CN109152835A - 双特异性结合蛋白及其用途 - Google Patents

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Abstract

本披露总体上提供了如下蛋白，该蛋白结合两个表位(例如，第一和第二表位)并且是二价的，用于结合该第一和第二表位中的每一个。本披露还提供了与靶标蛋白结合的特异性结合蛋白，包括抗体。本披露还提供了包含此类蛋白的组合物、编码此类蛋白的核酸分子以及制备此类蛋白的方法。本披露提供了在受试者中诱导免疫应答的方法，以及通过向该受试者给予蛋白、核酸分子和/或组合物用于治疗或预防该受试者中的癌症的方法。

Description

双特异性结合蛋白及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年5月6日提交的美国临时申请号62/332,788的优先权和权益，将其披露内容通过引用以其全文并入本文。
序列表
本申请连同电子格式的序列表一起提交。该序列表被提供为创建于2017年5月2日的、标题为IOBS_100_ST25.txt的文件，其大小是244kb。将电子格式的序列表的信息通过引用以其全文并入本文。
背景技术
癌症仍然是主要的全球健康负担。尽管在癌症的治疗方面有所进展，但对于更有效且毒性更小的治疗仍然存在未满足的医疗需求，尤其对于患有对现有治疗具有抗性的晚期疾病或癌症的那些患者。
免疫系统，特别是T细胞介导的细胞毒性在肿瘤控制中的作用是公认的。有越来越多的证据表明T细胞在癌症患者中控制肿瘤生长和存活，无论是在该疾病的早期和晚期阶段。然而，肿瘤特异性T细胞应答很难在癌症患者中上升和维持。当与利用非特异性化学疗法和/或放射的疗法相比，刺激或增强对抗癌症的先天免疫应答的癌症免疫疗法的持续进展和成功使得这类疗法成为有吸引力的治疗选择。
已经鉴定了许多分子靶标的作为对抗癌症的免疫肿瘤学(IO)疗法的潜在效用。一些分子靶标(正在研究其在免疫肿瘤疗法领域的治疗潜力)包括细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4或CD152)、程序性死亡配体1(PD-L1或B7-H1或CD274)、程序性死亡-1(PD-1)、OX40(CD134或TNFRSF4)和T细胞抑制性受体T细胞免疫球蛋白粘蛋白分子3(TIM3)。虽然这些靶标中的一些在治疗上已经被成功地利用(例如，PD-1和CTLA-4)，但是许多患者对已经开发的疗法无应答。并且，虽然可以考虑包括更高剂量和/或免疫疗法的组合的治疗方案，但是这类疗法可能与副作用的风险增加相关，其中副作用随着更高的剂量和累积暴露而增加，并且当与联合免疫疗法组合使用时似乎是加成的。一些常见的副作用包括下垂体炎、甲状腺炎、肾上腺功能不全、小肠结肠炎、皮炎、肺炎、肝炎、胰腺炎、运动和感觉神经病、以及关节炎。此外，由于免疫疗法典型地与高成本相关，因此包括免疫疗法组合的疗法对于患者来说可能是成本过高的。
因此，仍然需要继续鉴定IO疗法的候选靶标，开发针对现有靶标的新疗法，并开发治疗策略以避免目前使用的免疫疗法的缺点，包括缺乏患者应答和增加的联合治疗涉及的副作用风险。对于靶标分子的组合是双特异性的IO疗法(例如，结合蛋白)，特别是当与对单独的单特异性结合蛋白的组合的结合亲和力相比时对靶标分子展现出更大结合亲和力的那些，代表一类在治疗潜力方面特别令人希望的分子。
发明内容
本发明提供了如下双特异性分子或蛋白，该双特异性分子或蛋白结合两个表位(例如，第一和第二表位)并且是二价的，用于结合该第一和第二表位中的每一个。本发明还提供了在受试者中诱导免疫应答的方法，以及通过向该受试者给予蛋白、核酸分子和/或组合物用于治疗或预防该受试者(例如，人类受试者)中的癌症的方法。
在一个方面，本发明提供了一种蛋白，所述蛋白含有：结合第一表位的第一结合结构域(BD1)、结合第二表位的第二结合结构域(BD2)、和具有CH2和CH3结构域的Fc区；其中该Fc区包括在CH2结构域中的、在CH3结构域中的、或在CH2和CH3结构域的界面处的溶剂暴露环处的BD2；并且其中该蛋白是二价的，用于结合该第一和第二表位中的每一个。
在另一个方面，本发明提供了含有根据本文任何方面的蛋白或抗体和药学上可接受的载体的组合物。
在另一个方面，本发明提供了治疗或预防受试者中的癌症的方法，该方法涉及给予该受试者(例如，人类受试者)根据本文任何方面的蛋白或抗体。在各种实施例中，该癌症是卵巢癌、乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、膀胱癌、头颈癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾细胞癌、和肺癌中的一种或多种。
在另一个方面，本发明提供了在受试者中诱导免疫应答的方法，该方法涉及给予该受试者(例如，人类受试者)根据本文任何方面的蛋白或抗体。
在另一个方面，本发明提供了具有编码根据本文任何方面的蛋白或抗体的核苷酸序列的核酸分子。
在另一个方面，本发明提供了含有根据本文任何方面的核酸分子的载体。
在另一个方面，本发明提供了含有根据本文任何方面的载体的宿主细胞。
在一个方面，本发明提供了结合PD-1和CTLA-4的双特异性结合蛋白，该双特异性结合蛋白具有：具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第一肽和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的第二肽。
在另一个方面，本发明提供了结合PD-1和CTLA-4的双特异性结合蛋白，该双特异性结合蛋白具有：具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第一肽和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的第二肽。
在另一个方面，本发明提供了结合PD-1和CTLA-4的双特异性结合蛋白，该双特异性结合蛋白具有：具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的第一肽和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的第二肽。
在一个方面，本发明提供了结合PD-1和CTLA-4的双特异性结合蛋白，该双特异性结合蛋白具有：具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的第一重链、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的第一轻链、具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的第二重链、和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的第二轻链。
在一个方面，本发明提供了结合PD-L1和CTLA-4的双特异性结合蛋白，该双特异性结合蛋白具有：具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的第一肽和具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的第二肽。
在另一个方面，本发明提供了结合PD-L1和CTLA-4的双特异性结合蛋白，该双特异性结合蛋白具有：具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的第一肽和具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的第二肽。
在另一个方面，本发明提供了结合PD-L1和CTLA-4的双特异性结合蛋白，该双特异性结合蛋白具有：具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的第一肽和具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的第二肽。
在一个方面，本发明提供了结合PD-1和TIM3的双特异性结合蛋白，该双特异性结合蛋白具有：具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第一肽和具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的第二肽。
在另一个方面，本发明提供了结合PD-1和TIM3的双特异性结合蛋白，该双特异性结合蛋白具有：具有SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:91的氨基酸序列的第一肽和具有SEQ IDNO:23或SEQ ID NO:92的氨基酸序列的第二肽。
在另一个方面，本发明提供了结合PD-1和TIM3的双特异性结合蛋白，该双特异性结合蛋白具有：具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的第一重链、具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的第一轻链、具有或SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:30的氨基酸序列的第二重链、和具有SEQID NO:26或SEQ ID NO:28的氨基酸序列的第二轻链。
在一个方面，本发明提供了结合OX40和PD-L1的双特异性结合蛋白，该双特异性结合蛋白具有：具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的第一肽和具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的第二肽。
在另一个方面，本发明提供了结合OX40和PD-L1的双特异性结合蛋白，该双特异性结合蛋白具有：具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的第一肽和具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的第二肽。
在另一个方面，本发明提供了结合OX40和PD-L1的双特异性结合蛋白，该双特异性结合蛋白具有：具有SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:94的氨基酸序列的第一肽和具有SEQ IDNO:32或SEQ ID NO:93的氨基酸序列的第二肽。
在一个方面，本发明提供了结合TIM3的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段具有：具有CDR1、CDR2、和CDR3的重链和具有CDR1、CDR2、和CDR3的轻链，其中该重链CDR1包含SEQ ID NO:88，重链CDR2包含SEQ ID NO:80，重链CDR3包含SEQ ID NO:81，且该轻链CDR1包含SEQ ID NO:82，轻链CDR2包含SEQ ID NO:83，轻链CDR3包含SEQ ID NO:84。
在其他方面，本发明提供了具有双特异性结合蛋白和药学上可接受的载体的组合物、具有编码双特异性结合蛋白的核苷酸序列的核酸分子、通过给予双特异性结合蛋白治疗或预防受试者中的癌症的方法、和通过给予双特异性结合蛋白增强受试者中的免疫应答的方法。
在本文描述的任何方面的各种实施例中，该Fc区包含在该CH2结构域中的、在该CH3结构域中的、或在该CH2和CH3结构域的界面处的氨基酸序列中的溶剂暴露环处的BD2。
在本文描述的任何方面的各种实施例中，该溶剂暴露环包括来自该CH2结构域的氨基酸序列。在具体的实施例中，该溶剂暴露环包括氨基酸序列ISRTP(SEQ ID NO:39)。
在本文描述的任何方面的各种实施例中，该溶剂暴露环包括来自该CH3结构域的氨基酸序列。在具体的实施例中，该溶剂暴露环包括氨基酸序列SNG。
在本文描述的任何方面的各种实施例中，该溶剂暴露环包括来自CH2结构域和CH3结构域的界面的氨基酸序列。在具体的实施例中，如权利要求7所述的蛋白，其中该溶剂暴露环包含氨基酸序列AKGQP(SEQ ID NO:40)。
在本文描述的任何方面的各种实施例中，BD2是或包括单链可变片段(scFv)。
在本文描述的任何方面的各种实施例中，BD1是或包括结合结构域，该结合结构域是Fab结构域、scFv、单结构域抗体、和抗体可变结构域中的一种或多种。在具体的实施例中，BD1包括Fab结构域。
在本文描述的任何方面的各种实施例中，该Fab结构域经由抗体铰链区与Fc区连接。在某些实施例中，该Fc区是或包括如下结构域，该结构域是来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、或IgD的Fc区中的一种或多种。在具体的实施例中，该Fc区包含变体Fc区。在一些实施例中，该Fc区是未糖基化的、去糖基化的、和/或是未岩藻糖基化的或具有减少的岩藻糖基化。
在本文描述的任何方面的各种实施例中，该蛋白进一步包括BD2和该Fc区之间的蛋白接头L1。在本文描述的任何方面的各种实施例中，该蛋白进一步包括BD2和该Fc区之间的第一蛋白接头L1和第二蛋白接头L2。在本文描述的任何方面的各种实施例中，BD2经由蛋白接头L1与Fc区缔合。在本文描述的任何方面的各种实施例中，BD2经由蛋白接头L1和L2与Fc区缔合。在某些实施例中，L1和L2独立地选自(G4S)2(SEQ ID NO:41)、(G4S)3(SEQ ID NO:42)、和(G4S)4(SEQ ID NO:43)。
在本文描述的任何方面的各种实施例中，该蛋白包括嵌合重链，该嵌合重链包含以下多肽结构域，从N-末端到C-末端：VH1-CH1-CH2(N-末端)-BD2-CH2(C-末端)-CH3；并且BD1包括Fab结构域；其中VH1包括Fab结构域的重链可变结构域，且CH1包括Fab的重链恒定结构域1。
在本文描述的任何方面的各种实施例中，该蛋白包括嵌合重链，该嵌合重链包含以下多肽结构域，从N-末端到C-末端：VH1-CH1-CH2-BD2-CH3；并且BD1包括Fab结构域；其中VH1包含Fab结构域的重链可变结构域，且CH1包括Fab的重链恒定结构域1。
在本文描述的任何方面的各种实施例中，该蛋白包括嵌合重链，该嵌合重链包含以下多肽结构域，从N-末端到C-末端：VH1-CH1-CH2-CH3(N-末端)-BD2-CH3(C-末端)；并且BD1包括Fab结构域；其中VH1包括Fab结构域的重链可变结构域，且CH1包括Fab的重链恒定结构域1。
在本文描述的任何方面的各种实施例中，BD2是或包括scFv。在具体的实施例中，该scFv包括，从N-末端到C-末端：VH2-多肽接头-VL2或VL2-多肽接头-VH2；其中VH2包括scFv的重链可变结构域，且VL2包括scFv的轻链可变结构域。
在本文描述的任何方面的各种实施例中，该蛋白进一步包括BD2和该Fc区之间的蛋白接头L1。在本文描述的任何方面的各种实施例中，该蛋白进一步包括BD2和该Fc区之间的第一蛋白接头L1和第二蛋白接头L2。
在本文描述的任何方面的各种实施例中，该BD2经由接头(L1)与Fc区的CH2结构域、CH2结构域、或CH2和CH3结构域的界面缔合。
在本文描述的任何方面的各种实施例中，该BD2经由两个蛋白接头L1和L2，与Fc区的CH2结构域、CH3结构域、或CH2和CH3结构域的界面缔合。在各种实施例中，L1和L2独立地选自长度为1-25个氨基酸的蛋白接头。在具体的实施例中，L1和L2独立地选自(G4S)2(SEQ IDNO:41)、(G4S)3(SEQ ID NO:42)、和(G4S)4(SEQ ID NO:43)。
在本文描述的任何方面的各种实施例中，该第一和第二表位是不同的。在本文描述的任何方面的各种实施例中，该第一和第二表位是相同的。
附图说明
出于说明本披露的目的，在附图中描绘了本披露的某些方面。然而，本披露不限于附图中所描绘的方面的精确安排和手段。
图1A-1F描绘了本文描述的某些示例性蛋白的一般示意图。使用PyMOL在图1A-1C中示出了CH2和CH3区，并将溶剂暴露表面环区鉴定为球体。图1A描绘了CH2区中的环；图1B描绘了CH2-CH3界面中的环；且图1C描绘了CH3区中的环。示例性构建体示出于图1D-1F中，这些图包括代表性BD1和BD2结构域分别作为Fab和scFv结构域。图1D描绘了附接在铰链区处的BD1和附接在该CH2区中的溶剂暴露环处的BD2。图1E描绘了附接在铰链区处的BD1和附接在该CH2-CH3界面中的溶剂暴露环处的BD2。图1F描绘了附接在铰链区处的BD1和附接在该CH3区中的溶剂暴露环处的BD2。
图2A-2C提供了如本文所述的CH2中、CH2-CH3界面处、和CH3中的溶剂可及环序列的展开图。掺入BD2(scFv)的构建体的实例包括在图2A-2C中的每一幅中。图2A示出了在CH2-CH3界面上游的CH2环中被鉴定的代表性环序列ISRTP(SEQ ID NO:39)。图2B示出了在CH2-CH3界面中的代表性环序列AKGQP(SEQ ID NO:40)。图2C示出了在CH2-CH3界面下游的CH3区中的代表性环序列SNG。
图3证明了靶向PD-1和CTLA-4的BiS2、BiS3、和BiS5构建体的并行结合。迹线A9显示了BiS2 PD-1/CTLA-4、迹线B9显示了Bis3 PD-1/CTLA-4、且迹线C9显示了Bis5 PD-1/CTLA-4。
图4显示了所提出的PD-1/CTLA-4阻断的机制的示意图。
图5示出了octet结合测定的结果，其证明了靶向PD-1和CTLA-4的DuetMab构建体的并行结合。
图6A-D显示了PD-1/CTLA-4双特异性结合蛋白在报告基因测定中抑制PD-1和CTLA-4途径。图6A描绘了经由PD-1阻断的T细胞活化。图6B描绘了经由CTLA-4阻断的T细胞活化。图6C显示了PD-1报告物测定的结果。图6D显示了CTLA-4报告物测定的结果。
图7显示了SEB测定的结果，该结果显示，PD-1/CTLA-4DuetMab和BiS5Ab在葡萄球菌肠毒素B(SEB)测定中具有等效的活性。
图8A-B显示了与同种型和亲本mAb对照相比，在SEB测定中PD-1/CTLA-4 DuetMab的活性。
图9A-B显示了在SEB测定中与PD-1/CTLA-4 DuetMab相比，PD-1/CTLA-4 BiS5 Ab的活性。
图10A-C显示了PD-1/CTLA-4 DuetMab和BiS5Ab在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中具有等效的活性。图10A是该测定的示意图(n＝4个供体；2个独立的实验)。
图11A-D显示了与同种型对照(n＝2个供体；1个实验)相比，MLR测定中PD-1/CTLA-4 DuetMab的活性。
图12A-D显示了与亲本mAb对照(n＝2个供体；1个实验)相比，MLR测定中PD-1/CTLA-4 DuetMab的活性。
图13A-D显示了与竞争抗体(n＝2个供体；1个实验)相比，MLR测定中PD-1/CTLA-4DuetMab的活性。
图14显示了食蟹猴中的单剂量药代动力学/药效学(PK/PD)研究的研究设计。
图15A-B显示了，在食蟹猴中PD-1/CTLA-4 DuetMab显示了清楚的药效学(PD)。
图16A-B显示了被给药PD-1/CTLA-4 DuetMab(MEDI5752)和PD-1/CTLA-4 BiS5Ab(MEDI8500)的食蟹猴中的T细胞依赖性抗体应答(TDAR)。
图17显示了用来研究PD-1/CTLA-4双特异性分子的模型系统，其中稳定的CHO细胞表达不同水平的人类PD-1和/或CTLA-4。
图18A-C显示了，PD-1/CTLA-4 DuetMab在相同细胞表面并行地结合PD-1和CTLA-4。
图19A-C显示了一种实验，以确定在表达过量PD-1的细胞上的CTLA-4饱和时，协同结合是否区分抗PD-1和抗CTLA-4抗体的组合。
图20A-D显示了，PD-1和CTLA-4亲本单克隆抗体结合并占据其靶标受体而对非靶向受体没有重大影响。
图21A-D显示了与单克隆抗体的组合相比，PD-1/CTLA-4 DuetMab以低约250倍的浓度使表达过量PD-1的CHO细胞上的CTLA-4饱和。
图22A-F显示了与仅表达CTLA-4的细胞相比，PD-1/CTLA-4 DuetMab以低约500倍的浓度使表达过量PD-1的CHO细胞上的CTLA-4饱和。
图23A-B显示了PD-1/CTLA-4 DuetMab优先地以顺式结合相同细胞表面上的PD-1和CTLA-4。图23B中的曲美木单抗是CTLA-4mAb。
图24A-D显示了PD-1/CTLA-4 DuetMab和亲本单克隆抗体与培养的T细胞的结合和内化。PD-1/CTLA-4 DuetMab具有曲美木单抗的内化特性。
图25A显示了内化测定的示意图。图25B显示了，PD-1/CTLA-4 DuetMab在表达10倍过量PD-1的稳定的CHO细胞中具有曲美木单抗的内化特性。
图26证明了靶向PD-L1和CTLA-4的BiS2、BiS3、和BiS5构建体的并行结合。迹线All显示了Bis2 PD-L1CTLA-4、迹线B11显示了Bis3 PD-L1/CTLA-4、且迹线C11显示了Bis5 PD-L1/CTLA-4。
图27A证明了靶向PD-1和TIM3(克隆62，野生型)的BiS3构建体的并行结合。图27B证明了靶向PD-1和TIM3(克隆62，野生型)的DuetMab构建体的并行结合。
图28A-28C提供了细胞杀伤测定中单特异性TIM3和双特异性PD-1_TIM3PD-1双特异性构建体的细胞杀伤活性的总结。图28A显示了在18hr时共培养孔的明视野图像。抗TIM-3+抗PD1或TIM-3/PD-1双特异性形式的组合增强肿瘤细胞死亡并增加T细胞活化，如通过减少粘附细胞和增强的T细胞爆破(聚集)所评估的。图28B显示了与黑色素瘤特异性CD8+ T细胞共培养18hr后对肿瘤细胞摄取活性染料的评估。图28C显示了共培养18hr后的IFNγ分泌。双特异性构建体一般展示出更好的杀伤活性，其中DuetMab形式展现出最强键的杀伤活性。
图29证明了具有TIM3臂序列的PD-1/TIM3 DuetMab构建体的并行结合，该TIM3臂序列是克隆62的亲和力成熟变体。
图30显示了PD-1/TIM3双特异性抗体(包括BiS3、BiS5、和DuetMab)与过表达人类TIM3或人类PD1的CHO细胞的结合。PD-1和TIM3表达数据示出于插图中。
图31显示了活化的T细胞克隆(DMF4)上的TIM3和PD-1表达数据。
图32A-C描绘了来自CMV抗原回忆测定(recall assay)的结果，该结果显示了，PD-1/TIM3双特异性抗体(包括BiS3、BiS5、和DuetMab)与同种型治疗(3个供体(每次处理/每个供体中1-2个重复)，1个实验)相比展示出增强的活性。
图33A-D显示了，PD-1/TIM3双特异性抗体(包括BiS3、BiS5、和DuetMab)在混合淋巴细胞反应(MLR)测定(每次处理/1个供体对/2个独立的实验中的1个中2-4个重复孔)中增强浓度高于8nM的干扰素(IFNγ)。
图34A-C显示了使用PD-1/TIM3双特异性抗体(包括BiS3、BiS5、和DuetMab)的PD-1报告物测定(双细胞系统)的结果，所有双特异性形式展示出与亲本LO115 IgG1类似的活性(每次处理3-5个独立的实验/3个生物学重复的编译)。
图35显示了使用BiS2和BiS3 OX40/PD-L1双特异性分子的octet测定的结果。
图36A-B显示了使用BiS2和BiS3 OX40/PD-L1双特异性分子的SEB测定的结果。
图37显示了使用BiS2和BiS3 OX40/PD-L1双特异性分子的PD-L1报告物测定的结果。
图38显示了使用BiS2和BiS3 OX40/PD-L1双特异性分子的CMV Ag回忆测定的结果。
图39显示了octet结合测定的结果，该测定证明了靶向PD-L1和OX40的OX40(SLR)/PD-L1 BiS5构建体的并行结合。
图40A-F显示了靶向PD-L1和OX40的双特异性构建体与表达人类或食蟹猴OX40和PD-L1/B7H1的CHO细胞的结合。
图41A-B显示了通过流式细胞术(HyperCyt)测量的靶向PD-L1和OX40的双特异性构建体与Jurkat OX40报告细胞、NCI H358、CHOK1 B7H1(PD-L1)/OKT3细胞、和HEK CD32a细胞的结合。
图42A-B显示了使用OX40/PD-L1双特异性分子的PD-L1报告物测定的结果。
图43A-B显示了使用OX40/PD-L1双特异性分子在HEK CD32a细胞中进行的OX40报告物测定的结果。
图44A-B显示了使用OX40/PD-L1双特异性分子在过表达CHOKPD-L1的细胞中进行的OX40报告物测定的结果。
图45A-B显示了使用OX40/PD-L1双特异性分子用肿瘤细胞进行PD-L1介导的OX40激动作用。
图46A-D显示了如下结果，该结果表明在针对OX40/肿瘤细胞测定的对照中使用OX40/PD-L1双特异性分子，用NCI H358 PD-L1 KO细胞未检测到激动作用。
图47A-D显示了使用OX40/PD-L1双特异性分子的SEB测定的结果。
图48A显示了用于测试OX40/PD-L1双特异性分子的Treg抑制测定实验的示意图。图48B-C显示了基于双特异性分子结合的Treg抑制。
图49描绘显示了使用OX40/PD-L1双特异性分子的Treg抑制测定的结果。
图50描绘显示了使用OX40/PD-L1双特异性分子的Treg抑制测定的结果。
图51A-B显示了用以测试OX40/PD-L1双特异性分子的混合的白细胞反应(MLR)测定实验的设计。
图52A-E显示了使用OX40/PD-L1双特异性分子的MLR测定的结果。
图53A-B显示了，BiS2和BiS5 OX40/PD-L1双特异性分子介导对抗表达PD-L1或OX40的CHO细胞的天然杀伤(NK)细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)。
图54显示了，BiS2和BiS5 OX40/PD-L1双特异性分子介导对抗表达PD-L1和OX40的CHO细胞的NK细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)。
图55显示了，BiS2和BiS5 OX40/PD-L1双特异性分子在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)中增加对抗表达PD-L1和OX40的CHO细胞的NK细胞的CD107a动员。
图56显示了BiS2和BiS5 OX40/PD-L1双特异性分子介导对抗活化的同种异体T细胞的NK细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)。
图57A-B显示了，BiS5 OX40/PD-L1在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)中增加了对抗活化的同种异体T细胞的来自两个不同供体的NK细胞的CD107a动员。
图58显示了用以比较OX40/PD-L1双特异性分子的PK/PD的研究设计。
图59显示了食蟹猴中PD-L1/OX40双特异性分子的血清浓度时间曲线的比较。
图60显示了PD-L1/OX40双特异性分子在血清中耗竭可溶的PD-L1。
图61A-F提供了PD-L1/OX40双特异性分子的药效学数据的总结。基线定义为第5天和第0天给药前的平均值。
图62描绘了PD-1/OX40 BiS2 IgG4P单克隆抗体(mAb)的示意图。
图63描绘了PD-1/OX40 BiS2 mAb的潜在作用机制。
图64描绘了两个不同批号的PD-1(LO115)/OX40 BiS2 mAb对PD1-His和人类OX40-Fc的并行结合活性。
图65A描绘了OX40报告物测定的示意图。图65B显示了使用PD1LO115 mAb、OX40mAb、对照mAb和PD1(LO115)/OX40 BiS2 mAb的OX40报告物测定的结果。
图66A描绘了PD-1/PD-L1报告物测定的示意图。图66B显示了使用PD1 LO115 mAb、OX40 mAb、对照mAb和PD1(LO115)/OX40 BiS2 mAb的PD1/PD-L1报告物测定的结果。
图67显示了使用PD-1(LO115)/OX40双特异性分子和对照的BiS2变体的SEB测定的结果。
图68显示了使用PD-1(LO115)/OX40双特异性分子和对照的BiS2变体的CMV抗原回忆测定的结果。
图69显示了使用PD-1(AMP514)/OX40双特异性分子和对照的BiS2和BiS3变体的CMV抗原回忆测定的结果。
图70显示了在食蟹猴中单次静脉内给药后PD1(LO115)/OX40 BiS2 mAb的血清浓度-时间曲线。数据代表3个男性/组的平均值±标准偏差。LLOQ(5ng/mL)用虚线示出。PKC-药代动力学浓度；LLOQ＝定量下限。
图71显示了在食蟹猴中单次静脉内给予PD-1(LO115)/OX40 BiS2 mAb后的Ki67阳性CD4+和CD8+记忆T细胞百分比。数据代表3个男性/组的平均值±标准偏差。左图A代表CD4+记忆T细胞，且右图显示CD8+记忆T细胞。IV＝静脉内。
图72显示了用于定量食蟹猴血清中PD-1/OX40的代表性标准曲线。
图73A-73E提供了相对于不同pH值的不同BiS形式(“BiS4”)的本文公开的双特异性结合蛋白(“BiS5”)的说明性DSC热谱图。图73A阐明了pH对BiS4热稳定性的影响。图73B阐明了pH对BiS5热稳定性的影响。图73C描绘了具有T起始、Tm1、Tm2、和Tm3的BiS4的代表性曲线拟合的DSC热谱图。图73D描绘了具有T起始、Tm1、Tm2、和Tm3的BiS5的代表性曲线拟合的DSC热谱图。图73E描绘了代表pH对针对BiS4和BiS5形式的T起始、Tm1、Tm2、和Tm3的影响的图。
图74A和74B描绘了在40℃储存4周之前和之后在pH7.5的样品的HP-SEC分析。图74A提供了在热应激之前和之后的BiS4和BiS5的SEC色谱图的覆盖图，实线对应于时间零时的BiS4和BiS5样品(无应激)，并且虚线对应于在40℃孵育4周的BiS4和BiS5样品(应激的)。图74B提供了条形图，其代表pH 7.5对BiS4和BiS5的不同种类(单体、片段、和聚集体)的影响，如在40℃在第零天和4周后测量的。
图75A-75C提供了动力学图，其显示了pH 7.5对BiS4(三角迹线)和BiS5(圆形迹线)在40℃的加速和短期储存稳定性的影响。图75A显示了如通过HP-SEC在4周的时间内测量的单体剩余百分比。图75B显示了如通过HP-SEC在4周的时间内测量的片段化百分比。图75C显示了如通过HP-SEC在4周的时间内测量的聚集百分比。提出的数据来自单一小瓶分析。
图76A-76C描绘了BiS4(三角形)和BiS5(圆形)的pH速率曲线图。图76A显示了在40℃不同pH条件对单体损失速率的影响。图76B显示了在40℃不同pH条件对片段化速率的影响。图76C显示了在40℃不同pH条件对聚集速率的影响。
图77A和77B描绘了BiS4和BiS5片段化的另外的分析。图77A显示了在pH 7.5和40℃时(在时间＝0时)，两种分子均未展现出可感知的片段化。图77B显示了，在与图77A相同的条件下，但在40℃储存2周后，观察到BiS4的可感知的片段化和BiS5的最低片段化。
图78描绘了随pH变化的BiS4和BiS5片段化(左图)和聚集(右图)的分析。两种形式在较低(5.5)pH下都具有减少的片段化和聚集，而BiS5在两种pH值下均具有更优异的片段化和聚集性能。
图79描绘了针对构建体(左图)A、B、C、和D，以及(右图)E、F、G、和H本文披露的几种BiS5双特异性结合蛋白的DSC热谱图。构建体A和E包括IS-RTP处的scFv；B和F包括AK-GQP处的scFv；C和G包括S-NG处的scFv；且D和H包括SN-G处的scFv。针对构建体A、B、C、和D的scFv是2F4(IgG是LC10)，而针对E、F、G、和H的scFv是LC10(IgG是2F4)。各种TM值与以下结构域相关，TM1＝CH2/scFv；TM2＝Fab；TM3＝CH3。
图80描绘了与本文披露的双特异性结合蛋白(构建体D和H)结合的FcRn的代表性数据集。scFv在CH2-CH3结构域中的位置(即，在ISTRP环内)可以对FcRn结合活性产生影响。
图81描绘了与本文披露的双特异性结合蛋白结合的FcγR(具有FcγRIIIa-158V的构建体E、G、和H)的代表性数据集。插图反映了与主图相同的数据，该数据在FcγRIIIa-158V注射时重归一化。基于scFv结构域的位置，所有构建体能够结合具有可观察到的亲和力差异的FcγR。
图82显示了完整的ISRTP环对于说明性双特异性结合构建体(例如，A和E)的FcRn结合是重要的。引入N3环不能补偿ISRTP环(BiS5E+N3)的中断。引入插入IgG1Fc的N3环中的scFv使IgG不能结合FcRn。x轴中的时间以秒测量。
图83描绘了每种BiS1、BiS2、BiS3、BiS4、和BiS5构建体的一般示意性结构形式。“k1”和“k2”符号指示如在实例3中讨论的动力学分析中使用的片段化模式。
图84描绘了每种BiS1、BiS2、BiS3、BiS4、和BiS5的片段化速率随pH而变化。
图85描绘了每种BiS1、BiS2、BiS3、BiS4、和BiS5的聚集速率随pH而变化。
图86描绘了每种BiS1、BiS2、BiS3、BiS4、和BiS5的单体损失速率随pH而变化。
图87描绘了针对每种BiS1、BiS2、BiS3、BiS4、和BiS5的片段化模式和与HPSEC色谱图上的峰的对应关系的图示。
图88描绘了在还原条件下片段化模式的代表性分析。
图89描绘了BiS5在还原和非还原条件下的结构排列。
图90描绘了SEB测定形式。
具体实施方式
在继续进一步详细描述本披露之前，应当理解的是，本披露并不局限于特定的组合物或方法步骤，因为这些组合物或方法步骤可以改变。必须注意的是，除非上下文中另外清楚地指出，如在本说明书及所附权利要求中所使用，单数形式“一种/一个(a/an)”和“该”包括复数指示物。
除非另外定义，否则在本文使用的所有技术和科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。例如，Concise Dictionary of Biomedicine andMolecular Biology[简明生物医学和分子生物学词典]，Juo,Pei-Show，第2版，2002，CRC出版社；The Dictionary of Cell and Molecular Biology[细胞与分子生物学词典]第3版，1999，学术出版社(Academic Press)；以及Oxford Dictionary Of Biochemistry AndMolecular Biology[牛津生物化学和分子生物学词典]，修订版，2000，牛津大学出版社(Oxford University Press)为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的通用词典。
氨基酸可以在此通过它们的通常己知的三字母符号或通过由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号来提及。同样，核苷酸可以通过它们的通常接受的单字母代码来提及。
除非另有表明，否则抗体的可变结构域、互补决定区(CDR)以及框架区(FR)中的氨基酸编号遵循卡巴特(Kabat)定义，该定义如列出于卡巴特等人，Sequences of Proteinsof Immunological Interest[具有免疫学重要性的蛋白序列]，第5版，美国国立卫生研究院，公共卫生事业部，马里兰州贝塞斯达市(1991)。使用这个编号系统，实际的线性氨基酸序列可以含有对应于可变结构域的FR或CDR的缩短或插入该FR或CDR中的较少的或另外的氨基酸。例如，重链可变结构域可以包含在H2的残基52之后的单个氨基酸插入(根据卡巴特，残基52a)以及在重链FR残基82之后的插入残基(例如，根据卡巴特，残基82a、82b、以及82c等)。可以通过抗体序列与“标准”卡巴特编号序列在同源区的比对而对给定的抗体确定残基的卡巴特编号。框架残基的最大比对常常需要在编号系统中的有待用于Fv区的“间隔”残基插入。另外，由于种间或等位基因差异，在任何给定的卡巴特位点编号处的某些单独残基的身份在抗体链之间可以不同。
如本文所用，术语“抗体(antibody和antibodies)”也被称为免疫球蛋白，涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、由至少两个不同表位结合片段形成的多特异抗体(例如，多特异抗体，如PCT公开WO 2009018386、PCT申请号PCT/US 2012/045229，将其通过引用以其全文并入本文)、BiSAb、人类抗体、人源化抗体、骆驼化抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、单结构域抗体、结构域抗体、Fab片段、F(ab')2片段、展现出所希望的生物活性的抗体片段(例如，抗原结合部分)、二硫键连接的Fv(dsFv)，以及抗独特型(抗Id)抗体(包括，例如，针对本发明的抗体的抗Id抗体)、细胞内抗体，以及上述任一者的表位结合片段。具体地说，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即，含有至少一个抗原结合位点的分子。抗体还包括与抗体或其部分的肽融合物(例如与Fc结构域融合的蛋白质)。免疫球蛋白分子可以具有任何同种型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、亚同种型(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或同种异型(例如，Gm，例如G1m(f、z、a或x)、G2m(n)、G3m(g、b或e)、Am、Em、和Km(1、2或3))。抗体可以源自任何哺乳动物，包括但不限于人、猴、猪、马、兔、狗、猫、小鼠等等，或其他动物，如鸟类(例如鸡)。
CTLA-4
细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)在活化的T细胞上表达，并随着CD28介导的T细胞活化作为共抑制剂以抑制T细胞应答。CTLA-4被认为在TCR接合之后调节初试和记忆性T细胞的早期活化幅度，并且是影响抗肿瘤免疫和自身免疫两者的中央抑制途径的一部分。CTLA-4仅在T细胞上表达，并且其配体CD80(B7.1)和CD86(B7.2)的表达主要限于抗原呈递细胞、T细胞、和其他免疫介导的细胞。据报道阻断CTLA-4信号通路的拮抗性抗CTLA-4抗体增强T细胞活化。一个这样的抗体易普利姆玛在2011年被FDA批准用于转移性黑色素瘤的治疗。已经提出使用抗CTLA-4抗体来治疗感染和肿瘤并上调适应性免疫应答(参见，美国专利号6,682,736、7,109,003、7,132,281、7,411,057、7,824,679、8,143,379、7,807,797、8,491,895、8,883,984和美国公开号20150104409，通过引用以其全文并入本文)。
PD-L1
程序性死亡配体1(PD-L1)也是涉及控制T细胞活化的受体和配体的复杂系统的一部分。在正常组织中，PD-L1在T细胞、B细胞、树突细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、骨髓源性肥大细胞以及不同非造血细胞上表达。它的正常功能是通过与它的两个受体程序性死亡1(又称为PD-1或CD279)和CD80(又称为B7-1或B7.1)的相互作用来调节T细胞活化与耐受之间的平衡。PD-L1还通过肿瘤来表达并且在多个部位上起作用以帮助肿瘤避开由宿主免疫系统进行的检测和消除。PD-L1在宽范围的癌症中高频率地表达。在一些癌症中，PD-L1的表达与存活降低和不利预后相关联。阻断PD-L1与它的受体之间的相互作用的抗体能够在体外解除PD-L1依赖性免疫抑制效应并且增强抗肿瘤T细胞的细胞毒性活性。杜伐鲁单抗是针对人类PD-L1的能够阻断PD-L1与PD-1和CD80受体两者的结合的人类单克隆抗体。已经提出使用抗PD-L1抗体来治疗感染和肿瘤并增强适应性免疫应答(参见，美国专利号8,779,108和9,493,565，通过引用以其全文并入本文)。
PD-1
程序性死亡-1(“PD-1”)是T细胞调节子的扩展的CD28/CTLA-4家族的大约31 kD I型膜蛋白成员(参见Ishida,Y.等人(1992)“Induced Expression Of PD-1,A NovelMember Of The Immunoglobulin Gene Superfamily,Upon Programmed Cell Death[程序性细胞死亡诱导的PD-1(免疫球蛋白基因超家族的新成员)的表达]”EMBO J.[欧洲分子生物学组织杂志]11:3887-3895)。
PD-1在活化的T细胞、B细胞、和单核细胞上表达(Agata,Y.等人(1996)“Expression of the PD-1 Antigen on the Surface of Stimulated Mouse T and BLymphocytes[在受到刺激的小鼠T和B淋巴细胞的表面上表达PD-1抗原]”，Int.Immunol[国际免疫学]8(5):765-772；Martin-Orozco,N.等人(2007)“Inhibitory Costimulation andAnti-Tumor Immunity[抑制性共刺激和抗肿瘤免疫]”Semin.Cancer Biol.[癌症生物学研究会]17(4):288-298)。PD-1是在通过PDL-1或PDL-2的结合活化后负责下调免疫系统的受体(Martin-Orozco,N.等人(2007)“Inhibitory Costimulation and Anti-TumorImmunity[抑制性共刺激和抗肿瘤免疫]”，Semin.Cancer Biol.[癌症生物学研究会]17(4):288-298)并且作为细胞死亡诱导物发挥作用(Ishida,Y.等人(1992)“InducedExpression Of PD-1,A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily,UponProgrammed Cell Death[程序性细胞死亡诱导的PD-1(免疫球蛋白基因超家族的新成员)的表达]”EMBO J.[欧洲分子生物学组织杂志]11:3887-3895；Subudhi,S.K.等人(2005)“The Balance of Immune Responses:Costimulation Verse Coinhibition[免疫应答的平衡：共刺激与共同抑制]”，J.Molec.Med.[分子医学杂志]83:193-202)。经由PD-L1的过表达在许多肿瘤中利用该过程，导致免疫应答受到抑制。
PD-1是肿瘤学中免疫介导疗法的充分验证的靶标，其中临床试验在治疗黑色素瘤和非小细胞肺癌(NSCLC)等其他方面具有阳性结果。拮抗性抑制PD-1/PD-L-1相互作用增加T细胞活化，增强宿主免疫系统对肿瘤细胞的识别和消除。已经提出使用抗PD-1抗体来治疗感染和肿瘤并增强适应性免疫应答(参见，美国专利号7,521,051、7,563,869、7,595,048)。
OX40
OX40(CD134；TNFRSF4)是主要存在于活化的CD4+和CD8+T细胞、调控性T(Treg)细胞和自然杀伤(NK)细胞上的肿瘤坏死因子受体(Croft等人，2009，Immunol Rev[免疫学评论]229:173-91)。OX40具有一种已知的内源性配体，OX40配体(OX40L；CD152；TNFSF4)，其以三聚体形式存在并且可聚集OX40，从而产生T细胞内的有效细胞信号传导事件。同前。在活化的CD4+和CD8+T细胞上通过OX40信号传导导致增强的细胞因子产生、颗粒酶和穿孔素释放、以及效应和记忆T细胞池的扩增(Jensen等人，2010，Semin Oncol[肿瘤学研讨会]，37:524-32)。此外，Treg细胞上的OX40信号传导抑制Treg的扩增，停止Treg的诱导并且阻断Treg抑制功能(Voo等人，2013，J Immunol.[免疫学杂志]191:3641-50；Vu等人，2007，Blood.[血液]110:2501-10)。
免疫组织化学研究和早期流式细胞术分析显示，OX40在浸润广泛的人类癌症的T细胞上表达(Baruah等人，2011，Immunobiology[免疫生物学]217:668-675；Curti等人，2013，Cancer Res.[癌症研究]73:7189-98；Ladanyi等人，2004，Clin Cancer Res.[临床癌症研究]10:521-30；Petty等人，2002，Am J Surg.[美国外科学杂志]183:512-8；Ramstad等人，2000，Am J Surg[美国外科学杂志]179:400-6；Sarff等人，2008，Am J Surg[美国外科学杂志]195:621-5；讨论625；Vetto等人，1997，Am J Surg[美国外科学杂志]174:258-65)。虽然不希望受理论束缚，肿瘤浸润淋巴细胞上的OX40表达与几种人类癌症中更长的存活相关，从而表明OX40信号可在建立抗肿瘤免疫应答中发挥作用(Ladanyi等人，2004，ClinCancer Res[临床癌症研究]10:521-30；Petty等人，2002，Am J Surg[美国外科学杂志]183:512-8)。
在各种非临床小鼠肿瘤模型中，OX40的激动剂(包括抗体和OX40配体融合蛋白)已成功使用，具有有希望的结果(Kjaergaard等人，2000，Cancer Res[癌症研究]60:5514-21；Ndhlovu等人，2001，J Immunol.[免疫学杂志]167:2991-9；Weinberg等人，2000，JImmunol.[免疫学杂志]164:2160-9)。共刺激T细胞通过OX40促进抗肿瘤活性在一些情况下是持久的，从而针对随后的肿瘤激发提供持久的保护(Weinberg等人，2000，J Immunol.[免疫学杂志]164:2160-9)。Treg细胞抑制和效应T细胞的共刺激被证明对于OX40激动剂的肿瘤生长抑制是必要的(Piconese等人，2008，J Exp Med[实验医学杂志]205:825-39)。已经探索了许多策略和技术，以通过与疫苗、化学疗法、放射疗法和免疫疗法组合来增强OX40激动剂治疗的抗肿瘤影响(Jensen等人，2010，Semin Oncol[肿瘤学研讨会]37:524-32；Melero等人，2013，Clin Cancer Res[临床癌症研究]19:997-1008)。已经提出使用抗OX40抗体来治疗感染和肿瘤并上调适应性免疫应答(参见，美国公开号20160137740，通过引用以其全文并入本文)。
TIM3
T细胞抑制性受体Tim-3(T细胞免疫球蛋白粘蛋白分子3)在调节抗肿瘤免疫中发挥作用，因为它在产生IFN-γ的CD4+辅助细胞1(Th1)和CD8+ T细胞毒性1(Tc1)T细胞上表达。它最初被鉴定为T细胞抑制性受体，充当免疫检查点受体，其特异性地发挥功能以限制Th1和Tc1 T细胞应答的持续时间和幅度。另外的研究已经鉴定Tim-3途径可以与PD-1途径协作以促进癌症中CD8+ T细胞中的严重功能障碍表型的发展。它也在某些癌症中的调节性T细胞(Treg)中表达。鉴于TIM3途径涉及在某些癌症中被免疫抑制的关键免疫细胞群，它代表了免疫肿瘤学疗法的有吸引力的候选者。参见，Anderson,A.C.，Cancer Immunol Res.[癌症免疫学研究]，(2014)2:393-398；和Ferris,R.L.等人，J Immunol.[免疫学杂志](2014)193:1525-1530。
A.双特异性结合蛋白
将多个结合位点添加到对单个结合结构域具有特异性的分子可以极大地增强分子的能力(例如，治疗、诊断能力等)。例如，双特异性抗体可以结合相同靶标生物分子的多于一个区，赋予比仅结合靶标上的一个表位的单特异性多肽更高的特异性。可替代地，双特异性抗体可以结合多个靶标生物分子，例如在复合物中存在的靶标，或希望螯合和/或聚集的靶标。在第三种情况下，相同的双特异性抗体可以在任何给定时间进行不同的功能，这取决于其靶标分子的定位和/或表达。
本文描述的是新颖的结合蛋白。这些新颖的结合蛋白的一种这样的构型被称为“DuetMab”。DuetMab具有以下基本结构：具有修饰的重链的Fc区，其中修饰的重链的CH1区具有天然半胱氨酸至非半胱氨酸氨基酸的取代，和天然非半胱氨酸氨基酸至半胱氨酸氨基酸的取代；修饰的对应的轻链，其中该修饰的轻链的CL区还具有天然半胱氨酸至非半胱氨酸氨基酸的取代，和天然非半胱氨酸氨基酸至半胱氨酸氨基酸的取代；具有第二重链的第二Fc区；和第二对应的修饰轻链，其中该修饰的重链与对应的修饰的轻链直接连接，并且在单独的靶标结合臂上，该第二重链与第二对应的轻链直接连接，并且其中因该天然非半胱氨酸氨基酸被取代为半胱氨酸氨基酸而产生的修饰的重链中的取代的半胱氨酸、以及因该天然非半胱氨酸氨基酸被取代为半胱氨酸氨基酸而产生的修饰的相应轻链中的取代的半胱氨酸可以形成二硫键。与DuetMab相关的披露内容可以在例如美国专利号9,527,927中找到，其通过引用以其全文并入本文。
这些新颖的结合蛋白的另外的示例性构型被称为“BiSAb”或“BiSAbs”。本文提供了示例性BiSAb的示意图，以及特定BiSAb的具体实例。更一般地，BiSAb是含有两个结合单位的多肽，这两个结合单位中的每一个结合表位(例如，结合单位1结合第一表位，并且结合单位2结合第二表位)。碱性BiSAb对于结合这两个表位中的每一个是二价的(例如，多肽包含两个结合单位1(“BD1”或“BU1”)和两个结合单位2(“BD2”或“BU2”))。因此，当结合单位1和2结合不同的表位时，BiSAb具有常规双特异性抗体的多特异性和常规抗体分子的二价性。在结合单位1和2结合相同表位的实施例中，BiSAb具有常规抗体的单特异性，但是是四价的。除结合单位外，BiSAb还包括接头多肽和Fc部分。本披露内容涉及广泛组的双特异性结合蛋白，例如BiSAb和包含BiSAb核心的蛋白，所述结合蛋白靶向调节免疫应答的分子。一般地，本文所述的新颖结合蛋白平台和示例性双特异性结合蛋白(BiSAb)包含结合单位/结构域、接头多肽和Fc部分。本披露内容还提供了编码此类BiSAb的核酸分子以及包含此类核酸并且可用于生产和使用此类BiSAb的方法中的载体和宿主细胞。本文更详细地描述了BiSAb、包含BiSAb核心的结合蛋白、和BiSAb的各种部分。
在一些方面，BiSAb可包含衍生自特异性结合蛋白(即，抗体)的两个重-轻链对，其中重链和轻链各自包含可变区(例如，VL和VH)，它们一起形成第一结合单位，并且其中该重链各自进一步包含第二结合单位(例如，与Fc或Fab附接的scFv结构域)。在第一和第二结合单位结合不同表位的情况下，每个重-轻链对是双特异性的，并且这两对在一起对于每个表位是二价的。当第一和第二结合单位结合相同的表位的情况下，每个重-轻链对是单特异性的，并且这两对在一起对于该表位是四价的。在一些方面，这两个重-轻链对是相同的。在一些方面，这两个重-轻链对是不相同的。
在具体的实施例中，BiSAb的结构域可以基于已知的免疫球蛋白结构域。免疫球蛋白分子(例如单克隆抗体(mAb))广泛用作诊断和治疗剂，并且用于工程化mAb的结合片段的方法是本领域熟知的。与所有免疫球蛋白分子一样，单克隆抗体由重链和轻链肽亚基组成，每个亚基包括赋予结合特异性(可变结构域)和同种型(恒定结构域)的可变和恒定结构域。
本文披露的BiSAb可具有与常规抗体类似的总体结构，但是可以通过另外的结合单位的存在来区分，该另外的结合单位附接在Fab结构域内的位置处、附接于远离Fab结构域的位置处、和在铰链或Fc区内(例如，在CH2、CH3、或CH4区内，或在例如CH2-CH3界面的这些区的界面处)。因此，与对结合单个表位来说是二价的常规抗体不同，BiSAb对于结合两个表位是二价的。然而，如本文所述，BiSAb仍可保持常规抗体的许多希望的特性，例如结合FcRn的能力和结合C1q和Feγ受体的能力(例如，指示介导抗体和补体依赖性细胞毒性的能力)。
本文所述的结合结构域可包含仅含有部分的mAb分子的抗原结合片段，例如Fab、F(ab')2、Fab'、scFv、di-scFv、sdAb片段，因为这些片段已被发现用作诊断或治疗剂。另外，可以改变可变结构域中的特定残基以改进抗体和抗体片段的结合特异性和/或稳定性。可以替换不直接参与抗原结合的其他残基，以便“人源化”非人类抗体区并降低mAb的免疫原性。
尽管BiSAb与常规抗体不同，例如，他们对于结合两个不同的表位是二价的(或者对于结合单个表位是四价的)，但是BiSAb的许多部分衍生自或类似于部分的常规抗体。本领域已知的任何mAb结构域和/或片段可用于本文所述的BiSAb。特别地，BiSAb可包含Fab和/或scFv片段或其变体。scFv的示例性非限制性变体包括但不限于串联di-scFv、串联tri-scFv、双抗体、和三抗体。
本披露总体上涉及新颖的结合蛋白，其中BiSAb是说明性实例。另外的实例是包含BiSAb核心的结合蛋白以及包含扩展的BiSAb核心的一种或多种另外的结合单位和/或结合蛋白。应当理解，无论何时在本文中描述BiSAb或BiSAb的特征，这种描述一般适用于本披露的新颖的结合蛋白，无论这种结合蛋白是否包括两个结合单位或多于两个结合单位。因此，术语BiSAb是本文所述的结合蛋白的示例，并且在背景允许的情况下，任何此类对BiSAb的提及也可用于描述包含BiSAb核心的结合蛋白。
新颖的BiSAb结构平台。
在一个方面，本披露提供了具有结构平台的BiSAb结合蛋白，所述结构平台包含一般由图1A-1F中的示意图阐明的结构域。这些图是说明性的，并因此在另外的残基之间的插入也在披露的结合蛋白的范围内。图1A-1C描绘了使用PyMOL模仿的IgG1的CH2-CH3界面处的抗体的Fc区，并且阐明了本披露的几种示例性BiSAb。在CH2-CH3界面处或附近鉴定出三个表面暴露环，其可能能够承受第二结合部分(例如，scFv)的插入而不损害IgG或第二结合部分的结构完整性或稳定性。图1A是在CH2-CH3界面附近的CH2区中鉴定的一个这样的代表性环ISRTP(SEQ ID NO:39)的示意图。图1D还显示了代表性构建体IS-scFv-RTP，其中scFv插入ISRTP环的S和R之间。图1B是在CH2-CH3界面处鉴定的代表性环AKGQP(SEQ ID NO:40)的示意图。图1E显示了代表性构建体AK-scfv-GQP，其中scFv插入AKGQP环的K和G之间。图1C是在CH2-CH3界面下游的CH3区中鉴定的代表性环SNG的示意图。图1F还显示了代表性构建体S-scfv-NG，其中scFv插入SNG环的S和N之间。本文的实例提供了定向为SN-scFv-G的构建体的说明，其中scFv插入SNG环的N和G之间。
因此，本披露的一个方面涉及包含两个相同的重-轻链对的BiSAb，其中每个重-轻链对是双特异性的，并且两个相同的对在一起对于每个表位是二价的。每个重-轻链对包含结合结构域(BD)，该结合结构域可以包含结合第一表位(结合单位1)的Fab结构域、结合第二表位(或结合单位2，其可以是例如scFv)的第二结合结构域(BD2)和Fc区。在一些实施例中，该第二结合结构域可以与Fab结构域缔合。在一些实施例中，该BiSAb的Fc区可以与结合第二表位(结合单位2；在图1D-1F中描绘为scFv)的第二结合结构域(BD2)缔合。
在一些实施例中，本披露提供了具有一般平台结构的BiSAb，该一般平台结构包含两个嵌合重链，每个重链包含重链可变区(VH1)、重链恒定区(CH1)、铰链或多肽接头区、包含CH2结构域和CH3结构域的Fc区，其中任选地在一侧或两侧与多肽接头(L1和/或L2)侧接的第二结合结构域(BD2)与(i)CH2区、(ii)CH2和CH3区的界面、或(iii)CH3区的序列中的Fc区中的溶剂暴露环缔合。本披露的该方面的BiSAb还包含两个常规抗体轻链，每个轻链包含轻链可变区(VL1)和轻链恒定区(CL)，其形成第一结合结构域(BD1)的一部分。图1D-1F中阐明的特定BiSAb的结合结构域(BD2)是scFv。
图1D-1F提供了BiSAb的有用示意图，BiSAb在本文中也可以称为BiSAb“核心”。如图1D示出的多肽链包含重链，该重链具有：VH1结构域、CH1结构域、铰链/接头、部分N-末端CH2结构域、任选的接头(本文中称为L1或第一多肽接头)、结合单位2(例如scFv的VL2和VH2)、另一个任选的接头(例如，L2或第二多肽接头)、剩余的C-末端CH2结构域、和CH3结构域。因为此重链可以包括具有可替代的结合蛋白和/或传统轻链区的BD2，所以在本文中该重链被称为嵌合重链。BiSAb包含两个这样的嵌合重链，并且它们可以相同或不同。应注意用于结合单位1的可变重链结构域(VH)被称为VH1。在某些方面，这是结合第一表位的Fab的可变重链。类似地，用于结合单位1的可变轻链结构域(VL)被称为VL1。在某些方面，这是结合第一表位的Fab的可变轻链。相反，用于结合单位2的结构域用数字“2”表示，例如VH2和VL2，其中结合单位2是结合第二表位的scFv。
类似地，如图1E示出的多肽链包含重链，该重链具有：VH1结构域、CH1结构域、铰链/接头、CH2结构域、任选的接头(本文中被称为L1或第一多肽接头)、结合单位2(例如scFv的VL2和VH2)、另一个任选的接头(例如，L2或第二多肽接头)、和CH3结构域。在该实施例中，该BiSAb包含第二结合结构域，其图示为在CH2和CH3区的界面处的序列处与Fc缔合的scFv。
如图1F示出的多肽链包含重链，该重链具有：VH1结构域、CH1结构域、铰链/接头、CH2结构域、部分CH3结构域、任选的接头(本文中被称为L1或第一多肽接头)、结合单位2(例如scFv的VL2和VH2)、另一个任选的接头(例如，L2或第二多肽接头)、CH3结构域。
在这些实施例中，BiSAb典型地包括嵌合重链序列中的典型的或经修饰的抗体铰链区。含有铰链区的氨基酸序列的非限制性实例包括：EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:44)、EPKSCDKT(SEQ ID NO:45)、EPKSCGKT(SEQ ID NO:46)、EPKSC(SEQ ID NO:47)。
已经描述了与本文披露的某些BiSAb分子的特定结构平台相关的方面的一般格式，下面更详细地描述了所披露的BiSAb的各种部分和示例性功能特性。在其他实施例中，本披露考虑并提供了其他BiSAb结合蛋白，该其他BiSAb结合蛋白包含在本文以及其他披露中简要描述的可替代的结构形式和排列(参见，例如，美国公开号20090155275和美国专利号9,580,509)，其通过引用并入本文。
1.结合单位
本披露的BiSAb包含至少两个结合单位或结合结构域(结合单位/结构域1和结合单位/结构域2)。在某些方面，每个结合单位结合不同的表位，位于相同靶标分子上的不同表位或不同靶标上的表位。因为BiSAb的每个结合单位作为一对存在(有两个结合单位1和两个结合单位2)，所以BiSAb展现出与每个表位的二价结合。从本文的教导中可以理解，当每个结合单位结合相同的表位时，BiSAb将展现出与该表位的四价结合。
在某些方面，该第一结合单位是Fab片段，例如常规的单克隆抗体的Fab片段，或重组产生的抗原结合片段，其包含可变轻链(VL1)、恒定轻链(CL)、可变重链(VH1)和恒定重链部分(CH1)。任选地，Fab的轻链和重链可以经由一个或多个二硫键，例如经由合适的抗体铰链区互连。该Fab与第一表位结合。
在某些方面，该Fab衍生自或基于常规的单克隆抗体(例如常规的鼠类、人源化或人类抗体)的序列。在某些方面，含有衍生自或基于常规的单克隆抗体的序列的Fab的BiSAb保留常规抗体的一种或多种功能活性(例如保留至少80％或更多(80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)的功能活性)。例如，在某些方面，含有这种Fab的BiSAb保留对抗原的亲和力、抑制性活性、免疫系统调节活性、免疫应答的活化或诱导、和/或常规抗体的细胞(例如，癌细胞)杀伤活性中的一种或多种。
在某些方面，本披露的BiSAb包含结合单位2，并且结合单位2包含结合第二表位的结合结构域。该结合单位2(或结合结构域2(BD2))可以使用任何合适的策略与BiSAb缔合。如本文所用，与BiSAb“缔合”的BD2(例如，在一些实施例中，在Fc区内，在其他实施例中，在Fab区内)意指这两个分子之间具有相互作用，使得BD2保留与Fc部分或与BiSAb结构的Fab部分靶标结合和缔合的取向。此类相互作用的实例包括经由氨基酸接头的共价键合；通过在Fab区内，铰链区内，或在CH2、CH3、或CH2和CH3的界面、或CH4区处的Fc区内的BD2的重组表达的共价键合；和那些相同区内的非共价相互作用(例如范德华力)和氢键合相互作用。落入本披露范围内的结合结构域(或“BD”或“结合单位”)的非限制性实例包括抗体可变区、抗体片段、scFv、单链双抗体、或本领域已知的其他结合结构域。结合结构域还包括双特异性单链双抗体，或设计用于结合两个不同表位的单链双抗体。在一个方面，可用于构建本披露的多特异性表位结合结构域的表位结合结构域示例于US 20100298541和US20130079280中，其出于所有目的通过引用并入本文。
在某些方面，该BiSAb可包含包括scFv的结合结构域。因此，在某些方面，结合单位2包含scFv。应当理解，该scFv包括多肽链，该多肽链包含通过柔性多肽接头与可变轻链结构域(VL)连接的可变重链结构域(VH)。图1D-1F显示了示例性BiSAb的示意图，其中该BD(在此，描绘为结合单位2)是具有如本文所述的结构域的scFv，该结构域可以指定为VL2和VH2。在一些方面，VH2和VL2之间的多肽接头包含蛋白酶切割位点。scFv的VH和VL结构域可以来自相同或不同的抗体。在一些方面，该scFv的VH或VL可包含一个或多个结合至感兴趣的靶标的CDR，而VH或VL结构域的其余部分衍生自不同的抗体或是合成的。在一些方面，scFv包含抗体的至少一个CDR，例如，本领域已知的结合感兴趣的靶标的抗体。在一些方面，该scFv包含给定抗体的至少两个CDR。在一些方面，该scFv包含给定抗体的至少三个CDR。在一些方面，该scFv包含给定抗体的至少四个CDR。在一些方面，该scFv包含给定抗体的至少五个CDR。在一些方面，该scFv包含给定抗体的至少六个CDR。
在某些方面，BD可包含受体的配体结合结构域或配体的受体结合结构域。在一些方面，BD包含如上所述对在选自下组的靶标上的一个或多个表位具有结合亲和力的序列，该组由以下组成：CTLA-4、PD-1、PD-L1、OX40、和TIM3。在一些实施例中，该结合结构域对选自下组的靶标展示出特异性结合活性，该组由以下组成：CTLA-4、PD-1、PD-L1、OX40、和TIM3。本文披露的BiSAb可包含对本文披露的分子靶标具有结合亲和力或特异性结合活性的结合结构域的任何组合。例如，本文披露的BiSAb可以包含允许与靶标双特异性结合的结合结构域的组合，该靶标包括：CTLA-4和PD-1、CTLA-4和PD-L1、CTLA-4和TIM3、PD-1和PD-L1、PD-L1和OX40、PD-1和TIM3、PD-L1和TIM3、和TIM3。包括结合特定靶标组合的结合结构域的BiSAb在实例中阐明，并包括PD-1/CTLA-4、PD-L1/CTLA-4、PD-1/OX40、PD-L1/OX40、和PD-1/TIM3的非限制性组合。
在一些另外的实施例中，BiSAb对至少一种靶标分子展现出结合活性(例如，结合亲和力和/或结合特异性)，该结合活性比用于产生BiSAb的亲本单特异性结合序列的结合活性更高。在类似的实施例中，BiSAb可以对两种靶标分子展现出结合活性(例如，结合亲和力和/或结合特异性)，该结合活性比用于产生BiSAb的两种亲本单特异性结合序列的结合活性更高。在又另外的实施例中，BiSAb可以对两种靶标分子展现出结合活性(例如，结合亲和力和/或结合特异性)，该结合活性比用于产生BiSAb的亲本单特异性结合序列的组合的结合活性更高。相对于单独或组合的亲本单特异性结合序列，BiSAb的结合特性的增强相对于使用靶向相同分子的单特异性疗法提供了意想不到的优点(即使当组合使用时)。
在一些实施例中，本披露涉及结合选自下组的靶标的抗体或其抗原结合片段，该组由以下组成：CTLA-4、PD-1、PD-L1、OX40、和TIM3。在此类实施例中，抗体或其抗原结合片段可包含重链序列和轻链序列、或包含重链和轻链序列的CDR1、CDR2、和CDR3序列的重链序列和轻链序列的一部分。在其他实施例中，抗体或其抗原结合片段可包含重链可变(HCv)区序列和轻链可变(LCv)区序列，或包含重链和轻链序列的CDR1、CDR2、和CDR3序列的HCv和LCv的一部分。在又其他实施例中，抗体或其抗原结合片段可包含重链和轻链序列的CDR1、CDR2、和CDR3序列。在一些实施例中，该抗体可以是嵌合的、人源化的、或人类抗体。在一些实施例中，该抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。在另外的实施例中，该抗体是单克隆抗体。
在一些实施例中，包含如上所述的此类“亲本”抗体的全部或部分抗原结合区的结构域可用于产生本文披露的双特异性结合蛋白(BiSAb)。实例中阐明的非限制性实施例提供了关于如何能够鉴定和组合抗体序列以产生展现出与分子靶标组合的双特异性结合的BiSAb的说明。
可以单独或组合使用几种方法以改进包含scFv分子的BiSAb的稳定性。可单独使用或与一种或多种本文所述其他方法组合使用的一种潜在的方法是工程化连接scFv结构域的接头的长度和/或组成以稳定scFv部分。
可以使用的另一种潜在的方法是将至少两个氨基酸取代(也指修饰或突变)引入scFv的VH和/或VL结构域以促进二硫键形成(参见例如Brinkmann等人，1993，PNAS[美国科学院院报]，90:7538-42；Zhu等人，1997，Prot.Sci.[蛋白科学]6:781-8；Reiter等人，1994，Biochem.[生物化学]33:5451-9；Reiter等人，1996，Nature[自然]14:1239-45；Luo等人，1995，J.Biochem.[生物化学杂志]118:825-31；Young等人，1995，FEBS Let.[欧洲生化学会联合会快报]377:135-9；Glockshuber等人，1990，Biochem[生物化学]29:1362-7)。此方法可以单独使用或与本文描述的一种或多种其他方法组合使用。
在某些方面，可以将一个或多个突变引入scFv的VH和VL结构域的每一个中，以在包含scFv的BiSAb表达时促进VH和VL结构域之间的链间二硫键形成。在另一个方面，将两个突变引入链的相同结构域中。在某个方面，将两个突变引入不同的链中。在某些方面，引入多个互补突变以促进多个二硫键的形成或其他稳定化相互作用。在某些方面，引入半胱氨酸以促进二硫键形成。可以突变为半胱氨酸的示例性氨基酸包括VH2的氨基酸43、44、45、46、47、103、104、105和106，以及VL2的氨基酸42、43、44、45、46、98、99、100和101。上述编号基于卡巴特编号，其鉴定仅相对于scFv的VH2和VL2的位置(而不是相对于本文提供的BiSAb或SEQ ID NO的全长序列中氨基酸的位置)。可以突变为半胱氨酸残基的氨基酸位置的示例性组合包括：VH44-VL100、VH105-VL43、VH105-VL42、VH44-VL101、VH106-VL43、VH104-VL43、VH44-VL99、VH45-VL98、VH46-VL98、VH103-VL43、VH103-VL44、和VH103-VL45。在一些方面，将VH的氨基酸44和VL的氨基酸100突变为半胱氨酸。
可单独使用或与本文所述的一种或多种其他方法组合使用的另一个方法是选择scFv的结构域的顺序。在某些方面，相对于VL结构域的VH结构域的取向被优化以达到稳定性。在某些方面，该scFv处于VH-接头-VL取向。在某些方面，该scFv处于VL-接头-VH取向。在涉及本文披露的新颖BiSAb形式的实施例中，scFv中结构域的定向可确定scFv如何与BiSAb的Fc部分缔合。虽然下面在多肽接头的背景下更详细地描述了这一点。然而，简言之，鉴于BD(例如，scFv)通过任选的多肽接头(L1)和(L2)与CH2、CH3、或CH2和CH3的界面处互连，结构域的顺序确定了scFv的哪个部分与L1互连和scFv的哪个部分与L2互连。
可以单独使用或与本文所述的其他方法组合使用的另外的方法是通过突变scFv的一个或多个表面残基来引入一个或多个稳定性突变。在一些方面，将一个、两个、三个、四个、五个、六个或多于六个残基在scFv的VH和/或VL结构域的一者或两者中突变。在某些方面，仅在scFv的VH结构域中进行改变。在某些方面，仅在scFv的VL结构域中进行改变。在某些方面，在scFv的VH和VL结构域中进行改变。可以在每个结构域中进行相同数量的改变，或者可以在每个结构域中进行不同数量的改变。在某些方面，一个或多个变化是来自未修饰的母体scFv中存在的残基的保守氨基酸取代。在其他方面，一个或多个变化是来自未修饰的母体scFv中存在的残基的非保守氨基酸取代。当进行了多个取代时，在scFv的VH或VL结构域的一者或两者中，每个取代独立地是保守取代或非保守取代。在某些方面，所有取代是保守取代。在某些方面，所有取代是非保守的。在某些方面，至少一个取代是保守的。在某些方面，至少一个取代是非保守的。
可以单独使用或与其他方法组合使用的又另一种方法是通过突变在scFv的VH和/或VL结构域中存在的一个或多个残基来引入一个或多个氨基酸取代以匹配最常见的在已知抗体的VH和/或VL结构域的共有序列的所述特定位置处的残基。在某些方面，在scFv的VH结构域和/或VL结构域的一者或两者中的一个、两个、三个、四个、五个、六个或多于六个位置处引入取代。可以在每个结构域中进行相同数量的改变，或者可以在每个结构域中进行不同数量的改变。在某些方面，与给定共有序列匹配的序列中的一个或多个变化是来自未修饰的VH和/或VL序列中存在的残基的保守氨基酸取代。在其他方面，一个或多个变化表示来自未修饰的VH和/或VL序列中存在的残基的非保守氨基酸取代。当进行了多个取代时，在scFv的VH或VL结构域的一者或两者中，每个取代独立地是保守取代或非保守取代。在某些方面，所有取代是保守取代。在某些方面，所有取代是非保守取代。在某些方面，至少一个取代是保守的。在某些方面，至少一个取代是非保守的。
应当注意，描述为可用于修饰或稳定scFv部分的任何修饰可用于修饰Fab部分。例如，可以修饰BiSAb的Fab部分的可变结构域以改进稳定性，抗原结合等。此外，可以修饰Fab或scFv部分以降低免疫原性。
在某些方面，结合单位2(BD)是scFv，例如，衍生自常规单克隆抗体(包含通过柔性接头(例如甘氨酸-丝氨酸接头)互连的可变轻链(VL2)和可变重链(VH2))的scFv。任选地，scFv的可变轻链和可变重链可以经由一个或多个二硫键进一步互连，并且如上所述，可以包括一个或多个突变或变异。scFv与第二表位结合。在某些方面，第二表位与通过结合单位1结合的第一表位不同。在其他方面，第二表位与通过结合单位1结合的第一表位相同。在某些方面，scFv衍生自或基于常规单克隆抗体(例如常规的鼠类、人源化或人类抗体)的序列。在某些方面，含有衍生自或基于常规的单克隆抗体的序列的scFv的BiSAb保留常规抗体的一种或多种功能活性(例如保留至少80％或更多(80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％)的功能活性)。例如，在某些方面，含有这种scFv的BiSAb保留对抗原的亲和力、抑制性活性、或常规抗体的细胞杀伤活性中的一种或多种。
在某些方面，BiSAb包含本文所述的任何结合单位1和结合单位2，包括结合单位1和结合单位2的任何组合。例如，在某些方面，本披露提供了包含Fab的多肽，该Fab结合特定靶标(例如，结合特定靶标上的表位)，例如包含特定氨基酸序列或由特定核苷酸序列编码的Fab和/或与特定靶标结合(例如，与特定靶标上的表位结合)的scFv，例如包含特定氨基酸序列或由特定核苷酸序列编码的scFv。
如上文详细描述的，结合单位1和结合单位2可以经由接头多肽1(L1，L2)经由共价键与BiSAb缔合。一般地，连接经由BiSAb的嵌合重链实现，使得该互连经由重链CH2结构域、重链CH3结构域实现，或在重链CH2结构域和CH3结构域的界面处，或者在一些实施例中，在铰链区或Fab结构域内。L1和L2的长度和顺序可以彼此各自不同，并且本文描述了示例性构型。本披露考虑了包含结合单位和接头多肽的任何组合的BiSAb，包括结合一种或多种所希望的靶标的特异性结合单位和本文所述的特异性L1和L2多肽接头的任何组合。
2.Fc区
如本文所用，“Fc区”涵盖衍生自免疫球蛋白(优选地人类免疫球蛋白)恒定区的结构域，包括该恒定区的片段、类似物、变体、突变体或衍生物。合适的免疫球蛋白包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和其他类别，例如，IgA、IgD、IgE和IgM。Fc区可以是天然序列Fc区或改变的Fc区。免疫球蛋白的Fc区一般包含两个恒定结构域，CH2结构域和CH3结构域，并且任选地包含CH4结构域。本披露的BiSAb包括包含CH2结构域和CH3结构域的Fc区。
a.改变的Fc区
改变的Fc区(本文中也称为“变体Fc区”)可用于改变本披露的BiSAb的效应子功能和/或半衰期。可以在Fc区中进行一个或多个改变以改变分子的功能和/或药代动力学特性。此类改变可以导致C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)或者对于IgG的FcγR结合以及抗体依赖的细胞的细胞毒性(ADCC)、或者抗体依赖的细胞介导的吞噬作用(ADCP)的减少或增加。本披露涵盖BiSAb，其中已经进行改变以便微调效应子功能，通过增强或减少功能或提供所希望的效应子功能。因此，在本披露的一个方面，BiSAb包含变体Fc区(即，如下所述已经改变的Fc区)。包含变体Fc区的BiSAb在本文中也称为“Fc变体BiSAb”。如在此使用的，“天然的”是指未修饰的亲本序列，并且包含天然Fc区的BiSAb在此被称为“天然Fc BiSAb”。Fc变体BiSAb可以通过本领域已熟知的多种方法产生。非限制性实例包括分离抗体编码区(例如，从杂交瘤)以及在Fc区中进行一个或多个所希望的取代。可替代地，可以将BiSAb的抗原结合部分(例如，可变区)亚克隆到编码变体Fc区的载体中。在一个方面，与天然Fc区相比，变体Fc区展现出相似的诱导效应子功能的水平。在另一个方面，与天然Fc相比，变体Fc区展现出更高的效应子功能诱导。在另一个方面，如与天然Fc相比，变体Fc区展现出较低的效应子功能的诱导作用。在下文详述了变体Fc区的一些具体方面。用于测量效应子功能的方法在本领域是熟知的。
一般地，通过Fc区的变化而修饰抗体的效应子功能，这些变化包括但不限于氨基酸取代、氨基酸添加、氨基酸缺失以及对于Fc氨基酸的翻译后修饰(例如，糖基化)的变化。以下所述的方法可以用于微调本披露的BiSAb的效应子功能、Fc区对于FcR的结合特性(例如，亲和力和特异性)的比率，从而产生具有所希望特性的BiSAb。
应理解，如在此使用的Fc区包括含有抗体分子的除第一恒定区免疫球蛋白结构域之外的恒定区的多肽。因此，Fc是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，以及IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域、以及任选地，这些结构域的N-末端的柔性铰链的全部或部分。对于IgA和IgM，Fc可以包括J链。对于IgG，Fc包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3(Cγ2和Cγ3)以及任选地Cγ1(Cγ1)与Cγ2(Cγ2)之间的下铰链的一部分。尽管Fc区的边界可以变化，但如本文所用，人类IgG重链Fc区包含其羧基末端的残基A231，其中编号根据如卡巴特中列出的EU索引进行。Fc可以是指分离中的这个区或者在抗体、抗体片段、或Fc融合蛋白背景下的这个区。已在多个不同Fc位置处观察到多态性，包括但不限于如由EU索引编号的IgG1的位置270、272、312、315、356、以及358，并且因此所表示的序列与现有技术序列之间可能存在略微的差异。
在一个方面，本披露涵盖Fc变体BiSAb，其相对于天然Fc BiSAb具有改变的针对Fc配体(例如，Fc受体，C1q)的结合特性。结合特性的实例包括但不限于结合特异性、平衡解离常数(Kd)、解离和缔合速率(分别为koff和kon)、结合亲和力和/或亲合力。在本领域已知的是平衡解离常数(Kd)被定义为koff/kon。在某些方面，包含具有低Kd的Fc变体区的BiSAb可能比具有高Kd的BiSAb是更希望的。然而，在一些情况下，与Kd的值相比，kon或koff的值可能更加有意义。本领域技术人员可以确定哪个动力学参数对于给定的应用来说是最重要的。例如，减少与一种或多种正调节子(例如，FcγRIIIA)的结合和/或增强与抑制性Fc受体(例如，FcγRIIB)的结合的修饰合适于降低ADCC活性。因此，对不同受体的结合亲和力的比率(例如，平衡解离常数(Kd)的比率)可表明本披露的Fc变体BiSAb的ADCC活性是否增强或降低。另外，减少与C1q的结合的修饰将合适于减少或消除CDC活性。
在一个方面，与天然Fc BiSAb相比，Fc变体BiSAb展现出对一种或多种Fc受体的改变的结合亲和力，这些Fc受体包括但不限于FcRn、FcγRI(CD64)(包括同种型FcγRIA、FcγRIB、和FcγRIC)；FcγRII(CD32，包括同种型FcγRIIA、FcγRIIB、和FcγRIIC)；和FcγRIII(CD16，包括同种型FcγRIIIA和FcγRIIIB)。
在某些方面，Fc变体BiSAb具有增加的对Fc配体的亲和力。在其他方面，Fc变体BiSAb相对于天然Fc BiSAb具有减少的对Fc配体的亲和力。
在具体的方面，Fc变体BiSAb对Fc受体FcγRIIIA具有增强的结合。在另一个具体方面，Fc变体BiSAb对Fc受体FcγRIIB具有增强的结合。在另外的具体方面，Fc变体BiSAb对Fc受体FcγRIIIA和FcγRIIB两者具有增强的结合。在某些方面，与天然Fc BiSAb相比，对FcγRIIIA具有增强的结合的Fc变体BiSAb在结合FcγRIIB受体方面不具有伴随的增加。在具体的方面，Fc变体BiSAb对Fc受体FcγRIIIA具有降低的结合。在另外的具体方面，Fc变体BiSAb对Fc受体FcγRIIB具有降低的结合。在另一个具体的方面，Fc变体BiSAb对Fc受体FcRn具有增强的结合。在仍另一个具体的方面，对FcγRIIIA和/或FcγRIIB展现出改变的亲和力的Fc变体BiSAb对Fc受体FcRn具有增强的结合。在又另一个具体的方面，相对于天然Fc BiSAb，对FcγRIIIA和/或FcγRIIB展现出改变的亲和力的Fc变体BiSAb对C1q具有改变的结合。
在另一个方面，相对于天然Fc BiSAb，Fc变体BiSAb展现出增加或降低的对C1q的亲和力。在仍另一个具体的方面，对C1q展现出改变的亲和力的Fc变体BiSAb对Fc受体FcRn具有增强的结合。在又另一个具体的方面，相对于天然Fc BiSAb，对C1q展现出改变的亲和力的Fc变体BiSAb具有对FcγRIIIA和/或FcγRIIB的改变的结合。
认识到的是抗体能够通过在本领域中共同称为抗体效应子功能的多种方法引导靶标抗原的攻击和破坏。被称为“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用”或“ADCC”的这些方法之一指的是细胞毒性作用的一种形式，其中结合到存在于某些细胞毒性细胞(例如，天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞、以及巨噬细胞)上的Fcγ受体(FcγR)上的分泌的Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性地结合带有抗原的靶标细胞并且随后用细胞毒素杀伤该靶标细胞。针对靶细胞表面的特异性高亲和力IgG抗体“武装”细胞毒性细胞并且是这种杀伤所需要的。靶标细胞的裂解是细胞外的，要求直接的细胞与细胞接触，并且不涉及补体。术语效应子功能所涵盖的另一种方法是补体依赖性细胞毒性(下文称为“CDC”)，该方法指的是通过补体系统进行的抗体介导的靶标细胞破坏的生物化学事件。补体系统是在正常血浆中发现的一种蛋白质复合系统，该系统与抗体组合以消灭病原菌以及其他外源细胞。术语效应子功能所涵盖的仍然另一种方法是抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)，该方法指的是细胞介导的反应，其中表达一种或多种效应配体的非特异性细胞毒性细胞识别靶标细胞上的结合抗体并且随后引起靶标细胞的吞噬作用。
考虑的是，通过用于确定一种或多种FcγR介导的效应细胞功能的体外功能测定来表征Fc变体BiSAb。在某些方面，Fc变体BiSAb具有相似的结合特性，并且效应细胞如在基于体外测定中那样在体内模型(例如在此描述和披露的那些)中起作用。然而，本披露不排除在基于体外的测定中未展现出所希望的表型但在体内展现出所希望的表型的Fc变体BiSAb。
可通过增加Fc区对FcRn的结合亲和力来增加包含Fc区的蛋白的血清半衰期。如本文所用的术语“抗体半衰期”意指抗体的药代动力学特性，它是抗体分子在它们的给予之后的平均存活时间的度量。抗体半衰期可以表示为从患者(或其他哺乳动物)的身体或其特定区室(例如，如在血清中测量的，即循环半衰期)，或在其他组织中消除50％已知量的免疫球蛋白所需要的时间。从一种免疫球蛋白或免疫球蛋白类别到另一种免疫球蛋白或免疫球蛋白类别，半衰期可能不同。一般地，抗体(或BiSAb)半衰期的增加导致循环中所给予BiSAb的平均停留时间(MRT)的增加。
半衰期的增加允许供给患者的药物量的减少以及给予频率的减少。为了增加BiSAb的血清半衰期，可以例如将补救受体结合表位并入到BiSAb(尤其是抗体片段)中，如在美国专利号5,739,277中所描述的。如本文所用，术语“补救受体结合表位”是指引起IgG分子的体内血清半衰期的增加的IgG分子(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区的表位。可替代地，具有延长的半衰期的本披露的BiSAb可以通过对鉴别为参与Fc与FcRn受体之间的相互作用的氨基酸残基进行修饰而产生(参见，例如，美国专利号6,821,505和7,083,784)。另外，可利用本领域中广泛使用的技术通过与PEG或白蛋白轭合来使本披露的BiSAb的半衰期增加。
考虑到将另外的结合结构域插入如本文所述的Fc区和/或随后通过抗原结合可影响Fc活性。例如，结合抗原可以增加或降低对FcgR、C1q、和FcRn的结合亲和力和活性。这将产生抗原依赖性转换以调节各种抗体依赖性过程。在一个方面，抗原结合可以减少与FcRn的相互作用，允许游离的BiSAb与FcRn相互作用并具有正常的半衰期，但允许BiSAb-Ag复合物的快速清除/细胞内化。此外，这可以允许BD2-抗原介导的相互作用对BD1结合的抗原的清除产生影响。在另外的方面，BiSAb可包含直接插入BD2的Fc区(Fc-BD2)。
在一个方面，本披露提供了Fc变体，其中该Fc区包含在选自下组的一个或多个位置处的修饰(例如，氨基酸取代、氨基酸插入、氨基酸缺失)，该组由以下组成：如通过如在卡巴特中列出的EU索引来编号的221、225、228、234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、247、250、251、252、254、255、256、257、262、263、264、265、266、267、268、269、279、280、284、292、296、297、298、299、305、308、313、316、318、320、322、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、339、341、343、370、373、378、392、416、419、421、428、433、434、435、436、440、以及443。任选地，该Fc区可以包含在本领域技术人员已知的另外的和/或可替代的位置处的修饰(参见例如美国专利5,624,821、6,277,375、6,737,056、7,083,784、7,317,091、7,217,797、7,276,585、7,355,008)。另外，有用的氨基酸位置以及特定取代在US 6,737,056的表2以及表6-10、US 2006/024298的图41中表示的表、US 2006/235208的图5、12以及15中表示的表、US 2006/0173170的图8、9以及10中表示的表、以及WO 09/058492的图8-10、13以及14中表示的表中举例说明。
在具体的方面，本披露提供了Fc变体，其中该Fc区包含至少一个选自下组的取代，该组由以下组成：如通过如在卡巴特中列出的EU索引来编号的221K、221Y、225E、225K、225W、228P、234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、2341、234V、234F、235A、235D、235R、235W、235P、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、2351、235V、235E、235F、236E、237L、237M、237P、239D、239E、239N、239Q、239F、239T、239H、239Y、2401、240A、240T、240M、241W、241L、241Y、241E、241R、243W、243L、243Y、243R、243Q、244H、245A、247L、247V、247G、250E、250Q、251F、252L、252Y、254S、254T、255L、256E、256F、256M、257C、257M、257N、2621、262A、262T、262E、2631、263A、263T、263M、264L、2641、264W、264T、264R、264F、264M、264Y、264E、265A、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、2651、265L、265H、265T、2661、266A、266T、266M、267Q、267L、268E、269H、269Y、269F、269R、270E、280A、284M、292P、292L、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、296L、2961、296H、296G、297S、297D、297E、298A、298H、2981、298T、298F、2991、299L、299A、299S、299V、299H、299F、299E、3051、308F313F、316D、318A、318S、320A、320S、322A、322S、325Q、325L、3251、325D、325E、325A、325T、325V、325H、326A、326D、326E、326G、326M、326V、327G、327W、327N、327L、328S、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、3281、328V、328T、328H、328A、329F、329H、329Q、330K、330G、330T、330C、330L、330Y、330V、3301、330F、330R、330H、331G、331A、331L、331M、331F、331W、331K、331Q、331E、331S、331V、3311、331C、331Y、331H、331R、331N、331D、331T、332D、332S、332W、332F、332E、332N、332Q、332T、332H、332Y、332A、333A、333D、333G、333Q、333S、333V、334A、334E、334H、334L、334M、334Q、334V、334Y、339T、370E、370N、378D、392T、396L、416G、419H、421K、428L、428F、433K、433L、434A、424F、434W、434Y、436H、440Y以及443W。任选地，该Fc区可以包含本领域的技术人员已知的另外的和/或可替代的氨基酸取代，这些氨基酸取代包括但不限于在US 6,737,056的表2以及表6-10、US 2006/024298的图41中表示的表、US 2006/235208的图5、图12以及图15中表示的表、US 2006/0173170的图8、图9以及图10中表示的表、以及US 20090041770的图8、图9以及图10中表示的表中举例说明的那些，其所有通过引用以其全文并入本文。
在具体的方面，本披露提供了Fc变体BiSAb，其中该Fc区包含在选自下组的一个或多个位置处的至少一个修饰(例如，氨基酸取代、氨基酸插入、氨基酸缺失)，该组由以下组成：如通过如在卡巴特中列出的EU索引来编号的228、234、235以及331。在一个方面，该修饰是选自下组的至少一个取代，该组由以下组成：如通过如在卡巴特中列出的EU索引来编号的228P、234F、235E、235F、235Y、以及331S。
在另一个具体的方面，本披露提供了Fc变体BiSAb，其中该Fc区是IgG4 Fc区并且包含在选自下组的一个或多个位置处的至少一个修饰，该组由以下组成：如通过如在卡巴特中列出的EU索引来编号的228和235。在仍另一个具体的方面，该Fc区是IgG4 Fc区，并且这些非天然存在的氨基酸选自下组，该组由以下组成：如通过如在卡巴特中列出的EU索引编号的228P、235E以及235Y。
在另一个具体的方面，本披露提供了Fc变体BiSAb，其中该Fc区包含在选自下组的一个或多个位置处的至少一个非天然存在的氨基酸，该组由以下组成：如通过如在卡巴特中列出的EU索引来编号的239、330以及332。在一个方面，该修饰是选自下组的至少一个取代，该组由以下组成：如通过如在卡巴特中列出的EU索引来编号的239D、330L、330Y以及332E。参见美国专利号7,317,091，将其通过引用以其全文并入本文。
在具体的方面，本披露提供了Fc变体BiSAb，其中该Fc区包含在选自下组的一个或多个位置处的至少一个非天然存在的氨基酸，该组由以下组成：如通过如在卡巴特中列出的EU索引来编号的252、254以及256。在一个方面，该修饰是选自下组的至少一个取代，该组由以下组成：如通过如在卡巴特中列出的EU索引来编号的252Y、254T以及256E。参见美国专利号7,083,784，将其通过引用以其全文并入本文。
在某些方面，本披露提供了Fc变体BiSAb，其中该Fc区包含位置428(如通过如在卡巴特中列出的EU索引来编号)处的非天然存在的氨基酸。在一个方面，位置428处的修饰选自下组，该组由以下组成：如通过如在卡巴特中列出的EU索引来编号的428T、428L、428F、以及428S。参见美国专利号7,670,600，将其通过引用以其全文并入本文。在另一个方面，Fc变体BiSAb可进一步包含位置434(如通过如在卡巴特中列出的EU索引来编号)处的非天然存在的氨基酸。在一个方面，位置434处的修饰选自下组，该组由以下组成：如通过如在卡巴特中列出的EU索引来编号的434A、434S、以及434F。在其他方面，本披露提供了Fc变体BiSAb，其中该Fc区包含位置428和434(如通过如在卡巴特中列出的EU索引来编号)处的非天然存在的氨基酸。在具体的方面，该Fc区包含428L、434S。参见美国专利号8,088,376。
在某些方面，由IgG抗体引发的效应子功能很大程度上取决于连接至该蛋白的Fc区的碳水化合物部分(Claudia Ferrara等人，2006，Biotechnology and Bioengineering[生物技术与生物工程]93:851-861)。因此，可以修饰Fc区的糖基化以便提高或降低效应子功能(参见例如，Umana等人，1999，Nat.Biotechnol[自然生物技术]17:176-180；Davies等人，2001，Biotechnol Bioeng[生物技术和生物工程]74:288-294；Shields等人，2002，JBiol Chem[生物化学杂志]277:26733-26740；Shinkawa等人，2003，J Biol Chem[生物化学杂志]278:3466-3473；美国专利号6,602,684、6,946,292、7,064,191、7,214,775、7,393,683、7,425,446、7,504,256，POTELLIGENTTM技术(Biowa有限公司(Biowa,Inc.)普林斯顿，新泽西州)；GLYCOMABTM糖基化工程技术(格黎卡特生物技术股份公司(GLYCARTbiotechnology AG)，苏黎世，瑞士))。因此，在一个方面，本披露的BiSAb的Fc区包含氨基酸残基的改变的糖基化。在另一个方面，氨基酸残基的改变的糖基化导致降低的效应子功能。在另一个方面，氨基酸残基的改变的糖基化导致增加的效应子功能。在具体的方面，该Fc区具有减少的岩藻糖基化。在另一个方面，该Fc区是未岩藻糖基化的(参见，例如，美国专利申请公开号2005/0226867)。在一个方面，具有增加的效应子功能(尤其是ADCC)的这些BiSAb在宿主细胞(例如，CHO细胞，浮萍(Lemna minor))中产生，其被工程化来产生具有ADCC的高度去岩藻糖基化的多肽，该ADCC比通过亲本细胞产生的多肽高出100倍以上(Mori等人，2004，Biotechnol Bioeng[生物技术与生物工程]88:901-908；Cox等人，2006，NatBiotechnol[自然生物技术]24:1591-7)。
向IgG分子上的低聚糖添加唾液酸可以增强他们的抗炎症活性并且改变他们的细胞毒性(Keneko等人，Science[科学]，2006，313:670-673；Scallon等人，Mol.Immuno.[分子免疫学]2007年3月；44(7):1524-34)。以上参考的研究论证了具有增加的唾液酸化的IgG分子具有抗炎症特性，而具有降低的唾液酸化的IgG分子具有提高的免疫刺激特性(例如，提高ADCC活性)。因此，对于具体应用，BiSAb可以被修饰为具有适当的唾液酸化性质(美国公开号2009/0004179和国际公开号WO 2007/005786)。
在一个方面，与天然Fc区相比，本披露的BiSAb的Fc区包含改变的唾液酸化特征。在一个方面，与天然Fc区相比，本披露的BiSAb的Fc区包含增加的唾液酸化特征。在另一个方面，与天然Fc区相比，本披露的BiSAb的Fc区包含降低的唾液酸化特征。
在一个方面，本披露的Fc变体可以与其他已知的Fc变体组合，这些其他已知的Fc变体如在Ghetie等人，1997，Nat Biotech.[自然生物技术]15:637-40；Duncan等人，1988，Nature[自然]332:563-564；Lund等人，1991，J.Immunol[免疫学杂志]147:2657-2662；Lund等人，1992，Mol Immunol[分子免疫学]29:53-59；Alegre等人，1994，Transplantation[移植]57:1537-1543；Hutchins等人，1995，Proc Natl.Acad Sci USA[美国国家科学院院刊]92:11980-11984；Jefferis等人，1995，Immunol Lett.[免疫学快报]44:111-117；Lund等人，1995，Faseb J[美国实验生物学学会联合会杂志]9:115-119；Jefferis等人，1996，Immunol Lett[免疫学快报]54:101-104；Lund等人，1996，J Immunol 157:4963-4969；Armour等人，1999，Eur J Immunol[欧洲免疫学杂志]29:2613-2624；Idusogie等人，2000，JImmunol[免疫学杂志]164:4178-4184；Reddy等人，2000，J Immunol[免疫学杂志]164:1925-1933；Xu等人，2000，Cell Immunol[细胞免疫学]200:16-26；Idusogie等人，2001，JImmunol[免疫学杂志]166:2571-2575；Shields等人，2001，J Biol Chem[生物化学杂志]276:6591-6604；Jefferis等人，2002，Immunol Lett[免疫学快报]82:57-65；Presta等人，2002，Biochem Soc Trans[生物化学学会汇刊]30:487-490)；美国专利号5,624,821、5,885,573、5,677,425、6,165,745、6,277,375、5,869,046、6,121,022、5,624,821、5,648,260、6,528,624、6,194,551、6,737,056、7,122,637、7,183,387、7,332,581、7,335,742、7,371,826、6,821,505、6,180,377、7,317,091、7,355,008中披露的那些。Fc结构域的其他修饰和/或取代和/或添加和/或缺失将易于对本领域技术人员显而易见。
值得注意的是，以包含天然Fc的BiSAb形式存在的多肽保留结合FcRn和C1q以及介导ADCC的能力，如实例中示出的。因此，在某些方面，BiSAb保留结合FcRn和/或C1q和/或一种或多种Fcγ受体(FcγR)的能力。例如，在某些方面，与结合至与BiSAb结合的表位之一的常规抗体相比，BiSAb保留了至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的结合FcRn和/或C1q和/或一个或多个FcγR的能力。在某些方面，从一种或两种常规抗体的结合结构域产生BiSAb，并且对这些常规抗体中的一种或两种进行活性比较。
改变的Fc区也可用于产生重链异二聚体，产生包含两个不同重-轻链对的BiSAb。为了促进异二聚体的形成，工程化一对Fc区之间的界面以最大化从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比。在某些方面，该界面包含CH3结构域的至少一部分。在此方法中，“突起”通过用较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替换来自第一抗体分子的界面的一个或多个小的氨基酸侧链来产生。大小与一个或多个大侧链相同或相似的补偿“空腔”通过用较小侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链来在第二抗体分子的界面上产生。这提供一种机制用于提高异二聚体超出其他不想要的最终产物如同二聚体的产率。CH3修饰包括例如，一个重链上的Y407V/T366S/L368A和另一个重链上的T366W；一个重链上的S354C/T366W和另一个重链上的Y349C/Y407V/T366S/L368A。导致一个链上产生突起和另一个链上产生空腔的另外的修饰描述于U.S.7,183,076、US 2014/0348839以及Merchant等人，1998，Nat.Biotech[自然生物技术]16:677-681中。表1a中给出了可以导致突起-空腔排列的修饰的一些非限制性实例。可以用于产生异二聚体的其他修饰包括但不限于改变整个Fc二聚体界面的电荷极性以使得静电匹配的Fc区的共表达导致异二聚化的那些。改变电荷极性的修饰包括但不限于下文表1b中表示的那些(还参见US 20090182127；Gunasekaran等人，2010，JBC[生物化学杂志]285:19637-46)。此外，Davis等人(2010，Prot.Eng.Design&Selection[蛋白工程设计与选择]23:195-202)描述了使用链交换工程化结构域(SEED)CH3区的异二聚体的Fc平台，这些CH3区是人类IgG和IgA CH3结构域的衍生物(还参见WO 2007/110205)。
表1a.异二聚化的CH3修饰(突起-空腔)
表1b.用于异二聚化的CH3修饰
本领域技术人员将理解，在一些方面，由于包含Fc区的分子的同源二聚体性质，Fc融合蛋白可以形成二聚体。在一些方面中，结合蛋白(例如，BiSAb)的Fc区可以用突变有差别性地工程化以便：促进和/或保持异源二聚体化(例如，嵌合突变、互补突变、停靠和锁定突变、突起入孔(knobs into holes)突变、链交换工程化结构域(SEED)突变等，参见例如，美国专利号7,183,076；Merchant等人，(1998)Nat.Biotech[自然生物技术]16:677-681；Ridgway等人，(1996)Protein Engineering[蛋白工程]9:617-621；Davis等人，(2010)Prot.Eng.Design&Selection[蛋白工程设计与选择]23:195-202；WO 2007/110205、WO2007/147901；Gunasekaran等人，(2010)JBC[生物化学杂志]285:19637-46，全部通过引用并入本文)。因此，可以工程化结合蛋白以形成异二聚体，该异二聚体包含例如与第一Fc区或其片段融合的第一结合蛋白、结合结构域、或BiSAb，和与第二Fc区或片段融合的第二(即，不同的)结合蛋白、结合结构域、或BiSAb，其中该第一和第二Fc区或其片段已经被工程化以异二聚化。
3.糖基化
除了糖基化以改变多肽的效应子功能的能力之外，在可变区中的经修饰的糖基化还可以改变抗体(或BiSAb)对于靶抗原的亲和力。在一个方面，在本发明BiSAb的可变区中的糖基化模式被修饰。例如，可以制备未糖基化的BiSAb(即，BiSAb缺乏糖基化)。糖基化可以被改变为例如增加BiSAb对于靶标抗原的亲和力。此类碳水化合物修饰可以通过例如改变在BiSAb序列之内的一个或多个糖基化位点来完成。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，这导致一个或多个可变区框架糖基化位点的消除，由此消除在那个位点的糖基化。这种未糖基化可以增加BiSAb对抗原的亲和力。这种方法在美国专利号5,714,350和6,350,861中更详细地描述。还可以进行一个或多个氨基酸取代，这导致存在于Fc区中的糖基化位点(例如，IgG的天冬酰胺297)的消除。此外，未糖基化的BiSAb可以在缺乏必要的糖基化机器的细菌细胞中产生。
4.多肽接头
接头可用于将BiSAb嵌合重链的结构域/区连接成连续分子。如本文所述，BiSAb可包括一个、两个、或更多个接头多肽(例如，L1和L2)。另外地，BiSAb可以包括另外的接头，例如互连scFv的可变重链和轻链的柔性接头。另外地，BiSAb可以包括另外的接头，例如互连scFv的可变重链和轻链的柔性接头以及将其他结合单位连接到BiSAb核心结构的其他接头。
接头的示例性非限制性实例是包含至少4个残基的多肽链。这些接头中的部分可以是柔性的、亲水的并且具有很少或没有它们自身的二级结构(接头部分或柔性接头部分)。在分子组装后，至少4个氨基酸的接头可用于连接位置彼此靠近的结构域和/或区。也可以使用更长或更短的接头。因此，接头在长度上可以是大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、或大约50个残基。当多个接头用于互连部分的分子时，这些接头可以是相同或不同的(例如，相同或不同的长度和/或氨基酸序列)。
接头可以是可切割的接头，其含有至少一个可以被切割试剂选择性切割的键。可切割接头可用于促进全部或部分的接头序列的去除。可以将接头工程化成含有蛋白酶切割位点，使得切割发生在接头的中间或接头的至少一端。例如，可以在接头的两个侧翼末端中的每一个处工程化凝血酶位点。取决于所用接头的类型，切割也可以由例如TCEP、TFA、和DTT的试剂介导。可以设计接头以使切割试剂从切割产物中去除接头上的所有残余物。其他示例性非限制性接头包括前药接头，这些前药接头的键可以在体内条件下选择性地被切割，例如，在内源酶或其他内源因子的存在下，或简单地在存在于体内或体内细胞中的水性流体中。当BiSAb含有多于一种多肽接头时，每个接头可以是不同的，或者至少一个接头可以与其他接头不同。在一些方面，BiSAb包含可切割的接头。在具体的方面，该BiSAb包含scFv，其中该scFv包含VH2和VL2之间的可切割接头。
该接头(一个或多个)促进所希望的结构的形成。这些接头可以包含(Gly-Ser)n残基，其中一些Glu或Lys残基分散各处以增加溶解度。可替代地或另外地，接头可以不包含任何丝氨酸残基，当接头经历O-连接的糖基化时，这种接头可能是优选的。在一些方面，接头可以含有半胱氨酸残基，例如，如果接头的二聚化用于使BiSAb的结构域进入其正确折叠的构型。在一些方面，该BiSAb包含至少两个连接该多肽的结构域的多肽接头。在其他方面，该BiSAb包含至少三个多肽接头。在其他方面，该BiSAb包含四个或更多个多肽接头。
在一些方面，该多肽接头包含Fc部分的一部分。例如，在一些方面，该多肽接头可包含IgG1、IgG2、IgG3、和/或IgG4抗体的免疫球蛋白铰链结构域的一部分。在一些方面，该多肽接头包含IgG1、IgG2、IgG3、和/或IgG4的突变的免疫球蛋白铰链结构域的一部分。在一些方面，该多肽接头包含IgG1、IgG2、IgG3、和/或IgG4抗体的免疫球蛋白铰链区/结构域的至少5、7、8、或15个氨基酸残基。在一些方面，该多肽接头包含IgG1、IgG2、IgG3、和/或IgG4抗体的修饰的免疫球蛋白铰链区/结构域的至少5、7、8、或15个氨基酸残基。
该多肽接头可包含天然含有三个半胱氨酸的铰链区的全部或部分。在某些方面，相对于完整和/或天然存在的铰链区，所选择的铰链区被截短或者以另外方式改变或取代，使得仅剩余一个或两个半胱氨酸残基。类似地，在某些其他方面，该多肽接头可以包含铰链区的突变的或以另外方式改变的部分，其中半胱氨酸残基的数量通过氨基酸取代或缺失而减少，例如突变的或以另外方式改变的铰链区含有如本文所述的零个、一个或两个半胱氨酸残基。
因此，突变的或以另外方式改变的铰链结构域可以由(或使用)含有一个或多个半胱氨酸残基的野生型免疫球蛋白铰链结构域衍生或构建。在某些方面，铰链区的突变或以另外方式改变的部分可含有零个或仅一个半胱氨酸残基，其中该突变的或以另外方式改变的铰链区是野生型免疫球蛋白铰链区或已经从其衍生，其分别含有一个或多个或者两个或更多个半胱氨酸残基。在铰链区的突变或以另外方式改变的部分中，野生型免疫球蛋白铰链区的半胱氨酸残基优选地缺失或被不能形成二硫键的氨基酸取代。在一些方面，铰链区的突变或以另外方式改变的部分是人类IgG野生型铰链区或已经从其衍生，其可以包括四种人类IgG同种型亚类中的任何一种：IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4。
在一些方面，该多肽接头包含铰链区的一部分，该铰链区包含与免疫球蛋白轻链形成二硫键的半胱氨酸残基(EU残基220)。在一些方面，该多肽接头包含铰链区的改变部分，该铰链区包含在EU残基C220处的氨基酸取代。在一些方面，该多肽接头包含氨基酸取代C220V。
在一些方面，该多肽接头包含防止铰链相关的自发自切割的氨基酸取代。在一些方面，该多肽接头包含在EU位置D221处的位置处的氨基酸取代。在一些方面，该多肽接头包含氨基酸取代D221G。在一些方面，该多肽接头缺乏氨基酸D221。
如上所述，一些实施例包括一个或多个包含gly-ser接头或由其组成的多肽接头。如本文所用，术语“gly-ser接头”是指由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。示例性gly-ser接头包含式(Gly4Ser)n的氨基酸序列，其中n是正整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10)。gly-ser接头的一些优选和非限制性实例包括(Gly4Ser)2(SEQ ID NO:41)和(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:42)以及(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:43)。在又其他方面，两个或更多个gly-ser接头在多肽接头中串联并入。在一些方面，该多肽接头包含至少一部分的铰链区(例如，衍生自IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4分子)和一系列gly-ser氨基酸残基(例如，gly-ser接头，例如(Gly4Ser)n，其中n是2、3、或4)。
在某些方面，接头(例如，L1和/或L2和/或L3等)包括铰链部分和接头部分(例如包含gly-ser接头的接头部分)二者。在其他方面，L1和/或L2仅包括铰链部分或仅包括接头部分，例如gly-ser接头。在其他方面，L1和L2包括gly-ser接头部分。在某些方面，BiSAb内的gly-ser接头长度相同，而在其他方面，BiSAb内的gly-ser接头部分(例如，L1和L2)是不同的长度。当BiSAb包含scFv时，scFv的重链和轻链可以通过柔性接头与BiSAb(例如，BD1、Fab、Fc等)连接。该柔性接头一般不包括铰链部分，而是gly-ser接头或其他柔性接头。可以容易地选择和优化互连scFv结构域的柔性接头的长度和氨基酸序列(例如，(Gly4Ser)n(SEQ ID NO:48)，其中n是2、3、或4或更多)。
无论用于互连各种结合单位元和结构域的多肽接头如何(例如，在结合结构域/单位元(例如，Fab-scFv)之间，或结合结构域/单位与Fc(例如，经由L1和L2的scFv))，BiSAb可任选地包含另外的多肽接头。独立地选择这类另外的多肽接头的长度和序列。例如，BiSAb可以进一步包含互连scFv的可变重链和轻链的柔性多肽接头。该柔性多肽接头可包含gly-ser接头。一般地，该接头不包括铰链部分。
这里考虑变化BD2侧翼的接头的长度可以影响BD2抗原结合位点的定向和相对于BiSAb分子的其余部分的间隔。例如，短的N-末端接头和长的C-末端接头可以产生其中结合位点以一个方向构象的定向，而长的N-末端和短的C-末端接头可以赋予相反的构象定向。因此，可以调节接头长度以定向BD2抗原结合位点，并且对于产生或避免BD1和BD2和/或BD2与结合Fc或其他结构域中的抗体分子的其他实体之间的位阻效应具有重要影响。
5.BiSAb的具体构型
如上所述，本披露的一个方面涉及BiSAb结构排列(平台)，该排列包含两个重-轻链对(图1A-1F中所阐明的)。在该方面的一些实施例中，BiSAb嵌合重链的多肽序列可包含含有抗体重链可变结构域(VH1)的多肽序列、含有抗体重链恒定结构域1(CH1)的多肽序列、一部分的Fc结构域、含有第一多肽接头(L1)的多肽序列、含有结合结构域(BD2)的多肽序列、含有第二多肽接头(L2)的多肽序列、和含有Fc结构域的其余部分的多肽序列。在一些方面，该Fc结构域包含CH2结构域和CH3结构域。因此，某些实施例提供了BiSAb嵌合重链，该嵌合重链可以包含呈以下定向的多肽序列，从N-末端到C-末端：VH1-CH1-CH2(N-末端)-L1-BD2-L2-CH2(C-末端)-CH3、VH1-CH1-CH2-L1-BD2-L2-CH3、以及VH1-CH1-CH2-CH3(N-末端)-L1-BD2-L2-CH3(C-末端)。BiSAb轻链的多肽序列可包含轻链可变结构域(VL1)和轻链恒定结构域(CL)。因此，BiSAb轻链可以包含呈以下定向的多肽序列，从N-末端到C-末端：VL1-CL。注意将VH1、VL1和CL用于表示结合第一表位的“结合单位1”(BD1)的部分。将BD2用于表示结合第二表位的“结合单位2”的部分。
在其中结合结构域是scFv的方面中，该BiSAb嵌合重链可以包含含有抗体重链可变结构域(VH1)的多肽序列、含有抗体重链恒定结构域1(CH1)的多肽序列、含有第一多肽接头(L1)的多肽序列、含有抗体轻链可变结构域(VL2)的多肽序列、含有柔性接头的多肽序列、含有抗体重链可变结构域(VH2)的多肽序列、含有第二多肽接头(L2)的多肽序列、和含有抗体Fc结构域的多肽序列。因此，包含scFv作为BD2的BiSAb的嵌合重链可以包含呈以下定向的多肽序列，从N-末端到C-末端：VH1-CH1-CH2(N-末端)-L1-VL2-L3-VH2-L2-CH2(C-末端)-CH3、VH1-CH1-CH2-L1-VL2-L3-VH2-L2-CH3、VH1-CH1-CH2-CH3(N-末端)-L1-VL2-L3-VH2-L2-CH3(C-末端)、VH1-CH1-CH2(N-末端)-L1-VH2-L3-VL2-L2-CH2(C-末端)-CH3、VH1-CH1-CH2-L1-VH2-L3-VL2-L2-CH3、以及VH1-CH1-CH2-CH3(N-末端)-L1-VH2-L3-VL2-L2-CH3(C-末端)。
该嵌合重链是包含氨基酸序列(例如，每个多肽结构域的氨基酸序列)的多肽链。该嵌合重链是包含氨基酸序列(例如，每个多肽结构域的氨基酸序列)的多肽链。注意将VH1、VL1、和CL用于表示结合单位1的部分，其中VH1和VL1表示结合第一表位的部分。将VH2和VL2用于表示结合第二表位的结合单位2的部分。在某些方面，另外的scFv结合结构域存在于构成BiSAb核心的多肽的N-末端和/或C-末端(其中该BiSAb核心进一步包含结合单位(BD)3和/或4和/或5)。在某些方面，BiSAb核心内存在多于一个scFv结合结构域。每个另外的scFv包含表示为VH3、VH4、VH5的抗体重链可变区和表示为VL3、VL4、VL5的相应抗体轻链可变区。
6.标记物、轭合物和部分
在某些特征中，药物和其他分子可以经由位点特异性轭合靶向BiSAb。例如，BiSAb可以包含工程化半胱氨酸结构域(包括至结合单位和/或Fc结构域的一个或多个半胱氨酸)，这导致用于轭合反应的游离巯基。在某些方面，将BiSAb工程化以掺入特异性轭合位点。在一些方面，本披露提供了Fc变体BiSAb，其中该Fc区包含在如由EU索引编号的位置239、282、289、297、312、324、330、335、337、339、356、359、361、383、384、398、400、440、422、和442中的一个或多个处的氨基酸取代。在一些方面，该Fc区包含在下组中的一个或多个位置处的取代：a)289和440、b)330和440、c)339和440、d)359和440、e)289和359、f)330和359、g)339和359、h)289和339、i)330和339、j)289和330、k)339和442、1)289、339、和442、m)289、330、和339、n)330、339、和442、和o)289、330、和442。在其他方面，本披露提供了BiSAb，其中Fab臂的CH1结构域包含在如由EU索引进行编号的位置131、132、134、135、136和139中的一个或多个处的取代。在一个方面，该取代包含对选自半胱氨酸、赖氨酸、酪氨酸、组氨酸、硒代半胱氨酸、和硒代甲硫氨酸的氨基酸的取代。在具体的方面，该取代是半胱氨酸。用于产生稳定的半胱氨酸工程化抗体的方法描述于U.S.7,855,275、U.S.20110033378和US20120213705中，其内容通过引用以其全文并入本文。
7.示例性靶标
尽管可以产生与本文描述的各种DuetMab和BiSAb平台相关的方面和实施例以结合任何期望的一种或多种靶标，但本文披露的BiSAb优选地靶向特异性靶标分子对(例如，结合单位1结合这些靶标中之一并且结合单位2结合其他靶标)。如上所述并且如以下说明性实例中举例说明的，将本文披露的抗体，DuetMab和BiSAb靶向调节接受者受试者或培养物中免疫细胞中的免疫应答的分子。在一些实施例中，该结合结构域对选自下组的靶标展示出特异性结合活性，该组由以下组成：CTLA-4、PD-1、PD-L1、OX40、和TIM3。DuetMab和BiSAb可以包含呈各种顺序和定向的不同结合结构域的组合，其中这些结构域对本文披露的靶标具有结合亲和力或与其特异性结合。例如，本文披露的DuetMab和BiSAb可以包含允许与如下靶标双特异性结合的结合结构域的组合，这些靶标包括：CTLA-4和PD-1、CTLA-4和PD-L1、和CTLA-4、CTLA-4和TIM3、PD-1和PD-L1、PD-L1和OX40、PD-1和TIM3、PD-L1和TIM3。包括结合特定靶标组合的结合结构域的DuetMab和BiSAb在实例中阐明，并包括PD-1/CTLA-4、PD-L1/CTLA-4、PD-1/TIM3、和PD-L1/OX40的非限制性组合。在某些实施例中，相对于用于产生BiSAb的组合的单独单特异性结合蛋白的结合特性，BiSAb具有增强的结合特性。
在某些方面，本披露的DuetMab或BiSAb结合相同靶标上的两个不同表位(例如，结合单位1结合靶标上的第一表位，并且结合单位2结合相同靶标上的第二表位)。
在一些方面，本披露的DuetMab或BiSAb的多聚体性质赋予将标记或治疗剂靶向特异性细胞类型或分子靶标的能力。例如，DuetMab或BiSAb中的一个功能结构域可以结合细胞表面处的靶标，而相同DuetMab或BiSAb中的另一个功能结构域结合可用于检测的半抗原或标记剂。类似地，一个功能结构域可以结合至细胞靶标，而第二功能结构域结合毒素。由于两个结合反应均通过单个分子来介导，所以毒素可以放置在影响细胞毒性功能的细胞靶附近。
B.编码BiSAb的核酸分子
本披露提供了编码BiSAb的核酸分子。本披露的一个方面提供了编码本披露的BiSAb中任一个的核酸分子。核酸分子可以编码在本文中披露的BiSAb分子中的任一个的重链和/或轻链，以及在本文中披露的单独结合结构域(例如，scFv)。本领域技术人员将理解，如本领域一般已知的，考虑到核酸密码子简并性以及特定生物的密码子频率，此类多核苷酸分子的核苷酸序列可以不同。
C.用于产生BiSAb和随后纯化的载体和宿主细胞
本披露涉及用于产生BiSAb的方法。在某些方面，编码本文披露的全部或部分BiSAb的重组核酸分子可以与表达构建体中的一个或多个调节性核苷酸序列可操作地连接。编码BiSAb轻链和嵌合重链的核酸序列能以任何方向(例如，轻链在重链前面，或反之亦然)克隆在相同的表达载体中，或者可以克隆在两种不同的载体中。如果使用一种载体进行表达，则两种编码基因可以具有他们自己的遗传元件(例如，启动子、RBS、前导序列、终止、polyA等)，或者他们可以用一组遗传元件克隆，但与顺反子元件相连。调控核苷酸序列通常适合用于表达的宿主细胞。用于多种主宿主胞的许多类型的适当的表达载体和适合的调控序列是本领域已知的。典型地，所述一个或多个调控核苷酸序列可以包括但不限于启动子序列、前导序列或信号序列、核糖体结合位点、转录起始序列和终止序列、翻译起始和终止序列、以及增强子或活化序列。本披露期望如本领域已知的组成型或诱导型启动子。启动子可以是天然存在的启动子或组合一个以上启动子组分的杂合启动子。表达构建体可以存在于细胞中的附加体(例如质粒)上，或表达构建体可以插入染色体中。
在某些方面，表达载体含有选择标记基因以允许转化的宿主细胞的选择。选择标记基因在本领域是熟知的并且将随着使用的宿主细胞而变化。在某些方面，本披露涉及包含核苷酸序列的表达载体，所述核苷酸序列编码多肽并且可操作地连接至至少一个调控序列。调控序列是本领域公认的并且被选择为指导编码的多肽的表达。因此，术语调控序列包括启动子、增强子和其他表达控制元件。示例性的非限制性调控序列描述于Goeddel，GeneExpression Technology:Methods in Enzymology[基因表达技术：酶学中的方法]，Academic Press[学术出版社]，圣地亚哥,加利福尼亚州(1990)中。应当理解的是，表达载体的设计可以取决于这样的因素，如将要转化的宿主细胞的选择和/或希望表达的蛋白质的类型。而且，还应当考虑特定载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力和由该载体编码的任何其他蛋白(例如抗生素标记)的表达。
本披露进一步涉及产生本披露的BiSAb的方法。例如用一种或多于一种编码BiSAb的表达载体(例如，编码嵌合重链和轻链的单一载体或两个载体，一个编码嵌合重链并且一个编码轻链)转染的宿主细胞可以在适当的条件下培养以允许多肽的表达发生。可以从含有多肽的细胞和培养基的混合物中分泌和分离BiSAb。可替代地，BiSAb可以保留在细胞质或细胞膜部分中并且收获、裂解细胞并分离蛋白。细胞培养物包括宿主细胞、培养基和其他副产物。适合的用于细胞培养的培养基是本领域熟知的。可以使用本领域已知的用于纯化蛋白的技术从细胞培养基、宿主细胞或二者中分离BiSAb，这些技术包括离子交换色谱、凝胶过滤色谱、超滤、电泳和免疫亲和纯化。在某些方面，BiSAb被制成含有促进其纯化的结构域的融合蛋白。
可以通过将克隆基因或其部分连接至载体来产生重组核酸，该载体合适在原核细胞、真核细胞(酵母、鸟类、昆虫或哺乳动物)或两者中表达。用于产生重组多肽的表达载体包括质粒和其他载体。例如，合适的载体包括以下类型的质粒：用于在原核细胞，例如大肠杆菌中表达的pBR322-衍生的质粒、pEMBL-衍生的质粒、pEX-衍生的质粒、pBTac-衍生的质粒以及pUC-衍生的质粒。在某些方面，哺乳动物表达载体含有促进载体在细菌中增殖的原核序列、以及在真核细胞中表达的一个或多个真核转录单位。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo和pHyg衍生的载体为适合用于转染真核细胞的哺乳动物表达载体的实例。这些载体中的一些用来自细菌质粒(例如pBR322)的序列修饰，以促进在原核细胞和真核细胞中的复制和抗药性选择。可替代地，可以使用病毒的衍生物用于在真核细胞中暂时表达蛋白质，这些病毒如牛乳头状瘤病毒(BPV-1)或Epstein-Barr病毒(pHEBo、pREP衍生的和p205)。在这些质粒的制备和宿主生物的在转化中使用的多种方法是本领域已知的。对于用于原核和真核细胞两者的其他适合的表达系统、以及通用重组程序，参见Molecular Cloning A Laboratory Manual[分子克隆实验指南]，第二版，Sambrook、Fritsch和Maniatis编，Cold Spring HarborLaboratory Press[冷泉港实验室出版社]，1989，第16和17章。在一些情况下，通过使用杆状病毒表达系统表达重组多肽可能是所希望的。这样的杆状病毒表达系统的实例包括pVL衍生的载体(例如pVL1392、pVL1393和pVL941)、pAcUW衍生的载体(例如pAcUW1)和pBlueBac衍生的载体(例如含有β-gal的pBlueBac III)。
一旦已经产生分子，就可以通过本领域中已知的用于纯化蛋白、免疫球蛋白分子、或其他多聚体分子的任何方法，例如，使用技术，如色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱(特别是通过对于特定抗原蛋白A或蛋白G的亲和力色谱)、以及尺寸柱色谱(sizing columnchromatography))、离心、差别溶解度、或者通过用于纯化蛋白的任何其他标准技术将其纯化。此外，本文披露的分子可以与如常规用于促进纯化的异源多肽序列(例如，亲和标签)融合。
无论如何产生和纯化BiSAb，可以进行结合测定，例如双重ELISA测定(纯化之前和/或之后)，以确认BiSAb的功能性结合活性。此类结合测定在本领域通常是已知的。
D.药用配制品
在某些方面，本披露提供药物组合物。这类药物组合物可以是包含编码BiSAb的核酸分子的组合物。这类药物组合物还可以是包含DuetMab、BiSAb、DuetMab的组合、或BiSAb的组合、以及药学上可接受的赋形剂的组合物。在某些方面，将本披露的药物组合物用作药剂。
E.用途
如本文所讨论的，DuetMab和BiSAb可用于结合与可能对免疫疗法有应答的癌症和细胞增殖性疾病或障碍相关的靶标，例如，通过抑制免疫抑制活性和/或通过诱导与一个或多个靶标分子相关的免疫应答。例如，异常信号传导和/或抑制的免疫应答可能导致不需要的细胞增殖和癌症。因此，DuetMab、BiSAb和本文披露的抗体可用于治疗与靶向癌症的受抑制的、减少的、或不足的免疫应答相关的不需要的细胞增殖和/或癌症。特别地，肿瘤的肿瘤生长曲线和/或肿瘤的体积可以通过给予诱导和/或刺激受试者(例如，患有癌症的人类患者)中的免疫应答的BiSAb的DuetMab来降低。
因此，本披露还涉及各种包含将本文披露的结合蛋白给予对其有需要的受试者的方法。在一个方面，本披露涉及用于在患有癌症或有发展癌症风险的受试者中诱导免疫应答的方法，该方法包括向该受试者给予本文披露的结合蛋白。在一些实施例中，该方法活化对抗受试者中的癌症的免疫应答。在一些实施例中，该方法增强对抗受试者中的癌症的免疫应答。在一些实施例中，该方法活化在该受试者中被抑制的免疫应答途径，其中该活化增加靶标该受试者中的癌症的免疫应答。在一些实施例中，该方法增强靶标该受试者中的癌症的免疫应答途径。
在另一个方面，本披露涉及在对其有需要的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向该受试者给予本文披露的结合蛋白。在一个实施例中，治疗癌症的方法包括停止或减缓该受试者中癌症的生长。在一个实施例中，治疗癌症的方法包括停止或减缓该受试者中的癌症转移至其他区域。在一个实施例中，治疗癌症的方法包括杀死该受试者中的癌细胞。在一个实施例中，治疗癌症的方法包括停止该受试者中癌细胞的增殖和/或扩散。
在以上方面的不同实施例中，这些方法涉及治疗受试者的肿瘤疾病和/或癌症疾病。在实施例中，该癌症选自对该受试者中诱导的免疫应答敏感的癌症组。在一些实施例中，该癌症是卵巢癌、乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、膀胱癌、头颈癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾细胞癌、或肺癌中的一种或多种。在一些实施例中，该癌症选自消化道或胃肠道癌症(例如，肛门癌；胆管癌；肝外胆道癌；阑尾癌；类癌瘤，胃肠癌；结肠癌；结肠直肠癌，包括儿童结肠直肠癌；食道癌，包括儿童食道癌；胆囊癌；胃癌，包括儿童胃癌；肝细胞癌(hepatocellular cancer)(例如，肝细胞癌(hepatocellular carcinoma))，包括成人(原发性)肝细胞癌和儿童肝细胞癌；胰腺癌，包括儿童胰腺癌；肉瘤，横纹肌肉瘤；胰岛细胞胰腺癌；直肠癌；和小肠癌)；肺癌(例如，非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC))；头颈癌(例如，唇及口腔癌；口腔癌，包括儿童口腔癌；下咽癌；喉癌，包括儿童喉癌；具隐匿性原发灶的转移性鳞状颈癌；口癌；鼻腔和鼻窦癌；鼻咽癌，包括儿童鼻咽癌；口咽癌；甲状旁腺癌；鼻咽癌；唾液腺癌，包括儿童唾液腺癌；咽喉癌；和甲状腺癌)；卵巢癌和乳腺癌。
在上述方法中，给予该受试者的结合蛋白的量有效诱导免疫应答、增加免疫应答、停止或减缓癌症的生长、停止或减缓癌症的转移、杀死癌细胞、和/或减缓或阻止癌细胞在该受试者中增殖和/或扩散。
在上述方法的实施例中，该结合蛋白包含如本文披露的DuetmAb或BiSAb。在上述方法的一些实施例中，该结合蛋白包含如本文披露的抗体或其抗原结合片段。
如本文所用，术语“受试者”旨在包括人类和非人类动物，具体地哺乳动物。受试者的实例包括人类受试者，例如具有障碍(例如，本文描述的障碍，如癌症)的人类患者或者正常受试者。“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如非哺乳动物(例如鸡、两栖动物、爬行动物)和哺乳动物(例如非人类灵长动物)，驯化的和/或农业上有用的动物(例如绵羊、狗、猫、母牛、猪等)，以及啮齿动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等)。在具体实施例中，该受试者是人类患者。
“治疗(treatment或treat)”是指治疗性治疗和防止性(prophylactic或preventative)措施两者。对治疗有需要的那些受试者包括已经患有障碍的那些连同易于患有障碍的那些或者其中障碍有待预防的那些。当关于疾病或需要治疗的受试者使用时，术语相应地包括但不限于与未治疗的受试者相比，疾病进展的停止或减缓、疾病的缓解、症状的预防、疾病和/或症状严重程度的减轻、或疾病长度的减少。在实施例中，治疗方法可以减轻正在治疗的特定疾病的一个或多个临床指征。
提供以下实施例以阐明上面提供的本披露的特定方面和实施例，并且不应该被解释为限制说明书的范围或所附要求保护的主题。
实例
材料与方法
免疫应答调节测定
巨细胞病毒(CMV)抗原回忆测定用于评价由本文所述的某些免疫治疗分子诱导的潜在免疫应答。该测定的试剂包括：
-CMV反应性冷冻外周血单核细胞(PBMC)；
-AIM培养基(生命技术公司(Life Technologies)，目录号12055-091)；
-磷酸盐缓冲盐水(PBS，生命技术公司(Life Technologies)，目录号20012-043)；
-CMVpp65肽池，(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec)，目录号130-093-438，50μg/ml)；
-卵白蛋白，(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)目录号77120，1mg/ml)；
-Costar，无TC处理的96孔板(科宁公司(Corning)，目录号3788)；和
-免疫治疗分子。
一般测定方案：
在进行测定前一天，将冷冻的PBMC在温热的AIM V培养基中解冻。在科斯塔公司(Costar)96圆孔板中洗涤细胞两次。将细胞浓度调节至1×106个细胞/mL的浓度。
将等分试样(100μL)的细胞分配到单独孔中，使得板的外部柱和各行留空。允许这些细胞静止过夜。
第二天，向这些孔中添加100μL的含有2X PepTivator CMV肽池(0.1μg/ml-0.05μg/ml终浓度)和2X免疫治疗分子的AIMV培养基。
72小时后，将来自每个孔的25μL上清液转移至预封闭和洗涤的MSD板(抗人类IFNγ)。添加标准品后，将板在室温孵育2小时。孵育期后，将MSD板洗涤三次。洗涤后，添加25μLSULFO-TAG检测抗体，并允许在室温反应1小时。再次洗涤板，并在提取读数之前添加150μL2X MSD读取缓冲液。
葡萄球菌肠毒素A/B(SEA/SEB)测定方案
用于SEB或SEA测定方案以确定DuetMab或BiSAb对IL-2免疫应答的影响的试剂包括：
-白细胞锥(NHSBT代码NC24；来自阿登布鲁克斯医院(Addenbrookes Hospital))；
-50ml Falcon试管(BD 352070)；
-菲可帕克加(Ficoll-Paque PLUS)(GE医疗集团(GE Healthcare)17-1440-02)；
-抗CD3(克隆OKT3；1mg/ml；e生物科学公司(eBioscience)；目录号：16-0037-85)；
-氯化铵溶液(干细胞技术公司(Stemcell Technologies)07850)；
-葡萄球菌肠毒素A(SEA；Sigma(西格玛公司)，S-9399)或葡萄球菌肠毒素B(SEB；Sigma(西格玛公司)，S-4881)储备溶液，1mg/ml，储存于-20℃；
-培养基(均来自生命科技公司(Life Technologies))：具有glutamax的RPMI1640(61870)，补充有10％v/v热灭活的FCS(90005M)和100U/ml青霉素+100μg/ml链霉素(15140-122)；
-V型底板(格雷纳生物公司(Greiner BioOne)651201)；
-96孔平底板(康宁科斯塔公司(Corning Costar)7107)。
用于IL-2 DELFIA ELISA的试剂包括：
-FLUONUNC Maxisorp ELISA板(能肯公司(Nunc)437958)；
-铕标记的链霉亲和素，SA-Eu(珀金埃尔默(Perkin-Elmer)1244-360)；
-测定缓冲液(珀金埃尔默(Perkin-Elmer)，#4002-0010)；
-增强溶液(珀金埃尔默(Perkin-Elmer)4001-0010)；在使用前在室温下；
-测定稀释剂：DELFIA洗涤缓冲液(0.05％吐温-20，20mM Tris，150mM NaCl，pH 7.2-7.4)，补充有0.1％BSA，经无菌过滤；
-奶粉(Marvel；第一食品公司(Premier Foods))；
-样品稀释剂(如上所述的RPMI1640+10％FCS+1％青霉素/链霉素)；
-PBS(赛默飞世尔公司(ThermoFisher)14190235)；
-PBS-吐温(PBS中0.01％吐温-20)；
-人类IL-2 ELISA试剂盒(Duoset DY202，R&D系统公司(R&D Systems))；
-具有自动板加载器(Biostack)的Biotek洗板器(EL406)。
一般测定方案
使用密度梯度离心(菲可帕克加(Ficoll-Paque PLUS)；GE医疗集团(GEHealthcare))从人类血液白细胞锥(NHS血液与移植服务代码NC24)分离PBMC，然后在氯化铵溶液(干细胞技术公司(Stemcell Technologies))中裂解红细胞。将抗人类CD3(PBS中0.5μg/ml的克隆OKT3；e生物科学公司(eBioscience))在平底96孔板(康宁科斯塔公司(Corning Costar)7107)中于37℃包被2小时。然后，每孔添加在培养基(补充有10％v/v热灭活的牛血清和100U/100μg/ml链霉素/青霉素(分别地)的RPMI1640-Glutamax，生命科技公司(Life Technologies))中的PBMC的0.2×106个细胞。通过添加0.0088μg/mL-0.1μg/mL范围内的葡萄球菌肠毒素A或B(SEB；西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))进一步刺激PBMC，并将候选DuetMab或BiSAb添加至最终测试浓度。在37℃和5％CO2培养3天后，从细胞和根据制造商的说明书(R&D系统公司(R&D Systems)Duoset产品代码DY202)使用商业ELISA确定的IL-2分泌中去除上清液。参见图90。
混合白细胞反应(MLR)测定方案(新鲜血液)
基于MLR细胞的测定还用于提供应答于本文披露的DuetMab和BiSAb的T细胞功能的体外相关性。用于从新鲜血液样品中进行MLR测定的试剂包括：
-8mL CPT肝素试管；
-AIM-V培养基(无血清)Gibco#12055-091，无添加剂；
-50ml锥形试管；
-2ml低温保存小瓶；
-ACK裂解缓冲液(Gibco#A10492-01)；
-96孔组织培养处理的U型底板BD falcon#3077；
-PHA(罗氏公司(Roche)1mg/ml(10μg/mL终浓度)，作为阳性对照。
一般测定方案
从抽取到CPT肝素试管中的血液样品制备PBMC。将试管在2700rpm下离心20min，而不在25℃下制动。吸出顶层血清。轻轻吸移剩余的材料，并且收集CPT试管塞上方的所有物质并置于50ml锥形试管中。向细胞中添加AIM-V培养基以洗涤细胞(在1500rpm下3次，制动开启，在25℃持续5分钟)。使用红细胞裂解缓冲液裂解任何剩余的红细胞(例如，约5min，用约3ml缓冲液)。将剩余的细胞用AIM-V培养基洗涤两次(1500rpm，制动开启，在25℃持续5分钟)。如果需要，将沉淀物合并到单试管中并重悬于AIM-V培养基中，并进行细胞计数。
为了进行MLR测定，将细胞在AIM-V培养基中以每孔每个供体200,000个细胞接种于96孔板中，每个供体50μl(总共400,000/100μl)。向稀释于无血清AIM-V培养基中的每孔添加(4x)50μl候选分子。72小时后，对平板成像，并去除30μl上清液用于人类TH1/TH2(MSD)细胞因子测定。
人类TH1/TH2 MSD 10-丛方案
该测定用于确定存在于应答于本文披露的DuetMab和BiSAb的给予的培养物上清液中的细胞因子的量。为了进行测定，通过将200mg阻断剂B溶解在每个板的20ml PBS中来制备阻断剂。向每个孔中添加150μl溶解的阻断剂。将板密封并在室温振荡2小时或在4℃振荡过夜。用PBST缓冲液洗涤孔3x。通过将冷冻的校准物共混物(10μl)稀释到1ml的稀释剂中来制备校准物，并进一步连续稀释4倍。向分离的孔中添加25μl校准物(标准品)和25μl样品。将孔在室温伴随振荡孵育2小时。孵育后，将孔用PBST洗涤3x。
制备检测抗体并稀释至必要的浓度，并将其添加至每个孔中。在室温伴随振荡孵育2小时后，将孔在PBST中洗涤(3x)。在MSD机器上读数之前，向每个孔中添加读取缓冲液。
肿瘤特异性杀伤测定方案
具有对抗人类gp100209-217肽的反应性的人类CD8+T细胞系(JR6C12)由StevenRosenberg博士(国家癌症研究所(National Cancer Institute)，贝塞斯达，马里兰州)友情提供。将JR6C12细胞与CFSE(CellTrace CFSE增殖试剂盒，赛默飞世尔公司(ThermoFisher))标记的人类黑色素瘤系(Mel624)在37℃，在96孔平底板中以1:1的比率(20,000JR6C12+20,000Mel624)共培养18小时。在共培养的时间0时以69nM的浓度添加候选分子。18小时后，通过明视野显微镜观察这些孔。收集上清液用于MSD分析，并且在活力染色(Zombie UV可固定活力试剂盒，生物传奇公司(Biolegend))之前用胰蛋白酶消化粘附细胞并在PBS中洗涤(2x)。通过LSRFortessa(BD)上的流式细胞术评估CFSE标记细胞的活力染料摄取。
实例1.鉴定用于结合结构域附接的候选Fc位置
使用开源软件PyMOL分子可视化系统，在CH2和CH3区以及CH2-CH3界面处或附近研究抗体结构，以鉴定用于结合结构域附接的候选区，例如暴露的表面环。这些区可允许插入第二结合结构域(例如，scFv)而不损害IgG或第二结合结构域本身的结构完整性或稳定性。根据分析，鉴定了三个区(在图1A-1C中表示为球体)。图1D、1E、和1F描绘了结合蛋白的实施例，显示了分别在图1A、1B、和1C中鉴定的每个环中第二结合结构域的附接(为了阐明的目的具有scFv)。
图2A提供了在CH2-CH3界面附近的CH2区中鉴定的并且包含序列ISRTP(SEQ IDNO:39)的鉴定的代表性环之一的氨基酸序列的更详细的示意图。可以在该氨基酸序列内插入结合结构域以产生任何数量的代表性构建体，例如插入如实例中所阐明的scFv结构域(例如，I-scFv-SRTP、IS-scFv-RTP、ISR-scFv-TP、或ISRT-scFv-P scFV-ISRTP、和ISRTP-scFV，其中“-scFv-”鉴定该结合结构域可能与之缔合的天然环序列中的点。图2B是类似的示意图，其代表在CH2-CH3界面中鉴定的并且包含氨基酸序列AKGQP(SEQ ID NO:40)的环。本文描述的代表性构建体可包括与本文所述的该环序列附接的结合结构域(例如，scFv结构域)，包括A-scFv-KGQP、AK-scFv-GQP、AKG-scFv-QP、AKGQ-scFv-P、scFV-AKGQ、AKGQ-scFV，其中“-scFv-”鉴定该结合结构域可能与之缔合的天然环序列中的点。图2C提供了在CH3区内在CH2-CH3界面下游鉴定的并包含氨基酸序列SNG的代表性环的示意图。根据上述其他两个环区的说明性实施例所讨论的，该环序列的代表性构建体包括scFV-SNG、S-scFv-NG SN-scFv-G和SNG-scFV。
实例2.产生和表征一系列亲本抗体和双特异性结合蛋白(包括结合单位的组合)
开发并表征一系列单克隆抗体。使用衍生自这些“亲本”抗体的抗原结合序列(例如，CDR、HCv、LCv、HC、LC)的组合，产生一系列双特异性结合蛋白，并显示出对组合的靶抗原具有双特异性结合活性。设计双特异性结合蛋白以具有在本文中披露的特定结构平台基序(即“BiS5”)。
亲本抗体序列描述于下表中：
表2a.亲本抗体序列
PD-1
CTLA-4
PD-L1
TIM3
OX40
表2b.抗原序列
实例2(a)PD-1/CTLA-4双特异性结合蛋白
不被理论所束缚，对于PD-1和CTLA-4阻断的组合具有充足的临床和临床前基本原理。因此，希望最大化PD-1和CTLA-4组合的风险/效益比率(图4)。
使用以上表2中鉴定的亲本序列产生以下结合PD-1和CTLA-4的双特异性结合蛋白。用下文鉴定的序列产生鉴定为Bis2、Bis3、和Bis5的蛋白，并使用如下所讨论的Octet结合测定评估并行抗原结合活性。
表3.用于PD-1/CTLA-4的BiS构建体
Octet结合测定(BiS2、BiS3、和BiS5)
为了评价本文披露的双特异性结合分子的结合，使用配备有Ni-NTA生物传感器尖端和10X动力学缓冲液的Octet QK(ForteBio公司，门洛帕克(Menlo Park)，加利福尼亚州)。对于该特定系列的双特异性结合蛋白，His标记的PD-L1-Fc、his标记的PD-1-Fc和CTLA-4-Fc(人类重组蛋白)购自R&D系统公司(R&D Systems)(明尼阿波利斯，明尼苏达州)。所有结合测定均在25℃进行。
在分析之前，以1000rpm搅拌样品板。将Ni-NTA生物传感器尖端在1X动力学缓冲液中预湿润5分钟。该1X动力学缓冲液也用作基线确定的运行缓冲液以及抗原和双特异性抗体的稀释缓冲液。将Ni-NTA生物传感器尖端浸入100nM his标记的PD-L1-Fc(参见下文(b))或his标记的PD-1-Fc中用于抗原捕获，持续约1分钟。将抗原包被的生物传感器尖端各自浸入10μg/ml双特异性抗体中约5分钟，并且然后移入含有100nM CTLA-4-Fc抗原的孔柱中持续2分钟。结合结果示于图3中。
使用以上表2中鉴定的亲本序列产生呈DuetMab形式的结合PD-1和CTLA-4的双特异性结合蛋白。用下表4中的序列产生PD-1/CTLA-4 DuetMab，并如下所讨论的进行评估，包括与PD-1/CTLA-4 Bis5比较。
表4.用于PD-1/CTLA-4的DuetMab构建体
Octet结合测定(DuetMab)
通过Octet分析对两种不同的抗原进行并行结合研究。将生物素化的人类PD-1加载到链霉亲和素传感器上，然后按顺序首先与DuetMab PD-1/CTLA-4相互作用，并且然后与可溶的CTLA-4抗原相互作用。将链霉亲和素(SA)生物传感器(ForteBio)用于在PBS pH7.2、3mg/ml BSA、0.05％(v/v)吐温20(测定缓冲液)中以5μg/ml捕获生物素化的人类PD-1。在洗涤步骤之后，使加载的生物传感器首先与携带133nM的DuetMab PD-1/CTLA-4双特异性抗体的样品孔，并且然后与携带200nM的人类CTLA-4抗原的孔进行连续的缔合和解离相互作用。结合结果示于图5中。
还经由BiaCore评估PD-1/CTLA-4 DuetMab双特异性抗体的内在动力学。使用BIAcore T200仪器(BIAcore)进行结合实验。为了捕获抗体，将小鼠抗huIgG-Fab固定在CM5芯片上至靶标应答为2000RU。使100nM的DuetMab或mAb以20μL/min流动5min以获得大约100个应答单位的捕获抗体。然后以50μl/min的流速连续注射抗原5min。使用BIAevaluation4.1软件从非线性拟合计算动力学参数(kon和koff)和解离常数(KD)。结合结果示于表5中。
表5.PD-1/CTLA-4的BiaCore数据
报告基因测定
来自报告基因测定的结果显示了PD-1/CTLA-4双特异性结合蛋白抑制PD-1和CTLA-4途径(图6A-D)。与亲本相比，BiS5结合蛋白保留了PD-1效力，但与抗CTLA-4 IgG相比效力降低约3倍。DuetMab抗体的PD-1效力降低约9倍，并且CTLA-4效力降低约16倍(与IgG4P相比)。本领域需要具有降低的CTLA-4靶标作用但保留功能活性的分子(例如，如下文SEB测定中示出的)。因此，PD-1/CTLA-4双特异性结合蛋白具有为患者提供安全益处的潜力。
葡萄球菌肠毒素B(SEB)测定
来自SEB测定的结果显示了DuetMab和BiS5Ab在SEB初级免疫细胞测定中具有等效的活性(图7)，并且与DummyDuet对照组相比，DuetMab显示了更高的活性(图8A)。DuetMab显示了与亲本分子的组合大约等效的活性，并且与LO115或CTLA-4抗体MEDI1123(曲美木单抗)相比，具有更高的活性(图8B)。最后，与新的同种型对照的组合相比，BiS5和DuetMab显示了更高的活性(图9A-B)。从两个独立的实验的四个供体获得数据，并且这些特定测定需要使用IFNγ。
混合白细胞反应(MLR)测定
进行MLR测定以测试PD-1/CTLA-4双特异性分子。PD-1/CTLA-4 DuetMab和BiS5Ab在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中具有等效的活性(图10A-C)。与DummyDuet/同种型对照组的组合相比，PD-1/CTLA-4 DuetMab具有更高的活性(图11A-D)。与亲本抗体对照的组合相比，PD-1/CTLA-4 DuetMab具有大约等效的活性(图12A-D)。最后，与竞争者PD-1/CTLA-4组合相比，PD-1/CTLA-4 DuetMab具有大约等效的活性，并且比单独的抗PD-1(例如，派姆单抗(pembrolizumab)和纳武单抗(nivolumab))具有更高的活性(图13A-D)。
药代动力学和药效学(PK/PD)研究
进行了一项研究以检查食蟹猴中的单剂量药代动力学/药效学(PK/PD)。研究设计示出于图14中。DuetMab在食蟹猴中显示了明显的药效学(PD)，并且观察到两种分子的稳健的PD应答(图15A-B)。因此，证实了PD-1/CTLA-4双特异性结合蛋白在体内环境中的活力。
T细胞依赖性抗体应答(TDAR)
用指定剂量(0.5mg/kg、5mg/kg、50mg/kg)的DuetMab或BiS5双特异性分子静脉内给药(隐静脉或头静脉)食蟹猴。在无菌条件下用适量的无菌水注射来重建钥孔虫戚血兰素(KLH)蛋白。在两种情况下(第1天和第29天)在每个动物的背部皮下给予低剂量KLH溶液。从所有动物获得用于进一步分析的血液样品。进行KLH特异性IgM和IgG抗体滴度的评估。使用ELISA检测猴血清中的抗KLH抗体。
在给药PD-1/CTLA-4 DuetMab(图16A)和PD-1/CTLA-4 BiS5Ab(图16B)的食蟹猴中看到T细胞依赖性抗体应答(TDAR)。
表达不同水平的人类PD-1和/或CTLA-4的CHO细胞
使用表达不同水平的人类PD-1和/或CTLA-4的稳定的CHO细胞来开发模型系统以研究PD-1/CTLA-4双特异性分子(图17)。使用荧光标记的可溶的PD-1和CTLA-4蛋白通过流式细胞术检测细胞结合的DuetMab上的游离抗原结合臂。该测定结果显示了PD-1/CTLA-4DuetMab在相同细胞表面并行结合PD-1和CTLA-4(图18A-C)。
CTLA-4被连续内吞到网格蛋白包被的小窝中，导致在任何给定时间只有一小部分受体在细胞表面表达。细胞-表面CTLA-4的再循环是快速的，其中超过80％的表面CTLA-4在5分钟内被内化。因此，进行了一项实验来解决在表达过量PD-1的细胞上的CTLA-4饱和时，协同结合是否区分PD-1/CTLA-4 DuetMab与抗PD-1和抗CTLA-4抗体的组合(图19A-C)。使用标记的抗PD-1和抗CTLA-4 mAb独立地确定每种靶标抗原的受体占有率。
发现亲本单克隆抗体结合并占有其靶标受体而对非靶标受体没有重大影响(图20A-D)。与单克隆抗体的组合相比，PD-1/CTLA-4 DuetMab以低约250倍的浓度使表达过量PD-1的CHO细胞上的CTLA-4饱和(图21A-D)。与仅表达CTLA-4的细胞相比，PD-1/CTLA-4DuetMab以低约500倍的浓度使表达过量PD-1的CHO细胞上的CTLA-4饱和(图22A-F)。PD-1/CTLA-4 DuetMab优先地顺式结合相同细胞表面上的PD-1和CTLA-4，如通过定量总预混合的CHO群内的双峰形成所确定的(图23A-B)。然而，PD-1/CTLA-4 DuetMab也可以反式结合单表达细胞。PD-1/CTLA-4 DuetMab具有亲本抗CTLA-4抗体曲美木单抗的内化特性(图24A-D)。不被理论所束缚，该分子示出的作用具有诱导PD-1下调的潜力。在表达10倍过量PD-1的稳定CHO细胞中也看到PD-1/CTLA-4 DuetMab的内化特性(图25B)。
实例2(b)PD-L1/CTLA-4双特异性结合蛋白
使用以上表2中鉴定的亲本序列产生以下结合PD-L1和CTLA-4的双特异性结合蛋白。用下表6中的序列产生鉴定为Bis2、Bis3、和Bis5的蛋白，并使用如以上在部分2(a)中所述的Octet结合测定评估下文鉴定的序列的并行抗原结合活性(图26)。
表6.用于PD-L1/CTLA-4的BiS构建体
实例2(c)PD-1/TIM3双特异性结合蛋白
使用以上表2中鉴定的亲本序列产生以下结合PD-1和TIM3的双特异性结合蛋白(表7)。用以下鉴定的序列产生鉴定为Bis3、Bis5、和DuetMab的蛋白，并通过Octet分析评估并行结合研究。简言之，将链霉亲和素(SA)生物传感器(ForteBio)用于在PBS pH 7.2、3mg/ml BSA、0.05％(v/v)吐温20(测定缓冲液)中以2μg/ml捕获生物素化的人类TIM3-IgV结构域。在洗涤步骤之后，使加载的生物传感器首先与携带200nM的双特异性抗体的样品孔，然后与携带200nM的PD-1抗原的孔进行连续的缔合和解离相互作用。将生物素化的人类TIM3-IgV结构域加载到链霉亲和素传感器上，然后按顺序首先与双特异性分子相互作用，并且然后与PD-1抗原相互作用。结合结果示出于图27A-27B中。
表7.用于PD-1/TIM3的BiS构建体
肿瘤特异性杀伤活性测定
Rosenberg克隆黑色素瘤杀伤测定。
使用Rosenberg克隆：JR6C12和黑色素瘤细胞系：Mel324测试TIM3/PD-1双特异性结合分子和亲本TIM3抗体的一般细胞杀伤活性。
一般测定方案
JR6C12细胞作为效应子起作用，并且是从黑色素瘤患者扩增的并对gp100-黑色素瘤抗原具有特异性的人类CD8+T细胞系。为了评估治疗潜力，将Mel624肿瘤细胞荧光标记并与效应子(JR6C12)和结合TIM3和或PD-1的候选抗体一起添加。将细胞共培养16小时。图28A中的多个图提供了添加与抗PD1组合或作为PD-1/TIM3双特异性分子的TIM362(如表7中所述)增强T细胞活化和肿瘤杀伤的视觉表示。
此外，如图28B-28C示出的，PD-1/TIM3双特异性分子相对于抗TIM3、抗PD-1或同种型对照单一疗法展示出最大的肿瘤杀伤效力，如通过(b)肿瘤细胞活力染料摄取和(c)IFN-γ分泌评估的。
除了克隆62之外，使用上文表2中鉴定的亲本序列产生另一种呈DuetMab形式的结合PD-1和TIM3的双特异性结合蛋白。用下表8中的序列产生PD-1/TIM3 DuetMab。TIM3臂的序列获得自O13-1(其是克隆62的亲和力成熟变体)，并且抗PD-1臂的序列获得自LO115(其与用于上述PD-1/CTLA-4 DuetMab双特异性抗体的PD-1臂相同)。如下所讨论地评估PD-1(LO115)/TIM3(O13-1)双特异性抗体，包括与PD-1/TIM3 BiS3和BiS5比较。
表8.用于PD-1/TIM3的DuetMab构建体
Octet结合测定(DuetMab，TIM3臂亲和力成熟变体)
通过Octet分析对两种不同的抗原，PD-1和TIM3，进行并行结合研究。将生物素化的人类TIM3加载到链霉亲和素传感器上，然后按顺序首先与PD-1/TIM3 DuetMab相互作用，并且然后与可溶的PD-1抗原相互作用。将链霉亲和素(SA)生物传感器(ForteBio)用于在PBS pH 7.2、3mg/ml BSA、0.05％(v/v)吐温20(测定缓冲液)中以5μg/ml捕获生物素化的人类TIM3。在洗涤步骤之后，使加载的生物传感器首先与携带具有TIM3臂(O13-1)(其是以200nM加载的克隆62TIM3抗体的亲和力成熟变体)的DuetMab PD-1/CTLA-4双特异性抗体的样品孔，并且然后与携带200nM的人类PD-1抗原的孔进行连续的缔合和解离相互作用。结合结果示出于图29中。
还经由BiaCore评估PD-1/TIM3 DuetMab双特异性抗体的内在动力学。使用BIAcore T200仪器(BIAcore)进行结合实验。为了捕获抗体，将小鼠抗hulgG-Fab固定在CM5芯片上至靶标应答为2000RU。使100nM的DuetMab或mAb以20μL/min流动5min以获得大约100个应答单位的捕获抗体。然后以50μl/min的流速连续注射抗原5min。使用BIAevaluation4.1软件从非线性拟合计算动力学参数(kon和koff)和解离常数(KD)。结合结果示出于表9。
表9.PD-1/TIM3的BiaCore数据
PD-1/TIM3双特异性抗体(包括BiS3、BiS5、和DuetMab)与过表达人类TIM3或人类PD-1(图30和表25)的CHO细胞结合，PD-1和TIM3表达(DMF4)示出于图31中。
表25
CMVAg回忆测定
与同种型治疗相比，PD-1/TIM3双特异性抗体(包括BiS3、BiS5、和DuetMab)在CMV抗原回忆测定中增强CD8+T细胞增殖(图32A-C)。
混合白细胞反应(MLR)测定
PD-1/TIM3双特异性抗体(包括BiS3、BiS5、和DuetMab)在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中增强干扰素(IFNγ)分泌，其活性倾向高于单一和联合疗法(图33A-D)。PD-1/TIM3双特异性抗体(包括BiS3、BiS5、和DuetMab)在jurkat NFκB报告系中展示出与亲本LO115IgG1类似的活性，该报告系主要表达PD-1(87％PD-1单阳性)(图34A-C)。
总之，针对PD-1/TIM-3产生三种双特异性形式(DuetMab、Bis3、和Bis5)。所有双特异性形式显示了等效于或优于抗PD-1的体外功能性，表明这些分子可以为当前的免疫肿瘤学策略提供优越的优点。
实例2(d)OX40/PD-L1双特异性结合蛋白
使用以上表2中鉴定的亲本序列产生以下结合PD-L1和OX40的双特异性结合蛋白。用下表10中的序列产生鉴定为Bis2、Bis3、和Bis5的蛋白，并使用如下所讨论的Octet结合测定评估并行抗原结合活性。
表10.用于OX40/PD-L1的BiS构建体
Octet结合测定
为了评价本文披露的双特异性结合分子的结合，使用配备有Ni-NTA生物传感器尖端和10X动力学缓冲液的Octet QK(ForteBio公司，门洛帕克(Menlo Park)，加利福尼亚州)。对于该特定系列的双特异性结合蛋白，His标记的PD-L1-Fc、his标记的PD-1-Fc和hOX40-Fc(人类重组蛋白)购自R&D系统公司(R&D Systems)(明尼阿波利斯，明尼苏达州)。所有结合测定均在25℃进行。
在分析之前，以1000rpm搅拌样品板。将Ni-NTA生物传感器尖端在1X动力学缓冲液中预湿润5分钟。该1X动力学缓冲液也用作基线确定的运行缓冲液以及抗原和双特异性抗体的稀释缓冲液。将Ni-NTA生物传感器尖端浸入100nM his标记的PD-L1-Fc(参见下文(b))或his标记的PD-1-Fc中用于抗原捕获，持续约1分钟。将抗原包被的生物传感器尖端各自浸入10μg/ml双特异性抗体中约5分钟，然后移入含有100nM hOX40-Fc抗原的孔柱中2分钟。结合结果显示了BiS2/BiS3 OX40Ab/PD-L1分子与PD-L1-His和hOX40-Fc二者结合，并且BiS2OX40Ab/PD-L1以比BiS3 OX40Ab/PD-L1更大的亲和力结合。将BiS2 PD-1/OX40用作对照(图35)。
葡萄球菌肠毒素B(SEB)测定
使用上述方案的SEB测定显示了OX40/PD-L1双特异性分子在呈BiS2和BiS3形式时均有活性(图36A-B)。
PD-L1报告物测定
材料：
-细胞系和培养条件：
-人类PD-1 Jurkat NFAT荧光素酶克隆2报告物
-表达PD-L1的CHO scFv OKT3(UBC)(所有细胞在37℃在潮湿的组织培养孵育箱中维持在RPMI 1640培养基加10％FBS和1X pen/strep抗生素(RPMI完全培养基)中)。
-RPMI-1640，生命技术公司(LifeTechnologies)目录号A1049101
-热灭活的新生牛血清(FBS)，生命技术公司(LifeTechnologies)目录号26010074
-完全RPMI培养基：RPMI-1640加10％FBS
-100X青霉素/链霉素，生命技术公司(LifeTechnologies)目录号15140-122
-96孔TC处理的平底培养板，科斯塔公司(Costar)3903，VWR目录号29444-010
-SteadyGlo荧光素酶测定系统，普洛麦格公司(Promega)，目录号E2510
-测试抗体
-EnVision多标记读板器，珀金埃尔默公司(Perkin Elmer)
方法：
对于用于中和PD-L1抑制的2-细胞生物活性测定，用胰蛋白酶消化表达PD-L1的CHO scFv OKT3细胞、用温热的RPMI完全培养基中和、并收集在50mL锥形试管中。将细胞在室温以380g沉淀5min，并且然后悬浮在新鲜的RPMI完全培养基中并在Vi细胞计数器上计数。将表达PD-L1的CHO scFv OKT3细胞调节至0.4e6/mL，并将每孔25μL(10,000个细胞)铺板，如板布局示出的。使细胞粘附在板上3小时。此后，将50μL含有RPMI的测试试剂(2X最终浓度)等分到CHO细胞上并孵育另外1小时。该孵育给测试试剂时间以与CHO细胞表面上的PD-L1结合。在1小时时，将表达PD-1的Jurkat NFAT荧光素酶报告细胞收集在50mL锥形试管中，在室温以380g沉淀5min，并重悬于新鲜的温热的RPMI完全培养基中。将细胞调节至1.2e6/mL并将25μL(30,000)细胞铺板到具有表达PD-L1的CHO scFv OKT3细胞和测试品的孔中。
将细胞和测试试剂进一步孵育18小时以进行PD-1 Jurkat报告细胞活化。此后，制备SteadyGlo荧光素酶试剂并将100μL等分至每个孔。通过在室温轻轻振荡(200rpm定轨振荡器上)15min来实现完全裂解。裂解后，使用US96发光方案在Envision多标记读板器上测量荧光素酶活性。在Graphpad Prism软件中对荧光素酶RLU相对log[测试试剂]作图，并且使用非线性回归分析、S形剂量应答曲线的4-参数拟合确定PD-L1拮抗作用的EC50值。
结果：
使用起点为100nM的五点剂量滴定(PD-L1)，针对PD-L1/PD-1亲本和NIP228(G4P)对照测试OX40/PD-L1 BiS2/3。OX40-PD-L1 BisAb均示出具有活性并且具有比PD-L1(4736)亲本更强的激动作用(图37)。BiS2和BiS3形式以类似方式进行。
CMV Ag回忆测定
在CMV Ag回忆测定中(使用上述方案)，BiS2和BiS3分子展示出相对于组合的等效活性(图38)。
上面讨论的所有结合和免疫应答测定提供了说明性数据，显示了本文披露的双特异性结合分子展现出对两种靶标分子的特异性结合-在某些情况下比单独的单特异性亲本结合分子(抗体)的组合具有更高的结合活性，并且可以诱导或增强免疫应答。此外，显示了分子具有对抗癌细胞系的细胞杀伤活性。因此，数据显示了这些分子和双特异性平台结构代表了免疫肿瘤学治疗的优异候选者。
Octet结合测定(OX40(SLR PD-L1 BiS5))
为了评价本文披露的双特异性结合分子的结合，使用配备有Ni-NTA生物传感器尖端和10X动力学缓冲液的Octet QK(ForteBio公司，门洛帕克(Menlo Park)，加利福尼亚州)。对于该特定系列的双特异性结合蛋白，His标记的PD-L1-Fc、his标记的PD-1-Fc和hOX40-Fc(人类重组蛋白)购自R&D系统公司(R&D Systems)(明尼阿波利斯，明尼苏达州)。所有结合测定均在25℃进行。结合结果显示了BiS5 OX40Ab/PD-L1分子与PD-L1-His和hOX40-Fc二者结合(图39)。
PD-L1/OX40 BiS5与表达人类或食蟹猴OX40和PD-L1/B7H1的CHO细胞结合(图40A-F)。还通过流式细胞术(HyperCyt)测量PD-L1/OX40 BiS5构建体的结合(图42)。OX40 IgG4P和OX40/PD-L1双特异性物(bispecifics)结合Jurkat OX40报告细胞。PD-L1 IgG和OX40/PD-L1双特异性物结合NCI H358和CHOK1 B7H1(PD-L1)/OKT3细胞。所有IgG和双特异性物结合HEK CD32a细胞。
PD-L1和OX40报告物测定
在PD-L1报告物测定中(使用上述方案)，所有含有PD-L1scFv的双特异性物和阳性对照IgG都展示出活性(图42A-B)。单臂OX40对照和同种型对照在该测定中未展示出任何活性。EC50值和希尔(hill)斜率与在之前的针对抗PD-L1亲本对照和PD-L1Bis2、Bis3和Bis5构建体的测定中获得的值一致。
在使用HEK CD32a细胞的OX40报告物测定中，双特异性构建体彼此具有相等的活性，并且观察到Fc介导的激动作用(图43A-B)。OX40/PD-L1 Bis5 N434A IgG1对OX40 IgG4P和MEDI0562(OX40 IgG1)具有相等的EC50活性。
在使用过表达CHOK1 PD-L1的细胞的OX40报告基因测定中，OX40/PD-L1双特异性显示出相等的激动作用(图44A-B)。OX40/PD-L1 Bis5 N434A IgG1与测试的OX40/PD-L1Bis5双特异性Mab的其他Fc变体具有相等的EC50活性。未检测到使用OX40 IgG或PD-L1IgG的激动作用。因此，证明了PD-L1介导的OX40激动作用。
检测到使用OX40/PD-L1双特异性分子的PD-L1介导的使用肿瘤细胞的OX40激动作用(图45A-B)。OX40/PD-L1双特异性分子在该测定中显示了相等的激动作用-钟形曲线。没有观察到使用OX40 IgG的激动作用，因此证明了比起OX40 IgG加PD-L1 IgG组合使用双特异性物的益处。未看到使用NCI H358 PD-L1 KO细胞的激动作用(图46A-D)，显示了使用细胞看到的NCI H358激动作用是PD-L1特异性的。
葡萄球菌肠毒素B(SEB)测定
在SEB测定中，OX40/PD-L1双特异性分子比对OX40和PD-L1的单独抗体的组合具有更高的活性(图47A-D)。特别地，G4P构建体具有比G1构建体更高的活性。野生型、含有YTE的变体和N434A变体具有相等的活性。
Treg抑制测定
进行Treg抑制测定以测试OX40/PD-L1双特异性分子(图4A-D)。OX40/PD-L1双特异性分子仅在PD-L1存在下对CD4+Teff具有活性(图49和50)。不被理论所束缚，这表明OX40反式交联。OX40/PD-L1双特异性分子抑制Treg抑制作用，但仅在通过与板固定的PD-L1结合而交联时。
混合白细胞反应(MLR)测定
进行MLR测定以测试OX40/PD-L1双特异性分子(图51A-B)。OX40/PD-L1双特异性分子比针对OX40和PD-L1的单独抗体的组合具有更高的活性(图52A-E)。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)测定
进行ADCC测定以测试OX40/PD-L1双特异性分子。ADCC测定使用新鲜分离的NK细胞作为效应细胞以及分别过表达CHOK1 PD-L1 B7H1和CHOK1 OX40的细胞作为靶细胞，其中效应子与靶标(E:T)的比率为20:1。在5小时后使用从标记的靶标细胞释放的铕来分析靶标细胞裂解。在ADCC测定中，OX40/PD-L1 BiS2和BiS5介导对抗表达PD-L1或OX40的CHO细胞的ADCC(图53A-B和54)。
CD107a动员测定是使用新鲜分离的NK细胞作为效应细胞以及过表达PD-L1和OX40的CHO Kl作为靶细胞进行的，其中E:T的比率为10:1。4小时后通过流式细胞术分析CD107a向NK细胞的细胞表面的动员。BiS2和BiS5 OX40/PD-L1双特异性分子在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)中增加对抗表达PD-L1和OX40的CHO细胞的NK细胞的CD107a动员(图55)。BiS2和BiS5 OX40/PD-L1双特异性分子增加对抗活化的具有上调的OX40和PD-L1的同种异体T细胞的NK细胞的CD107a动员(图56)。BiS5 OX40/PD-L1增加来自两个不同的对抗活化的同种异体T细胞的供体的NK细胞的CD107a动员(图57A-B)。
药代动力学和药效学(PK/PD)研究
设计了一项研究来比较OX40/PD-L1双特异性分子的PK/PD(图58)。在食蟹猴中比较PD-L1/OX40双特异性分子的血清浓度时间曲线(图59和表11)。Bis5 OX40/PD-L1 IgG1N434A分子的平均T1/2大于WT Bis5分子；与WT Bis5分子相比，Bis5 OX40/PD-L1 IgG1N434A分子的清除率更低。两种分子以类似方式降低血清中的可溶PD-L1，并且引起Ki67+总记忆CD4+ T细胞、总记忆CD8+ T细胞和NK细胞的百分比的显著增加。
表11.BiS5-OX40/PD-L1-G1的药代动力学参数
OX40/PD-L1双特异性分子将血清可溶PD-L1浓度降低至低于测定LLOQ(图60)。N434A突变改进了BiS5-OX40/PD-L1-G1的药代动力学。特别地，CL减少了大约一半；T1/2和AUCinf相应增加2倍；并且Cmax和Vss没有受到影响。这与之前报道的该突变对单克隆抗体的PK的作用一致。因此，针对BiS5-OX40/PD-L1-G1 IO BisAb的mAb样PK取得了进展。BiS5-OX40/PD-L1-G1 BiSAb的血清浓度在2周时低于定量限制(BLOQ)，并且可能与ADA相关。
将PD-L1 OX40 Bis5组与对照(抗PcrV-Psl对照)Ab组相比，看到总记忆CD4、总记忆CD8、和NK细胞增殖(Ki67+细胞百分比)显著增加(图61A-F)。看到PD-1 LO115和PD-L1OX40Bis5组之间在总记忆CD4、总记忆CD8、和NK细胞增殖(Ki67+)上的显著差异的趋势。PD-L1 OX40 Bis5 N434A(半衰期扩展的)版本和G1版本之间在增殖上没有统计学上的显著差异。PD-L1 OX40 Bis5 N434A和IgG1版本是具有生物活性的双特异性分子。
实例2(e).OX40/PD-1双特异性结合蛋白
使用以上表2中鉴定的亲本序列产生以下结合PD-1和OX40的双特异性结合蛋白。用下表24中的序列产生鉴定为Bis2和Bis3的蛋白，并使用如下所述的Octet结合测定评估同时的抗原结合活性。
表24.用于OX40/PD-1的BiS构建体
PD-1/OX40 BiS2单克隆抗体(mAb)是双特异性抗体(图62；以灰色描绘的PD-1结合蛋白和以浅灰色描绘的OX40结合蛋白)，其被工程化以与人类和食蟹猴PD-1以及人类和食蟹猴OX40并行结合。不被理论所束缚，提出的作用机制表明在顺式结合OX40和PD-1二者之后对T细胞的双重信号传导作用，即T细胞共刺激表面受体OX40的激动作用和免疫抑制性PD-1的阻断(图63)。
Octet结合测定
显示了两个不同批号的PD-1(LO115)/OX40 BiS2 mAb与PD1-His和人类OX40-Fc的并行结合活性(图64)。
OX40报告物测定
PD-1(LO115)/OX40 BiS2 mAb显示了与其他OX40激动剂可比较的活性(图65A-B)。将蛋白储存在4℃并立即使用，冷冻/解冻三次，在4℃储存7天并在40℃储存7天。将活性报告为相对光单位对mAb浓度。在第0天，在4℃，PD1(LO115)/OX40 BiS2 mAb的EC50为约2nM。
PD-1/PD-L1报告物测定
PD-1(LO115)/OX40 BiS2 mAb显示了与其他PD-1激动剂可比较的活性(图66A-B)。将蛋白储存在4℃并立即使用，冷冻/解冻三次，在4℃储存7天并在40℃储存7天。将活性报告为相对光单位对mAb浓度。在第0天，在4℃，PD1(LO115)/OX40 BiS2 mAb的EC50为约1nM。已经进行了两组原代人类体外效力测定；使用葡萄球菌肠毒素B(SEB)的抗原-回忆T细胞测定和T细胞共刺激。
葡萄球菌肠毒素B(SEB)测定
在SEB测定中，PD-1(LO115)/OX40 BiS2 mAb在培养物中3天后诱导在细胞上清液中检测到的IL-2水平的增加(图67)。因此，PD-1/OX40 BiS2 mAb可以并行结合其人类靶标抗原并且可以在体外共刺激T细胞。
在抗原-回忆测定中，与亲本mAb和亲本mAb的组合相比，PD-1/OX40 BiS2 mAb促使干扰素(IFN)-γ的水平增加(图68和69)。
CMV Ag回忆测定
CMV Ag回忆测定的结果(使用上述方案)，BiS2和BiS3分子没有展示出相对于组合的相等活性(图70)。数据显示了PD-1/OX40 BiS2 IgG4P mAb在体外和体内均具有活性。PD-1/OX40 BiS3(其结构与PD1/OX40 BiS2不同)不具有可检测的活性。因此，PD-1/OX40 BiS3(无活性的)不同于BiS2(有活性的)。
药代动力学和药效学(PK/PD)研究
食蟹猴被考虑是药理学相关的非临床物种，用于测试PD-1/OX40 BiS2 mAb的功能活性。在食蟹猴的非GLP(良好实验室实践)研究中评估PD-1/OX40 BiS2 mAb的药代动力学(PK)和药效学(PD)。在剂量范围为0.1mg/kg至30mg/kg的单次静脉内(IV)给药后，在食蟹猴(n＝3；雄性)中评价PD-1(LO115)/OX40 BiS2 mAb PK和PD(Ki67阳性CD4+和CD8+总记忆T细胞百分比)。在给药前和给药后第1、8、11和15天收集PBMC，低温保存和解冻，然后通过流式细胞术分析。总之，PD1(LO115)/OX40 BiS2 mAb展示近似线性的PK，具有0.6-1.7天的短半衰期(图70；表12)。
表12.PD1(LO115)/OX40 BiS2 mAb的药代动力学参数平均值。
这些值表示为平均值(标准偏差)。AUClast＝浓度时间曲线(一直到最后一次可测量的浓度)下的面积；AUCINF＝浓度时间曲线(一直到无穷时间)下的面积；Cmax＝最大观察浓度；CL：系统清除率；T1/2＝半衰期；Vss：终末相分布体积；Vss：稳态分布体积。
平均峰浓度(C最大)近似地与剂量成比例增加，从以0.1mg/kg的2.0μg/mL到以30mg/kg的607μg/mL。AUC∞近似地与剂量成比例增加，从以0.1mg/kg的1.7μg天/mL到以30mg/kg的577μg天/mL。平均血清清除率范围为从41.8mL/天/kg至60.2mL/天/kg。稳态分布体积范围为从43.2mL/kg至85.6mL/kg。PD结果(图71)显示了CD4+总记忆T细胞增殖(Ki67)的剂量依赖性增加和CD8+总记忆T细胞增殖(Ki67)的增加。显示了用于定量食蟹猴血清中PD-1/OX40的代表性标准曲线(图72)。
实例3.BiSAb构建体的物理和化学稳定性
进行一系列实验以评价和评估如本文所述的BiSAb构建体相对于其他双特异性结合蛋白结构策略和平台的物理和化学稳定性。特别地，下面讨论的一系列稳定性研究鉴定和分析了各种pH范围对BiSAb稳定性(例如，水解、片段化、聚集、热稳定性)的影响。如数据所显示的，对于各种BiSAb形式的不同说明性实施例，本文披露的BiSAb(在下面的研究中被鉴定为“BiS5”，并且呈如表13中所示出的D/H形式)相对于所有其他BiSAb结构基序展现出意想不到的和令人惊讶的物理和化学稳定性。
表13.BiS5稳定性研究构建体
实例3.1
在本文披露的BiS形式(“BiS5”)和另一种BiS形式(其包括在铰链区处连接(即Fc和Fab区之间)的两个结合结构域(scFv结构域)，被鉴定为“BiS4”)之间进行进一步比较。BiS4和BiS5蛋白在中国仓鼠卵巢(CHO)中表达，并通过常规色谱方法纯化。如上所指出，这两种形式具有类似的Fab和scFv序列，它们之间的主要差异是scFv结构域的位置(对于BiS4，scFv位于铰链区；对于该特定BiS5，scFv位于CH3结构域中的SNG环中，如本文所讨论的)。将纯化的BiS分子在PBS缓冲液中提供，并使用NanoDrop ND-1000(赛默飞世尔公司(Thermo Scientific)，威尔明顿，特拉华州)使用1.54M-1cm-1的消光系数确定蛋白浓度。
pH筛选和短期稳定性研究
对于pH筛选研究，将BiS4和BiS5抗体浓缩至约12mg/mL并针对6种不同的pH条件、20mM琥珀酸钠(pH 5.0)、组氨酸/组氨酸HCl(pH 5.5、6.0、和6.5)、和磷酸钠(pH 7.0和7.5)(均含有240mM蔗糖)透析。通过使用Slide-A-Lyzer透析盒(10kDa分子量截留(MWCO)，赛默飞世尔公司(Thermo Scientific)，罗克福德，伊利诺伊州)进行透析。透析完成后，掺入0.02％聚山梨醇酯80，并将蛋白的最终浓度调节为约10mg/mL。使用0.22μm过滤器(密理博公司(Millipore)，比尔里卡，马萨诸塞州)在预消毒的层流洁净工作台中对BiS4和BiS5配制品进行灭菌。将1毫升等分试样分配到3mL的I型硼硅酸盐玻璃小瓶(西部药物服务公司(West Pharmaceutical Services)，艾克斯顿，宾夕法尼亚州)中。将样品储存在40℃并在时间零时并在储存1、2、3、和4周后通过SEC进行分析。
差示扫描量热法(DSC)
使用连接到温度调节的自动取样器(马尔文仪器有限公司(Malvern InstrumentsLtd.)，斯特伯鲁，马萨诸塞州)的VP-Capillary DSC获得时间零样品的差示扫描量热法热谱图。为了获得热谱图，在20℃-100℃的温度范围内使用1mg/mL的蛋白浓度以及90℃/h的扫描速率。从在范围为从5.0至7.5的不同pH条件下的BiS4和BiS5的热谱图中减去缓冲液并进行基线校正。使用Origin 7SR4软件包的DSC插件进行数据分析。将实验结果拟合到具有三个转变的多态模型以计算熔化温度(Tm)值。将第一次热转变的热容量(Cp)值达到500calmol-1℃-1的点视为起始温度(T起始)。
高效尺寸排阻色谱(HP-SEC)
为了基于尺寸从单体中分离聚集体和片段种类，使用安捷伦(Agilent)高效液相色谱系统分析稳定性样品，该系统具有能够记录200nm-400nm紫外吸收度光谱的光电二极管阵列检测器，该检测器具有7.8×30cm2、5μm、Tosho TSKgel G3000SWxl(东曹生物科学公司(TOSOH Biosciences)，普鲁士王，宾夕法尼亚州)和相应的保护柱。为了分离这些种类，使用含有0.1M无水磷酸氢二钠、0.1M硫酸钠、0.01％叠氮化钠的流动相，pH 6.8和1mLmin-1的流速。注射的蛋白量约为250μg。使用280nm的吸收度光谱监测BiS4和BiS5的分离。定量可溶的聚集体(多聚体和二聚体)、单体、和片段的峰面积。然后，计算每个种类的百分比并针对孵育时间绘图以制作动力学图。通过计算每个动力学图的斜率来建立每月单体损失、片段化和聚集的pH曲线。
BiS4和BiS5的热稳定性
通过分析通过使用毛细管DSC获得的热谱图评价pH对BiS4和BiS5的热稳定性的影响，并且该影响在六种不同的pH条件下产生。图74A和74B分别显示了从pH 5.0到7.5的BiS4和BiS5的DSC热谱图的叠加。如图73示出的，每个热谱图显示了具有转变温度Tm1、Tm2、和Tm3的三个热解折叠事件。第一个转变(Tm1)可能与CH2和scFv结构域的同时解折叠相关，而第二个(Tm2)和第三个(Tm3)转变与CH3和Fab结构域的解折叠相关。对于这两种形式，观察到随着pH增加至6.5，T起始、Tm1、Tm2和Tm3增加(图73A、73B、73E和下表14)。对于BiS4和BiS5，在所有pH条件下T起始、Tm2、和Tm3均未观察到差异(图73E和表15)，这表明在铰链区或CH3结构域中scFv的存在不影响CH3和Fab的热稳定性。有趣的是，在所有pH条件下观察到BiS5的Tm1略微增加，这表明当scFv位于CH3结构域中时scFv、CH2、或两者的热稳定性增加。
表14：通过毛细管DSC测量的pH对BiS4和BiS5的热起始温度(T起始)和热熔化温度(Tm1、Tm2、和Tm3)的影响。
BiS4和BiS5的物理和化学稳定性
在40℃评价BiS4和BiS5形式在不同pH值(范围从5.0至7.5)下的物理和化学稳定性，持续长达4周。将在“时间零”时的HP-SEC色谱图用于比较其他时间点的HP-SEC色谱图的总面积、单体、聚集体、和片段含量。与4周相比，pH 7.5、时间零时的BiS4和BiS5的代表性色谱图示出于
图74A.所有样品主要含有具有低水平可溶聚集体和有或没有片段的单体。在时间零(实线)，大部分样品是单体，没有其他显著差异，除了两个样品之间的峰高度的小差异可能是由于浓度的略微差异(图74A)。虚线显示了在40℃储存4周后，在相同pH条件下两种形式的HP-SEC色谱图的叠加。在加速温度应激条件下，两种形式都显示出另外的峰、早期洗脱峰(多聚体种类)、单体减少、和片段水平升高(图74A)。与BiS5相比，由于片段化导致的单体损失在BiS4中更突出，表明BiS5在化学上更稳定。根据它们的结构、可能的片段化位点、和保留时间，我们推测小片段峰(RT约10.8min)是Fab，以及大片段峰(RT约9.8min)和肩峰(RT约8.7min)是具有scFv的Fab及其相应的分别具有Fab、scFv、和Fc的较高分子量片段(HMWF)。
为了更好地评价scFv位置对BiS4和BiS5的物理和化学稳定性的影响，将每个种类的总面积百分比针对时间零和4周、在40℃、针对pH 7.5绘制成条形图(图74B)。如图74B所示，在时间零，BiS4和BiS5的单体纯度类似。在40℃孵育长达4周的样品显示了形成的片段的类型和程度的显著差异。对于BiS4样品，分别形成11.8％、7.2％、和3.5％的肩峰(RT约8.7min)、大片段(RT约9.8min)和小片段(RT约10.8min)(图74B)。令人惊讶的是，BiS5样品仅显示了1.4％的小片段(RT约10.8min)，这可能是由于将scFv从结构域两侧束缚至Fc(图89)。
图75A-75C显示了在40℃孵育pH 7.5样品时BiS4和BiS5的聚集、片段化和单体损失的动力学。与BiS5相比，BiS4样品显示了更快速的单体损失速率(图75A)。在pH 7.5，BiS4和BiS5的单体损失速率分别为27.4％/月和4.5％/月(图75A)。对于BiS4，大部分单体损失是由于23.9％/月的片段化和在较小程度上是由于3.5％/月的聚集(图75B和75C)。有趣的是，对于BiS5，与片段化速率(1.7％/月)相比，聚集速率似乎略高(2.8％/月)(图75B-75C)。
通过将以下值针对6个pH条件作图来进行pH对BiS4和BiS5形式的物理和化学稳定性，每月单体损失、片段化和聚集的速率的影响的进一步分析(图76A-76C)。贯穿pH范围为5.0-7.5的所有六个pH条件，与BiS4相比，BiS5形式的单体损失速率更低(图76A)，这表明本文披露的BiS5形式具有意想不到的优越于其他双特异性蛋白形式的物理和化学稳定性。对于BiS4，大多数单体降解是由于即使在较低pH条件下也会片段化(图76B)。在所有测试的pH条件下，BiS5与BiS4相比显示了更低的片段化速率。令人惊讶的是，与BiS4相比，BiS5中的片段化速率似乎不变且在更广泛pH范围内变低。不被任何特定理论所束缚，可能是BiS5中观察到的较低片段化速率可能由在将其连接至Fc的scFv的任一末端上的G4S接头引起。连接到Fc的G4S接头之一上的片段化可能不会释放scFv，因为它可能仍然经由另一个G4S接头与Fc连接。在BiS4和BiS5中，贯穿所有测试的pH条件，聚集速率似乎类似(图76C)，表明scFv的位置对聚集动力学的作用最小，这也得到以下事实的支持：没有观察到如使用毛细管DSC测量的在所有pH条件下两种形式之间的T起始发生变化(图73E和表14，如上所讨论)。在pH7.5和40℃(时间＝0)时，两种分子均未展现出可感知的片段化(图77A)，但在相同条件下，在40℃储存2周后，观察到BiS4可感知的片段化和BiS5的最小片段化(图77B)。BiS4和BiS5在较低(5.5)pH下均具有减少的片段化和聚集，而BiS5在两种pH值下均具有更优异的片段化和聚集性能(图78)。该系列实验证明，本文披露的BiS5具有比BiS4更优异的化学稳定性和与其类似的物理稳定性。
实例3.2
进行另外的研究以评价在本文中披露的双特异性结合蛋白的不同实施例的物理和化学稳定性，并鉴定为构建体A-H(参见，例如，上表13和相关实例)。使用如下DSC、加速储存稳定性以及FcRn和FcgR结合测定分析这些构建体。
差示扫描量热分析
使用Microcal VP-DSC扫描微量热计(微量热公司(Microcal))进行该数据组的DSC实验。在装载到该热量计中之前，使用0.22μm过滤器过滤并脱气用于DSC的所有溶液和样品。用于DSC研究的抗体中>98％是单体的，如通过分析型SEC所确定的。在DSC分析之前，在25mM组氨酸HCl(pH 6.0)中彻底透析(至少3次缓冲液交换)所有样品。将来自这次透析的缓冲液用作参考缓冲液以用于随后的DSC实验。在样品测量之前，将基线测量值(缓冲液对缓冲液)从样品测量值中减去。将透析的样品(浓度为1mg/ml)添加至样品孔(sample well)中并且以1℃/min的扫描速率进行DSC测量。使用微量热公司所提供的OriginTMDSC软件进行数据分析和去卷积。使用非2状态模型进行去卷积分析并且使用100个迭代循环来获得最佳拟合。T起始定义为热谱图看起来具有非零斜率时的定性温度，Tm定义为一组中一半分子解折叠时的温度，并计算为对应于热谱图上每个峰最大值的温度值。
不同构建体的结果如图79所示。一般地，与包括LC10作为scFv的构建体E、G、H相比，包括2F4作为scFv的构建体A、C、D具有更低的TMI。不被理论所束缚，TMI值的差异可能是由于LC10scFv结构域相对于2F4可变结构域具有固有地更好的热稳定性。数据表明，具有2F4作为scFv的构建体A-D比具有LC10作为scFv的构建体E-H的热稳定性低。
加速存储稳定性分析
将构建体的浓度归一化至1mg/mL。将1mL每种双特异性构建体或IgG对照等分到1.5ml Eppendorf试管中。将样品在静态孵育箱中在45℃孵育2周。在第3天、第7天、和第14天分析样品并评估稳定性。在每个时间点，进行视觉检查以记录任何增加的浊度或沉淀。使用0.2μm旋转柱过滤样品，并将120μl样品等分到HPLC小瓶中，确保小瓶底部没有气泡。然后在安捷伦(Agilent)1100系列HPLC-SEC上测试样品以使用TSK-GEL G3000SWXL(300x7.8mm)东曹生物科技有限公司(Tosoh Bioscience)柱检测聚集和降解，该柱具有0.1M磷酸钠、0.1M硫酸钠(pH 6.8)作为运行缓冲液，注射60μL的样品并以1mL/min的流速运行。捕获单体保留时间(min)、总峰面积、单体％、聚集体％、片段％、单体损失％并用于分析型SEC分析。结果总结于表15中。
表15：加速的稳定性研究。
如本文所述，scFv结构域在上述构建体中的位置如下(其中“-”表示scFv)：A和E在IS-RTP处、B和F在AK-GQP处、C和G在S-NG处、以及D和H在SN-G处。各种TM值与以下结构域相关，TM1＝CH2/scFv；TM2＝Fab；TM3＝CH3。数据倾向于显示，具有插入到ISRTP(A)和SNG(C)环中的2F4scFv的构建体A和C比具有在相同位置处插入LC10 scfv的构建体E和G更易于聚集。该观察结果表明scFv结构域的序列同一性和行为可能对双特异性结合蛋白构建体的稳定性有影响。此外，从上述可以预测，含有2F4 scFv的构建体D具有与A和C类似的较低稳定性；然而，似乎将2F4 scFv插入SNG环可稳定该分子并降低形成聚集体的倾向。总之，这种加速稳定性研究表明，scFv序列和在Fc区内的位置可以在BiSAb构建体的稳定性中起重大作用。
FcRn和FcγR结合分析
使用BIAcore 3000仪器(BIAcore)进行结合实验。为了捕获抗体，将1000RU IsdH(Fab)抗原固定在CM5芯片上。使100nM的BiSAb构建体或mAb对照以20μL/min流动5min以捕获抗体。使5μM huFcRn或FcγR I、IIa、IIb、IIIa-158V或IIIA158F以5μL/min流动20min。在PBS+5μM EDTA中在pH 6.0下进行FcRn结合，而在PBS+5μM EDTA中在pH 7.4下进行FcRn结合。
评价构建体A、C、D、E、G和H的FcRn结合。对于双特异性构建体E和H中的每种，以及对于与FcRn结合的2F4IgG，代表性数据显示于图80中。具有CH2-CH3界面下游的scFv的构建体似乎保留了FcRn结合(例如D&H构建体)。具有位于CH2-CH3界面上游的ISRTP环内的scFv的构建体似乎去除了可检测的FcRn结合(例如，A&E构建体)。ISRTP环在Fc中的已知的半衰期扩展的YTE突变(M252Y/S254T/T256E)区内，已知这些突变对FcRn结合是重要的。
测试构建体A、C、D、E、G、和H与FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa-158F、和FcγRIIIa-158V的结合。对于与Fc7RIIIa-158V结合的构建体E、G、和H，代表性数据示出于图81中。所有测试的构建体保留与FcγR的结合，虽然具有不同的亲和力(图81，插图)。表16显示了观察到的各种构建体与FcγR的结合趋势。
表16：FcγR结合趋势。
在与具有scFv插入CH2-CH3界面上游的ISRTP环中的构建体(A和E)结合的FcγR中观察到的差异，当与其他具有scFv插入CH2-CH3界面下游的SNG环中的构建体(C、D、G、和H)相比时，显示了一致的降低的FcγR结合。
通过向Fc区引入半衰期扩展环(N3)，尝试评价构建体A和E中的FcRn结合是否可以改进或恢复。图82是代表数据，并且显示了对于E构建体，BiS5Ab E和具有引入的N3环的构建体E(BiS5Ab E+N3)都不能结合FcRn。此外，将LC10scFv插入N3环(N3scFv)并保持ISRTP环完整，也将FcRn结合降低至低于可检测水平。这些数据表明，至少对于E构建体(如果不是对于本文披露的每种构建体)，ISRTP环和N3环(如果存在的话)都需要是完整的和未修饰的以保留FcRn结合。
实例3.3
除了BiS4与本文披露的双特异性结合构建体(BiS5)之间的比较之外，进行了一项研究以评价三种其他BiS结构基序平台(被鉴定为BiS1、BiS2、和BiS3)(参见图83)。如将参考图83所理解的，这些平台在这些结合结构域中之一的位置方面有所不同(如scFv结构域所阐明的)。在五个基序中，仅BiS4和BiS5包括两个接头部分作为与较大蛋白附接的点，其他(BiS1、BiS2、和BiS3)通过单个接头附接。
简言之，使用以上实例3.1和3.2中讨论的技术分析每种构建体的代表性分子的稳定性。将每种构建体的样品添加至pH 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、和7.5的缓冲液中，并在40℃储存两个月的时间段。然后使用HP-SEC分析样品的片段化速率(图84)、聚集速率(图85)、和单体损失速率(图86)。在这些条件下，分析表明本文披露的双特异性结合蛋白形式(“BiS5”；和呈如上表13中所示的D/H形式)在所有pH条件下相对于所有其他形式具有更优异的物理和化学稳定性。
SEC数据还用于将各种峰映射到BiS分子的相应片段(图87)。该映射基于以下假设，包括：在这些分子的铰链和连接区中发生片段化、片段的尺寸、理论的片段化、以及预期的片段种如何与呈其他形式的观察到的片段种类比对。虽然呈每种形式的较低分子量片段(LMWF)之间存在良好的分辨率，但在呈所有形式的单体和较高分子量片段(HMWF)之间也存在差的或没有分辨率。基于表17中的信息得出结论，相比单克隆抗体，HP-SEC技术更大程度地低估了呈BiS形式的片段化。如下所讨论地开发了一种交替分析。
表17：片段化分析-SEC低估了BiS形式的片段化速率。
*保留时间
1单体损失仅包括由于片段化导致的损失，并且不包括聚集。
2由于HMWF与单体的共洗脱，可能低估了速率。
3由于下降整合，肩峰的速率可能会变化。
为了使用摩尔消光系数计算HMWF的片段化速率，基于以下假设开发交替分析：(i)在降解期间，如果检测到小片段，那么还应该存在相应的大片段；(ii)在稳定性研究期间，二次片段化(片段的片段)不会显著发生；和(iii)片段化发生在接头区和/或铰链区中。片段化速率基于以下关系确定：
单体＝LMWF+HMWF
kt kLMWF kHMWF
mECm mECLMWF mECHMWF
表18：推断的片段化分析。
1单体损失仅包括由于片段化导致的损失，并且不包括聚集。
2由于HMWF与单体的共洗脱，可能低估了速率。
3由于未完全分辨的峰的整合，肩峰的速率可能变化。
另外，在还原条件下用构建体进行片段化速率分析，以鉴定二硫键的形成是否对片段化和稳定性有影响。该测定的代表性数据表示在(图86)中。在还原条件下，除BiS1外，针对所有BiS格式都可观察到更高的片段化速率(表19)。得出的结论是，在还原条件下较高的片段化速率证实了BiS5构建体中的scFv部分被束缚至CH3区(图89)。
表19：片段化分析-还原条件。
表20：片段化分析概况。
进一步研究了以上披露的稳定化二硫键的特征。结果显示在下表23和24中。在具有和不具有scFv中的稳定化二硫键的BiS4和BiS5(插入SN-G环的scFv)形式中产生对应于两种不同特异性的双特异性抗体。加速稳定性研究表明，没有稳定化二硫键的BiS4构建体由于降解(其通过引入稳定化VL-VH二硫键来防止)而具有大量的单体损失。这些结果表明，去除BiS5构建体中scFv中的稳定化二硫键对其稳定性没有显著作用。
表21
表22
基于所有上述数据，似乎本文披露的双特异性结合蛋白形式是所有测试形式中最稳定的。此外，就最小化片段化和聚集二者而言，BiSAb5在测试的较低pH值(例如，5.0、5.5、和6.0)下似乎最稳定。因此，本文披露的BisAb的意想不到且令人惊讶的稳定性特征相对于用于工程化双特异性结合分子的其他结构平台和形式提供了另外的优点。
通过引用并入
在此提及的所有公开物和专利特此以其全文通过引用而结合，如同每个单独的出版物或专利被明确且单独地表明通过引用而结合。
虽然已经讨论了本披露的特定方面，但上述说明是说明性而非限制性的。通过回顾此说明书和以下权利要求，本披露的多种变体对于本领域的技术人员而言将变得明显。应通过参考权利要求、连同它们的等效物的全部范围、以及说明书、连同这类变体，确定本披露的全部范围。

Claims (58)

1.一种蛋白，其包含：
结合第一表位的第一结合结构域(BD1)，
结合第二表位的第二结合结构域(BD2)，和
包含CH2和CH3结构域的Fc区；
其中该Fc区包含在该CH2结构域中的、在该CH3结构域中的、或在该CH2和CH3结构域的界面处的溶剂暴露环处的BD2；并且
其中该蛋白是二价的，用于结合该第一和第二表位中的每一个。
2.如权利要求1所述的蛋白，其中该Fc区包含在该CH2结构域中、在该CH3结构域中、或在该CH2和CH3结构域的界面处的氨基酸序列中的溶剂暴露环处的BD2。
3.如权利要求2所述的蛋白，其中该溶剂暴露环包含来自该CH2结构域的氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的蛋白，其中该溶剂暴露环包含氨基酸序列ISRTP(SEQ ID NO:39)。
5.如权利要求2所述的蛋白，其中该溶剂暴露环包含来自该CH3结构域的氨基酸序列。
6.如权利要求5所述的蛋白，其中该溶剂暴露环包含氨基酸序列SNG。
7.如权利要求2所述的蛋白，其中该溶剂暴露环包含来自该CH2结构域和该CH3结构域的界面的氨基酸序列。
8.如权利要求7所述的蛋白，其中该溶剂暴露环包含氨基酸序列AKGQP(SEQ ID NO:40)。
9.如权利要求1-8中任一项所述的蛋白，其中BD2包含单链可变片段(scFv)。
10.如权利要求1-8中任一项所述的蛋白，其中BD1包含选自下组的结合结构域，该组由以下组成：Fab结构域、scFv、单结构域抗体、和抗体可变结构域。
11.如权利要求1-8中任一项所述的蛋白，其中BD1包含Fab结构域。
12.如权利要求11所述的蛋白，其中该Fab结构域经由抗体铰链区与该Fc区连接。
13.如权利要求1-8中任一项所述的蛋白，其中该Fc区包含选自下组的结构域，该组由来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、和IgD的Fc区组成。
14.如权利要求13所述的蛋白，其中该Fc区包含变体Fc区。
15.如权利要求13所述的蛋白，其中该Fc区是未糖基化的。
16.如权利要求13所述的蛋白，其中该Fc区是去糖基化的。
17.如权利要求13所述的蛋白，其中该Fc区具有减少的岩藻糖基化或是未岩藻糖基化的。
18.如权利要求1-8中任一项所述的蛋白，其中该蛋白进一步包含BD2和该Fc区之间的蛋白接头L1。
19.如权利要求1-8中任一项所述的蛋白，其中该蛋白进一步包含BD2和该Fc区之间的第一蛋白接头L1和第二蛋白接头L2。
20.如权利要求1-8中任一项所述的蛋白，其中BD2经由蛋白接头L1与该Fc区缔合。
21.如权利要求1-8中任一项所述的蛋白，其中BD2经由两个蛋白接头L1和L2与该Fc区缔合。
22.如权利要求18-21中任一项所述的蛋白，其中L1和L2独立地选自(G4S)2(SEQ ID NO:41)、(G4S)3(SEQ ID NO:42)、和(G4S)4(SEQ ID NO:43)。
23.如权利要求1所述的蛋白，其中该蛋白包含嵌合重链，该嵌合重链包含以下多肽结构域，从N-末端到C-末端
VH1-CH1-CH2(N-末端)-BD2-CH2(C-末端)-CH3；并且
BD1包含Fab结构域；
其中VH1包含该Fab结构域的重链可变结构域，并且CH1包含该Fab的重链恒定结构域1。
24.如权利要求1所述的蛋白，其中该蛋白包含嵌合重链，该嵌合重链包含以下多肽结构域，从N-末端到C-末端
VH1-CH1-CH2-BD2-CH3；并且
BD1包含Fab结构域；
其中VH1包含该Fab结构域的重链可变结构域，并且CH1包含该Fab的重链恒定结构域1。
25.如权利要求1所述的蛋白，其中该蛋白包含嵌合重链，该嵌合重链包含以下多肽结构域，从N-末端到C-末端
VH1-CH1-CH2-CH3(N-末端)-BD2-CH3(C-末端)；并且
BD1包含Fab结构域；
其中VH1包含该Fab结构域的重链可变结构域，CH1包含该Fab的重链恒定结构域1。
26.如权利要求23-25中任一项所述的蛋白，其中BD2包含scFv。
27.如权利要求26所述的蛋白，其中该scFv包含，从N-末端到C-末端，
VH2-多肽接头-VL2或VL2-多肽接头-VH2；
其中VH2包含该scFv的重链可变结构域，并且VL2包含该scFv的轻链可变结构域。
28.如权利要求23-27中任一项所述的蛋白，其中该蛋白进一步包含BD2和该Fc区之间的蛋白接头L1。
29.如权利要求23-27中任一项所述的蛋白，其中该蛋白进一步包含BD2和该Fc区之间的第一蛋白接头L1和第二蛋白接头L2。
30.如权利要求23-25中任一项所述的蛋白，其中BD2经由接头(L1)与该Fc区的CH2结构域、CH2结构域、或CH2和CH3结构域的界面缔合。
31.如权利要求23-25中任一项所述的蛋白，其中BD2经由两个蛋白接头L1和L2，与该Fc区的CH2结构域、CH2结构域、或CH2和CH3结构域的界面缔合。
32.如权利要求28-31中任一项所述的蛋白，其中L1和L2独立地选自长度为1-25个氨基酸的蛋白接头。
33.如权利要求28-31中任一项所述的蛋白，其中L1和L2独立地选自(G4S)2(SEQ ID NO:41)、(G4S)3(SEQ ID NO:42)、和(G4S)4(SEQ ID NO:43)。
34.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中该第一和第二表位是不同的。
35.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中该第一和第二表位是相同的。
36.一种结合PD-1和CTLA-4的双特异性结合蛋白，该双特异性结合蛋白包含含有SEQID NO:1的氨基酸序列的第一肽和含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的第二肽。
37.一种结合PD-1和CTLA-4的双特异性结合蛋白，该双特异性结合蛋白包含含有SEQID NO:3的氨基酸序列的第一肽和含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的第二肽。
38.一种结合PD-1和CTLA-4的双特异性结合蛋白，该双特异性结合蛋白包含含有SEQID NO:5的氨基酸序列的第一肽和含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的第二肽。
39.一种结合PD-1和CTLA-4的双特异性结合蛋白，该双特异性结合蛋白包含含有SEQID NO:9的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的第一轻链、含有SEQID NO:12的氨基酸序列的第二重链、和含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的第二轻链。
40.一种结合PD-L1和CTLA-4的双特异性结合蛋白，该双特异性结合蛋白包含含有SEQID NO:14的氨基酸序列的第一肽和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的第二肽。
41.一种结合PD-L1和CTLA-4的双特异性结合蛋白，该双特异性结合蛋白包含含有SEQID NO:16的氨基酸序列的第一肽和含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的第二肽。
42.一种结合PD-L1和CTLA-4的双特异性结合蛋白，该双特异性结合蛋白包含含有SEQID NO:18的氨基酸序列的第一肽和含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的第二肽。
43.一种结合PD-1和TIM3的双特异性结合蛋白，该双特异性结合蛋白包含含有SEQ IDNO:22或SEQ ID NO:89的氨基酸序列的第一肽和含有SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:90的氨基酸序列的第二肽。
44.一种结合PD-1和TIM3的双特异性结合蛋白，该双特异性结合蛋白包含含有SEQ IDNO:24或SEQ ID NO:91的氨基酸序列的第一肽和含有SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:92的氨基酸序列的第二肽。
45.一种结合PD-1和TIM3的双特异性结合蛋白，该双特异性结合蛋白包含含有SEQ IDNO:9的氨基酸序列的第一重链、含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的第一轻链、含有SEQ IDNO:27或SEQ ID NO:30的氨基酸序列的第二重链、和含有SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:28的氨基酸序列的第二轻链。
46.一种结合OX40和PD-L1的双特异性结合蛋白，该双特异性结合蛋白包含含有SEQ IDNO:34的氨基酸序列的第一肽和含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的第二肽。
47.一种结合OX40和PD-L1的双特异性结合蛋白，该双特异性结合蛋白包含含有SEQ IDNO:35的氨基酸序列的第一肽和含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的第二肽。
48.一种结合OX40和PD-L1的双特异性结合蛋白，该双特异性结合蛋白包含含有SEQ IDNO:36或SEQ ID NO:94的氨基酸序列的第一肽和含有SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:93的氨基酸序列的第二肽。
49.一种结合TIM3的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含含有CDR1、CDR2、和CDR3的重链和含有CDR1、CDR2、和CDR3的轻链，其中该重链CDR1包含SEQ ID NO:79，重链CDR2包含SEQ ID NO:80，重链CDR3包含SEQ ID NO:81，并且该轻链CDR1包含SEQ IDNO:82，轻链CDR2包含SEQ ID NO:83，轻链CDR3包含SEQ ID NO:84。
50.如权利要求49所述的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含：SEQ ID NO:85，并且该轻链可变区包含：SEQID NO:86。
51.如权利要求49所述的抗体或其抗原结合片段，其中该重链包含：SEQ ID NO:87，并且该轻链包含：SEQ ID NO:88。
52.一种组合物，其包含如权利要求1-51中任一项所述的蛋白或抗体和药学上可接受的载体。
53.一种核酸分子，其包含编码根据权利要求1-51中任一项所述的蛋白或抗体的核苷酸序列。
54.一种载体，其包含如权利要求53所述的核酸分子。
55.一种宿主细胞，其包含如权利要求54所述的载体。
56.一种治疗或预防受试者中的癌症的方法，该方法包括向该受试者给予如权利要求1-51中任一项所述的蛋白或抗体。
57.如权利要求56所述的方法，其中该癌症是卵巢癌、乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、膀胱癌、头颈癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾细胞癌、和肺癌中的一种或多种。
58.一种增强受试者中的免疫应答的方法，该方法包括向该受试者给予如权利要求1-51中任一项所述的蛋白或抗体。
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