JP2022514215A - Ｒａｎｋアンタゴニストおよびその使用 - Google Patents

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Abstract

NF-κB受容体活性化因子（RANK）の1つまたは複数の機能をアンタゴナイズする抗原結合分子ならびにそれらの製造および使用方法が開示される。RANKリガンド（RANKL）／RANKシグナル経路の活性化に関連する状態を処置するまたは発症を阻害するため、免疫を刺激または強化するため、腫瘍に対する免疫抑制または寛容の発症または進行を阻害するため、および癌の発症、進行または再発を阻害するための、組成物および方法においてこれらのアンタゴニスト抗原結合分子を使用する応用も開示される。

Description

発明の分野
本願は、2018年12月5日に出願された「Antagonists and uses therefor」を表題とする米国仮出願番号62/775,803の恩典を主張し、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる。
本発明は概して、アンタゴニスト抗原結合分子に関する。より具体的に、本発明は、NF-κB受容体活性化因子（RANK）の1つまたは複数の機能をアンタゴナイズする抗原結合分子ならびにそれらの製造および使用方法に関する。具体的な態様において、アンタゴニスト抗原結合分子は、RANKリガンド（RANKL）/RANKシグナル伝達経路の活性化に関連する状態を処置するもしくは発症を阻害するため、免疫を刺激もしくは強化するため、腫瘍に対する免疫抑制もしくは寛容の発症もしくは進行を阻害するため、または癌の発症、進行もしくは再発を阻害するために、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて使用される。
発明の背景
RANKおよびRANKLは、それぞれ、CD40およびCD40Lに最も近い相同性を有する、腫瘍壊死因子受容体およびリガンドスーパーファミリーのメンバーである。RANK（TNFRSF11a）およびRANKL（TNFSF11）は、現在、臨床実務において、単球マクロファージ系統から破骨細胞への分化が骨髄破骨細胞前駆体で発現されるRANKとRANKLの相互作用を必要とすることから、骨の恒常性におけるそれらの役割に関して最も知られている（Dougall et al., 1999. Genes Dev. 13(18):2412-2424; Kong et al., 1999. Nature 397(6717):315-323）。しかし、RANKLは、当初、活性化されたT細胞によって上方調節され、成熟樹状細胞（DC）の表面上のRANKと相互作用してアポトーシスを防ぐ樹状細胞特異的生存因子として同定された（Anderson et al., 1997. Nature 390:175-179; Wong et al., 1997. J. Exp. Med. 186(12):2075-2080）。完全ヒトIgG2抗RANKL抗体（デノスマブ）は、臨床実務において、骨転移に起因する骨格関連イベントの予防、ならびに骨巨細胞腫および骨粗鬆症の管理のための強力かつ合理的に十分認容される吸収抑制剤として広く使用されている（Branstetter et al., 2012. Clin. Cancer Research 18(16):4415-4424; Fizazi et al., 2011. Lancet (London, England) 377(9768):813-822）。
RANKタンパク質は、様々なTNF受容体関連因子（TRAF）と相互作用することにより細胞内イベントを開始する（Galibert et al., 1998 J Biol Chem 273(51):34120-27）。例えばRANKLとの相互作用による、RANKの起動は、RANKの多量体化をもたらし、これがRANKの細胞質ドメインにTRAFを動員し、TRAF媒介細胞内イベントを活性化させ、それによってNF-KBを含む転写因子を上方調節する（Anderson et al., 1997, 前記）。RANK/RANKL相互作用が媒介するシグナルは、骨吸収を担う細胞である破骨細胞の分化および機能の刺激に関連する（例えば、Lacey et al., 1998. Cell 93:165-7; Yasuda et al., 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3597-3602を参照のこと）。
RANKLは、破骨細胞の分化、活性化および生存の刺激を通じた骨転移、多発性骨髄腫、関節リウマチ、摩耗粉誘導骨溶解（wear debris-induced osteolysis）、グルココルチコイド誘導骨粗鬆症、ホルモン除去療法に起因する骨減少症、骨巨細胞腫（GCTB）および閉経後骨粗鬆症（PMO）における病的な骨破壊の鍵となるメディエーターである（Lacey et al., 1998. Cell 93, 165-176; Boyce and Xing,2008. Arch. Biochem. Biophys. 473:139-146）。骨の恒常性がRANKL-RANKシグナル伝達により決定的に調節されるという認識は、他のRANKL阻害剤と比較して強力なRANKL中和活性および優れた薬理学的特性を有する完全ヒトIgG2モノクローナル抗体（MAb）であるデノスマブの開発を促した（Lacey et al., 2012. Nat. Rev. Drug Discov. 11:401-419）。デノスマブの効能は、その後、これらの疾患状況において実証され、骨髄系統に属するRANK発現前駆体から骨吸収性破骨細胞への分化および機能的刺激におけるRANKLの必須の役割に関連する（Dougall et al., 1999, 前記）。
最近、RANK/RANKL系が、特定の癌、例えば、BRCA1変異関連乳癌およびホルモン受容体陰性およびトリプルネガティブ（ER-、PR-、HER2-）乳癌を含む乳癌（Gonzalez-Suarez et al., 2010. Nature 468(7320):103-107; Nolan et al., 2016. Nat Med 22(8):933-939; Widschwendter et al., 2015, EBioMedicine 2(10):1331-1339; Pfitzner et al., 2014, Breast Cancer Res Treat. 145(2):307-315; Palafox et al., 2012. Cancer Res. 72(11):2879-2888; Reyes et al., 2017, Breast Cancer Res Treat. 164(1):57-67; Blake et al., 2014. Clin Exp Metastasis 31(2):233-245; Yoldi et al., 2016, Cancer Res. 76(19):5857-5869）、前立腺癌（Ohtaka et al., 2017. Int J Surg Case Rep. 30:106-107; Li et al., 2014. Oncol Rep. 32(6):2605-2611）、KRAS変異またはKRASおよびLKB1変異サブタイプを含む非小細胞肺癌（NSCLC）（Branstetter et al., 2013, Abstract World Conference on Lung Cancer; Rao et al., 2017. Genes Dev. 31, 2099-2112; Faget et al., 2017, J. Thorac. Oncol. 13, 387-398）ならびに明細胞RCC（ccRCC）を含む腎細胞癌腫（RCC）（Steven et al., 2018. Urol Oncol. 36, 502.e15-502）の発生および進行において機能的に重要であることが見出された。したがって、これらの癌の処置において、RANK/RANKL活性をブロックする治療戦略が提案されている。
治療処置としてRANKL/RANKアンタゴニストを開発するために、様々な戦略が採られている。例えば、Lacey et al. (2012, 前記)でレビューされているように、様々な異なるデコイ受容体が開発され、これらはRANKL/RANKアンタゴニストとして異なる能力および欠点、または副作用プロフィールを示した。あるタイプのデコイ受容体は、ヒトIgG Fcに融合されたRANK細胞外ドメイン（ECD）を含むキメラタンパク質（RANK-Fc）を含むものであった。この分子は前臨床モデルにおいて見込みのある効能を示したが、非ヒト霊長類におけるヒトRANK-Fcの反復投与の後、高カルシウム血症を引き起こすRANKに対する自己抗体の結合価の上昇が検出された（Lacey et al. (2012, 前記)）。天然の全長オステオプロテゲリン（OPG）はRANKLの効果的な結合物質かつ阻害物質であることが示されているが、治療薬の開発は、動物におけるこれらの分子の薬物動態および生物活性を改善するために数百の組み換え変種の試験を必要とした。ヒト免疫グロブリンG1（IgG1）Fc領域にそのアミノ末端で融合されたヒトOPGのアミノ酸残基22～194を含む組み換えタンパク質（Fc-OPG）が第1相臨床試験において試験され、骨ターンオーバーマーカーの急速で用量に関連する下降が示され、これによりFc-OPGがヒトにおけるRANKL/RANKアンタゴニストであることが示された。RANKL/RANKアンタゴニストを改善するため、ヒトOPGの残基22～194がそのカルボキシル末端で哺乳類細胞宿主（チャイニーズハムスター卵巣細胞）において発現されたヒトIgG1 Fcに融合された別のOPG-Fc（AMGN-0007）が、Fc-OPGと比較しておよそ10倍長い半減期および3～10倍高い効能を有することが示された（Lacey et al., 2012,前記）。
しかし、治療薬としてのデノスマブの利用に関しては、副作用、例えば顎骨壊死（ONJ）、皮膚発疹、低カルシウム血症または腎毒性の危険（Proliaパッケージ同封物；Xgevaパッケージ同封物）を含む、重大な制約がなおも存在する。加えて、深刻な感染、皮膚化学的な有害反応または非定型の骨折、後者はおそらく骨破壊性骨リモデリングの完全な阻害がミクロ破壊および脆弱な骨を蓄積させるプロセスである「フローズンボーン（frozen bone）」に起因する、が各々、デノスマブを用いたRANKL阻害の有害な結果である（Schwarz and Ritchlin, 2007. Res Ther. 9 Suppl 1:S7; Proliaパッケージ同封物; Xgevaパッケージ同封物）。RANKL/RANKアンタゴニストの有効性および／または安全性は、それを適切な組織／細胞区画に選択的に標的化することにより改善され得る。例えば、骨、乳房、腫瘍または腫瘍微小環境へのRANK/RANKLアンタゴニストの集中的分配は、大きな効果を達成し、同時に全身暴露および付随する毒性を減少させ得る。したがって、RANKL/RANKアンタゴニストの開発のための代替戦略は、改善された有効性および安全性を提供し得る。
ヒトRANKLを用いたIgG2 XenoMouse系統の免疫刺激により、AMG 162（デノスマブとしても公知）が同定され、これは平衡結合においてRANKLに対して高い親和性および、重要なことに、遅い結合オフレートを示した（Lacey et al., 2012, 前記）。決定的なことは、AMG 162/デノスマブを用いたRANKL活性の阻害が、細胞ベースの破骨細胞形成アッセイにおいて示されたことである。デノスマブは、組み換えOPG形式と比較してヒトRANKLに対して多少低い親和性を有するが、インビボでのデノスマブの有意に長い循環半減期は、この親和性の差を補償して余りあり、それによって実質的な効果を提供する。
開発された他の抗RANKL抗体は、ALX-0141と命名された、キャミリダエ（Camillidae）由来の重鎖単独（VHH）抗体形式を含む（Van de Wetering de Rooij et al., 2011. Ann. Rheum. Dis. 70(3):136;およびWO2012163887に記載）。この抗RANKL抗体は、閉経後患者における第1相において評価され、骨吸収マーカーに対する強力かつ持続的な阻害効果を示している。さらに、ALX-0141は、十分に認容され、幅広い用量で安全に投与され得る。
他の抗RANKL抗体または抗体誘導体は、ヒトFabバクテリオファージライブラリ由来のFabである「AT」、「Y」、「P」および「S」を含む（EP1257648）。抗RANKL Fab「AT」、「Y」、「P」は、細胞ベースの破骨細胞アッセイを用いてRANKL/RANKをアンタゴナイズすることが示された。他の抗RANKL抗体は、抗原として大腸菌（Escherichia coli）またはチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞由来の精製された組み換えRANKLを用いたHuMabトランスジェニックマウス系統HCo7、HCo12およびHCo7+HCo12の免疫刺激により生成された16El、2D8、2E11、18B2、22B3または9H7を含む（米国特許第8,455,629号）。さらなる抗RANKL抗体は、細胞ベースの破骨細胞アッセイを用いてRANKL/RANKをアンタゴナイズすることが示されたXPA12.004、XPA12.020、XPA12.039、XPA12.041およびXPA12.042を含む（WO2011017294）。
RANKL/RANKアンタゴニストに関する他の戦略は、腫瘍関連骨溶解の処置において見込みのある結果を示した、RANKLを標的とするsiRNA製剤を含む（Rousseau et al., 2011. J Bone Miner Res. 26(10):2452-2462）。
別の治療代替案は、RANKLとRANKの相互作用をブロックするまたはその活性およびその後の生化学的シグナル伝達を減少させるようRANKの構造を変化させる阻害性ペプチド、タンパク質・タンパク質相互作用のペプチド模倣体または抗体の使用である。例えば、OPG（「受容体」）またはRANKL（「リガンド」）の合理的に設計された低分子模倣体が、インビトロでの破骨細胞生成アッセイにおいて試験された（Cheng et al., 2004. J Biol Chem. 2004;279(9):8269-8277）。興味深いことに、OPGから設計されたペプチドは、RANKLから設計されたものよりも大きな阻害作用を示し、これにより受容体由来模倣体は、リガンド模倣体とは異なる様式でその受容体に対するリガンドの結合をブロックすることが示唆された。1つのOPG模倣体（OP3-4）は、インビトロおよびインビボで、RANKLおよびRANKに結合し、RANKに対するRANKLの結合を減少させ、破骨細胞形成を阻害し、それによってRANKL/RANKアンタゴニストとして機能することが示された。このアンタゴニズムに関する1つの可能性のある機構は、RANK/RANKL受容体複合体の変化を通じたものであり、OP3-4は、細胞質ドメイン相互作用を妨げ、それによって下流のシグナル伝達を減少させるよう受容体の方向を変化させることによってまたは「スペーサー」として機能することによってのいずれかによって欠陥のある複合体をもたらし得る。
RANKL/RANKアンタゴニストを同定するために、RANKに対する受容体結合に関して、様々な長さの無作為ペプチドのライブラリがスクリーニングされた（Teletchea et al., 2014. J Bone Miner Res. 29(6):1466-1477）。これらの実験は、2つのペプチドPep501およびPep8が細胞ベースの破骨細胞生成アッセイにおいて強い活性を示したことを示した。Aoki et al.（2006, J Clin Invest. 116(6):1525-1534）は、TNFに結合するTNFRのCRD3リガンド接触表面を模倣するよう設計された環状ペプチドを報告し、彼らは、このWP9QYペプチドがRANKLにより誘導されるシグナル伝達も阻害することを示した。ペプチドWP9QYはRANKL誘導シグナル伝達を阻害するが、RANKに対するRANKLの結合はブロックしなかった。この見かけ上の不一致を説明するため、分子モデリングは、RANK CRD3に対する結合部位に位置するペプチドWP9QYが潜在的にこの受容体の細胞質ドメインの予想されるリガンド誘導クラスタリングと干渉し、それによってRANKL/RANKアンタゴニストとして機能すると予測した。
アンタゴニスト性抗RANK抗体を用いた場合の意図しない受容体アゴニズムの可能性を考慮して、RANKLを標的とする抗体が好まれている（Lacey et al., 2012, 前記）。しかし、ファージディスプレイ技術を用いて、RANK ECDに対する単鎖Fv（scFv）抗体が同定された（Newa et al., 2014. Mol Pharm. 11(1):81-89）。さらに、抗RANK scFvは、（マウス）RAW264.7アッセイにおいて、RANKL依存的破骨細胞形成活性をブロックした。しかし、抗RANK scFvがRANKに対するRANKLの結合に影響したかどうか、あるいはRANK受容体複合体および下流のシグナル伝達を変化させたかどうかは、明らかにされなかった。その後、Chypre et al.（2016, Immunol Lett. 171:5-14）は、Kabat位置82に欠失コドンを挿入することによって抗RANK scFvを改変し（ここでRANK-02と名称変更された）、ヒトIgG1重および軽鎖バックボーン上で発現させ、結合特性を比較し、アゴニスト性対アンタゴニスト性を検討するインビトロおよびインビボアッセイを行った。RANKLをブロックするRANK-02の能力は、ELISAにおいて確認されたが、抗体の活性がJurkat huRANK:Fasアッセイにおいて試験された場合、RANK-02は、残念ながら、アゴニスト活性を示した。インビボ試験は、RANK-02が破骨細胞TRAP形成においてRANKL依存的増加をブロックも強化しもしないことを示した。これらのデータは、RANK ECDに対する抗体の結合もインビトロでRANKLをブロックする能力も細胞ベースまたはインビボアッセイにおけるアンタゴニスト活性を予測するものではないことを示している。
本発明は、一部、RANKに結合しRANKL/RANKシグナル伝達経路をアンタゴナイズする抗原結合分子の開発に基づいている。これらのアンタゴニスト抗原結合分子は、本明細書で後述されるように、RANKL/RANKシグナル伝達経路の活性化に関連する状態を処置するもしくは発症を阻害するため、免疫を刺激もしくは強化するため、腫瘍に対する免疫抑制もしくは寛容の発症もしくは進行を阻害するため、または癌の発症、進行もしくは再発を阻害するため、単独でまたは他の薬剤と組み合わせてのいずれにおいても有用である。
したがって、1つの局面において、本発明は、RANKに適切に結合しRANKL/RANKシグナル伝達経路をアンタゴナイズする抗原結合分子を提供する。これらの抗原結合分子は、概して：
（1）SEQ ID NO:3に示されるVHCDR1アミノ酸配列、SEQ ID NO:4に示されるVHCDR2アミノ酸配列およびSEQ ID NO:5に示されるVHCDR3アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）、ならびにSEQ ID NO:6に示されるVLCDR1アミノ酸配列、SEQ ID NO:7に示されるVLCDR2アミノ酸配列およびSEQ ID NO:8に示されるVLCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）；
（2）SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を含むVH、およびSEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列を含むVL；
（3）SEQ ID NO:1のアミノ酸配列に対して少なくとも90％（少なくとも91％～99％およびその間のすべての整数値の百分率を含む）の配列同一性を有するVH、ならびにSEQ ID NO:2のアミノ酸配列に対して少なくとも90％（少なくとも91％～99％およびその間のすべての整数値の百分率を含む）の配列同一性を有するVL；
（4）SEQ ID NO:1のアミノ酸配列内の各CDR以外のフレームワーク領域のアミノ酸配列に対して少なくとも90％（少なくとも91％～99％およびその間のすべての整数値の百分率を含む）の配列同一性を有するVH、ならびにSEQ ID NO:2のアミノ酸配列内の各CDR以外のフレームワーク領域のアミノ酸配列に対して少なくとも90％（少なくとも91％～99％およびその間のすべての整数値の百分率を含む）の配列同一性を有するVL；または
（5）SEQ ID NO:1のアミノ酸配列内の各CDR以外のフレームワーク領域の配列内に1つもしくは複数（例えば、1、2、3、4もしくは5個）のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を含むアミノ酸配列を含むVH、およびSEQ ID NO:2のアミノ酸配列内の各CDR以外のフレームワーク領域の配列内に1つもしくは複数（例えば、1、2、3、4もしくは5個）のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を含むアミノ酸配列を含むVL、
を含む。
抗原結合分子は、単離、精製、合成または組み換え形態であり得る。特定の態様において、抗原結合分子は、一価抗原結合分子（例えば、Fab、scFab、Fab'、scFv、1アーム抗体等）である。
抗原結合分子は、適切には、以下の活性：（a）RANKに対するRANKLの結合を阻害する；（b）RANKの活性化を阻害する；（c）下流RANK媒介分子シグナル伝達（例えば、TRAFタンパク質のRANK動員）を阻害する；（d）RANKの多量体化を阻害する；（e）破骨細胞の分化を減少させる；（f）破骨細胞の活性化を減少させる；（g）破骨細胞の生存率を低下させる；（h）骨喪失を阻害し、骨密度を増加させる；（i）腫瘍微小環境（TME）において骨髄細胞または他の免疫細胞の免疫抑制活性を阻害する；ならびに（j）腫瘍細胞（例えば、トリプルネガティブ乳癌（TNBC）細胞および／またはBRCA-1変異陽性乳癌細胞を含むホルモン受容体陰性（例えば、ER-；PR-；HER2-；ER-、PR-；ER-、HER2-；PR-、HER2-；およびER-、PR-、HER2-）乳癌細胞を含む乳癌細胞、前立腺癌細胞、KRAS変異またはKRASおよびLKB1変異NSCLC腫瘍サブタイプを含むNSCLC細胞、ならびにccRcc細胞を含むRCC細胞）の増殖、遊走、生存および／または形態形成を阻害する、の任意の1つまたは複数を含む。
いくつかの態様において、RANKアンタゴニスト抗原結合分子は、送達ビヒクル（例えば、リポソーム、ナノ粒子、マイクロ粒子、デンドリマーまたはシクロデキストリン）中に含まれる。
本発明の別の局面は、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子をコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
本発明のさらに別の局面は、1つまたは複数の制御配列に機能的に連結された、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子をコードする核酸配列を含む構築物を提供する。適切な構築物は、好ましくは、発現構築物の形態であり、その代表例は、プラスミド、コスミド、ファージおよびウイルスを含む。
別の局面において、本発明は、1つまたは複数の制御配列に機能的に連結された、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子をコードする核酸配列を含む構築物を含む宿主細胞を提供する。
本発明のさらに別の局面は、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物はさらに、骨吸収抑制剤（例えば、特に副甲状腺ホルモン、BMP2、ビタミンD、抗炎症剤からなる群より選択される、同化増強剤；および特にビスホスホネート、カテプシンK阻害剤、p38阻害剤、JNK阻害剤、IKK阻害剤、NF-κB阻害剤、カルシニューリン阻害剤、NFAT阻害剤、PI3K阻害剤からなる群より選択される、異化阻害剤）ならびに化学療法剤（例えば、抗増殖／抗新生物薬、細胞増殖抑制剤、癌細胞浸潤阻害剤、成長因子機能阻害剤、抗血管新生剤、血管損傷剤（vascular damaging agent）等）または免疫療法剤（例えば、サイトカイン、サイトカイン発現細胞、抗体等）から選択される少なくとも1つの補助的薬剤を含む。
本発明のさらなる局面は、RANK発現細胞に対するRANKLの結合を阻害する方法を提供する。これらの方法は、通常、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子をRANK発現細胞と接触させ、それによってRANK発現細胞に対するRANKの結合を阻害する工程を含む。
関連する局面において、本発明は、RANK発現細胞におけるRANKの活性化を阻害する方法を提供する。これらの方法は、通常、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子をRANK発現細胞と接触させ、それによってRANK発現細胞におけるRANKの活性化を阻害する工程を含む。
別の関連する局面において、本発明は、RANK発現細胞におけるRANK媒介分子シグナル伝達（例えば、TRAFタンパク質のRANK動員）を阻害する方法を提供する。これらの方法は、通常、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子をRANK発現細胞と接触させ、それによってRANK発現細胞におけるRANK媒介分子シグナル伝達を阻害する工程を含む。
さらに別の関連する局面において、本発明は、RANK発現細胞におけるRANKの多量体化を阻害する方法を提供する。これらの方法は、通常、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子をRANK発現細胞と接触させ、それによってRANK発現細胞におけるRANKの多量体化を阻害する工程を含む。
代表的なRANK発現細胞は、破骨細胞、免疫細胞、例えば、抗原提示細胞（例えば、単球および樹状細胞）ならびにエフェクター免疫細胞（例えば、T細胞）、造血前駆体、ならびに腫瘍細胞（例えば、トリプルネガティブ乳癌（TNBC）細胞および／またはBRCA-1変異陽性乳癌細胞を含むホルモン受容体（HR）陰性（例えば、ER-；PR-；HER2-；ER-、PR-；ER-、HER2-；PR-、HER2-；およびER-、PR-、HER2-）乳癌細胞を含む乳癌細胞、前立腺癌細胞、KRAS変異またはKRASおよびLKB1変異NSCLC腫瘍サブタイプを含むNSCLC細胞、ならびにccRcc細胞を含むRCC細胞）を含む。
さらに別の関連する局面において、本発明は、破骨細胞の分化、活性化および／または生存を阻害する方法を提供する。これらの方法は、通常、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子を破骨細胞と接触させ、それによって破骨細胞の分化、活性化および／または生存を阻害する工程を含む。
別の関連する局面において、本発明は、免疫細胞（例えば、骨髄細胞またはTreg）の免疫抑制活性を阻害する方法を提供する。これらの方法は、通常、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子を免疫細胞と接触させ、それによって免疫細胞の免疫抑制活性を阻害する工程を含む。
さらに別の関連する局面において、本発明は、腫瘍細胞の増殖、生存または遊走を阻害する方法を提供する。これらの方法は、通常、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子を腫瘍細胞と接触させ、それによって腫瘍細胞の増殖、生存または遊走を阻害する工程を含む。
本発明のさらに別の局面は、対象においてRANKL/RANKシグナル伝達経路の活性化に関連する状態を処置するまたは発症を阻害する方法を提供する。これらの方法は、通常、本明細書に記載される有効量のRANKアンタゴニスト抗原結合分子を対象に投与し、それによって該状態を処置するまたは発症を阻害する工程を含む。特定の態様において、RANKL/RANKシグナル伝達経路の活性化に関連する状態は、骨減少障害、ミオパチーおよび癌から選択される。
関連する局面において、本発明は、対象において骨喪失を処置するまたは発症を阻害する方法を提供する。これらの方法は、通常、本明細書に記載される有効量のRANKアンタゴニスト抗原結合分子を対象に投与し、それによって骨喪失を処置するまたは発症を阻害する工程を含む。
別の関連する局面において、本発明は、対象において癌を処置するまたは発症を阻害する方法であって、癌がRANKL/RANKシグナル伝達経路の活性化に関連する方法を提供する。これらの方法は通常、本明細書に記載される有効量のRANKアンタゴニスト抗原結合分子を対象に投与し、それによって癌を処置するまたは発症を阻害する工程を含む。特定の態様において、癌は、HR陰性（例えば、ER-；PR-；HER2-；ER-、PR-；ER-、HER2-；PR-、HER2-；およびER-、PR-、HER2-）乳癌、BRCA-1変異陽性乳癌、HR陰性（例えば、ER-；PR-；HER2-；ER-、PR-；ER-、HER2-；PR-、HER2-；およびER-、PR-、HER2-）およびBRCA-1変異陽性乳癌を含む乳癌、前立腺癌、KRAS変異またはKRASおよびLKB1変異NSCLCを含むNSCLC、ならびにccRccを含むRCC細胞から選択される。
本発明者らは、その内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる、2018年6月5日に出願された同時係属中の国際出願番号PCT/AU2018/050557において、RANKL/RANKおよび免疫チェックポイント（ICM）の共アンタゴナイズが、癌に対する免疫応答における相乗作用的強化をもたらすことを開示した。
したがって、別の局面において、本発明は、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子および少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる治療組み合わせを提供する。治療組み合わせは、RANKアンタゴニスト抗原結合分子および少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子の各々を含む単一組成物（例えば、混合物）の形態であり得る。あるいは、RANKアンタゴニスト抗原結合分子および少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子は、別々の組成物中の別個の成分として提供され得る。
少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子は、適切に、プログラム死1受容体（PD-1）、プログラム死リガンド1（PD-L1）、プログラム死リガンド2（PD-L2）、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4（CTLA-4）、A2Aアデノシン受容体（A2AR）、A2Bアデノシン受容体（A2BR）、B7-H3（CD276）、Vセットドメイン含有T細胞活性化阻害因子1（VTCN1）、BおよびTリンパ球アテニュエーター（BTLA）、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（KIR）、リンパ球活性化遺伝子3（LAG3）、T細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン3（TIM-3）、T細胞活性化のVドメインIgサプレッサー（VISTA）、5'-ヌクレオチダーゼ（CD73）、タクタイル（CD96）、ポリオウイルス受容体（CD155）、DNAXアクセサリー分子1（DNAM-1）、ポリオウイルス受容体関連2（CD112）、細胞傷害性および制御性T細胞分子（CRTAM）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー4（TNFRS4；OX40；CD134）、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリー、メンバー4（TNFSF4；OX40リガンド（OX40L）、ナチュラルキラー細胞受容体2B4（CD244）、CD160、グルココルチコイド誘導TNFR関連タンパク質（GITR）、グルココルチコイド誘導TNFR関連タンパク質リガンド（GITRL）、誘導性共刺激因子（ICOS）、ガレクチン9（GAL-9）、4-1BBリガンド（4-1BBL；CD137L）、4-1BB（4-1BB；CD137）、CD70（CD27リガンド（CD27L））、CD28、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、シグナル調節タンパク質（SIRP-1）、インテグリン関連タンパク質（IAP；CD47）、B-リンパ球活性化マーカー（BLAST-1；CD48）、ナチュラルキラー細胞受容体2B4（CD244）；CD40、CD40リガンド（CD40L）、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（HVEM）、膜貫通および免疫グロブリンドメイン含有2（TMIGD2）、HERV-H LTR関連2（HHLA2）、血管内皮成長阻害因子（VEGI）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー25（TNFRS25）、誘導性T細胞共刺激因子リガンド（ICOLG；B7RP1）およびIgおよびITIM（免疫受容体チロシン型阻害モチーフ）ドメインを有するT細胞免疫受容体（TIGIT）からなる群より選択されるICMをアンタゴナイズする。いくつかの態様において、少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子は、PD-1アンタゴニスト抗原結合分子、PD-L1アンタゴニスト抗原結合分子およびCTLA4アンタゴニスト抗原結合分子から選択される。いくつかの態様において、少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子は、PD-1アンタゴニスト抗原結合分子を含む。いくつかの態様において、少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子は、PD-L1アンタゴニスト抗原結合分子を含む。特定の態様において、少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子は、PD-1アンタゴニスト抗原結合分子およびPD-L1アンタゴニスト抗原結合分子を含む。いくつかの態様において、少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子は、CTLA4アンタゴニスト抗原結合分子を含む。他の態様において、少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子は、PD-1アンタゴニスト抗原結合分子およびCTLA4アンタゴニスト抗原結合分子を含む。他の態様において、少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子は、PD-L1アンタゴニスト抗原結合分子およびCTLA4アンタゴニストを含む。特定の態様において、抗ICM抗原結合分子は、Treg細胞が発現しないまたは低レベルで発現するICMをアンタゴナイズする。同じまたは他の態様のいくつかにおいて、抗ICM抗原結合分子は、TregにおいてCTLA4よりも低レベルで発現されるICM（例えば、PD-1またはPD-L1）をアンタゴナイズする。同じまたは他の態様のいくつかにおいて、抗ICM抗原結合分子は、Tregよりも免疫エフェクター細胞（例えば、エフェクターT細胞、マクロファージ、樹状細胞、B細胞等）において高レベルで発現されるICM（例えば、PD-1またはPD-L1）をアンタゴナイズする。これらの態様の代表例において、少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子は、PD-1およびPD-L1の一方または両方から選択されるICMをアンタゴナイズする。多数の抗ICM抗原結合分子が、当技術分野で公知となっており、そのいずれも本発明を実施する上で使用され得る。
特定の態様において、抗ICM抗原結合分子は、抗PD-1抗原結合分子、抗PD-L1抗原結合分子および抗CTLA4抗原結合分子から選択される。
抗PD-1抗原結合分子は、その非限定的な例がニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブおよびMEDI-0680（AMP-514）、AMP-224、JS001-PD-1、SHR-1210、Gendor PD-1、PDR001、CT-011、REGN2810、BGB-317を含むMAbまたはその抗原結合フラグメントであり得る。あるいは、抗PD-1抗原結合分子は、PD-1への結合に関してニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブまたはMEDI-0680と競合するものであり得る。
いくつかの態様において、抗PD-1抗原結合分子は、SEQ ID NO:9（すなわち、SEQ ID NO:10に示されるネイティブPD-1配列の残基62～86）および／またはSEQ ID NO:11（すなわち、SEQ ID NO:10に示されるネイティブPD-1配列の残基118～136）に示されるアミノ酸配列の1つまたは複数のアミノ酸に特異的に結合する。同じ態様および他の態様のいくつかにおいて、抗PD-1抗原結合分子は、SEQ ID NO:12に示されるアミノ酸配列（すなわち、SEQ ID NO:10に示されるネイティブPD-1配列の残基66～97に対応）の1つまたは複数のアミノ酸に特異的に結合する。
いくつかの態様において、抗PD-L1抗原結合分子は、その非限定的な例がデュルバルマブ（MEDI4736）、アテゾリズマブ（テセントリク）、アベルマブ、BMS-936559/MDX-1105、MSB0010718C、LY3300054、CA-170、GNS-1480およびMPDL3280Aを含むMAb、またはその抗原結合フラグメントである。このタイプの具体例において、抗PD-L1抗原結合分子は、SEQ ID NO:13に示されるアミノ酸配列（すなわち、SEQ ID NO:14に示される全長ネイティブPD-L1アミノ酸配列の残基279～290）内の1つまたは複数のアミノ酸に特異的に結合する。あるいは、抗PD-L1抗原結合分子は、PD-L1への結合に関してデュルバルマブ（MEDI4736）、アテゾリズマブ（テセントリク）、アベルマブ、BMS 936559/MDX-1105、MSB0010718C、LY3300054、CA-170、GNS-1480およびMPDL3280Aのいずれか1つと競合するものであり得る。
いくつかの態様において、抗CTLA4抗原結合分子は、その代表例がイピリムマブおよびトレメリムマブを含むMAb、またはその抗原結合フラグメントである。あるいは、抗CTLA4抗原結合分子は、CTLA4への結合に関してイピリムマブもしくはトレメリムマブと競合するものであり得る。このタイプの具体例において、抗CTLA4抗原結合分子は、SEQ ID NO:15（すなわち、SEQ ID NO:16に示される全長ネイティブCTLA4アミノ酸配列の残基25～42）、SEQ ID NO:17（すなわち、SEQ ID NO:16に示されるネイティブCTLA4配列の残基43～65）およびSEQ ID NO:18（すなわち、SEQ ID NO:16に示されるネイティブCTLA4配列の残基96～109）のいずれか1つに示される配列から選択されるアミノ酸配列内の1つまたは複数のアミノ酸に特異的に結合する。
いくつかの態様において、治療組み合わせは、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子および抗PD-1抗原結合分子を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる。他の態様において、治療組み合わせは、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子および抗PD-L1抗原結合分子を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる。さらに他の態様において、治療組み合わせは、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子、抗PD-1抗原結合分子および抗PD-L1抗原結合分子を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる。さらに他の態様において、治療組み合わせは、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子、抗PD-1抗原結合分子および抗CTLA4抗原結合分子を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる。他の態様において、治療組み合わせは、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子および抗PD-L1抗原結合分子を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる。
いくつかの態様において、RANKまたはICM抗原結合分子は、免疫グロブリン定常鎖（例えば、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3またはIgG4定常鎖）に連結される。免疫グロブリン定常鎖は、κ軽鎖またはλ軽鎖から選択される軽鎖と、γ1重鎖、γ2重鎖、γ3重鎖、およびγ4重鎖から選択される重鎖とを含み得る。
特定の態様において、治療組み合わせは、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子および2つまたはそれ以上の異なる抗ICM抗原結合分子を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる。このタイプの代表例において、治療組み合わせは、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子ならびに抗CTLA4抗原結合分子、抗PD-1抗原結合分子および抗PD-L1抗原結合分子の少なくとも2つを含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる。
治療組み合わせの成分は、別個の成分の形態である。あるいは、それらは、相互に（直接的もしくは間接的のいずれかで）融合され得るまたはそれ以外の方法でコンジュゲートされ得る。
特定の態様において、治療組み合わせは、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子および少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子を含む、多特異性アンタゴニスト剤の形態である。多特異性剤は、2つまたはそれ以上のポリペプチドの複合体であり得る。あるいは、多特異性剤は、単鎖ポリペプチドであり得る。RANKアンタゴニスト抗原結合分子は、個々の抗ICM抗原結合分子のN末端またはC末端にコンジュゲートされ得る。RANKアンタゴニスト抗原結合分子と抗ICM抗原結合分子は、直接的にまたは介在リンカー（例えば、ポリペプチドリンカー）により接続され得る。有利な態様において、多特異性アンタゴニスト剤は、少なくとも2つの抗原結合分子を含む。適切に、多特異性抗原結合分子の個々の成分は、キメラ、ヒト化およびヒト抗原結合分子を含む組み換え分子の形態である。
関連する局面において、本発明は、RANKおよび少なくとも1つのICMを共アンタゴナイズする多特異性抗原結合分子を提供する。これらの多特異性抗原結合分子は、通常、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子および少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる。RANKアンタゴニスト抗原結合分子は、適切に、RANKに特異的に結合し、アンタゴナイズする抗体またはその抗原結合フラグメントである。個々の抗ICM抗原結合分子は、適切に、対応するICMに特異的に結合し、アンタゴナイズする抗体またはその抗原結合フラグメントから選択される。抗体および／または抗原結合フラグメントは、直接的にまたは介在リンカー（例えば、化学リンカーもしくはポリペプチドリンカー）により接続され得る。個々の多特異性抗原結合分子は、抗体または抗原結合フラグメントが機能的に接続された単鎖ポリペプチドの形態であり得る。あるいは、それは、複合体を形成するよう相互に連結またはそれ以外の方法で結合された複数の別個のポリペプチド鎖を含み得る。同じおよび他の態様のいくつかにおいて、多特異性抗原結合分子は、二価、三価または四価である。
多特異性抗原結合分子における使用が想定される抗原結合フラグメントは、Fab、Fab'、F(ab')2およびFv分子ならびに相補性決定領域（CDR）から選択され得る。いくつかの態様において、個々の抗体またはその抗原結合フラグメントは、IgG、IgM、IgD、IgAおよびIgEからなる群より独立して選択される定常ドメインを含む。多特異性抗原結合分子の非限定的な例は、適切に、タンデムscFv（taFvもしくはscFv2）、ダイアボディ、dAb2/VHH2、ノブ・イン・ホール（knobs-in-holes）誘導体、Seedcod-IgG、ヘテロFc-scFv、Fab-scFv、scFv-Jun/Fos、Fab'-Jun/Fos、トリボディ、DNL-F(ab)3、scFv3-CH1/CL、Fab-scFv2、IgG-scFab、IgG-scFv、scFv-IgG、scFv2-Fc、F(ab')2-scFv2、scDB-Fc、scDb-CH3、Db-Fc、scFv2-H/L、DVD-Ig、tandAb、scFv-dhlx-scFv、dAb2-IgG、dAb-IgG、dAb-Fc-dAb、tandab、DART、BiKE、TriKE、mFc-VH、架橋MAb、クロスMAb、MAb2、FIT-Ig、静電気的適合抗体、対称性IgG様抗体、LUZ-Y、Fab交換抗体またはそれらの組み合わせを含む。
適切な抗原結合フラグメントは、免疫グロブリン定常鎖（例えば、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3およびIgG4定常鎖）に連結され得る。このタイプの代表例において、免疫グロブリン定常鎖は、κ軽鎖およびλ軽鎖から選択される軽鎖；ならびに／またはγ1重鎖、γ2重鎖、γ3重鎖、およびγ4重鎖から選択される重鎖を含み得る。
多特異性抗原結合分子がPD-1をアンタゴナイズするいくつかの態様において、抗PD-1抗体またはその抗原結合フラグメントは、SEQ ID NO:9（すなわち、SEQ ID NO:10に示されるネイティブヒトPD-1配列の残基62～86）、SEQ ID NO:11（すなわち、SEQ ID NO:10に示されるネイティブヒトPD-1配列の残基118～136）およびSEQ ID NO:12（すなわち、SEQ ID NO:10に示されるネイティブヒトPD-1配列の残基66～97に対応）から選択されるアミノ酸配列の1つまたは複数のアミノ酸に特異的に結合する。
同じおよび他の態様のいくつかにおいて、抗PD-1抗体またはその抗原結合フラグメントは、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブおよびMEDI-0680（AMP-514）、AMP-224、JS001-PD-1、SHR-1210、Gendor PD-1、PDR001、CT-011、REGN2810、BGB-317から選択されるMAbの重鎖および軽鎖またはその抗原結合フラグメントを含む。
多特異性抗原結合分子がPD-L1をアンタゴナイズするいくつかの態様において、抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメントは、SEQ ID NO:13に示されるアミノ酸配列（すなわち、SEQ ID NO:14に示されるネイティブヒトPD-L1アミノ酸配列の残基279～290）の1つまたは複数のアミノ酸に特異的に結合する。このタイプの例示的な抗体および抗原結合フラグメントは、デュルバルマブ（MEDI4736）、アテゾリズマブ（テセントリク）、アベルマブ、BMS 936559/MDX-1105、MSB0010718C、LY3300054、CA-170、GNS-1480およびMPDL3280Aから選択されるMAbの重鎖および軽鎖、またはその抗原結合フラグメントを含むものを含む。
多特異性抗原結合分子がCTLA4をアンタゴナイズするいくつかの態様において、抗CTLA4抗体またはその抗原結合フラグメントは、SEQ ID NO:15（すなわち、SEQ ID NO:16に示される全長ネイティブPD-CTLA4アミノ酸配列の残基25～42）、SEQ ID NO:17（すなわち、SEQ ID NO:16に示されるネイティブCTLA4配列の残基43～65）およびSEQ ID NO:18（すなわち、SEQ ID NO:16に示されるネイティブCTLA4配列の残基96～109）から選択されるアミノ酸配列の1つまたは複数のアミノ酸に特異的に結合する。このタイプの例示的な抗体および抗原結合フラグメントは、イピリムマブおよびトレメリムマブから選択されるMAbの重鎖および軽鎖、またはその抗原結合フラグメントを含むものを含む。
いくつかの態様において、多特異性抗原結合分子は、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子および抗PD-1抗原結合分子を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる。他の態様において、多特異性抗原結合分子は、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子および抗PD-L1抗原結合分子を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる。さらに他の態様において、多特異性抗原結合分子は、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子、抗PD-1抗原結合分子および抗PD-L1抗原結合分子を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる。さらに他の態様において、多特異性抗原結合分子は、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子、抗PD-1抗原結合分子および抗CTLA4抗原結合分子を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる。他の態様において、多特異性抗原結合分子は、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子および抗PD-L1抗原結合分子を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる。
別の局面において、本発明は、上記および本明細書の他所に広義的に記載される治療組み合わせを製造する方法を提供する。これらの方法は、通常、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子および少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子を組み合わせて、それによって治療組み合わせを製造する工程を含む。いくつかの態様において、この方法は、（例えば、標的ポリペプチドに対応するアミノ酸配列を含む免疫刺激ポリペプチドを用いて動物を免疫刺激し；標的ポリペプチドまたはその少なくとも1つの領域に特異的に結合するB細胞を同定および／または動物から単離し；そのB細胞により発現される抗原結合分子を産生させることによって）治療組み合わせの標的ポリペプチド（例えば、RANKまたはICM）に特異的に結合し、アンタゴナイズする抗原結合分子を生成する工程を含む。非限定的な例において、この方法はさらに、そのようにして生成された抗原結合分子を誘導体化して前記抗原結合分子と同じエピトープ結合特異性を有する抗原結合分子誘導体を製造する工程を含む。抗原結合分子誘導体は、その具体例がFab、Fab’、F(ab')2、Fv、単鎖（scFv）、1アームおよびドメイン抗体（例えば、サメおよびラクダ抗体を含む）、および抗体を含む融合タンパク質、ならびに抗原結合／認識部位を含む任意の他の修飾形態の免疫グロブリン分子を含む抗体フラグメントから選択され得る。
いくつかの態様において、治療組み合わせまたは多特異性抗原結合分子は、送達ビヒクル（例えば、リポソーム、ナノ粒子、マイクロ粒子、デンドリマーまたはシクロデキストリン）中に含まれる。
さらに別の局面において、本発明は、1つまたは複数の制御配列に機能的に連結された本明細書に記載される多特異性抗原結合分子をコードする核酸配列を含む構築物を提供する。適切な構築物は、好ましくは、その代表例がプラスミド、コスミド、ファージおよびウイルスを含む発現構築物の形態である。
本発明のさらに別の局面は、1つまたは複数の制御配列に機能的に連結された本明細書に記載される多特異性抗原結合分子をコードする核酸配列を含む構築物を含む宿主細胞を提供する。
別の局面において、本発明は、広義的に上記される治療組み合わせまたは多特異性抗原結合分子および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物はさらに、化学療法剤（例えば、抗増殖／抗新生物薬、細胞増殖抑制剤、癌細胞浸潤阻害剤、成長因子機能阻害剤、抗血管新生剤、血管損傷剤等から選択される）または免疫療法剤（例えば、サイトカイン、サイトカイン発現細胞、抗体等）から選択される少なくとも1つの補助的薬剤を含む。
本発明のさらに別の局面は、対象において免疫を刺激または強化する方法を提供する。これらの方法は、通常、有効量の本明細書に記載される治療組み合わせまたは多特異性抗原結合分子を対象に投与し、それによって対象において免疫を刺激または強化する工程を含む、該工程からなる、または該工程から本質的になる。治療組み合わせのRANKアンタゴニスト抗原結合分子および少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子が別個の成分として提供される態様において、これらの成分は、適切に、対象に同時に（concurrently）投与される。このタイプの具体例において、RANKアンタゴニスト抗原結合分子は、少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子と同時に（simultaneously）投与される。他の具体例において、RANKアンタゴニスト抗原結合分子および少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子は、順次投与される。例えば、RANKアンタゴニスト抗原結合分子は、少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子の投与前に投与され得る。適切に、RANKアンタゴニスト抗原結合分子は、少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子の投与後に投与される。
典型的に、刺激または強化された免疫は、有益な宿主免疫応答を含み、その具体例は、以下の任意の1つまたは複数を含む：腫瘍サイズの減少；腫瘍量の減少；疾患の安定化；内因性または外因性抗原に対する抗体の産生；免疫系の誘導；免疫系の1つまたは複数の成分の誘導；細胞媒介免疫およびその生成に関与する分子；液性免疫およびその生成に関与する分子；抗体依存細胞傷害（ADCC）免疫およびその生成に関与する分子；補体媒介細胞傷害（CDC）免疫およびその生成に関与する分子；ナチュラルキラー細胞；サイトカインおよびケモカインならびにそれらの生成に関与する分子および細胞；抗体依存細胞傷害；補体依存細胞傷害；ナチュラルキラー細胞活性；ならびに抗原刺激細胞傷害。このタイプの代表例において、刺激または強化された免疫は、炎症促進性免疫応答を含む。
本発明のさらに別の局面は、対象において腫瘍に対する免疫抑制または寛容の発症または進行を阻害する方法を提供する。これらの方法は、通常、本明細書に記載される治療組み合わせまたは多特異性抗原結合分子を腫瘍と接触させ、それによって対象において腫瘍に対する免疫抑制または寛容の発症または進行を阻害する工程を含む、該工程からなる、または該工程から本質的になる。適切に、治療組み合わせまたは多特異性抗原結合分子はまた、免疫系に腫瘍抗原を提示する抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）と接触する、
本発明のさらなる局面は、対象において癌の発症、進行または再発を阻害する方法を提供する。これらの方法は、通常、有効量の本明細書に記載される治療組み合わせまたは多特異性抗原結合分子を対象に投与し、それによって対象において癌の発症、進行または再発を阻害する工程を含む、該工程からなる、または該工程から本質的になる。
関連する局面において、本発明は、対象において癌を処置する方法を提供する。これらの方法は、通常、有効量の本明細書に記載される治療組み合わせまたは多特異性抗原結合分子を対象に投与し、それによって癌を処置する工程を含む、該工程からなる、または該工程から本質的になる。
本発明にしたがい処置され得る癌の非限定的な例は、黒色腫、乳癌、結腸癌、卵巣癌、子宮内膜および子宮癌腫、胃（gastric）または胃（stomach）癌、膵臓癌、前立腺癌、唾液腺癌、肺癌、肝細胞癌、膠芽腫、子宮頸癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、直腸癌、結腸直腸癌、腎臓癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、肛門癌腫、陰茎癌腫、精巣癌、食道癌、胆道の腫瘍、頭頚部癌、ならびに扁平上皮癌腫を含む。いくつかの具体的態様において、癌は転移癌である。
対象への治療組み合わせまたは多特異性抗原結合分子の投与を伴う任意の上記局面において、対象は、適切に、免疫調整剤に対する減少したまたは低下した応答性を有する、例えば、対象は、ICM分子アンタゴニスト（例えば、抗PD-1または抗PD-L1免疫療法）に対する減少したまたは低下した応答性を有する。
本発明の方法のいくつかにおいて、有効量の補助的抗癌剤が、対象に同時に投与される。いくつかの適切な補助的抗癌剤は、化学療法剤、放射線外部照射、標的指向放射性同位体およびシグナル伝達阻害剤を含む。しかし、任意の他の公知の抗癌剤が、同等に、本発明の方法における使用に適用可能である。
さらなる局面において、本発明は、免疫を刺激もしくは強化するため、腫瘍に対する免疫抑制もしくは寛容の発症もしくは進行を阻害するためまたは対象において癌を処置するためのキットを提供する。これらのキットは、上記および本明細書の他所に広義的に記載される治療組み合わせ、薬学的組成物および多特異性抗原結合分子の任意の1つまたは複数を含む。
図1は、ヒトRANK-Fc［RANK AA配列30～212］またはマウスRANK-Fc［RANK AA配列31～214］に対する抗RANKファージミドクローンの反応性に関するELISAを示す図表である。ELISA（Panousis et al., 2016, 前記にしたがうELISA法）においてウェルあたり100μL/ウェルのファージ溶液を用いて一点分析を行った。Y軸はO.D. A450nmである。ファージミドFabクローンを、ELISAにより標的結合に関して試験した。4℃で一晩、MTPBS；pH 7.3中2μg/mLの精製されたRANK-Fcまたは無関係のヒトIgG抗体で96ウェルMaxiSorp（商標）ELISA（Thermo Fischer Scientific 439454）プレートをコーティングした。プレートを、37℃で2時間、200μL/ウェルの5％スキムミルク/PBSTでブロッキングし、PBSTで2回洗浄した後、室温で90分間、ファージ上清（100μL/ウェル）と共にインキュベートした。ファージ上清は、スキムミルク/PBSTで1：2希釈した。プレートをPBSTで5回洗浄した後、PBSTで1；10,000希釈された抗M13-HRP抗体（Sino biological/Jomar 11973-MM05-100）と共にインキュベートした。プレートをPBSTで6回洗浄し、100μL TMB/E基質（Merck Millipore ES001-500ML）を用いてシグナルを生成した。この反応を、2Mリン酸（50μLウェル）で停止させ、450 nmで測定した。 図2は、RANKLによるヒトRANK-Fcに対する抗RANKファージミドR03A03の結合の阻害を示す図表である。組み換え可能性ヒトRANKLを、1μMの最終ウェル濃度となるよう添加した。50μL/ウェルのファージ上清の添加前に等量の4％スキムミルク/PBST中の2μMの競合RANKLタンパク質を各ウェルに添加したこと除いて以前に記載されたようにして競合ファージELISAを行った。値は、2回の決定の平均とした。 図3は、ヒトRANKL誘導インビトロ破骨細胞生成に対する抗RANK 3A3抗体の阻害効果を示す図表である。マウスBM細胞を、1000 ng/mL～7.8 ng/mLの濃度の陽性対照としてのRANK-Fc、IgG2aアイソタイプ対照、非ブロッキング性抗RANK 3B10 mAbまたはブロッキング性抗RANK 3A3抗体の存在下または非存在下で培養した。BM細胞の培養は、CSF-1およびヒトRANKLを補充したDMEM中で行った。7日後、TRAP+多核化（3つ超の核の）細胞を計測した。データを、3つの培養物の平均±SEMとして分析した。 図4は、マウスRANKL誘導インビトロ破骨細胞生成に対する抗RANK 3A3抗体の阻害効果を示す図表である。マウスBM細胞を、1000 ng/mL～7.8 ng/mLの濃度の陽性対照としての抗muRANKL IK22-5 mAb、IgG2aアイソタイプ対照、非ブロッキング性抗RANK 3B10 mAbまたはブロッキング性抗RANK 3A3抗体の存在下または非存在下で培養した。BM細胞の培養は、CSF-1およびマウスRANKLを補充したDMEM中で行った。7日後、TRAP+多核化（3つ超の核の）細胞を計測した。データを、3つの培養物の平均±SEMとして分析した。 図5は、抗PD-L1および抗RANK（3A3）mAbの組み合わせが腫瘍の皮下成長を抑制することを示す図表である。第0日に、C57BL/6 WTマウスのグループに、MCA1956（1 x 106細胞）を皮下注射した。次いで、示されるように、第10、14、18および22日に、マウスを、cIg（2A3 200μg i.p.）、抗PD-L1単独（10F9G2ラットIgG2b、50μg i.p.）、抗RANK単独（3A3マウスIgG1D265A、200μg i.p.）、またはそれらの組み合わせのいずれかで、腹腔内処置した。腫瘍成長を、デジタルカリパスを用いて測定し、腫瘍サイズを、グループあたり5～6匹のマウスの平均±SEMで表した。 図6は、抗PD-L1および抗RANK（3A3）mAbの組み合わせが腫瘍の皮下成長を抑制することを示す図表である。第0日に、C57BL/6 WTマウスのグループに、MC38-ovadim（1 x 106細胞）を皮下注射した。次いで、示されるように、第12、16、20および24日に、マウスを、cIg（2A3 200μg i.p.）、抗PD-L1単独（10F9G2ラットIgG2b、50μg i.p.）、抗RANK単独（3A3マウスIgG1D265A、200μg i.p.）、またはそれらの組み合わせのいずれかで、腹腔内処置した。腫瘍成長を、デジタルカリパスを用いて測定し、腫瘍サイズを、グループあたり5匹の平均±SEMで表した。
いくつかの図面および書類は、カラー表示または物を含んでいる。カラー図は、請求により出願人からまたは適切な特許庁から入手可能である。特許庁から入手する場合、料金が請求される可能性がある。
発明の詳細な説明
1．定義
特段の定義がなければ、本明細書で用いられる全ての技術および科学用語は、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本発明の実施または試験においては、本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料を使用することができるが、好ましい方法および材料について記載する。本発明の目的のために、以下の用語を以下で定義する。
「a」および「an」という冠詞は、本明細書において、1つまたは複数（すなわち、少なくとも1つ）の当該冠詞の文法上の目的語を表すために使用される。例として、「an element」は、1つの要素または複数の要素を意味する。
「約」は、参照される量（quantity）、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量（amount）、重量または長さに対して15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1％程度のばらつきのある量（quantity）、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量（amount）、重量または長さを意味する。
「同時（concurrently）投与」または「同時に投与」または「共投与」等の用語は、2つもしくはそれ以上の活性物質を含む単一の組成物の投与、または、その有効な結果が、すべてのそのような活性物質が単一の組成物として投与された場合に得られるのと同等である、別個の組成物としてのおよび／もしくは別経路により送達される各活性物質の同時（contemporaneously）または同時（simultaneously）または十分短い期間内での順次の投与を表す。「同時（simultaneously）」は、活性剤が実質的に同じ時点で、望ましくは同じ製剤として一緒に、投与されることを意味する。「同時（contemporaneously）」は、活性剤が近い時期に投与されること、例えば、1つの薬剤がもう一方の前後約1分以内～約1日以内に投与されることを表す。任意の同時の時間が有用である。しかし、多くの場合、同時（simultaneously）に投与されないならば、その薬剤は約1分以内～約8時間以内に、および適切には約1時間未満～約4時間以内に投与されるであろう。同時（contemporaneously）に投与される場合、薬剤は、適切には、対象の同じ部位に投与される。「同じ部位」という用語は、正確な位置を含むが、約0.5～約15センチメートル以内、好ましくは約0.5～約5センチメートル以内であり得る。「別々に」という用語は、本明細書で使用される場合、薬剤が、間隔、例えば、約1日～数週間または数か月の間隔をあけて投与されることを意味する。活性剤は、いずれの順番で投与されてもよい。「順次」という用語は、本明細書で使用される場合、薬剤が、順に、例えば、数分、数時間、数日または数週間の間隔をあけて投与されることを意味する。適切な場合、活性剤は、定期的な反復周期で投与され得る。
本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連して列挙される項目の1つまたは複数の任意かつすべての可能性のある組み合わせ、および択一なもの（または）として解釈される場合は、組み合わせの欠如、を表し、それらを包含する。
「アンタゴニスト」という用語は、その最も広義の意味で使用され、インビトロ、インサイチューまたはインビボを含む任意の状況において、RANKまたはICMの1つまたは複数の生物学的活性または機能、例えば、非限定的に、結合、シグナル伝達、複合体の形成、増殖、遊走、浸潤、生存または生存能を部分的または完全にブロックする、阻害する、停止する、縮小する、減少させる、妨げる、損なわせるまたは中和する任意の分子を含む。同様に、「アンタゴナイズする」、「アンタゴナイズ性」等の用語は、本明細書で言い換え可能に使用され、例えば上記および本明細書の他所に記載される活性または機能をブロックすること、阻害すること、停止すること、縮小すること、減少させること、妨げること、損なわせることまたは中和することを表す。例として、「アンタゴナイズする」は、活性または機能の約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％または100％の減少を表し得る。
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、特定の抗原（例えば、RANKまたはICM）に特異的に結合するまたは相互作用する少なくとも1つの相補性決定領域（CDR）を含む任意の抗原結合分子または分子複合体を意味する。「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互接続された2つの重（H）鎖および2つの軽（L）鎖である4つのペプチド鎖を含む免疫グロブリン分子、ならびにその多量体（例えば、IgM）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（HCVRまたはVHと省略され得る）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、CH1、CH2およびCH3の3つのドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（LCVRまたはVLと省略され得る）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、1つのドメイン（CL1）を含む。VHおよびVL領域は、フレームワーク領域（FR）と呼ばれる、より保存された領域によって間隔をあけて配置されている、相補性決定領域（CDR）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分される。各VHおよびVLは、3つのCDRおよび4つのFRから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で配置される。本発明の異なる態様において、本発明の抗体（またはその抗原結合部分）のFRは、ヒト生殖系配列と同一であり得る、または自然現象によりもしくは人為的に修飾され得る。アミノ酸コンセンサス配列は、2つまたはそれ以上のCDRの並列分析に基づき定義され得る。
抗体は、任意のクラス、例えばIgG、IgAもしくはIgM（またはそれらのサブクラス）の抗体を含み、かつ抗体は任意の特定のクラスであることを要しない。その重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てられ得る。IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMの5大免疫グロブリンクラスが存在し、これらのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2に分類され得る。異なる免疫グロブリンクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれ、α、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。異なる免疫グロブリンクラスのサブユニット構造および三次元構造は、周知である。
本明細書で使用される場合、「抗原」という用語およびその文法上の同義的表現（例えば、「抗原性」）は、特定の液性または細胞性免疫の生産物、例えば、抗体分子またはT細胞受容体によって特異的に結合され得る化合物、組成物または物質を表す。抗原は、例えば、ハプテン、単純な中間代謝産物、糖（例えば、オリゴ糖）、脂質およびホルモン、ならびに高分子、例えば、複雑な炭水化物（例えば、多糖）、リン脂質およびタンパク質を含む、任意のタイプの分子であり得る。抗原の一般的なカテゴリーは、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原生生物および他の寄生生物抗原、腫瘍抗原、自己免疫疾患、アレルギーおよび移植片拒絶に関与する抗原、毒素、ならびに他の様々な抗原を含むがこれらに限定されない。
「抗原結合フラグメント」、「抗原結合部分」、「抗原結合ドメイン」および「抗原結合部位」という用語は、本明細書で言い換え可能に使用され、抗原結合に関与する抗原結合分子の一部分を表す。これらの用語は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に存在する、酵素的に入手可能な、合成性の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、任意の適切な標準的技術、例えば、タンパク質分解消化または抗体の可変ドメインおよび任意で定常ドメインをコードするDNAの操作および発現を行う組み換え遺伝子操作技術を用いて、全長抗体分子から、取得され得る。そのようなDNAは、公知である、および／もしくは、例えば商業的供給源、DNAライブラリ（例えば、ファージ・抗体ライブラリを含む）から容易に入手可能である、または合成され得る。DNAは、例えば、1つもしくは複数の可変および／もしくは定常ドメインを適切な構成に配置するため、またはコドンを導入する、システイン残基を形成する、アミノ酸を修飾、付加もしくは欠失させるため等のために、配列決定され、化学的にまたは分子生物学的技術を用いることによって操作され得る。
抗原結合フラグメントの非限定的な例は、（i）Fabフラグメント、（ii）F(ab')2フラグメント、（iii）Fdフラグメント、（iv）Fvフラグメント、（v）単鎖Fv（scFv）分子、（vi）dAbフラグメント、および（vii）抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位（例えば、単離された相補性決定領域（CDR）、例えば、CDR3ペプチド）、または拘束されたFR3-CDR3-FR4ペプチドを含む。他の人工分子、例えば、ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、CDRグラフト抗体、1アーム抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディ等）、低分子免疫薬（SMIP）、およびサメ可変IgNARドメインもまた、本明細書で使用される「抗原結合フラグメント」という表現に包含される。
抗体の抗原結合フラグメントは、典型的に、少なくとも1つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成のものであり得、通常、1つまたは複数のフレームワーク配列に隣接するまたは1つまたは複数のフレームワーク配列とインフレームな少なくとも1つのCDRを含む。VLドメインに結合されたVHドメインを有する抗原結合フラグメントにおいて、VHおよびVLドメインは、相互に対して任意の適切な配置下に置かれ得る。例えば、可変領域は、二量体であり得、VH-VH、VH-VLまたはVL-VL二量体を含み得る。あるいは、抗体の抗原結合フラグメントは、単量体のVHまたはVLドメインを含み得る。
特定の態様において、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも1つの定常ドメインに共有結合により連結された少なくとも1つの可変ドメインを含み得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメント内で見出され得る可変および定常ドメインの非限定的、例示的な構成は、（i）VH-CH1、（ii）VH-CH2、（iii）VH-CH3、（iv）VH-CH1-CH2、（v）VH-CH1-CH2-CH3、（vi）VH-CH2-CH3、（vii）VH-CL、（viii）VL-CH1、（ix）VL-CH2、（x）VL-CH3、（i）VL-CH1-CH2、（xii）VL-CH1-CH2-CH3（xiii）VL-CH2-CH3、および（xiv）VL-CLを含む。任意の上記の例示的な構成を含む、可変および定常ドメインの任意の構成において、可変および定常ドメインは、相互に直接的に連結されるか、または完全なもしくは部分的なヒンジもしくはリンカー領域により連結されるかのいずれかであり得る。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子内での離接する可変および／または定常ドメイン間のフレキシブルまたは準フレキシブルな連結を実現する少なくとも2つ（例えば、5、10、15、20、40、60またはそれ以上）のアミノ酸からなり得る。さらに、本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、相互に非共有結合的に結合しているおよび／または（例えば、ジスルフィド結合により）1つまたは複数の単量体VHもしくはVLドメインを含む任意の上記の可変および定常ドメイン構成のホモ二量体もしくはヘテロ二量体（または他の多量体）を含み得る。多特異性抗原結合分子は、典型的に、少なくとも2つの異なる可変ドメインを含み、各可変ドメインは別個の抗原にまたは同じ抗原の異なるエピトープに特異的に結合することができる。本明細書に開示される例示的な二重特異性抗原結合分子を含む、任意の多特異性抗原結合分子形式が、当技術分野で利用可能な従来技術を用いて、本発明の抗体の抗原結合フラグメントとしての使用に適合され得る。
「抗原結合分子」は、標的抗原に対する結合親和性を有する分子を意味する。この用語は、免疫グロブリン、免疫グロブリンフラグメントおよび抗原結合活性を示す非免疫グロブリン由来タンパク質フレームワークに及ぶことが理解されるであろう。本発明を実施する上で有用な代表的な抗原結合分子は、抗体およびそれらの抗原結合フラグメントを含む。「抗原結合分子」という用語は、抗体および抗体の抗原結合フラグメントを含む。
「二重特異性抗原結合分子」という用語は、同じ抗原上の2つの異なるエピトープまたは2つの異なる抗原に結合する能力を有する多特異性抗原結合分子を表す。二重特異性抗原結合分子は、二価、三価または四価であり得る。本明細書で使用される場合、「結合価（valent）」、「結合価（valence）」、「結合価（valencies）」またはその他のそれらの文法上の派生語は、抗原結合分子内の抗原認識部位の数を意味する。これらの抗原認識部位は、同じエピトープまたは異なるエピトープを認識し得る。二価・二重特異性分子は、例えば、Kostelny et al. J Immunol 148 (1992):1547, Pack and Pluckthun Biochemistry 31 (1992) 1579、Gruber et al. J Immunol (1994) 5368、Zhu et al. Protein Sci 6 (1997):781、Hu et al. Cancer Res. 56 (1996):3055、Adams et al. Cancer Res. 53 (1993):4026、およびMcCartney, et al. Protein Eng. 8 (1995):301に記載されている。三価二重特異性抗原結合分子および四価二重特異性抗原結合分子もまた、当技術分野で公知である。例えば、Kontermann RE (ed.), Springer Heidelberg Dordrecht London New York, pp. 199- 216 (2011)を参照のこと。二重特異性抗原結合分子はまた、4より高い結合価を有し得、それもまた本発明の範囲内である。そのような抗原結合分子は、例えば、ドック・アンド・ロック（dock and lock）コンジュゲート法により、生成され得る（Chang, C.-H. et al. In: Bispecific Antibodies. Kontermann RE (2011), 前記）。
これに対して、「一価抗原結合分子」という用語は、抗原の単一のエピトープに結合する抗原結合分子を表す。一価抗原結合分子は、典型的に、抗原架橋を行うことができない。
「抗原結合部位」は、抗原との相互作用を提供する抗原結合分子の部位、すなわち、1つまたは複数のアミノ酸残基を表す。例えば、抗体の抗原結合部位は、相補性決定領域（CDR）のアミノ酸残基を含む。ネイティブの免疫グロブリン分子は典型的に2つの抗原結合部位を有し、Fab分子は典型的に1つの抗原結合部位を有する。本明細書に記載される抗原結合分子の抗原結合部位は、典型的に、抗原に、より具体的には抗原のエピトープに特異的に結合する。
「特異的に結合する」または「特異的結合」というフレーズは、生理学的条件下でバックグラウンドの少なくとも2倍、より典型的にはバックグラウンドの分子結合の10～100倍超である2つの分子間の結合反応を表す。タンパク質である1つまたは複数の検出可能な結合物質を使用する場合、特異的結合は、タンパク質および他の生体物質の異種集団内でのそのタンパク質の存在の決定要因となる。したがって、指定された免疫アッセイ条件下で、特定の抗原結合分子は特定の抗原性決定基に結合し、それによってその存在を特定する。そのような条件下での抗原性決定基に対する特異的結合は、その決定基に対する特異性に関して選択された抗原結合分子を必要とする。この選択は、他の分子と交差反応する抗原結合分子を取り除くことによって達成され得る。抗原結合分子、例えば免疫グロブリンを、それらが特定の抗原と特異的に免疫反応するよう選択するために、様々な免疫アッセイ形式が使用され得る。例えば、固相ELISA免疫アッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために従来から使用されている（例えば、Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988) for a description of immunoassay formats and conditions that can be used to determine specific immunoreactivityを参照のこと）。結合親和性および特異性を決定する方法はまた、当技術分野で周知である（例えば、Harlow and Lane, 前記；Friefelder, "Physical Biochemistry: Applications to biochemistry and molecular biology" (W.H. Freeman and Co. 1976)を参照のこと）。
「キメラ」という用語は、分子を参照して使用される場合、その分子が2つまたはそれ以上の異なる起源または供給源に由来する、2つまたはそれ以上の異なる起源または供給源から取得もしくは単離された、または2つまたはそれ以上の異なる起源または供給源に基づく部分を含むことを意味する。したがって、ポリペプチドは、それが異なる起源の2つまたはそれ以上のアミノ酸配列を含む場合、キメラであり、（1）天然では一緒に見いだされないポリペプチド配列（すなわち、アミノ酸配列の少なくとも1つがその他のアミノ酸配列の少なくとも1つに対して異種である）、または（2）自然界では隣接していないアミノ酸配列、を含む。
「分化クラスター38」（CD38）（環状ADPリボースヒドロラーゼ、ADPRC1およびADPRC 1としても公知）は、CD4+、CD8+、Bリンパ球、骨髄およびナチュラルキラー細胞を含む多くの免疫細胞（白血球）の表面上で見いだされる糖タンパク質である。CD38はまた、細胞接着、シグナル伝達およびカルシウムシグナル伝達においても機能する。CD38は、NADP+からのNAADPの合成に加えて、NAD＋からの環状ADPリボース（cADPR）の合成およびADPリボースへの加水分解を触媒する多機能性外酵素である。「CD38」という用語は、CD38のフラグメントならびに、対立遺伝子変種、スプライス変種、誘導体変種、置換変種、欠失変種および／または挿入変種、融合ポリペプチドならびに種間ホモログを含むがこれらに限定されない関連ポリペプチドを含む。特定の態様において、CD38ポリペプチドは、末端残基、例えば、非限定的に、リーダー配列残基、標的化残基、アミノ末端メチオニン残基、リジン残基、タグ残基および／または融合タンパク質残基を含む。好ましい態様において、本明細書で使用される「CD38」は、ヒトCD38（hCD38）、hCD38の変種、アイソフォームおよび種ホモログ、ならびにhCD38との少なくとも1つの共通エピトープを有するアナログを含む。完全なhCD38配列は、UniProtアクセッション番号P28907の下で見出すことができる。
「分化クラスター103（CD103）」（インテグリン、アルファE（ITGAE）、HUMINAE、インテグリンサブユニットアルファEとしても公知）は、ヒトにおいてITGAE遺伝子によりコードされるインテグリンタンパク質である。CD103は、インテグリンベータ7（β7-ITGB7）に結合して完全ヘテロ二量体インテグリン分子αEβ7を形成する。「CD103」という用語は、CD103のフラグメントならびに、対立遺伝子変種、スプライス変種、誘導体変種、置換変種、欠失変種および／または挿入変種、融合ポリペプチドならびに種間ホモログを含むがこれらに限定されない関連ポリペプチドを含む。特定の態様において、CD103ポリペプチドは、末端残基、例えば、非限定的に、リーダー配列残基、標的化残基、アミノ末端メチオニン残基、リジン残基、タグ残基および／または融合タンパク質残基を含む。好ましい態様において、本明細書で使用される「CD103」は、ヒトCD103（hCD103）、hCD103の変種、アイソフォームおよび種ホモログ、ならびにhCD103との少なくとも1つの共通エピトープを有するアナログを含む。完全なhCD103配列は、UniProtアクセッション番号P3850の下で見出すことができる。
「分化クラスター163」（CD163）（M130、MM130、SCARI1としても公知）は、ヘモグロビン・ハプトグロビン複合体の高親和性スカベンジャー受容体であり、ハプトグロビンの非存在下では、ヘモグロビン単独に対してより低い親和性を示す。それはまた、単球／マクロファージ系統の細胞のマーカーでもあり、特に、M2様免疫抑制性骨髄細胞のマーカーである。CD163は、グラム陽性およびグラム陰性細菌に対する自然免疫センサーとして機能する。「CD163」という用語は、CD163のフラグメントならびに、対立遺伝子変種、スプライス変種、誘導体変種、置換変種、欠失変種および／または挿入変種、融合ポリペプチドならびに種間ホモログを含むがこれらに限定されない関連ポリペプチドを含む。特定の態様において、CD163ポリペプチドは、末端残基、例えば、非限定的に、リーダー配列残基、標的化残基、アミノ末端メチオニン残基、リジン残基、タグ残基および／または融合タンパク質残基を含む。好ましい態様において、本明細書で使用される「CD163」は、ヒトCD163（hCD163）、hCD163の変種、アイソフォームおよび種ホモログ、ならびにhCD163との少なくとも1つの共通エピトープを有するアナログを含む。完全なhCD163配列は、UniProtアクセッション番号Q86VB7の下で見出すことができる。
「分化クラスター200」（CD200）（OX-2膜糖タンパク質、MOX1、MOX2、MRC、OX-2としても公知）は、CD200遺伝子によってコードされるヒトタンパク質である。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、2つの免疫グロブリンドメインを含み、したがってその免疫グロブリンスーパーファミリーに属する1型膜糖タンパク質である。この遺伝子は、骨髄細胞の活性を調節し、様々な組織においてマクロファージ系統に対する抑制シグナルを送達する。「CD200」という用語は、CD200のフラグメントならびに、対立遺伝子変種、スプライス変種、誘導体変種、置換変種、欠失変種および／または挿入変種、融合ポリペプチドならびに種間ホモログを含むがこれらに限定されない関連ポリペプチドを含む。特定の態様において、CD200ポリペプチドは、末端残基、例えば、非限定的に、リーダー配列残基、標的化残基、アミノ末端メチオニン残基、リジン残基、タグ残基および／または融合タンパク質残基を含む。好ましい態様において、本明細書で使用される「CD200」は、ヒトCD200（hCD200）、hCD200の変種、アイソフォームおよび種ホモログ、ならびにhCD200との少なくとも1つの共通エピトープを有するアナログを含む。完全なhCD200配列は、UniProtアクセッション番号P41217の下で見出すことができる。
「分化クラスター206」（CD206）（マンノース受容体としても公知）は、マクロファージおよび未成熟樹状細胞を含む骨髄細胞の表面上に主に存在するC型レクチンである。この受容体は、いくつかの微生物の表面上で見いだされるタンパク質に結合したグリカン上の末端マンノース、N-アセチルグルコサミンおよびフコース残基を認識し、自然および適応の両免疫系において役割を果たす。さらなる機能は、硫酸化糖タンパク質ホルモンおよび病理学的イベントに応じて放出される糖タンパク質を含む糖タンパク質の循環からの除去を含む。マンノース受容体は、クラスリン依存的な様式で、原形質膜とエンドソーム区画の間で継続的にリサイクルされる。「CD206」という用語は、CD206のフラグメントならびに、対立遺伝子変種、スプライス変種、誘導体変種、置換変種、欠失変種および／または挿入変種、融合ポリペプチドならびに種間ホモログを含むがこれらに限定されない関連ポリペプチドを含む。特定の態様において、CD206ポリペプチドは、末端残基、例えば、非限定的に、リーダー配列残基、標的化残基、アミノ末端メチオニン残基、リジン残基、タグ残基および／または融合タンパク質残基を含む。好ましい態様において、本明細書で使用される「CD206」は、ヒトCD206（hCD206）、hCD206の変種、アイソフォームおよび種ホモログ、ならびにhCD206との少なくとも1つの共通エピトープを有するアナログを含む。完全なhCD206配列は、UniProtアクセッション番号P22897の下で見出すことができる。
「コード配列」は、遺伝子のポリペプチド産物または遺伝子の最終mRNA産物（例えば、スプライシング後の遺伝子のmRNA産物）のコードに寄与する任意の核酸配列を意味する。これに対して、「非コード配列」という用語は、遺伝子のポリペプチド産物または遺伝子の最終mRNA産物のコードに寄与しない任意の核酸配列を表す。
本明細書で使用される場合、「相補性決定領域」（CDR；すなわち、CDR1、CDR2およびCDR3）という用語は、その存在が抗原結合に必要とされる抗体可変ドメインのアミノ酸残基を表す。各可変ドメインは、典型的に、CDR1、CDR2およびCDR3として特定される3つのCDR領域を有する。各相補性決定領域は、例えばKabatにより定義される「相補性決定領域」のアミノ酸残基（すなわち、おおよそ軽鎖可変ドメインの残基24～34（L1）、50～56（L2）および89～97（L3）ならびに重鎖可変ドメインの31～35（H1）、50～65（H2）および95～102（H3）；Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）ならびに／または「超可変ループ」の残基（すなわち、おおよそ軽鎖可変ドメインの残基26～32（L1）、50～52（L2）および91～96（L3）ならびに重鎖可変ドメインの26～32（H1）、53～55（H2）および96～101（H3）；Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）を含み得る。いくつかの例において、相補性決定領域は、Kabatにより定義されるCDR領域および超可変ループの両方のアミノ酸を含み得る。
本明細書で使用される場合、「複合体」という用語は、相互に直接および／または間接接触している分子（例えば、ペプチド、ポリペプチド等）の集合体または凝集体を表す。特定の態様において、「接触」または特に「直接接触」は、2つまたはそれ以上の分子が、それらの分子の相互作用を誘引性非共有結合性相互作用、例えば、ファンデルワールス力、水素結合、イオン性および疎水性相互作用等が支配するよう十分近接していることを意味する。そのような態様において、分子（例えば、ペプチドおよびポリペプチド）の複合体は、その複合体が（例えば、その構成成分である分子の非凝集または非複合体化状態と比較して）熱力学的に好ましい条件下で形成される。「ポリペプチド複合体」または「タンパク質複合体」という用語は、本明細書で使用される場合、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、十量体、十一量体、十二量体、またはそれより高次のオリゴマーを表す。
本明細書を通じて、文脈がそれ以外のことを必要としていない限り、「含む（comprise）」、「含む（comprises）」および「含む（comprising）」という語は、示されている工程もしくは要素または工程もしくは要素の群を包含し、任意の他の工程もしくは要素または工程もしくは要素の群を排除しないことを暗示していると理解されるであろう。したがって、「含む（comprising）」等の用語の使用は、列挙されている要素が必要とされるまたは必須であるが、他の要素は任意であり存在してもしなくてもよいことを示す。「からなる」は、その「からなる」というフレーズの後に続くものが何であれ、それを含みかつそれに限定されることを意味する。したがって、「からなる」というフレーズは、列挙されている要素が必要とされるまたは必須であり、かつ他の要素が存在し得ないことを示す。「から本質的になる」は、そのフレーズの後に列挙される任意の要素を含み、かつその列挙される要素に関して本開示で示されている活性または作用と干渉しないまたはそれに寄与しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「から本質的になる」というフレーズは、列挙されている要素が必要とされるまたは必須であるが、他の要素は任意であり、それらが列挙される要素の活性または作用に影響するかどうかに依存して存在する場合も存在しない場合もあることを示す。いくつかの態様において、言及されているサブユニット配列（例えば、アミノ酸配列）との関係でいう「から本質的になる」というフレーズは、その配列が、少なくとも1つの追加の上流サブユニット（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50もしくはそれ以上の上流サブユニット、例えば、アミノ酸）および／または少なくとも1つの追加の下流サブユニット（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50もしくはそれ以上の下流サブユニット、例えば、アミノ酸）を含み得ることを示し、ここで上流サブユニットおよび下流サブユニットの数は独立して選択可能である。
本明細書で使用される場合、化学的コンジュゲートまたは組み換え手段（例えば、遺伝子融合による）を含むどのような手段によるものであっても、2つ以上の要素または成分またはドメインが一つに接続される文脈において、「コンジュゲート」、「連結」、「融合（fused）」または「融合（fusion）」という用語およびそれらの文法上の同義語は、言い換え可能に使用される。（例えば、ヘテロ二機能性架橋剤を用いる）化学的コンジュゲート法は、当技術分野で公知である。
本願の中で使用される「定常ドメイン」または「定常領域」という用語は、可変領域以外の抗体のドメインの総和を意味する。定常領域は、抗原の結合に直接関与しないが、様々な免疫エフェクター機能を示す。
「コンストラクト」という用語は、異なる供給源由来の1つまたは複数の単離された核酸配列を含む組み換え遺伝分子を表す。したがって、コンストラクトは、異なる起源の2つまたはそれ以上の核酸配列が単一の核酸分子にまとめられたキメラ分子であり、（1）自然界では一緒に見いだされない（すなわち、ヌクレオチド配列の少なくとも1つがその他のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して異種である）調節およびコード配列を含む核酸配列、または（2）自然界では隣接しない機能的なRNA分子またはタンパク質の一部をコードする配列、または（3）自然界では隣接しないプロモーターの一部を含む任意のコンストラクトを含む。代表的なコンストラクトは、1つまたは複数の核酸分子が機能的に連結された核酸分子を含む、ゲノム組み込みまたは自律複製が可能な、任意の供給源由来の、任意の組み換え核酸分子、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、自律複製性ポリヌクレオチド分子、ファージ、または直鎖状もしくは環状一本鎖もしくは二本鎖DNAもしくはRNA核酸分子、を含む。本発明のコンストラクトは、通常、このコンストラクトに含まれる関心対象の核酸配列の発現を誘導するのに必要な要素、例えば、標的核酸配列または調節核酸配列を含む。そのような要素は、制御要素、例えば、関心対象の核酸配列（の転写を誘導するよう）に機能的に連結されたプロモーターを含み得、しばしば、ポリアデニル化配列も含む。本発明の特定の態様において、コンストラクトは、ベクターに含まれ得る。コンストラクトの要素に加えて、ベクターは、例えば、1つもしくは複数の選択マーカー、1つもしくは複数の複製起点、例えば原核生物および真核生物起点、少なくとも1つのマルチクローニングサイト、ならびに／または宿主細胞のゲノムへのコンストラクトの安定的組み込みを促進する要素を含み得る。2つもしくはそれ以上のコンストラクトは、単一の核酸分子、例えば、単一のベクターに含まれ得、または2つもしくはそれ以上の別個の核酸分子、例えば2つもしくはそれ以上の別個のベクターに含まれ得る。「発現コンストラクト」は、通常、関心対象のヌクレオチド配列に機能的に連結された少なくとも1つの制御配列を含む。この様式で、例えば、発現させたいヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーターが、宿主細胞を含む生物またはその一部における発現のための発現ベクターに提供される。本発明の実施上、コンストラクトおよび宿主細胞を調製および使用するための従来的な組成物および方法は、当技術分野で周知である、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition Volumes 1, 2, および3. J. F. Sambrook, D. W. Russell, and N. Irwin, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000を参照のこと。
「制御要素」または「制御配列」は、特定の宿主細胞における機能的に連結されたコード配列の発現に必要とされる核酸配列（例えば、DNA）を意味する。原核生物細胞に適した制御配列は、例えば、プロモーター、ならびに任意で、シス作用性配列、例えば、オペレーター配列およびリボソーム結合部位を含む。真核生物細胞に適した制御配列は、転写制御配列、例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、転写エンハンサー、翻訳制御配列、例えば、翻訳エンハンサーおよび内部リボソーム結合部位（IRES）、mRNAの安定性を調整する核酸配列、ならびに転写されるポリヌクレオチドによりコードされる生産物を細胞内の細胞内区画または細胞外環境に標的化する標的化配列を含む。
「対応する（corresponds to）」または「対応する（corresponding to）」は、参照核酸配列に対して実質的な配列同一性（例えば、参照核酸配列の全体もしくは一部に対して少なくとも約50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、97、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％もしくは100％でさえある配列同一性）を示す核酸配列または参照アミノ酸配列に対して実質的な配列類似性もしくは同一性（例えば、参照アミノ酸配列の全体もしくは一部に対して少なくとも50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、97、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％もしくは100％でさえある配列類似性もしくは同一性）を示すアミノ酸配列を意味する。
「細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4（CTLA4）」（ALPS5、CD、CD152、CELIAC3、CTLA-4、GRD4、GSE、IDDM12としても公知）は、免疫チェックポイントとして機能し、免疫応答を下方調節するタンパク質受容体を表す。CTLA4は、T制御性細胞（Treg）において構成的に発現されるが、従来的なT細胞においては活性化後に上方調節されるのみである。それは、抗原提示細胞の表面上のCD80またはCD86に結合した際、「オフ」スイッチとして機能する。本明細書で使用される「CTLA4」という用語は、ヒトCTLA4（hCTLA4）、hCTLA4の変種、アイソフォームおよび種ホモログ、ならびにhCTLA4との少なくとも1つの共通エピトープを有するアナログを含む。完全なhCTLA4配列は、UniProtアクセッション番号P16410の下で見いだされ得る。
「DART」（二重親和性再標的化試薬）という用語は、同じまたは異なるエピトープを認識し得る少なくとも2つのエピトープ結合部位を形成するよう（特に、共有結合的相互作用を通じて）結合する少なくとも2つのポリペプチド鎖を含む免疫グロブリン分子を表す。DARTのポリペプチド鎖の各々は、免疫グロブリン軽鎖可変領域および免疫グロブリン重鎖可変領域を含むが、これらの領域はエピトープ結合部位を形成するよう相互作用しない。そうではなく、1つ（例えば、第1の）DARTポリペプチド鎖の免疫グロブリン重鎖可変領域は、異なる（例えば、第2の）DARTポリペプチド鎖の免疫グロブリン軽鎖可変領域と相互作用し、エピトープ結合部位を形成する。同様に、1つ（例えば、第1の）DARTポリペプチド鎖の免疫グロブリン軽鎖可変領域は、異なる（例えば、第2の）DARTポリペプチド鎖の免疫グロブリン重鎖可変領域と相互作用し、エピトープ結合部位を形成する。DARTは、一特異性、二重特異性、三重特異性等であり得、したがって、（同じまたは異なる抗原のものであり得る）1つ、2つ、3つまたはそれ以上の異なるエピトープに同時に結合しすることができる。DARTはさらに、一価、二価、三価、四価、五価、六価等であり得、したがって、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つまたはそれ以上の分子に同時に結合することができる。DARTのこれらの2つの属性（すなわち、特異性および結合価の度数）は、例えば、四価である（すなわち、4セットのエピトープに結合することができる）二重特異性（すなわち、2つのエピトープに結合することができる）抗体等を生成するよう組み合わされ得る。DART分子は、より詳細に、国際PCT公開番号WO 2006/113665、WO 2008/157379、およびWO 2010/080538に開示されている。
「有効量」は、疾患または状態（例えば、癌）の処置または予防との関係で、その疾患または状態の処置または予防に効果的な量の活性剤の、単回用量でまたは一連の用量もしくは徐放システムの一部としてのいずれかでの、対象への投与を意味する。有効量は、対象の健康および身体的状態、および処置される個体の分類学的グループ、組成物の配合、医学的状況の評価、ならびに他の関連因子に依存して異なり得る。
本明細書で使用される場合、「コードする（encode）」、「コードする（encoding）」等の用語は、別の核酸またはポリペプチドを提供する核酸の能力を表す。例えば、核酸配列は、それがポリペプチドを生成するよう転写および／または翻訳され得る場合、またはそれがポリペプチドを生成するよう転写および／もしくは翻訳され得る形態にプロセシングされ得る場合、ポリペプチドを「コードする」と言われる。そのような核酸配列は、コード配列またはコード配列および非コード配列の両方を含み得る。したがって、「コードする（encode）」、「コードする（encoding）」等の用語は、DNA分子の転写から生じるRNA産物、RNA分子の翻訳から生じるタンパク質、RNA産物を形成するDNA分子の転写およびその後のRNA産物の翻訳から生じるタンパク質、またはRNA産物を提供するDNA分子の転写、プロセシングを受けたRNA産物（例えば、mRNA）を提供するRNA産物のプロセシングおよびその後のプロセシングを受けたRNA産物の翻訳から生じるタンパク質を含む。
「エピトープ」および「抗原性決定基」という用語は、本明細書で言い換え可能に使用され、抗原結合分子またはその抗原結合フラグメントによって結合される抗原の領域を表す。エピトープは、連続するアミノ酸（直鎖状エピトープ）またはタンパク質の三次折り畳みによって近接する非連続アミノ酸（立体構造的エピトープ）の両方から形成され得る。連続するアミノ酸から形成されるエピトープは典型的に、変性溶媒に暴露されても維持され、これに対して三次折り畳みにより形成されるエピトープは典型的に、変性溶媒処理により失われる。エピトープは典型的に、特有の空間的配置にある少なくとも3および通常は少なくとも5または8～10個のアミノ酸を含む。エピトープの空間的配置を決定する方法は、例えば、x線結晶解析および二次元核磁気共鳴を含む（例えば、Morris G.E., Epitope Mapping Protocols, Meth Mol Biol, 66 (1996)を参照のこと）。好ましいエピトープマッピング法は、表面プラズモン共鳴である。二重特異性抗体は、二価、三価、または四価であり得る。二重特異性抗体との関係で本明細書で使用される場合、「結合価（valent）」、「結合価（valence）」、「結合価（valencies）」という用語またはそれらの文法上の派生語は、抗体分子内の抗原結合部位の数を意味する。これらの抗原認識部位は、同じエピトープまたは異なるエピトープを認識し得る。二価二重特異性分子は、例えば、Kostelny et al., (1992) J Immunol 148:1547; Pack and Pluckthun (1992) Biochemistry 31:1579; Hollinger et al., 1993, 前記, Gruber et al., (1994) J Immunol 5368, Zhu et al., (1997) Protein Sci 6:781; Hu et al., (1996) Cancer Res 56:3055; Adams et al., (1993) Cancer Res 53:4026; およびMcCartney et al., (1995) Protein Eng 8:301に記載されている。三価二重特異性抗体および四価二重特異性抗体もまた、当技術分野で公知である（例えば、Kontermann R E (ed.), Springer Heidelberg Dordrecht London New York, 199-216 (2011)を参照のこと）。二重特異性抗体はまた、4より高い結合価を有し得、それもまた本発明の範囲内である。そのような抗体は、例えば、ドック・アンド・ロックコンジュゲート法により、生成され得る（Chang, C.-H. et al. In: Bispecific Antibodies. Kontermann R E (ed.), Springer Heidelberg Dordrecht London New York, pp. 199-216 (2011)を参照のこと）。
本明細書で使用される場合、「機能」、「機能的」等の用語は、リガンド結合、多量体化、活性化、シグナル伝達、生物学的、病理学的または治療的機能を表す。
「フレームワーク領域」（FR）は、CDR残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは、典型的に、FR1、FR2、FR3およびFR4として特定される4つのFRを有する。CDRがKabatにしたがい定義される場合、軽鎖FR残基は、おおよそ残基1～23（LCFR1）、35～49（LCFR2）、57～88（LCFR3）および98～107（LCFR4）に位置し、重鎖FR残基は、重鎖残基中のおおよそ残基1～30（HCFR1）、36～49（HCFR2）、66～94（HCFR3）および103～113（HCFR4）に位置する。CDRが超可変ループのアミノ酸残基を含む場合、軽鎖FR残基は、軽鎖のおおよそ残基1～25（LCFR1）、33～49（LCFR2）、53～90（LCFR3）および97～107（LCFR4）に位置し、重鎖FR残基は、重鎖残基中のおおよそ残基1～25（HCFR1）、33～52（HCFR2）、56～95（HCFR3）および102～113（HCFR4）に位置する。いくつかの例において、CDRがKabatにより定義されるCDRおよび超可変ループのそれらの両方のアミノ酸を含む場合、FR残基は、それに応じて調節される。例えば、CDRH1がアミノ酸H26～H35を含む場合、重鎖FR1残基は1～25位にあり、FR2残基は36～49位にある。
「ガレクチン-9」（Gal9）（LGALS9、HUAT、LGALS9Aとも称される）は、細胞凝集および接着ならびに腫瘍細胞のアポトーシスを含む様々な生物学的機能を調整する2つの炭水化物認識ドメインを有するタンデムリピート型ガレクチンである。ガレクチン-9はまた、癌細胞に対する抗増殖効果を有し、T細胞免疫グロブリンムチン-3（Tim-3）と相互作用してCD8+T細胞の消耗を促進し、骨髄由来サプレッサー細胞の拡張を誘導することによりT細胞応答を負に調節する。これらの機構は、腫瘍の成長および免疫からの逃避に関与する。多くの固形癌において、ガレクチン-9発現の消失は、転移の進行に強く相関し、組み換えガレクチン-9処置は、様々な前臨床癌モデルにおいて転移の拡散を防いでいる。「Gal9」という用語は、Gal9のフラグメントならびに対立遺伝子変種、スプライス変種、誘導体変種、置換変種、欠失変種および／または挿入変種、融合ポリペプチドならびに種間ホモログを含むがこれらに限定されない関連するポリペプチドを含む。特定の態様において、Gal9ポリペプチドは、末端残基、例えば、非限定的に、リーダー配列残基、標的化残基、アミノ末端メチオニン残基、リジン残基、タグ残基および／または融合タンパク質残基を含む。好ましい態様において、本明細書で使用される「Gal9」は、ヒトGal9（hGal9）、hGal9の変種、アオソフォームおよび種ホモログ、ならびにhGal9との少なくとも1つの共通エピトープを有するアナログを含む。完全なhGal9配列は、UniProtアクセッション番号O00182の下で見出すことができる。
「ヘルペスウイルス侵入メディエーター」（HVEM）（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー14（TNFRSF14）、ATAR、CD270、HVEA、HVEM、LIGHTR、TR2、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー14、TNF受容体スーパーファミリーメンバー14としても公知）は、TNF受容体スーパーファミリーのヒト細胞表面受容体である。この受容体は、単純ヘルペスウイルス（HSV）の侵入の細胞メディエーターとして同定された。この受容体タンパク質へのHSVウイルスエンベロープ糖タンパク質D（gD）の結合は、ウイルス侵入機構の一部であることが示されている。この受容体の細胞質領域は、免疫応答を活性化させるシグナル伝達経路を媒介し得る、様々なTRAFファミリーメンバーに結合することが見いだされた。「HVEM」という用語は、HVEMのフラグメントならびに対立遺伝子変種、スプライス変種、誘導体変種、置換変種、欠失変種および／または挿入変種、融合ポリペプチドならびに種間ホモログを含むがこれらに限定されない関連するポリペプチドを含む。特定の態様において、HVEMポリペプチドは、末端残基、例えば、非限定的に、リーダー配列残基、標的化残基、アミノ末端メチオニン残基、リジン残基、タグ残基および／または融合タンパク質残基を含む。好ましい態様において、本明細書で使用される「HVEM」は、ヒトHVEM（hHVEM）、hHVEMの変種、アオソフォームおよび種ホモログ、ならびにhHVEMとの少なくとも1つの共通エピトープを有するアナログを含む。完全なhHVEM配列は、UniProtアクセッション番号Q92956の下で見出すことができる。
本明細書で使用される場合、細胞マーカーまたはバイオマーカーの測定における「より高い」という用語は、参照レベルと比較しての、その参照レベルよりも高い、バイオマーカー測定値レベルの統計的に有意かつ測定可能な差を表す。その差は、適切には、少なくとも約10％、または少なくとも約20％、または少なくとも約30％、または少なくとも約40％、または少なくとも約50％、または少なくとも約60％、または少なくとも約70％、または少なくとも約80％、または少なくとも約90％である。
「免疫チェックポイント分子」という用語は、免疫チェックポイントとして機能する受容体およびリガンドの両方を含む。免疫チェックポイントは、免疫系がそれ自身の身体を攻撃するのを防ぐ免疫逃避機構である。免疫チェックポイント受容体は、T細胞上に存在し、抗原提示細胞上に発現される免疫チェックポイントリガンドと相互作用する。T細胞は、MHC分子上に提示される抗原を認識し、免疫反応を生じるよう活性化され、上記と平行して起こる免疫チェックポイント受容体とリガンドの間の相互作用は、T細胞の活性化を制御する。例示的な免疫チェックポイント分子は、非限定的に、PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、A2AR、A2BR、B7-H3、CD276、VTCN1、BTLA、IDO、KIR、LAG3、TIM-3、VISTA、CD73、CD96、CD155、DNAM-1、CD112、CRTAM、TNFRS4（OX40、CD134）、TNFSF4（OX40L）、CD244、CD160、GITR、GITRL、ICOS、GAL-9、4-1BBL（CD137L）、4-1BB（CD137）、CD70、CD27L、CD28、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、SIRP-1、IAP（CD47）、BLAST-1（CD48）、CD244；CD40、CD40L、HVEM、TMIGD2、HHLA2、VEGI、TNFRS25、ICOLG（B7RP1）およびTIGITを含む。特定の態様において、免疫チェックポイント分子は、PD-1、PD-L1またはCTLA-4である。
本発明との関係でいう「免疫エフェクター細胞」という用語は、免疫反応の間にエフェクター機能を発揮する細胞を表す。例えば、そのような細胞は、サイトカインおよび／またはケモカインを分泌し、微生物を殺傷し、抗体を分泌し、感染または癌性細胞を認識し、任意でそのような細胞を排除する。例えば、免疫エフェクター細胞は、T細胞（細胞傷害性T細胞、ヘルパーT細胞、腫瘍浸潤性T細胞）、B細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、リンホカイン活性化キラー（LAK）細胞、好中球、マクロファージおよび樹状細胞を含む。
本発明との関係でいう「免疫エフェクター機能」という用語は、例えば、ウイルス感染細胞もしくは腫瘍細胞の殺傷、または腫瘍成長の阻害および／もしくは腫瘍の拡散および転移を含む腫瘍発症の阻害をもたらす免疫系の成分により媒介される任意の機能を含む。好ましくは、本発明との関係でいう免疫エフェクター機能は、T細胞媒介エフェクター機能である。そのような機能は、ヘルパーT細胞（CD4+ T細胞）の場合、T細胞受容体によるMHCクラスII分子との関係下にある抗原もしくは抗原由来の抗原ペプチドの認識、サイトカインの放出ならびに／またはCD8+リンパ球（CTL）および／もしくはB細胞の活性化、ならびにCTLの場合は、T細胞受容体によるMHCクラスI分子との関係下にある抗原もしく抗原由来の抗原ペプチドの認識、例えばアポトーシスまたはパーフォリン媒介細胞溶解を通じた、MHCクラスI分子との関係下で提示される細胞、すなわちクラスI MHCを伴う抗原の提示により特徴づけられる細胞の排除、サイトカイン、例えば、IFN-γおよびTNF-αの産生、ならびに抗原発現標的細胞の特異的細胞溶解殺傷を含む。
「免疫系」という用語は、損傷および障害ならびに腫瘍、病原体および自己反応性細胞を含むがこれらに限定されない抗原性分子から構成される物質に対する防御を提供する、抗原特異的および非特異的カテゴリーの、それぞれ、適応および自然免疫系を含む、細胞、分子成分および機構を表す。「適応免疫系」は、数日間出現し、特定の抗原と反応してこれを除去する抗原特異的細胞、分子成分および機構を表す。適応免疫系は、宿主の生涯を通じて発展する。適応免疫系は、白血球に基づくものであり、主としてB細胞により産生される免疫グロブリンを通じて作用する液性免疫系および主としてT細胞を通じて機能する細胞媒介免疫系の2つの大きなセクションに分類される。
「リンカー」は、2つの分子を接続し、多くの場合その2つの分子を望ましい立体構造下に置くよう機能する分子または分子群（例えば、単量体もしくは多量体）を意味する。特定の態様において、「ペプチドリンカー」は、2つのタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ドメイン、領域またはモチーフを接続し、同族エピトープに特異的に結合できるようにする抗原結合フラグメントの空間的間隔に適合するスペーサー機能を提供し得るアミノ酸配列を表す。特定の態様において、リンカーは、約2～約35アミノ酸、例えば、または約4～約20アミノ酸または約8～約15アミノ酸または約15～約25アミノ酸から構成される。
本明細書で使用される場合、細胞マーカーまたはバイオマーカーの測定に関する「より低い」という用語は、参照レベルと比較しての、その参照レベルよりも低い、バイオマーカー測定値レベルの統計的に有意かつ測定可能な差を表す。その差は、適切には、少なくとも約10％、または少なくとも約20％、または少なくとも約30％、または少なくとも約40％、または少なくとも約50％、または少なくとも約60％、または少なくとも約70％、または少なくとも約80％、または少なくとも約90％である。
「陰性」、「陽性」および「低」発現レベルは、それらがマーカーに適用される場合、以下のように定義される。陰性発現（すなわち、「-」）を示すまたは「発現を欠く」細胞は、本明細書において、追加の蛍光放射チャネルにおいて関心対象の他のタンパク質を標識する完全抗体染色カクテルの存在下の蛍光のチャネルにおいてアイソタイプ対照抗体で観察される発現の95パーセンタイル以下を発現する細胞と定義される。当業者は、陰性イベントを定義するこの手順が「蛍光マイナスワン」または「FMO」染色として参照されることを理解するであろう。上記のFMO染色手順を用いてアイソタイプ対照抗体で観察される発現の95パーセンタイル超の発現を示す細胞は、本明細書において、「陽性」（すなわち、「+」）と定義される。様々な細胞集団が、広義的に「陽性」と定義される。例えば、低発現（すなわち、「低（low）」または「低（lo）」）を示す細胞は、通常、アイソタイプ対照抗体と共にFMO染色を用いて決定される95パーセンタイルを上回る、かつ上記のFMO染色手順を用いてアイソタイプ対照抗体で観察される発現の95パーセンタイルの1標準偏差内の発現が観察される細胞と定義される。ICM（例えば、PD-1、PD-L1等）に関する「低（low）」または「低（lo）」という用語は、1つまたは複数の他の別個の細胞または細胞集団（例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、NK T（NK）細胞、単球、マクロファージおよび樹状細胞（DC）；ならびに腫瘍細胞）よりも低いレベルでICMを発現する細胞または細胞集団（例えば、腫瘍微小環境のT細胞を含むTreg細胞）を表す。例えば、腫瘍微小環境において、CTLA4は、PD-1よりもTregにおいて有意に高いレベルで発現され、PD-1は、TregよりもエフェクターT細胞を含む免疫エフェクター細胞において有意に高いレベルで発現される（Jacobs et al., 2009. Neuro-Oncology 11(4): 394-402）。
「コラーゲン構造を有するマクロファージ受容体」（MARCO）（SCARA2およびSR-A6としても公知）は、マクロファージの特定のサブセットにおいて見出されるクラスAスカベンジャー受容体である。スカベンジャー受容体は、パターン認識受容体（PRR)であり、最も一般的には免疫細胞において見出される。それらを定義する特徴は、それらがポリアニオンおよび低密度リポタンパク質（LDL）と呼ばれる1つのタイプのコレステロールの修飾形態に結合する点である。MARCOは、これらのリガンドおよび病原体関連分子パターン（PAMP）に結合してこれらを貪食し、それによって病原体を除去し、炎症を引き起こす細胞内の下流効果をもたらす。自然免疫系の一部として、MARCOは、病原体を除去または掃除し、炎症応答を引き起こす。スカベンジャー受容体である、MARCOの細胞外側の末端のシステインリッチ（SRCR）ドメインが、リガンド結合およびその後の免疫応答を担っている。マクロファージにおけるMARCO発現はまた、アルツハイマー病が、リガンドがMARCOに結合したときの細胞内での減少した応答に関連することから、疾患にも関連する。「MARCO」という用語は、MARCOのフラグメントならびに対立遺伝子変種、スプライス変種、誘導体変種、置換変種、欠失変種および／または挿入変種、融合ポリペプチドならびに種間ホモログを含むがこれらに限定されない関連するポリペプチドを含む。特定の態様において、MARCOポリペプチドは、末端残基、例えば、非限定的に、リーダー配列残基、標的化残基、アミノ末端メチオニン残基、リジン残基、タグ残基および／または融合タンパク質残基を含む。好ましい態様において、本明細書で使用される「MARCO」は、ヒトMARCO（hMARCO）、hMARCOの変種、アオソフォームおよび種ホモログ、ならびにhMARCOとの少なくとも1つの共通エピトープを有するアナログを含む。完全なhMARCO配列は、UniProtアクセッション番号Q9UEW3の下で見出すことができる。
本明細書で使用される場合、「微小環境」という用語は、生物学的細胞、組織または器官の結合的、支持的な枠組みを表す。本明細書で使用される場合、「腫瘍微小環境」または「TME」という用語は、生存および／または拡張および／または拡散する悪性プロセスのための構造的およびまたは機能的環境を形成する腫瘍環境の任意かつすべての要素を表す。通常、「腫瘍微小環境」または「TME」という用語は、線維芽細胞、白血球および内皮細胞ならびに細胞外マトリクス（ECM）を直接取り囲む領域を含む腫瘍が存在する細胞環境を表す。したがって、腫瘍微小環境の細胞は、悪性細胞と共に、それらの成長および生存を支持する非悪性細胞を含む。間質細胞とも呼ばれる非悪性細胞は、悪性細胞と同じ細胞空間または悪性細胞に隣接もしくは近接する細胞空間を占有または当該細胞空間に蓄積し、腫瘍細胞の成長または生存を調整する。「間質細胞」という用語は、線維芽細胞、白血球および脈管細胞を含む。腫瘍微小環境の非悪性細胞は、線維芽細胞、上皮細胞、脈管細胞（血液およびリンパ管内皮細胞および周皮細胞を含む）、常在性のおよび／または動員された炎症および免疫（例えば、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球、リンパ球等）を含む。これらの細胞および特に活性化された線維芽細胞は、転移の発生に能動的に関与する。
「モノクローナル抗体」（Mab）という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を表す、すなわち、その集団を形成する個々の抗体は、微量で存在し得る、可能性のある自然発生する変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原性エピトープに対して、高度に特異的である。「モノクローナル」という形容詞は、実質的に均質な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示すものであり、何らかの特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきでない。例えば、本発明にしたがい使用されるモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature 256: 495 (1975)によって最初に記載され、上記の体細胞ハイブリダイゼーション法によって改良されたハイブリドーマ法によって作製され得、または他の組み換えDNA法（例えば、米国特許第4,816,567号に記載されるもの）によって作製され得る。
「多特異性抗原結合分子」という用語は、その広義の意味で使用され、具体的に、少なくとも2つ（例えば、2つ、3つ、4つ等）の異なるエピトープに対する特異性を有する（すなわち、1つの抗原上の2つもしくはそれ以上の異なるエピトープに特異的に結合することができるまたは2つもしくはそれ以上の抗原上のエピトープに特異的に結合することができる）抗原結合分子を網羅する。
本明細書で使用される「骨髄細胞」という用語は、骨髄系統の細胞またはそれ由来の細胞を表す。骨髄系統は、顆粒球（好中球、好酸球および好塩基球）、単球、マクロファージ、赤血球、巨核球および肥満細胞の異なるサブセットを含む、多くの形態学的、表現型的および機能的に異なる細胞型を含む。特定の態様において、骨髄細胞は、骨髄系統の細胞株由来の細胞である。
本明細書で使用される場合、「ミオパチー」という用語は、筋繊維が適切に機能せず、典型的に筋衰弱をもたらす筋肉の疾患を表す。ミオパチーは、本来的に神経筋性および筋骨格性である筋肉疾患を含む。いくつかの態様において、ミオパチーは、遺伝性ミオパチーである。遺伝性ミオパチーは、非限定的に、ジストロフィー、筋緊張、先天性ミオパチー（例えば、ネマリンミオパチー、マルチ／ミニコアミオパチー、および中心核ミオパチー）、ミトコンドリアミオパチー、家族性周期性ミオパチー、炎症性ミオパチー、ならびに代謝性ミオパチー（例えば、糖原病および脂質蓄積症）を含む。いくつかの態様において、ミオパチーは、獲得性ミオパチーである。獲得性ミオパチーは、非限定的に、外来物質誘導ミオパチー（例えば、薬物誘導ミオパチーおよびグルココルチコイドミオパチー、アルコール性ミオパチー、ならびに他の毒性物質に起因するミオパチー）、筋炎（例えば、皮膚筋炎、多発性筋炎および封入体筋炎）、化骨筋炎、横紋筋融解症、およびミオグロビン尿症、ならびに非活動性萎縮を含む。いくつかの態様において、ミオパチーは、非活動性萎縮であり、これは骨折（例えば、尻の骨折）によりまたは神経損傷（例えば、脊髄損傷（SCI））により引き起こされ得る。いくつかの態様において、ミオパチーは、疾患または障害、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、脊髄性筋萎縮症（SMA）、腎不全、AIDS、心臓状態および／または癌に起因する悪液質症候群に関連する。いくつかの態様において、ミオパチーは、加齢に関連する。
本明細書で使用される「機能的に接続」または「機能的に連結」という用語は、そのように表現される要素がそれらの意図された様式で機能できる関係にある並置状態を表す。例えば、関心対象のヌクレオチド配列（例えば、コードおよび／または非コード配列）に「機能的に連結」された調節配列（例えば、プロモーター）は、制御配列と適合する条件下でのその配列の発現を可能にする関心対象のヌクレオチド配列に対する制御配列の位置取りおよび／または方向づけを表す。制御配列は、それらがその発現を誘導するよう機能する限り、関心対象のヌクレオチド配列と連続的である必要はない。したがって、例えば、介在する非コード配列（例えば、翻訳されず、転写もされない配列）が、プロモーターとコード配列の間に存在し得、プロモーター配列はそれでもコード配列に「機能的に連結」されているみなされ得る。同様に、第1の抗原結合フラグメントを第2の抗原結合フラグメントに「機能的に接続」することは、その同族エピトープへの各抗原結合フラグメントの結合を可能にする抗原結合フラグメントの位置取りおよび／または方向づけを包含する。
「骨減少障害」という用語は、石灰化および／または骨密度が減少した状態を表し、その状態が認められるすべての骨格系を表すために使用される。代表的な骨減少障害は、骨粗鬆症、骨減少症、ページェット病、溶解性骨転移、歯周炎、関節リウマチ、および運動不能に起因する骨喪失を含む。これらの骨障害に加えて、特定の癌、例えば、乳癌、前立腺癌および多発性骨髄腫が、破骨細胞の活性を増大させ、骨吸収を誘導することが公知である。これらの癌は、現在、骨においてRANKLの過剰発現をもたらす因子を産生し、破骨細胞数および活性の増大を引き起こすことが公知である。
「薬学的に許容される担体」は、生物学的にまたはその他の面で望ましくないものではない物質から構成される薬学的ビヒクルを意味する、すなわち、その物質は、任意のまたは実質的な有害反応を引き起こすことなく、選択された活性剤と共に対象に投与され得る。担体は、賦形剤および他の添加物、例えば、希釈剤、界面活性剤、着色剤、湿潤または乳化剤、pH緩衝剤、保存剤等を含み得る。
「プログラム死-1（PD-1）」（CD279、PD1、SLEB2、hPD-1、hPD-IおよびhSLE1としても公知）は、CD28ファミリーに属する免疫抑制性受容体を表す。PD-1は、インビボで、主としてすでに活性化されているT細胞において発現され、2つのリガンドPD-L1およびPD-L2に結合する。「PD-1」という用語は、PD-1のフラグメントならびに対立遺伝子変種、スプライス変種、誘導体変種、置換変種、欠失変種および／または挿入変種、融合ポリペプチドならびに種間ホモログを含むがこれらに限定されない関連するポリペプチドを含む。特定の態様において、PD-1ポリペプチドは、末端残基、例えば、非限定的に、リーダー配列残基、標的化残基、アミノ末端メチオニン残基、リジン残基、タグ残基および／または融合タンパク質残基を含む。好ましい態様において、「PD-1」は、ヒトPD-1（hPD-1）、hPD-1の変種、アオソフォームおよび種ホモログ、ならびにhPD-1との少なくとも1つの共通エピトープを有するアナログを含む。完全なhPD-1配列は、GenBankアクセッション番号U64863の下で見出すことができる。
「プログラム死リガンド-1（PD-L1）」（CD274、B7-H、B7H1、PDCD1L1、PDCD1LG1、PDL1およびCD274分子としても公知）は、PD-1に結合してT細胞の活性化およびサイトカインの分泌を下方調節するPD-1に対する2つの細胞表面糖タンパク質リガンドの1つである（もう一方はPD-L2である）。「PD-L1」という用語は、PD-L1のフラグメントならびに対立遺伝子変種、スプライス変種、誘導体変種、置換変種、欠失変種および／または挿入変種、融合ポリペプチドならびに種間ホモログを含むがこれらに限定されない関連するポリペプチドを含む。特定の態様において、PD-1ポリペプチドは、末端残基、例えば、非限定的に、リーダー配列残基、標的化残基、アミノ末端メチオニン残基、リジン残基、タグ残基および／または融合タンパク質残基を含む。好ましい態様において、本明細書で使用される「PD-L1」は、ヒトPD-L1（hPD-L1）、hPD-L1の変種、アオソフォームおよび種ホモログ、ならびにhPD-L1との少なくとも1つの共通エピトープを有するアナログを含む。完全なhPD-L1配列は、GenBankアクセッション番号Q9NZQ7の下で見出すことができる。
「ポリペプチド」、「タンパク質分子」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書で言い換え可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーならびにその変種および合成アナログを表す。したがって、これらの用語は、1つまたは複数のアミノ酸残基が合成性非天然アミノ酸、例えば、対応する天然アミノ酸の化学的アナログであるアミノ酸ポリマーにも、天然アミノ酸ポリマーにも適用される。これらの用語は、修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等を排除しない。対象のタンパク質分子の可溶性形態が特に有用である。この定義に含まれるのは、例えば、例えば置換された連結と共に非自然的なアミノ酸またはポリペプチドを含む1つまたは複数のアミノ酸のアナログを含むポリペプチドである。
「NF-κB受容体活性化因子リガンド（RANKL）」（腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー11（TNFSF11）、TNF関連活性化誘導サイトカイン（TRANCE）、オステオプロテゲリンリガンド（OPGL）および破骨細胞分化因子（ODF）としても公知）は、特に、NF-κB受容体活性化因子（RANK）への結合を通じて破骨細胞の形成を促進するポリペプチドを表す。「RANKL」という用語は、RANKLのフラグメントならびに対立遺伝子変種、スプライス変種、誘導体変種、置換変種、欠失変種および／または挿入変種、融合ポリペプチドならびに種間ホモログを含むがこれらに限定されない関連するポリペプチドを含む。特定の態様において、RANKLポリペプチドは、末端残基、例えば、非限定的に、リーダー配列残基、標的化残基、アミノ末端メチオニン残基、リジン残基、タグ残基および／または融合タンパク質残基を含む。RANKLという用語は、ヒトRANKL（hRANKL）、hRANKLの変種、アオソフォームおよび種ホモログ、ならびにhRANKLとの少なくとも1つの共通エピトープを有するアナログを含む。完全なhRANKL配列は、UniProtアクセッション番号O14788の下で見出すことができる。
「NF-κB受容体活性化因子（RANK）」（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー11a、NF-κB活性化因子、CD265、FEO、LOH18CR1、ODFR、OFE、OPTB7、OSTS、PDB2、およびTRANCERとしても公知）は、RANKリガンド（RANKL）の受容体ならびに破骨細胞の分化および活性化を調節するRANK/RANKL/オステオプロテゲリン（OPG）シグナル伝達経路の一部であるポリペプチドを表す。それは、骨の再モデリングおよび修復、免疫細胞の機能、リンパ節の発展、熱調節、ならびに乳腺の発展にも関連する。「RANK」という用語は、RANKのフラグメントならびに対立遺伝子変種、スプライス変種、誘導体変種、置換変種、欠失変種および／または挿入変種、融合ポリペプチドならびに種間ホモログを含むがこれらに限定されない関連するポリペプチドを含む。特定の態様において、RANKポリペプチドは、末端残基、例えば、非限定的に、リーダー配列残基、標的化残基、アミノ末端メチオニン残基、リジン残基、タグ残基および／または融合タンパク質残基を含む。RANKという用語は、ヒトRANK（hRANK）、hRANKの変種、アオソフォームおよび種ホモログ、ならびにhRANKとの少なくとも1つの共通エピトープを有するアナログを含む。完全なhRANK配列は、UniProtアクセッション番号Q9Y6Q6の下で見出すことができる。
本明細書で使用される場合、「組み換え」抗原結合分子は、その非限定的な例がタンデムscFv（taFvもしくはscFv2）、ダイアボディ、dAb2/VHH2、ノブ・イントゥ・ホール誘導体、SEED-IgG、ヘテロFc-scFv、Fab-scFv、scFv-Jun/Fos、Fab'-Jun/Fos、トリボディ、DNL-F(ab)3、scFv3-CH1/CL、Fab-scFv2、IgG-scFab、IgG-scFv、scFv-IgG、scFv2-Fc、F(ab')2-scFv2、scDB-Fc、scDb-CH3、Db-Fc、scFv2-H/L、DVD-Ig、tandAb、scFv-dhlx-scFv、dAb2-IgG、dAb-IgG、dAb-Fc-dAb、クロスMab、MAb2、FIT-Ig、およびそれらの組み合わせを含む、その産生が生物内での所望の抗体構造をコードする非ネイティブDNA配列の発現を伴う任意の抗原結合分子を意味する。
本明細書で使用される場合、「制御性T細胞」または「Treg」という用語は、エフェクターT細胞を含む他のT細胞および自然免疫系細胞の活性化を負に調節するT細胞を表す。Treg細胞は、エフェクターT細胞応答の持続的抑制により特徴づけられる。いくつかの局面において、Tregは、CD4+CD25+Foxp3+ T細胞である。
「対象」、「患者」、「宿主」または「個体」という用語は、本明細書で言い換え可能に使用され、治療または予防が望まれる任意の対象、具体的には脊椎動物対象、さらにより具体的には哺乳類対象を表す。本発明の範囲に包含される適切な脊椎動物は、霊長類（例えば、ヒト、サルおよび類人猿、ならびに猿の種、例えば、マカク（例えば、カニクイザル、例えば、マカカ・ファシクラリス（Macaca fascicularis）および/またはアカゲザル（マカカ・ムラッタ（Macaca mulatta））およびヒヒ（パピオ・ウルシヌス（Papio ursinus）、ならびにマーモセット（カリスリクス（Callithrix）属の種）、リスザル（サイミリ（Saimiri）属の種）、およびタマリン（サギヌス（Saguinus）属の種）、ならびに類人猿の種、例えば、チンパンジー（パン・トログロディテス（Pan troglodytes）を含む）、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、モルモット）、ウサギ類（例えば、ウサギ、ノウサギ）、ウシ類（例えば、ウシ）、ヒツジ類（例えば、ヒツジ）、ヤギ類（例えば、ヤギ）、ブタ類（例えば、ブタ）、ウマ類（例えば、ウマ）、イヌ類（例えば、イヌ）、ネコ類（例えば、ネコ）、鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、カモ、ペットの鳥類、例えば、カナリア、セキセイインコ等）、海洋哺乳類（例えば、イルカ、クジラ）、爬虫類（ヘビ、カエル、トカゲ等）、ならびに魚類を含む脊索動物亜門の任意のメンバーを含むがこれらに限定されない。好ましい対象は、癌に対する免疫応答を誘発する必要のあるヒトである。しかし、上記の用語は症状が存在することを暗示するものではないことが理解されるであろう。
本発明の薬剤（例えば、RANKアンタゴニスト抗原結合分子、抗ICM抗原結合分子、抗AMA抗原結合分子等）を参照して言う「治療組み合わせ」、「組み合わせ」等の用語は、薬剤が物理的に接続（例えば、単一ポリペプチド内で共有結合により接続または複合体内で非共有結合的に接続）されているまたは単一の組成物中の別個の成分として存在するもしくはレジメンの一部として同時に、一緒にもしくは別々に、もしくは異なる時点で別々に投与される異なる組成物中に存在する組み合わせを含む任意の組み合わせを含む。典型的に、本発明の治療組み合わせ中の各々のそのような薬剤は、薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物中に存在する。本発明の治療組み合わせ中の薬剤は、各薬剤の有益な効果が所望の時点で対象により実現されるような投薬形態で提供される。
「処置」、「処置する」、「処置される」等は、対象に対する防御免疫を与えることを含む、（1）標的抗原の存在もしくは異常な発現に関連する疾患もしくは状態、または（2）当該疾患もしくは状態の症状、または（3）当該疾患もしくは状態の素因を予防すること、軽減すること、変化させること、好転させること、影響を及ぼすこと、その発症もしくは進行を阻害すること、改善すること、または治癒することを含むがこれらに限定されない、予防的処置および治療的処置の両方を含むことが意味される。
本明細書で使用される場合、「三重特異性抗体」という用語は、少なくとも、第1のエピトープに対する特異性を有する第1の抗原結合ドメイン、第2のエピトープに対する特異性を有する第2の抗原結合ドメイン、および第3のエピトープに対する特異性を有する第3の抗原結合ドメイン、例えば、RANKならびにCTLA4、PD-1およびPD-L1のうちの任意の2つに対するもの、を含む抗体を表す。第1、第2、および第3のエピトープは、同一でない（すなわち、異なる標的（例えば、タンパク質）である）が、単一の細胞または少なくとも2つの細胞にすべてが存在し（例えば、共発現され）得る。
「腫瘍」という用語は、本明細書で使用される場合、悪性であるか良性であるかによらず、任意の新生物細胞成長および増殖、ならびにすべての前癌性および癌性細胞および組織を表す。「癌」および「癌性」という用語は、典型的に調節されない細胞成長によって一部特徴づけられる哺乳類における生理学的状態を表すまたは表現する。本明細書で使用される場合、「癌」という用語は、初期段階および後期段階の癌を含む、非転移および転移の癌を表す。「前癌性」という用語は、典型的に癌の前段階であるまたは癌に発展する状態または成長を表す。「非転移」は、良性であるまたは原発部位にとどまっており、リンパ管もしくは血管系または原発部位以外の組織に浸潤していない癌を意味する。通常、非転移癌は、ステージ0、IまたはII癌であり、まれにステージIII癌である任意の癌である。「初期段階癌」は、浸潤性もしくは転移性でないまたはステージ0、IもしくはII癌に分類される癌を意味する。「後期段階癌」は、通常、ステージIIIまたはステージIV癌を表すが、ステージII癌またはステージIIのサブステージの癌も表し得る。当業者は、初期段階癌または後期段階癌のいずれかとしてのステージII癌の分類が、癌の個々のタイプに依存することを理解するであろう。癌の具体例は、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、肝細胞癌、胃癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌種、メラノーマ、脳癌、非小細胞肺癌、頭頚部の扁平上皮細胞、子宮内膜癌、多発性骨髄腫、直腸癌、および食道癌を含むがこれらに限定されない。例示的な態様において、癌は、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌および骨癌から選択される。
「ベクター」は、核酸配列が挿入され得るまたはクローン化され得る、例えば、プラスミド、バクテリオファージまたは植物ウイルス由来の、核酸分子、好ましくはDNA分子を意味する。ベクターは、好ましくは、1つまたは複数の特有の制限部位を含み、標的細胞もしくは組織またはその子孫細胞もしくは組織を含む定義された宿主細胞において自律複製を行うことができるものであり得る、またはクローン化された配列が複製可能なように定義された宿主のゲノムに組み込まれ得るものであり得る。したがって、ベクターは、自律複製ベクター、すなわち、その複製が染色体の複製に非依存的である染色体外物質として存在するベクター、例えば、直鎖状もしくは閉鎖型環状プラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、または人工染色体であり得る。ベクターは、自己複製を保証する任意の手段を含み得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されたときに、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製されるものであり得る。ベクターシステムは、単一のベクターもしくはプラスミド、共に宿主細胞のゲノムに導入される総DNAを含む2つもしくはそれ以上のベクターもしくはプラスミド、またはトランスポゾンを含み得る。ベクターの選択は、典型的に、ベクターと、そのベクターが導入される宿主細胞との適合性に依存する。ベクターはまた、選択マーカー、例えば、適当な形質転換体の選択に使用され得る抗生物質耐性遺伝子を含み得る。そのような耐性遺伝子の例は、当業者に周知である。
本明細書に記載される各態様は、そうでないことが個別に言及されていない限り、必要な変更を加えて、各々かつすべての態様に適用され得る。
2．略語
本願を通じて以下の略語が使用される。
Figure 2022514215000001
3. RANKアンタゴニスト抗原結合分子
本発明は、RANKに結合し、そしてRANKL/RANKシグナル伝達経路をアンタゴナイズすることを含む、RANK機能をアンタゴナイズする抗原結合分子を開示する。これらのアンタゴニスト抗原結合分子は、骨減少障害、ミオパチーおよび癌の処置または予防を含む応用範囲で、単独で、または他の薬剤と組み合わせて使用され得る。
特定の態様において、本明細書に開示される抗原結合分子は：
（1）GFTFSSYAMH［SEQ ID NO:3］のVHCDR1アミノ酸配列、VVSYDGSTKS［SEQ ID NO:4］のVHCDR2アミノ酸配列、および
Figure 2022514215000002
のVHCDR3アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）、ならびにSGDKLGDKYVC［SEQ ID NO:6］のVLCDR1アミノ酸配列、GDSERPS［SEQ ID NO:7］のVLCDR2アミノ酸配列、およびQAWDSTTPL［SEQ ID NO:8］のVLCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）；
（2）アミノ酸配列
Figure 2022514215000003
を含むVH、およびアミノ酸配列
Figure 2022514215000004
を含むVL；
（3）SEQ ID NO:1のアミノ酸配列に対して少なくとも90％（少なくとも91％～99％およびその間のすべての整数値の百分率を含む）の配列同一性を有するVH、およびSEQ ID NO:2のアミノ酸配列に対して少なくとも90％（少なくとも91％～99％およびその間のすべての整数値の百分率を含む）の配列同一性を有するVL；
（4）SEQ ID NO:1のアミノ酸配列内の各CDR以外のフレームワーク領域のアミノ酸配列に対して少なくとも90％（少なくとも91％～99％およびその間のすべての整数値の百分率を含む）の配列同一性を有するVH、ならびにSEQ ID NO:2のアミノ酸配列内の各CDR以外のフレームワーク領域のアミノ酸配列に対して少なくとも90％（少なくとも91％～99％およびその間のすべての整数値の百分率を含む）の配列同一性を有するVL；または
（5）SEQ ID NO:1のアミノ酸配列内の各CDR以外のフレームワーク領域の配列内に1つもしくは複数（例えば、1、2、3、4もしくは5）個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を含むアミノ酸配列を含むVH、およびSEQ ID NO:2のアミノ酸配列内の各CDR以外のフレームワーク領域の配列内に1つもしくは複数（例えば、1、2、3、4もしくは5）個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を含むアミノ酸配列を含むVL、
を含む。
RANKがメンバーである、TNFRスーパーファミリー（TNFRSF）メンバーは、一般に、TNFRSFをオリゴマー化し活性化にいたらせるそれらの各々のリガンドに結合することによって活性化される。リガンドと受容体の間のこの構造的な相互作用は、抗体の二価という性質がそれらの意図された標的を二量体化し、アンタゴナイズではなくアゴナイズし得るため、治療抗体としては挑戦的である。実際、RANKが一メンバーである、TNFRスーパーファミリー（TNFRSF）のオリゴマー化は、アゴニスト活性をもたらし得（Wajant, H., 2015, Cell Death Differ. 22(11):1727-174）、これは、アゴニスト性活性化をもたらすRANKの抗体媒介オリゴマー化の例を含む（Chypre, 2016, 前記）。したがって、いくつかの態様において、抗原結合分子は、一価であり、RANKを架橋または多量体化することができない。一価抗原結合分子は、1つのみの抗原分子に結合する能力を有し、したがって受容体架橋および活性化の危険を回避するまたは減少させる。この用語が本明細書で使用される場合、一価抗原結合分子はまた、2つ以上の抗原結合部位、例えば、2つの抗原結合部位を含み得るが、その結合部位は、抗原結合分子が一度に1つのRANK分子にのみ結合することができるよう異なる抗原に対するものでなければならない。一価抗原結合分子の抗原結合ドメインは、VHおよびVLドメインを含み得るが、いくつかの態様において、単一の免疫グロブリン可変ドメインのみ、すなわち、対応するVLまたはVHドメインを必要とせずにRANKLに結合する能力を有する、それぞれ、VHまたはVLドメインを含み得る。
非限定的な一価抗原結合分子は、VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなるFabフラグメント；VL、VH、CLおよびCH1ドメインならびにCH2ドメインの一部からなるFab’フラグメント；VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント；抗体の単一のアームのVLおよびVHドメインからなるFvフラグメント；単鎖抗体分子（例えば、scFabおよびscFv）；VHドメインからなる単一ドメイン抗体（dAb）フラグメント（Ward et al., 1989 Nature 341:544-546）；ならびに、例えばUS20080063641（Genentech）に記載される、1アーム抗体、または、例えばWO2007048037（Amgen）に記載される、他の一価抗体を含む。
特定の態様において、アンタゴニスト抗原結合分子は、Fvフラグメントを含む。Fvフラグメントは、抗原結合活性の機能を有する免疫グロブリン分子の最小単位である。scFv（単鎖可変フラグメント）形式の抗原結合分子は、scFvの特性を改善する、例えば親和性を増加および特異性を変化させるタンパク質改変を可能にする、発現宿主、例えば、大腸菌（E.coli）および哺乳類細胞において容易に機能性の形態で発現させることができるフレキシブルペプチドリンカーによって一つに接続されている重（VH）および軽（VL）鎖の可変領域からなる（Ahmed et al., 2012. Clin Dev Immunol. 2012:980250）。scFv構成において、ドメインの順番は、VH-リンカー-VLまたはVL-リンカー-VHのいずれかであり得、両方の配向が適用され得る。
scFvにおいて使用されるほとんどのリンカー配列は、ペンタペプチドGGGGS（またはG4SもしくはGly4Ser）の多量体である。これらは、15マー（G4S）3（Huston et al., 1988. Proc Natl Acad Sci U S A. 85(16), 5879-83）、18マー
Figure 2022514215000005
（Andris-Widhopf et al., "Generation of human scFv antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences." Cold Spring Harbor Protocols, 2011(9)）および20マー（G4S）4（Schaefer et al., "Construction of scFv Fragments from Hybridoma or Spleen Cells by PCR Assembly." In: Antibody Engineering, R. Kontermann and S. Dubel, Springer Verlag, Heidelberg, Germany (2010) pp. 21-44）を含む。多くの場合、特定の抗体配列との関係で、追加機能、例えば、エピトープタグを有する配列またはCre-Lox組み換え部位を含むコード配列またはscFv特性を改善する配列を含む、多くの他の配列が提案されている。
scFvのクローン化は、通常、記載されるように（Schaefer et al., 2010, 前記）、2工程オーバーラップPCR（オーバーラップ伸長によるスプライシングまたはSOE-PCRとしても公知）により行われる。最初にVHおよびVLドメインが増幅およびゲル精製され、次にアセンブリPCRの1つの工程で組み立てられる。リンカーは、2つの内部プライマーのオーバーラップによってまたはその配列がリンカー全体またはそれ以上を網羅するリンカープライマーを追加することによってのいずれかにより生成される（3フラグメントアセンブリPCR）。
いくつかの態様において、RANKアンタゴニストscFv分子は、表1に示されるように、本明細書に記載される抗RANKファージミドクローン3A3のVHおよびVL配列由来のCDR配列を含む。
Figure 2022514215000006
このタイプの代表例において、RANKアンタゴニスト抗原結合分子は、配列
Figure 2022514215000007
を含み、ここで、
・非修飾大文字は抗RANK MAb 3A3の可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
・
Figure 2022514215000008
はフレキシブルリンカーであり、
・小文字は抗RANK MAb 3A3の可変軽鎖アミノ酸配列に対応する。
scFvは、例えば、適切な翻訳、転写開始部位、および哺乳類発現の場合はシグナルペプチド配列を有する適切な発現ベクターの下でのscFvのタンパク質コード配列のクローン化により、大腸菌または哺乳類宿主において組み換え産生される。
他の態様において、RANKアンタゴニスト抗原結合分子は、単一の抗原結合フラグメント（Fab）およびFc領域からなり、またはから本質的になり、Fc領域は第1および第2のFcポリペプチドを含み、第1および第2のFcポリペプチドは複合体として存在する。この戦略は、例えば、Merchant et al. (2013. Proc Natl Acad Sci U S A. 110(32):E2987-96に記載されるように、抗c-MET抗体に首尾よく適用され、c-METに対する一価結合を示し、c-METアゴニズムを回避した。
Fc含有一価抗原結合分子の組み換え発現は、しばしば、望まれない二価ホモ二量体混入物質を生じ得る。ポリペプチド鎖間の好ましくない相互作用を支持し、求められないFcホモ二量体形成を抑制する変化した構造を形成するよう免疫グロブリン定常領域に変異を導入する方法を含む、ホモ二量体の形成を阻害する戦略が知られている。ヘテロ二量体化を促進するこの戦略の非限定的な例は、2つのポリペプチドへのノブ・イントゥ・ホール（KIH）構造の導入およびCLおよびCH1ドメインの自然発生的なヘテロ二量体化の利用を含む（Kontermann, 前記, pp. 1-28 (2011) Ridgway et al., 1996. Protein Eng. 9(7):617-21; Atwell et al., 1997. J Mol Biol. 270(1):26-35; WO 2005/063816の記載を参照のこと）。これらのKIH変異は、ノブ含有Fcおよびホール含有重鎖のヘテロ二量体化を促進して、一価抗体の構築を促進し、望まれない二価抗体のレベルを低下させる。
上記のアンタゴニスト性抗RANKヒト抗体のFcドメインにおける修飾は、Fc受容体結合を減少させ、したがってRANKのアゴニスト性架橋の可能性を減少させ得る。RANKに対して高い相同性を有する別のTNFRスーパーファミリー（TNFRSF）メンバーであるCD40タンパク質に対する異なる抗体は、異なる機能的アンタゴニスト性 対 アゴニスト性を有し、このことは、TNFRSのアゴニズムが、Fcを通じた架橋によって抗TNFR抗体により付与され得ることを示している。例えば、CD40上のTNFR CRDエピトープがまさに、アイソタイプと共に、抗CD40 mAb活性に、CRD1結合性mAbがIgG2としてまたはFcgRIIB架橋下でアゴニスト性であるよう指図していることが示された（Yu et al., 2018, Cancer Cell 33:664-675）。ヒトIgG（IgG1を含む）におけるいわゆる「LALA」二重変異（Leu234AlaおよびLeu235Ala）は、Fc受容体結合およびエフェクター機能を大きく損なわせるであろう（Lund et al., 1991, J. Immunol. 147, 2657-2662; Lund et al., 1992, Mol. Immunol. 29:53-59）。ヒトIgG4の場合、S228P/L235E変異変種（SPLE）の形成が最小のFcγR結合をもたらすことが以前に示されている（Newman et al., 2001, Clin. Immunol. 98, 164-174）。IgG1またはIgG4 Fcドメインにおける変異は組み合わされ得る、例えば、ヒトIgG1におけるLALA変異とP329Gにおける変異の組み合わせまたはヒトIgG4におけるSPLE変異とP329Gにおける変異の組み合わせは、FcγRおよびC1q相互作用を完全に消失させ得る（Schlothauer et al., 2016, Protein Eng Des. Sel. 29, 457-466）。
いくつかの態様において、RANKアンタゴニストは、抗RANK抗原結合分子（例えば、MAbまたはその抗原結合フラグメント）であり、この抗体の任意の望まれない架橋または免疫エフェクター機能、例えば、抗体依存細胞媒介細胞傷害性（ADCC）、食作用（ADCP）および補体依存細胞傷害性（CDC）を消失させるよう、この抗体のIgG1 Fc鎖の各々がP329G、L235A、L234A（P329G LALA）変異を有するまたはIgG4 Fc鎖の各々がP329G、S228P、L235E変異を有する。
したがって、いくつかの態様において、本発明は、軽鎖、重鎖および短縮Fcドメインの共発現により産生される一価RANKアンタゴニスト抗原結合分子を想定している。適切に、重鎖は、ホール変異およびP329G LALA変異を有し、短縮Fcドメインはノブ変異およびP329G LALA変異を有する。いくつかの態様において、抗RANK抗体は、（a）SEQ ID NO:1のアミノ酸配列（3A3 VH配列）、CH1配列および第1のFcポリペプチドを含む第1のポリペプチド、ならびに（b）SEQ ID NO:2のアミノ酸配列（3A3 VL配列）およびCL1配列を含む第2のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、抗RANK抗体はさらに、（c）第2のFcポリペプチドを含む第3のポリペプチドを含む。
抗RANKアームを含むRANKアンタゴニスト抗原結合分子のアゴニスト活性についてのインビトロスクリーンは、記載されるように、RANK-Fas JurkatアッセイにおいてRANKアンタゴニスト抗原結合分子の二価または一価抗体形態を用いて行われ得る（Schneider et al., 2014, 前記；Chypre et al., 2016, 前記）。
一価RANKアンタゴニスト抗原結合分子を構築する1つの態様において、3つの構築物が作製される。第1に、3A3の重鎖（VH）ドメインが、そのNH2末端で、ヒトIgG1分子（例えば、アテゾリズマブ）の短縮重鎖（CH1-CH2-CH3）とタンデムに直接融合され、ここで重鎖CH3ドメインは、重鎖のKiHヘテロ二量体化を促進するよう「ホール」と呼ばれる407位で変更される（Y407A）。第2の構築物は、ヒトIgG1分子（例えば、アテゾリズマブ）のCLとタンデムに直接融合された3A3のVLであり、第3の構築物は、ヒトIgG1分子（例えば、アテゾリズマブ）の短縮重鎖（CH2-CH3）であり、ここで重鎖CH3ドメインの1つが、重鎖のKiHヘテロ二量体化を促進するよう「ノブ」と呼ばれる366位で変更される（T366W）。両方の重鎖構築物は、減少したFcγRおよびC1q相互作用のためにL234A、L235A、P329G置換を含む。
非限定的な例において、
第1の構築物は、重鎖CH3ドメインが重鎖のKiHヘテロ二量体化を促進するよう「ホール」と呼ばれる407位で変更された（Y407A）、アテゾリズマブの短縮重鎖（CH1-CH2-CH3）とタンデムに直接融合された3A3の重鎖（VH）ドメインからなり、以下のアミノ酸配列：
Figure 2022514215000009
を有し、ここで、
・抗RANK抗体（3A3）VH配列の成熟アミノ酸配列は、大文字で示され、
・アテゾリズマブの定常領域（CH1-CH2-CH3）は、小文字で示され、
・減少したFcγRおよびC1q相互作用のためのL234A、L235A、P329G置換およびY407A「ホール」置換は、太字の大文字で示されている。
第2の構築物は、アテゾリズマブのCLとタンデムに直接融合された3A3のVLであり、以下のアミノ酸配列：
Figure 2022514215000010
を有し、ここで、
・抗RANK抗体（3A3）VL配列の成熟アミノ酸配列は、大文字で示され、
・アテゾリズマブ軽鎖の定常領域（CL）は、小文字で示されている。
第3の構築物は、重鎖CH3ドメインが重鎖のKiHヘテロ二量体化を促進するよう「ノブ」と呼ばれる366位で変更された（T366W）、アテゾリズマブの短縮重鎖（CH2-CH3）であり、以下のアミノ酸配列：
Figure 2022514215000011
を有し、ここで、
・アテゾリズマブの定常領域（CH2-CH3）の成熟アミノ酸配列は、大文字で示され、
・減少したFcγRおよびC1q相互作用のためのL234A、L235A、P329G置換およびT366W「ノブ」置換は、太字の大文字で示されている。
RANKに結合しアンタゴナイズするこの一価分子の発現は、例えば、適切な翻訳、転写開始部位、および哺乳類発現の場合はシグナルペプチド配列を有する適切な発現ベクターの下での構築物のタンパク質コード配列のクローン化により、大腸菌または哺乳類宿主において達成され得る。そのような構築物の発現および精製は記載されている（Merchant et al., 2013,前記）。
一価結合相互作用の架橋を回避する別の戦略は、Fc/scFv-Fc体の下でのFc変種の生成を含む。一価抗原結合性を有するヘテロ二量体性のFcベースの一特異性抗体（mAb）は、1つのみのFc鎖のN末端へのscFvの融合（Fc/scFv-Fc）により生成される（Moore et al., 2011. MAbs. 3(6): 546-557; Ha et al., 2016. Front Immunol. 7: 394）。ヘテロ二量体、一価Fc/scFv-Fc体を生成するために、2つの異なる免疫グロブリンポリペプチド：（i）Fc（ヒンジ-CH2-CH3''）および（ii）scFv-Fc（VH-リンカー-VL-ヒンジ-CH2-CH3'）をコードするDNA構築物が設計される。ここで、2つの異なるCH3ドメインであるCH3'およびCH3''は、所望のヘテロ二量体の一方の鎖に大きなアミノ酸（ノブ）をおよび所望のヘテロ二量体の他の鎖に小さなアミノ酸（ホール）を導入することによりポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を促進する「ノブ・イントゥ・ホール」構造を生成する非対称な変化を表す。両方の構築物は、減少したFcγRおよびC1q相互作用のために、L234A、L235A、P329G置換を含む。
一価ヘテロ二量体Fc/scFv-Fc 抗RANKアンタゴニストを生成する1つの態様において、2つの異なる免疫グロブリンポリペプチドをコードする2つの構築物が設計される。
ヒトIgG1（例えば、アテゾリズマブ）の短縮重鎖（ヒンジ-CH2-CH3）からなり、重鎖CH3ドメインが重鎖のKiHヘテロ二量体化を促進するよう「ホール」と呼ばれる407位で変更され（Y407A）、L234A、L235A、P329G置換を含む、第1の構築物は、以下のアミノ酸配列：
Figure 2022514215000012
を有し、ここで、
・アテゾリズマブのCH2-CH3配列は小文字で示され、
・アテゾリズマブのヒンジ領域AA配列は下線付きの大文字で示され、
・減少したFcγRおよびC1q相互作用のためのL234A、L235A、P329G置換およびY407A「ホール」置換は太字の大文字で示されている。
ヒトIgG1（例えば、アテゾリズマブ）の短縮重鎖（ヒンジ-CH2-CH3'）配列にタンデムに直接融合された抗RANK 3A3のVHおよびVL配列由来のscFv部分（VH-リンカー-VL）からなり、重鎖CH3ドメインが重鎖のKiHヘテロ二量体化を促進するよう「ノブ」と呼ばれる366位で変更され（T366W）、L234A、L235A、P329G置換を含む、第2の構築物は、以下のアミノ酸配列：
Figure 2022514215000013
を有し、ここで、
・非修飾大文字は抗RANK MAb 3A3の可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
・
Figure 2022514215000014
はフレキシブルリンカーであり、
・小文字は抗RANK MAb 3A3の可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
・アテゾリズマブのヒンジおよび定常領域（CH2-CH3）のアミノ酸配列は下線付きの大文字で示され、
・減少したFcγRおよびC1q相互作用のためのL234A、L235A、P329G置換およびT366W「ノブ」置換は太字の大文字で示されている。
一価ヘテロ二量体Fc/scFv-Fc抗RANKアンタゴニストの発現および精製は、記載されるように（Moore et al., 2011., MAbs 3, 546-557）、適切なシグナルペプチドコード配列を含む適切な哺乳類発現ベクターに上記構築物をコードするcDNAをサブクローン化し、哺乳類細胞、例えば、HEK-293細胞において産生することによって達成され得る。
4. 治療組み合わせ
本発明者らは、2018年6月5日に出願された同時係属中の国際出願番号PCT/AU2018/050557において、RANKL/RANKおよび免疫チェックポイント分子（ICM）の共アンタゴナイズが癌に対する免疫応答の相乗作用的強化をもたらすことを開示した。したがって、本明細書に開示されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子および抗ICM抗原結合分子は、対象において癌に対する免疫応答を刺激または増進するための組成物において使用されることが想定される。組成物は、通常、（1）本明細書に開示されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子、および（2）少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子を含む。組成物は、腫瘍または癌の部位へのCD8+ T細胞の局在化を増大させるRANKL/RANKとICM経路の間の新たに同定された相乗作用を利用する。この相乗作用的組成物は、エフェクター細胞機能の強化を適切に刺激する点で有利であり、例えば、強化されたエフェクターT細胞機能は、Th1型サイトカイン（例えば、IFN-γおよび／またはIL-2）の産生ならびに多機能性T細胞の産生の増加を含む。
本発明者らはまた、PCT/AU2018/050557において、抗RANKL mAb IK22/5の抗腫瘍効果がBatF3を欠くマウスにおいて打ち消されることを示し、これにより、CD103+ DCを介した交差提示の必須の役割が示唆された。加えて、腫瘍からのCD11c+/MHCII+ DCのフローサイトメトリー分析は、RANK陽性DCの100％がPDL-1およびCD103も発現していることを明らかにした。同様の分析は、RANK陽性腫瘍浸潤マクロファージにおけるCD206発現の有意な増加を示した。これらのデータは、RANK/RANKLのブロックが、RANK発現骨髄細胞（例えば、DCまたはマクロファージ）とRANKL発現細胞、例えば、腫瘍細胞、リンパ球、リンパ節細胞または他の間質成分との間のTMEにおける免疫抑制性または寛容原性軸を破壊する作用機構と合致する。
ヒト癌における骨髄細胞内でのRANKシグナルの寛容原的性質は、実験的観察により実証されている。生殖路扁平上皮癌腫（SCC）由来のRANKL発現癌細胞株と共に培養されたヒトDCは、より未成熟かつ寛容原性的な表現型を有した（Demoulin et al., 2015. Oncoimmunology 4, e1008334）。これらのDCは、正常なケラチン生成細胞と共に培養されたものよりも高レベルの免疫グロブリン様転写物3および免疫調節性サイトカインIL-10によって特徴づけられた。RANKL-RANK相互作用は、この表現型の誘導を部分的に担っており、それは、共培養物への可溶性RANKLデコイ受容体OPGの添加を通じて部分的に可逆的であった。まれな上皮内腺癌であるヒト乳房外ページェット病（EMPD）において、腫瘍内でのRANK発現は、マクロファージマーカーCD163（スカベンジャー受容体システインリッチ1型タンパク質M130としても公知）、アルギナーゼ-1（Arg1）およびCD206（マクロファージマンノース受容体1）と大部分が共局在化し、これによりRANK発現細胞が免疫抑制性M2型腫瘍関連マクロファージ（TAM）であることが示唆された（Kambayashi et al., 2015. J. Invest. Dermatol. 135, 2547-2550）。したがって、本発明者らはさらに、（1）本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子および（2）その代表例がPD-L1、CD206、CD103、CD200、Gal9、HVEM、CD38、CD163およびMARCO（本明細書で言い換え可能に「補助的骨髄抗原」（AMA）とも称される）を含む骨髄細胞の表面上にRANKと共に共発現される抗原に特異的に結合する少なくとも1つの抗原結合分子（例えば、An et al., 2016. Blood 128(12):1590-603; Fujimura et al., 2015. J. Invest. Dermatol. 135:2884-2887; Matsushita et al., 2010. Cancer Immunol Immunother 59:875; Georgoudaki et al., 2016. Cell Rep. 15(9):2000-2011を参照のこと）を含む治療組み合わせを提案する。したがって、本明細書に開示されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子はまた、（例えば、癌に対する）免疫を刺激もしくは増進するため、（例えば、腫瘍に対する）免疫抑制もしくは寛容の発症もしくは進行を阻害するため、または癌の発症、進行もしくは再発を阻害するための組成物および方法のおける1つまたは複数の抗AMA抗原結合分子と組み合わせての使用が想定される。これらの方法は、適切に、1つまたは複数の抗AMA抗原結合分子と組み合わせて本明細書に開示されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子を含む治療組み合わせを骨髄細胞と接触させる工程を含む。
治療組み合わせは、RANKアンタゴニスト抗原結合分子および少なくとも1つの抗ICMまたはAMA抗原結合分子の各々を含む単一組成物（例えば、混合物）の形態であり得る。あるいは、RANKアンタゴニスト抗原結合分子および少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子は、別個の組成物中の別個の成分として提供され得る。
適切な抗ICMまたはAMA抗原結合分子は、組み換え抗体、モノクローナル抗体（MAb）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体およびそのような抗体の抗原結合フラグメントを含む、抗体およびそれらの抗原結合フラグメントから選択され得る。
ヒトにおける用途に関しては、多くの場合、マウスのような他の種由来の抗体の免疫原性を減少させることが望ましい。これは、キメラ抗体の構築により、または「ヒト化」と呼ばれるプロセスによりなされ得る。この文脈で、「キメラ抗体」は、異なる種（例えば、ヒト）由来のドメイン（例えば、定常ドメイン）に融合されたある種（例えば、マウス）由来のドメイン（例えば、可変ドメイン）を含む抗体であると理解される。
「ヒト化抗体」は、非ヒト（例えば、マウス）抗体およびヒト抗体由来の配列を含む抗体の形態を表す。そのような抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンのそれらに対応する超可変ループのすべてまたは実質的にすべておよびフレームワーク（FR）領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のそれらである、少なくとも1つ、典型的に2つの可変ドメインの実質的にすべてを含む。ヒト化抗体はまた、任意で、免疫グロブリン定常領域（Fc）、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれ、の少なくとも一部を含む（Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)；およびPresta, Curr Op Struct Biol 2:593-596 (1992)を参照のこと）。ヒト化は、本質的に、Winter et al.（Jones et al.,前記；Riechmann et al.,前記を参照のこと）；およびVerhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)）の方法にしたがい、げっ歯類CDRまたはCDR配列を対応するヒト抗体の配列で置換することにより、行われ得る。さらに、例えば、ファージディスプレイによりまたはトランスジェニック動物を用いて、ヒトゲノム由来の配列に基づき抗体を作製する技術が開発されている（国際特許出願公開番号WO 90/05144；Marks et al., (1991) By-passing immunization. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage, J Mol Biol, 222, 581-597; Knappik et al., J Mol Biol 296: 57-86, 2000; Carmen and Jermutus, Concepts in antibody phage display, Briefings in Functional Genomics and Proteomics 2002 1(2):189-203; Lonberg and Huszar, Human antibodies from transgenic mice. Int Rev Immunol 1995; 13(1):65-93; Bruggemann and Taussig, Production of human antibody repertoires in transgenic mice, Curr Opin Biotechnol 1997 8(4): 455-8を参照のこと）。そのような抗体は、本発明との関係で、「ヒト抗体」である。
治療に使用することができる任意の適切な抗ICM抗原結合分子が、本発明を実施する上で使用されることが想定される。本発明の治療組み合わせによってアンタゴナイズされるICMは、PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、A2AR、A2BR、CD276、VTCN1、BTLA、IDO、KIR、LAG3、TIM-3、VISTA、CD73、CD96、CD155、DNAM-1、CD112、CRTAM、OX40、OX40L、CD244、CD160、GITR、GITRL、ICOS、GAL-9、4-1BBL、4-1BB、CD27L、CD28、CD80、CD86、SIRP-1、CD47、CD48、CD244、CD40、CD40L、HVEM、TMIGD2、HHLA2、VEGI、TNFRS25およびICOLGから選択される抑制性ICMの任意の1つまたは複数を含む。適切に、治療組み合わせがRANKLアンタゴニストおよび単一のICMアンタゴニストを含む態様において、ICMは、CTLA-4以外である。
いくつかの好ましい態様において、治療組み合わせに含まれる抗ICM抗原結合分子は、抗PD-1抗原結合分子である。これに関して、「抗PD-1抗原結合分子」は、免疫細胞（例えば、T細胞、B細胞またはNKT細胞）上に発現されるPD-1に対するPD-L1（例えば、癌細胞の表面上に発現されるPD-L1）の結合をブロックする任意の抗原結合分子を含む。PD-1の別名または同義語は、PDCD1、PD1、CD279およびSLEB2を含む。ヒトPD-1の代表的な成熟アミノ酸配列（UniProtアクセッション番号Q15116）を以下に示す：
Figure 2022514215000015
。
ヒトPD-1に結合する、したがって本発明において使用されるMAbの例は、米国特許公開番号US2003/0039653、US2004/0213795、US2006/0110383、US2007/0065427、US2007/0122378、US2012/237522、ならびに国際PCT公開番号WO2004/072286、WO2006/121168、WO2006/133396、WO2007/005874、WO2008/083174、WO2008/156712、WO2009/024531、WO2009/014708、WO2009/114335、WO2010/027828、WO2010/027423、WO2010/036959、WO2010/029435、WO2010/029434、WO2010/063011、WO2010/089411、WO2011/066342、WO2011/110604、WO2011/110621、およびWO2012/145493に記載されている（これらの全内容が参照により本明細書に組み入れられる）。本発明の目的上有用な具体的MAbは、抗PD-1 MAbであるニボルマブ、ペムブロリズマブ、およびピジリズマブ、ならびに国際特許公開番号WO2008/156712に記載されるヒト化抗PD-1抗体h409A11、h409A16、およびh409A17を含む。
本発明の抗PD-1抗原結合分子は、好ましくは、PD-1の細胞外ドメインの領域に結合する。例として、抗PD-1抗原結合分子は、アミノ酸配列
Figure 2022514215000016
（すなわち、SEQ ID NO:10に示されるネイティブPD-1配列の残基62～86）および
Figure 2022514215000017
（すなわち、SEQ ID NO:10に示されるネイティブPD-1配列の残基118～136）の一方または両方を含むヒトPD-1の細胞外ドメインの領域に特異的に結合し得る。別の例において、抗PD-1抗原結合分子は、アミノ酸配列
Figure 2022514215000018
（すなわち、SEQ ID NO:10に示されるネイティブヒトPD-1配列の残基66～97に対応）を含むヒトPD-1の細胞外ドメインの領域に結合する。
特定の態様において、抗PD-1抗原結合分子は、（その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第8,008,449号に詳細に記載されている（「5C4」として参照されている））完全ヒト化IgG4 MAbニボルマブまたはその抗原結合フラグメントを含む。このタイプの代表例において、抗PD-1抗原結合分子は、表2に示されるCDR配列を含む。
Figure 2022514215000019
他の特定の態様において、抗PD-1抗原結合分子は、例えば以下に示されるニボルマブの重鎖アミノ酸配列：
Figure 2022514215000020
またはアミノ酸配：
Figure 2022514215000021
を含む、それからなる、もしくはそれから本質的になるその抗原結合フラグメントを含む。
同じおよび他の態様のいくつかにおいて、抗PD-1抗原結合分子は、例えば以下に示されるニボルマブの軽鎖アミノ酸配列：
Figure 2022514215000022
またはアミノ酸配列：
Figure 2022514215000023
を含む、それからなる、もしくはそれから本質的になるその抗原結合フラグメントを含み得る。
代替の態様において、抗PD-1抗原結合分子は、ヒト化IgG4 MAbペムブロリズマブまたはその抗原結合フラグメントを含む。このタイプの非限定的な例において、抗PD-1抗原結合分子は、表3に示されるCDR配列を含む。
Figure 2022514215000024
いくつかの態様において、抗PD-1抗原結合分子は、PD-1への結合に関してMAbペムブロリズマブと競合する。
さらなる態様において、抗PD-1抗原結合分子は、例えば以下に示されるペムブロリズマブの重鎖アミノ酸配列：
Figure 2022514215000025
またはアミノ酸配列：
Figure 2022514215000026
を含む、それからなる、もしくはそれから本質的になるその抗原結合フラグメントを含む。
同様に、抗PD-1抗原結合分子は、例えば以下に示されるペムブロリズマブの軽鎖アミノ酸配列：
Figure 2022514215000027
またはアミノ酸配列：
Figure 2022514215000028
を含む、それからなる、もしくはそれから本質的になるその抗原結合フラグメントを含み得る。
このタイプのさらに他の態様において、抗PD-1抗原結合分子は、MAbピジリズマブまたはその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの関連する態様において、抗PD-1抗原結合分子は、表4に示されるCDR配列を含む。
Figure 2022514215000029
より具体的な態様において、抗PD-1抗原結合分子は、以下に示されるピジリズマブの重鎖アミノ酸配列：
Figure 2022514215000030
またはアミノ酸配列：
Figure 2022514215000031
を含む、それからなる、もしくはそれから本質的になるその抗原結合フラグメントを含む。
同じおよび他の態様のいくつかにおいて、抗PD-1抗原結合分子は、以下に示されるピジリズマブの軽鎖アミノ酸配列：
Figure 2022514215000032
またはアミノ酸配列：
Figure 2022514215000033
を含む、それからなる、もしくはそれから本質的になるその抗原結合フラグメントを含む。
他の適切なMAbは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる国際特許公開番号WO2015/026634に記載されている。これらは、（a）アミノ酸配列：
Figure 2022514215000034
（それぞれ、CDR1、CDR2およびCDR3）を有する軽鎖CDRならびにアミノ酸配列SYYLY［SEQ ID NO:57］、GVNPSNGGTNFSEKFKS［SEQ ID NO:58］およびRDSNYDGGFDY［SEQ ID NO:59］（それぞれ、CDR1、CDR2およびCDR3）を有する重鎖CDR；または（b）アミノ酸配列RASKGVSTSGYSYLH［SEQ ID NO:60］、LASYLES［SEQ ID NO:6１］およびQHSRDLPLT［SEQ ID NO:62］（それぞれ、CDR1、CDR2およびCDR3）を有する軽鎖CDRならびにアミノ酸配列
Figure 2022514215000035
（それぞれ、CDR1、CDR2およびCDR3）を有する重鎖CDR、を含むMAbまたはその抗原結合フラグメントを含む。
例として、そのようなMAbは、（a）
Figure 2022514215000036
を含む重鎖可変領域またはその変種もしくは抗原結合フラグメント；および
Figure 2022514215000037
から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域またはその変種もしくは抗原結合フラグメントを含み得る。
なおさらなる例示的な態様において、抗PD-1 MAbは、
Figure 2022514215000038
を含むIgG1重鎖またはその変種もしくは抗原結合フラグメント；および
Figure 2022514215000039
のいずれか1つを含む軽鎖またはその変種もしくは抗原結合フラグメント
を含み得る。
他の態様において、ICMアンタゴニストは、PD-L1アンタゴニストである。PD-L1の別名または同義語は、PDCD1L1、PDL1、B7H1、B7-4、CD274およびB7-Hを含む。一般に、PD-L1アンタゴニストは、以下に示されるヒトPD-L1のネイティブアミノ酸配列（UniProtアクセッション番号Q9NZQ7）：
Figure 2022514215000040
に特異的に結合する。
適切に、PD-L1アンタゴニストは、抗PD-L1抗原結合分子である。例として、本発明における使用に適した抗PD-L1抗原結合分子は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブ（MEDI4736）、アテゾリズマブ（テセントリク）、BMS-936559/MDX-1105、MSB0010718C、LY3300054、CA-170、GNS-1480、MPDL3280Aおよびアベルマブを含む。これらおよび他の抗PD-L1抗体は、その各々の全体が参照により本明細書に組み入れられる、国際公開番号WO2007/005874およびWO2010/077634、ならびに米国特許第8,217,149号および同8,779,108号に記載されている。さらなる抗PD-L1 MAbは、その全内容もまた参照により本明細書に組み入れられる、国際PCT特許公開番号WO2016/007,235に記載されている。
抗PD-L1抗原結合分子は、適切に、PD-L1の細胞外ドメインの領域に結合する。例として、抗PD-L1抗原結合分子は、アミノ酸配列SKKQSDTHLEET［SEQ ID NO:13］（すなわち、SEQ ID NO:14に示されるネイティブPD-L1配列の残基279～290）を含むヒトPD-L1の細胞外ドメインの領域に特異的に結合し得る。特定の態様において、抗PD-L1抗原結合分子は、（それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる、国際PCT公開番号WO2011/066389および米国特許公開番号2013/034559において「MEDI4736」として記載されている）完全ヒト化IgG1 MAbデュルバルマブまたはその抗原結合フラグメントを含む。このタイプの代表的態様において、抗PD-L1抗原結合分子は、表5に示されるCDR配列を含む。
Figure 2022514215000041
より具体的な態様において、抗PD-L1抗原結合分子は、例えば以下に示されるデュルバルマブの重鎖アミノ酸配列：
Figure 2022514215000042
またはアミノ酸配列：
Figure 2022514215000043
を含む、それからなる、もしくはそれから本質的になるその抗原結合フラグメントを含む。
同じおよび他の態様のいくつかにおいて、抗PD-L1抗原結合分子は、軽鎖アミノ酸配列：
Figure 2022514215000044
またはアミノ酸配列：
Figure 2022514215000045
を含む、それからなる、もしくはそれから本質的になるその抗原結合フラグメントを含み得る。
あるいは、抗PD-L1抗原結合分子は、PD-L1への結合に関して、MAbデュルバルマブと競合する。
他の態様において、抗PD-L1抗原結合分子は、（その全内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第8,217148号に記載される）完全ヒト化IgG1 MAbアテゾリズマブまたはその抗原結合フラグメントを含む。このタイプの代表的態様において、抗PD-L1抗原結合分子は、表6に示されるCDR配列を含む。
Figure 2022514215000046
 ここで、X1はDまたはGであり；X2はSまたはLであり；X3はTまたはSであり；X4はDまたはVであり；X5はVまたはIであり；X6はSまたはNであり；X7はAまたはFであり；X8はVまたはLであり；X9はFまたはTであり；X10はYまたはAであり；X11はY、G、またはFであり；X12はL、Y、またはFであり；X13はY、N、T、G、FまたはIであり；X14はH、V、P、T、またはIであり；X15はA、W、R、P、またはTである。
より具体的な態様において、抗PD-L1抗原結合分子は、例えば以下に示されるアテゾリズマブの重鎖アミノ酸配列：
Figure 2022514215000047
またはアミノ酸配列：
Figure 2022514215000048
を含む、それからなる、もしくはそれから本質的になるその抗原結合フラグメントを含む。
同じおよび他の態様のいくつかにおいて、抗PD-L1抗原結合分子は、例えば以下に提供されるアテゾリズマブの軽鎖アミノ酸配列：
Figure 2022514215000049
またはアミノ酸配列：
Figure 2022514215000050
を含む、それからなる、もしくはそれから本質的になるその抗原結合フラグメントを含む。
あるいは、抗PD-L1抗原結合分子は、PD-L1への結合に関して、MAbアテゾリズマブと競合する。
他の態様において、抗PD-L1抗原結合分子は、（その全内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第8,217148号に記載される）完全ヒト化IgG1 MAbアベルマブまたはその抗原結合フラグメントを含む。このタイプの代表的態様において、抗PD-L1抗原結合分子は、表7に示されるCDR配列を含む。
Figure 2022514215000051
 ここで、X1はM、I、またはSであり；X2はR、K、L、M、またはIであり；X3はFまたはMであり；X4はFまたはIであり；X5はSまたはTであり；X6はEまたはDであり；X7はNまたはSであり；X8はT、R、またはSであり；X9はAまたはGであり；X10はEまたはDであり；X11はI、N、またはSであり；X12はD、H、またはNであり；X13はFまたはYであり；X14はNまたはSであり；X15はR、T、またはSであり、X16はGまたはSであり、X17はIまたはTである。
具体的な態様において、抗PD-L1抗原結合分子は、例えば以下に提供されるアベルマブの重鎖アミノ酸配列：
Figure 2022514215000052
またはアミノ酸配列：
Figure 2022514215000053
を含む、それからなる、もしくはそれから本質的になるその抗原結合フラグメントを含む。
同じおよび他の態様のいくつかにおいて、抗PD-L1抗原結合分子は、例えば以下に示されるアベルマブの軽鎖アミノ酸配列：
Figure 2022514215000054
またはアミノ酸配列：
Figure 2022514215000055
を含む、それからなる、もしくはそれから本質的になるその抗原結合フラグメントを含む。
あるいは、抗PD-L1抗原結合分子は、PD-L1への結合に関して、MAbアベルマブと競合する。
いくつかの態様において、ICMアンタゴニストは、CTLA4のアンタゴニストである。CTLA4の別名または同義語は、ALPS5、CD、CD152、CELIAC3、CTLA-4、GRD4、GSE、IDDM12を含む。一般に、CTLA4アンタゴニストは、例えば以下に示されるヒトCTLA4の成熟アミノ酸配列（UniProtアクセッション番号P16410）：
Figure 2022514215000056
に特異的に結合する。
適切に、CTLA4アンタゴニストは、抗CTLA4抗原結合分子である。例として、本発明における使用に適した抗CTLA4抗原結合分子は、抗CTLA4 MAbイピリムマブ（BMS-734016、MDX-010、MDX-101）およびトレメリムマブ（チシリムマブ、CP-675,206）を含む。
抗CTLA4抗原結合分子は、適切に、CTLA4の細胞外ドメインの領域に結合する。例として、抗CTLA4抗原結合分子は、アミノ酸配列
Figure 2022514215000057
（すなわち、SEQ ID NO:16に示されるネイティブCTLA4配列の残基26～42）、
Figure 2022514215000058
（すなわち、SEQ ID NO:16に示されるネイティブCTLA4配列の残基43～65）、および
Figure 2022514215000059
（すなわち、SEQ ID NO:16に示されるネイティブCTLA4配列の残基96～109）の任意の1つまたは複数を含むヒトCTLA4の細胞外ドメインの領域に特異的に結合し得る。あるいはまたは加えて、抗CTLA4抗原結合分子は、CTLA4の成熟形態の以下の残基の任意の1つまたは複数、好ましくはすべてを含むヒトCTLA4の細胞外ドメインの領域に特異的に結合し得る：K1、A2、M3、E33、R35、Q41、S44、Q45、V46、E48、L91、I93、K95、E97、M99、P102、P103、Y104、Y105、L106、I108、N110。
特定の態様において、抗CTLA4抗原結合分子は、（例えば、それらの全内容が参照により本明細書に組み入れられる、国際公開WO2014/209804および米国特許公開番号2015/0283234に記載される）ヒトIgG1 MAbイピリムマブまたはその抗原結合フラグメントを含む。このタイプの代表的態様において、抗CTA4抗原結合分子は、表8に示されるCDR配列を含む。
Figure 2022514215000060
より具体的な態様において、抗CTLA4抗原結合分子は、例えば以下に示されるイピリムマブの重鎖アミノ酸配列：
Figure 2022514215000061
またはその非限定的な例がアミノ酸配列：
Figure 2022514215000062
を含む、それからなる、もしくはそれから本質的になるその抗原結合フラグメントを含む。
同じおよび他の態様のいくつかにおいて、抗CTLA4抗原結合分子は、例えば以下に示されるイピリムマブの軽鎖アミノ酸配列：
Figure 2022514215000063
またはその代表例がアミノ酸配列：
Figure 2022514215000064
を含む、それからなる、もしくはそれから本質的になるその抗原結合フラグメントを含む。
抗CTLA4抗原結合分子は、（例えば、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許公開番号2009/0074787に記載される）ヒトIgG2 MAbトレメリムマブまたはその抗原結合フラグメントを含む。このタイプの代表的態様において、抗CTLA4抗原結合分子は、表9に示されるCDR配列を含む。
Figure 2022514215000065
より具体的な態様において、抗CTLA4抗原結合分子は、例えば以下に示されるトレメリムマブの重鎖アミノ酸配列：
Figure 2022514215000066
またはその非限定的な例がアミノ酸配列：
Figure 2022514215000067
を含む、それからなる、もしくはそれから本質的になるその抗原結合フラグメントを含む。
同じおよび他の態様のいくつかにおいて、抗CTLA4抗原結合分子は、例えば以下に示されるトレメリムマブの軽鎖アミノ酸配列：
Figure 2022514215000068
またはその代表例がアミノ酸配列：
Figure 2022514215000069
を含む、それからなる、もしくはそれから本質的になるその抗原結合フラグメントを含む。
他の態様において、抗ICM抗原結合分子は、抗B7-H3抗原結合分子である。一般に、B7-H3抗原結合分子は、例えば以下に示されるヒトB7-H3（UniProtアクセッション番号Q5ZPR3）のネイティブアミノ酸配列：
Figure 2022514215000070
に特異的に結合する。
適切に、本発明における使用に適した抗B7-H3抗原結合分子は、MAbエノブリツズマブまたはその抗原結合フラグメントである。いくつかの態様において、抗B7-H3抗原結合分子は、表10に示されるCDR配列を含む。
Figure 2022514215000071
より具体的な態様において、抗B7-H3抗原結合分子は、例えば以下に示されるエノブリツズマブの重鎖アミノ酸配列：
Figure 2022514215000072
またはその代表例がアミノ酸配列：
Figure 2022514215000073
を含む、それからなる、もしくはそれから本質的になるその抗原結合フラグメントを含む。
同じおよび他の態様のいくつかにおいて、抗B7-H3抗原結合分子は、例えば以下に提供されるエノブリツズマブの軽鎖アミノ酸配列：
Figure 2022514215000074
またはその代表例がアミノ酸配列：
Figure 2022514215000075
を含む、それからなる、もしくはそれから本質的になるその抗原結合フラグメントを含む。
いくつかの代替の態様において、抗B7-H3抗原結合分子は、B7-H3への結合に関してMAbエノブリツズマブと競合する。
いくつかの態様において、抗ICM抗原結合分子は、抗KIR抗原結合分子である。このタイプの好ましい態様において、抗KIR抗原結合分子は、KIR2-DL-1、-2、および-3とそれらのリガンドの間の相互作用をブロックする。ヒトKIR、すなわち、KIR2-DL1の成熟アミノ酸配列（UniProtアクセッション番号P43626）は、例えば以下に提供されるものである：
Figure 2022514215000076
。
本発明における使用に適した抗KIR抗原結合分子は、当技術分野で周知の方法を用いて生成され得る。あるいは、当技術分野で知られているKIR抗原結合分子が使用され得る。例えば、抗KIR抗原結合分子は、例えばその全内容が参照により本明細書に組み入れられるWO2014/066532に記載される完全ヒト化MAbリリルマブまたはその抗原結合フラグメントを含む。適切に、抗KIR抗原結合分子は、表11に示されるCDR領域を含む。
Figure 2022514215000077
このタイプの代表的態様において、抗KIR抗原結合分子は、例えば以下に示されるリリルマブの重鎖可変ドメインアミノ酸配列：
Figure 2022514215000078
またはその代表例がアミノ酸配列：
Figure 2022514215000079
を含む、それからなる、もしくはそれから本質的になるその抗原結合フラグメントを含み得る。
同じおよび他の態様のいくつかにおいて、抗KIR抗原結合分子は、例えば以下に示されるリリルマブの軽鎖可変ドメインアミノ酸配列：
Figure 2022514215000080
またはその代表例がアミノ酸配列：
Figure 2022514215000081
を含む、それからなる、もしくはそれから本質的になるその抗原結合フラグメントを含み得る。
代替の態様において、抗ICM抗原結合分子は、抗LAG-3抗原結合分子である。LAG-3は、4つの細胞外Ig様ドメインを有する503アミノ酸のI型膜貫通タンパク質である。LAG-3は、活性化されたT細胞、NK細胞、B細胞、および形質細胞様DCにおいて発現される。ヒトLAG-3の代表的な成熟アミノ酸配列（UniProtアクセッション番号P18627）を以下に示す：
Figure 2022514215000082
。
いくつかの態様において、抗LAG-3抗原結合分子は、適切に、抗LAG3ヒト化MAbであるBMS-986016である。他の抗LAG-3抗体は、それらの各々の全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許公開番号2011/0150892ならびに国際PCT公開番号WO2010/019570およびWO2014/008218に記載されている。
いくつかの態様において、抗LAG-3抗原結合分子は、表12に示されるCDR配列を含む。
Figure 2022514215000083
抗LAG-3抗原結合分子は、適切に、MAb BMS-986016またはその抗原結合フラグメントを含む。より詳細に、いくつかの態様において、抗LAG-3抗原結合分子は、例えば以下に示されるBMS-986016の重鎖アミノ酸配列：
Figure 2022514215000084
またはその代表例がアミノ酸配列：
Figure 2022514215000085
を含む、それからなる、もしくはそれから本質的になるその抗原結合フラグメントを有する。
同様に、抗LAG-3抗原結合分子は、SEQ ID NO:45に示されるおよび以下に提供されるBMS-986016の軽鎖アミノ酸配列もしくはその抗原結合フラグメント：
Figure 2022514215000086
またはその代表例がアミノ酸配列：
Figure 2022514215000087
を含む、それからなる、もしくはそれから本質的になるその抗原結合フラグメントを含み得る。
治療に使用され得る任意の適切な抗AMA抗原結合分子もまた、本発明のRANKアンタゴニスト抗原結合分子と組み合わせての使用が想定される。
5. 多特異性抗原結合分子
RANKアンタゴニスト抗原結合分子および抗ICMまたは抗AMA抗原結合分子が同じ組成物内に提供されるいくつかの態様において、それらは、多特異性抗原結合分子の形態でひとつにコンジュゲートされ得る。
多特異性抗原結合分子の代表例は、タンデムscFv（taFvまたはscFv2）、ダイアボディ、dAb2/VHH2、ノブ・イントゥ・ホール誘導体、SEED-IgG、ヘテロFc-scFv、Fab-scFv、scFv-Jun/Fos、Fab'-Jun/Fos、トリボディ、DNL-F(ab)3、scFv3-CH1/CL、Fab-scFv2、IgG-scFab、IgG-scFv、scFv-IgG、scFv2-Fc、F(ab')2-scFv2、scDB-Fc、scDb-CH3、Db-Fc、scFv2-H/L、DVD-Ig、tandAb、scFv-dhlx-scFv、dAb2-IgG、dAb-IgG、dAb-Fc-dAb、およびそれらの組み合わせを含む。特定の態様において、合成または組み換え抗原結合分子は、IgG様抗体（例えば、トリオマブ（triomab）/クアドローマ（quadroma）、Trion Pharma/Fresenius Biotech；ノブ・イントゥ・ホール、Genentech；クロスMAb、Roche；静電気的適合抗体、AMGEN；LUZ-Y、Genentech；鎖交換加工ドメイン（strand exchange engineered domain；SEED）体；EMD Serono; biolonic, Merus；およびFab交換抗体、Genmab）、対称性IgG様抗体（例えば、二標的（DT）-Ig、GSK/Domantis；2イン1抗体、Genentech；架橋MAb、カルマノスがんセンター；MAb2、F-star；およびCoy Xボディ、Coy X/Pfizer）、IgG融合体（例えば、二可変ドメイン（DVD）-Ig、Abbott；IgG様二重特異性抗体、Eli Lilly；Ts2Ab、Medimmune/AZ；BsAb、ZymoGenetics；HERCULES、Biogen Idec；TvAb、Roche）、Fc融合体（例えば、ScFv/Fc融合体、Academic Institution；SCORPION、Emergent BioSolutions/Trubion、ZymoGenetics/BMS；二親和性再標的化技術（Fc-DART）、MacroGenics；デュアル(ScFv)2-Fab、National Research Center for Antibody Medicine）、Fab融合体（例えば、F(ab)2、Medarex/AMGEN；二作用性またはBis-Fab、Genentech；ドック・アンド・ロック（DNL）、ImmunoMedics；二価二重特異性、Biotechnol；およびFab-Fv、UCB-Celltech）、ScFvおよびダイアボディベースの抗体（例えば、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（BiTE）、Micromet；タンデムダイアボディ（Tandab）、Affimed；DART、MacroGenics；単鎖ダイアボディ、Academic；TCR様抗体、AIT、Receptor Logics；ヒト血清アルブミンScFv融合体、Merrimack；およびCOMBODIES、Epigen Biotech）、IgG/非IgG融合体（例えば、免疫サイトカイン、EMDSerono、Philogen、ImmunGene、ImmunoMedics；スーパー抗原融合タンパク質、Active Biotech；および癌に対する免疫動員性mTCR、ImmTAC）ならびにオリゴクローナル抗体（例えば、SymphogenおよびMerus）から選択される。
多特異性抗原結合分子の他の非限定的な例は、Fab・イン・タンデム免疫グロブリン（FIT-Ig）（Gong et al., 2017. MAbs. 9(7):1118-1128. doi: 10.1080/19420862.2017.1345401. Epub 2017 Jul 10. PubMedPMID: 28692328; PubMed Central PMCID: PMC5627593）を含み、これは2つまたはそれ以上の抗原に結合することができる。FIT-Ig分子の設計の際、親mAb由来の2つのFabドメインがクリスクロス（crisscross）方向に直列に直接融合される。哺乳類細胞において共発現される場合、3つのフラグメントが集合して四価多特異性FIT-Ig分子を形成する。例えば、二重特異性結合タンパク質は、（抗原Aに結合する）mAb Aおよび（抗原Bに結合する）mAb Bの2つの親モノクローナル抗体を用いてFIT-Igとして構築され得る。FIT-Ig分子の設計の際、親mAb由来の2つのFabドメインがクリスクロス方向に直列に直接融合される。哺乳類細胞において共発現される場合、3つのフラグメントが集合して四価多特異性FIT-Ig分子を形成する。代表的な態様において、FIT-Igは、RANKおよび少なくとも1つのICMまたは少なくとも1つのAMAをアンタゴナイズする多特異性抗原結合分子を提供する。これらの多特異性抗原結合分子は、通常、RANKに特異的に結合してアンタゴナイズするFIT-Ig分子として構築された抗体またはその抗原結合フラグメントおよびICMまたはAMAのそれぞれについて、そのICMまたはAMAに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる。少なくとも1つの抗ICM抗体またはその抗原結合フラグメントは、適切に、抗PD-1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、抗PD-L1抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または抗CTLA-4抗体もしくはその抗原結合フラグメントから選択され、FIT-Ig分子に組み込まれる。多特異性抗原結合分子がPD-1をアンタゴナイズするいくつかの態様において、多特異性抗原結合分子は、抗PD-1抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。多特異性抗原結合分子がPD-L1をアンタゴナイズするいくつかの態様において、多特異性抗原結合分子は、抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。多特異性抗原結合分子がCTLA4をアンタゴナイズするいくつかの態様において、多特異性抗原結合分子は、抗CTLA4抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
さらに、少なくとも1つの抗AMA抗体または抗原結合フラグメントは、適切に、抗PD-L1抗体もしくは抗原結合フラグメント、抗CD206抗体もしくは抗原結合フラグメント、抗CD103抗体もしくは抗原結合フラグメント、抗CD200抗体もしくは抗原結合フラグメント、抗CD200抗体もしくは抗原結合フラグメント、抗Gal9抗体もしくは抗原結合フラグメント、抗HVEM抗体もしくは抗原結合フラグメント、抗CD38抗体もしくは抗原結合フラグメント、抗CD163抗体もしくは抗原結合フラグメント、または抗MARCO抗体もしくは抗原結合フラグメントから選択され、FIT-Ig分子に組み込まれる。したがって、多特異性抗原結合分子がCD206をアンタゴナイズするいくつかの態様において、多特異性抗原結合分子は、抗CD206抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。多特異性抗原結合分子がPD-L1をアンタゴナイズするいくつかの態様において、多特異性抗原結合分子は、抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。多特異性抗原結合分子がCD103をアンタゴナイズするいくつかの態様において、多特異性抗原結合分子は、抗CD103抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。多特異性抗原結合分子がCD200をアンタゴナイズするいくつかの態様において、多特異性抗原結合分子は、抗CD200抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。多特異性抗原結合分子がHVEMをアンタゴナイズするいくつかの態様において、多特異性抗原結合分子は、抗HVEM抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。多特異性抗原結合分子がCD38をアンタゴナイズするいくつかの態様において、多特異性抗原結合分子は、抗CD38抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。多特異性抗原結合分子がCD163をアンタゴナイズするいくつかの態様において、多特異性抗原結合分子は、抗CD163抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。多特異性抗原結合分子がMARCOをアンタゴナイズするいくつかの態様において、多特異性抗原結合分子は、抗MARCO抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
特定の態様において、第1の抗原結合特異性を有する抗原結合分子は、二重特異性抗原結合分子を生成するよう、1つまたは複数の他の分子体、例えば、第2の抗原結合特異性を有する別の抗原結合分子に（例えば、化学的カップリング、遺伝的融合、非共有結合的会合またはそれ以外の方法により）機能的に連結され得る。本発明との関係で使用され得る特定の例示的な多機能性形式は、非限定的に、単鎖ダイアボディ（scDb）、タンデムscDb（Tandab）、直鎖状二量体scDb（LD-scDb）、環状二量体scDb（CD-scDb）、二重特異性T細胞エンゲージャー（BiTE；タンデムdi-scFv）、ジスルフィド安定化Fvフラグメント（Brinkmann et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1993; 90: 7538-7542）、タンデムトリ-scFv、トリボディ、二重特異性Fab2、ジ-ミニ抗体、テトラボディ、scFv-Fc-scFv融合体、ジ-ダイアボディ、DVD-Ig、IgG-scFab、scFab-dsscFv、Fv2-Fc、IgG-scFv融合体、例えば、bsAb（軽鎖のC末端に連結されたscFv）、Bs1Ab（軽鎖のN末端に連結されたscFv）、Bs2Ab（重鎖のN末端に連結されたscFv）、Bs3Ab（重鎖のC末端に連結されたscFv）、Ts1Ab（重鎖および軽鎖の両方のN末端に連結されたscFv）、Ts2Ab（重鎖のC末端に連結されたdsscFv）、およびノブ・イントゥ・ホール（KiH）（KiH技術により調製された二重特異性IgG）、SEED技術（SEED-IgG）およびデュオボディ（デュオボディ技術により調製された二重特異性IgG）、1つの機能的Fvドメインが形成されるよう、各々KiHまたはデュオボディの2つの異なる重鎖の1つのC末端に融合された、VHおよびVLドメインを含む。本発明における使用に特に適するものは、単鎖ダイアボディ（scDb）、特に二重特異性単量体scDbである。様々な多特異性構築物を考察および提示するレビュー記事については、例えば、Chan Carter, Nature Reviews Immunology 10 (2010) 301-316; Klein et al., MAbs 4(2012) 1-11; Schubert et al., Antibodies 1 (2012) 2-18；Byrne et al., Trends in Biotechnology 31 (2013) 621；Metz et al., Protein Engineering Design & Selection 25(2012) 571-580)、およびそれらで引用されている参考文献を参照のこと。
特定の態様において、本発明は、RANKに特異的に結合してアンタゴナイズする第1の抗原結合分子（例えば、抗体または抗原結合フラグメント）、およびICMに特異的に結合する第2の抗原結合分子（例えば、抗体または抗原結合フラグメント）を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。二重特異性抗原結合分子は、適切に、上記および本明細書中の他所で詳細に記載される抗原結合分子のいずれかを含む。
例として、第1の抗原結合分子は、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子であり、第2の抗原結合分子は、ヒトPD-1の領域、好ましくはヒトPD-1の細胞外ドメインの領域に特異的に結合し得る。
これらの態様の非限定的な例は、表1に示されるCDR配列を含む第1の抗原結合分子を含む。第2の抗原結合分子は、適切に、表2～4のいずれか1つに示されるCDR配列を含む。このタイプの特定の態様において、第2の抗原結合分子は、ニボルマブ、ペムブロリズマブおよびピジリズマブから選択されるMAbのいずれか1つの少なくとも抗原結合フラグメントを含み得る。
他の態様において、第2の抗原結合分子は、ヒトPD-L1の領域、好ましくはヒトPD-L1の細胞外ドメインの領域に特異的に結合する。したがって、いくつかの態様において、第2の抗原結合分子は、PD-L1の領域に特異的に結合し、表5～7のいずれか1つに示されるCDR配列を含む。このタイプの特定の態様において、第2の抗原結合分子は、デュルバルマブ、アテゾリズマブおよびアベルマブから選択されるMAbのいずれか1つの少なくとも抗原結合フラグメントを含み得る。
さらに他の態様において、第2の抗原結合分子は、ヒトCTLA4の領域に特異的に結合する。したがって、いくつかの態様において、第2の抗原結合分子は、ヒトCTLA4に特異的に結合し、表8～9のいずれか1つに示されるCDR配列を含む。このタイプの特定の態様において、第2の抗原結合分子は、イピリムマブおよびトレメリムマブから選択されるMAbのいずれか1つの少なくとも抗原結合フラグメントを含み得る。
特定の態様において、本発明は、RANKに特異的に結合してアンタゴナイズする第1の抗原結合分子（例えば、抗体または抗原結合フラグメント）、およびAMAに特異的に結合する第2の抗原結合分子（例えば、抗体または抗原結合フラグメント）を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
これらの態様の代表例において、第1の抗原結合分子は、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子であり、第2の抗原結合分子は、ヒトPD-L1の領域、好ましくはヒトPD-L1の細胞外ドメインの領域に特異的に結合し得る。
他の代表例において、第1の抗原結合分子は、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子であり、第2の抗原結合分子は、ヒトCD206の領域、好ましくはヒトCD206の細胞外ドメインの領域に特異的に結合し得る。
他の代表例において、第1の抗原結合分子は、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子であり、第2の抗原結合分子は、ヒトCD103の領域、好ましくはヒトCD103の細胞外ドメインの領域に特異的に結合し得る。
さらに他の代表例において、第1の抗原結合分子は、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子であり、第2の抗原結合分子は、ヒトCD200の領域、好ましくはヒトCD200の細胞外ドメインの領域に特異的に結合し得る。
他の代表例において、第1の抗原結合分子は、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子であり、第2の抗原結合分子は、ヒトGal9の領域、好ましくはヒトGal9の細胞外ドメインの領域に特異的に結合し得る。
他の代表例において、第1の抗原結合分子は、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子であり、第2の抗原結合分子は、ヒトHVEMの領域、好ましくはヒトHVEMの細胞外ドメインの領域に特異的に結合し得る。
さらなる代表例において、第1の抗原結合分子は、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子であり、第2の抗原結合分子は、ヒトCD38の領域、好ましくはヒトCD38の細胞外ドメインの領域に特異的に結合し得る。
他の代表例において、第1の抗原結合分子は、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子であり、第2の抗原結合分子は、ヒトCD163の領域、好ましくはヒトCD163の細胞外ドメインの領域に特異的に結合し得る。
さらに他の代表例において、第1の抗原結合分子は、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子であり、第2の抗原結合分子は、ヒトMARCOの領域、好ましくはヒトMARCOの細胞外ドメインの領域に特異的に結合し得る。
本発明はまた、RANKアンタゴニスト抗原結合分子および2つまたはそれ以上のICMに対する特異性を有する複数のICMアンタゴニスト抗原結合分子を含む多特異性構築物を提供する。非限定的な例において、複数のICMアンタゴニスト抗原結合分子は、（1）PD-1およびPD-L1、（2）PD-1およびCTLA4、（3）PD-L1およびCTLA4、ならびに（4）PD-1、PD-L1およびCTLA4から選択されるICMの組み合わせに対する特異性を有する。多特異性構築物は、本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントを含む、特定のICMの組み合わせに対する特異性を有する任意の適切な抗体または抗原結合フラグメントを含み得る。
本発明はさらに、RANKアンタゴニスト抗原結合分子および2つまたはそれ以上のAMAに対する特異性を有する複数のAMAアンタゴニスト抗原結合分子を含む多特異性構築物を提供する。非限定的な例において、複数のAMAアンタゴニスト抗原結合分子は、（1）PD-L1およびCD206、（2）PD-L1およびCD103、（3）PD-L1およびCD200、（4）PD-L1およびGal9、（5）PD-L1およびHVEM、（6）PD-L1およびCD38、（7）PD-L1およびCD163、（8）PD-L1およびMARCO、（9）CD206およびCD103、（10）CD206およびCD200、（11）CD206およびGal9、（12）CD206およびHVEM、（13）CD206およびCD38、（14）CD206およびCD163、（15）CD206およびMARCO、（16）CD103およびCD200、（17）CD103およびGal9、（18）CD103およびHVEM、（19）CD103およびCD38、（20）CD103およびCD163、（21）CD103およびMARCO、（22）CD200およびGal9、（23）CD200およびHVEM、（24）CD200およびCD38、（25）CD200およびCD163、（26）CD200およびMARCO、（27）Gal9およびHVEM、（28）Gal9およびCD38、（29）Gal9およびCD163、（30）Gal9およびMARCO、（31）HVEMおよびCD38、（32）HVEMおよびCD163、（33）HVEMおよびMARCO、（34）CD38およびCD163、（35）CD38およびMARCO、（36）CD163およびMARCO、（37）PD-L1、CD206およびCD103、（38）PD-L1、CD206およびCD200、（39）PD-L1、CD206およびGal9、（40）PD-L1、CD206およびHVEM、（41）PD-L1、CD206およびCD38、（42）PD-L1、CD206およびCD163、（43）PD-L1、CD206およびMARCO、（44）CD206、CD103およびCD200、（45）CD206、CD103およびGal9、（46）CD206、CD103およびHVEM、（47）CD206、CD103およびCD38、（48）CD206、CD103およびCD163、（49）CD206、CD103およびMARCO、（50）CD103、CD200およびGal9、（51）CD103、CD200およびHVEM、（52）CD103、CD200およびCD38、（53）CD103、CD200およびCD163、（54）CD103、CD200およびMARCO、（55）CD200、Gal9およびHVEM、（56）CD200、Gal9およびCD38、（57）CD200、Gal9およびCD163、（58）CD200、Gal9およびMARCO、（59）Gal9、HVEMおよびCD38、（60）Gal9、HVEMおよびCD163、（61）Gal9、HVEMおよびMARCO、（62）HVEM、CD38およびCD163、（63）HVEM、CD38およびMARCO、（64）CD38、CD163およびMARCOから選択されるAMAの組み合わせに対する特異性を有する。多特異性構築物は、本明細書に開示される抗体または抗原結合フラグメントを含む、特定のICMの組み合わせに対する特異性を有する任意の適切な抗体または抗原結合フラグメントを含み得る。
本発明の多特異性抗原結合分子は、当技術分野で周知の任意の多くの方法により生成され得る。適切な方法は、生物学的方法（例えば、体細胞ハイブリダイゼーション）、遺伝的方法（例えば、生物内での所望の抗体構造をコードする非ネイティブDNA配列の発現）、化学的方法（例えば、2つの抗体の化学的コンジュゲート）、またはそれらの組み合わせを含む（Kontermann R E (ed.), Bispecific Antibodies, Springer Heidelberg Dordrecht London New York, 1-28 (2011)を参照のこと）。
5.1 二重特異性抗原結合分子の化学的な製造法
化学的にコンジュゲートされた二重特異性抗原結合分子は、2つの既存の抗体または抗体フラグメント、例えば、本明細書中上記および他所に記載されるもの、の化学的連結により得られる。典型的な連結は、2つの異なる全長抗体の架橋、2つの異なるFab’フラグメントの架橋による二重特異性F(ab')2の生成、およびF(ab')2フラグメントと異なるFab’フラグメントの架橋による二重特異性F(ab')3の生成を含む。化学的コンジュゲートのために、酸化的再結合戦略が使用され得る。現在の方法論は、ホモまたはヘテロ二官能性架橋試薬の使用を含む（同書）。
ヘテロ二官能性架橋試薬は、例えば、抗体分子上の、2つの異なる反応性基に対する反応性を有する。ヘテロ二官能性架橋試薬の例は、SPDP（N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート）、SATA（スクシンイミジルアセチルチオアセテート）、SMCC（スクシンイミジルトランス-4-(マレイミジルメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート）、EDAC（1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド）、PEAS（N-((2-ピリジルジチオ)エチル)-4-アジドサリチルアミド）、ATFB-SE（4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロ安息香酸、スクシンイミジルエステル）、ベンゾフェノン-4-マレイミド、ベンゾフェノン-4-イソチオシアネート、4-ベンゾイル安息香酸、スクシンイミジルエステル、アジ化ヨードアセトアミド、ヨードアセトアミドアルキン、Click-iTマレイミドDIBOアルキン、アジド(PEO)4プロピオン酸、スクシンイミジルエステル、アルキン、スクシンイミジルエステル、Click_iTスクシンイミジルエステルDIBOアルキン、スルホ-SBED（スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジル-2-(6-[ビオチンアミド]-2-(p-アジドベンズアミド)-ヘキサノアミド)エチル-1,3'-ジチオプロピオネート)、光反応性アミノ酸（例えば、L-光学ロイシンおよびL-光学メチオニン)、NHS-ハロアセチル架橋物質（例えば、スルホ-SIAB）、SIAB、SBAP、SIA、NHS-マレイミド架橋物質（例えば、スルホ-SMCC）、SM(PEG)nシリーズ架橋物質、SMCC、LC-SMCC、スルホ-EMCS、EMCS、スルホ-GMBS、GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、MBS、スルホ-SMPB、SMPB、AMAS、BMPS、SMPH、PEG12-SPDP、PEG4-SPDP、スルホ-LC-SPDP、LC-SPDP、SMPT、DCC (N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド)、EDC（1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド）、NHS（N-ヒドロキシスクシンイミド）、スルホ-NHS（N-ヒドロキシスルホスクシンイミド)、BMPH、EMCH、KMUH、MPBH、PDPH、およびPMPIを含む。
ホモ二官能性架橋試薬は、1つの分子、例えば抗体上の同じ反応性基に対する反応性を有する。ホモ二官能性架橋試薬の例は、DTNB（5,5'-ジチオビス (2-ニトロ安息香酸）、o-PDM（o-フェニレンジマレイミド）、DMA（ジメチルアジピミデート）、DMP（ジメチルピメリミデート）、DMS（ジメチルスベリミデート）、DTBP（ジチオビスプロピオンイミデート）、BS(PEG)5、BS(PEG)9、BS3、BSOCOES、DSG、DSP、DSS、DST、DTSSP、EGS、スルホ-EGS、TSAT、DFDNB、BM(PEG)n架橋物質、BMB、BMDB、BMH、BMOE、DTME、およびTMEAを含む。
5.2 二重特異性抗原結合分子の生物学的な製造法
体細胞ハイブリダイゼーションは、2つの異なる抗体重鎖（すなわち、VHAおよびVHB）および軽鎖（すなわち、VLAおよびVLB）を生成することができるクアドローマを生成する2つの別個のハイブリドーマ（特定の抗体を産生するB細胞と骨髄細胞の融合体）細胞株の融合である（Kontermann, 前記）。これらの重および軽鎖は、細胞内で無作為に組み合わされ、二重特異性抗原結合分子（例えば、VLA鎖と組み合わされたVHA鎖およびVLB鎖と組み合わされたVHB鎖）ならびにいくつかの非機能的（例えば、2つのVLB鎖と組み合わされた2つのVHA鎖）および一特異性（例えば、2つのVHA鎖と組み合わされた2つのVHA鎖）抗原結合分子を生成する。二重特異性抗原結合分子は、その後、十分に確立された方法を用いて、例えば、2つの異なる親和性クロマトグラフィーカラムを用いて精製され得る。
一特異性抗原結合分子と同様に、二重特異性抗原結合分子もまた、抗原結合の下流でFc媒介効果を発揮するFc領域を含み得る。これらの効果は、例えば、ペプシン消化による二重特異性抗体からのFc領域のタンパク質分解切断による二重特異性F(ab')2分子の生成により軽減され得る（同書）。
5.3 多特異性抗原結合分子の遺伝的な製造法
多特異性抗原結合分子はまた、当技術分野において十分に確立されている遺伝的手段、例えば、所望の抗体構造に対応するDNA配列を含むプラスミドのインビトロ発現によって生成され得る（例えば、Kontermann, 前記を参照のこと）。
5.4 ダイアボディ
いくつかの態様において、多特異性抗原結合分子は、ダイアボディである。ダイアボディは、各鎖が2つの可変ドメイン（VHA-VLBおよびVHB-VLAまたはVLA-VHBおよびVLB-VHA）を有する、例えば、RANKおよびICMに結合しアンタゴナイズする抗体由来の、2つの別個のポリペプチド鎖から構成される。典型的に、可変ドメインを接続するポリペプチドリンカーは、短い（すなわち、約2、3、4、5、6、7、8、9または10アミノ酸残基から）。短いポリペプチドリンカーは、同一鎖上のVHおよびVLドメインの会合を防ぎ、したがって異なる鎖上のVHおよびVLドメインの会合を促進する。形成するヘテロ二量体は、両方の標的抗原に対して機能的である（例えば、VHA-VLBとVHB-VLAまたはVLA-VHBとVLB-VHA）。しかし、非機能的分子となるホモ二量体も形成し得る(例えば、VHA-VLBとVHA-VLB、VHB-VLAとVHB-VLA等)。2つのポリペプチド鎖を共有結合的に接続するジスルフィド結合の導入、一方の鎖に大きなアミノ酸および他方に小さなアミノ酸を含むようにするポリペプチド鎖の修飾（本明細書中上記および他所で議論されるノブ・イントゥ・ホール構造）、およびC末端伸長部へのシステイン残基の付加を含む、ホモ二量体を防ぐ様々な戦略が、当技術分野で公知である。別の戦略は、2つのポリペプチド鎖をポリペプチドリンカー配列により接続し、taFvよりもコンパクトな構造を示す単鎖ダイアボディ分子（scDb）を生成することである。scDbまたはダイアボディはまた、ジダイアボディを生成するようIgG1 CH3ドメインまたはFc領域に融合され得る。ジダイアボディの例は、scDb-Fc、Db-Fc、scDb-CH3およびDb-CH3を含むがこれらに限定されない。さらに、scDbは、四価二重特異性分子を作製するために使用され得る。scDbのポリペプチドリンカー配列を約15アミノ酸から約5アミノ酸に短縮することにより、（Muller and Kontermann, in Bispecific Antibodies Kontermann R E (ed.), Springer Heidelberg Dordrecht London New York, 83-100 (2011)に記載されるように）TandAbとして公知の二量体単鎖ダイアボディ分子が生成される。
5.5 抗原結合分子生成のための他のコンジュゲート技術
本発明にしたがう多特異性抗原結合分子を生成する別の適当な戦略は、抗体分子（例えば、scFvまたはFab）のC末端にヘテロ二量体化ペプチドをコンジュゲートまたはそれ以外の方法で連結することを含む。
この戦略の非限定的な例は、jun-fosロイシンジッパーに連結された抗体フラグメント（例えば、scFv-Jun/FosおよびFab'-Jun/Fos）の使用である。
二重特異性抗原結合分子を生成するさらなる方法は、異なる抗原結合フラグメントを含む2つの抗体をビオチンで誘導体化し、ついでその2つの抗体をストレプトアビジンを通じて連結した後、生じた二重特異性抗体を精製および単離することを含む。
本発明にしたがうさらなるタイプの二重特異性抗原結合分子は、各抗原につき2つ以上の抗原結合部位を含むものを含む。例えば、追加のVHおよびVLドメインが、抗原結合部位が効果的に直列に配置されるよう、既存の抗体のVHおよびVLドメインのN末端に融合され得る。これらのタイプの抗体は、二可変ドメイン抗体（DVD-Ig）として公知である（Tarcsa, E. et al., in Bispecific Antibodies. Kontermann, supra, pp. 171-185を参照のこと）。1つの抗原に対して2つ以上の抗原結合部位を含む抗体を製造する別の方法は、重鎖のN末端または軽鎖のC末端にscFvフラグメントを融合することである（以下でより詳細に議論する）。
多特異性抗原結合分子複合体または構築物の抗体または抗原結合フラグメントは、IgM、IgG、IgD、IgA、IgEまたはそれらのフラグメントからなる群より独立して選択され、これらはそれらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列によって相互に区別される。これらのIgクラスのいくつかは、サブクラス、例えば、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4、IgA1およびIgA2にさらに細分される。異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常領域は、それぞれ、α、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。5つすべての抗体クラスで見出され得る軽鎖定常領域（CL）は、κ（カッパ）およびλ（ラムダ）から選択される。抗原認識および結合能を有する抗体フラグメントは、Fab、Fab'、F(ab')2およびFvフラグメントである。さらに、第1および第2の抗原結合フラグメントは、直接的にまたはリンカー（例えば、ポリペプチドリンカー）によりのいずれかにより接続される。
5.6 IgGスキャホールドを用いる二重特異性抗原結合分子の生成
2つのポリペプチド鎖のヘテロ二量体化（例えば、IgG様抗体）を促進するために、定常免疫グロブリンドメインが適切に使用され得る。この二重特異性抗体製造戦略の非限定的な例は、2つのポリペプチドへのノブ・イントゥ・ホール構造の導入およびCLおよびCH1ドメインの自然発生的ヘテロ二量体化の利用を含む（Kontermann, 前記, pp. 1-28 (2011) Ridgway et al., Protein Eng. 1996 Jul;9(7):617-21; Atwell et al., J Mol Biol.1997 Jul 4;270(1):26-35を参照のこと）。
本発明にしたがう組み換え抗原結合分子の大部分は、IgG様となるよう作製され得、このことはそれらがFcドメインも含むことを意味する。作製されたポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を必要とするダイアボディと同様、IgG様抗原結合分子もまた、類似の重鎖同士または異なる特異性の2つの抗体由来の重鎖と軽鎖の相互作用を防ぐためにヘテロ二量体化を必要とする（Jin, P. and Zhu, Z. In: Bispecific Antibodies. Kontermann RE (ed.), Springer Heidelberg Dordrecht London New York, pp. 151-169 (2011)）。
ノブ・イントゥ・ホール構造は、所望のヘテロ二量体の一方の鎖に大きなアミノ酸（ノブ）をおよび所望のヘテロ二量体の他の鎖に小さなアミノ酸（ホール）を導入することによりポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を促進する。立体的相互作用は、ノブとノブまたはホールとホールではなく、ノブとホールの相互作用が優先されるであろう。二重特異性IgG様抗体に関して、類似の重鎖は、Fc領域のCH3ドメインへのノブ・イントゥ・ホール（KiH）構造の導入によってホモ二量体化を妨げられ得る。同様に、同じ抗原に特異的な重鎖および軽鎖の相互作用の促進は、VH-VL界面にKiH構造を形成することによって達成され得る。詳細に、KiH法において、大きなアミノ酸側鎖が重鎖の一方のCH3ドメインに導入され、その側鎖は他方の重鎖のCH3ドメインに適切に設計されたくぼみにフィットする（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Ridgeway et al., Protein Eng. 9(1996), 617-621 and Atwell et al., J. Mol. Biol. 270(1997), 677-681を参照のこと）。したがって、重鎖のヘテロ二量体は、いずれかのホモ二量体よりも安定化し、より発現されたポリペプチドの中でより高い比率を占める傾向がある。加えて、所望の軽鎖／重鎖対の会合は、軽鎖と重鎖の間で定常または定常および可変領域を「スワップ」する二重特異性抗体の1つのFab（Fab領域）の修飾により誘導され得る。したがって、修飾されたFabドメインにおいて、重鎖は、例えば、CL-VHまたはCL-VLドメインを含み、軽鎖は、それぞれ、CHI-VLまたはCHI-VHドメインを含む。これは、修飾された鎖（すなわち、修飾された軽または重鎖）の重／軽鎖Fab部分と、標準／非修飾アームの重／軽鎖Fab部分の相互作用を防ぐ。解説すると、CLドメインを含む、修飾アームのFabドメイン内の重鎖は、これもまたCLドメインを含む、非修飾アーム／Fabドメインの軽鎖と優先的に相互作用しない（重／軽鎖の「不適切」または望まれない対形成を防ぐ）。「不適切」な軽／重鎖の会合を防ぐこの技術は、「クロスMAb」技術と呼ばれ、KiH技術を組み合わせることで、所望の二重特異性分子の発現が大きく向上する（例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる、Schaefer et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011; 108(27):11187-92；および米国特許公開番号2010/0159587を参照のこと）。KiH構造の他の例も存在し、上で議論された例が限定であると解釈されるべきでない。Fc領域のヘテロ二量体化を促進する他の方法は、Fcドメインへの電荷極性の導入（Gunasekaran et al., 2010を参照のこと）およびSEED技術（SEED-IgG）（Davis et al., Protein Eng Des Sel. 2010 Apr;23(4):195-202, 2010）を含む。
特定の態様において、多特異性抗原結合分子は、抗体ドメイン交換がKiH法に基づく独立した親抗体から得られるクロスMAbである。軽鎖の誤った対形成は、ドメインクロスオーバーおよびKIH法を用いてヘテロ二量体化された重鎖を用いて克服される。ドメインクロスオーバーのために、可変ドメインまたは定常ドメインのいずれかが、2つの非対称性Fabアームを形成するよう軽鎖と重鎖の間でスワップされ、その「クロスオーバー」が抗原結合親和性を維持しつつ軽鎖の誤った対形成が回避される。天然抗体と比較して、クロスMAbは、より高い安定性を示す。異なる領域で交換された、Fab、VH-VLおよびCH1-CLのような様々な異なるクロスMAb形式が存在する。好ましい態様において、多特異性抗原結合分子は、二重特異性抗体のCH1およびCL領域を交換するクロスMAbCH1-CL形式に基づく。
さらなるヘテロ二量体化IgG様抗原結合分子は、ヘテロFc-scFv、Fab-scFv、IgG-scFvおよびscFv-IgGを含むがこれらに限定されない。ヘテロFc-scFvは、2つの別個のscFvをヘテロ二量体化可能なFcドメインに連結し、Fab-scFvは、異なるエピトープに特異的なscFvに連結された1つのエピトープに特異的なFabドメインを含む。IgG-scFvおよびscFv-IgGは、それぞれ、それらのC末端およびN末端に連結されたscFvを有するIg様抗体である（Kontermann R E (ed.),前記,pp. 151-169を参照のこと）。
代表的なクロスMAb態様は、第1のIgG様ポリペプチドの界面において、そのポリペプチドのCH3ドメイン内の少なくとも1つの接触残基を置き換えることによって人工的な突起を形成するものを含む。特に、第１のポリペプチドにおいて置き換えられる接触残基は、366位のIgG残基に対応し（残基番号はFc結晶構造に基づく（Deisenhofer, Biochem. 20:2361 [1981]））、人工の突起は、元の残基をコードする核酸を、元の残基よりも大きな側鎖容積を有する導入残基をコードする核酸で置き換えること含む。詳細に、366位のスレオニン（T）残基が、トリプトファン（W）に変異される。第2の工程において、第2のポリペプチドの界面において、そのポリペプチドのCH3ドメイン内の少なくとも1つの接触残基を置き換えることによって人工のくぼみが形成され、人工のくぼみは、元の残基をコードする核酸を、元の残基よりも小さな側鎖容積を有する導入残基をコードする核酸で置き換えること含む。詳細に、第2のポリペプチドにおいて置き換えられる接触残基は、407位のIgG残基に対応する。詳細に、407位のチロシン（Y）残基がアラニン（A）に変異される。この手順は、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3およびIgG4からなる群より選択される異なるIgGサブタイプにおいて行われ得る。
クロスMAb技術の別の具体例において、多特異性抗原結合分子は、例えば、2つの異なる宿主細胞における構成成分である抗体の個別の発現により二重特異性抗体が作製され、その後に精製され、2つの一特異性抗体間での制御されたFabアーム交換を通じて二重特異性ヘテロ二量体抗体が組み立てられるWO2008119353およびWO 2011131746（各々の全体が参照により本明細書に組み入れられる）に記載されるデュオボディプラットフォーム/cFAE（GenMAb）に基づくものであり得る。（例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられるLabrijn et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2013;110(13):5145-5150; Gramer et al. MAbs 2013;5(6): 962-973; Labrijn et al. Nature Protocols 2014;9(10):2450-63に記載されるように）2つの一特異性出発タンパク質のCH3領域に非対称性の適合する変異（例えば、EU番号インデックスにしたがうF405LおよびK409R）を導入することにより、同様にFabアーム交換が指向性となり、それによって還元条件下で安定的なヘテロ二量体対を得ることができる。実施には、二重特異性ヒトIgG1 Abは、各々がそれぞれの相補的変異の1つであるK409RまたはF405Lを有する2つの精製された二価親抗体から製造され得る。この同じ戦略は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4骨格上で実施され得る（Labrijn 2013, 前記）。
多特異性抗原結合分子のさらに他の非限定的な例は、（WO 2018/057955に記載される）ラムダ鎖ポリペプチドおよびカッパ軽鎖ポリペプチドを含み、2つまたはそれ以上の抗原に結合することができる多特異性、例えば二重特異性抗体分子を含む。このアプローチの基礎は、1つのカッパ軽鎖ポリペプチドおよび1つのラムダ軽鎖ポリペプチドを使用することにより、多特異性抗体分子において不正確な重鎖に対する軽鎖の誤った対形成を防ぐことである。RANKおよび抗ICM抗原結合分子を含む、ラムダ鎖ポリペプチドおよびカッパ軽鎖ポリペプチドを含み、2つの抗原に結合する多特異性抗原結合分子の設計において、4つの構築物が作製される。2つの異なるCH3ドメインにおいて「ノブ・イントゥ・ホール」構造を形成するさらなる非対称的変化は、所望のヘテロ二量体の一方の鎖に大きなアミノ酸（ノブ）をおよび所望のヘテロ二量体の他方の鎖に小さなアミノ酸（ホール）を導入することによりポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を促進する。哺乳類細胞において共発現される場合、4つのフラグメントは集合して、多特異性抗体分子を形成する。
5.7 静電気的ステアリング
他の態様において、多特異性抗原結合分子は、選択された変異を通じてそのCH3ドメインにおける荷電相補性が変更され、静電気的ステアリング作用を通じて抗体Fcヘテロ二量体形成が促進される、静電気的ステアリングに基づくものである（Gunasekaran et al., 2010. J Biol Chem 285(25):19637-46；WO 2009089004 A1）。この同じ戦略は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4骨格において実施され得る（WO 2009089004 A1）。
5.8 リンカー
リンカーは、少なくとも2つの抗原結合分子を含むキメラ分子を形成するよう異なる抗原結合分子を共有結合により連結するために使用され得る。抗原結合分子間の連結は、個々の抗原結合分子がそれらの対応する同族エピトープに結合することを可能にする空間的関係を提供し得る。これに関連して、個々のリンカーは、2つの別個の機能的な抗原結合分子を接続するよう機能する。リンカーのタイプは、化学的リンカーおよびポリペプチドリンカーを含むがこれらに限定されない。
リンカーは、化学的であり得、例えば、アルキレン鎖、ポリエチレングリコール（PEG）鎖、ポリコハク酸無水物、ポリ-L-グルタミン酸、ポリ（エチレンイミン）、オリゴ糖、アミノ酸鎖、または任意の他の適当な連結を含む。特定の態様において、リンカー、例えばアルキレン鎖は、それ自体が、生理学的条件下で安定であり得る、またはそれは、例えば酵素により（例えば、連結は、ペプチダーゼの基質であるペプチド配列を含む）または加水分解により（例えば、連結は、加水分解可能な基、例えばエステルもしくはチオエステルを含む）、生理学的条件下で切断可能であり得る。リンカー、例えばPEG、ポリグルコール酸もしくはポリ乳酸鎖は、生物学的に不活性であり得る、または例えばオリゴもしくはポリペプチドは、生物学的に活性であり得、その部分から切断されたときに、受容体に結合し、酵素を不活性化する等である。リンカーは、炭素・炭素結合、エステル、エーテル、アミド、アミン、カーボネート、カルバメート、スルホンアミド等を含む任意の適切な結合または官能基により第1および第2の抗体または抗原結合フラグメントに付加され得る。
特定の態様において、リンカーは、少なくとも1つ（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上）の誘導体化または非誘導体化アミノ酸を表す。このタイプの具体例において、リンカーは、好ましくは、非免疫原性かつフレキシブル、例えば、セリンおよびグリシン配列またはAla-Ala-Alaの反復を含むもの、である。個々の構築物に依存して、リンカーは、長い（例えば、12アミノ酸長を超える）または短い（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12アミノ酸長）ものであり得る。例えば、単鎖ダイアボディを作製するために、第1および第3のリンカーは、好ましくは、約3～約12アミノ酸長（より好ましくは約5アミノ酸長）であり、第2のリンカーは、好ましくは、12アミノ酸長より長い（より好ましくは約15アミノ酸長）。所望の場合、リンカーの長さを3残基以下に縮小することにより、単鎖抗体フラグメントを本発明にすることができ、それによって二重特異性抗体が二価、三価または四価になるようにすることができる。
代表的なペプチドリンカーは、
Figure 2022514215000088
から選択され得、ここでnは1～10、適切には1～5、より適切には1～3の整数である。
6. 多特異性抗原結合構築物
本発明の1つの局面は、直接的にまたはリンカーを介してのいずれかでひとつに融合またはそれ以外の方法でコンジュゲートされた異なる特異性を有する複数の抗原結合分子を含むキメラ構築物に関する。例示的な構築物を以下に提供する。
6.1 抗RANK抗PD-1ダイアボディ
多特異性抗体を開発する代替アプローチは、単鎖ダイアボディ（scダイアボディ）形式に基づくものである。ここで、2つの抗体由来の可変ドメインAおよびBは、ポリペプチド鎖VHA-VLB-リンカー-VHB-VLAとして発現される。本発明は、その代表例が以下：
Figure 2022514215000089
から選択される配列を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる、二重特異性であり、RANKアンタゴニスト抗原結合分子および抗PD-1抗原結合分子を含む多特異性構築物を想定しており、ここで、
・非修飾大文字は、抗RANK MAb 3A3の可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
・下線付きの小文字は、抗PD-1 MAbニボルマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
・下線付きの大文字は、抗PD-1 MAbニボルマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
・非修飾小文字は、抗RANK MAb 3A3の可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
・各[SGGGG]n表記は、フレキシブルリンカーであり、ここで、1番目および3番目のフレキシブルリンカーの表示においてn=1、2、3または4、好ましくはn=1であり、2番目のフレキシブルリンカーの表示においてn=3である。
6.2 抗RANK抗PD-L1ダイアボディ
あるいは、二重特異性構築物は、その代表例が以下：
Figure 2022514215000090
から選択される配列を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる、抗RANK抗原結合分子および抗PD-L1抗原結合分子を含み、ここで、
・非修飾大文字は、抗RANK MAb 3A3の可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
・下線付きの小文字は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
・下線付きの大文字は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
・非修飾小文字は、抗RANK MAb 3A3の可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
・各[SGGGG]n表記は、フレキシブルリンカーであり、ここで、1番目および3番目のフレキシブルリンカーの表示においてn=1、2、3または4、好ましくはn=1であり、2番目のフレキシブルリンカーの表示においてn=3である。
あるいは、二重特異性構築物は、その代表例が以下：
Figure 2022514215000091
から選択される配列を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる、抗RANK抗原結合分子および抗PD-L1抗原結合分子を含み、ここで、
・非修飾大文字は、抗RANK MAb 3A3の可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
・下線付きの小文字は、抗PD-L1 MAbアテゾリズマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
・下線付きの大文字は、抗PD-L1 MAbアテゾリズマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
・被修飾小文字は、抗RANK MAb 3A3の可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
・各[SGGGG]n表記は、フレキシブルリンカーであり、ここで、1番目および3番目のフレキシブルリンカーの表示においてn=1、2、3または4、好ましくはn=1であり、2番目のフレキシブルリンカーの表示においてn=3である。
6.3 抗RANKL抗CTLA4ダイアボディ
あるいは、二重特異性構築物は、その代表例が以下：
Figure 2022514215000092
から選択される配列を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる、抗RANK抗原結合分子および抗CTLA4抗原結合分子を含み、ここで、
・非修飾大文字は、抗RANK MAb 3A3の可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
・下線付きの小文字は、抗CTLA4 MAbイピリムマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
・下線付きの大文字は、抗CTLA4 MAbイピリムマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
・非修飾小文字は、抗RANK MAb 3A3の可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
・各[SGGGG]n表記は、フレキシブルリンカーであり、ここで、1番目および3番目のフレキシブルリンカーの表示においてn=1、2、3または4、好ましくはn=1であり、2番目のフレキシブルリンカーの表示においてn=3である。
あるいは、二重特異性構築物は、その代表例が以下：
Figure 2022514215000093
から選択される配列を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる、抗RANK抗原結合分子および抗CTLA4抗原結合分子を含み、ここで、
・非修飾大文字は、抗RANK MAb 3A3の可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
・下線付きの小文字は、抗CTLA4 MAbトレメリムマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
・下線付きの大文字は、抗CTLA4 MAbトレメリムマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
・非修飾小文字は、抗RANK MAb 3A3の可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
・各[SGGGG]n表記は、フレキシブルリンカーであり、ここで、1番目および3番目のフレキシブルリンカーの表示においてn=1、2、3または4、好ましくはn=1であり、2番目のフレキシブルリンカーの表示においてn=3である。
6.4 抗RANK-抗PD-L1クロスMAb構築物
本発明はまた、クロスMAb多特異性抗原結合分子を想定している。クロスMAb構築の第1の工程では、第1のIgG様ポリペプチドの界面において、そのポリペプチドのCH3ドメイン内の少なくとも1つの接触残基を置き換えることによって、人工的な突起が形成される。詳細に、第１のポリペプチドにおいて置き換えられる接触残基は、366位のIgG残基に対応し（残基番号はFc結晶構造に基づく（Deisenhofer, Biochem. 20:2361 [1981]））、人工の突起は、元の残基をコードする核酸を、元の残基よりも大きな側鎖容積を有する導入残基をコードする核酸で置き換えること含む。詳細に、366位のスレオニン（T）残基が、トリプトファン（W）に変異される。第2の工程では、第2のポリペプチドの界面において、そのポリペプチドのCH3ドメイン内の少なくとも1つの接触残基を置き換えることによって、人工のくぼみが形成され、人工のくぼみは、元の残基をコードする核酸を、元の残基よりも小さな側鎖容積を有する導入残基をコードする核酸で置き換えること含む。詳細に、第2のポリペプチドにおいて置き換えられる接触残基は、407位のIgG残基に対応する。詳細に、407位のチロシン（Y）残基がアラニン（A）に変異される。この手順は、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3およびIgG4からなる群より選択される異なるIgGサブタイプにおいて行われ得る。
その後の工程では、ヘテロ二量体二重特異性IgGにおいて可能性のある2つの軽鎖／重鎖相互作用の間の区別を促進するために、軽鎖と重鎖の間で定常または定常および可変領域を「スワップ」する二重特異性抗体の1つのFab（Fab領域）の修飾により、所望の軽鎖／重鎖の対形成が誘導され得る（例えば、Schaefer et al.,前記を参照のこと）。したがって、修飾されたFabドメインにおいて、重鎖は、例えば、CL-VHまたはCL-VLドメインを含み、軽鎖は、それぞれ、CH1-VLまたはCH1-VHドメインを含む。これは、修飾された鎖（修飾された軽または重鎖）の重／軽鎖Fab部分と、標準／非修飾アームの重／軽鎖Fab部分の相互作用を防ぐ。解説すると、CLドメインを含む、修飾アームのFabドメイン内の重鎖は、これもまたCLドメインを含む、非修飾アーム／Fabドメインの軽鎖と優先的に相互作用しない（重／軽鎖の「不適切」または望まれない対形成を防ぐ）。「不適切」な軽／重鎖の会合を防ぐこの技術は、「クロスMAb」技術と呼ばれ、KiH技術を組み合わせることで、所望の二重特異性分子の発現が大きく向上する（例えば、Schaefer et al., 2011,前記を参照のこと）。
ヘテロ二量体二重特異性IgG抗体の作製は、最初に、哺乳類細胞（例えば、HEK293）における分泌発現が可能なように二重特異性IgGの4つの鎖をコードする抗体遺伝子の各々を哺乳類発現ベクターにクローニングすることにより達成される。抗体鎖cDNAの各々は、293フェクチンまたは同様の技術を用いて、等モル比でまとめてHEK293細胞にトランスフェクトされ、抗体含有細胞培養上清が収集され、プロテインAセファロースを用いて上清から抗体が精製される。
いくつかの態様において、抗RANK抗原結合分子および抗PD-L1抗原結合分子の両方から構成される二重特異性ヘテロ二量体IgGは、重鎖のKiHヘテロ二量体化を促進するよう重鎖CH3ドメインの1つが「ノブ」と呼ばれる366位で変更（T366W）され、他方の重鎖CH3ドメインが「ホール」と呼ばれる407位で変更（Y407A）された2つの重鎖および2つの軽鎖構築物を用いて構築され得る。
いくつかの態様において、抗RANK抗原結合分子および抗PD-L1抗原結合分子の両方から構成される二重特異性ヘテロ二量体IgGは、重鎖CH3ドメインの各々がFcγRおよびC1q相互作用の減少のために234位（L234A）、235位（L235A）、329位（P329G）で変更された2つの重鎖および2つの軽鎖構築物を用いて構築され得る。
6.4.1 CH1-CL交換を用いるRANKおよびPD-L1の両方に結合する多特異性クロスMAb構築物
例示的な多特異性クロスMAb分子は、抗RANK 3A3抗体およびアテゾリズマブIgG1由来の重および軽鎖配列を含み得、所望の軽鎖／重鎖対形成が、CH1およびCLドメインがIg鎖間で交換される抗RANK抗原結合分子のFabドメインの修飾により誘導され得る。
この構築の目的で、抗RANK 3A3 VH1ドメインは、アテゾリズマブ由来のヒトIgG1 CH1ドメイン（または別の適切なヒトIgG1）とタンデムに融合され、以下のAA配列：
Figure 2022514215000094
を有し、ここで、
・抗RANK 3A3 VHは、非修飾大文字で示され；
・アテゾリズマブCHドメインは、太字の小文字で示される。
この構築の目的で、抗RANK 3A3 VLドメインは、ラムダ1軽鎖Uniprot配列P0DOX8由来のヒトラムダCLドメイン（または別の適切なヒトラムダもしくはカッパCL配列）とタンデムに融合され、以下のAA配列：
Figure 2022514215000095
を有し、ここで、
・抗RANK 3A3 VLは、非修飾大文字で示され；
・P0DOX8 CLドメインは、太字の小文字で示される。
RANKおよびPD-L1の両方に結合する多特異性クロスMAbをCH1-CL交換を用いて作製するために、以下の4つの構築物がこの構築で使用される。
構築物1
抗RANK 3A3クロスMAb CH1-CL huIgG1 KNOB変異、重鎖
Figure 2022514215000096
ここで、
・抗RANK 3A3 VH［SEQ ID NO:163由来］は、非修飾大文字で示され；
・CLドメイン［SEQ ID NO:164由来］は、太字の小文字で示され；
・ヒトIgG1ヒンジ領域は、下線付きの小文字で示され；
・アテゾリズマブCH2-CH3ドメインは、非修飾小文字で示され；
・T366W「ノブ」置換およびL234A、L235A、P329G置換は、太字の大文字で示される。
構築物2
抗RANK 3A3クロスMAb CH1-CL軽鎖
Figure 2022514215000097
ここで、
・抗RANK 3A3 VLは、非修飾大文字で示され；
・CH1ドメイン［SEQ ID NO:163由来］は、太字の小文字で示される。
構築物3
アテゾリズマブIgG1ホール変異、重鎖
Figure 2022514215000098
ここで、
・アテゾリズマブVHは、非修飾大文字で示され；
・アテゾリズマブCH1ドメインは、太字の小文字で示され；
・HuIgG1ヒンジ領域は、下線付きの小文字で示され；
・アテゾリズマブHuIgG1 CH2-CH3ドメインは、非修飾小文字で示され；
・Y407A「ホール」およびL234A、L235A、P329G置換は、太字の大文字で示される。
構築物4
アテゾリズマブ軽鎖
Figure 2022514215000099
本明細書に記載されるクロスMabアプローチは、上記のPD-L1抗原結合分子配列を他の抗PD-L1および抗PD-1または抗CTLA4抗原結合分子配列で置き換えても使用され得る。さらに、他のIgGスキャホールド、特にIgG4も使用される。
いくつかの態様において、RANKアンタゴニスト抗原結合分子および抗PD-1抗原結合分子の両方から構成される二重特異性ヘテロ二量体IgGは、クロスMAb多特異性抗原結合分子との関係で、重鎖のKiHヘテロ二量体化を促進するよう重鎖CH3ドメインの1つが「ノブ」と呼ばれる366位で変更（T366W）され、他方の重鎖CH3ドメインが「ホール」と呼ばれる407位で変更（Y407A）された2つの重鎖および2つの軽鎖構築物を用いて構築され得る。
6.4.2 RANKおよびPD-1の両方に結合する多特異性クロスMAb-CH1-CL交換-IgG4の構築物
例示的な多特異性クロスMAb分子は、抗RANK 3A3抗体およびニボルマブIgG4由来の重および軽鎖配列を含み得、所望の軽鎖／重鎖対は、CH1およびCLドメインをIg鎖間で交換する抗RANK抗原結合分子のFabドメインの修飾により誘導され得る。以下の4つの構築物が、この構築において使用される。
構築物1
抗RANK 3A3クロスMAb CH1-CL huIgG4 KNOB変異、重鎖
Figure 2022514215000100
ここで、
・抗RANK 3A3 VH［SEQ ID NO:163由来の］は、非修飾大文字で示され；
・CLドメイン［SEQ ID NO:154由来の］は、太字の小文字で示され；
・IgG4ヒンジ領域は、下線付きの小文字で示され；
・IgG4 CH2-CH3ドメインは、非修飾小文字で示され；
・T366W「ノブ」置換は、太字の大文字で示される。
構築物2
抗RANK 3A3クロスMAb CH1-CL軽鎖
Figure 2022514215000101
ここで、
・抗RANK 3A3 VLは、非修飾大文字で示され；
・CH1ドメイン［SEQ ID NO:AAA由来の］は、太字の小文字で示される。
構築物3
ニボルマブIgG4ホール変異、重鎖
Figure 2022514215000102
ここで、
・ニボルマブVHは、非修飾大文字で示され；
・ニボルマブCH1ドメインは、太字の小文字で示され；
・IgG4ヒンジ領域は、下線付きの小文字で示され；
・IgG4 CH2-CH3ドメインは、非修飾小文字で示され；
・Y407A「ホール」置換は、太字の大文字で示される。
構築物4
ニボルマブ軽鎖
Figure 2022514215000103
ヒトIgG4の場合、以前に、変異S228P/L235E変種（SPLE）の作製が最小のFcγR結合を示している（Newman et al., 2001, Clin. Immunol. 98, 164-174）。IgG1またはIgG4 Fcドメインの変異は組み合わされ得る、例えば、ヒトIgG1におけるLALA変異とP329Gにおける変異を組み合わせるまたはヒトIgG4におけるSPLE変異とP329Gにおける変異を組み合わせることで、FcγRおよびC1q相互作用が完全に消失するであろう（Schlothauer et al., 2016, Protein Eng Des. Sel. 29, 457-466）。
いくつかの態様において、抗RANK抗原結合分子および抗PD-1抗原結合分子の両方から構成される二重特異性ヘテロ二量体IgG4は、重鎖CH3ドメインの各々がFcγRおよびC1q相互作用の減少のために228位（S228P）、235位（L235E）、329位（P329G）で変更された2つの重鎖および2つの軽鎖構築物を用いて構築され得る。
7. 薬学的組成物
本発明の薬学的組成物は、概して、1つまたは複数の薬学的に許容される担体を用いて製剤化された、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子または治療組み合わせを含む。任意で、薬学的組成物は、1つまたは複数の他の化合物、薬物、成分および／または物質を含む。選択される投与経路に関わらず、本発明のRANKアンタゴニスト抗原結合分子または治療組み合わせは、当業者に公知の従来法により薬学的に許容される投薬形態で製剤化される（例えば、Remington, The Science and Practice of Pharmacy (21st Edition, Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia, Pa.)を参照のこと）。
薬学的に許容される担体は、生理学的に適合する任意かつすべての溶媒、分散媒、等張・吸収遅延剤等を含む。担体は、（例えば、注射または輸注による）静脈内、筋内、皮下、非経口、直腸、脊椎または上皮投与に適したものであり得る。
薬学的組成物は、様々な形態であり得る。これらは、例えば、液体、半固体および固体の投薬形態、例えば、溶液（例えば、注射可能および輸注可能な溶液）、分散物または懸濁物、リポソームおよび坐剤を含む。好ましい形態は、意図されている投与経路および治療用途に依存する。典型的な好ましい組成物は、注射可能または輸注可能な溶液の形態である。好ましい投与様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋内）である。好ましい態様において、RANKアンタゴニスト抗原結合分子または治療組み合わせは、静脈内輸注または注射により投与される。別の好ましい態様において、RANKアンタゴニスト抗原結合分子または治療組み合わせは、筋内または皮下注射により投与される。
本明細書で使用される「非経口投与」および「非経口的に投与」というフレーズは、通常注射による、経腸および局所投与以外の投与様式を意味し、非限定的に、静脈内、筋内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および輸注を含む。
薬学的組成物は、典型的に、製造および保管条件下で滅菌性かつ安定であるべきである。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散物、リポソームまたは高い抗原結合分子濃度に適する他の秩序ある構造として製剤化され得る。滅菌性注射溶液は、必要量の活性化合物（すなわち、RANKアンタゴニスト抗原結合分子または治療組み合わせ）を、必要に応じて上記成分の1つまたは組み合わせと共に適切な溶媒に添加し、その後にろ過滅菌することによって調製され得る。通常、分散物は、基礎分散媒および上記のものの中からの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中に活性化合物を添加することによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分および任意の追加の所望の成分の粉末を事前に滅菌ろ過されたその溶液から生成する真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、コーティング、例えば、レシチンの使用により、分散物の場合は必要な粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持され得る。注射可能な組成物の長期的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらされ得る。
特定の態様において、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子または治療組み合わせは、細胞送達のためのビヒクルにコンジュゲートされ得る。これらの態様において、典型的に、検出標識および／または補助的治療剤にコンジュゲートされる場合もされない場合もある本開示の抗体は、標的細胞への抗原結合分子もしくは治療組み合わせの送達を補助するため、抗原結合分子もしくは治療組み合わせの安定性を向上させるため、または抗原結合分子もしくは治療組み合わせの潜在的毒性を最小化するためのいずれかのために、適切なビヒクルでカプセル化され得る。当業者に理解されるように、様々なビヒクルが、本開示の抗体の送達に適する。適切な構造化された液体送達システムの非限定的な例は、ナノ粒子、リポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、デンドリマーおよび他のリン脂質含有システムを含み得る。抗体を送達ビヒクルに組み込む方法は、当技術分野で公知である。以下には様々な態様が示されているが、本開示の抗原結合分子または治療組み合わせを送達ビヒクルに組み込む当技術分野で公知の他の方法も想定されていることが理解されるであろう。
いくつかの態様において、リポソーム送達ビヒクルが利用され得る。一般的に言うと、リポソームは、リン脂質二重層膜を有する球形の小胞である。リポソームの脂質二重層は、他の二重層（例えば、細胞膜）と融合し得、それによってリポソームの内容物を細胞に送達する。この様式で、本発明の抗原結合分子または治療組み合わせは、標的とされた細胞の膜と融合するリポソームによるカプセル化により細胞に選択的に送達され得る。
リポソームは、様々な炭化水素鎖長を有する様々な異なるタイプのリン脂質から構成され得る。リン脂質は、通常、グリセロールリン酸を通じて様々な極性基の1つに連結された2つの脂肪酸を含む。適切なリン脂質は、ホスファチジン酸（PA）、ホスファチジルセリン（PS）、ホスファチジルイノシトール（PI）、ホスファチジルグリセロール（PG）、ジホスファチジルグリセロール（DPG）、ホスファチジルコリン（PC）、およびホスファチジルエタノールアミン（PE）を含む。リン脂質を含む脂肪酸鎖は、約6～約26の炭素原子長の範囲であり得、脂質鎖は、飽和または不飽和であり得る。適切な脂肪酸鎖は（一般名を括弧内に示す）、n-ドデカノエート（ラウレート）、n-テトラデカノエート（ミリステート）、n-ヘキサデカノエート（パルミテート）、n-オクタデカノエート（ステアレート）、n-エイコサノエート（アラキデート）、n-ドコサノエート（ベヘネート）、n-テトラコサノエート（リグノセレート）、シス-9-ヘキサデセノエート（パルミトレエート）、シス-9-オクタデカノエート（オレエート）、シス,シス-9,12-オクタデカンジエノエート（リノレエート）、全シス-9,12,15-オクタデカトリエノエート（リノレネート）、および全シス-5,8,11,14-エイコサテトラエノエート（アラキドネート）を含む。リン脂質の2つの脂肪酸鎖は、同じまたは異なり得る。許容されるリン脂質は、ジオレオイルPS、ジオレオイルPC、ジステアロイルPS、ジステアロイルPC、ジミリストイルPS、ジミリストリルPC、ジパルミトイルPG、ステアロイル、オレオイルPS、パルミトイル、リノレニルPS等を含む。
リン脂質は、任意の天然源由来であり得、したがって、リン脂質の混合物を含み得る。例えば、卵黄は、PC、PGおよびPEが豊富であり、ダイズはPC、PE、PIおよびPAを含み、動物の脳または脊髄はPSが豊富である。リン脂質は、合成源由来でもあり得る。様々な比の個々のリン脂質を有するリン脂質の混合物が使用され得る。異なるリン脂質の混合物は、有利な活性または活性の安定性を有するリポソーム組成物を形成し得る。上記のリン脂質は、最適な比で、カチオン性脂質、例えば、N-(1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド、1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニンペルクロレート、3,3'-デヘプチルオキサカルボシアニンヨージド、1,1'-デドデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニンペルクロレート、1,1'-ジオレオイル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニンメタンスルホネート、N-4-(デリノレイルアミノスチリル)-N-メチルピリジニウムヨージド、または1,1,-ジリノレイル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニンペルクロレートと混合され得る。
リポソームは、任意で、スフィンゴ脂質を含み得、スフィンゴシンはグリセロールの構造上の対応物であり、動物の細胞膜の主成分であるホスホグリセリドまたはコレステロールの1つの脂肪酸の1つである。リポソームは、任意で、ポリエチレングリコール（PEG）のポリマーに共有結合により連結された脂質であるペグ化脂質を含み得る。PEGは、約500～約10,000ダルトンの範囲のサイズであり得る。
リポソームはさらに、適切な溶媒を含み得る。溶媒は、有機溶媒または無機溶媒であり得る。適切な溶媒は、ジメチルスルホキシド（DMSO）、メチルピロリドン、N-メチルピロリドン、アセトニトリル、アルコール、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない。
本開示の抗体を含む（すなわち、少なくとも1つのメチオニン化合物を有する）リポソームは、例えば、米国特許第4,241,046号、同第4,394,448号、同第4,529,561号、同第4,755,388号、同第4,828,837号、同第4,925,661号、同第4,954,345号、同第4,957,735号、同第5,043,164号、同第5,064,655号、同第5,077,211号、および同第5,264,618号において詳述される、薬物送達用のリポソームを調製する任意の公知の方法により調製され得る。例えば、リポソームは、水溶液中での脂質の超音波処理、溶媒注入、脂質水和、逆相蒸散、または凍結および解凍の反復による凍結乾燥により調製され得る。好ましい態様において、リポソームは、超音波処理により形成される。リポソームは、タマネギのように多くの層を有する多層状、または単層状であり得る。リポソームは、大型または小型であり得る。継続的な高せん断力の超音波処理は、より小さな単層状のリポソームを形成する傾向がある。
当業者に明らかなように、リポソーム形成を支配するパラメータのすべてが、異なり得る。これらのパラメータは、温度、pH、メチオニン化合物の濃度、脂質の濃度および組成、多価カチオンの濃度、混合率、溶媒の存在および濃度を含むがこれらに限定されない。
他の態様において、本開示の抗原結合分子または治療組み合わせは、マイクロエマルジョンとして細胞に送達され得る。マイクロエマルジョンは、一般に、水溶液、界面活性剤および「油」を含む透明な、熱力学的に安定な溶液である。この場合、「油」は、超臨界流体相である。界面活性剤は、油・水界面に存在する。本明細書に記載されるものまたはそれ以外の当技術分野で公知のものを含む、任意の様々な界面活性剤が、マイクロエマルジョン形成における使用に適する。本開示における使用に適した水性マイクロドメインは、約5 nm～約100 nmの特徴的な構造上の寸法を有するであろう。このサイズの凝集体は、可視光の低散乱体であり、したがって、これらの溶液は光学的に透明である。当業者に理解されるように、マイクロエマルジョンは、球体、ロッドまたはディスク形状の凝集体を含む多くの異なる微視的構造を有し得、かつ有するであろう。1つの態様において、構造は、概ね球形または円筒形の物体である最も単純なマイクロエマルジョン構造であるミセルであり得る。ミセルは、水中の油滴のようなものであり、逆ミセルは、油中の水滴のようなものである。代替の態様において、マイクロエマルジョン構造は、層状である。それは、界面活性剤の層により隔てられた水および油の連続する層を含む。マイクロエマルジョンの「油」は、最適には、リン脂質を含む。リポソームに関して上で詳述されている任意のリン脂質が、マイクロエマルジョンに関する態様に適する。本開示の抗体は、一般に当該分野で公知の任意の方法によりマイクロエマルジョンにカプセル化され得る。
さらに他の態様において、本発明の抗原結合分子または治療組み合わせは、樹状高分子またはデンドリマーで送達され得る。一般的に言うと、デンドリマーは、各枝が一定長の後に2つの新たな枝（分子）に分かれるつなぎ合わされた分子鎖である枝分かれした木のような分子である。この枝分かれは、枝（分子）が密集しそのキャノピーが球体を形成するまで続く。通常、デンドリマーの特性は、それらの表面の官能基によって決定される。例えば、親水性末端基、例えば、カルボキシル基は、典型的に、水溶性デンドリマーを生成する。あるいは、リン脂質は、皮膚を通じた吸収を促進するようデンドリマーの表面に組み込まれ得る。リポソームの態様における使用について詳述されているリン脂質はいずれも、デンドリマーの態様における使用に適する。当技術分野で一般に公知となっている任意の方法が、デンドリマーを作製するためおよび本開示の抗体をその中にカプセル化するために使用され得る。例えば、デンドリマーは、反応工程の反復シーケンスにより作製され得、各々の追加の反復がより高次のデンドリマーをもたらす。その結果、それらは、ほぼ均一のサイズおよび形状の、規則正しい高度に枝分かれした3D構造を有する。さらに、デンドリマーの最終サイズは、典型的に、合成の間に使用される反復工程の回数により制御される。様々なデンドリマーサイズが、本開示における使用に適する。通常、デンドリマーのサイズは、約1 nm～約100 nmの範囲であり得る。
本開示のRANKアンタゴニスト抗原結合分子または治療組み合わせは、当技術分野で公知の様々な方法により投与され得るが、多くの治療用途において、好ましい投与経路／様式は、静脈内注射または輸注である。1つの態様において、RANKアンタゴニスト抗原結合分子または治療組み合わせは、約35～440 mg/m2、好ましくは約70～310 mg/m2、より好ましくは約110～130 mg/m2の用量に到達するよう、20 mg/分超、例えば、20～40 mg/分、好ましくは40 mg/分以上の速度での静脈内輸注により投与される。別の態様において、RANKアンタゴニスト抗原結合分子または治療組み合わせは、約1～100 mg/m2、好ましくは約5～50 mg/m2、約7～25 mg/m2、より好ましくは約10 mg/m2の用量に到達するよう、10 mg/分未満、好ましくは5 mg/分以下の速度での静脈内輸注により投与される。当業者により理解されるであろうが、投与経路および／または様式は、求められる結果に依存して異なり得る。特定の態様において、活性化合物は、その化合物を即時放出から保護する担体を用いて調製され得る、例えば、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤であり得る。生分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸が使用され得る。そのような製剤の調製のための多くの方法は、特許化されているまたは一般に当業者に公知となっている。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照のこと。
特定の態様において、RANKアンタゴニスト抗原結合分子または治療組み合わせは、例えば、不活性希釈剤または吸収性食用担体を用いて、経口投与され得る。化合物（および、所望の場合、他の成分）はまた、ハードもしくはソフトシェルゼラチンカプセルに内包され得、錠剤中に圧縮され得、または対象の食事に直接組み込まれ得る。経口治療投与の場合、化合物は、賦形剤と共に組み込まれ得、消化性錠剤、口腔錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁物、シロップ、ウエハース等の形態で使用され得る。本発明の化合物を非経口以外の投与により投与するために、その不活性化を防ぐ物質でその化合物をコーティングすること、またはその不活性化を防ぐ物質と共に化合物を共投与することが必要であり得る。薬学的組成物はまた、当技術分野で公知の医療デバイスを用いて投与され得る。
投薬レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するよう調節される。例えば、単回のボーラスが投与され得、複数の分割された用量が時間をかけて投与され得、または用量は治療状況の緊急性に比例して減少もしくは増加され得る。投与の容易性および用量の均一性のために、非経口組成物を投薬単位で製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される投薬単位形態は、処置される対象への統一された投薬に適する物理的に別々の単位を表し、各単位は、必要とされる薬学的担体と共に、所望の治療効果を生ずるよう計算された既定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態の詳細は、（a）活性化合物の特有の特徴および達成されるべき具体的治療効果、および（b）個体における過敏症の処置のためにそのような活性化合物を配合する当技術分野に固有の制約により決定され、かつ直接的に依存する。
RANKアンタゴニスト抗原結合分子または治療組み合わせの有効量の例示的、非限定的な範囲は、0.1～30 mg/kg、より好ましくは1～25 mg/kgである。RANKアンタゴニスト抗原結合分子または治療組み合わせの用量および治療レジメンは、当業者が決定することができる。特定の態様において、RANKアンタゴニスト抗原結合分子または治療組み合わせは、約1～40 mg/kg、例えば、1～30 mg/kg、例えば、約5～25 mg/kg、約10～20 mg/kg、約1～5 mg/kg、1～10 mg/kg、5～15 mg/kg、10～20 mg/kg、15～25 mg/kg、または約3 mg/kgの用量で、注射により（例えば、皮下または静脈内）投与される。投薬スケジュールは、例えば、週に1回～2、3もしくは4週に1回まで様々であり得る。1つの態様において、RANKアンタゴニスト抗原結合分子または治療組み合わせは、2週に1回、約10～20 mg/kgの用量で投与される。
RANKアンタゴニスト抗原結合分子または治療組み合わせは、約35～440 mg/m2、好ましくは約70～310 mg/m2、より好ましくは約110～130 mg/m2の用量に到達するよう20 mg/分超、例えば、20～40 mg/分、好ましくは40 mg/分以上の速度で静脈内輸注により投与され得る。態様において、約110～130 mg/m2の輸注速度は、約3 mg/kgのレベルを達成する。1つの態様において、RANKアンタゴニスト抗原結合分子または治療組み合わせは、約3～800 mg、例えば、約3、20、80、240、または800 mgの用量で（例えば、静脈内）投与される。特定の態様において、RANKアンタゴニスト抗原結合分子または治療組み合わせは、約20～800 mg、例えば、約3、20、80、240、または800 mgの用量で単独投与される。他の態様において、RANKアンタゴニスト抗原結合分子または治療組み合わせは、約3～240 mg、例えば、約3、20、80、または240 mgの用量で、第2の薬剤または治療様式、例えば、本明細書に記載される補助的薬剤または治療様式と組み合わせて投与される。1つの態様において、RANKアンタゴニスト抗原結合分子または治療組み合わせは、例えば、最大96週、各8週サイクルの間、2週間ごと（例えば、1、3、5、7週の間）に投与される。
RANKアンタゴニスト抗原結合分子または治療組み合わせは、約35～440 mg/m2、好ましくは約70～310 mg/m2、より好ましくは約110～130 mg/m2の用量に到達するよう20 mg/分超、例えば、20～40 mg/分、好ましくは40 mg/分以上の速度で静脈内輸注により投与され得る。態様において、約110～130 mg/m2の輸注速度は、約3 mg/kgのレベルを達成する。他の態様において、RANKアンタゴニスト抗原結合分子または治療組み合わせは、約1～100 mg/m2、例えば、約5～50 mg/m2、約7～25 mg/m2、より好ましくは約10 mg/m2の用量に到達するよう、10 mg/分未満、例えば、5 mg/分以下の速度で静脈内輸注により投与される。いくつかの態様において、RANKアンタゴニスト抗原結合分子または治療組み合わせは、約30分の時間をかけて輸注される。
用量値は、軽減したい状態のタイプおよび重篤度により異なり得ることに留意されたい。さらに、任意の個々の対象に対して、詳細な投薬レジメンは、個々のニーズおよび組成物を投与するまたは投与を監督する者の専門的判断にしたがい時間と共に調節されるべきであること、ならびに本明細書に示される用量の範囲は例にすぎず、特許請求の範囲に記載の組成物の範囲または実施を限定することを意図したものではないことが理解されるべきである。
本発明の薬学的組成物は、有効量のRANKアンタゴニスト抗原結合分子または治療組み合わせを含み得る。有効量は、本発明のRANKアンタゴニスト抗原結合分子または治療組み合わせの「治療有効量」または「予防有効量」であり得る。「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するために必要な用量および期間において効果的な量を表す。RANKアンタゴニスト抗原結合分子または治療組み合わせの治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発するRANKアンタゴニスト抗原結合分子または治療組み合わせの能力等の要因によって異なり得る。治療有効量はまた、RANKアンタゴニスト抗原結合分子または治療組み合わせの任意の毒性または有害効果をその治療的に有益な効果が上回るものである。「治療有効用量」は、好ましくは、測定可能なパラメータ、例えば、破骨細胞増殖または腫瘍成長率を、未処置対象と比較して少なくとも約20％、より好ましくは少なくとも約40％、さらにより好ましくは少なくとも約60％、さらにより好ましくは少なくとも約80％阻害する。測定可能なパラメータ、例えば、骨減少障害、ミオパチーまたは癌を阻害する化合物の能力は、ヒト骨減少障害、ミオパチーまたは癌における効能を予測する動物モデルシステムにおいて評価され得る。あるいは、組成物のこの特性は、例えば、当業者に公知のアッセイによってインビトロで阻害する化合物の能力を試験することによって評価され得る。
これに対して、「予防有効量」は、所望の予防効果を達成するために必要な用量および期間において効果的な量を表す。典型的に、予防用量は疾患前または疾患の初期段階の対象に使用されるので、予防有効量は、治療有効量よりも少量であろう。
8. 補助的処置
本明細書に開示されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子、治療組み合わせおよび薬学的組成物は、1つまたは複数の追加の治療剤（例えば、骨吸収剤、抗癌剤、細胞傷害もしくは細胞増殖抑制剤、ホルモン処置、ワクチン、および／または他の免疫療法）と共投与され得る。あるいはまたは加えて、RANKアンタゴニスト抗原結合分子、治療組み合わせおよび薬学的組成物は、手術、放射線照射、凍結手術、および／または温熱療法を含む、他の治療処置様式と組み合わせて投与される。そのような併用療法は、より低用量の投与される治療剤を利用し、それによって可能性のある毒性または合併症を回避する点で有利であり得る。
本発明のRANKアンタゴニスト抗原結合分子と共に使用されることが想定される併用療法は、骨抗吸収剤、例えば、非限定的に、BMP-1～BMP-12と呼ばれる骨形成因子；形質転換成長因子-βおよびTGF-βファミリーメンバー；線維芽細胞成長因子FGF-1～FGF-10；インターロイキン-1阻害剤（IL-1ra、IL-1に対する抗体およびIL-1受容体に対する抗体を含む）；TNFα阻害剤（エタネルセプト、アダリムマブおよびインフリキシマブを含む）；RANKリガンド阻害剤（可溶性RANK、オステオプロテゲリンおよびRANKリガンドに特異的に結合するアンタゴニスト抗体を含む）、Dkk-1阻害剤（例えば、抗Dkk-1抗体）副甲状腺ホルモン、Eシリーズプロスタグランジン、ビスホスホネートならびに骨強化ミネラル、例えば、フッ化物およびカルシウムを含む。RANKアンタゴニスト抗原結合分子と組み合わせて使用され得る同化剤は、副甲状腺ホルモンおよびインスリン様成長因子（IGF）を含み、後者の薬剤は好ましくはIGF結合タンパク質と複合体化される。そのような併用処置に適したIL-1受容体アンタゴニストは、WO89/11540に記載されており、適切な可溶性TNF受容体-1は、WO98/01555に記載されている。例示的なRANKリガンドアンタゴニストは、例えば、WO 03/086289、WO 03/002713、米国特許第6,740,511号および同第6,479,635号に開示されている。本発明のRANKアンタゴニスト抗原結合分子との使用のために包含される代替の併用療法は、ミオパチー治療剤を含み、その具体例は、ニフロキサジド、ケトプロフェン、スルファサラジン、5,15-ジフェニルポルフィリン、パルギリン塩酸塩、メトラゾン、ジメリジン2塩酸塩1水和物、ミコナゾール、チクロピジン塩酸塩、イオヘキソール、ベノキシネート塩酸塩、ニモジピン、トラニルシプロミン塩酸塩、およびAG490を含む。
他の例において、本明細書に開示される治療組み合わせは、任意の1つもしくは複数の抗体分子、化学療法、他の抗癌療法（例えば、標的指向抗癌療法、もしくは腫瘍溶解薬）、細胞傷害剤、免疫ベースの療法（例えば、サイトカイン）、手術および／または放射線照射処置を含む、標準的な癌処置と組み合わされ得る。組み合わせて投与され得る例示的な細胞傷害剤は、抗微小管剤、トポイソメラーゼ阻害剤、代謝拮抗物質、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、インターカレート剤、シグナル伝達経路と干渉することができる薬剤、アポトーシスを促進する薬剤、プロテアソーム阻害剤、および放射線照射（例えば、局部または全身放射線照射）を含む。
いくつかの態様において、治療組み合わせは、対象の処置における標準としてすでに従来から使用されている化学療法剤と組み合わせて使用される。適切な化学療法剤は、アナストロゾール（ARIMIDEX）、ビカルタミド（CASODEX）、ブレオマイシン硫酸塩（BLENOXANE）、ブスルファン（MYLERAN）、ブスルファン注射（BUSULFEX）、カペシタビン（XELODA）、N4-ペントキシカルボニル-5-デオキシ-5-フルオロシチジン、カルボプラチン（PARAPLATIN）、カルムスチン（BICNU）、クロラムブシル（LEUKERAN）、シスプラチン（PLATINOL）、クラドリビン（LEUSTATIN）、シクロホスファミド（CYTOXANもしくはNEOSAR）、シタラビン、シトシンアラビノシド（CYTOSAR-U）、シタラビンリポソーム注射（DEPOCYT）、ダカルバジ（DTIC-DOME）、ダクチノマイシン（アクチノマイシンD、Cosmegan）、ダウノルビシン塩酸塩（CERUBIDINE）、ダウノルビシンクエン酸塩リポソーム注射（DAUNOXOME）、デキサメタゾン、ドセタキセル（TAXOTERE）、ドキソルビシン塩酸塩（ADRIAMYCIN、RUBEX）、エトポシド（VEPESID）、フルダラビンリン酸塩（FLUDARA）、5-フルオロウラシル（ADRUCIL、EFUDEX）、フルタミド（EULEXIN）、テザシチビン、ゲムシタビン（GEMZAR）、ヒドロキシ尿素（HYDREA）、イダルビシン（IDAMYCIN）、イホスファミド（IFEX）、イリノテカン（CAMPTOSAR）、L-アスパラギナーゼ（ELSPAR）、ロイコボリンカルシウム、メルファラン（ALKERAN）、6-メルカプトプリン（PURINETHOL）、メトトレキサート（FOLEX）、ミトキサントロン（NOVANTRONE）、マイロターグ、パクリタキセル（TAXOL）、nab-パクリタキセル（ABRAXANE）、フェニックス（イットリウム90/MX-DTPA）、ペントスタチン、ポリフェプロサン20およびカルムスチンインプラント（GLIADELウエハー）、タモキシフェンクエン酸塩（NOLVADEX）、テニポシド（VUMON）、6-チオグアニン、チオテパ、チラパザミン（TIRAZONE）、注射用トポテカン塩酸塩（HYCAMPTIN）、ビンブラスチン（VELBAN）、ビンクリスチン（ONCOVIN）、ならびにビノレルビン（NAVELBINE）を含むがこれらに限定されない。
例示的なアルキル化剤は、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素およびトリアゼン）：ウラシルマスタード（AMINOURACIL MUSTARD、CHLORETHAMINACIL、DEMETHYLDOPAN、DESMETHYLDOPAN、HAEMANTHAMINE、NORDOPAN、URACIL NITROGEN MUSTARD、URACILLOST、URACILMOSTAZA、URAMUSTIN、URAMUSTINE）、クロルメチン（MUSTARGEN）、シクロホスファミド（CYTOXAN、NEOSAR、CLAFEN、ENDOXAN、PROCYTOX、REVIMMUNE）、ダカルバジン（DTIC-DOME）、イホスファミド（MITOXANA）、メルファラン（ALKERAN）、クロラムブシル（LEUKERAN）、ピポブロマン（AMEDEL、VERCYTE）、トリエチレンメラミン（HEMEL、HEXALEN、HEXASTAT）、トリエチレンチオホスホラミン、テモゾロミド（TEMODARおよびTEMODAL）、チオテパ（THIOPLEX）、ブスルファン（BUSILVEX、MYLERAN）、カルムスチン（BICNU）、ロムスチン（CCNUCEENU）、ストレプトゾシン（ZANOSAR）、オキサリプラチン（ELOXATIN）；ダクチノマイシン（アクチノマイシン-Dとしても公知、COSMEGEN）；メルファラン（L-PAM、L-サルコリシン、フェニルアラニンマスタード、ALKERAN）、アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン（HMM）、HEXALEN）、ベンダムスチン（TREANDA）、ブスルファン（BUSULFEXおよびMYLERAN）、カルボプラチン（PARAPLATIN）、シスプラチン（CDDP、PLATINOLおよびPLATINOL-AQ）、クロラムブシル（LEUKERAN）、ダカルバジン（DTIC、DICおよびイミダゾールカルボキサミド、DTIC-DOME）、アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン（HMM）、HEXALEN）、イホスファミド（IFEX）、プレドヌムスチン（prednumustine）、プロカルバジン（MATULANE）、ならびにチオテパ（チオホスファミド、TESPAおよびTSPA、THIOPLEX）を含む。
例示的なアントラサイクリンは、例えば、ドキソルビシン（ADRIAMYCINおよびRUBEX）、ブレオマイシン（LENOXANE）、ダウノルビシン（ダウノルビシン塩酸塩、ダウノマイシン、ルビドマイシン塩酸塩およびCERUBIDINE）、ダウノルビシンリポソーム型（ダウノルビシンクエン酸塩リポソーム、およびDAUNOXOME）、ミトキサントロン（DHADおよびNOVANTRONE）、エピルビシン（ELLENCE）、イダルビシン（IDAMYCINおよびIDAMYCIN PFS）、マイトマイシンC（MUTAMYCIN）、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、ラビドマイシン、ならびにデスアセチルラビドマイシンを含む。
本明細書の上および他所に開示される薬剤、抗体および方法と組み合わせて使用され得る例示的なビンカアルカロイドは、ビノレルビン酒石酸塩（NAVELBINE）、ビンクリスチン（ONCOVIN）、ビンデシン（ELDISINE）、およびビンブラスチン（ビンブラスチン硫酸塩、ビンカロイコブラスチン、VLB、ALKABAN-AQおよびVELBAN）を含むがこれらに限定されない。
本発明において使用され得る例示的なプロテアソーム阻害剤は、ボルテゾミブ（VELCADE）、カルフィルゾミブ（PX-171-007）、マリゾミブ（NPI-0052）、イキサゾミブクエン酸塩（MLN-9708）、デランゾミブ（CEP-18770）、O-メチル-N-[(2-メチル-5-チアゾリル)カルボニル]-L-セリル-O-メチル-N-[(1S)-2-[(2R)-2-メチル-2-オキシラニル]-2-オキソ-1-(フェニルメチル)エチル]-L-セリンアミド（ONX-0912）；ダノプレビル（RG7227、CAS 850876-88-9）、イキサゾミブ（MLN2238、CAS 1072833-77-2）、および(S)-N-[(フェニルメトキシ)カルボニル]-L-ロイシル-N-(1-ホルミル-3-メチルブチル)-L-ロイシンアミド（MG-132、CAS 133407-82-6）を含むがこれらに限定されない。
いくつかの態様において、治療組み合わせは、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、受容体チロシンキナーゼ（RTK）阻害剤）と組み合わせて使用され得る。例示的なチロシンキナーゼ阻害剤は、上皮成長因子（EGF）経路阻害剤（例えば、上皮成長因子受容体（EGFR）阻害剤）、血管内皮成長因子（VEGF）経路阻害剤（例えば、血管内皮成長因子受容体（VEGFR）阻害剤（例えば、VEGFR-1阻害剤、VEGFR-2阻害剤、VEGFR-3阻害剤））、血小板由来成長因子（PDGF）経路阻害剤（例えば、血小板由来成長因子受容体（PDGFR）阻害剤（例えば、PDGFR-β阻害剤））、RAF-1阻害剤、KIT阻害剤およびRET阻害剤を含むがこれらに限定されない。
いくつかの態様において、治療組み合わせは、ヘッジホッグ経路阻害剤と組み合わせて使用される。癌の処置において効果的であることが知られている適切なヘッジホッグ阻害剤は、アキシチニブ（AG013736）、ボスチニブ（SKI-606）、セジラニブ（RECENTIN、AZD2171）、ダサチニブ（SPRYCEL、BMS-354825）、エルロチニブ（TARCEVA）、ゲフィチニブ（IRESSA）、イマチニブ（GLEEVEC、CGP57148B、STI-571）、ラパチニブ（TYKERB、TYVERB）、レスタウルチニブ（CEP-701）、ネラチニブ（HKI-272）、ニロチニブ（TASIGNA）、セマキサニブ（セマキシニブ、SU5416）、スニチニブ（SUTENT、SU11248）、トセラニブ（PALLADIA）、バンデタニブ（ZACTIMA、ZD6474）、バタラニブ（PTK787、PTK/ZK）、トラスツズマブ（HERCEPTIN）、ベバシズマブ（AVASTIN）、リツキシマブ（RITUXAN）、セツキシマブ（ERBITUX）、パニツムマブ（VECTIBIX）、ラニビズマブ（Lucentis）、ニロチニブ（TASIGNA）、ソラフェニブ（NEXAVAR）、アレムツズマブ（CAMPATH）、ゲムツズマブオゾガマイシン（MYLOTARG）、ENMD-2076、PCI-32765、AC220、ドビチニブ乳酸塩（TKI258、CHIR-258）、BIBW 2992（TOVOK（商標））、SGX523、PF-04217903、PF-02341066、PF-299804、BMS-777607、ABT-869、MP470、BIBF 1120（VARGATEF（登録商標））、AP24534、JNJ-26483327、MGCD265、DCC-2036、BMS-690154、CEP-11981、チボザニブ（AV-951）、OSI-930、MM-121、XL-184、XL-647、XL228、AEE788、AG-490、AST-6、BMS-599626、CUDC-101、PD153035、ペリチニブ（EKB-569）、バンデタニブ（ザクチマ）、WZ3146、WZ4002、WZ8040、ABT-869（リニファニブ）、AEE788、AP24534（ポナチニブ）、AV-951（チボザニブ）、アキシチニブ、BAY 73-4506（レゴラフェニブ）、ブリバニブアラニンエステル（BMS-582664）、ブリバニブ（BMS-540215）、セジラニブ（AZD2171）、CHIR-258（ドビチニブ）、CP 673451、CYC116、E7080、Ki8751、マシチニブ（AB1010）、MGCD-265、モテサニブ2リン酸塩（AMG-706）、MP-470、OSI-930、パゾパニブ塩酸塩、PD173074、ソラフェニブトシル酸塩（Bay 43-9006）、SU 5402、TSU-68（SU6668）、バタラニブ、XL880（GSK1363089、EXEL-2880）、ビスモデギブ（2-クロロ-N-[4-クロロ-3-(2-ピリジニル)フェニル]-4-(メチルスルホニル)-ベンズアミド、GDC-0449（PCT公開番号WO 06/028958に開示）、1-(4-クロロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル)-3-((3-(4-フルオロフェニル)-3,4-ジヒドロ-4-オキソ-2-キナゾリニル)メチル)-ウレア（CAS 330796-24-2）、N-[(2S,3R,3'R,3aS,4'aR,6S,6'aR,6'bS,7aR,12'aS,12'bS)-2',3',3a,4,4',4'a,5,5',6,6',6'a,6'b,7,7',7a,8',10',12',12'a,12'b-エイコサヒドロ-3,6,11',12'b-テトラメチルスピロ[フロ[3,2-b]ピリジン-2(3H),9'(1'H)-ナフト[2,1-a]アズレン]-3'-イル]-メタンスルホンアミド（IPI926、CAS 1037210-93-7）、4-フルオロ-N-メチル-N-[1-[4-(1-メチル-1H-ピラゾール-5-イル)-1-フタラジニル]-4-ピペリジニル]-2-(トリフルオロメチル)-ベンズアミド（LY2940680、CAS 1258861-20-9）、エリスモデギブ（LDE225）を含むがこれらに限定されない。
特定の態様において、治療組み合わせは、ベバシズマブ（AVASTIN）、アキシチニブ（INLYTA）、ブリバニブアラニンエステル（BMS-582664、(S)-((R)-1-(4-(4-フルオロ-2-メチル-1H-インドール-5-イルオキシ)-5-メチルピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-6-イルオキシ)プロパン-2-イル)2-アミノプロパノエート）、ソラフェニブ（NEXAVAR）、パゾパニブ（VOTRIENT）、スニチニブリンゴ酸塩（SUTENT）、セジラニブ、（AZD2171、CAS 288383-20-1）、バルガテフ（vargatef）（BIBF1120、CAS 928326-83-4）、フォレチニブ（foretinib）（GSK1363089）、テラチニブ（BAY57-9352、CAS 332012-40-5）、アパチニブ（YN968D1、CAS 811803-05-1）、イマチニブ（GLEEVEC）、ポナチニブ（AP24534、CAS 943319-70-8）、チボザニブ（AV951、CAS 475108-18-0）、レゴラフェニブ（BAY73-4506、CAS 755037-03-7）、バタラニブ2塩酸塩（PTK787、CAS 212141-51-0）、ブリバニブ（BMS-540215、CAS 649735-46-6）、バンデタニブ（CAPRELSAまたはAZD6474）、モテサニブ2リン酸塩（AMG706、CAS 857876-30-3、N-(2,3-ジヒドロ-3,3-ジメチル-1H-インドール-6-イル)-2-[(4-ピリジニルメチル)アミノ]-3-ピリジンカルボキサミド、国際PCT公開番号WO 02/066470に記載）、ドビチニブ2乳酸塩（TKI258、CAS 852433-84-2）、リンファニブ（ABT869、CAS 796967-16-3）、カボザンチニブ（XL184、CAS 849217-68-1）、レスタウルチニブ（CAS 111358-88-4）、N-[5-[[[5-(1,1-ジメチルエチル)-2-オキサゾリル]メチル]チオ]-2-チアゾリル]-4-ピペリジンカルボキサミド（BMS38703、CAS 345627-80-7）、(3R,4R)-4-アミノ-1-((4-((3-メトキシフェニル)アミノ)ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-5-イル)メチル)ピペリジン-3-オール（BMS690514）、N-(3,4-ジクロロ-2-フルオロフェニル)-6-メトキシ-7-[[(3aα,5β,6aα)-オクタヒドロ-2-メチルシクロペンタ[c]ピロール-5-イル]メトキシ]-4-キナゾリンアミン（XL647、CAS 781613-23-8）、4-メチル-3-[[1-メチル-6-(3-ピリジニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-イル]アミノ]-N-[3-(トリフルオロメチル)フェニル]-ベンズアミド（BHG712、CAS 940310-85-0）、およびアフリベルセプト（EYLEA）を含むがこれらに限定されない血管内皮成長因子（VEGF）受容体阻害剤と組み合わせて使用される。
いくつかの態様において、治療組み合わせは、PI3K阻害剤と組み合わせて使用される。1つの態様において、PI3K阻害剤は、PI3Kのデルタおよびガンマアイソフォームの阻害剤である。組み合わせて使用され得る例示的なPI3K阻害剤は、例えば、その内容が参照により本明細書に組み入れられるWO2010/036380、WO2010/006086、WO09/114870、WO05/113556に記載されている。適切に、PI3K阻害剤は、4-[2-(1H-インダゾール-4-イル)-6-[[4-(メチルスルホニル)ピペラジン-1-イル]メチル]チエノ[3,2-d]ピリミジン-4-イル]モルホリン（GDC-0941としても公知（国際PCT公開番号WO 09/036082およびWO 09/055730に記載））、2-メチル-2-[4-[3-メチル-2-オキソ-8-(キノリン-3-イル)-2,3-ジヒドロイミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]フェニル]プロピオニトリル（BEZ235またはNVP-BEZ 235、国際PCT公開番号WO06/122806に記載）；4-(トリフルオロメチル)-5-(2,6-ジモルホリノピリミジン-4-イル)ピリジン-2-アミン（BKM120またはNVP-BKM120、国際PCT公開番号WO2007/084786に記載）、トザセルチブ（tozasertib）（VX680またはMK-0457、CAS 639089-54-6）；(5Z)-5-[[4-(4-ピリジニル)-6-キノリニル]メチレン]-2,4-チアゾリジンジオン（GSK1059615、CAS 958852-01-2）；(1E,4S,4aR,5R,6aS,9aR)-5-(アセチルオキシ)-1-[(ジ-2-プロペニルアミノ)メチレン]-4,4a,5,6,6a,8,9,9a-オクタヒドロ-11-ヒドロキシ-4-(メトキシメチル)-4a,6a-ジメチル-シクロペンタ[5,6]ナフト[1,2-c]ピラン-2,7,10(1H)-トリオン（PX866、CAS 502632-66-8）；8-フェニル-2-(モルホリン-4-イル)-クロメン-4-オン（LY294002、CAS 154447-36-6）、2-アミノ-8-エチル-4-メチル-6-(1H-ピラゾール-5-イル)ピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン（SAR 245409またはXL 765）、1,3-ジヒドロ-8-(6-メトキシ-3-ピリジニル)-3-メチル-1-[4-(1-ピペラジニル)-3-(トリフルオロメチル)フェニル]-2H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-2-オン, (2Z)-2-ブテンジオエート（1:1）（BGT 226）、5-フルオロ-3-フェニル-2-[(1S)-1-(9H-プリン-6-イルアミノ)エチル]-4(3H)-キナゾリノン（CAL101）、2-アミノ-N-[3-[N-[3-[(2-クロロ-5-メトキシフェニル)アミノ]キノキサリン-2-イル]スルファモイル]フェニル]-2-メチルプロパンアミド（SAR 245408またはXL 147）、および(S)-ピロリジン-1,2-ジカルボン酸2-アミド1-({4-メチル-5-[2-(2,2,2-トリフルオロ-1,1-ジメチル-エチル)-ピリジン-4-イル]-チアゾール-2-イル}-アミド)（BYL719）を含む。
いくつかの態様において、治療組み合わせは、mTOR阻害剤、例えば、ラパマイシン、テムシロリムス（TORISEL）、AZD8055、BEZ235、BGT226、XL765、PF-4691502、GDC0980、SF1126、OSI-027、GSK1059615、KU-0063794、WYE-354、Palomid 529（P529）、PF-04691502、またはPKI-587、リダホロリムス（以前はデフェロリムスとして知られていた、(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2 [(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-ジヒドロキシ-19,30-ジメトキシ-15,17,21,23,29,35-ヘキサメチル-2,3,10,14,20-ペンタオキソ-11,36-ジオキサ-4-アザトリシクロ[30.3.1.04,9]ヘキサトリアコンタ-16,24,26,28-テトラエン-12-イル]プロピル]-2-メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネート、AP23573およびMK8669としても公知、およびPCT公開番号WO03/064383に記載されるもの）、エベロリムス（ARINITORまたはRAD001）、ラパマイシン（AY22989、SIROLIMUS）、シマピモド（simapimod）（CAS 164301-51-3）、エムシロリムス、(5-{2,4-Bis[(3S)-3-メチルモルホリン-4-イル]ピリド[2,3-d]ピリミジン-7-イル}-2-メトキシフェニル)メタノール（AZD8055）、2-アミノ-8-[トランス-4-(2-ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]-6-(6-メトキシ-3-ピリジニル)-4-メチル-ピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オン（PF04691502、CAS 1013101-36-4）、およびN2-[1,4-ジオキソ-4-[[4-(4-オキソ-8-フェニル-4H-1-ベンゾピラン-2-イル)モルホリニウム-4-イル]メトキシ]ブチル]-L-アルギニルグリシル-L-α-アスパルチルL-セリン-、内塩（SF1126、CAS 936487-67-1）、(1r,4r)-4-(4-アミノ-5-(7-メトキシ-1H-インドール-2-イル)イミダゾ[1,5-f][1,2,4]トリアジン-7-イル)シクロヘキサンカルボン酸（OSI-027）；ならびにXL765の1つまたは複数から選択される1つまたは複数のmTOR阻害剤と組み合わせて使用される。
いくつかの態様において、治療組み合わせは、BRAF阻害剤、例えば、GSK2118436、RG7204、PLX4032、GDC-0879、PLX4720、およびソラフェニブトシル酸塩（Bay 43-9006）と組み合わせて使用される。さらなる態様において、BRAF阻害剤は、レゴラフェニブ（BAY73-4506、CAS 755037-03-7）、ツビザニブ（AV951、CAS 475108-18-0）、ベムラフェニブ（ZELBORAF、PLX-4032、CAS 918504-65-1）、エンコラフェニブ（LGX818としても公知）、1-メチル-5-[[2-[5-(トリフルオロメチル)-1H-イミダゾール-2-イル]-4-ピリジニル]オキシ]-N-[4-(トリフルオロメチル)フェニル-1H-ベンズイミダゾール-2-アミン（RAF265、CAS 927880-90-8）、5-[1-(2-ヒドロキシエチル)-3-(ピリジン-4-イル)-1H-ピラゾール-4-イル]-2,3-ジヒドロインデン-1-オンオキシム（GDC-0879、CAS 905281-76-7）、5-[2-[4-[2-(ジメチルアミノ)エトキシ]フェニル]-5-(4-ピリジニル)-1H-イミダゾール-4-イル]-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-オンオキシム（GSK2118436またはSB590885）、(+/-)-メチル(5-(2-(5-クロロ-2-メチルフェニル)-1-ヒドロキシ-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-1-イル)-1H-ベンズイミダゾール-2-イル)カルバメート（XL-281およびBMS908662としても公知）、ならびにN-(3-(5-クロロ-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-カルボニル)-2,4-ジフルオロフェニル)プロパン-1-スルホンアミド（PLX4720としても公知）を含むがこれらに限定されない。
治療組み合わせはまた、MEK阻害剤と組み合わせて使用され得る。セルメチニブ（5-[(4-ブロモ-2-クロロフェニル)アミノ]-4-フルオロ-N-(2-ヒドロキシエトキシ)-1-メチル-1H-ベンズイミダゾール-6-カルボキサミド（AZD6244またはARRY 142886、PCT公開番号WO2003/077914に記載）、トラメチニブジメチルスルホキシド（GSK-1120212、CAS 1204531-25-80）、RDEA436、N-[3,4-ジフルオロ-2-[(2-フルオロ-4-ヨードフェニル)アミノ]-6-メトキシフェニル]-1-[(2R)-2,3-ジヒドロキシプロピル]-シクロプロパンスルホンアミド（RDEA119またはBAY869766、PCT公開番号WO2007/014011に記載）、AS703026、BIX 02188、BIX 02189、2-[(2-クロロ-4-ヨードフェニル)アミノ]-N-(シクロプロピルメトキシ)-3,4-ジフルオロ-ベンズアミド（CI-1040またはPD184352としても公知、PCT公開番号WO2000/035436に記載）、N-[(2R)-2,3-ジヒドロキシプロポキシ]-3,4-ジフルオロ-2-[(2-フルオロ-4-ヨードフェニル)アミノ]-ベンズアミド（PD0325901およびPCT公開番号WO2002/006213に記載）、2’-アミノ-3’-メトキシフラボン（PD98059)）、2,3-ビス[アミノ[(2-アミノフェニル)チオ]メチレン]-ブタンジニトリル（U0126および米国特許第2,779,780号に記載）、XL-518（GDC-0973、カタログ番号1029872-29-4）、G-38963、およびG02443714（AS703206としても公知）、またはそれらの薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含むがこれらに限定されない任意のMEK阻害剤が、組み合わせて使用され得る。他のMEK阻害剤は、その内容が参照により本明細書に組み入れられるWO2013/019906、WO03/077914、WO2005/121142、WO2007/04415、WO2008/024725およびWO2009/085983に開示されている。MEK阻害剤のさらなる例は、ベニメチニブ（6-(4-ブロモ-2-フルオロフェニルアミノ)-7-フルオロ-3-メチル-3H-ベンゾイミダゾール-5-カルボン酸(2-ヒドロキシエトキシ(hydroxyethyoxy))-アミド（MEK162、CAS 1073666-70-2、PCT公開番号WO2003/077914に記載）、2,3-ビス[アミノ[(2-アミノフェニル)チオ]メチレン]-ブタンジニトリル（U0126および米国特許第2,779,780号に記載）、 (3S,4R,5Z,8S,9S,11E)-14-(エチルアミノ)-8,9,16-トリヒドロキシ-3,4-ジメチル-3,4,9,19-テトラヒドロ-1H-2-ベンゾキサシクロテトラデシン-1,7(8H)-ジオン]（E6201、PCT公開番号WO2003/076424に記載）、ベムラフェニブ（PLX-4032、CAS 918504-65-1）、(R)-3-(2,3-ジヒドロキシプロピル)-6-フルオロ-5-(2-フルオロ-4-ヨードフェニルアミノ)-8-メチルピリド[2,3-d]ピリミジン-4,7(3H,8H)-ジオン（TAK-733、CAS 1035555-63-5）、ピマセルチブ（pimasertib）（AS-703026、CAS 1204531-26-9）、2-(2-フルオロ-4-ヨードフェニルアミノ)-N-(2-ヒドロキシエトキシ)-1,5-ジメチル-6-オキソ-1,6-ジヒドロピリジン-3-カルボキサミド（AZD 8330）、および3,4-ジフルオロ-2-[(2-フルオロ-4-ヨードフェニル)アミノ]-N-(2-ヒドロキシエトキシ)-5-[(3-オキソ-[1,2]オキサジナン-2-イル)メチル]ベンズアミド（CH 4987655またはRo 4987655)を含むがこれらに限定されない。
いくつかの態様において、治療組み合わせは、JAK2阻害剤、例えば、CEP-701、INCB18424、CP-690550（タソシチニブ（tasocitinib））と共に投与される。例示的なJAK阻害剤は、ルキソリチニブ（JAKAFI）、トファシチニブ（CP690550）、アキシチニブ（AG013736、CAS 319460-85-0）、5-クロロ-N2-[(1S)-1-(5-フルオロ-2-ピリミジニル)エチル]-N4-(5-メチル-1H-ピラゾール-3-イル(y))-l2,4-ピリミジンジアミン（AZD1480、CAS 935666-88-9）、(9E)-15-[2-(1-ピロリジニル)エトキシ]-7,12,26-トリオキサ-19,21,24-トリアザテトラシクロ[18.3.1.12,5.114,18]-ヘキサコサ-1(24),2,4,9,14,16,18(25),20,22-ノナエン（SB-1578、CAS 937273-04-6）、モメロチニブ（CYT 387）、バリシチニブ（INCB-028050またはLY-3009104）、パクリチニブ（SB1518）、(16E)-14-メチル-20-オキサ-5,7,14,27-テトラアザテトラシクロ[19.3.1.12,6.18,12]ヘプタコサ-1(25),2,4,6(27),8,10,12(26),16,21,23-デカエン（SB 1317）、ガンドチニブ（LY 2784544）、およびN,N-シクロプロピル（cicyclopropyl）-4-[(1,5-ジメチル-1H-ピラゾール-3-イル)アミノ]-6-エチル-1,6-ジヒドロ-1-メチル-イミダゾ[4,5-d]ピロロ [2,3-b]ピリジン-7-カルボキサミド（BMS 911543）を含むがこれらに限定されない。
さらに他の態様において、治療組み合わせは、免疫療法と組み合わせて投与される。免疫療法アプローチは、例えば、癌ワクチン、免疫モジュレーター（例えば、共刺激分子の活性化因子または抑制分子の阻害因子）、患者の腫瘍細胞の免疫原性を増大させるエクスビボおよびインビボアプローチ、例えば、サイトカイン、例えば、インターロイキン2、インターロイキン4または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子のトランスフェクション、Ｔ細胞のアネルギーを減少させるアプローチ、トランスフェクトされた免疫細胞、例えば、サイトカインでトランスフェクトされた樹状細胞を用いるアプローチ、サイトカインでトランスフェクトされた腫瘍細胞株を用いるアプローチならびに抗イディオタイプ抗体を用いるアプローチを含む。これらのアプローチは、通常、免疫エフェクター分子ならびに癌細胞を標的としかつ破壊する分子の使用に基づく。免疫エフェクターは、例えば、悪性細胞の表面上のあるマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体は単独で治療のエフェクターとして機能し得、またはそれは細胞殺傷を実際に促進する他の細胞を動員し得る。抗体はまた、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンA鎖、コレラ毒素、百日咳毒素等）にコンジュゲートされ得、標的指向物質としてのみ機能し得る。あるいは、エフェクターは、悪性細胞標的と直接的または間接的のいずれかで相互作用する表面分子を有するリンパ球であり得る。様々なエフェクター細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞およびNK細胞を含む。
治療組み合わせは、手術；放射線療法（例えば、放射線野が設計される三次元原体照射療法を行う外部ビーム療法、局所照射（例えば、予め選択された標的もしくは器官に対する照射）、または集束照射）を含むがこれらに限定されない既存の癌処置様式の1つまたは複数と共に投与され得る。集束照射は、定位放射線手術、分割定位放射線手術、および強度変調放射線療法からなる群より選択され得る。集束照射は、粒子線（プロトン）、コバルト60（フォトン）および、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられるWO2012/177624に記載される、直線加速器（x線）からなる群より選択される放射線源を有し得る。
放射線療法は、外部ビーム療法、内部照射療法、インプラント照射、定位放射線手術、全身照射療法、放射線療法および永続的または一時的組織内小線源療法を含む、様々な方法の1つ、または方法の組み合わせを通じて実施され得る。「小線源療法」という用語は、身体の腫瘍または他の増殖性組織疾患部位にまたはその付近に挿入された空間的に制限された放射性物質により送達される放射線療法を表す。この用語は、非限定的に、放射性同位体（例えば、At-211、I-131、I-125、Y-90、Re-186、Re-188、Sm-153、Bi-212、P-32、およびLuの放射性同位体）への暴露を含むことが意図されている。本開示の細胞コンディショナーとして使用するのに適した放射線源は、固体および液体の両方を含む。非限定的な例として、放射線源は、放射性核種、例えば、固体源としてのI-125、I-131、Yb-169、Ir-192、固体源としてのI-125、またはフォトン、ベータ粒子、ガンマ線もしくは他の治療線を放射する他の放射性核種であり得る。放射性物質はまた、任意の放射性核種の溶液、例えば、I-125もしくはI-131の溶液から生成される液体であり得る、または放射性液体は、固体放射性核種、例えば、Au-198、Y-90の小さな粒子を含む適切な液体のスラリーを用いて生成され得る。さらに、放射性核種は、ゲルまたは放射性マイクロスフィアに埋め込まれ得る。
9. 治療的または予防的使用
本発明はまた、RANKの活性化に関連する様々な状態を処置するための本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子およびそれらの抗原結合分子に基づく治療組み合わせの使用を想定している。
特に、本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子は、RANKL/RANKシグナル伝達経路の活性化に関連する状態を処置または発症を阻害する上での使用が想定される。これらの状態は、骨減少障害、ミオパチーおよび癌を含むがこれらに限定されない。
これらの応用の特定の態様において、本発明は、対象における骨喪失を処置または発症を阻害する方法であって、有効量の本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子を対象に投与し、それによって骨喪失を処置または発症を阻害する工程を含む方法を提供する。
これらの応用の他の特定の態様において、本発明は、対象におけるRANKL/RANKシグナル伝達経路の活性化に関連する癌を処置するまたは発症を阻害する方法であって、有効量の本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子を対象に投与し、それによって癌を処置するまたは発症を阻害する工程を含む方法を提供する。特定の態様において、癌は、HR陰性（例えば、ER-；PR-；HER2-；ER-、PR-；ER-、HER2-；PR-、HER2-；およびER-、PR-、HER2-）乳癌、BRCA-1変異陽性乳癌、HR陰性（例えば、ER-；PR-；HER2-；ER-、PR-；ER-、HER2-；PR-、HER2-；およびER-、PR-、HER2-）かつBRCA-1変異陽性乳癌を含む乳癌、前立腺癌、KRAS変異またはKRASおよびLKB1変異NSCLCを含むNSCLC、ならびにccRCCを含むRCC細胞から選択される。
さらに、1つもしくは複数の抗ICM抗原結合分子または1つもしくは複数の抗AMA抗原結合分子と組み合わせて本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子を用いる本発明の治療組み合わせは、免疫を刺激もしくは強化する、腫瘍に対する免疫抑制もしくは寛容の発症もしくは進行を阻害する、または癌の発症、進行もしくは再発を阻害する特別な有用性を有する。
本発明にしたがい、本発明の薬剤（例えば、RANKアンタゴニスト抗原結合分子および治療組み合わせ）は、状態（例えば、骨減少障害、ミオパチーまたは癌）が診断された後に治療的に使用され得、または対象が状態（例えば、骨減少障害、ミオパチーまたは癌）を発症する前に予防的に使用され得ることが提案される。本発明は、したがって、（a）RANKL/RANKシグナル伝達経路の活性化に関連する状態を処置する、（b）RANKL/RANKシグナル伝達経路の活性化に関連する状態の発症を遅らせる、（c）RANKL/RANKシグナル伝達経路の活性化に関連する状態の進行を遅らせる、および（d）RANKL/RANKシグナル伝達経路の活性化に関連する状態に罹患した患者の生存期間を延ばす上で使用するためのRANKアンタゴニスト抗原結合分子を提供する。本発明に包含される骨減少障害は、骨粗鬆症、歯周炎、骨転移に関連する癌、多発性骨髄腫、関節リウマチ、乾癬性関節炎、家族性広汎性骨溶解、ぺージェット病（若年性ぺージェット病を含む）、骨巨細胞腫、慢性ウイルス感染に関連する骨喪失ならびに成人および小児白血病、ならびにプロテーゼ周囲骨喪失、ならびに破骨細胞活性が増加し骨吸収が誘導される癌、例えば乳癌、前立腺癌、および多発性骨髄腫を含むがこれらに限定されない。代表的なミオパチーは、遺伝性ミオパチー、例えば、ジストロフィー、ミオトニー、先天性ミオパチー（例えば、ネマリンミオパチー、マルチ／ミニコアミオパチー、および中心核ミオパチー）、ミトコンドリアミオパチー、家族性周期性ミオパチー、炎症性ミオパチーおよび代謝性ミオパチー（例えば、糖原病および脂質蓄積障害）、ならびに後天性ミオパチー、例えば、外部物質誘導ミオパチー（例えば、薬物誘導ミオパチーおよびグルココルチコイドミオパチー、アルコール性ミオパチー、および他の毒性物質に起因するミオパチー）、筋炎（例えば、皮膚筋炎、多発性筋炎および封入体筋炎）、骨化性筋炎、横紋筋融解症、およびミオグロビン尿、ならびに非活動性萎縮を含む。
本発明はまた、（1）癌を処置する、（2）癌の進行を遅らせる、（3）癌の移動もしくは転移を阻害する、（4）癌に罹患した患者の生存期間を延ばす、または（5）癌に対する細胞媒介免疫応答を刺激するための方法におけるRANKアンタゴニスト抗原結合分子および少なくとも1つの抗ICMアンタゴニストまたは少なくとも1つの抗AMAアンタゴニストを含む治療組み合わせを提供する。代表的な癌は、固形腫瘍、例えば黒色腫（例えば、進行段階（例えば、ステージII～IV）黒色腫またはHLA-A2陽性黒色腫）、膵臓癌（例えば、進行膵臓癌）、固形腫瘍、乳癌（例えば、転移乳癌腫、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体もしくはHer2/neuの1つ、2つもしくはすべてを発現しない乳癌、例えば、トリプルネガティブ乳癌）、腎細胞癌腫（例えば、進行（例えば、ステージIV）もしくは転移腎細胞癌種（MRCC））、前立腺癌（例えば、ホルモン不応性前立腺癌）、結腸癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、骨癌、皮膚癌、頭頚部癌（例えば、HPV+扁平上皮癌）、皮膚もしくは眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、ファローピウス管癌種、子宮内膜癌腫、子宮頸部癌腫、膣癌腫、外陰部癌腫、メルケル細胞癌、小児固形腫瘍、膀胱癌、腎臓または尿管癌、腎盤癌腫、中枢神経系（CNS）新生物、腫瘍血管新生、脊髄腫瘍、脳幹膠腫、下垂体腺癌、カポジ肉腫、類上皮腫癌もしくは扁平上皮癌、または血液悪性腫瘍、例えば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病（例えば、再発性もしくは難治性慢性リンパ性白血病）を含む慢性もしくは急性白血病、小児固形腫瘍、リンパ性リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、膀胱癌、腎臓もしくは尿管癌、腎盤癌腫、中枢神経系（CNS）新生物、原発性CNSリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹膠腫、下垂体腺癌、カポジ肉腫、類上皮腫癌、扁平上皮癌、T細胞リンパ腫、石綿により誘導される癌（例えば、中皮腫）を含む環境により誘導される癌、ならびに前記癌の組み合わせを含む。いくつかの態様において、癌は、転移性である。
任意の所定の対象に対する特定の同時および／または順次投薬レジメンは、その患者において診断された特定の疾患もしくは状態に基づき、または患者の疾患もしくは状態のステージに関連して構築され得る。例えば、患者が低侵襲性の癌またはその早期ステージにある癌と診断される場合、患者は、RANKアンタゴニスト抗原結合分子および抗ICMまたは抗AMA抗原結合分子の同時投与からの臨床的利益および／または同時投与に対する免疫関連応答を達成する可能性が高いと考えられる。あるいは、患者が高侵襲性の癌または後期ステージにある癌と診断される場合、患者は、同時投与からの臨床利益および／または同時投与に対する免疫関連応答を達成する可能性が低いと考えられ、したがって、より高用量のRANKアンタゴニスト抗原結合分子および／または抗ICMもしくは抗AMA抗原結合分子が投与されるべきことまたはより積極的な投薬レジメンまたはいずれかの薬剤もしくは併用療法が妥当であり得ることのいずれかが示唆され得る。
単独または抗ICMもしくは抗AMA抗原結合分子と組み合わせてのいずれかの治療もしくは予防有効量のRANKアンタゴニスト抗原結合分子が、好ましくは、対象に注射され得る。用いられる実際の用量は、患者の要求および処置される状態の重篤度に依存して異なり得る。特定の状況に対する適切な開始用量の決定は、当業者の技能範囲内であるが、処置レジメンの割り当ては、適応および疾患のステージを考慮することにより利益が得られるであろう。そうであったとしても、任意の特定の対象に対する具体的投薬レベルおよび投薬頻度は異なり得、それは用いられる具体的化合物の活性、その化合物の代謝安定性および効果の長さ、患者の種、年齢、体重、全体的健康、性別および食事、投与様式および期間、排出率、薬物の組み合わせ、ならびに個々の状態の重篤度を含む様々な要因に依存し得ることが理解されるであろう。好ましい処置対象は、動物、より好ましくは哺乳類種、例えば、ヒト、および家畜動物、例えば、イヌ、ネコ等、癌の患者を含む。
10. キット
本発明のさらなる態様は、対象において癌を処置するためのキットである。このキットは、本明細書に開示される任意の薬学的組成物を含む。
本発明のキットにおける使用のために、任意で癌の処置に関する指示書と共に、適切な治療組み合わせを含む薬学的組成物。キットはまた、各薬学的組成物および対象への薬学的組成物の投与に使用される他の含まれる試薬（例えば、緩衝液、平衡塩溶液等）のための適切な保管容器（例えば、アンプル、バイアル、チューブ等）を含み得る。薬学的組成物および他の試薬は、任意の便利な形態で、例えば、薬学的組成物の溶液または粉末として、キット内に存在し得る。キットはさらに、任意で薬学的組成物および他のオプションの試薬を収容するための1つまたは複数のパーティションを有する包装容器を含み得る。
本発明が直ちに理解され効果的に実施されるよう、ここから、具体的な好ましい態様を、以下の非限定的な実施例として記載する。
実施例1
アンタゴニスト抗RANK抗原結合分子の単離
完全ヒトFabベース抗体ファージディスプレイライブラリは、CSL（Parkville, Melbourne, Victoria, AUS）から入手した。ヒトFabライブラリの構築およびスクリーニングの一般的手順は、de Haard et al.（1998, Advanced Drug Delivery Reviews 31, 5-31; 1999, J. Biol. Chem. 274:18218-18230）に記載されている。
CDR2およびCDR3領域内のエピトープを標的とし、それによってRANKLのアンタゴニズムおよびマウスRANKとの交差反応結合を実現するFabを同定するため、RANKタンパク質の組み換え細胞外領域全体に結合するFabフラグメントに関してライブラリをスクリーニングした。
ビオチン・抗ヒトFc捕捉抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories 109-065-098）によりDynabeads（登録商標）M-280ストレプトアビジン（Invitrogen（商標）、Thermo Fisher Scientific 11205D）上に固定化されたRANK-Fcタンパク質を用いて、RANKに対する結合体に関してファージミドライブラリをスクリーニングした。選択は、以前に記載された方法にしたがい行った（Hoet et al., 2005. Nat Biotechnol. 23(3):344-348; Panousis et al., 2016. MAbs 8(3):436-453）。簡単に説明すると、室温で20分間、2％ミルク/PBST（MTPBS、0.1% Tween-20）中で10μgの固定化されたRANK-Fcと共にストレプトアビジンビーズ除去ファージインプットをインキュベートすることによって、3ラウンドの選別を行い、その後12回洗浄した。各ラウンドのパニング前に、Dynabeads（登録商標）M-280ストレプトアビジンおよびビオチンを通じて抗ヒトFc捕捉抗体でコーティングされたビーズを無関係のヒトIgG抗体と共にインキュベートすることによって、ストレプトアビジンおよび／またはFc抗体に対する非特異的結合体をファージミドライブラリから除去した。選別されたファージクローンを、対数期の大腸菌TG1細胞中で増幅し、M13K07ヘルパーファージの超感染によりFabファージミドを救済した。
RANKブロック能を有するクローンを濃縮するため、可溶性ヒトRANKLを用いて、固定化されたヒトRANK-Fcタンパク質に結合したファージを溶出させた。
3ラウンドの選択後におよそ1000個の個別のクローンを回収し、FabファージELISAによりRANK結合に関してスクリーニングした。特有のクローンを決定するために、ヒトRANK-Fcファージミド結合体からのFab cDNAを配列決定した。本質的に記載されているようにして、Fabの可変重領域および軽鎖をPCR増幅し、配列決定した（Hoet et al., 2005,前記）。使用したELISA法は、Panousis et al.（2016,前記）にしたがうものであった。
つぎに、RANKL溶出実験から単離された特有の陽性のhuRANK-Fc結合ファージクローンを、ファージELISAによりマウスRANK-Fcに対する種交差反応について試験した。要約すると、ヒトRANK-FcおよびマウスRANK-Fc結合を交互に行うことにより同定された3つのファージミドクローンに加えて、5つのファージミドクローン（R03A03、R03A06、R03A10、R03A12、R03B12と命名）が、ELISAによりヒトおよびマウスの両RANK-Fcに反応した（図1）。
ヒトRANK-FcおよびマウスRANK-Fcに正の結合を示した特有のファージクローンを、RANKLを用いる一点ファージ競合ヒトRANK-Fc ELISAにおいて試験し、ファージミドクローンがRANKL/RANKブロック能またはアンタゴニスト活性を有し得るかどうかを決定した。ヒトRANK-Fcに対する1つのクローン（R03A03）の結合が、ヒトRANKLの存在下で実質的に（＞75％）ブロックされた（図2）。ヒトRANK-Fcに対する他のファージミドクローン（R03A06、R03A10、R03A12、R03B12、R03C03、R03C04、R03C05）の結合は、RANKLの存在下でブロックされなかった。したがって、ファージミドR03A03は、他のRANK結合ファージミドクローンとは異なる特性を有している。
ELISAによりヒトRANK-FcおよびマウスRANK-Fcにも結合した特有のファージミドクローンを、全長IgG（マウスIgG2a Fc骨格上のヒトFab）に再フォーマットした。合計で、24個の特有の抗体クローンを、全長IgG（マウスIgG2a Fc骨格上のヒトFab）抗体を発現するよう再フォーマットした。ヒトFabは、（リンカー配列なしで）マウスIgG2a Fcに融合されている。
IgGを一過的なトランスフェクト体から発現させ、精製されたタンパク質を、機能的インビトロ効能試験の前にELISAにより結合について試験した。IgGを、ExpiFectamine（商標）293トランスフェクションキット（Thermo Fisher Scientific）を製造元の指示にしたがい用い、以前に記載（Spanevello et al., 2013, J Neurotrauma 30:1023-1034）されたようにして、懸濁適合293T細胞（Expi293F細胞）の一過的トランスフェクションから生成した。IgGの精製は、Panousis et al. （2016,前記）に以前に記載されたようにして行った。
実施例2
細胞ベースの機能アッセイにおける抗RANK抗体のアンタゴニスト活性
細胞ベースの機能アッセイにおいて3A3抗体の機能的阻害効果を評価するため、インビトロ破骨細胞生成に対するこの抗RANK抗体の効果を試験した。インビトロTRAP+破骨細胞アッセイの方法は、本質的に記載されている通りとした（Simonet et al., 1997. Cell 89(2): 309-319）。正常なBL/6マウス由来の骨髄（BM）細胞を、50 ng/mLのヒト組み換えCSF-1（Preprotech）を補充した総量200μL/ウェルの完全DMEM（10％ FCS + PS + Glu）中25000細胞／ウェルの密度となるよう96ウェル平底プレートに播種した。48時間の培養後、培地を、50 ng/mLのヒト組み換えCSF-1および200 ng/mLの可溶性muRANKLまたは可溶性huRANKL（Miltenyi）を補充した完全DMEMで置き換えた。細胞を、CSF-1およびヒトまたはマウスのいずれかのRANKLと共に4日間（抗体阻害剤ありおよびなしで）培養し、その後にTRAP+多核化（3つを超える核の）破骨細胞を計数した。生成された破骨細胞を、以前に記載されたようにしてTRAP細胞化学染色により評価した（Simonet et al., 1997,前記）。
破骨細胞形成を、組み換えヒトRANKLを用いて評価した。陽性対照RANK-Fcの効果と同様、抗RANK抗体3A3の添加は、用量依存的な様式でTRAP+多核化細胞の形成を阻害したが、アイソタイプIgG2aの添加ではそうならなかった（図3）。なお、非ブロッキング性の抗RANK mAb 3B10の添加は、破骨細胞形成に影響しなかった。抗RANK抗体3A3は、125～250 ng/mLの間の濃度で破骨細胞形成を完全にブロックし、陽性対照RANK-Fcは、500 ng/mL～1μg/mLの間の濃度で破骨細胞形成を完全にブロックした。抗RANK 3A3抗体は、3.5 ng/mLのIC50でhuRANKL誘導破骨細胞形成のブロックにおいてアンタゴニスト活性を示し、対照RANK-Fcは、92 ng/mLのIC50を示した。
これらの結果は、抗RANK 3A3抗体が、細胞ベースのRANKL/RANKアンタゴニストアッセイ（破骨細胞形成）において陽性対照RANK-Fcと比較して少なくとも同等の活性を有していたことを示している。算出されたIC50は、抗RANK 3A3抗体が陽性対照RANK-Fcと比較しておよそ25倍高い能力を有することを示している。これらの結果は、抗RANK 3A3抗体がRANKL/RANK活性およびインビトロでの破骨細胞の分化に対するアンタゴニスト活性を有していることを示した。
次のアッセイにおいて、組み換えマウスRANKLを用いて破骨細胞形成を評価した。陽性対照抗muRANKL IK22-5 mAbの効果と同様、抗RANK抗体3A3の添加は、用量依存的な様式でTRAP+多核化細胞の形成を阻害したが、アイソタイプIgG2aの添加ではそうならなかった（図4）。ここでも、非ブロッキング性の抗RANK mAb 3B10の添加は、破骨細胞形成に影響しなかった。抗RANK抗体3A3は、33～62.5 ng/mLの間の濃度で破骨細胞形成を完全にブロックし、陽性対照抗muRANKL IK22-5 mAbは、62.5～125 ng/mLの間の濃度で破骨細胞形成を完全にブロックした。抗RANK 3A3抗体は、7.4 ng/mLのIC50でmuRANKL誘導破骨細胞形成のブロックにおいてアンタゴニスト活性を示し、対照抗muRANKL mAB IK22-5は、19.8 ng/mLのIC50を示した。
これらの結果は、抗RANK 3A3抗体が、細胞ベースのRANKL/RANKアンタゴニストアッセイ（破骨細胞形成）において陽性対照抗muRANKL mAb IK22-5と比較して少なくとも同等の活性を有していたことを示している。算出されたIC50は、抗RANK 3A3抗体が陽性対照抗muRANKL mAb IK22-5と比較しておよそ2倍高い能力を有することを示している。これらの結果は、抗RANK 3A3抗体がRANKL/RANK活性およびインビトロでの破骨細胞の分化に対するアンタゴニスト活性を有していることを示した。
実施例3
RANKおよびPD-L1の二重ブロックは繊維肉腫腫瘍免疫を有意に強化する
抗RANK 3A3抗体が細胞ベースのRANKL/RANKアンタゴニストアッセイ（インビトロ破骨細胞形成）において陽性対照RANK-Fcと比較して少なくとも同等の活性を有することを示す実施例2に示された結果に基づき、アンタゴニスト性抗RANKおよび抗PD-L1抗体を用いて皮下腫瘍を有するマウスにおけるRANKおよびPD-L1の二重ブロックの効果を評価した。抗PD-L1感受性MCA1956繊維肉腫モデルにおいて、アンタゴニスト性抗RANK mAbの添加は、有意に強化された抗PD-L1効果を示した（図5、P＜0.0001）。この観察は、アンタゴニスト性抗RANK 3A3抗体が抗腫瘍免疫を改善し得ることを支持している。
実施例4
RANKおよびPD-L1の二重ブロックは結腸腫瘍免疫を有意に強化する
結腸MC38結腸癌腫モデルにおいて、アンタゴニスト性抗RANK mAbの添加は、有意に強化された抗PD-L1効果を示した（図6、P＜0.0001）。この観察は、アンタゴニスト性抗RANK 3A3抗体が抗腫瘍免疫を改善し得ることを実証している。
本明細書で引用されているすべての特許、特許出願および刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書における参考文献の引用は、そのような参考文献が本願に対する「先行技術」として利用可能であることの承認とみなされるべきでない。
本願を通して、その目的は、本発明を任意の1つの態様または特定の特徴の集合に限定することなく本発明の好ましい態様を解説することであった。したがって、当業者は、本開示に照らして、本発明の範囲から逸脱することなく例示されている特定の態様において様々な改変および変更がなされ得ることを理解するであろう。すべてのそのような改変および変更は、添付の特許請求の範囲内に包含されることが意図されている。
いくつかの態様において、抗CTLA4抗原結合分子は、その代表例がイピリムマブおよびトレメリムマブを含むMAb、またはその抗原結合フラグメントである。あるいは、抗CTLA4抗原結合分子は、CTLA4への結合に関してイピリムマブもしくはトレメリムマブと競合するものであり得る。このタイプの具体例において、抗CTLA4抗原結合分子は、SEQ ID NO:15（すなわち、SEQ ID NO:16に示される全長ネイティブCTLA4アミノ酸配列の残基25～42）、SEQ ID NO:172（すなわち、SEQ ID NO:16に示されるネイティブCTLA4配列の残基43～65）およびSEQ ID NO:173（すなわち、SEQ ID NO:16に示されるネイティブCTLA4配列の残基96～109）のいずれか1つに示される配列から選択されるアミノ酸配列内の1つまたは複数のアミノ酸に特異的に結合する。
多特異性抗原結合分子がCTLA4をアンタゴナイズするいくつかの態様において、抗CTLA4抗体またはその抗原結合フラグメントは、SEQ ID NO:15（すなわち、SEQ ID NO:16に示される全長ネイティブPD-CTLA4アミノ酸配列の残基25～42）、SEQ ID NO:172（すなわち、SEQ ID NO:16に示されるネイティブCTLA4配列の残基43～65）およびSEQ ID NO:173（すなわち、SEQ ID NO:16に示されるネイティブCTLA4配列の残基96～109）から選択されるアミノ酸配列の1つまたは複数のアミノ酸に特異的に結合する。このタイプの例示的な抗体および抗原結合フラグメントは、イピリムマブおよびトレメリムマブから選択されるMAbの重鎖および軽鎖、またはその抗原結合フラグメントを含むものを含む。
抗CTLA4抗原結合分子は、適切に、CTLA4の細胞外ドメインの領域に結合する。例として、抗CTLA4抗原結合分子は、アミノ酸配列
Figure 2022514215000110
（すなわち、SEQ ID NO:16に示されるネイティブCTLA4配列の残基26～42）、
Figure 2022514215000111
（すなわち、SEQ ID NO:16に示されるネイティブCTLA4配列の残基43～65）、および
Figure 2022514215000112
（すなわち、SEQ ID NO:16に示されるネイティブCTLA4配列の残基96～109）の任意の1つまたは複数を含むヒトCTLA4の細胞外ドメインの領域に特異的に結合し得る。あるいはまたは加えて、抗CTLA4抗原結合分子は、CTLA4の成熟形態の以下の残基の任意の1つまたは複数、好ましくはすべてを含むヒトCTLA4の細胞外ドメインの領域に特異的に結合し得る：K1、A2、M3、E33、R35、Q41、S44、Q45、V46、E48、L91、I93、K95、E97、M99、P102、P103、Y104、Y105、L106、I108、N110。
さらなる局面において、本発明は、免疫を刺激もしくは強化するため、腫瘍に対する免疫抑制もしくは寛容の発症もしくは進行を阻害するためまたは対象において癌を処置するためのキットを提供する。これらのキットは、上記および本明細書の他所に広義的に記載される治療組み合わせ、薬学的組成物および多特異性抗原結合分子の任意の1つまたは複数を含む。
[本発明1001]
（1）SEQ ID NO:3に示されるVHCDR1アミノ酸配列、SEQ ID NO:4に示されるVHCDR2アミノ酸配列、およびSEQ ID NO:5に示されるVHCDR3アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（V H ）、ならびにSEQ ID NO:6に示されるVLCDR1アミノ酸配列、SEQ ID NO:7に示されるVLCDR2アミノ酸配列、およびSEQ ID NO:8に示されるVLCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（V L ）；
（2）SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を含むV H 、およびSEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列を含むV L ；
（3）SEQ ID NO:1のアミノ酸配列に対して少なくとも90％（少なくとも91％～99％およびその間のすべての整数値の百分率を含む）の配列同一性を有するV H 、ならびにSEQ ID NO:2のアミノ酸配列に対して少なくとも90％（少なくとも91％～99％およびその間のすべての整数値の百分率を含む）の配列同一性を有するV L ；
（4）SEQ ID NO:1のアミノ酸配列内の各CDR以外のフレームワーク領域のアミノ酸配列に対して少なくとも90％（少なくとも91％～99％およびその間のすべての整数値の百分率を含む）の配列同一性を有するV H 、ならびにSEQ ID NO:2のアミノ酸配列内の各CDR以外のフレームワーク領域のアミノ酸配列に対して少なくとも90％（少なくとも91％～99％およびその間のすべての整数値の百分率を含む）の配列同一性を有するV L ；または
（5）SEQ ID NO:1のアミノ酸配列内の各CDR以外のフレームワーク領域の配列内に1つもしくは複数（例えば、1、2、3、4もしくは5個）のアミノ酸の欠失、置換、もしくは付加を含むアミノ酸配列を含むV H 、およびSEQ ID NO:2のアミノ酸配列内の各CDR以外のフレームワーク領域の配列内に1つもしくは複数（例えば、1、2、3、4もしくは5個）のアミノ酸の欠失、置換、もしくは付加を含むアミノ酸配列を含むV L 、
を含む、RANKアンタゴニスト抗原結合分子。
[本発明1002]
単離、精製、合成、または組み換え形態である、本発明1001の抗原結合分子。
[本発明1003]
一価（例えば、Fab、scFab、Fab'、scFv、1アーム抗体等）である、本発明1001または本発明1002の抗原結合分子。
[本発明1004]
以下の活性：
（a）RANKに対するRANKLの結合を阻害する；（b）RANKの活性化を阻害する；（c）下流RANK媒介分子シグナル伝達（例えば、TRAFタンパク質のRANK動員）を阻害する；（d）RANKの多量体化を阻害する；（e）破骨細胞の分化を低下させる；（f）破骨細胞の活性化を減少させる；（g）破骨細胞の生存率を低下させる；（h）骨喪失を阻害し、骨密度を増加させる；（i）腫瘍微小環境（TME）において骨髄細胞または他の免疫細胞の免疫抑制活性を阻害する；ならびに（j）腫瘍細胞（例えば、トリプルネガティブ乳癌（TNBC）細胞およびBRCA-1変異陽性乳癌細胞を含む乳癌細胞、非小細胞肺癌（NSCLC）細胞ならびに腎細胞癌（RCC）細胞）の増殖、遊走、生存、および／または形態形成を阻害する
の任意の1つまたは複数を有する、本発明1001～1003のいずれかまたは複数の抗原結合分子。
[本発明1005]
送達ビヒクル（例えば、リポソーム、ナノ粒子、マイクロ粒子、デンドリマー、またはシクロデキストリン）中に含まれる、本発明1001～1003のいずれかまたは複数の抗原結合分子。
[本発明1006]
本発明1001～1004のいずれかのRANKアンタゴニスト抗原結合分子をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
[本発明1007]
1つまたは複数の制御配列に機能的に連結されている本発明1001～1004のいずれかのRANKアンタゴニスト抗原結合分子をコードする核酸配列を含む、構築物。
[本発明1008]
発現構築物（例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、またはウイルス）の形態である、本発明1007の構築物。
[本発明1009]
本発明1008の構築物を含む、宿主細胞。
[本発明1010]
本発明1001～1004のいずれかのRANKアンタゴニスト抗原結合分子および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
[本発明1011]
骨吸収抑制剤（例えば、特に副甲状腺ホルモン、BMP2、ビタミンD、抗炎症剤からなる群より選択される、同化増強剤；および特にビスホスホネート、カテプシンK阻害剤、p38阻害剤、JNK阻害剤、IKK阻害剤、NF-κB阻害剤、カルシニューリン阻害剤、NFAT阻害剤、PI3K阻害剤からなる群より選択される、異化阻害剤）、ならびに化学療法剤（例えば、抗増殖／抗新生物薬、細胞増殖抑制剤、癌細胞浸潤阻害剤、成長因子機能阻害剤、抗血管新生剤、血管損傷剤（vascular damaging agent）等）、または免疫療法剤（例えば、サイトカイン、サイトカイン発現細胞、抗体等）
から選択される少なくとも1つの補助的薬剤をさらに含む、本発明1010の薬学的組成物。
[本発明1012]
本発明1001～1004のいずれかのRANKアンタゴニスト抗原結合分子をRANK発現細胞と接触させ、それによってRANK発現細胞に対するRANKの結合を阻害する工程を含む、RANK発現細胞に対するRANKLの結合を阻害するための方法。
[本発明1013]
本発明1001～1004のいずれかのRANKアンタゴニスト抗原結合分子をRANK発現細胞と接触させ、それによってRANK発現細胞におけるRANKの活性化を阻害する工程を含む、RANK発現細胞におけるRANKの活性化を阻害するための方法。
[本発明1014]
本発明1001～1004のいずれかのRANKアンタゴニスト抗原結合分子をRANK発現細胞と接触させ、それによってRANK発現細胞におけるRANK媒介分子シグナル伝達を阻害する工程を含む、RANK発現細胞におけるRANK媒介分子シグナル伝達（例えば、TRAFタンパク質のRANK動員）を阻害するための方法。
[本発明1015]
本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子をRANK発現細胞と接触させ、それによってRANK発現細胞におけるRANKの多量体化を阻害する工程を含む、RANK発現細胞におけるRANKの多量体化を阻害するための方法。
[本発明1016]
RANK発現細胞が、破骨細胞、免疫細胞、例えば、抗原提示細胞（例えば、単球および樹状細胞）ならびにエフェクター免疫細胞（例えば、T細胞）、造血前駆体、ならびに腫瘍細胞、例えば、乳癌細胞、前立腺癌細胞、NSCLC細胞、およびRCC細胞から選択される、本発明1012～1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
本発明1001～1004のいずれかのRANKアンタゴニスト抗原結合分子を破骨細胞と接触させ、それによって破骨細胞の分化、活性化、および／または生存を阻害する工程を含む、破骨細胞の分化、活性化および／または生存を阻害するための方法。
[本発明1018]
本発明1001～1004のいずれかのRANKアンタゴニスト抗原結合分子を免疫細胞と接触させ、それによって免疫細胞の免疫抑制活性を阻害する工程を含む、免疫細胞（例えば、骨髄細胞またはTreg）の免疫抑制活性を阻害するための方法。
[本発明1019]
本発明1001～1004のいずれかのRANKアンタゴニスト抗原結合分子を腫瘍細胞と接触させ、それによって腫瘍細胞の増殖、生存、または遊走を阻害する工程を含む、腫瘍細胞の増殖、生存、または遊走を阻害するための方法。
[本発明1020]
対象においてRANKL/RANKシグナル伝達経路の活性化に関連する状態を処置するまたは発症を阻害するための方法であって、
本発明1001～1004のいずれかのRANKアンタゴニスト抗原結合分子を有効量で対象に投与し、それによって該状態を処置するまたは発症を阻害する工程を含む、方法。
[本発明1021]
RANKL/RANKシグナル伝達経路の活性化に関連する状態が、骨減少障害、ミオパチー、および癌から選択される、本発明1020の方法。
[本発明1022]
本発明1001～1004のいずれかのRANKアンタゴニスト抗原結合分子および少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる、治療組み合わせ。
[本発明1023]
RANKアンタゴニスト抗原結合分子および少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子が、単一組成物（例えば、混合物）の形態である、本発明1022の治療組み合わせ。
[本発明1024]
RANKアンタゴニスト抗原結合分子および少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子が、別々の組成物中の別個の成分の形態である、本発明1022の治療組み合わせ。
[本発明1025]
少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子が、プログラム死1受容体（PD-1）、プログラム死リガンド1（PD-L1）、プログラム死リガンド2（PD-L2）、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4（CTLA-4）、A2Aアデノシン受容体（A2AR）、A2Bアデノシン受容体（A2BR）、B7-H3（CD276）、Vセットドメイン含有T細胞活性化阻害因子1（VTCN1）、BおよびTリンパ球アテニュエーター（BTLA）、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（KIR）、リンパ球活性化遺伝子3（LAG3）、T細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン3（TIM-3）、T細胞活性化のVドメインIgサプレッサー（VISTA）、5'-ヌクレオチダーゼ（CD73）、タクタイル（CD96）、ポリオウイルス受容体（CD155）、DNAXアクセサリー分子1（DNAM-1）、ポリオウイルス受容体関連2（CD112）、細胞傷害性および制御性T細胞分子（CRTAM）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー4（TNFRS4；OX40；CD134）、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリー、メンバー4（TNFSF4；OX40リガンド（OX40L））、ナチュラルキラー細胞受容体2B4（CD244）、CD160、グルココルチコイド誘導TNFR関連タンパク質（GITR）、グルココルチコイド誘導TNFR関連タンパク質リガンド（GITRL）、誘導性共刺激因子（ICOS）、ガレクチン9（GAL-9）、4-1BBリガンド（4-1BBL；CD137L）、4-1BB（4-1BB；CD137）、CD70（CD27リガンド（CD27L））、CD28、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、シグナル調節タンパク質（SIRP-1）、インテグリン関連タンパク質（IAP；CD47）、B-リンパ球活性化マーカー（BLAST-1；CD48）、ナチュラルキラー細胞受容体2B4（CD244）；CD40、CD40リガンド（CD40L）、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（HVEM）、膜貫通および免疫グロブリンドメイン含有2（TMIGD2）、HERV-H LTR関連2（HHLA2）、血管内皮成長阻害因子（VEGI）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー25（TNFRS25）、誘導性T細胞共刺激因子リガンド（ICOLG；B7RP1）およびIgおよびITIM（免疫受容体チロシン型阻害モチーフ）ドメイン（TIGIT）を有するT細胞免疫受容体からなる群より選択されるICMをアンタゴナイズする、本発明1022～1024のいずれかの治療組み合わせ。
[本発明1026]
少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子が、PD-1アンタゴニスト抗原結合分子、PD-L1アンタゴニスト抗原結合分子、およびCTLA4アンタゴニスト抗原結合分子から選択される、本発明1025の治療組み合わせ。
[本発明1027]
少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子が、PD-1アンタゴニスト抗原結合分子を含む、本発明1025の治療組み合わせ。
[本発明1028]
少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子が、PD-L1アンタゴニスト抗原結合分子を含む、本発明1025の治療組み合わせ。
[本発明1029]
少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子が、CTLA4アンタゴニスト抗原結合分子を含む、本発明1025の治療組み合わせ。
[本発明1030]
少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子が、PD-1アンタゴニスト抗原結合分子およびPD-L1アンタゴニスト抗原結合分子を含む、本発明1025の治療組み合わせ。
[本発明1031]
少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子が、PD-1アンタゴニスト抗原結合分子およびCTLA4アンタゴニスト抗原結合分子を含む、本発明1025の治療組み合わせ。
[本発明1032]
少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子が、PD-L1アンタゴニスト抗原結合分子およびCTLA4アンタゴニストを含む、本発明1025の治療組み合わせ。
[本発明1033]
抗ICM抗原結合分子が、Treg細胞が発現しないまたは低レベルで発現するICMをアンタゴナイズする、本発明1025の治療組み合わせ。
[本発明1034]
抗ICM抗原結合分子が、TregにおいてCTLA4よりも低レベルで発現されるICM（例えば、PD-1またはPD-L1）をアンタゴナイズする、本発明1025の治療組み合わせ。
[本発明1035]
抗ICM抗原結合分子が、Tregよりも免疫エフェクター細胞（例えば、エフェクターT細胞、マクロファージ、樹状細胞、B細胞等）において高レベルで発現されるICM（例えば、PD-1またはPD-L1）をアンタゴナイズする、本発明1025の治療組み合わせ。
[本発明1036]
抗PD-1抗原結合分子が、その非限定的な例がニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、およびMEDI-0680（AMP-514）、AMP-224、JS001-PD-1、SHR-1210、Gendor PD-1、PDR001、CT-011、REGN2810、BGB-317を含むMAbもしくはその抗原結合フラグメントであるか、またはPD-1への結合に関してニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、もしくはMEDI-0680と競合するものである、本発明1027の治療組み合わせ。
[本発明1037]
抗PD-1抗原結合分子が、
SEQ ID NO:9（すなわち、SEQ ID NO:10に示されるネイティブPD-1配列の残基62～86）、
SEQ ID NO:11（すなわち、SEQ ID NO:10に示されるネイティブPD-1配列の残基118～136）、および
SEQ ID NO:12（すなわち、SEQ ID NO:10に示されるネイティブPD-1配列の残基66～97に対応する）
に示されるアミノ酸配列の1つまたは複数のアミノ酸に特異的に結合する、本発明1027または本発明1036の治療組み合わせ。
[本発明1038]
抗PD-L1抗原結合分子が、その非限定的な例がデュルバルマブ（MEDI4736）、アテゾリズマブ（テセントリク）、アベルマブ、BMS-936559/MDX-1105、MSB0010718C、LY3300054、CA-170、GNS-1480、およびMPDL3280Aを含むMAb、またはその抗原結合フラグメントである、本発明1028の治療組み合わせ。
[本発明1039]
抗PD-L1抗原結合分子が、SEQ ID NO:13（すなわち、SEQ ID NO:14に示される全長ネイティブPD-L1アミノ酸配列の残基279～290）に示されるアミノ酸配列内の1つまたは複数のアミノ酸に特異的に結合し、PD-L1への結合に関してデュルバルマブ（MEDI4736）、アテゾリズマブ（テセントリク）、アベルマブ、BMS 936559/MDX-1105、MSB0010718C、LY3300054、CA-170、GNS-1480およびMPDL3280Aと競合するものである、本発明1028または本発明1038の治療組み合わせ。
[本発明1040]
抗CTLA4抗原結合分子が、その代表例がイピリムマブおよびトレメリムマブを含むMAbもしくはその抗原結合フラグメントであるか、またはCTLA4への結合に関してイピリムマブもしくはトレメリムマブと競合するものである、本発明1029の治療組み合わせ。
[本発明1041]
抗CTLA4抗原結合分子が、
SEQ ID NO:15（すなわち、SEQ ID NO:16に示される全長ネイティブCTLA4アミノ酸配列の残基25～42）、
SEQ ID NO:17（すなわち、SEQ ID NO:16に示されるネイティブCTLA4配列の残基43～65）、および
SEQ ID NO:18（すなわち、SEQ ID NO:16に示されるネイティブCTLA4配列の残基96～109）
のいずれか1つに示される配列から選択されるアミノ酸配列内の1つまたは複数のアミノ酸に特異的に結合する、本発明1029または本発明1040の治療組み合わせ。
[本発明1042]
RANKまたはICM抗原結合分子が、免疫グロブリン定常鎖（例えば、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、またはIgG4定常鎖）に連結される、本発明1022～1041のいずれかの治療組み合わせ。
[本発明1043]
免疫グロブリン定常鎖が、
κ軽鎖またはλ軽鎖から選択される軽鎖；ならびに
γ1重鎖、γ2重鎖、γ3重鎖、およびγ4重鎖から選択される重鎖
を含み得る、本発明1042の治療組み合わせ。
[本発明1044]
本発明1001～1004のいずれかのRANKアンタゴニスト抗原結合分子および2つまたはそれ以上の異なる抗ICM抗原結合分子を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる、本発明1022～1043のいずれかの治療組み合わせ。
[本発明1045]
本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子、ならびに
抗CTLA4抗原結合分子、抗PD-1抗原結合分子、および抗PD-L1抗原結合分子の少なくとも2つ
を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる、本発明1044の治療組み合わせ。
[本発明1046]
治療組み合わせの個々の抗原結合分子が別個の成分の形態である、本発明1022～1045のいずれかの治療組み合わせ。
[本発明1047]
治療組み合わせの個々の抗原結合分子が、相互に（直接的もしくは間接的のいずれかで）融合されるかまたはそれ以外の方法でコンジュゲートされる、本発明1022～1045のいずれかの治療組み合わせ。
[本発明1048]
本発明1001～1004のいずれかのRANKアンタゴニスト抗原結合分子および少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子を含む多特異性アンタゴニスト剤の形態である、本発明1047の治療組み合わせ。
[本発明1049]
多特異性剤が2つまたはそれ以上のポリペプチドの複合体である、本発明1048の治療組み合わせ。
[本発明1050]
多特異性剤が単鎖ポリペプチドである、本発明1048の治療組み合わせ。
[本発明1051]
RANKアンタゴニスト抗原結合分子が、個々の抗ICM抗原結合分子のN末端またはC末端にコンジュゲートされる、本発明1050の治療組み合わせ。
[本発明1052]
RANKアンタゴニスト抗原結合分子と抗ICM抗原結合分子が、直接的にまたは介在リンカー（例えば、ポリペプチドリンカー）により接続される、本発明1050または本発明1051の治療組み合わせ。
[本発明1053]
送達ビヒクル（例えば、リポソーム、ナノ粒子、マイクロ粒子、デンドリマー、またはシクロデキストリン）中に含まれる、本発明1022～1052のいずれかの治療組み合わせ。
[本発明1054]
本発明1001～1004のいずれかのRANKアンタゴニスト抗原結合分子および少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる、RANKおよび少なくとも1つのICMを共アンタゴナイズするための多特異性抗原結合分子。
[本発明1055]
RANKアンタゴニスト抗原結合分子が、RANKに特異的に結合しかつアンタゴナイズする抗体またはその抗原結合フラグメントである、本発明1054の多特異性抗原結合分子。
[本発明1056]
個々の抗ICM抗原結合分子が、対応するICMに特異的に結合しかつアンタゴナイズする抗体またはその抗原結合フラグメントから選択される、本発明1054または本発明1055の多特異性抗原結合分子。
[本発明1057]
抗体および／または抗原結合フラグメントが、直接的にまたは介在リンカー（例えば、化学リンカーもしくはポリペプチドリンカー）により接続される、本発明1055または本発明1056の多特異性抗原結合分子。
[本発明1058]
RANKアンタゴニスト抗原結合分子および少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子が機能的に接続された単鎖ポリペプチドの形態である、本発明1054～1057のいずれかの多特異性抗原結合分子。
[本発明1059]
RANKアンタゴニスト抗原結合分子および少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子が複合体を形成するよう相互に連結またはそれ以外の方法で結合された個別のポリペプチド鎖の形態である、本発明1054～1057のいずれかの多特異性抗原結合分子。
[本発明1060]
二価、三価、または四価である、本発明1054～1059のいずれかの多特異性抗原結合分子。
[本発明1061]
RANKアンタゴニスト抗原結合分子および少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子が、Fab、Fab'、F(ab') 2 、およびFv分子、ならびに相補性決定領域（CDR）から選択される、本発明1054～1060のいずれかの多特異性抗原結合分子。
[本発明1062]
個々の抗原結合分子が、IgG、IgM、IgD、IgA、およびIgEからなる群より独立して選択される定常ドメインを含む、本発明1054～1061のいずれかの多特異性抗原結合分子。
[本発明1063]
タンデムscFv（taFvもしくはscFv 2 ）、ダイアボディ、dAb 2 /VHH 2 、ノブ・イン・ホール（knobs-in-holes）誘導体、Seedcod-IgG、ヘテロFc-scFv、Fab-scFv、scFv-Jun/Fos、Fab'-Jun/Fos、トリボディ、DNL-F(ab) 3 、scFv 3 -C H 1/C L 、Fab-scFv 2 、IgG-scFab、IgG-scFv、scFv-IgG、scFv 2 -Fc、F(ab') 2 -scFv 2 、scDB-Fc、scDb-C H 3、Db-Fc、scFv 2 -H/L、DVD-Ig、tandAb、scFv-dhlx-scFv、dAb 2 -IgG、dAb-IgG、dAb-Fc-dAb、tandab、DART、BiKE、TriKE、mFc-V H 、架橋MAb、クロスMAb、MAb 2 、FIT-Ig、静電気的適合抗体、対称性IgG様抗体、LUZ-Y、Fab交換抗体、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1054～1062のいずれかの多特異性抗原結合分子。
[本発明1064]
個々の抗原結合分子が、免疫グロブリン定常鎖（例えば、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、およびIgG4）に連結される、本発明1054～1063のいずれかの多特異性抗原結合分子。
[本発明1065]
免疫グロブリン定常鎖が、
κ軽鎖およびλ軽鎖から選択される軽鎖；ならびに
γ1重鎖、γ2重鎖、γ3重鎖、およびγ4重鎖から選択される重鎖
を含む、本発明1064の多特異性抗原結合分子。
[本発明1066]
多特異性抗原結合分子がPD-1をアンタゴナイズし、
抗PD-1抗原結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）が、
SEQ ID NO:9（すなわち、SEQ ID NO:10に示されるネイティブヒトPD-1配列の残基62～86）、
SEQ ID NO:11（すなわち、SEQ ID NO:10に示されるネイティブヒトPD-1配列の残基118～136）、および
SEQ ID NO:12（すなわち、SEQ ID NO:10に示されるネイティブヒトPD-1配列の残基66～97に対応する）
から選択されるアミノ酸配列の1つまたは複数のアミノ酸に特異的に結合する、
本発明1054～1065のいずれかの多特異性抗原結合分子。
[本発明1067]
抗PD-1抗原結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）が、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、およびMEDI-0680（AMP-514）、AMP-224、JS001-PD-1、SHR-1210、Gendor PD-1、PDR001、CT-011、REGN2810、BGB-317から選択されるMAbの重鎖および軽鎖、またはその抗原結合フラグメントを含む、本発明1066の多特異性抗原結合分子。
[本発明1068]
多特異性抗原結合分子がPD-L1をアンタゴナイズし、
抗PD-L1抗原結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）が、SEQ ID NO:13に示されるアミノ酸配列（すなわち、SEQ ID NO:14に示されるネイティブヒトPD-L1アミノ酸配列の残基279～290）の1つまたは複数のアミノ酸に特異的に結合する、
本発明1054～1067のいずれかの多特異性抗原結合分子。
[本発明1069]
抗PD-L1抗原結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）が、デュルバルマブ（MEDI4736）、アテゾリズマブ（テセントリク）、アベルマブ、BMS-936559/MDX-1105、MSB0010718C、LY3300054、CA-170、GNS-1480、およびMPDL3280Aから選択されるMAbの重鎖および軽鎖、またはその抗原結合フラグメントを含む、本発明1068の多特異性抗原結合分子。
[本発明1070]
多特異性抗原結合分子がCTLA4をアンタゴナイズし、
抗CTLA4抗原結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）が、
SEQ ID NO:15（すなわち、SEQ ID NO:16に示される全長ネイティブPD-CTLA4アミノ酸配列の残基25～42）、
SEQ ID NO:17（すなわち、SEQ ID NO:16に示されるネイティブCTLA4配列の残基43～65）、および
SEQ ID NO:18（すなわち、SEQ ID NO:16に示されるネイティブCTLA4配列の残基96～109）
から選択されるアミノ酸配列の1つまたは複数のアミノ酸に特異的に結合する、
本発明1054～1069のいずれかの多特異性抗原結合分子。
[本発明1071]
抗CTLA4抗原結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）が、イピリムマブおよびトレメリムマブから選択されるMAbの重鎖および軽鎖、またはその抗原結合フラグメントを含む、本発明1070の多特異性抗原結合分子。
[本発明1072]
本発明1001～1004のいずれかのRANKアンタゴニスト抗原結合分子および抗PD-1抗原結合分子を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる、本発明1054～1071のいずれかの多特異性抗原結合分子。
[本発明1073]
本発明1001～1004のいずれかのRANKアンタゴニスト抗原結合分子および抗PD-L1抗原結合分子を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる、本発明1054～1071のいずれかの多特異性抗原結合分子。
[本発明1074]
本発明1001～1004のいずれかのRANKアンタゴニスト抗原結合分子ならびに抗PD-1抗原結合分子および抗PD-L1抗原結合分子を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる、本発明1054～1071のいずれかの多特異性抗原結合分子。
[本発明1075]
本発明1001～1004のいずれかのRANKアンタゴニスト抗原結合分子ならびに抗PD-1抗原結合分子および抗CTLA4抗原結合分子を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる、本発明1054～1071のいずれかの多特異性抗原結合分子。
[本発明1076]
本発明1001～1004のいずれかのRANKアンタゴニスト抗原結合分子および抗PD-L1抗原結合分子を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる、本発明1054～1071のいずれかの多特異性抗原結合分子。
[本発明1077]
本発明1001～1004のいずれかのRANKアンタゴニスト抗原結合分子および少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子を組み合わせて、それによって治療組み合わせを製造する工程
を含む、本発明1054～1076のいずれかの治療組み合わせの製造方法。
[本発明1078]
（例えば、標的ポリペプチドに対応するアミノ酸配列を含む免疫刺激ポリペプチドを用いて動物を免疫刺激し；標的ポリペプチドまたはその少なくとも1つの領域に特異的に結合するB細胞を同定および／または動物から単離し；そのB細胞により発現される抗原結合分子を産生させることによって）治療組み合わせの標的ポリペプチド（例えば、RANKまたはICM）に特異的に結合しかつアンタゴナイズする抗原結合分子を生成する工程
をさらに含む、本発明1077の方法。
[本発明1079]
そのようにして生成された抗原結合分子を誘導体化して、該抗原結合分子と同じエピトープ結合特異性を有する抗原結合分子誘導体を製造する工程
をさらに含む、本発明1077または本発明1078の方法。
[本発明1080]
抗原結合分子誘導体が、抗体フラグメントから選択され、その具体例が、Fab、Fab’、F(ab') 2 、Fv、単鎖（scFv）、1アームおよびドメイン抗体（例えば、サメおよびラクダ抗体を含む）、および抗体を含む融合タンパク質、ならびに抗原結合／認識部位を含む任意の他の修飾形態の免疫グロブリン分子を含む、本発明1079の方法。
[本発明1081]
1つまたは複数の制御配列に機能的に連結された、本発明1054～1076のいずれかの多特異性抗原結合分子をコードする核酸配列を含む、構築物。
[本発明1082]
その代表例がプラスミド、コスミド、ファージ、およびウイルスを含む発現構築物の形態である、本発明1081の構築物。
[本発明1083]
本発明1081または本発明1082の構築物を含む、宿主細胞。
[本発明1084]
本発明1022～1053のいずれかの治療組み合わせまたは本発明1054～1076のいずれかの多特異性抗原結合分子、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
[本発明1085]
（例えば、抗増殖／抗新生物薬、細胞増殖抑制剤、癌細胞浸潤阻害剤、成長因子機能阻害剤、抗血管新生剤、血管損傷剤等から選択される）化学療法剤または免疫療法剤（例えば、サイトカイン、サイトカイン発現細胞、抗体等）から選択される、少なくとも1つの補助的薬剤
をさらに含む、本発明1084の組成物。
[本発明1086]
本発明1022～1053のいずれかの治療組み合わせまたは本発明1054～1076のいずれかの多特異性抗原結合分子を有効量で対象に投与し、それによって対象において免疫を刺激または強化する工程を含む、該工程からなる、または該工程から本質的になる、対象において免疫を刺激または強化するための方法。
[本発明1087]
前記治療組み合わせのRANKアンタゴニスト抗原結合分子および少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子が別個の成分として提供され、これらの成分が対象に同時に（concurrently）投与される、本発明1086の方法。
[本発明1088]
RANKアンタゴニスト抗原結合分子が、少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子と同時に（simultaneously）投与される、本発明1087の方法。
[本発明1089]
RANKアンタゴニスト抗原結合分子および少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子が、順次投与される、本発明1087の方法。
[本発明1090]
RANKアンタゴニスト抗原結合分子が、少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子の投与前に投与される、本発明1089の方法。
[本発明1091]
RANKアンタゴニスト抗原結合分子が、少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子の投与後に投与される、本発明1089の方法。
[本発明1092]
刺激または強化された免疫が、有益な宿主免疫応答を含み、その具体例が、以下：
腫瘍サイズの減少；腫瘍量の減少；疾患の安定化；内因性または外因性抗原に対する抗体の産生；免疫系の誘導；免疫系の1つまたは複数の成分の誘導；細胞媒介免疫およびその生成に関与する分子；液性免疫およびその生成に関与する分子；抗体依存細胞傷害（ADCC）免疫およびその生成に関与する分子；補体媒介細胞傷害（CDC）免疫およびその生成に関与する分子；ナチュラルキラー細胞；サイトカインおよびケモカインならびにそれらの生成に関与する分子および細胞；抗体依存細胞傷害；補体依存細胞傷害；ナチュラルキラー細胞活性；ならびに抗原増強細胞傷害
のいずれか1つまたは複数を含む、本発明1086～1091のいずれかの方法。
[本発明1093]
刺激または強化された免疫が、炎症促進性免疫応答を含む、本発明1092の方法。
[本発明1094]
本発明1022～1053のいずれかの治療組み合わせまたは本発明1054～1076のいずれかの多特異性抗原結合分子を腫瘍と接触させ、それによって対象において腫瘍に対する免疫抑制または寛容の発症または進行を阻害する工程を含む、該工程からなる、または該工程から本質的になる、対象において腫瘍に対する免疫抑制または寛容の発症または進行を阻害するための方法。
[本発明1095]
治療組み合わせまたは多特異性抗原結合分子がまた、免疫系に腫瘍抗原を提示する抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）と接触する、本発明1094の方法。
[本発明1096]
本発明1022～1053のいずれかの治療組み合わせまたは本発明1054～1076のいずれかの多特異性抗原結合分子を有効量で対象に投与し、それによって対象において癌の発症、進行、または再発を阻害する工程を含む、該工程からなる、または該工程から本質的になる、対象において癌の発症、進行、または再発を阻害するための方法。
[本発明1097]
本発明1022～1053のいずれかの治療組み合わせまたは本発明1054～1076のいずれかの多特異性抗原結合分子を有効量で対象に投与し、それによって癌を処置する工程を含む、該工程からなる、または該工程から本質的になる、対象において癌を処置するための方法。
[本発明1098]
癌が、黒色腫、乳癌、結腸癌、卵巣癌、子宮内膜および子宮癌腫、胃（gastric）または胃（stomach）癌、膵臓癌、前立腺癌、唾液腺癌、肺癌、肝細胞癌、膠芽腫、子宮頸癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、直腸癌、結腸直腸癌、腎臓癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、肛門癌腫、陰茎癌腫、精巣癌、食道癌、胆道の腫瘍、頭頚部癌、ならびに扁平上皮癌腫から選択され、いくつかの具体的態様においては、癌が転移癌である、本発明1097の方法。
[本発明1099]
対象が、免疫調整剤に対する減少したまたは低下した応答性を有する、例えば、対象が、ICM分子アンタゴニスト（例えば、抗PD-1または抗PD-L1免疫療法）に対する減少したまたは低下した応答性を有する、本発明1086～1098のいずれかの方法。
[本発明1100]
有効量の補助的抗癌剤を対象に同時に投与する工程をさらに含む、本発明1086～1099のいずれかの方法。
[本発明1101]
補助的抗癌剤が、化学療法剤、放射線外部照射、標的指向放射性同位体、およびシグナル伝達阻害剤を含む、本発明1100の方法。
[本発明1102]
本発明1022～1053のいずれかの治療組み合わせまたは本発明1054～1076のいずれかの多特異性抗原結合分子のいずれか1つまたは複数を含む、免疫を刺激もしくは強化するため、腫瘍に対する免疫抑制もしくは寛容の発症もしくは進行を阻害するため、または対象において癌を処置するための、キット。

Claims (102)

  1. （1）SEQ ID NO:3に示されるVHCDR1アミノ酸配列、SEQ ID NO:4に示されるVHCDR2アミノ酸配列、およびSEQ ID NO:5に示されるVHCDR3アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）、ならびにSEQ ID NO:6に示されるVLCDR1アミノ酸配列、SEQ ID NO:7に示されるVLCDR2アミノ酸配列、およびSEQ ID NO:8に示されるVLCDR3アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）；
    （2）SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を含むVH、およびSEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列を含むVL；
    （3）SEQ ID NO:1のアミノ酸配列に対して少なくとも90％（少なくとも91％～99％およびその間のすべての整数値の百分率を含む）の配列同一性を有するVH、ならびにSEQ ID NO:2のアミノ酸配列に対して少なくとも90％（少なくとも91％～99％およびその間のすべての整数値の百分率を含む）の配列同一性を有するVL；
    （4）SEQ ID NO:1のアミノ酸配列内の各CDR以外のフレームワーク領域のアミノ酸配列に対して少なくとも90％（少なくとも91％～99％およびその間のすべての整数値の百分率を含む）の配列同一性を有するVH、ならびにSEQ ID NO:2のアミノ酸配列内の各CDR以外のフレームワーク領域のアミノ酸配列に対して少なくとも90％（少なくとも91％～99％およびその間のすべての整数値の百分率を含む）の配列同一性を有するVL；または
    （5）SEQ ID NO:1のアミノ酸配列内の各CDR以外のフレームワーク領域の配列内に1つもしくは複数（例えば、1、2、3、4もしくは5個）のアミノ酸の欠失、置換、もしくは付加を含むアミノ酸配列を含むVH、およびSEQ ID NO:2のアミノ酸配列内の各CDR以外のフレームワーク領域の配列内に1つもしくは複数（例えば、1、2、3、4もしくは5個）のアミノ酸の欠失、置換、もしくは付加を含むアミノ酸配列を含むVL、
    を含む、RANKアンタゴニスト抗原結合分子。
  2. 単離、精製、合成、または組み換え形態である、請求項1記載の抗原結合分子。
  3. 一価（例えば、Fab、scFab、Fab'、scFv、1アーム抗体等）である、請求項1または請求項2記載の抗原結合分子。
  4. 以下の活性：
    （a）RANKに対するRANKLの結合を阻害する；（b）RANKの活性化を阻害する；（c）下流RANK媒介分子シグナル伝達（例えば、TRAFタンパク質のRANK動員）を阻害する；（d）RANKの多量体化を阻害する；（e）破骨細胞の分化を低下させる；（f）破骨細胞の活性化を減少させる；（g）破骨細胞の生存率を低下させる；（h）骨喪失を阻害し、骨密度を増加させる；（i）腫瘍微小環境（TME）において骨髄細胞または他の免疫細胞の免疫抑制活性を阻害する；ならびに（j）腫瘍細胞（例えば、トリプルネガティブ乳癌（TNBC）細胞およびBRCA-1変異陽性乳癌細胞を含む乳癌細胞、非小細胞肺癌（NSCLC）細胞ならびに腎細胞癌（RCC）細胞）の増殖、遊走、生存、および／または形態形成を阻害する
    の任意の1つまたは複数を有する、請求項1～3のいずれか1項または複数項記載の抗原結合分子。
  5. 送達ビヒクル（例えば、リポソーム、ナノ粒子、マイクロ粒子、デンドリマー、またはシクロデキストリン）中に含まれる、請求項1～3のいずれか1項または複数項記載の抗原結合分子。
  6. 請求項1～4のいずれか1項記載のRANKアンタゴニスト抗原結合分子をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
  7. 1つまたは複数の制御配列に機能的に連結されている請求項1～4のいずれか1項記載のRANKアンタゴニスト抗原結合分子をコードする核酸配列を含む、構築物。
  8. 発現構築物（例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、またはウイルス）の形態である、請求項7記載の構築物。
  9. 請求項8記載の構築物を含む、宿主細胞。
  10. 請求項1～4のいずれか1項記載のRANKアンタゴニスト抗原結合分子および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
  11. 骨吸収抑制剤（例えば、特に副甲状腺ホルモン、BMP2、ビタミンD、抗炎症剤からなる群より選択される、同化増強剤；および特にビスホスホネート、カテプシンK阻害剤、p38阻害剤、JNK阻害剤、IKK阻害剤、NF-κB阻害剤、カルシニューリン阻害剤、NFAT阻害剤、PI3K阻害剤からなる群より選択される、異化阻害剤）、ならびに化学療法剤（例えば、抗増殖／抗新生物薬、細胞増殖抑制剤、癌細胞浸潤阻害剤、成長因子機能阻害剤、抗血管新生剤、血管損傷剤（vascular damaging agent）等）、または免疫療法剤（例えば、サイトカイン、サイトカイン発現細胞、抗体等）
    から選択される少なくとも1つの補助的薬剤をさらに含む、請求項10記載の薬学的組成物。
  12. 請求項1～4のいずれか1項記載のRANKアンタゴニスト抗原結合分子をRANK発現細胞と接触させ、それによってRANK発現細胞に対するRANKの結合を阻害する工程を含む、RANK発現細胞に対するRANKLの結合を阻害するための方法。
  13. 請求項1～4のいずれか1項記載のRANKアンタゴニスト抗原結合分子をRANK発現細胞と接触させ、それによってRANK発現細胞におけるRANKの活性化を阻害する工程を含む、RANK発現細胞におけるRANKの活性化を阻害するための方法。
  14. 請求項1～4のいずれか1項記載のRANKアンタゴニスト抗原結合分子をRANK発現細胞と接触させ、それによってRANK発現細胞におけるRANK媒介分子シグナル伝達を阻害する工程を含む、RANK発現細胞におけるRANK媒介分子シグナル伝達（例えば、TRAFタンパク質のRANK動員）を阻害するための方法。
  15. 本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子をRANK発現細胞と接触させ、それによってRANK発現細胞におけるRANKの多量体化を阻害する工程を含む、RANK発現細胞におけるRANKの多量体化を阻害するための方法。
  16. RANK発現細胞が、破骨細胞、免疫細胞、例えば、抗原提示細胞（例えば、単球および樹状細胞）ならびにエフェクター免疫細胞（例えば、T細胞）、造血前駆体、ならびに腫瘍細胞、例えば、乳癌細胞、前立腺癌細胞、NSCLC細胞、およびRCC細胞から選択される、請求項12～15のいずれか1項記載の方法。
  17. 請求項1～4のいずれか1項記載のRANKアンタゴニスト抗原結合分子を破骨細胞と接触させ、それによって破骨細胞の分化、活性化、および／または生存を阻害する工程を含む、破骨細胞の分化、活性化および／または生存を阻害するための方法。
  18. 請求項1～4のいずれか1項記載のRANKアンタゴニスト抗原結合分子を免疫細胞と接触させ、それによって免疫細胞の免疫抑制活性を阻害する工程を含む、免疫細胞（例えば、骨髄細胞またはTreg）の免疫抑制活性を阻害するための方法。
  19. 請求項1～4のいずれか1項記載のRANKアンタゴニスト抗原結合分子を腫瘍細胞と接触させ、それによって腫瘍細胞の増殖、生存、または遊走を阻害する工程を含む、腫瘍細胞の増殖、生存、または遊走を阻害するための方法。
  20. 対象においてRANKL/RANKシグナル伝達経路の活性化に関連する状態を処置するまたは発症を阻害するための方法であって、
    請求項1～4のいずれか1項記載のRANKアンタゴニスト抗原結合分子を有効量で対象に投与し、それによって該状態を処置するまたは発症を阻害する工程を含む、方法。
  21. RANKL/RANKシグナル伝達経路の活性化に関連する状態が、骨減少障害、ミオパチー、および癌から選択される、請求項20記載の方法。
  22. 請求項1～4のいずれか1項記載のRANKアンタゴニスト抗原結合分子および少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる、治療組み合わせ。
  23. RANKアンタゴニスト抗原結合分子および少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子が、単一組成物（例えば、混合物）の形態である、請求項22記載の治療組み合わせ。
  24. RANKアンタゴニスト抗原結合分子および少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子が、別々の組成物中の別個の成分の形態である、請求項22記載の治療組み合わせ。
  25. 少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子が、プログラム死1受容体（PD-1）、プログラム死リガンド1（PD-L1）、プログラム死リガンド2（PD-L2）、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4（CTLA-4）、A2Aアデノシン受容体（A2AR）、A2Bアデノシン受容体（A2BR）、B7-H3（CD276）、Vセットドメイン含有T細胞活性化阻害因子1（VTCN1）、BおよびTリンパ球アテニュエーター（BTLA）、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（KIR）、リンパ球活性化遺伝子3（LAG3）、T細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン3（TIM-3）、T細胞活性化のVドメインIgサプレッサー（VISTA）、5'-ヌクレオチダーゼ（CD73）、タクタイル（CD96）、ポリオウイルス受容体（CD155）、DNAXアクセサリー分子1（DNAM-1）、ポリオウイルス受容体関連2（CD112）、細胞傷害性および制御性T細胞分子（CRTAM）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー4（TNFRS4；OX40；CD134）、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリー、メンバー4（TNFSF4；OX40リガンド（OX40L））、ナチュラルキラー細胞受容体2B4（CD244）、CD160、グルココルチコイド誘導TNFR関連タンパク質（GITR）、グルココルチコイド誘導TNFR関連タンパク質リガンド（GITRL）、誘導性共刺激因子（ICOS）、ガレクチン9（GAL-9）、4-1BBリガンド（4-1BBL；CD137L）、4-1BB（4-1BB；CD137）、CD70（CD27リガンド（CD27L））、CD28、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、シグナル調節タンパク質（SIRP-1）、インテグリン関連タンパク質（IAP；CD47）、B-リンパ球活性化マーカー（BLAST-1；CD48）、ナチュラルキラー細胞受容体2B4（CD244）；CD40、CD40リガンド（CD40L）、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（HVEM）、膜貫通および免疫グロブリンドメイン含有2（TMIGD2）、HERV-H LTR関連2（HHLA2）、血管内皮成長阻害因子（VEGI）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー25（TNFRS25）、誘導性T細胞共刺激因子リガンド（ICOLG；B7RP1）およびIgおよびITIM（免疫受容体チロシン型阻害モチーフ）ドメイン（TIGIT）を有するT細胞免疫受容体からなる群より選択されるICMをアンタゴナイズする、請求項22～24のいずれか1項記載の治療組み合わせ。
  26. 少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子が、PD-1アンタゴニスト抗原結合分子、PD-L1アンタゴニスト抗原結合分子、およびCTLA4アンタゴニスト抗原結合分子から選択される、請求項25記載の治療組み合わせ。
  27. 少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子が、PD-1アンタゴニスト抗原結合分子を含む、請求項25記載の治療組み合わせ。
  28. 少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子が、PD-L1アンタゴニスト抗原結合分子を含む、請求項25記載の治療組み合わせ。
  29. 少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子が、CTLA4アンタゴニスト抗原結合分子を含む、請求項25記載の治療組み合わせ。
  30. 少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子が、PD-1アンタゴニスト抗原結合分子およびPD-L1アンタゴニスト抗原結合分子を含む、請求項25記載の治療組み合わせ。
  31. 少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子が、PD-1アンタゴニスト抗原結合分子およびCTLA4アンタゴニスト抗原結合分子を含む、請求項25記載の治療組み合わせ。
  32. 少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子が、PD-L1アンタゴニスト抗原結合分子およびCTLA4アンタゴニストを含む、請求項25記載の治療組み合わせ。
  33. 抗ICM抗原結合分子が、Treg細胞が発現しないまたは低レベルで発現するICMをアンタゴナイズする、請求項25記載の治療組み合わせ。
  34. 抗ICM抗原結合分子が、TregにおいてCTLA4よりも低レベルで発現されるICM（例えば、PD-1またはPD-L1）をアンタゴナイズする、請求項25記載の治療組み合わせ。
  35. 抗ICM抗原結合分子が、Tregよりも免疫エフェクター細胞（例えば、エフェクターT細胞、マクロファージ、樹状細胞、B細胞等）において高レベルで発現されるICM（例えば、PD-1またはPD-L1）をアンタゴナイズする、請求項25記載の治療組み合わせ。
  36. 抗PD-1抗原結合分子が、その非限定的な例がニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、およびMEDI-0680（AMP-514）、AMP-224、JS001-PD-1、SHR-1210、Gendor PD-1、PDR001、CT-011、REGN2810、BGB-317を含むMAbもしくはその抗原結合フラグメントであるか、またはPD-1への結合に関してニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、もしくはMEDI-0680と競合するものである、請求項27記載の治療組み合わせ。
  37. 抗PD-1抗原結合分子が、
    SEQ ID NO:9（すなわち、SEQ ID NO:10に示されるネイティブPD-1配列の残基62～86）、
    SEQ ID NO:11（すなわち、SEQ ID NO:10に示されるネイティブPD-1配列の残基118～136）、および
    SEQ ID NO:12（すなわち、SEQ ID NO:10に示されるネイティブPD-1配列の残基66～97に対応する）
    に示されるアミノ酸配列の1つまたは複数のアミノ酸に特異的に結合する、請求項27または請求項36記載の治療組み合わせ。
  38. 抗PD-L1抗原結合分子が、その非限定的な例がデュルバルマブ（MEDI4736）、アテゾリズマブ（テセントリク）、アベルマブ、BMS-936559/MDX-1105、MSB0010718C、LY3300054、CA-170、GNS-1480、およびMPDL3280Aを含むMAb、またはその抗原結合フラグメントである、請求項28記載の治療組み合わせ。
  39. 抗PD-L1抗原結合分子が、SEQ ID NO:13（すなわち、SEQ ID NO:14に示される全長ネイティブPD-L1アミノ酸配列の残基279～290）に示されるアミノ酸配列内の1つまたは複数のアミノ酸に特異的に結合し、PD-L1への結合に関してデュルバルマブ（MEDI4736）、アテゾリズマブ（テセントリク）、アベルマブ、BMS 936559/MDX-1105、MSB0010718C、LY3300054、CA-170、GNS-1480およびMPDL3280Aと競合するものである、請求項28または請求項38記載の治療組み合わせ。
  40. 抗CTLA4抗原結合分子が、その代表例がイピリムマブおよびトレメリムマブを含むMAbもしくはその抗原結合フラグメントであるか、またはCTLA4への結合に関してイピリムマブもしくはトレメリムマブと競合するものである、請求項29記載の治療組み合わせ。
  41. 抗CTLA4抗原結合分子が、
    SEQ ID NO:15（すなわち、SEQ ID NO:16に示される全長ネイティブCTLA4アミノ酸配列の残基25～42）、
    SEQ ID NO:17（すなわち、SEQ ID NO:16に示されるネイティブCTLA4配列の残基43～65）、および
    SEQ ID NO:18（すなわち、SEQ ID NO:16に示されるネイティブCTLA4配列の残基96～109）
    のいずれか1つに示される配列から選択されるアミノ酸配列内の1つまたは複数のアミノ酸に特異的に結合する、請求項29または請求項40記載の治療組み合わせ。
  42. RANKまたはICM抗原結合分子が、免疫グロブリン定常鎖（例えば、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、またはIgG4定常鎖）に連結される、請求項22～41のいずれか1項記載の治療組み合わせ。
  43. 免疫グロブリン定常鎖が、
    κ軽鎖またはλ軽鎖から選択される軽鎖；ならびに
    γ1重鎖、γ2重鎖、γ3重鎖、およびγ4重鎖から選択される重鎖
    を含み得る、請求項42記載の治療組み合わせ。
  44. 請求項1～4のいずれか1項記載のRANKアンタゴニスト抗原結合分子および2つまたはそれ以上の異なる抗ICM抗原結合分子を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる、請求項22～43のいずれか1項記載の治療組み合わせ。
  45. 本明細書に記載されるRANKアンタゴニスト抗原結合分子、ならびに
    抗CTLA4抗原結合分子、抗PD-1抗原結合分子、および抗PD-L1抗原結合分子の少なくとも2つ
    を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる、請求項44記載の治療組み合わせ。
  46. 治療組み合わせの個々の抗原結合分子が別個の成分の形態である、請求項22～45のいずれか1項記載の治療組み合わせ。
  47. 治療組み合わせの個々の抗原結合分子が、相互に（直接的もしくは間接的のいずれかで）融合されるかまたはそれ以外の方法でコンジュゲートされる、請求項22～45のいずれか1項記載の治療組み合わせ。
  48. 請求項1～4のいずれか1項記載のRANKアンタゴニスト抗原結合分子および少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子を含む多特異性アンタゴニスト剤の形態である、請求項47記載の治療組み合わせ。
  49. 多特異性剤が2つまたはそれ以上のポリペプチドの複合体である、請求項48記載の治療組み合わせ。
  50. 多特異性剤が単鎖ポリペプチドである、請求項48記載の治療組み合わせ。
  51. RANKアンタゴニスト抗原結合分子が、個々の抗ICM抗原結合分子のN末端またはC末端にコンジュゲートされる、請求項50記載の治療組み合わせ。
  52. RANKアンタゴニスト抗原結合分子と抗ICM抗原結合分子が、直接的にまたは介在リンカー（例えば、ポリペプチドリンカー）により接続される、請求項50または請求項51記載の治療組み合わせ。
  53. 送達ビヒクル（例えば、リポソーム、ナノ粒子、マイクロ粒子、デンドリマー、またはシクロデキストリン）中に含まれる、請求項22～52のいずれか1項項記載の治療組み合わせ。
  54. 請求項1～4のいずれか1項記載のRANKアンタゴニスト抗原結合分子および少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる、RANKおよび少なくとも1つのICMを共アンタゴナイズするための多特異性抗原結合分子。
  55. RANKアンタゴニスト抗原結合分子が、RANKに特異的に結合しかつアンタゴナイズする抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項54記載の多特異性抗原結合分子。
  56. 個々の抗ICM抗原結合分子が、対応するICMに特異的に結合しかつアンタゴナイズする抗体またはその抗原結合フラグメントから選択される、請求項54または請求項55記載の多特異性抗原結合分子。
  57. 抗体および／または抗原結合フラグメントが、直接的にまたは介在リンカー（例えば、化学リンカーもしくはポリペプチドリンカー）により接続される、請求項55または請求項56記載の多特異性抗原結合分子。
  58. RANKアンタゴニスト抗原結合分子および少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子が機能的に接続された単鎖ポリペプチドの形態である、請求項54～57のいずれか1項記載の多特異性抗原結合分子。
  59. RANKアンタゴニスト抗原結合分子および少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子が複合体を形成するよう相互に連結またはそれ以外の方法で結合された個別のポリペプチド鎖の形態である、請求項54～57のいずれか1項記載の多特異性抗原結合分子。
  60. 二価、三価、または四価である、請求項54～59のいずれか1項記載の多特異性抗原結合分子。
  61. RANKアンタゴニスト抗原結合分子および少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子が、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFv分子、ならびに相補性決定領域（CDR）から選択される、請求項54～60のいずれか1項記載の多特異性抗原結合分子。
  62. 個々の抗原結合分子が、IgG、IgM、IgD、IgA、およびIgEからなる群より独立して選択される定常ドメインを含む、請求項54～61のいずれか1項記載の多特異性抗原結合分子。
  63. タンデムscFv（taFvもしくはscFv2）、ダイアボディ、dAb2/VHH2、ノブ・イン・ホール（knobs-in-holes）誘導体、Seedcod-IgG、ヘテロFc-scFv、Fab-scFv、scFv-Jun/Fos、Fab'-Jun/Fos、トリボディ、DNL-F(ab)3、scFv3-CH1/CL、Fab-scFv2、IgG-scFab、IgG-scFv、scFv-IgG、scFv2-Fc、F(ab')2-scFv2、scDB-Fc、scDb-CH3、Db-Fc、scFv2-H/L、DVD-Ig、tandAb、scFv-dhlx-scFv、dAb2-IgG、dAb-IgG、dAb-Fc-dAb、tandab、DART、BiKE、TriKE、mFc-VH、架橋MAb、クロスMAb、MAb2、FIT-Ig、静電気的適合抗体、対称性IgG様抗体、LUZ-Y、Fab交換抗体、またはそれらの組み合わせを含む、請求項54～62のいずれか1項記載の多特異性抗原結合分子。
  64. 個々の抗原結合分子が、免疫グロブリン定常鎖（例えば、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、およびIgG4）に連結される、請求項54～63のいずれか1項記載の多特異性抗原結合分子。
  65. 免疫グロブリン定常鎖が、
    κ軽鎖およびλ軽鎖から選択される軽鎖；ならびに
    γ1重鎖、γ2重鎖、γ3重鎖、およびγ4重鎖から選択される重鎖
    を含む、請求項64記載の多特異性抗原結合分子。
  66. 多特異性抗原結合分子がPD-1をアンタゴナイズし、
    抗PD-1抗原結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）が、
    SEQ ID NO:9（すなわち、SEQ ID NO:10に示されるネイティブヒトPD-1配列の残基62～86）、
    SEQ ID NO:11（すなわち、SEQ ID NO:10に示されるネイティブヒトPD-1配列の残基118～136）、および
    SEQ ID NO:12（すなわち、SEQ ID NO:10に示されるネイティブヒトPD-1配列の残基66～97に対応する）
    から選択されるアミノ酸配列の1つまたは複数のアミノ酸に特異的に結合する、
    請求項54～65のいずれか1項記載の多特異性抗原結合分子。
  67. 抗PD-1抗原結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）が、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、およびMEDI-0680（AMP-514）、AMP-224、JS001-PD-1、SHR-1210、Gendor PD-1、PDR001、CT-011、REGN2810、BGB-317から選択されるMAbの重鎖および軽鎖、またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項66記載の多特異性抗原結合分子。
  68. 多特異性抗原結合分子がPD-L1をアンタゴナイズし、
    抗PD-L1抗原結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）が、SEQ ID NO:13に示されるアミノ酸配列（すなわち、SEQ ID NO:14に示されるネイティブヒトPD-L1アミノ酸配列の残基279～290）の1つまたは複数のアミノ酸に特異的に結合する、
    請求項54～67のいずれか1項記載の多特異性抗原結合分子。
  69. 抗PD-L1抗原結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）が、デュルバルマブ（MEDI4736）、アテゾリズマブ（テセントリク）、アベルマブ、BMS-936559/MDX-1105、MSB0010718C、LY3300054、CA-170、GNS-1480、およびMPDL3280Aから選択されるMAbの重鎖および軽鎖、またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項68記載の多特異性抗原結合分子。
  70. 多特異性抗原結合分子がCTLA4をアンタゴナイズし、
    抗CTLA4抗原結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）が、
    SEQ ID NO:15（すなわち、SEQ ID NO:16に示される全長ネイティブPD-CTLA4アミノ酸配列の残基25～42）、
    SEQ ID NO:17（すなわち、SEQ ID NO:16に示されるネイティブCTLA4配列の残基43～65）、および
    SEQ ID NO:18（すなわち、SEQ ID NO:16に示されるネイティブCTLA4配列の残基96～109）
    から選択されるアミノ酸配列の1つまたは複数のアミノ酸に特異的に結合する、
    請求項54～69のいずれか1項記載の多特異性抗原結合分子。
  71. 抗CTLA4抗原結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）が、イピリムマブおよびトレメリムマブから選択されるMAbの重鎖および軽鎖、またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項70記載の多特異性抗原結合分子。
  72. 請求項1～4のいずれか1項記載のRANKアンタゴニスト抗原結合分子および抗PD-1抗原結合分子を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる、請求項54～71のいずれか1項記載の多特異性抗原結合分子。
  73. 請求項1～4のいずれか1項記載のRANKアンタゴニスト抗原結合分子および抗PD-L1抗原結合分子を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる、請求項54～71のいずれか1項記載の多特異性抗原結合分子。
  74. 請求項1～4のいずれか1項記載のRANKアンタゴニスト抗原結合分子ならびに抗PD-1抗原結合分子および抗PD-L1抗原結合分子を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる、請求項54～71のいずれか1項記載の多特異性抗原結合分子。
  75. 請求項1～4のいずれか1項記載のRANKアンタゴニスト抗原結合分子ならびに抗PD-1抗原結合分子および抗CTLA4抗原結合分子を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる、請求項54～71のいずれか1項記載の多特異性抗原結合分子。
  76. 請求項1～4のいずれか1項記載のRANKアンタゴニスト抗原結合分子および抗PD-L1抗原結合分子を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる、請求項54～71のいずれか1項記載の多特異性抗原結合分子。
  77. 請求項1～4のいずれか1項記載のRANKアンタゴニスト抗原結合分子および少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子を組み合わせて、それによって治療組み合わせを製造する工程
    を含む、請求項54～76のいずれか1項記載の治療組み合わせの製造方法。
  78. （例えば、標的ポリペプチドに対応するアミノ酸配列を含む免疫刺激ポリペプチドを用いて動物を免疫刺激し；標的ポリペプチドまたはその少なくとも1つの領域に特異的に結合するB細胞を同定および／または動物から単離し；そのB細胞により発現される抗原結合分子を産生させることによって）治療組み合わせの標的ポリペプチド（例えば、RANKまたはICM）に特異的に結合しかつアンタゴナイズする抗原結合分子を生成する工程
    をさらに含む、請求項77記載の方法。
  79. そのようにして生成された抗原結合分子を誘導体化して、該抗原結合分子と同じエピトープ結合特異性を有する抗原結合分子誘導体を製造する工程
    をさらに含む、請求項77または請求項78記載の方法。
  80. 抗原結合分子誘導体が、抗体フラグメントから選択され、その具体例が、Fab、Fab’、F(ab')2、Fv、単鎖（scFv）、1アームおよびドメイン抗体（例えば、サメおよびラクダ抗体を含む）、および抗体を含む融合タンパク質、ならびに抗原結合／認識部位を含む任意の他の修飾形態の免疫グロブリン分子を含む、請求項79記載の方法。
  81. 1つまたは複数の制御配列に機能的に連結された、請求項54～76のいずれか1項記載の多特異性抗原結合分子をコードする核酸配列を含む、構築物。
  82. その代表例がプラスミド、コスミド、ファージ、およびウイルスを含む発現構築物の形態である、請求項81記載の構築物。
  83. 請求項81または請求項82記載の構築物を含む、宿主細胞。
  84. 請求項22～53のいずれか1項記載の治療組み合わせまたは請求項54～76のいずれか1項記載の多特異性抗原結合分子、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
  85. （例えば、抗増殖／抗新生物薬、細胞増殖抑制剤、癌細胞浸潤阻害剤、成長因子機能阻害剤、抗血管新生剤、血管損傷剤等から選択される）化学療法剤または免疫療法剤（例えば、サイトカイン、サイトカイン発現細胞、抗体等）から選択される、少なくとも1つの補助的薬剤
    をさらに含む、請求項84記載の組成物。
  86. 請求項22～53のいずれか1項記載の治療組み合わせまたは請求項54～76のいずれか1項記載の多特異性抗原結合分子を有効量で対象に投与し、それによって対象において免疫を刺激または強化する工程を含む、該工程からなる、または該工程から本質的になる、対象において免疫を刺激または強化するための方法。
  87. 前記治療組み合わせのRANKアンタゴニスト抗原結合分子および少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子が別個の成分として提供され、これらの成分が対象に同時に（concurrently）投与される、請求項86記載の方法。
  88. RANKアンタゴニスト抗原結合分子が、少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子と同時に（simultaneously）投与される、請求項87記載の方法。
  89. RANKアンタゴニスト抗原結合分子および少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子が、順次投与される、請求項87記載の方法。
  90. RANKアンタゴニスト抗原結合分子が、少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子の投与前に投与される、請求項89記載の方法。
  91. RANKアンタゴニスト抗原結合分子が、少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子の投与後に投与される、請求項89記載の方法。
  92. 刺激または強化された免疫が、有益な宿主免疫応答を含み、その具体例が、以下：
    腫瘍サイズの減少；腫瘍量の減少；疾患の安定化；内因性または外因性抗原に対する抗体の産生；免疫系の誘導；免疫系の1つまたは複数の成分の誘導；細胞媒介免疫およびその生成に関与する分子；液性免疫およびその生成に関与する分子；抗体依存細胞傷害（ADCC）免疫およびその生成に関与する分子；補体媒介細胞傷害（CDC）免疫およびその生成に関与する分子；ナチュラルキラー細胞；サイトカインおよびケモカインならびにそれらの生成に関与する分子および細胞；抗体依存細胞傷害；補体依存細胞傷害；ナチュラルキラー細胞活性；ならびに抗原増強細胞傷害
    のいずれか1つまたは複数を含む、請求項86～91のいずれか1項記載の方法。
  93. 刺激または強化された免疫が、炎症促進性免疫応答を含む、請求項92記載の方法。
  94. 請求項22～53のいずれか1項記載の治療組み合わせまたは請求項54～76のいずれか1項記載の多特異性抗原結合分子を腫瘍と接触させ、それによって対象において腫瘍に対する免疫抑制または寛容の発症または進行を阻害する工程を含む、該工程からなる、または該工程から本質的になる、対象において腫瘍に対する免疫抑制または寛容の発症または進行を阻害するための方法。
  95. 治療組み合わせまたは多特異性抗原結合分子がまた、免疫系に腫瘍抗原を提示する抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）と接触する、請求項94記載の方法。
  96. 請求項22～53のいずれか1項記載の治療組み合わせまたは請求項54～76のいずれか1項記載の多特異性抗原結合分子を有効量で対象に投与し、それによって対象において癌の発症、進行、または再発を阻害する工程を含む、該工程からなる、または該工程から本質的になる、対象において癌の発症、進行、または再発を阻害するための方法。
  97. 請求項22～53のいずれか1項記載の治療組み合わせまたは請求項54～76のいずれか1項記載の多特異性抗原結合分子を有効量で対象に投与し、それによって癌を処置する工程を含む、該工程からなる、または該工程から本質的になる、対象において癌を処置するための方法。
  98. 癌が、黒色腫、乳癌、結腸癌、卵巣癌、子宮内膜および子宮癌腫、胃（gastric）または胃（stomach）癌、膵臓癌、前立腺癌、唾液腺癌、肺癌、肝細胞癌、膠芽腫、子宮頸癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、直腸癌、結腸直腸癌、腎臓癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、肛門癌腫、陰茎癌腫、精巣癌、食道癌、胆道の腫瘍、頭頚部癌、ならびに扁平上皮癌腫から選択され、いくつかの具体的態様においては、癌が転移癌である、請求項97記載の方法。
  99. 対象が、免疫調整剤に対する減少したまたは低下した応答性を有する、例えば、対象が、ICM分子アンタゴニスト（例えば、抗PD-1または抗PD-L1免疫療法）に対する減少したまたは低下した応答性を有する、請求項86～98のいずれか1項記載の方法。
  100. 有効量の補助的抗癌剤を対象に同時に投与する工程をさらに含む、請求項86～99のいずれか1項記載の方法。
  101. 補助的抗癌剤が、化学療法剤、放射線外部照射、標的指向放射性同位体、およびシグナル伝達阻害剤を含む、請求項100記載の方法。
  102. 請求項22～53のいずれか1項記載の治療組み合わせまたは請求項54～76のいずれか1項記載の多特異性抗原結合分子のいずれか1つまたは複数を含む、免疫を刺激もしくは強化するため、腫瘍に対する免疫抑制もしくは寛容の発症もしくは進行を阻害するため、または対象において癌を処置するための、キット。
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