놉)을 목적하는 이종이량체의 한 사슬에 도입하고 작은 아미노산(홀)을 목적하는 이종이량체의 다른 사슬에 도입합으로써 폴리펩타이드 사슬의 이종이량체화를 촉진한다. 포유류 세포에서 공동-발현될 때 4개의 단편이 조립되어 다중-특이적 항체 분자를 형성한다.
5.7 정전기적 스티어링
다른 실시 양태에서, 다중특이적 항원-결합 분자는 정전기적 스티어링을 기반으로 하며, CH3 도메인에서의 전하 상보성이 선별된 돌연변이를 통해 변경되어 정전기적 스티어링 효과를 통해 향상된 항체 Fc 이종이량체 형성을 유도한다(참조문헌: Gunasekaran 외, 2010. J Biol Chem 285(25):19637-46; WO제2009089004호 A1). 이와 동일한 전략이 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 백본에서 수행될 수 있다(WO제2009089004호 A1).
5.8 링커
링커를 사용하여 상이한 항원-결합 분자를 공유적으로 연결하여 적어도 2 개의 항원-결합 분자를 포함하는 키메라 분자를 형성할 수 있다. 항원-결합 분자 사이의 연결은 개별 항원-결합 분자가 상응하는 동족 에피토프에 결합할 수 있도록 공간적 관계를 제공할 수 있다. 이와 관련하여, 개별 링커는 두 개의 별개의 기능적 항원-결합 분자를 연결하는 역할을 수행한다. 링커의 유형은 화학적 링커 및 폴리펩타이드 링커를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
링커는 화학적인 링커일 수 있으며, 예를 들어 알킬렌 사슬, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 사슬, 폴리숙신산 무수물, 폴리-L-글루탐산, 폴리(에틸렌이민), 올리고당류, 아미노산 사슬, 또는 임의의 다른 적절한 연결을 포함한다. 특정 실시 양태에서, 링커 자체는 알킬렌 사슬과 같은 생리적 조건하에서 안정할 수 있거나 또는 생리적 조건 하에서 예를 들어, 효소(예를 들어, 연결은 펩티다아제에 대한 기질인 펩타이드 서열을 함유함), 또는 가수 분해(예를 들어, 연결은 에스테르 또는 티오에스테르와 같은 가수분해성 기를 함유함)에 의해 절단될 수 있다. 링커는 PEG, 폴리글리콜산 또는 폴리락트산 사슬과 같이 생물학적으로 불활성일 수 있거나, 모이어티로부터 절단될 때 수용체에 결합하고, 효소를 비활성화시키는 등 올리고- 또는 폴리펩타이드와 같이 생물학적으로 활성일 수 있다. 링커는 탄소-탄소 결합, 에스테르, 에테르, 아미드, 아민, 카보네이트, 카바메이트, 설폰아미드 등을 포함하는 임의의 적합한 결합 또는 작용기에 의해 제1 및 제2 항체 또는 항원-결합 단편에 부착될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 링커는 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상) 유도체화 또는 비-유도체화 아미노산을 나타낸다. 이러한 유형의 구체적인 예에서, 링커는 바람직하게는 세린 및 글리신 서열 또는 Ala-Ala-Ala의 반복을 포함하는 링커와 같이 비-면역원성이고 가요성이다. 특정 작제물에 따라 링커는 길거나(예를 들어, 12 개 이상의 아미노산 길이) 짧을 수 있다(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개의 아미노산 길이). 예를 들어, 단일 사슬 디아바디를 제조하기 위해, 제1 및 제3 링커는 바람직하게는 약 3 내지 약 12개의 아미노산 길이(보다 바람직하게는 약 5개의 아미노산 길이)이고, 제2 링커는 바람직하게는 12개 아미노산 길이보다 더 길다(보다 바람직하게는 약 15개의 아미노산 길이). 링커 길이를 3 개의 잔기 미만으로 감소시키면 이중특이적 항체가 목적하는대로 2가, 3가 또는 4가가 되도록 하는 본 발명에 맞게 단일 사슬 항체 단편을 강제로 적용할 수 있다.
대표적인 펩타이드 링커는 [AAA]n, [SGGGG]n, [GGGGS]n, [GGGGG]n, [GGGKGGGG]n, [GGGNGGGG]n, [GGGCGGGG]n에서 선택될 수 있으며, 여기서 n은 1 내지 10, 적절하게는 1 내지 5, 보다 적절하게는 1 내지 3 사이의 정수이다.
6. 다중특이적 항원-결합 작제물
본 발명의 한 국면은 직접 또는 링커를 통해 함께 융합되거나 또는 접합되는 상이한 특이성을 갖는 복수의 항원-결합 분자를 포함하는 키메라 작제물에 관한 것이다. 예시적인 작제물이 아래에 제공된다.
6.1 항-RANK-항-PD-1 디아바디
다중특이적 항체를 개발하는 대안적인 접근법은 단일 사슬 디아바디(scdiabody) 형식을 기반으로 한다. 여기서 두 항체 A와 B의 가변 도메인은 폴리펩타이드 사슬인 VHA-VLB-링커-VHB-VLA로 표현된다. 본 발명은 이중특이적이고 RANK 길항제 항원-결합 분자 및 항-PD-1 항원-결합 분자를 포함하는 다중특이적 작제물을 고려하며, 이들의 대표적인 예는 다음으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성된다:
EVQLVESGGGVVQPGTSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVVSYDGSTKSYADSMKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPALRYFDWGYFQHWGQGTLVTVSS[SGGGG] n 　eivltqspatlslspgeratlscrasqsvssylawyqqkpgqaprlliydasnratgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqssnwprtfgqgtkveik　[SGGGG] n QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS　[SGGGG] n 　syeltqppsvsvspgqtasitcsgdklgdkyvcwyqqkpgqspvlviygdserpsgiperfsgsnsgntatltisgtravdeadyycqawdsttplfgggtnltvl [서열 번호 158],
여기서,
* 일반 대문자는 항-RANK MAb 3A3의 가변 중쇄 아미노산 서열에 상응한다.
* 밑줄 친 소문자는 항-PD-1 MAb 니볼루맙의 가변 경쇄 아미노산 서열에 상응한다.
* 밑줄 친 대문자는 항-PD-1 MAb 니볼루맙의 가변 중쇄 아미노산 서열에 상응한다.
* 일반 소문자는 항-RANK MAb 3A3의 가변 경쇄 아미노산 서열에 상응한다.
* [SGGGG] n 의 각 발생은 가요성 링커이며, 여기서 가요성 링커의 첫 번째 및 세 번째 예시에서 n = 1, 2, 3 또는 4, 바람직하게는 n = 1이고, 가요성 링커의 두 번째 예시에서 n = 3이다.
6.2 항-RANK-항-PD-L1 디아바디
대안적으로, 이중특이적 작제물은 항-RANK 항원-결합 분자 및 항-PD-L1 항원-결합 분자를 포함하며, 이들의 대표적인 예는 다음으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성된다:
EVQLVESGGGVVQPGTSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVVSYDGSTKSYADSMKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPALRYFDWGYFQHWGQGTLVTVSS[SGGGG] n 　eivltqspgtlslspgeratlscrasqrvsssylawyqqkpgqaprlliydassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygslpwtfgqgtkveik　[SGGGG] n 　VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSS　[SGGGG] n 　syeltqppsvsvspgqtasitcsgdklgdkyvcwyqqkpgqspvlviygdserpsgiperfsgsnsgntatltisgtravdeadyycqawdsttplfgggtnltvl [서열 번호 159],
여기서,
* 일반 대문자는 항-RANK MAb 3A3의 가변 중쇄 아미노산 서열에 상응한다.
* 밑줄 친 소문자는 항-PD-L1 MAb 더발루맙의 가변 경쇄 아미노산 서열에 상응한다.
* 밑줄 친 대문자는 항-PD-L1 MAb 더발루맙의 가변 중쇄 아미노산 서열에 상응한다.
* 일반 소문자는 항-RANK MAb 3A3의 가변 경쇄 아미노산 서열에 상응한다.
* [SGGGG] n 의 각 발생은 가요성 링커이며, 여기서 가요성 링커의 첫 번째 및 세 번째 예시에서 n = 1, 2, 3 또는 4, 바람직하게는 n = 1이고, 가요성 링커의 두 번째 예시에서 n = 3이다.
대안적으로, 이중특이적 작제물은 항-RANK 항원-결합 분자 및 항-PD-L1 항원-결합 분자를 포함하며, 이들의 대표적인 예는 다음으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성된다:
EVQLVESGGGVVQPGTSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVVSYDGSTKSYADSMKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPALRYFDWGYFQHWGQGTLVTVSS[SGGGG] n 　 diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvstavawyqqkpgkapklliysasflysgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqylyhpatfgqgtkveik　[SGGGG] n 　EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS　[SGGGG] n 　syeltqppsvsvspgqtasitcsgdklgdkyvcwyqqkpgqspvlviygdserpsgiperfsgsnsgntatltisgtravdeadyycqawdsttplfgggtnltvl [서열 번호 160],
여기서,
* 일반 대문자는 항-RANK MAb 3A3의 가변 중쇄 아미노산 서열에 상응한다.
* 밑줄 친 소문자는 항-PD-L1 MAb 아테졸리주맙의 가변 경쇄 아미노산 서열에 상응한다.
* 밑줄 친 대문자는 항-PD-L1 MAb 아테졸리주맙의 가변 중쇄 아미노산 서열에 상응한다.
* 일반 소문자는 항-RANK MAb 3A3의 가변 경쇄 아미노산 서열에 상응한다.
* [SGGGG] n 의 각 발생은 가요성 링커이며, 여기서 가요성 링커의 첫 번째 및 세 번째 예시에서 n = 1, 2, 3 또는 4, 바람직하게는 n = 1이고, 가요성 링커의 두 번째 예시에서 n = 3이다.
6.3 항-RANKL-항-CTLA4 디아바디
대안적으로, 이중특이적 작제물은 항-RANK 항원-결합 분자 및 항-CTLA4 항원-결합 분자를 포함하며, 이들의 대표적인 예는 다음으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성된다:
EVQLVESGGGVVQPGTSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVVSYDGSTKSYADSMKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPALRYFDWGYFQHWGQGTLVTVSS[SGGGG] n 　 eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvgssylawyqqkpgqaprlliygafsratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygsspwtfgqgtkveik　[SGGGG] n 　 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS　 [SGGGG] n 　syeltqppsvsvspgqtasitcsgdklgdkyvcwyqqkpgqspvlviygdserpsgiperfsgsnsgntatltisgtravdeadyycqawdsttplfgggtnltvl [서열 번호 161],
여기서,
* 일반 대문자는 항-RANK MAb 3A3의 가변 중쇄 아미노산 서열에 상응한다.
* 밑줄 친 소문자는 항-CTLA4 MAb 이필리무맙의 가변 경쇄 아미노산 서열에 상응한다.
* 밑줄 친 대문자는 항-CTLA4 MAb 이필리무맙의 가변 중쇄 아미노산 서열에 상응한다.
* 일반 소문자는 항-RANK MAb 3A3의 가변 경쇄 아미노산 서열에 상응한다.
* [SGGGG] n 의 각 발생은 가요성 링커이며, 여기서 가요성 링커의 첫 번째 및 세 번째 예시에서 n = 1, 2, 3 또는 4, 바람직하게는 n = 1이고, 가요성 링커의 두 번째 예시에서 n = 3이다.
대안적으로, 이중특이적 작제물은 항-RANK 항원-결합 분자 및 항-CTLA4 항원-결합 분자를 포함하며, 이들의 대표적인 예는 다음으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 또는 본질적으로 구성된다:
EVQLVESGGGVVQPGTSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVVSYDGSTKSYADSMKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPALRYFDWGYFQHWGQGTLVTVSS[SGGGG] n 　 diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsinsyldwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqyystpftfgpgtkveik　[SGGGG] n 　 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS　[SGGGG] n 　syeltqppsvsvspgqtasitcsgdklgdkyvcwyqqkpgqspvlviygdserpsgiperfsgsnsgntatltisgtravdeadyycqawdsttplfgggtnltvl [서열 번호 162],
여기서,
* 일반 대문자는 항-RANK MAb 3A3의 가변 중쇄 아미노산 서열에 상응한다.
* 밑줄 친 소문자는 항-CTLA4 MAb 트레멜리무맙의 가변 경쇄 아미노산 서열에 상응한다.
* 밑줄 친 대문자는 항-CTLA4 MAb 트레멜리무맙의 가변 중쇄 아미노산 서열에 상응한다.
* 일반 소문자는 항-RANK MAb 3A3의 가변 경쇄 아미노산 서열에 상응한다.
* [SGGGG] n 의 각 발생은 가요성 링커이며, 여기서 가요성 링커의 첫 번째 및 세 번째 예시에서 n = 1, 2, 3 또는 4, 바람직하게는 n = 1이고, 가요성 링커의 두 번째 예시에서 n = 3이다.
6.4 항-RANK-항-PD-L1 크로스맙 작제물
본 발명은 또한 크로스맙 다중특이적 항원-결합 분자를 고려한다. 크로스맙 구성의 제1 단계에서, CH3 도메인 내에서 폴리펩타이드의 적어도 하나의 접촉 잔기를 대체함으로써 첫 번째 IgG-유사 폴리펩타이드의 계면에서 조작된 돌기가 생성된다. 구체적으로, 첫 번째 폴리펩타이드에서 대체될 접촉 잔기는 366번 위치의 IgG 잔기에 해당하고(잔기 넘버링은 Fc 결정 구조(Deisenhofer, Biochem. 20:2361 [1981])에 따름), 여기서 조작된 돌기는 원래 잔기를 인코딩하는 핵산을 원래 잔기보다 더 큰 측쇄 부피를 갖는 임포트 잔기를 인코딩하는 핵산으로 대체하는 것을 포함한다. 구체적으로, 366번 위치의 트레오닌(T) 잔기는 트립토판(W)으로 돌연변이된다. 제2 단계에서, CH3 도메인 내에서 폴리펩타이드의 적어도 하나의 접촉 잔기를 대체함으로써 제2 폴리펩타이드의 계면에서 조작된 캐비티가 생성되며, 여기서 조작된 캐비티는 원래 잔기를 인코딩하는 핵산을 원래 잔기보다 더 큰 측쇄 부피를 갖는 임포트 잔기를 인코딩하는 핵산으로 대체하는 것을 포함한다. 구체적으로, 제2 폴리펩타이드에서 대체될 접촉 잔기는 407번 위치의 IgG 잔기에 상응한다. 구체적으로, 407번 위치의 티로신(Y) 잔기는 알라닌(A)으로 돌연변이된다. 이 절차는 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 및 IgG4로 구성되는 그룹으로부터 선택된 다른 IgG 서브타입에서 조작될 수 있다.
후속 단계에서, 이종이량체 이중특이적 IgG에서 가능한 두 개의 경쇄/중쇄 상호작용 사이의 구별을 촉진하기 위해, 목적하는 경쇄/중쇄 쌍의 회합은 경쇄와 중쇄 사이의 불변 또는 불변 및 가변 영역을 "스왑"하기 위한 이중특이적 항체(Fab 영역)의 한 Fab의 변경에 의해 유도될 수 있다(예를 들어, Schaefer 외, 2011, 상기 참조). 따라서, 변형된 Fab 도메인에서, 중쇄는 예를 들어 CL-VH 또는 CL-VL 도메인을 포함하고 경쇄는 CH1-VL 또는 CH1-VH 도메인을 각각 포함할 것이다. 이는 변형된 사슬(즉, 변형된 경쇄 또는 중쇄)의 중쇄/경쇄 Fab 부분 및 표준/비-변형된 암의 중쇄/경쇄 Fab 부분과의 상호 작용을 방지한다. 설명하자면, CL 도메인을 포함하는 변형된 암의 Fab 도메인에 있는 중쇄는 CL 도메인을 또한 포함하는 비-변형된 암/Fab 도메인의 경쇄와 우선적으로 상호 작용하지 않는다("부적절한" 또는 목적하지 않는 중쇄/경쇄 쌍을 방지함). "부적절한" 경쇄/중쇄의 회합을 방지하기 위한 이 기술을 "크로스맙(CrossMAb)" 기술이라고 명명하며, KiH 기술과 결합하면 목적하는 이중특이적 분자의 발현이 현저하게 향상된다(예를 들어, Schaefer 외, 2011, 상기 참조).
이종이량체 이중특이적 IgG 항체의 생산은 먼저 이중특이적 IgG의 4 개 사슬을 인코딩하는 각각의 항체 유전자를 포유동물 발현 벡터로 클로닝하여 포유동물 세포(예를 들어, HEK293)에서 분비 발현을 가능하게 함으로써 달성된다. 각각의 항체 사슬 cDNA는 293펙틴 또는 유사한 기술을 사용하여 등몰 비율로 함께 HEK293 세포로 형질 감염되고, 세포 배양 상청액을 함유하는 항체를 수확하고 단백질 A 세파로스를 사용하여 상청액으로부터 항체를 정제한다.
일부 실시 양태에서, 항-RANK 항원-결합 분자 및 항-PD-L1 항원-결합 분자 둘 다로 구성된 이중특이적 이종이량체 IgG는 2 개의 중쇄 및 2 개의 경쇄 작제물을 사용하여 작제될 수 있는데, 여기서 중쇄 CH3 도메인 중 하나는 "놉"으로 명명된 366번 위치(T366W)에서 변경되고 다른 중쇄 CH3 도메인은 "홀"이라고 명명된 407번 위치(Y407A)에서 변경되어 중쇄의 KiH 이종이량체화를 촉진시킨다.
일부 실시 양태에서, 항-RANK 항원-결합 분자 및 항-PD-L1 항원-결합 분자 둘 다로 구성된 이중특이적 이종이량체 IgG는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄 작제물을 사용하여 작제될 수 있으며, 여기서 각각의 중쇄 CH3 도메인은 감소된 FcγR 및 C1q 상호 작용을 위해 234번 위치(L234P), 235번 위치(L235A), 329번 위치(P329G)에서 변경된다.
6.4.1 RANK 및 PD-L1 둘 다에 결합하는 CH1-CL 교환을 사용하는 다중특이적 크로스맙을 위한 작제물
예시적인 다중특이적 크로스맙 분자는 항-RANK 3A3 항체 및 아테졸리주맙 IgG1로부터 유래된 중쇄 및 경쇄 서열을 포함할 수 있고, 목적하는 경쇄/중쇄 쌍은 항-RANK 항원-결합 분자의 Fab 도메인의 변형에 의해 유도되어서 CH1 및 CL 도메인이 Ig 사슬 사이에서 교환될 수 있다.
본 구성의 목적을 위해, 항-RANK 3A3 VH1 도메인은 아테졸리주맙(또는 다른 적합한 인간 IgG1)으로부터 유래된 인간 IgG1 CH1 도메인과 일렬로 융합되고 다음과 같은 AA 서열을 갖는다:
EVQLVESGGGVVQPGTSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVVSYDGSTKSYADSMKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPALRYFDWGYFQHWGQGTLVTVSSastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkv [서열 번호 163],
여기서,
* 항-RANK 3A3 VH는 일반 대문자로 표시되어 있고;
* 아테졸리주맙 CH 도메인은 굵은 소문자로 기재되어 있다.
본 구성의 목적을 위해, 항-RANK 3A3 VL 도메인은 람다-1 경쇄 Uniprot 서열 P0DOX8(또는 다른 적합한 인간 람다 또는 카파 CL 서열)로부터 유래된 인간 람다 CL 도메인과 일렬로 융합되고, 다음과 같은 AA 서열을 갖는다:
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYVCWYQQKPGQSPVLVIYGDSERPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTRAVDEADYYCQAWDSTTPLFGGGTNLTVLgqpkanptvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadgspvkagvettkpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs [서열 번호 164],
여기서,
* 항-RANK 3A3 VL은 일반 대문자로 표시되어 있고;
* P0DOX8 CL 도메인은 굵은 소문자로 기재되어 있다.
RANK 및 PD-L1 모두에 결합하는 CH1-CL 교환을 사용하여 다중특이적 크로스맙을 생성하기 위해, 다음 네 가지 작제물이 본 구성에 사용된다.
작제물 1
항-RANK 3A3 크로스맙 CH1-CL huIgG1 KNOB 돌연변이, 중쇄
EVQLVESGGGVVQPGTSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVVSYDGSTKSYADSMKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPALRYFDWGYFQHWGQGTLVTVSSgqpkanptvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadgspvkagvettkpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs epkscdkthtcppcpapeAAggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyastyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalGapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvslWclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk [서열 번호 165],
여기서,
* 항-RANK 3A3 VH[서열 번호 163로부터]는 일반 대문자로 표시되어 있고;
* CL 도메인[서열 번호 164로부터]은 굵은 소문자로 표시되어 있고;
* 인간 IgG1 힌지 영역은 밑줄 친 소문자로 표시되어 있고;
* 아테졸리주맙 CH2-CH3 도메인은 일반 소문자로 표시되어 있으며;
* T366W "놉" 치환 및 L234A, L235A, P329G 치환은 굵은 대문자로 표시되어 있다.
작제물 2
항-RANK 3A3 크로스맙 CH1-CL 경쇄
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYVCWYQQKPGQSPVLVIYGDSERPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTRAVDEADYYCQAWDSTTPLFGGGTNLTVLastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkv [서열 번호 166],
여기서,
* 항-RANK 3A3 VL은 일반 대문자로 표시되어 있고;
* CH1 도메인[서열 번호 163로부터]은 굵은 소문자로 표시되어 있다.
작제물 3
아테졸리주맙 IgG1 홀 돌연변이, 중쇄
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkv epkscdkthtcppcpapeAAggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyastyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalGapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflAskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk [서열 번호 167],
여기서,
* 아테졸리주맙 VH는 일반 대문자로 표시되어 있고;
* 아테졸리주맙 CH1 도메인은 굵은 소문자로 표시되어 있고;
* HuIgG1 힌지 영역은 밑줄 친 소문자로 표시되어 있고;
* 아테졸리주맙 HuIgG1 CH2-CH3 도메인은 일반 소문자로 표시되어 있으며;
* Y407A "홀" 및 L234A, L235A, P329G 치환은 굵은 대문자로 표시되어 있다.
작제물 4
아테졸리주맙 경쇄
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC [서열 번호 168].
본 명세서에 기재된 크로스맙 접근법은 상기 기재된 PD-L1 항원-결합 분자 서열을 치환하는 다른 항-PD-L1 및 항-PD-1 또는 항-CTLA4 항원-결합 분자 서열과 함께 사용될 수 있다. 추가로, 다른 IgG 스캐폴드, 특히 IgG4를 사용한다.
일부 실시 양태에서, RANK 길항제 항원-결합 분자 및 항-PD-1 항원-결합 분자 둘 다로 구성된 이중특이적 이종이량체 IgG는, 중쇄 CH3 도메인 중 하나가 "놉"이라고 불리는 366번 위치(T366W)에서 변경되고 다른 중쇄 CH3 도메인이 "홀"이라고 불리는 407번 위치(Y407A)에서 변경되어 KiH 이종이량체화를 촉진시키는 크로스맙 다중특이적 항원-결합 분자와 관련하여, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄 작제를 사용하여 구성될 수 있다.
6.4.2 RANK 및 PD-1 둘 다에 결합하는 다중특이적 크로스맙-CH1-CL 교환-IgG4를 위한 작제물
예시적인 다중특이적 크로스맙 분자는 항-RANK 3A3 항체 및 니볼루맙 IgG4로부터 유래된 중쇄 및 경쇄 서열을 포함할 수 있고, 목적하는 경쇄/중쇄 쌍은 항-RANK 항원-결합 분자의 Fab 도메인의 변형에 의해 유도되어서 CH1 및 CL 도메인이 Ig 사슬 사이에서 교환될 수 있다. 본 구성에는 다음 네 가지 작제물이 사용된다.
작제물 1
항-RANK 3A3 크로스맙 CH1-CL huIgG4 KNOB 돌연변이, 중쇄
EVQLVESGGGVVQPGTSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVVSYDGSTKSYADSMKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPALRYFDWGYFQHWGQGTLVTVSSgqpkanptvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadgspvkagvettkpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs eskygppcpscpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvslWclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk [서열 번호 169],
여기서,
* 항-RANK 3A3 VH[서열 번호 163로부터]는 일반 대문자로 표시되어 있고;
* CL 도메인[서열 번호 154로부터]은 굵은 소문자로 표시되어 있고;
* IgG4 힌지 영역은 밑줄 친 소문자로 표시되어 있고;
* IgG4 CH2-CH3 도메인은 일반 소문자로 표시되어 있으며;
* T366W "놉" 치환은 굵은 대문자로 기재되어 있다.
작제물 2
항-RANK 3A3 CrossMAb CH1-CL 경쇄
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYVCWYQQKPGQSPVLVIYGDSERPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTRAVDEADYYCQAWDSTTPLFGGGTNLTVLastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkv [서열 번호 166]
여기서,
* 항-RANK 3A3 VL은 일반 대문자로 표시되어 있고;
* CH1 도메인[서열 번호 AAA로부터]은 굵은 소문자로 표시되어 있다.
작제물 3
니볼루맙 IgG4 홀 돌연변이, 중쇄
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrv eskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflAsrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk [서열 번호 170],
여기서,
* 니볼루맙 VH는 일반 대문자로 표시되어 있고;
* 니볼루맙 CH1 도메인은 굵은 소문자로 표시되어 있고;
* IgG4 힌지 영역은 밑줄 친 소문자로 표시되어 있고;
* IgG4 CH2-CH3 도메인은 일반 소문자로 표시되어 있으며;
* Y407A "홀" 치환은 굵은 대문자로 표시되어 있다.
작제물 4
니볼루맙 경쇄
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC [서열 번호 171].
인간 IgG4의 경우, 조작 돌연변이 S228P/L235E 변이체(SPLE)는 최소한의 FcγR 결합을 앞서 입증하였다(참조문헌: Newman 외, 2001, Clin. Immunol. 98, 164-174). IgG1 또는 IgG4 Fc 도메인의 돌연변이는 결합될 수 있는데, 예를 들어 인간 IgG1의 LALA 돌연변이를 P329G의 돌연변이와 결합하거나 또는 인간 IgG4의 SPLE 돌연변이를 P329G의 돌연변이와 결합하는 것은 FcγR 및 C1q 상호 작용을 완전히 폐기할 것이다(참조문헌: Schlothauer 외, 2016, Protein Eng Des. Sel. 29, 457-466).
일부 실시 양태에서, 항-RANK 항원-결합 분자 및 항-PD-1 항원-결합 분자 둘 다로 구성된 이중특이적 이종이량체 IgG4는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄 작제물을 사용하여 작제될 수 있으며, 여기서 각각의 중쇄 CH3 도메인은 감소된 FcγR 및 C1q 상호 작용을 위해 228번 위치(S228P), 235번 위치(L235E), 329번 위치(P329G)에서 변경된다.
7. 약제학적 조성물
본 발명의 약제학적 조성물은 일반적으로 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화된, 본 명세서에 기재된 바와 같은 RANK 길항제 항원-결합 분자 또는 치료학적 조합물을 포함한다. 선택적으로, 약제학적 조성물은 하나 이상의 기타 화합물, 약물, 성분 및/또는 물질을 포함한다. 선택된 투여 경로에 관계없이, 본 발명의 RANK 길항제 항원-결합 분자 또는 치료학적 조합물은 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 약제학적으로 허용되는 투여 형태로 제형화된다(참조문헌: 예를 들어, Remington, The Science and Practice of Pharmacy (21st Edition, Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia, Pa.)).
약제학적으로 허용되는 담체는 생리학적으로 적합한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 담체는 정맥 내, 근육 내, 피하, 비경구, 직장, 척추 또는 표피 투여(예를 들어, 주사 또는 주입에 의함)에 적합할 수 있다.
약제학적 조성물은 다양한 형태를 가질 수 있다. 이들 약제학적 조성물은, 예를 들어, 액체 용액(예를 들어, 주사 및 주입 용액), 분산액 또는 현탁액, 리포솜 및 좌약과 같은 액체, 반고체 및 고체 투여 형태를 포함한다. 바람직한 형태는 의도된 투여 방식 및 치료학적 적용에 따라 달라진다. 전형적인 바람직한 조성물은 주사가능한 또는 주입가능한 용액의 형태이다. 바람직한 투여 방식은 비경구(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내, 근육 내)이다. 바람직한 실시 양태에서, RANK 길항제 항원-결합 분자 또는 치료학적 조합물은 정맥 내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 또 다른 바람직한 실시 양태에서, RANK 길항제 항원-결합 분자 또는 치료학적 조합물은 근육 내 또는 피하 주사에 의해 투여된다.
본 명세서에 사용된 "비경구 투여"및 "비경구적으로 투여된"이라는 문구는 일반적으로 주사에 의한 장내 투여 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 척수강 내, 캡슐 내, 안와 내, 심장 내, 피부내, 복강 내, 경기 관, 표피하, 피하, 관절 내, 피막 하, 지주막 하, 척추 내, 경막 외 및 흉골 내 주사 및 주입을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
약제학적 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에서 멸균되고 안정되어야한다. 상기 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포솜, 또는 높은 항원-결합 분자 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로 제형화될 수 있다. 멸균 주사 용액은 적절한 용매에 필요한 양의 활성 화합물(즉, RANK 길항제 항원-결합 분자 또는 치료학적 조합물)을 필요에 따라 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합물과 함께 혼입한 다음 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산 매질 및 위에 열거된 성분으로부터 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조로, 앞서 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분의 분말에 추가하여 임의의 목적하는 추가 성분을 생성한다. 용액의 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 주사가능한 조성물은 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 장기간 흡수될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 RANK 길항제 항원-결합 분자 또는 치료학적 조합물은 세포 전달을 위해 비히클에 접합될 수 있다. 이들 실시 양태에서, 전형적으로 검출가능한 표지 및/또는 보조 치료제에 접합될 수 있거나 접합되지 않을 수 있는 개시된 항체는, 항원-결합 분자 또는 치료학적 조합물을 표적 세포에 전달하는 것을 돕거나, 항원-결합 분자 또는 치료학적 조합물의 안정성을 증가시키거나, 또는 항원-결합 분자 또는 치료학적 조합물의 잠재적 독성을 최소화하기 위해 적합한 비히클에 캡슐화된다. 숙련된 기술자가 인식하는 바와 같이, 다양한 비히클이 본 기재내용의 항체를 전달하기에 적합하다. 적합한 구조화된 유체 전달 시스템의 비-제한적인 예는 나노입자, 리포솜, 마이크로에멀젼, 미셀, 덴드리머 및 기타 인지질-함유 시스템을 포함할 수 있다. 항체를 전달 비히클에 혼입시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 다양한 실시 양태가 하기에 제시되지만, 본 기재내용의 항원-결합 분자 또는 치료학적 조합물을 전달 비히클에 혼입시키는 다른 방법들이 당업계에 공지되어 있음을 이해할 것이다.
일부 실시 양태에서, 리포솜 전달 비히클이 활용될 수 있다. 일반적으로, 리포솜은 인지질 이중층 막을 가진 구형 비히클이다. 리포솜의 지질 이중층은 다른 이중층(예를 들어, 세포막)과 융합되어 리포솜의 내용물을 세포로 전달할 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명의 항원-결합 분자 또는 치료학적 조합물은 표적 세포의 멤브레인과 융합하는 리포솜에 캡슐화함으로써 세포에 선택적으로 전달될 수 있다.
리포솜은 다양한 탄화수소 사슬 길이를 갖는 다양한 유형의 인지질로 구성될 수 있다. 인지질은 일반적으로 다양한 극성 그룹 중 하나에 글리세롤 포스페이트를 통해 연결된 두 개의 지방산을 포함한다. 적합한 인지질은 포스파티드산(PA), 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜 이노시톨(PI), 포스파티딜글리세롤(PG), 디포스파티딜글리세롤(DPG), 포스파티딜콜린(PC) 및 포스파티딜에탄올아민(PE)을 포함한다. 인지질을 포함하는 지방산 사슬은 길이가 약 6 내지 약 26 개의 탄소 원자의 범위를 가질 수 있고, 지질 사슬은 포화되거나 불포화될 수 있다. 적합한 지방산 사슬은 n-도데카노에이트(라우린산염), n-트레트라데카노에이트(미리스트산염), n-헥사데카노에이트(팔미트산염), n-옥타데카노에이트(스테아르산염), n-에이코사노에이트(아라키드산염), n-도코사노에이트(베헨산염), n-테트라코사노에이트(리그노세르산염), 시스-9-헥사데세노에이트(팔미톨레인산염), 시스-9-옥타데카노에이트(올레산염), 시스,시스-9,12-옥타데칸디에노에이트(리놀레산염), 모든 시스-9,12,15-옥타데카트리에노에이트(리놀렌산염), 및 모든 시스-5,8,11,14-에이코사테트라에노에이트(아라키돈산염)(괄호 안에 총칭으로 제시되어 있음)를 포함한다. 인지질의 두 지방산 사슬은 동일하거나 상이할 수 있다. 허용가능한 인지질은 디올레오일 PS, 디올레오일 PC, 디스테아로일 PS, 디스테아로일 PC, 디미리스토일 PS, 디미리스토일 PC, 디팔미토일 PG, 스테아로일, 올레오일 PS, 팔미토일, 리놀레닐 PS 등을 포함한다.
인지질은 임의의 천연 공급원에서 유래할 수 있으며, 그 자체로 인지질의 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 난황에는 PC, PG, PE가 풍부하고 콩에는 PC, PE, PI, 및 PA가 풍부하며, 동물의 뇌나 척수에는 PS가 풍부하다. 인지질은 합성 공급원에서도 유래될 수 있다. 다양한 비율의 개별 인지질을 갖는 인지질의 혼합물이 사용될 수 있다. 상이한 인지질의 혼합물은 유리한 활성 또는 활성 특성의 안정성을 갖는 리포솜 조성물을 생성할 수 있다. 위에서 언급된 인지질은, N-(1-(2,3-디올레올리옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸 암모늄 클로라이드, 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카복시아닌 퍼클로아레이트, 3,3'-데헵틸옥사카복시아닌 요오다이드, 1,1'-데도데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카복시아닌 퍼클로아레이트, 1,1'-디올레일-3,3,3',3'-테트라메틸인도 카복시아닌 메탄설포네이트, N-4-(델리놀레일아미노스티릴)-N-메틸피리디늄 요오다이드, 또는 1,1-딜리놀레일-3,3,3',3'-테트라메틸인도카복시아닌 퍼클로아레이트와 같은 양이온성 지질과 최적의 비율로 혼합될 수 있다.
리포솜은 선택적으로 스핑고지질을 포함할 수 있으며, 여기서 스핑고신은 글리세롤 및 동물 세포막의 주요 구성 요소인 포스포 글리세리드 또는 콜레스테롤의 지방산 중 하나의 구조적 대응물이다. 리포솜은 선택적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 중합체에 공유 결합된 지질인 페길화된 지질을 함유할 수 있다. PEG는 약 500 내지 약 10,000 달톤 범위의 크기를 가질 수 있다.
리포솜은 적합한 용매를 추가로 포함할 수 있다. 용매는 유기 용매 또는 무기 용매일 수 있다. 적합한 용매는 디메틸설폭사이드(DMSO), 메틸피롤리돈, N-메틸피롤리돈, 아세트로니트릴, 알코올, 디메틸포름아미드, 테트라하이드로푸란 또는 이의 조합물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본 기재내용의 항체를 보유하는 리포솜(즉, 적어도 하나의 메티오닌 화합물을 가짐)은 예를 들어, 미국 특허 제4,241,046호, 제4,394,448호, 제4,529,561호, 제4,755,388호, 제4,828,837호, 제4,925,661호, 제4,954,345호, 제4,957,735호, 제5,043,164호, 제5,064,655호, 제5,077,211호 및 제5,264,618호에 기재된, 약물 전달을 위한 리포솜을 제조하는 임의의 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 리포솜은 수용액에서 지질을 초음파 처리하고, 용매 주입, 지질 수화, 역 증발(reverse evaporation) 또는 반복된 동결 및 해동에 의한 동결 건조에 의해 제조될 수 있다. 바람직한 실시 양태에서, 리포솜은 초음파 처리에 의해 형성된다. 리포솜은 양파와 같은 다수의 층을 갖는 다중층 또는 단층일 수 있다. 리포솜은 크거나 작을 수 있다. 고-전단 초음파의 지속적인 처리는 더 작은 단층 리포솜을 형성하는 경향이 있다.
통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 리포솜 형성을 지배하는 모든 매개변수는 다양할 수 있다. 이들 매개변수는 온도, pH, 메티오닌 화합물의 농도, 지질의 농도 및 조성, 다가양이온의 농도, 혼합 속도, 용매의 존재 및 농도를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
다른 실시 양태에서, 본 기재내용의 항원-결합 분자 또는 치료학적 조합물은 마이크로에멀젼으로서 세포로 전달될 수 있다. 마이크로에멀젼은 일반적으로 수용액, 계면 활성제 및 "오일"을 포함하는 투명하고 열역학적으로 안정한 용액이다. 이 경우 "오일"은 초임계 유체 상이다. 계면 활성제는 오일-물 계면으로 존재한다. 본 명세서에 기술되거나 당업계에 공지된 것을 포함하여 다양한 계면 활성제 중 어느 것이든 마이크로에멀젼 제형에 사용하기에 적합하다. 본 기재내용에서 사용하기에 적합한 수성 마이크로도메인은 일반적으로 약 5 nm 내지 약 100 nm의 특징적인 구조적 치수를 가질 것이다. 이러한 크기를 가진 집합체는 가시광선의 산란이 좋지 않으므로 이들 용액은 광학적으로 투명하다. 숙련된 기술자에 의해 인식되는 바와 같이, 마이크로에멀젼은 구형, 막대 또는 디스크형 집합체를 포함하여 다수의 상이한 미세구조를 가질 수 있으며 가지게 될 것이다. 일 실시 양태에서, 구조는 일반적으로 구형 또는 원통형 물체인 가장 단순한 마이크로에멀젼 구조인 미셀일 수 있다. 미셀은 물 속의 기름 방울과 같고, 역 미셀(reverse micelle)은 기름 속의 물방울과 같다. 대안적인 실시 양태에서, 마이크로에멀젼 구조는 박층(라멜라: lamellae)이다. 이것은 계면 활성제 층에 의해 분리된 물과 기름의 연속적인 층으로 구성된다. 마이크로에멀젼의 "오일"은 최적으로 인지질을 포함한다. 리포솜에 대해 위에서 설명한 임의의 인지질은 마이크로에멀젼에 대한 실시 양태에 적합하다. 본 기재내용의 항체는 당업계에 일반적으로 공지된 임의의 방법에 의해 마이크로에멀젼에 캡슐화될 수 있다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명의 항원-결합 분자 또는 치료학적 조합물은 수지상 거대분자 또는 덴드리머에 전달될 수 있다. 일반적으로, 덴드리머는 분지형 트리-유사 분자로, 각 분지는 특정 길이 후에 두 개의 새로운 분지(분자)로 분할되는 분자의 상호 연결된 사슬이다. 이 분기(branching)는 분지(분자)가 매우 밀집되어 카노피가 구체를 형성할 때까지 계속된다. 일반적으로, 덴드리머의 특성은 이들 표면의 작용기에 의해 결정된다. 예를 들어, 카복실기와 같은 친수성 말단기는 전형적으로 수용성 덴드리머를 생성한다. 대안적으로, 인지질은 피부를 통한 흡수를 촉진하기 위해 덴드리머의 표면에 혼입될 수 있다. 리포솜 실시 양태에서 사용하기 위해 상세히 설명된 임의의 인지질은 덴드리머 실시 양태에서 사용하기에 적합하다. 당업계에 일반적으로 공지된 임의의 방법을 활용하여 덴드리머를 생성하고 본 기재내용의 항체를 캡슐화할 수 있다. 예를 들어, 덴드리머는 반응 단계의 반복 순서에 의해 제조될 수 있으며, 여기서 각각의 추가 반복은 고차원 덴드리머로 이어진다. 결과적으로 거의 균일한 크기와 모양을 가진 규칙적이고 고도로 분기된 3D 구조를 가지고 있다. 또한, 덴드리머의 최종 크기는 전형적으로 합성 중에 사용되는 반복 단계의 수에 의해 제어된다. 다양한 덴드리머 크기가 본 개시내용에 사용하기에 적합하다. 일반적으로, 덴드리머의 크기는 약 1nm 내지 약 100nm 범위일 수 있다.
본 기재내용의 RANK 길항제 항원-결합 분자 또는 치료학적 조합물은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있지만, 다수의 치료학적 적용을 위한 바람직한 투여 경로/방식은 정맥 내 주사 또는 주입이다. 일 실시 양태에서, RANK 길항제 항원-결합 분자 또는 치료학적 조합물은 20 mg/분을 초과하는 속도, 예를 들어 20 내지 40 mg/분, 바람직하게는 40 mg/분 이상의 속도로 정맥 내 주입으로 투여하여 약 35 내지 440 mg/m2, 바람직하게는 약 70 내지 310 mg/m2, 보다 바람직하게는 약 110 내지 130 mg/m2의 용량에 도달할 수 있다. 다른 실시 양태에서, RANK 길항제 항원-결합 분자 또는 치료학적 조합물은 10 mg/분 미만의 속도; 바람직하게는 5 mg/분 이하로 정맥 내 주입으로 투여하여 약 1 내지 100 mg/m2, 바람직하게는 약 5 내지 50 mg/m2, 약 7 내지 25 mg/m2, 보다 바람직하게는 약 10 mg/m2의 용량에 도달한다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 달라질 것이다. 특정 실시 양태에서, 활성 화합물은 임플란트, 경피용 패치 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 방출조절 제형과 같이, 신속한 방출로부터 화합물을 보호할 담체와 함께 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해성 생체적합성 중합체를 사용할 수 있다. 이러한 제형의 제조를 위한 다수의 방법이 특허를 받았거나 일반적으로 당업자에게 공지되어있다. 예를 들어, 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
특정 실시 양태에서, RANK 길항제 항원-결합 분자 또는 치료학적 조합물은 예를 들어 불활성 희석제 또는 동화성(assimilable) 식용 담체와 함께 경구 투여될 수 있다. 화합물(및 바람직한 경우 다른 성분)은 또한 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐에 내장되거나, 정제로 압축되거나, 또는 대상체의 식단에 직접 혼입될 수 있다. 경구 치료학적 투여를 위해, 화합물은 부형제와 혼입될 수 있고 섭취가능한 정제, 구강 정제, 트로키제, 캡슐제, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 비경구적 투여 이외의 방법으로 본 발명의 화합물을 투여하기 위해, 비활성화를 방지하기 위한 물질로 화합물을 코팅하거나 또는 상기 물질과 화합물과의 공동-투여가 필요할 수 있다. 약제학적 조성물은 또한 당업계에 공지된 의료 장치와 함께 투여될 수 있다.
최적의 목적하는 반응(예를 들어, 치료학적 반응)을 제공하기 위해 투여 요법이 조정된다. 예를 들어, 단일 한 회 분으로 투여할 수 있고, 여러 분할된 용량을 시간에 걸쳐 투여할 수 있거나, 또는 치료학적 긴급한 상황에 의해 지시된 바와 같이 용량을 비례적으로 감소 또는 증가시킬 수 있다. 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여량 단위 형태로 비경구 조성물을 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에 사용된 투여량 단위 형태는 치료될 대상체에 대한 단위 투여량으로 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하고; 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 관련하여 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여량 단위 형태에 대한 상세 내용은, (a) 활성 화합물의 고유한 특성 및 달성될 특정 치료 효과, 및 (b) 개인의 민감도 치료를 위해 이러한 화합물을 배합하는 기술에 내재된 제약에 의해 지시되고 이에 직접적으로 의존한다.
RANK 길항제 항원-결합 분자 또는 치료학적 조합물의 유효량에 대한 예시적이고 비-제한적인 범위는 0.1-30 mg/kg, 더욱 바람직하게는 1-25 mg/kg이다. RANK 길항제 항원-결합 분자 또는 치료학적 조합물의 투여량 및 치료 요법은 숙련된 기술자에 의해 결정될 수 있다. 특정 실시 양태에서, RANK 길항제 항원-결합 분자 또는 치료학적 조합물은 약 1 내지 40 mg/kg, 예를 들어 1 내지 30 mg/kg, 예를 들어 약 5 내지 25 mg/kg, 약 10 내지 20 mg/kg, 약 1 내지 5 mg/kg, 1 내지 10 mg/kg, 5 내지 15 mg/kg, 10 내지 20 mg/kg, 15 내지 25 mg/kg 또는 약 3 mg/kg의 용량으로 주사(예를 들어, 피하 또는 정맥 내)로 투여된다. 투여 일정은 예를 들어 주 1회 투여에서 2 주, 3 주 또는 4 주마다 1 회 투여까지 다양할 수 있다. 일 실시 양태에서, RANK 길항제 항원-결합 분자 또는 치료학적 조합물은 격주로 약 10 내지 20 mg/kg의 용량으로 투여된다.
RANK 길항제 항원-결합 분자 또는 치료학적 조합물은 20 mg/분을 초과하는 속도, 예를 들어 20 내지 40 mg/분, 바람직하게는 40 mg/분 이상의 속도로 정맥 내 주입으로 투여하여 약 35 내지 440 mg/m2, 바람직하게는 약 70 내지 310 mg/m2, 보다 바람직하게는 약 110 내지 130 mg/m2의 용량에 도달할 수 있다. 실시 양태에서, 약 110 내지 130 mg/m2의 주입 속도는 약 3 mg/kg의 수준을 달성한다. 일 실시 양태에서, RANK 길항제 항원-결합 분자 또는 치료학적 조합물은 약 3 내지 800 mg, 예를 들어 약 3, 20, 80, 240 또는 800 mg의 용량으로(예를 들어, 정맥 내로) 투여된다. 특정 실시 양태에서, RANK 길항제 항원-결합 분자 또는 치료학적 조합물은 약 20 내지 800 mg, 예를 들어 약 3, 20, 80, 240 또는 800 mg의 용량으로 단독으로 투여된다. 다른 실시 양태에서, RANK 길항제 항원-결합 분자 또는 치료학적 조합물은 제2 제제 또는 치료 양식, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 보조제 또는 치료 양식과 조합하여 약 3 내지 240 mg, 예를 들어 약 3, 20, 80 또는 240 mg의 용량으로 투여된다. 일 실시 양태에서, RANK 길항제 항원-결합 분자 또는 치료학적 조합물은 각 8주 주기 동안, 예를 들어 최대 96주 까지 2 주마다(예를 들어, 1, 3, 5, 7주 동안) 투여된다.
RANK 길항제 항원-결합 분자 또는 치료학적 조합물은 20 mg/분을 초과하는 속도, 예를 들어 20 내지 40 mg/분, 바람직하게는 40 mg/분 이상의 속도로 정맥 내 주입으로 투여하여 약 35 내지 440 mg/m2, 바람직하게는 약 70 내지 310 mg/m2, 보다 바람직하게는 약 110 내지 130 mg/m2의 용량에 도달할 수 있다. 실시 양태에서, 약 110 내지 130 mg/m2의 주입 속도는 약 3 mg/kg의 수준을 달성한다. 다른 실시 양태에서, RANK 길항제 항원-결합 분자 또는 치료학적 조합물은 10 mg/분 미만, 예를 들어 5 mg/분 이하의 속도로 정맥 내 주입으로 투여하여 약 1 내지 100 mg/m2, 예를 들어 약 5 내지 50 mg/m2, 약 7 내지 25 mg/m2, 및 보다 바람직하게는 약 10 mg/m2의 용량에 도달한다. 일부 실시 양태에서, RANK 길항제 항원-결합 분자 또는 치료학적 조합물은 약 30 분 동안 주입된다.
투여량 값은 완화될 병태의 유형 및 중증도에 따라 달라질 수 있음을 인지해야 한다. 임의의 특정 대상체에 대해, 특정 투여량 요법은 개별적인 필요 및 조성물의 투여를 투여하거나 감독하는 사람의 전문적인 판단에 따라 시간이 지남에 따라 조정되어야하며, 본 명세서에 제시된 투여량 범위는 단지 예시적인 것이며 청구된 조성의 범위 또는 실행을 제한하려는 것은 아님을 추가로 이해해야한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 유효량의 RANK 길항제 항원-결합 분자 또는 치료학적 조합물을 포함할 수 있다. 유효량은 본 발명의 RANK 길항제 항원-결합 분자 또는 치료학적 조합물뮬의 "치료학적 유효량"또는 "예방학적 유효량"일 수 있다. "치료학적 유효량"은 목적하는 치료학적 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다. RANK 길항제 항원-결합 분자 또는 치료학적 조합물의 치료학적 유효량은, 개인에게 목적하는 반응을 유발하기 위해서 질병 상태, 연령, 성별 및 개인의 체중과 같은 인자 및 RANK 길항제 항원-결합 분자 또는 치료학적 조합물의 능력에 따라 달라질 수 있다. 치료학적 유효량은 또한 RANK 길항제 항원-결합 분자 또는 치료학적 조합물의 임의의 독성 또는 해로운 효과보다 치료학적으로 유익한 효과가 더 큰 것이다. "치료학적 유효 투여량"은 바람직하게는 측정 가능한 매개 변수, 예를 들어 파골세포 증식 또는 종양 성장 속도를, 치료되지 않은 대상체에 비해 적어도 약 20%, 더 바람직하게는 적어도 약 40%, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 60%, 여전히 보다 바람직하게는 적어도 약 80%만큼 억제한다. 측정 가능한 매개 변수, 예를 들어 골감소 장애, 근병증 또는 암을 억제하는 화합물의 능력은 인간 골감소 장애, 근병증 또는 암에서의 효능을 예측하는 동물 모델계에서 평가될 수 있다. 대안적으로, 조성물의 이러한 특성은 예를 들어 숙련된 실무자에게 공지된 검정에 의해 시험관내에서 억제하는 화합물의 능력을 조사함으로써 평가될 수 있다.
대조적으로, "예방학적 유효량"은 목적하는 예방학적 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 전형적으로, 예방학적 용량이 질병의 이전 또는 초기 단계에 있는 대상체에서 사용되기 때문에, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 적을 것이다.
8. 보조 치료
본 명세서에 개시된 RANK 길항제 항원-결합 분자, 치료학적 조합물 및 약제학적 조성물은 하나 이상의 추가 치료학적 제제(예를 들어, 골 흡수제, 항암제, 세포 독성 또는 세포 증식 억제제, 호르몬 치료, 백신, 및/또는 다른 면역요법)와 공동 투여될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, RANK 길항제 항원-결합 분자, 치료학적 조합물 및 제약학적 조성물은 수술, 방사선, 냉동 수술 및/또는 온열 요법을 포함하는 다른 치료학적 치료 양식과 조합하여 투여된다. 이러한 조합물 요법은 더 낮은 투여량으로 투여되는 치료제를 유리하게 활용함으로써, 가능한 독성 또는 합병증을 피할 수 있다.
본 발명의 RANK 길항제 항원-결합 분자와 함께 사용하기 위해 고려되는 조합물 요법은, BMP-1 내지 BMP-12로 지정된 골 형태형성 인자; 형질전환생장인자-β 및 TGF-β 패밀리멤버; 섬유아세포 성장 인자 FGF-1 내지 FGF-10; 인터루킨-1 억제제(IL-1ra, IL-1에 대한 항체 및 IL-1 수용체에 대한 항체를 포함함); TNFα 억제제(에타너셉트(etanercept), 아달리무맙(adalimumab) 및 인플릭시맙(infliximab)을 포함함); RANK 리간드 억제제(가용성 RANK, 오스테오프로테게린 및 RANK 리간드에 특이적으로 결합하는 길항적 항체를 포함함), Dkk-1 억제제(예를 들어, 항-Dkk-1 항체) 부갑상선 호르몬, E 시리즈 프로스타글란딘, 비스포스포네이트 및 불소 및 칼슘과 같은 골-강화 미네랄을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 항-골흡수제를 포함한다. RANK 길항제 항원-결합 분자와 조합하여 사용될 수 있는 단백 동화제(anabolic agent)는 부갑상선 호르몬 및 인슐린-유사 성장 인자(IGF)를 포함하며, 후자는 바람직하게는 IGF 결합 단백질과 복합화된다. 이러한 조합물 치료에 적합한 IL-1 수용체 길항제는 문헌 WO제89/11540호에 기재되어 있고 적합한 가용성 TNF 수용체-1은 문헌 WO제98/01555호에 기재되어 있다. 예시적인 RANK 리간드 길항제는 예를 들어 문헌 WO제03/086289호, WO제03/002713호, 미국 특허 제6,740,511호 및 제6,479,635호에 기재되어 있다. 본 발명의 RANK 길항제 항원-결합 분자와 함께 사용하기 위해 포함되는 대안적 조합물 요법은 근병증 치료제를 포함하며, 이의 구체적인 예로는 니푸록사지드, 케토프로펜, 설파살라진, 5,15-디페닐포르피린, 파길린 하이드로클로라이드, 메톨라존, 지멜리딘 디하이드로클로라이드 모노하이드레이트, 미코나졸, 티클로피딘 하이드로클로라이드, 이오헥솔, 베녹시네이트 하이드로클로라이드, 니모디핀, 트라닐시프로민 하이드로클로라이드 및 AG490를 포괄한다.
다른 예에서, 본 명세서에 개시된 치료학적 조합물은 임의의 하나 이상의 항체 분자, 화학 요법, 다른 항암 요법(예를 들어, 표적화된 항암 요법 또는 종양 용해성 약물), 세포 독성제, 면역-기반 요법(예를 들어, 사이토카인), 수술 및/또는 방사선 절차를 포함하는 표준 암 치료와 조합할 수 있다. 조합하여 투여될 수 있는 예시적인 세포 독성제는 항미세관제, 토포이소머라제 억제제, 항-대사산물, 유사 분열 억제제, 알킬화제, 안트라사이클린, 빈카 알칼로이드, 삽입제 (intercalating agent), 신호 전달 경로를 방해할 수 있는 제제, 세포자멸, 프로테아좀 억제제 및 방사선(예를 들어, 국소 또는 전신 조사)을 촉진하는 제제를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 치료학적 조합물은 대상체의 치료에 있어서 표준으로 이미 일상적으로 사용되는 화학요법제와 조합하여 사용된다. 적합한 화학요법제는 아나스트로졸(ARIMIDEX), 비칼루타미드(CASODEX), 블레오마이신 설페이트(BLENOXANE), 부설판(MYLERAN), 부설판 주사(BUSULFEX), 카페시타빈(XELODA), N4-펜톡시카보닐-5-데옥시-5-플루오로시티딘, 카보플라틴(PARAPLATIN), 카무스틴(BICNU), 클로람부실(LEUKERAN), 시스플라틴(PLATINOL), 클라드리빈(LEUSTATIN), 사이클로 포스파미드(CYTOXAN 또는 NEOSAR), 시타라빈, 시토신 아라비노사이드(CYTOSARU), 시타라빈 리포솜 주사(DEPOCYT), 다카르바진(DTIC-DOME), 닥티노마이신(악티노마이신 D, Cosmegan), 다우노루비신염산염(CERUBIDINE), 다우노루비신 시트레이트 리포좀 주사(DAUNOXOME), 덱사메타손, 도세탁셀(TAXOTERE), 독소루비신 염산염(ADRIAMYCIN, RUBEX), 에토포사이드(VEPESID), 플루다라빈 포스페이트(FLUDARA), 5-플루오로우라실(ADRUCIL, EFUDEX), 플루타마이드(EULEXIN), 테자시티빈, 젬시타빈(GEMZAR), 하이드록시우레아(HYDREA), 이다루비신(IDAMYCIN), 이포스파미드(IFEX), 이리노테칸(CAMPTOSAR), L-아스파라기나제(ELSPAR), 류코보린 칼슘, 멜팔란(ALKERAN), 6-머캅토퓨린(PURINETHOL), 메토트렉세이트(FOLEX), 미톡산트론(NOVANTRONE), 마일로타그, 파클리탁셀(TAXOL), nab-파클리탁셀(ABRAXANE), 피닉스(Yttrium90/MX-DTPA), 펜토스타틴, 카무스틴 임플란트(GLIADEL 웨이퍼)를 가진 폴리페프로산 20, 타목시펜 시트레이트(NOLVADEX), 테니포사이드(VUMON), 6-티오구아닌, 티오테파, 티라파자민(TIRAZONE), 주사용 토포테칸 염산염(HYCAMPTIN), 빈블라스틴(VELBAN), 빈크리스틴(ONCOVIN) 및 비노렐빈(NAVELBINE)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
예시적인 알킬화제는 질소 머스타드, 에틸렌이민 유도체, 알킬 설포네이트, 니트로소우레아 및 트리아젠: 우라실 머스타드(AMINOURACIL MUSTARD, CHLORETHAMINACIL, DEMETHYLDOPAN, DESMETHYLDOPAN, HAEMANTHAMINE, NORDOPAN, URACIL NITROGEN MUSTARD, URACILLOST, URACILMOSTAZA, URAMUSTIN, URAMUSTINE), 클로르메틴(MUSTARGEN), 사이클로포스파미드(CYTOXAN, NEOSAR, CLAFEN, ENDOXAN, PROCYTOX, REVIMMUNE), 다카르바진(DTIC-DOME), 이포스파미드(MITOXANA), 멜팔란(ALKERAN), 클로람부실(LEUKERAN), 피포브로만(AMEDEL, VERCYTE), 트리에틸렌멜라민(HEMEL, HEXALEN, HEXASTAT), 트리에틸렌티오포스포라민, 테모졸로마이드(TEMODAR 및 TEMODAL), 티오테파(THIOPLEX), 부설판(BUSILVEX, MYLERAN), 카무스틴(BICNU), 로무스틴 (CCNUCEENU), 스트렙토조신(ZANOSAR), 옥살리플라틴(ELOXATIN); 닥티노마이신(악티노마이신-D, COSMEGEN으로도 공지되어 있음); 멜팔란(L-PAM, L-사르콜리신, 페닐알라닌 머스타드, ALKERAN), 알트레타민(헥사메틸멜라민(HMM), HEXALEN), 벤다무스틴(TREANDA), 부설판(BUSULFEX 및 MYLERAN), 카보플라틴(PARAPLATIN), 시스플라틴(CDDP, PLATINOL 및 PLATINOL-AQ), 클로람부실(LEUKERAN), 다카르바진(DTIC, DIC 및 이미다졸 카르복사미드, DTIC-DOME), 알트레타민(헥사메틸멜라민 (HMM), HEXALEN), 이포스파미드(IFEX), 프레드누무스틴(prednumustine), 프로카르바진(procarbazine)(MATULANE) 및 티오테파(티오포스포아미드, TESPA 및 TSPA, THIOPLEX)을 포함한다.
예시적인 안트라사이클린은 예를 들어, 독소루비신(ADRIAMYCIN 및 RUBEX), 블레오마이신(LENOXANE), 다우노루비신(다우노루비신 염산염, 다우노마이신, 루비도마이신 염산염 및 CERUBIDINE), 다우노루비신 리포좀(다우노루비신 시트레이트 리포좀, 및 DAUNOXOME), 미톡산트론(DHAD 및 NOVANTRONE), 에피루비신(ELLENCE), 이다루비신(IDAMYCIN 및 IDAMYCIN PFS), 미토마이신 C(MUTAMYCIN), 젤다나마이신, 헤르비마이신, 라비도마이신 및 데스아세틸라비도마이신을 포함한다.
상기 및 본 명세서의 다른 곳에서 개시된 제제, 항체 및 방법과 조합하여 사용될 수 있는 예시적인 빈카 알칼로이드는 비노렐빈 타르트레이트(NAVELBINE), 빈크리스틴(ONCOVIN), 빈데신(ELDISINE) 및 빈블라스틴(빈블라스틴 설페이트, 빈칼루코블라스틴, VLB, ALKABAN-AQ 및 VELBAN)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명과 함께 사용될 수 있는 예시적인 프로테아좀 억제제에는 보르테조밉(VELCADE), 카르필조밉(PX-171-007), 마리조밉(NPI-0052), 익사조밉 시트레이트(MLN-9708), 델란조밉(CEP-18770), O-메틸-N-[(2-메틸-5-티아졸릴)카르보닐]-L-세릴-O-메틸-N-[(1S)-2-[(2R)-2-메틸-2-옥시라닐]-2-옥소-1-(페닐메틸)에틸]-L-세린아미드(ONX-0912); 다노프레비르(RG7227, CAS 850876-88-9), 익사조밉(MLN2238, CAS 1072833-77-2) 및 (S)-N-[(페닐메톡시)카보닐]-L-류실-N-(1-포밀-3-메틸부틸)-L-류신아미드(MG-132, CAS 133407-82-6)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시 양태에서, 치료학적 조합물은 티로신 키나제 억제제(예를 들어, 수용체 티로신 키나제(RTK) 억제제)와 조합하여 사용될 수 있다. 예시적인 티로신 키나제 억제제는 표피 성장 인자(EGF) 경로 억제제(예를 들어, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 억제제), 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 경로 억제제[예를 들어, 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR) 억제제(예를 들어, VEGFR-1 억제제, VEGFR-2 억제제, VEGFR-3 억제제)], 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 경로 억제제(예를 들어, 혈소판 유래 성장 인자 수용체(PDGFR) 억제제(예를 들어, PDGFR-β 억제제)), RAF-1 억제제, KIT 억제제 및 RET 억제제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시 양태에서, 치료학적 조합물은 헤지호그(hedgehog) 경로 억제제와 조합하여 사용된다. 암 치료에 효과적인 것으로 알려진 적합한 헤지호그 억제제는, 악시티닙(AG013736), 보수티닙(SKI-606), 세디라닙(RECENTIN, AZD2171), 다사티닙(SPRYCEL, BMS-354825), 에를로티닙(TARCEVA), 게피티닙(IRESSA), 이마티닙(GLEEVEC, CGP57148B, STI-571), 라파티닙(TYKERB, TYVERB), 레스타르티닙(CEP-701), 네라티닙(HKI-272), 닐로티닙(TASIGNA), 세막사닙(세막시닙, SU5416), 수니티닙(SUTENT, SU11248), 토세라닙(PALLADIA), 반데타닙(ZACTIMA, ZD6474), 바탈라닙(PTK787, PTK/ZK), 트라스투주맙(HERCEPTIN), 베바시주맙(AVASTIN), 리툭시맙(RITUXAN), 세툭시맙(ERBITUX), 파니투무맙(VECTIBIX), 라니비주맙(Lucentis), 닐로티닙(TASIGNA), 소라페닙(NEXAVAR), 알렘투주맙(CAMPATH), 젬투주맙 오조가마이신(MYLOTARG), ENMD-2076, PCI-32765, AC220, 도비티니브 락테이트(TKI258, CHIR-258), BIBW 2992(TOVOKTM), SGX523, PF-04217903, PF-02341066, PF-299804, BMS-777607, ABT-869, MP470, BIBF 1120(VARGATEF®), AP24534, JNJ-26483327, MGCD265, DCC-2036, BMS-690154, CEP-11981, 티보자닙(AV-951), OSI-930, MM-121, XL-184, XL-647, XL228, AEE788, AG-490, AST-6, BMS-599626, CUDC-101, PD153035, 펠리티닙(EKB-569), 반데타닙(zactima), WZ3146, WZ4002, WZ8040, ABT-869(리니파닙), AEE788, AP24534(포나티닙), AV-951(티보자닙), 액시티닙, BAY 73-4506(레고라페닙), 브리바닙 알라니네이트(BMS-582664), 브리바닙(BMS-540215), 세디라닙(AZD2171), CHIR-258(도비티닙), CP 673451, CYC116, E7080, Ki8751, 마시티닙(AB1010), MGCD-265, 모테사닙 디포스페이트(AMG-706), MP-470, OSI-930, 파조파닙 염산염, PD173074S, 소라페닙 토실레이트(Bay 43-9006), SU 5402, TSU-68(SU6668), 바탈라닙, XL880(GSK1363089, EXEL-2880), 비스모데깁(2-클로로-N-[4-클로로-3-(2-피리디닐)페닐]-4-(메틸설포닐)-벤즈아미드, GDC-0449(PCT 국제공개공보 WO제06/028958호에 개시됨), 1-(4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐)-3-((3-(4-플루오로페닐)-3,4-디하이드로-4- 옥소-2-퀴나졸리닐)메틸)-우레아(CAS 330796-24-2), N-[(2S,3R,3'R,3aS,4'aR,6S,6'aR,6'bS,7aR,12'aS,12'bS)-2',3',3a,4,4',4'a,5,5',6,6',6'a,6'b,7,7',7a,8',10',12',12'a,12'b-에이코사하이드로-3,6,11',12'b-테트라메틸스피로[푸로[3,2-b]피리딘-2(3H), 9'(1'H)-나프스[2,1-a]아줄렌]-3'-일]-메탄설폰아미드(IPI926, CAS 1037210-93-7), 4-플루오로-N-메틸-N-[1-[4-(1-메틸-1H-피라졸-5-일)-1-프탈라지닐]-4-피페리디닐]-2-(트리플루오로메틸)-벤즈아미드(LY2940680, CAS 1258861-20-9), 에리스모데깁(LDE225)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시 양태에서, 치료학적 조합물은 베바시주맙(AVASTIN), 악시티닙(INLYTA), 브리바닙 알라니네이트(BMS-582664, (S)-((R)-1-(4-(4-플루오로-2-메틸-1H-인돌-5-일옥시)-5-메틸피롤로[2,1-f][1,2,4]트리아진-6-일옥시)프로판-2-일)2-아미노프로파노에이트), 소라페닙(NEXAVAR), 파조파닙(VOTRIENT), 수니티닙 말레이트(SUTENT), 세디라닙(AZD2171, CAS 288383-20-1), 바가테프(BIBF1120, CAS 928326-83-4), 포레티닙(GSK1363089), 텔라티닙(BAY57-9352, CAS 332012-40-5), 아파티닙(YN968D1, CAS 811803-05-1), 이마티닙(GLEEVEC), 포나티닙(AP24534, CAS 943319-70-8), 티보자닙(AV951, CAS 475108-18-0), 레고라페닙(BAY73-4506), CAS 755037-03-7), 바탈라닙 중염산염(PTK787, CAS 212141-51-0), 브리바닙(BMS-540215, CAS 649735-46-6), 반데타닙(CAPRELSA 또는 AZD6474), 모테사닙 이인산염(AMG706, CAS 857876-30-3, N-(2,3-디히드로-3,3-디메틸-1H-인돌-6-일)-2-[(4-피리디닐메틸)아미노]-3-피리딘카복스아미드, PCT 국제공개공보 WO제02/066470호에 기재됨), 도비티닙 중젖산(TKI258, CAS 852433-84-2), 린파닙(ABT869, CAS 796967-16-3), 카보잔티닙(XL184, CAS 849217-68-1), 레스타우티닙(CAS 111358-88-4), N-[5-[[[5-(1,1-디메틸에틸)-2-옥사졸릴]메틸]티오]-2-티아졸릴]-4-피페리딘카복스아미드(BMS38703, CAS 345627-80-7), (3R,4R)-4-아미노-1-((4-((3-메톡시페닐)아미노)피롤로[2,1-f][1,2,4]트리아진-5-일)메틸)피페리딘-3-올(BMS690514), N-(3,4-디클로로-2-플루오로페닐)-6-메톡시-7-[[(3aα,5β,6aα)-옥타히드로-2-메틸사이클로펜타[c]피롤-5-일]메톡시]-4-퀴나졸린아민(XL647, CAS 781613-23-8), 4-메틸-3-[[1-메틸-6-(3-피리디닐)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-일]아미노]-N-[3-(트리플루오로메틸)페닐]-벤즈아미드(BHG712, CAS 940310-85-0) 및 애플리버셉트(EYLEA)을 포함하는 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 수용체 억제제와 조합하여 사용된다.
일부 실시 양태에서, 치료학적 조합물은 PI3K 억제제와 조합하여 사용된다. 일 실시 양태에서, PI3K 억제제는 PI3K의 델타 및 감마 아형의 억제제이다. 조합하여 사용될 수 있는 예시적인 PI3K 억제제는 예를 들어 WO제2010/036380호, WO제2010/006086호, WO제09/114870호, WO제05/113556호에 기재되어 있으며, 그 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다. 적합하게는, PI3K 억제제는 4-[2-(1H-인다졸-4-일)-6-[[4-(메틸설포닐)피페라진-1-일]메틸]티에노[3,2-d]피리미딘-4-일]모르폴린(GDC-0941로도 공지되어 있음, PCT 국제공개공보 WO제09/036082호 및 WO제09/055730호에 기재됨), 2-메틸-2-[4-[3-메틸-2-옥소-8-(퀴놀린-3-일)-2,3-디히드로이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]페닐]프로피오니트릴(BEZ235 또는 NVP-BEZ 235, PCT 국제공개공보 WO제06/122806호에 기재됨); 4-(트리플루오로메틸)-5-(2,6-디모르폴리노피리미딘-4-일)피리딘-2-아민(BKM120 또는 NVP-BKM120, PCT 국제공개공보 WO제2007/084786호에 기재됨), 토자세르팁(VX680 또는 MK-0457, CAS 639089-54-6); (5Z)-5-[[4-(4-피리디닐)-6-퀴놀리닐]메틸렌]-2,4-티아졸리딘디온(GSK1059615, CAS 958852-01-2); (1E, 4S, 4aR, 5R, 6aS, 9aR)-5-(아세틸옥시)-1-[(디-2-프로페닐아미노)메틸렌]-4,4a,5,6,6a,8,9,9a-옥타하이드로-11-히드록시-4-(메톡시메틸)-4a,6a-디메틸-사이클로펜타[5,6]나프토[1,2-c]피란-2,7,10(1H)-트리온(PX866, CAS 502632-66-8); 8-페닐-2-(모르폴린-4-일)-크로멘-4-온(LY294002, CAS 154447-36-6), 2-아미노-8-에틸-4-메틸-6-(1H-피라졸-5-일)피리도[2,3-d]피리미딘-7(8H)-온(SAR 245409 또는 XL 765), 1,3-디하이드로-8-(6-메톡시-3-피리디닐)-3-메틸-1-[4-(1-피페라지닐)-3-(트리플루오로메틸)페닐]-2H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2-온, (2Z)-2-부텐디오에이트(1 : 1) (BGT 226), 5-플루오로-3-페닐-2-[(1S)-1-(9H-푸린-6-일아미노)에틸]-4(3H)-퀴나졸리논(CAL101), 2-아미노-N-[3-[N-[3-[(2-클로로-5-메톡시페닐)아미노]퀴녹살린-2-일]설파모일]페닐]-2-메틸프로판아미드(SAR 245408 또는 XL 147), 및 (S)-피롤리딘-1,2-디카복실산 2-아미드 1-({4-메틸-5-[2-(2,2,2-트리플루오로-1,1-디메틸-에틸)-피리딘-4-일]-티아졸-2-일}-아미드)(BYL719)를 포함한다.
일부 실시 양태에서, 치료학적 조합물은 mTOR 억제제, 예를 들어 하나 이상의 라파마이신, 템시롤리무스(TORISEL), AZD8055, BEZ235, BGT226, XL765, PF-4691502, GDC0980, SF1126, OSI-027, GSK1059615, KU-0063794, WYE-354, 팔로미드 529 (P529), PF04691502, 또는 PKI-587, 리다포롤리무스[공식적으로 데페롤리무스(deferolimus), (1R,2R,4S)-4[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R, 23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-디히드록시-19,30-디메톡시-15,17,21,23,29,35-헥사메틸-2,3,10,14,20-펜타옥소-11,36-디옥사-4-아자트리사이클로[30.3.1.04,9]헥사트리아콘타-16,24,26,28-테트라엔-12-일]프로필]-2-메톡시사이클로헥실 디메틸포스피네이트로 공지되어 있고, AP23573 및 MK8669로도 공지되어 있으며, PCT 국제공개공보 WO제03/064383호에 기재되어 있음), 에베로리무스(ARINITOR 또는 RAD001), 라파마이신(AY22989, SIROLIMUS), 시마피모드(CAS 164301-51-3), 엠시롤리무스, (5-{2,4-비스[(3S)-3-메틸모르폴린-4-일]피리도[2,3-d]피리미딘-7-일}-2-메톡시페닐)메탄올 (AZD8055), 2-아미노-8-[트랜스-4-(2-히드록시에톡시)사이클로헥실]-6-(6-메톡시-3-피리디닐)-4-메틸-피리도[2,3-d]피리미딘-7(8H)-온(PF04691502, CAS 1013101-36-4) 및 N2-[1,4-디옥소-4-[[4-(4-옥소-8-페닐-4H-1-벤조피란-2-일)모르폴리늄-4-일]메톡시]부틸]-L-아르기닐글리실-L-α-아스파틸L-세린-, 내부 염(SF1126, CAS 936487-67-1), (1r,4r)-4-(4-아미노-5-(7-메톡시-1H-인돌-2-일)이미다조[1,5-f][1,2,4]트리아진-7-일)사이클로헥산카복실산(OSI-027); 및 XL765로부터 선택되는 하나 이상의 mTOR 억제제와 조합하여 사용된다.
일부 실시 양태에서, 치료학적 조합물은 BRAF 억제제, 예를 들어 GSK2118436, RG7204, PLX4032, GDC-0879, PLX4720, 및 소라페닙 토실레이트(Bay 43-9006)와 조합하여 사용된다. 추가 실시 양태에서, BRAF 억제제는 레고라페닙(BAY73-4506, CAS 755037-03-7), 투비자닙(AV951, CAS 475108-18-0), 베무라페닙(ZELBORAF, PLX-4032, CAS 918504-65-1), 엔코라페닙(LGX818로도 공지되어 있음), 1-메틸-5-[[2-[5-(트리플루오로메틸)-1H-이미다졸-2-일]-4-피리디닐]옥시]-N-[4-(트리플루오로메틸)페닐-1H-벤즈이미다졸-2-아민(RAF265, CAS 927880-90-8), 5-[1-(2-히드록시에틸)-3-(피리딘-4-일)-1H-피라졸-4-일]-2,3-디히드로인덴-1-온 옥심(GDC-0879, CAS 905281-76- 7), 5-[2-[4-[2-(디메틸아미노)에톡시]페닐]-5-(4-피리디닐)-1H-이미다졸-4-일]-2,3-디히드로-1H-인덴-1-온 옥심(GSK2118436 또는 SB590885), (+/-)-메틸(5-(2-(5-클로로-2-메틸페닐)-1-히드록시-3-옥소-2,3-디히드로-1H-이소인돌-1-일)-1H-벤즈이미다졸-2-일)카르바메이트(XL-281 및 BMS908662로도 공지되어 있음) 및 N-(3-(5-클로로-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-카보닐)-2,4-디플루오로페닐)프로판-1-설폰아미드(PLX4720로도 공지되어 있음)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
치료학적 조합물은 또한 MEK 억제제와 조합하여 사용될 수 있다. 셀루메티닙(5-[(4-브로모-2-클로로페닐)아미노]-4-플루오로-N-(2-히드록시에톡시)-1-메틸-1H-벤즈이미다졸-6-카복스아미드(AZD6244 또는 ARRY 142886, PCT 국제공개공보 WO제2003/077914호에 기재됨), 트라메티닙 디메틸 설폭사이드(GSK-1120212, CAS 1204531-25-80), RDEA436, N-[3,4-디플루오로-2-[(2-플루오로-4-요오도페닐)아미노]-6-메톡시페닐]-1-[(2R)-2,3-디히드록시프로필]-사이클로프로판술폰아미드(RDEA119 또는 BAY869766, PCT 국제공개공보 WO제2007/014011호에 기재됨), AS703026, BIX 02188, BIX 02189, 2-[(2-클로로-4-요오도페닐)아미노]-N-(사이클로프로필메톡시)-3,4-디플루오로-벤즈아미드(CI-1040 또는 PD184352로도 공지되어 있고, PCT 국제공개공보 WO제2000/035436호에 기재됨), N-[(2R)-2,3-디히드록시프로폭시]-3,4-디플루오로-2-[(2-플루오로-4-요오도페닐)아미노]-벤즈아미드(PD0325901 및 PCT 국제공개공보 WO제2002/006213호에 기재됨), 2'-아미노-3'-메톡시플라본(PD98059), 2,3-비스[아미노[(2-아미노페닐)티오]메틸렌]-부탄디니트릴(U0126 및 미국 특허 제2,779,780호에 기재됨), XL-518 (GDC-0973, Cas No. 1029872-29-4), G-38963 및 G02443714(AS703206로도 공지됨), 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 모든 MEK 억제제와 조합하여 사용될 수 있다. 다른 MEK 억제제는 WO제2013/019906호, WO제03/077914호, WO제2005/121142호, WO제2007/04415호, WO제2008/024725호, 및 WO제2009/085983호에 개시되어 있으며, 그 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다. MEK 억제제의 추가적인 예로는 베니메티닙(6-(4-브로모-2-플루오로페닐아미노)-7-플루오로-3-메틸-3H-벤조이미다졸-5-카복실산(2-히드록시에톡시)-아미드(MEK162, CAS 1073666-70-2, PCT 국제공개공보 WO제2003/077914호에 기재됨), 2,3-비스[아미노[(2-아미노페닐)티오]메틸렌]-부탄디니트릴(U0126 및 미국 특허 제2,779,780호에 기재됨), (3S,4R,5Z,8S,9S,11E)-14-(에틸아미노)-8,9,16-트리히드록시-3,4-디메틸-3,4,9,19-테트라히드로-1H-2-벤즈옥사사이클로테트라데신-1,7(8H)-디온](E6201, PCT 국제공개공보 WO제2003/076424호에 기재됨), 베무라페닙(PLX-4032, CAS 918504-65-1), (R)-3-(2,3-디히드록시프로필)-6-플루오로-5-(2-플루오로-4-요오도페닐아미노)-8-메틸피리도[2,3-d]피리미딘-4,7(3H,8H)-디온(TAK-733, CAS 1035555-63-5), 피마세티브(pimasertib)(AS-703026, CAS 1204531-26-9), 2-(2-플루오로-4-요오도페닐아미노)-N-(2-히드록시에톡시)-1,5-디메틸-6-옥소-1,6-디히드로피리딘-3-카복스아미드(AZD 8330) 및 3,4-디플루오로-2-[(2-플루오로-4-요오도페닐)아미노]-N-(2-히드록시에톡시)-5-[(3-옥소-[1,2]옥사지난-2-일)메틸]벤즈아미드(CH 4987655 또는 Ro 4987655)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시 양태에서, 치료학적 조합물은 JAK2 억제제, 예를 들어 CEP-701, INCB18424, CP-690550(타소시티닙)과 함께 투여된다. 예시적인 JAK 억제제는 룩솔리티닙(JAKAFI), 토파시티닙(CP690550), 악시티닙(AG013736, CAS 319460-85-0), 5-클로로-N2-[(1S)-1-(5-플루오로-2-피리미디닐)에틸]-N4-(5-메틸-1H-피라졸-3-y)-12,4-피리미딘디아민(AZD1480, CAS 935666-88-9), (9E)-15-[2-(1-피롤리디닐)에톡시]-7,12,26-트리옥사-19,21,24-트리아자테트라사이클로[18.3.1.12,5.114,18]-헥사코사-1(24),2,4,9,14,16,18(25),20,22-노나엔(SB-1578, CAS 937273-04-6), 모멜로티닙(CYT 387), 바리시티닙(INCB-028050 또는 LY-3009104), 파크리티닙(SB1518), (16E)-14-메틸-20-옥사-5,7,14,27-테트라아자테트라사이클로[19.3.1.12,6.18,12]헵타코사-1(25),2,4,6(27),8,10,12(26),16,21,23-데카엔(SB 1317), 간도티닙(LY 2784544) 및 N, N-시사이클로프로필-4-[(1,5-디메틸-1H-피라졸-3-일)아미노]-6-에틸-1,6-디히드로-1-메틸-이미다조[4,5-d]피롤로[2,3-b]피리딘-7-카복스아미드(BMS 911543)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
또 다른 실시 양태에서, 치료학적 조합물은 면역요법과 조합하여 투여된다. 면역요법 접근법은 예를 들어 암 백신, 면역 조절자(예를 들어, 공동 자극 분자의 활성화제 또는 억제 분자의 억제제), 환자 종양 세포의 면역원성을 증가시키기위한 생체 외 및 생체 내 접근법, 예를 들어, 인터루킨 2, 인터루킨 4 또는 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자와 같은 사이토카인을 사용한 형질 감염, T-세포 무반응을 감소시키는 접근법, 사이토카인-형질 감염된 수지상 세포와 같은 형질 감염된 면역 세포를 사용하는 접근법, 사이토카인-형질 감염된 종양 세포주를 사용하는 접근법 및 항-유전자형 항체를 사용하는 접근법을 포함한다. 이들 접근법은 일반적으로 암세포를 표적으로하고 파괴하기 위해 면역 이펙터 세포와 분자의 사용에 의존한다. 면역 이펙터는 예를 들어 악성 세포 표면의 일부 마커에 특이적인 항체일 수 있다. 항체 단독은 치료의 이펙터 역할을 수행할 수 있거나 실제로 세포 사멸을 촉진하기 위해 다른 세포를 동원할 수 있다. 항체는 또한 약물 또는 독소(화학 치료제, 방사성 핵종, 리신 A 사슬, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)에 접합될 수 있고 표적화제로서의 역할을 단지 수행한다. 대안적으로, 이펙터 악성 세포 표적과 직접 또는 간접적으로 상호 작용하는 표면 분자를 운반하는 림프구일 수 있다. 다양한 이펙터 세포는 세포 독성 T 세포 및 NK를 포함한다.
치료학적 조합물은, 수술; 방사선 요법(예를 들어, 방사선 분야가 설계된 3차원 등각 방사선 요법, 국소 방사선(예를 들어, 미리 선택된 표적 또는 기관에 대한 방사선) 또는 집중 방사선을 포함하는 외부 빔 요법)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 암 치료를 위한 하나 이상의 기존 방식과 함께 투여될 수 있다. 집중 방사선은 정위 방사선 수술, 분별 정위 방사선 수술 및 강도-조절된 방사선 요법으로 구성되는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 집중 방사선은, 예를 들어 문헌 WO제2012/177624호(전문이 참조로 본 명세서에 포함됨)에 기재된 바와 같은 입자 빔(양성자), 코발트-60(광자) 및 선형 가속기(X-선)로 구성되는 그룹으로부터 선택된 방사선 공급원을 가질 수 있다.
방사선 요법은 외부 빔 요법, 내부 방사선 요법, 임플란트 방사선, 정위 방사선 수술, 전신 방사선 요법, 방사선 요법 및 영구 또는 일시적 개재 근접 요법을 포함하는 여러 방법 중 하나 또는 방법의 조합물을 통해 투여될 수 있다. 용어 "근접 요법"은 종양 또는 기타 증식성 조직 질환 부위에서 또는 근처부위에서 신체에 삽입된 공간적으로 제한된 방사성 물질에 의해 전달되는 방사선 요법을 지칭한다. 이 용어는 방사성 동위원소(예를 들어, At-211, I-131, I-125, Y-90, Re-186, Re-188, Sm-153, Bi-212, P-32, 및 Lu의 방사성 동위원소)에 대한 노출을 제한없이 포함하도록 의도된다. 본 기재내용의 세포 컨디셔너로서 사용하기에 적합한 방사선 공급원은 고체 및 액체 모두를 포함한다. 비-제한적인 예로서, 방사선 공급원은 고체 공급원으로서 I-125, I-131, Yb-169, Ir-192, 고체 공급원으로서 I-125, 또는 광자, 베타 입자, 감마선 또는 기타 치료 광선을 방출하는 기타 방사성핵종과 같은 방사성 핵종일 수 있다. 방사성 물질은 또한 방사성 핵종 용액(예를 들어, I-125 또는 I-131의 용액)으로 만든 유체일 수 있거나, Au-198, Y-90과 같은 고체 방사성 핵종의 작은 고체 입자를 함유하는 적절한 유체의 슬러리를 사용하여 방사성 유체를 생성할 수 있다.
또한, 방사성 핵종(들)은 겔 또는 방사성 미소구로 구현될 수 있다.
9. 치료학적 또는 예방학적 용도
본 발명은 또한 RANK 활성화와 관련된 다양한 병태를 치료하기 위한 이들 항원-결합 분자에 기초한 치료학적 조합물 뿐만 아니라 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자의 용도를 포괄한다.
특히, 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자는 RANKL/RANK 시그널링 경로의 활성화와 관련된 상태의 발병을 치료 또는 억제하는데 사용하기 위해 고려된다. 이들 병태는 골감소 장애, 근병증 및 암이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
이들 적용의 특정 실시 양태에서, 본 발명은 대상체에서 골 손실의 발생을 치료 또는 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 유효량의 RANK 길항제 항원-결합 분자를 대상체에게 투여하여 골 손실의 발생을 치료 또는 억제하는 단계를 포함한다.
이들 적용의 다른 특정 실시 양태에서, 본 발명은 대상체에서 RANKL/RANK 시그널링 경로의 활성화와 관련된 암의 발병을 치료 또는 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 유효량의 RANK 길항제 항원-결합 분자를 대상체에게 투여하여 암 발생을 치료 또는 억제하는 단계를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 암은 HR 음성(예를 들어, ER-; PR-; HER2-; ER-, PR-; ER-, HER2-; PR-, HER2-; 및 ER-, PR-, HER2-) 유방암, BRCA-1 돌연변이 양성 유방암, HR 음성(예를 들어, ER-; PR-; HER2-; ER-, PR-; ER-, HER2-; PR-, HER2-; 및 ER-, PR-, HER2-) 및 BRCA-1 돌연변이 양성 유방암을 포함하는 유방암, 전립선 암, KRAS 돌연변이 또는 KRAS 및 LKB1 돌연변이 NSCLC를 포함하는 NSCLC, 및 ccRCC를 포함하는 RCC 세포로부터 선택된다.
추가로, 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자를 하나 이상의 항-ICM 항원-결합 분자 또는 하나 이상의 항-AMA 항원-결합 분자와 조합하여 사용하는 본 발명의 치료학적 조합물은 면역을 자극하거나 증가하기 위한 특별한 유용성을 갖는데, 예를 들어 면역억제 또는 종양에 대한 내성의 발달 또는 진행을 억제하거나, 암의 발달, 진행 또는 재발을 억제한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 제제(예를 들어, RANK 길항제 항원-결합 분자 및 치료학적 조합물)는 병태(예를 들어, 골감소 장애, 근병증 또는 암)가 진단된 후에 치료학적으로 사용될 수 있거나 또는 대상체에서 병태(예를 들어, 골감소 장애, 근병증 또는 암)가 발생하기 전에 예방학적으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 (a) RANKL/RANK 시그널링 경로의 활성화와 관련된 병태의 치료, (b) RANKL/RANK 시그널링 경로의 활성화와 관련된 상태의 발병 지연, (c) RANKL/RANK 시그널링 경로의 활성화와 관련된 상태의 진행 지연, 및 (d) RANKL/RANK 시그널링 경로의 활성화와 관련된 병태를 가진 환자의 생존을 연장하기 위해 사용하기 위한 RANK 길항제 항원-결합 분자를 제공한다. 본 발명에 포함되는 골감소 장애는 골다공증, 치주염, 암 관련 골 전이, 다발성 골수종, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 가족성 확장성 골 용해, 파제트 병(연소성파제트병 포함), 파골세포종, 만성 바이러스 감염 및 성인 및 소아 백혈병과 관련된 골 손실, 인공 관절 주위 골 손실, 뿐만 아니라 유방암, 전립선 및 다발성 골수종과 같이 파골세포 활동이 증가하고 골 흡수가 유도되는 암을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 대표적인 근병증은 영양 장애, 근긴장증, 선천성 근병증(예를 들어, 네말린 근병증, 다핵/미니코어 근병증 및 중심핵 근병증), 미토콘드리아 근병증, 가족성 주기성 근병증, 염증성 근병증 및 대사성 근병증(예를 들어, 글리코겐 저장 질환 및 지질 저장 장애)과 같은 유전성 근병증, 뿐만 아니라 외부 물질 유발 근병증(예를 들어, 약물 유발성 근병증 및 글루코코르티코이드 근병증, 알코올성 근병증, 기타 독성 물질로 인한 근병증), 근염(예를 들어, 피부근염, 다발성 근염 및 봉입체 근염), 골수 근염, 횡문근 융해증 및 미오글로빈 뇨증, 및 폐용위축과 같은 후천선 근병증을 포함한다.
본 발명은 또한 (1) 암을 치료하고, (2) 암의 진행을 지연시키고, (3) 암의 이동 또는 전이를 억제하고, (4) 암 환자의 생존 연장, 또는 (5) 암에 대한 세포 매개 면역 반응을 자극하기 위한 방법에서 RANK 길항제 항원 결합-분자 및 적어도 하나의 항-ICM 길항제 또는 적어도 하나의 항-AMA 길항제를 포함하는 치료학적 조합물을 제공한다. 대표적인 암은 고형 종양, 예를 들어 흑색종(예를 들어, 진행 단계(예를 들어, II-IV 단계) 흑색종 또는 HLA-A2 양성 흑색종), 췌장암(예를 들어, 진행성 췌장암), 고형 종양, 유방암(예를 들어, 전이성 유방암종, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체 또는 Her2/neu 중 하나, 둘 또는 모두를 발현하지 않는 유방암, 예를 들어 삼중 음성 유방암), 신 세포 암종(예를 들어, 진행성(예를 들어, IV 단계) 또는 전이성 신 세포 암종(MRCC)), 전립선 암(예를 들어, 호르몬 불응성 전립선 선암종), 대장암, 폐암(예를 들어, 비소세포 폐암), 골암, 피부암, 두경부암(예를 들어, HPV+ 편평 세포 암종), 피부 또는 안구내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문암, 위암, 고환암, 자궁암, 난관암종, 자궁 내막 암종, 자궁 경부암종, 질암종, 외음부 암종, 메르켈 세포암, 소아 고형 종양, 방광암, 신장 또는 요관 암, 신우암, 중추 신경계 신생물(CNS), 종양 혈관 신생, 척수 종양, 뇌간 신경 교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 표피 암, 또는 편평 세포 암, 또는 혈액 악성 종양, 예를 들어, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 식도암, 소장암, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병을 포함하는 만성 또는 급성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병(예를 들어, 재발성 또는 불응성 만성 림프구성 백혈병), 소아 고형 종양, 림프구성 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 방광암, 신장 또는 요관암, 신장 골반 암종, 중추 종양 신경계(CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관 신생, 척수 종양, 뇌간 신경 교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 표피 암, 편평 세포 암, T 세포 림프종, 석면에 의해 유도된 암(예를 들어, 중피종)을 포함한 환경적으로 유발된 암, 및 상기 암의 조합물을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 암은 전이성이다.
임의의 주어진 대상체에 대한 특정 동시 및/또는 순차적 투여 요법은 환자가 진단된 특정 질환 또는 병태에 기초하여 또는 환자의 질환 또는 병태의 단계와 관련하여 확립될 수 있다. 예를 들어, 환자가 덜 공격적인 암 또는 초기 단계에 있는 암으로 진단받은 경우, 환자는 RANK 길항제 항원-결합 분자 및 항-ICM 또는 항-AMA 항원-결합 분자의 동시 투여에 대한 임상적 이점 및/또는 면역-관련 반응을 달성할 가능성이 증가할 수 있다. 대안적으로, 환자가 보다 공격적인 암 또는 후기 단계에 있는 암으로 진단받은 경우, 환자는 동시 투여에 대한 임상적 이점 및/또는 면역-관련 반응을 달성 할 가능성이 감소할 수 있으며, 이에 따라 더 높은 용량의 RANK 길항제 항원-결합 분자 및/또는 항-ICM 또는 항-AMA 항원-결합 분자가 투여되어야 하거나 또는 더 공격적인 투여 요법 또는 제제 또는 조합물 요법이 보장될 수 있음을 암시할 수 있다.
치료학적 또는 예방학적 유효량의 RANK 길항제 항원-결합 분자를 단독으로 또는 항-ICM 또는 항-AMA 항원-결합 분자와 조합하여 대상체에 주사하는 것이 바람직하다. 사용되는 실제 투여량은 환자의 요구 사항과 치료중인 병태의 심각성에 따라 다양할 수 있다. 특정 상황에 대한 적절한 시작 투여량의 결정은 당업자의 목록 내에 있지만, 치료 요법의 할당은 질병의 징후 및 단계를 고려하면 도움이 될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 특정 피험자에 대한 특정 용량 수준 및 투여 빈도는 다양할 수 있으며, 사용된 특정 화합물의 활성, 해당 화합물의 대사 안정성 및 작용 기간, 종, 연령, 체중, 환자의 일반적인 건강 상태, 성별 및 식이 요법, 투여 방식 및 시간, 배설 속도, 약물 조합 및 특정 병태의 중증도를 포함한 다양한 요인에 따라 좌우될 것임을 이해할 것이다. 치료를 위한 바람직한 대상체는 동물, 가장 바람직하게는 인간과 같은 포유 동물 종, 및 암에 대한 환자인 개, 고양이 등과 같은 가축을 포함한다.
10. 키트
본 발명의 추가 실시 양태는 대상체에서 암을 치료하기 위한 키트이다. 본 키트는 본 명세서에 개시된 임의의 약제학적 조성물을 포함한다.
본 발명의 키트에 사용하기 위해, 약제학적 조성물은 적합한 치료학적 조합물, 및 암 치료를 위한 지침서를 임의로 포함한다. 키트는 또 대상체에게 약제학적 조성물을 투여하는데 사용하기 위해, 각각의 약제학적 조성물 및 기타 포함된 시약(예를 들어, 완충제, 안정한 염 용액 등)에 대한 적절한 보관 용기(예를 들어, 앰플, 바이알, 튜브 등)를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물 및 기타 시약은 예를 들어 분말 약제학적 조성물 중의 용액과 같은 임의의 편리한 형태로 키트에 존재할 수 있다. 키트는 약제학적 조성물 및 다른 임의의 시약을 수용하기 위한 하나 이상의 구획을 임의로 갖는 포장 용기를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명을 용이하게 이해하고 실행하기 위해서, 특정 바람직한 실시 양태가 다음의 비-제한적인 실시예에 의해 설명될 것이다.
실시예
실시예 1
길항제 항-RANK 항원-결합 분자의 분리
완전 인간형 Fab-기반 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 CSL(호주 빅토리아주의 멜버른 내 파크빌 소재)사로부터 수득했다. 인간 Fab 라이브러리의 작제 및 스크리닝을 위한 일반적인 절차는 참조문헌[de Haard 외 (1998, Advanced Drug Delivery Reviews 31, 5-31; 1999, J. Biol. Chem. 274:18218-18230)]에 기재되어 있다.
RANK 단백질의 전체 재조합 세포외 영역에 결합하는 Fab 단편에 대한 라이브러리를 스크리닝하여 CDR2 및 CDR3 영역 내의 에피토프를 표적으로 하는 Fab의 식별을 용이하게 하여 RANKL의 길항 작용 및 마우스 RANK와의 교차-반응성 결합을 가능하도록 한다.
비오틴-항-인간 Fc 항체 포획(Jackson ImmunoResearch Laboratories 109-065-098)에 의해 다이나비즈®(Dynabeads®) M-280 스트렙트아비딘(인비트로젠™, 써모피셔사이언티픽 11205D)에 고정된 RANK-Fc 단백질을 사용하여 RANK에 대한 결합제에 대하여 파지미드 라이브러리를 스크리닝했다. 앞서 기재된 방법에 따라 선별을 수행하였다(참조문헌: Hoet 외, 2005. Nat Biotechnol. 23(3):344-348; Panousis 외, 2016. MAbs 8(3):436-453). 간략하게는, 스트렙타비딘 비드-고갈된 파지(streptavidin bead-depleted phage) 투입물을 2% 우유/PBST (MTPBS, 0.1 % Tween-20) 중 10 ㎍의 고정된 RANK-Fc와 함께 실온에서 20분 동안 인큐베이션함으로써 3회 선별을 수행한 다음, 12회 세척하였다. 각 횟수의 패닝을 시행하기 전, 파지미드 라이브러리는 다이나비즈® M-280 스트렙타비딘 및 비오틴 항-인간 Fc 항체 포획을 통해 무관한 인간 IgG 항체로 코팅된 비즈와 함께 인큐베이션함으로써 스트렙타비딘 및/또는 Fc에 대한 비특이적 결합제가 고갈되었다. 선택된 파지 클론은 대장균 TG1 세포 대수기에서 증폭되었고, Fab-파지미드는 M13K07 헬퍼 파지의 슈퍼-감염에 의해 구조되었다.
RANK 차단 잠재력을 가진 클론을 강화시키기 위해서, 가용성 인간 RANKL을 사용하여 고정화된 인간 RANK-Fc 단백질에 결합된 파지를 용출하였다.
3회 선별후 대략 1,000 개의 개별 클론을 선택하고 RANK 결합에 대해 Fab-파지 ELISA로 스크리닝하였다. 독특한 클론을 결정하기 위해 인간 RANK-Fc 파지미드 결합제로부터의 Fab cDNA를 시퀀싱하였다. Fab의 중쇄 가변 영역 및 경쇄를 PCR-증폭시키고 기재된 바와 같이 본질적으로 시퀀싱하였다(Hoet 외, 2005, 상기 참조). 사용된 ELISA 방법은 참조문헌(Panousis 외, 2016, 상기참조)에 따른다.
RANKL 용출 실험에서 분리된 고유한 양성 huRANK-Fc 결합 파지 클론을, 마우스 RANK-Fc에 대한 종 교차-반응성에 대해서 파지 ELISA로 테스트하였다. 요약하자면: 인간 RANK-Fc 및 마우스 RANK-Fc 결합을 번갈아 가며 확인한 3 개의 파지미드 클론 이외에 5 개의 파지미드 클론(R03A03, R03A06, R03A10, R03A12, R03B12로 지정함)이 ELISA에 의해 인간 및 마우스 RANK-Fc 모두에 반응하였다(도 1).
인간 RANK-Fc 및 마우스 RANK-Fc에 양성 결합된 독특한 파지 클론을 RANKL과 단일점 파지 경쟁 인간 RANK-Fc ELISA로 테스트하여 파지미드 클론이 RANKL/RANK 차단 가능성 또는 길항 활성을 가질 수 있는지 여부를 결정하였다. 인간 RANK-Fc에 대한 하나의 클론(R03A03)의 결합은 인간 RANKL의 존재하에 실질적으로 (> 75 %) 차단되었다(도 2). 인간 RANK-Fc에 대한 다른 파지미드 클론(R03A06, R03A10, R03A12, R03B12, R03C03, R03C04, R03C05)의 결합은 RANKL의 존재하에 차단되지 않았다. 따라서 파지미드 R03A03은 다른 RANK-결합 파지미드 클론과 구별되는 특성을 가지고 있다.
ELISA에 의해 인간 RANK-Fc 및 마우스 RANK-Fc에 결합된 독특한 파지미드 클론을 전장 IgG(마우스 IgG2a Fc 백본상의 인간 Fab)로 재포맷하였다. 총 24개의 고유한 항체 클론이 전장 IgG(마우스 IgG2a Fc 백본상의 인간 Fab) 항체를 발현하도록 재포맷되었다. 인간 Fab는 마우스 IgG2aFc에 융합된다(임의의 링커 서열은 없음).
IgG는 일시적 형질 감염으로부터 발현되었고 정제된 단백질은 기능적 시험관내 효능 테스트 전에 ELISA로 결합에 대한 테스트를 거쳤다. 제조업체의 지침서 및 앞서 기재된 내용에 따라 ExpiFectamineTM 293 형질 감염 키트(써모피셔사이언티픽)를 사용하여 현탁 적응된 293T 세포(Expi293F 세포)의 일시적 형질 감염으로 IgG를 생산하였다(참조문헌: Spanevello 외, 2013, J Neurotrauma 30:1023-1034). 앞서 기재된 참조문헌(Panousis 외, 2016, 상기 참조)에서 기재한 대로 IgG의 정제를 수행하였다.
실시예 2
세포-기반 기능 검정에서 항-RANK 항체의 길항 활성
세포-기반 기능 검정에서 3A3 항체의 기능적 억제 효과를 평가하기 위해, 시험관 내 파골세포 형성에 대한 항-RANK 항체의 효과를 테스트하였다. 시험관내 TRAP+ 파골세포 검정에 대한 방법은 본질적으로 참조문헌(Simonet 외, 1997. Cell 89(2): 309-319)에 기재된 바와 같다. 50 ng/mL의 인간 재조합 CSF-1(Preprotech사)이 보충된 완전한 DMEM(10 % FCS + PS + Glu)의 총 부피 200 μL/웰에서 25000 세포/웰의 밀도로 96-웰 평평한 바닥 플레이트에 정상 BL/6 마우스의 골수(BM) 세포를 시딩(seeding)하였다. 48 시간 동안 배양한 후, 배지를 50 ng/mL의 인간 재조합 CSF-1 및 200 ng/mL의 가용성 muRANKL 또는 가용성 huRANKL (Miltenyi)이 보충된 완전한 DMEM으로 교체하였다. 세포를 CSF-1 및 인간 또는 마우스 RANKL로 4일 동안(항체 억제제 존재 및 부재) 배양한 다음 TRAP+ 다핵(3 개 이상의 핵)파골세포를 계수했다. 생성된 파골세포는 앞서 기재한 바와 같이 TRAP 세포 화학적 염색으로 평가하였다(참조문헌 Simonet 외, 1997, 상기 참조).
파골세포 형성은 재조합 인간 RANKL을 사용하여 평가하였다. 양성 대조군 RANK-Fc의 효과와 유사하게, 동형 IgG2a의 첨가가 아닌 항-RANK 항체 3A3의 첨가는 용량-의존 방식으로 TRAP+ 다핵 세포의 형성을 억제하였다(도 3). 특히, 비-차단 항-RANK mAb 3B10의 첨가는 파골세포 형성에 영향을 미치지 않았다. 항-RANK 항체 3A3은 125 내지 250 ng/mL 농도로 파골세포 형성을 완전히 차단한 반면, 양성 대조군 RANK-Fc는 500 ng/mL 내지 1 μg/mL 농도로 파골세포 형성을 완전히 차단하였다. 대조군 RANK-Fc는 92 ng/mL의 IC50을 나타냈으나, 항-RANK 3A3 항체는 3.5 ng/mL의 IC50으로 huRANKL-유도된 파골세포 형성을 차단하는 길항 활성을 입증하였다.
이들 결과는 항-RANK 3A3 항체가 세포 기반 RANKL/RANK 길항 검정(파골세포 형성)에서 양성 대조군 RANK-Fc와 비교하여 적어도 동등한 활성을 가짐을 입증한다. 계산된 IC50은 항-RANK 3A3 항체가 양성 대조군 RANK-Fc에 비해 약 25 배 더 큰 효능을 가짐을 시사한다. 이들 결과는 항-RANK 3A3 항체가 RANKL/RANK 활성을 거스르는 길항 활성 및 시험관내 파골세포 분화를 유지함을 시사하였다.
다음 검정에서, 재조합 마우스 RANKL을 사용하여 파골세포 형성을 평가하였다. 양성 대조군 항-muRANKL IK22-5 mAb의 효과와 유사하게, 동형 IgG2a의 첨가가 아닌 항-RANK 항체 3A3의 첨가는 용량-의존 방식으로 TRAP+ 다핵 세포의 형성을 억제하였다(도 4). 다시 말하면, 비-차단 항-RANK mAb 3B10의 첨가는 파골세포 형성에 영향을 미치지 않았다. 항-RANK 항체 3A3은 33 내지 62.5 ng/mL 농도로 파골세포 형성을 완전히 차단한 반면, 양성 대조군 항-muRANKL IK22-5 mAb는 62.5 내지 125 ng/mL 농도로 파골세포 형성을 완전히 차단하였다. 대조군 항-muRANKL mAb IK22-5는 19.8 ng/mL의 IC50을 나타냈으나, 항-RANK 3A3 항체는 7.4 ng/mL의 IC50으로 muRANKL-유도된 파골세포 형성을 차단하는 길항 활성을 입증하였다.
이들 결과는 항-RANK 3A3 항체가 세포 기반 RANKL/RANK 길항 검정(파골세포 형성)에서 양성 대조군 항-muRANKL mAb IK22-5와 비교하여 적어도 동등한 활성을 가짐을 입증한다. 계산된 IC50은 항-RANK 3A3 항체가 양성 대조군 항-muRANKL mAb IK22-5에 비해 약 2배 더 큰 효능을 가짐을 시사한다. 이들 결과는 항-RANK 3A3 항체가 RANKL/RANK 활성을 거스르는 길항 활성 및 시험관 내 파골세포 분화를 유지함을 시사하였다.
실시예 3
RANK 및 PD-L1의 이중 차단은 섬유육종 종양 면역을 현저하게 향상시킨다
항-RANK 3A3 항체가 세포 기반 RANKL/RANK 길항 검정(시험관내 파골세포 형성)에서 양성 대조군 RANK-Fc와 비교하여 적어도 동등한 활성을 갖는다는 것을 입증하는 실시예 2에 제시된 결과를 고려할 때, 피하 종양을 가진 마우스에서 RANK 및 PD-L1의 이중 차단의 효능이 길항성 항-RANK 및 항-PD-L1 항체를 사용하여 평가되었다. 항-PD-L1 민감성 MCA1956 섬유육종 모델에서, 길항적 항-RANK mAb의 첨가는 상당히 향상된 항-PD-L1 효능을 보여주었다(도 5, P <0.0001). 이러한 관찰은 길항적 항-RANK 3A3 항체가 항-종양 면역을 개선할 수 있음을 지지한다.
실시예 4
RANK 및 PD-L1의 이중 차단은 대장 종양 면역을 현저하게 향상시킨다
대장 MC38 대장 암종 모델에서, 길항적 항-RANK mAb의 첨가는 현저히 향상된 항-PD-L1 효능을 보여주었다(도 6, P <0.0001). 이러한 관찰은 길항적 항-RANK 3A3 항체가 항-종양 면역을 개선할 수 있음을 입증한다.
본 명세서에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 공보의 기재는 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 명세서 내 참조문헌의 인용은 이러한 참고 문헌이 본 출원에 대한 "선행 기술"로 이용가능하다는 것을 인정하는 것으로 해석해서는 안된다.
명세서 전체에 걸쳐, 본 발명을 임의의 일 실시 양태 또는 특정 특징들의 집합으로 제한하지 않고 본 발명의 바람직한 실시 양태를 기재하는 것을 목표로 한다. 따라서, 당업자는 본 기재 내용을 감안하여, 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 예시된 특정 실시 양태에서 다양한 수정 및 변경이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 모든 수정 및 변경은 첨부된 청구 범위 내에 포함되도록 의도된다.
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Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 184 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic antigen binding molecule <400> 184 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Val Ser Tyr Asp Gly Ser Thr Lys Ser Tyr Ala Asp Ser Met 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Pro Ala Leu Arg Tyr Phe Asp Trp Gly Tyr Phe Gln His 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala 115 120 125 Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala 130 135 140 Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala 145 150 155 160 Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly Val 165 170 175 Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser 180 185 190 Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr 195 200 205 Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala 210 215 220 Pro Thr Glu Cys Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys 225 230 235 240 Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 245 250 255 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 260 265 270 Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 275 280 285 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 290 295 300 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 305 310 315 320 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 325 330 335 Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 340 345 350 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 355 360 365 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 370 375 380 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 385 390 395 400 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 405 410 415 Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn 420 425 430 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 435 440 445 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 450 455 <210> 185 <211> 204 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic antigen binding molecule <400> 185 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly 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220 Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 225 230 235 240 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 245 250 255 Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val 260 265 270 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 275 280 285 Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 290 295 300 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly 305 310 315 320 Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 325 330 335 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr 340 345 350 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 355 360 365 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 370 375 380 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Ala 385 390 395 400 Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe 405 410 415 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 420 425 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Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 188 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 188 Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn 1 5 10 15 Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp 20 <210> 189 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 189 Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly 1 5 10

Claims (102)

  1. (1) 서열 번호 3에 제시된 VHCDR1 아미노산 서열, 서열 번호 4에 제시된 VHCDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호 5에 제시된 VHCDR3 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH), 및 서열 번호 6에 제시된 VLCDR1 아미노산 서열, 서열 번호 7에 제시된 VLCDR2 아미노산 서열, 및 서열 번호 8에 제시된 VLCDR3 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
    (2) 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL;
    (3) 서열 번호 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(적어도 91% 내지 99% 및 이들 사이의 모든 정수 백분율을 포함함)의 서열 동일성을 갖는 VH, 및 서열 번호 2의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(적어도 91% 내지 99% 및 이들 사이의 모든 정수 백분율을 포함함)의 서열 동일성을 갖는 VL;
    (4) 서열 번호 1의 아미노산 서열 내 각 CDR 이외의 프레임워크 영역의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(적어도 91% 내지 99% 및 이들 사이의 모든 정수 백분율을 포함함)의 서열 동일성을 갖는 VH, 및 서열 번호 2의 아미노산 서열 내 각 CDR 이외의 프레임워크 영역의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%(적어도 91% 내지 99% 및 이들 사이의 모든 정수 백분율을 포함함)의 서열 동일성을 갖는 VL; 또는
    (5) 서열 번호 1의 아미노산 서열 내 각 CDR 이외의 프레임워크 영역의 서열에서 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5)의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호 2의 아미노산 서열 내 각 CDR 이외의 프레임워크 영역의 서열에서 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5)의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, RANK 길항제 항원-결합 분자.
  2. 제1항에 있어서, 항원-결합 분자가 분리된, 정제된, 합성 또는 재조합 형태인, 항원-결합 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항원-결합 분자가 1가(예를 들어, Fab, scFab, Fab', scFv, 외팔 항체(one-armed antibodies) 등)인, 항원-결합 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 다음 활성 중 임의의 하나 이상을 갖는, 항원-결합 분자: (a) RANK에 대한 RANKL의 결합 억제; (b) RANK 활성화 억제; (c) 다운스트림 RANK-매개 분자 시그널링(예를 들어, TRAF 단백질의 RANK 모집)의 억제; (d) RANK 다중화 억제; (e) 파골세포 분화 감소; (f) 파골세포 활성화 감소; (g) 파골세포 생존 감소; (h) 골 손실 억제 및 골밀도 증가; (i) 종양 미세환경(TME)에서 골수 세포 또는 다른 면역 세포의 면역억제 활성의 억제; 및 (j) 종양 세포(예를 들어, 삼중 음성 유방암(TNBC)세포 및 BRCA-1 돌연변이 양성 유방암 세포를 포함하는 유방암 세포, 비-소세포 폐암 (NSCLC) 세포 및 신장 세포 암종(RCC) 세포)의 증식, 이동, 생존 및/또는 형태형성의 억제.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 분자가 전달 비히클(예를 들어, 리포솜, 나노입자, 마이크로입자, 덴드리머(dendrimer) 또는 사이클로덱스트린)에 함유되는, 항원-결합 분자.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 RANK 길항제 항원-결합 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  7. 하나 이상의 제어 서열과 작동 가능하게 연결된 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 RANK 길항제 항원-결합 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 작제물(construct).
  8. 제7항에 있어서, 발현 작제물(예를 들어, 플라스미드(plasmids), 코스미드(cosmids), 파지(phages) 또는 바이러스)의 형태인, 작제물.
  9. 제8항의 작제물을 함유하는 숙주 세포.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 RANK 길항제 항원-결합 분자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 항-골흡수제(예를 들어, 특히 부갑상선 호르몬, BMP2, 비타민 D, 항-염증제로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 신진대사 증강제; 특히 비스포스포네이트, 카텝신 K 억제제, p38 억제제, JNK 억제제, IKK 억제제, NF-κB 억제제, 칼시뉴린 억제제, NFAT 억제제, PI3K 억제제로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 이화 작용 억제제) 및 화학요법제(예를 들어, 항증식성/항신생물 약물, 세포 증식 억제제, 암세포 침입을 억제하는 제제, 성장 인자 기능 억제제, 항-혈관 신생제, 혈관 손상제 등) 또는 면역요법제(예를 들어, 사이토카인, 사이토카인-발현 세포, 항체 등)로부터 선택되는 적어도 하나의 보조제를 추가로 포함하는, 조성물.
  12. RANK-발현 세포를 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 RANK 길항제 항원-결합 분자와 접촉시킴으로써 RANK 발현 세포에 대한 RANK의 결합을 억제하는 단계를 포함하는, RANK-발현 세포에 대한 RANKL의 결합을 억제하는 방법.
  13. RANK-발현 세포를 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 RANK 길항제 항원-결합 분자와 접촉시킴으로써 RANK 발현 세포에 대한 RANK의 활성화를 억제하는 단계를 포함하는, RANK-발현 세포에 대한 RANK의 활성화를 억제하는 방법.
  14. RANK-발현 세포를 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 RANK 길항제 항원-결합 분자와 접촉시킴으로써 RANK 발현 세포에서 RANK-매개 분자 시그널링을 억제하는 단계를 포함하는, RANK-발현 세포에서 RANK-매개 분자 시그널링(예를 들어, TRAF 단백질의 RANK 동원)을 억제하는 방법.
  15. RANK-발현 세포를 본 명세서에 기재된 RANK 길항제 항원-결합 분자와 접촉시킴으로써 RANK 발현 세포에서 RANK 다중화를 억제하는 단계를 포함하는, RANK-발현 세포에서 RANK 다중화를 억제하는 방법.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, RANK-발현 세포는 파골 세포, 항원-제시 세포(antigen-presenting cells)(예를 들어, 단핵구 및 수지상 세포) 및 이펙터 면역 세포(effector immune cells)(예를 들어, T 세포)와 같은 면역 세포, 조혈 전구체, 및 유방암 세포, 전립선 암 세포, NSCLC 세포 및 RCC 세포와 같은 종양 세포로부터 선택되는, 방법.
  17. 파골 세포를 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 RANK 길항제 항원-결합 분자와 접촉시킴으로써, 파골 세포의 분화, 활성화 및/또는 생존을 억제하는 단계를 포함하는, 파골 세포의 분화, 활성화 및/또는 생존을 억제하는 방법.
  18. 면역 세포를 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 RANK 길항제 항원-결합 분자와 접촉시킴으로써 면역 세포의 면역억제 활성을 억제하는 단계를 포함하는, 면역 세포(예를 들어, 골수 세포 또는 Treg)의 면역억제 활성을 억제하는 방법.
  19. 종양 세포를 제1항 내지 제4 항 중 어느 한 항의 RANK 길항제 항원-결합 분자와 접촉시킴으로써 종양 세포의 증식, 생존 또는 이동을 억제하는 단계를 포함하는, 종양 세포의 증식, 생존 또는 이동을 억제하는 방법.
  20. 유효량의 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 RANK 길항제 항원-결합 분자를 대상체에게 투여하여 상태의 발병을 치료 또는 억제하는 단계를 포함하는, 대상체에서 RANKL/RANK 시그널링 경로의 활성화와 관련된 상태의 발병을 치료 또는 억제하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, RANKL/RANK 시그널링 경로 활성화와 관련된 병태가 골감소 장애(osteopenic disorder), 근병증(myopathy) 및 암(cancer)으로부터 선택되는, 방법.
  22. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 RANK 길항제 항원-결합 분자 및 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자를 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 본질적으로 구성되는 치료학적 조합물(combination).
  23. 제22항에 있어서, RANK 길항제 항원-결합 분자 및 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자가 단일 조성물(예를 들어, 혼합물)의 형태인 치료학적 조합물.
  24. 제22항에 있어서, RANK 길항제 항원-결합 분자 및 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자는 별도의 조성물에서 별개의 성분의 형태인, 치료학적 조합물.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자가 다음으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 ICM에 길항하는 치료학적 조합물: 예정된(programmed) 사멸 1 수용체(PD-1), 예정된 사멸 리간드 1(PD-L1), 예정된 사멸 리간드 2(PD-L2), 세포독성 T-림프구-관련 항원 4(CTLA-4), A2A 아데노신 수용체(A2AR), A2B 아데노신 수용체(A2BR), B7-H3 (CD276), V-세트 도메인-함유 T-세포 활성화 억제제 1(VTCN1), B- 및 T-림프구 감쇠제(BTLA), 인돌아민 2,3-다이옥시게나제(IDO), 살해-세포 면역글로불린-유사 수용체(KIR), 림프구 활성화 유전자-3 (LAG3), T 세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3(TIM-3), T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제제(VISTA), 5'-뉴클레오티다제(CD73), 택타일(TACTILE: CD96), 폴리오바이러스 수용체(CD155), DNAX 액세서리 분자-1(DNAM-1), 폴리오바이러스 수용체-관련 2(CD112), 세포독성 및 조절성 T-세포 분자(CRTAM), 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 멤버 4(TNFRS4; 0X40; CD134), 종양 괴사 인자 (리간드) 수퍼패밀리 멤버 4(TNFSF4; 0X40 리간드 (OX40L), 자연 살해 세포 수용체 2B4(CD244), CD160, 글루코코르티코이드-유도된 TNFR-관련 단백질(GITR), 글루코코르티코이드-유도된 TNFR-관련 단백질 리간드(GITRL), 유도성 공동 자극제(ICOS), 갈렉틴 9(GAL-9), 4-1BB 리간드(4-1BBL; CD137L), 4-1BB(4-1BB; CD137), CD70(CD27 리간드(CD27L)), CD28, B7-1(CD80), B7-2(CD86), 신호-조절 단백질(SIRP-1), 인테그린 관련 단백질(IAP; CD47); B-림프구 활성화 마커(BLAST-1; CD48), 자연 살해 세포 수용체 2B4(CD244); CD40, CD40 리간드(CD40L), 헤르페스바이러스 진입 매개체(HVEM), 막관통 및 면역글로불린 도메인 함유 2(TMIGD2), HERV-H LTR-연관 2(HHLA2), 혈관 내피 성장 억제제(VEGI), 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 멤버 25(TNFRS25), 유도성 T-세포 공동 자극 리간드(ICOLG; B7RP1) 및 Ig 및 ITIM(면역 수용체 티로신-기반 억제 모티프) 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT).
  26. 제25항에 있어서, 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자는 PD-1 길항제 항원-결합 분자, PD-L1 길항제 항원-결합 분자 및 CTLA4 길항제 항원-결합 분자로부터 선택되는, 치료학적 조합물.
  27. 제25항에 있어서, 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자는 PD-1 길항제 항원-결합 분자를 포함하는, 치료학적 조합물.
  28. 제25항에 있어서, 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자는 PD-L1 길항제 항원-결합 분자를 포함하는, 치료학적 조합물.
  29. 제25항에 있어서, 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자는 CTLA4 길항제 항원-결합 분자를 포함하는, 치료학적 조합물.
  30. 제25항에 있어서, 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자는 PD-1 길항제 항원-결합 분자 및 PD-L1 길항제 항원-결합 분자를 포함하는, 치료학적 조합물.
  31. 제25항에 있어서, 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자는 PD-1 길항제 항원-결합 분자 및 CTLA4 길항제 항원-결합 분자를 포함하는, 치료학적 조합물.
  32. 제25항에 있어서, 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자는 PD-L1 길항제 항원-결합 분자 및 CTLA4 길항제를 포함하는, 치료학적 조합물.
  33. 제25항에 있어서, 항-ICM 항원-결합 분자는 Treg 세포가 발현이 부족하거나 낮은 수준으로 발현하는 ICM에 길항하는, 치료학적 조합물.
  34. 제25항에 있어서, 항-ICM 항원-결합 분자는 CTLA4보다 Treg에서 더 낮은 수준으로 발현되는 ICM(예를 들어, PD-1 또는 PD-L1)에 길항하는, 치료학적 조합물.
  35. 제25항에 있어서, 항-ICM 항원-결합 분자는 Treg보다 면역 이펙터 세포(예를 들어, 이펙터 T 세포, 대식세포, 수지상 세포, B 세포 등)에서 더 높은 수준으로 발현되는 ICM(예를 들어, PD-1 또는 PD-L1)을 길항하는, 치료학적 조합물.
  36. 제27항에 있어서, 항-PD-1 항원-결합 분자는 MAb(비 제한적 예로 니볼루맙(nivolumab), 펨브롤리주맙(pembrolizumab), 피딜리주맙(pidilizumab) 및 MEDI-0680(AMP-514), AMP-224, JSOO1-PD-1, SHR-1210, Gendor PD-1, PDR001, CT-011, REGN2810, BGB-317을 포함함) 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 PD-1에 결합하기 위해 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙 또는 MEDI-0680과 경쟁하는 분자인, 치료학적 조합물.
  37. 제27항 또는 제36항에 있어서, 항-PD-1 항원-결합 분자는 서열 번호 9(즉, 서열 번호 10에 제시된 천연 PD-1 서열의 62 내지 86번 잔기), 서열 번호 11(즉, 서열 번호 10에 제시된 천연 PD-1 서열의 118 내지 136번 잔기) 및 서열 번호 12(즉, 서열 번호 10에 제시된 천연 PD-1 서열의 66 내지 97번 잔기에 상응함)에 제시된 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산에 특이적으로 결합하는, 치료학적 조합물.
  38. 제28항에 있어서, 항-PD-L1 항원-결합 분자가 MAb(비 제한적 예로, 더발루맙(durvalumab: MEDI4736), 아테졸리주맙(atezolizumab, 티센트릭: Tecentriq), 아벨루맙(avelumab), BMS-936559/MDX-1105, MSB0010718C, LY3300054, CA-170, GNS-1480, 및 MPDL3280A을 포함함), 또는 이의 항원-결합 단편인, 치료학적 조합물.
  39. 제28항 또는 제38항에 있어서, 항-PD-L1 항원-결합 분자는 서열 번호 13(즉, 서열 번호 14에 제시된 전장 천연 PD-L1 아미노산 서열의 279 내지 290번 잔기)에 제시된 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산에 특이적으로 결합하고, PD-L1에 결합하기 위해 더발루맙(MEDI4736), 아테졸리주맙(티센트릭), 아벨루맙, BMS-936559/MDX-1105, MSB0010718C, LY3300054, CA-170, GNS-1480 및 MPDL3280A 중 임의의 하나와 경쟁하는, 치료학적 조합물.
  40. 제29항에 있어서, 항-CTLA4 항원-결합 분자는 MAb(대표적인 예로 이필리무맙(ipilimumab) 및 트레멜리무맙(tremelimumab)을 포함함), 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 CTLA4에 결합하기 위해 이필리무맙 또는 트레멜리무맙과 경쟁하는 분자인, 치료학적 조합물.
  41. 제29항 또는 제40항에 있어서, 항-CTLA4 항원-결합 분자는 서열 번호 15(즉, 서열 번호 16에 제시된 전장 천연(full-length native) CTLA4 아미노산 서열의 25 내지 42번 잔기), 서열 번호 17(즉, 서열 번호 16에 제시된 천연 CTLA4 서열의 43 내지 65번 잔기), 및 서열 번호 18(즉, 서열 번호 16에 제시된 천연 CTLA4 서열의 96 내지 109번 잔기) 중 임의의 하나에 제시된 서열로부터 선택되는 아미노산 서열 내 하나 이상의 아미노산에 특이적으로 결합하는, 치료학적 조합물.
  42. 제22항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, RANK 또는 ICM 항원-결합 분자가 면역글로불린 불변 사슬(immunoglobulin constant chain)(예를 들어, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 또는 IgG4 불변 사슬)에 연결된, 치료학적 조합물.
  43. 제42항에 있어서, 면역글로불린 불변 사슬이 κ 경쇄 또는 λ 경쇄로부터 선택되는 경쇄; 및 γ1 중쇄, γ2 중쇄, γ3 중쇄 및 γ4 중쇄로부터 선택되는 중쇄를 포함할 수 있는, 치료학적 조합물.
  44. 제22항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 치료학적 조합물이 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 RANK 길항제 항원-결합 분자 및 2개 이상의 상이한 항-ICM 항원-결합 분자를 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 본질적으로 구성되는, 치료학적 조합물.
  45. 제44항에 있어서, 치료학적 조합물이 본 명세서에 기술된 RANK 길항제 항원-결합 분자 및 항-CTLA4 항원-결합 분자, 항-PD-1 항원-결합 분자 및 항 PD-L1 항원-결합 분자 중 적어도 2개를 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 본질적으로 구성되는, 치료학적 조합물.
  46. 제22항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 치료학적 조합물의 개별 항원-결합 분자가 별개의 성분의 형태인, 치료학적 조합물.
  47. 제22항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 치료학적 조합물의 개별 항원-결합 분자가 서로 융합 또는 (직접 또는 간접적으로) 접합되는, 치료학적 조합물.
  48. 제47항에 있어서, 치료학적 조합물이 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 RANK 길항제 항원-결합 분자 및 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자를 포함하는 다중특이적 길항제 형태인, 치료학적 조합물.
  49. 제48항에 있어서, 다중특이적 제제가 2개 이상의 폴리펩타이드의 복합체인, 치료학적 조합물.
  50. 제48항에 있어서, 다중특이적 제제가 단일 사슬 폴리펩타이드인, 치료학적 조합물.
  51. 제50항에 있어서, RANK 길항제 항원-결합 분자가 개별 항-ICM 항원-결합 분자의 N-말단 또는 C-말단에 접합되는, 치료학적 조합물.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, RANK 길항제 항원-결합 분자 및 항-ICM 항원-결합 분자가 직접 또는 개입 링커(intervening linker)(예를 들어, 폴리펩타이드 링커)에 의해 연결되는, 치료학적 조합물.
  53. 제22항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 치료학적 조합물이 전달 비히클(예를 들어, 리포솜, 나노입자, 마이크로입자, 덴드리머 또는 사이클로덱스트린)에 함유되는, 치료학적 조합물.
  54. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 RANK 길항제 항원-결합 분자 및 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자를 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 본질적으로 구성되는, RANK 및 적어도 하나의 ICM을 공동-길항하기 위한 다중특이적 항원-결합 분자.
  55. 제54항에 있어서, RANK 길항제 항원-결합 분자가 RANK에 특이적으로 결합하고 길항하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 다중특이적 항원-결합 분자.
  56. 제54항 또는 제55항에 있어서, 개별 항-ICM 항원-결합 분자가 상응하는 ICM에 특이적으로 결합하고 길항하는 항체 또는 항원-결합 단편으로부터 선택되는, 다중특이적 항원-결합 분자.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 항체 및/또는 항원-결합 단편이 직접 또는 개입 링커(예를 들어, 화학적 링커 또는 폴리펩타이드 링커)에 의해 연결되는, 다중특이적 항원-결합 분자.
  58. 제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, RANK 길항제 항원-결합 분자와 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자가 작동 가능하게 연결된 단일 사슬 폴리펩타이드의 형태인, 다중특이적 항원-결합 분자.
  59. 제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, RANK 길항제 항원-결합 분자와 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자가 서로 연결되거나 또는 관련되어 복합체를 형성하는 별개의 폴리펩타이드 사슬 형태인, 다중특이적 항원-결합 분자.
  60. 제54항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 2가, 3가 또는 4가인, 다중특이적 항원-결합 분자.
  61. 제54항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, RANK 길항제 항원-결합 분자 및 적어도 하나의 항 ICM 항원-결합 분자가 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 분자 및 상보성 결정 영역(CDR)으로부터 선택되는, 다중특이적 항원-결합 분자.
  62. 제54항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 개별 항원-결합 분자가 IgG, IgM, IgD, IgA 및 IgE로 구성되는 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 불변 도메인을 포함하는, 다중특이적 항원-결합 분자.
  63. 제54항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 탠덤 scFv(tandem scFv)(taFv 또는 scFv2), 디아바디(diabody), dAb2/VHH2, 놉-인-홀 유도체(knobs-in-holes derivative), Seedcod-IgG, 헤테로Fc-scFv, Fab-scFv, scFv-Jun/Fos, Fab'-Jun/Fos, 트라이바디(tribody), DNL-F(ab)3, scFv3-CH1/CL, Fab-scFv2, IgG-scFab, IgG-scFv, scFv-IgG, scFv2-Fc, F(ab')2-scFv2, scDB-FC, scDb-CH3, Db-Fc, scFv2-H/L, DVD-Ig, tandAb, scFv-dhlx-scFv, dAb2-IgG, dAb-IgG, dAb-Fc-dAb, tandab, DART, BiKE, TriKE, mFC-VH, 가교 MAb(crosslinked MAbs), Cross MAbs, MAb2, FIT-Ig, 정전기적으로 매칭된 항체, 대칭형 IgG 유사 항체, LUZ-Y, Fab-교환 항체 또는 이들의 조합물을 포함하는, 다중특이적 항원-결합 분자.
  64. 제54항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 개별 항원-결합 분자가 면역글로불린 불변 사슬(예를 들어, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 및 IgG4)에 연결되는, 다중특이적 항원-결합 분자.
  65. 제64항에 있어서, 면역글로불린 불변 사슬이 κ 경쇄 및 λ 경쇄로부터 선택되는 경쇄; 및/또는 γ1 중쇄, γ2 중쇄, γ3 중쇄 및 γ4 중쇄로부터 선택되는 중쇄를 포함하는, 다중특이적 항원-결합 분자.
  66. 제54항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 항원-결합 분자는 PD-1을 길항하고, 항-PD-1 항원-결합 분자(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)는 서열 번호 9(즉, 서열 번호 10에 제시된 천연 인간 PD-1 서열의 62 내지 86 번 잔기), 서열 번호 11(즉, 서열 번호 10에 제시된 천연 인간 PD-1 서열의 118 내지 136번 잔기) 및 서열 번호 12(즉, 서열 번호 10에 제시된 천연 인간 PD-1 서열의 66 내지 97번 잔기에 상응함)로부터 선택되는 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산에 특이적으로 결합하는, 다중특이적 항원-결합 분자.
  67. 제66항에 있어서, 항-PD-1 항원-결합 분자(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)가 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 피딜리주맙, 및 MEDI-0680 (AMP-514), AMP-224, JS001-PD-1, SHR-1210, Gendor PD-1, PDR001, CT-011, REGN2810, BGB-317로부터 선택된 MAb의 중쇄 및 경쇄, 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 다중특이적 항원-결합 분자.
  68. 제54항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 항원-결합 분자는 PD-L1을 길항하고, 항-PD-L1 항원-결합 분자(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)는 서열 번호 13(즉, 서열 번호 14에 제시된 천연 인간 PD-L1 아미노산 서열의 279 내지 290번 잔기)에 제시된 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산에 특이적으로 결합하는, 다중특이적 항원-결합 분자.
  69. 제68항에 있어서, 항-PD-L1 항원-결합 분자(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)는 더발루맙(MEDI4736), 아테졸리주맙(티센트릭), 아벨루맙, BMS-936559/MDX-1105, MSB0010718C, LY3300054, CA-170, GNS-1480 및 MPDL3280A로부터 선택되는 MAb의 중쇄 및 경쇄, 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 다중특이적 항원-결합 분자.
  70. 제54항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 항원-결합 분자는 CTLA4를 길항하고, 항-CTLA4 항원-결합 분자(예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)는 서열 번호 15(즉, 서열 번호 16에 제시된 전장 천연 PD-CTLA4 아미노산 서열의 25 내지 42번 잔기), 서열 번호 17(즉, 서열 번호 16에 제시된 천연 CTLA4 서열의 43 내지 65번 잔기), 및 서열 번호 18(즉, 서열 번호 16에 제시된 천연 CTLA4 서열의 96 내지 109번 잔기)로부터 선택되는 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산에 특이적으로 결합하는, 다중특이적 항원-결합 분자.
  71. 제70항에 있어서, 항-CTLA4 항원-결합 분자(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편)는 이필리무맙 및 트레멜리무맙으로부터 선택되는 MAb의 중쇄 및 경쇄 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 다중특이적 항원-결합 분자.
  72. 제54항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 항원-결합 분자는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 RANK 길항제 항원-결합 분자 및 항-PD-1 항원-결합 분자를 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 본질적으로 구성되는, 다중특이적 항원-결합 분자.
  73. 제54항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 항원-결합 분자는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 RANK 길항제 항원-결합 분자 및 항-PD-L1 항원-결합 분자를 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 본질적으로 구성되는, 다중특이적 항원-결합 분자.
  74. 제54항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 항원-결합 분자는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 RANK 길항제 항원-결합 분자, 항 PD-1 항원-결합 분자 및 항-PD-L1 항원-결합 분자를 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 본질적으로 구성되는, 다중특이적 항원-결합 분자.
  75. 제54항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 항원-결합 분자는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 RANK 길항제 항원-결합 분자, 항-PD-1 항원-결합 분자, 및 항-CTLA4 항원-결합 분자를 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 본질적으로 구성되는, 다중특이적 항원-결합 분자.
  76. 제54항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 다중특이적 항원-결합 분자는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 RANK 길항제 항원-결합 분자 및 항-PD-L1 항원-결합 분자를 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 본질적으로 구성되는, 다중특이적 항원-결합 분자.
  77. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 RANK 길항제 항원-결합 분자, 및 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자를 조합하여 치료학적 조합물을 생산하는 단계를 포함하는, 제54항 내지 제76항 중 어느 한 항의 치료학적 조합물의 제조 방법.
  78. 제77항에 있어서, 치료학적 조합물의 표적 폴리펩타이드(예를 들어, RANK 또는 ICM)에 특이적으로 결합하고 길항하는 항원-결합 분자를 (예를 들어, 표적 폴리펩타이드에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 면역화 폴리펩타이드로 동물을 면역화함으로써; 및 표적 폴리펩타이드 또는 이의 적어도 하나의 영역에 특이적으로 결합하는 B 세포를 동물로부터 식별 및/또는 분리함으로써; 및 B 세포에 의해 발현되는 항원-결합 분자를 생산함으로써) 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  79. 제77항 또는 제78항에 있어서, 생성된 항원-결합 분자를 유도체화하여 항원-결합 분자와 동일한 에피토프(epitope)-결합 특이성을 갖는 유도체 항원-결합 분자를 생산하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  80. 제79항에 있어서, 유도체 항원-결합 분자는 항체 단편(구체적인 예로, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 단일 사슬(scFv), 외팔(one-arm) 및 도메인 항체(예를 들어, 샤크(shark) 및 카멜리드(camelid) 항체를 포함함) 및 항체를 포함하는 융합 단백질을 포함함), 및 항원 결합/인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 기타 변형된 구성으로부터 선택되는, 방법.
  81. 하나 이상의 제어 서열과 작동 가능하게 연결되는, 제54항 내지 제76항 중 어느 한 항의 다중특이적 항원-결합 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 작제물.
  82. 제81항에 있어서, 발현 작제물(대표적인 예로 플라스미드, 코스미드, 파지 및 바이러스를 포함함)의 형태인, 작제물.
  83. 제81항 또는 제82항의 작제물을 함유하는 숙주 세포.
  84. 제22항 내지 제53항 중 어느 한 항의 치료학적 조합물, 또는 제54항 내지 제76항 중 어느 한 항의 다중특이적 항원-결합 분자, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  85. 제84항에 있어서, 화학요법제(예를 들어, 항증식성/항신생물 약물, 세포 증식 억제제, 암세포 침입을 억제하는 제제, 성장 인자 기능 억제제, 항-혈관신생제, 혈관 손상 제제 등으로부터 선택됨) 또는 면역요법제(예를 들어, 사이토카인, 사이토카인-발현 세포, 항체 등)로부터 선택되는 적어도 하나의 보조제를 추가로 포함하는, 조성물.
  86. 제22항 내지 제53항 중 어느 한 항의 치료학적 조합물, 또는 제54항 내지 제76항 중 어느 한 항의 다중특이적 항원-결합 분자의 유효량을 대상체에게 투여하여 대상체에서 면역을 자극 또는 증가시킬 수 있는 단계를 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 본질적으로 구성되는, 대상체 내 면역을 자극 또는 증가시키는 방법.
  87. 제86항에 있어서, 치료학적 조합물의 RANK 길항제 항원-결합 분자 및 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자는 별개의 성분으로서 제공되고, 성분은 대상체에게 동시에 투여되는, 방법.
  88. 제87항에 있어서, RANK 길항제 항원-결합 분자는 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자와 동시에 투여되는, 방법.
  89. 제87항에 있어서, RANK 길항제 항원-결합 분자 및 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자는 순차적으로 투여되는, 방법.
  90. 제89항에 있어서, RANK 길항제 항원-결합 분자는 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자의 투여 전에 투여되는, 방법.
  91. 제89항에 있어서, RANK 길항제 항원-결합 분자는 적어도 하나의 항-ICM 항원-결합 분자의 투여 후에 투여되는, 방법.
  92. 제86항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 자극된 또는 증가된 면역은, 유익한 숙주 면역 반응(구체적인 예로, 종양 크기 감소; 종양 부담 감소; 질병의 안정화; 내인성 또는 외인성 항원에 대한 항체 생산; 면역계 유도; 면역계의 하나 이상의 성분의 유도; 세포-매개 면역 및 이의 생산에 관여하는 분자; 체액성 면역 및 이의 생산에 관여하는 분자; 항체-의존성 세포독성(ADCC) 면역 및 이의 생산에 관여하는 분자; 보체-매개 세포독성(complement-mediated cytotoxicity, CDC) 면역 및 이의 생산에 관여하는 분자; 자연 살해 세포; 사이토카인 및 케모카인, 및 이의 생산에 관여하는 분자와 세포; 항체-의존성 세포독성; 보체-의존성 세포독성; 자연 살해 세포 활성; 및 항원-강화 세포독성 중 임의의 하나 이상을 포함함)을 포함하는 방법.
  93. 제92항에 있어서, 자극된 또는 증가된 면역이 전-염증성 면역 반응을 포함하는, 방법.
  94. 제22항 내지 제53항 중 어느 한 항의 치료학적 조합물, 또는 제54항 내지 제76항 중 어느 한 항의 다중특이적 항원-결합 분자와 종양을 접촉시킴으로써 대상체에서 종양에 대한 면역억제 또는 내성의 발달 또는 진행을 억제시키는 단계를 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 본질적으로 구성되는, 대상체에서 종양에 대한 면역억제 또는 내성의 발달 또는 진행을 억제하는 방법.
  95. 제94항에 있어서, 치료학적 조합물 또는 다중특이적 항원-결합 분자가 또한, 종양 항원을 면역계에 제시하는 항원-제시 세포(예를 들어, 수지상 세포)와 접촉하는 방법.
  96. 제22항 내지 제53항 중 어느 한 항의 치료학적 조합물, 또는 제54항 내지 제76항 중 어느 한 항의 다중특이적 항원-결합 분자의 유효량을 대상체에게 투여하여 대상체에서 암의 발병, 진행 또는 재발을 억제하는 단계를 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 본질적으로 구성되는, 대상체에서 암의 발병, 진행 또는 재발을 억제하는 방법.
  97. 제22항 내지 제53항 중 어느 한 항의 치료학적 조합물, 또는 제54항 내지 제76항 중 어느 한 항의 다중특이적 항원-결합 분자의 유효량을 대상체에게 투여하여 암을 치료하는 단계를 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 본질적으로 구성되는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  98. 제97항에 있어서, 암은 흑색종(melanoma), 유방암(breast cancer), 대장암(colon cancer), 난소암(ovarian cancer), 자궁 내막 및 자궁암(endometrial and uterine carcinoma), 위장암 또는 위암(gastric or stomach cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 전립선암(prostate cancer), 침샘암(salivary gland cancer), 폐암(lung cancer), 간세포암(hepatocellular cancer), 교모세포종(glioblastoma), 자궁 경부암(cervical cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer), 간종양(hepatoma), 직장암(rectal cancer), 결장암(colorectal cancer), 신장암(kidney cancer), 외음부암(vulval cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 간암(hepatic carcinoma), 항문암(anal carcinoma), 음경암(penile carcinoma), 고환암(testicular cancer), 식도암(esophageal cancer), 담도 종양(tumors of the biliary tract), 두경부암(head and neck cancer), 및 편평세포암종(squamous cell carcinoma)(일부 특정 실시 양태에서, 암은 전이성 암이다)으로부터 선택되는, 방법.
  99. 제86항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 면역조절제에 대한 반응성을 감소 또는 손상시키는 방법으로, 예를 들어 대상체에서 ICM 분자 길항제(예를 들어, 항-PD-1 또는 항-PD-Ll 면역요법)에 대한 반응성을 감소 또는 손상시키는, 방법.
  100. 제86항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량의 보조 항암제를 대상체에게 동시에 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  101. 제100항에 있어서, 보조 항암제가 화학요법제, 외부 빔 방사선, 표적 방사성 동위원소 및 신호 전달 억제제를 포함하는, 방법.
  102. 제22항 내지 제53항 중 어느 한 항의 치료학적 조합물 또는 제54항 내지 제76항 중 어느 한 항의 다중특이적 항원-결합 분자 중 임의의 하나 이상을 포함하는, 대상체에서 면역을 자극 또는 증가하기 위한, 면역억제 또는 종양에 대한 내성의 발생 또는 진행을 억제하기 위한, 또는 암을 치료하기 위한 키트.
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