KR102674279B1 - 이중특이성 결합 단백질 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일반적으로 2개의 에피토프(예를 들어, 제1 및 제2 에피토프)에 결합하고, 제1 및 제2 에피토프의 각각에 결합하기 위해 2가인 단백질을 제공한다. 본 발명은 또한 표적 단백질에 결합하는 항체를 포함하는 특이적 결합 단백질을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 단백질을 포함하는 조성물, 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자 및 상기 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명은 단백질, 핵산 분자 및/또는 조성물을 대상체에게 투여함으로써 대상체 내에서 면역 반응을 유도하는 방법뿐만 아니라 대상체 내에서 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

Description

이중특이성 결합 단백질 및 그의 용도{BISPECIFIC BINDING PROTEINS AND USES THEREOF}
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2016년 5월 6일자로 출원된 미국 가출원 제62/332,788호의 우선권 및 그 은전을 주장하며, 그 개시 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 전자 포맷의 서열 목록과 함께 출원되고 있다. 서열 목록은 크기가 244 kb인, 2017년 5월 2일에 작성된 IOBS_100_ST25.txt라는 파일로 제공된다. 서열 목록의 전자 포맷의 정보는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
암은 계속해서 세계의 주요 건강 부담이 되고 있다. 암 치료의 진전에도 불구하고, 특히 진행성 질환을 앓고 있거나 기존 치료법에 내성이 있는 암 환자의 경우 보다 효과적이고 덜 독성있는 치료법에 대한 의학적 요구가 충족되지 못하고 있다.
종양 조절에서 면역계, 특히 T 세포-매개된 세포독성의 역할은 잘 인식되어 있다. T 세포가 질병의 초기 및 말기 단계에서 암 환자의 종양 성장 및 생존을 제어한다는 증거가 늘어나고 있다. 그러나 종양-특이적 T-세포 반응은 암 환자에서 일어나고 지속되기가 어렵다. 암에 대한 타고난 면역 반응을 자극하거나 향상시키는 암 면역요법의 지속적인 발전과 성공은 비특이적인 화학요법 및/또는 방사선을 이용하는 치료법과 비교할 때 매력적인 치료법이 될 수 있도록 한다.
다수의 분자 표적이 암에 대한 면역-종양학(IO) 치료제로서의 잠재적인 유용성으로 확인되었다. 면역-종양학 치료 영역에서 치료 잠재력에 대해 연구되고 있는 일부 분자 표적에는 세포독성 T 림프구 항원-4(CTLA-4 또는 CD152), 프로그램된 사멸 리간드 1(PD-L1 또는 B7-H1 또는 CD274), 프로그램된 사멸-1(PD-1), OX40(CD134 또는 TNFRSF4) 및 T-세포 억제성 수용체 T-세포 면역글로불린 및 뮤신-도메인 함유-3(TIM3)이 포함된다. 이들 표적 중 일부는 치료학적으로 성공적으로 이용되었지만(예를 들어, PD-1 및 CTLA-4), 많은 환자가 개발된 치료법에 반응하지 않았다. 그리고, 고용량 및/또는 면역요법들의 조합을 포함하는 치료 요법이 고려될 수 있지만, 이러한 요법은 고용량 및 누적 노출로 인해 증가하는 경향이 있는 부작용의 위험이 증가될 수 있으며, 복합 면역요법과 함께 사용되는 경우 도움이 되는 것으로 나타난다. 일부 일반적인 부작용은 뇌하수체염, 갑상선염, 부신 기능부전증, 소장결장염, 피부염, 폐렴, 간염, 췌장염, 운동 및 감각 신경병증 및 관절염을 포함한다. 또한, 면역요법은 일반적으로 높은 비용과 관련되어 있기 때문에, 면역요법의 조합을 포함하는 요법은 환자에게 비용이 많이 들 수 있다.
이와 같이, IO 치료제에 대한 후보 표적을 계속 확인하고, 기존 표적에 대한 새로운 치료법을 개발하며, 환자 반응의 부족 및 조합 치료와 관련된 부작용의 증가되는 위험을 포함하여 현재 사용중인 면역요법의 단점을 피하는 치료 전략을 개발할 필요가 있다. 개별 단일특이적 결합 단백질의 조합에 대한 결합 친화도와 비교할 때, 표적 분자의 조합에 대해 이중특이적인 IO 치료제(예를 들어, 결합 단백질), 특히 표적 분자에 대한 더 큰 결합 친화도를 나타내는 치료제는 치료 잠재력에 특히 바람직한 분자의 부류를 나타낸다.
본 발명은 2개의 에피토프(예를 들어, 제1 및 제2 에피토프)에 결합하고 각각의 제1 및 제2 에피토프에 결합하기 위해 2가인 이중특이적 분자 또는 단백질을 제공한다. 본 발명은 또한 대상체내에서 면역 반응을 유도하는 방법뿐만 아니라 단백질, 핵산 분자 및/또는 조성물을 대상체에게 투여함으로써 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에서 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 제1 에피토프에 결합하는 제1 결합 도메인(BD1), 제2 에피토프에 결합하는 제2 결합 도메인(BD2) 및 CH2 및 CH3 도메인을 갖는 Fc 영역을 함유하는 단백질을 제공하며; 상기 Fc 영역은 CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 CH2 및 CH3 도메인의 계면에서 용매 노출된 루프에서 BD2를 포함하고; 및 상기 단백질은 상기 제1 및 제2 에피토프의 각각에 결합하기 위해 2가이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원의 임의의 양태에 따른 단백질 또는 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체의 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원의 임의의 양태에 따른 단백질 또는 항체를 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에게 투여하는 단계를 포함한다. 다양한 구현예에서, 암은 난소암, 유방암, 결장직장암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁암, 고환암, 방광암, 두경부암, 흑색종, 췌장암, 신세포암종 및 폐암 중 하나 이상이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체내에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하며, 이 방법은 본원의 임의의 양태에 따른 단백질 또는 항체를 대상체(예를 들어, 인간 대상체)에게 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원의 임의의 양태에 따른 단백질 또는 항체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원의 임의의 양태에 따른 핵산 분자를 함유하는 벡터를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원의 임의의 양태에 따른 벡터를 함유하는 숙주 세포를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 제1 펩타이드 및 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 갖는 제2 펩타이드를 갖는 PD-1 및 CTLA-4에 결합하는 이중특이성 결합 단백질을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 갖는 제1 펩타이드 및 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 갖는 제2 펩타이드를 갖는 PD-1 및 CTLA-4에 결합하는 이중특이성 결합 단백질을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 제1 펩타이드 및 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 제2 펩타이드를 갖는 PD-1 및 CTLA-4에 결합하는 이중특이성 결합 단백질을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 갖는 제1 중쇄, SEQ ID NO:7의 아미노산 서열을 갖는 제1 경쇄, SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 갖는 제2 중쇄 및 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 갖는 제2 경쇄를 갖는 PD-1 및 CTLA-4에 결합하는 이중특이성 결합 단백질을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 갖는 제1 펩타이드 및 SEQ ID NO:15의 아미노산 서열을 갖는 제2 펩타이드를 갖는 PD-L1 및 CTLA-4에 결합하는 이중특이성 결합 단백질을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:16의 아미노산 서열을 갖는 제1 펩타이드 및 SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 갖는 제2 펩타이드를 갖는 PD-L1 및 CTLA-4에 결합하는 이중특이성 결합 단백질을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 갖는 제1 펩타이드 및 SEQ ID NO:19의 아미노산 서열을 갖는 제2 펩타이드를 갖는 PD-L1 및 CTLA-4에 결합하는 이중특이성 결합 단백질을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 갖는 제1 펩타이드 및 SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 갖는 제2 펩타이드를 갖는 PD-1 및 TIM3에 결합하는 이중특이성 결합 단백질을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:24 또는 SEQ ID NO:91의 아미노산 서열을 갖는 제1 펩타이드 및 상기 SEQ ID NO:23 또는 SEQ ID NO:92의 아미노산 서열을 갖는 제2 펩타이드를 갖는 PD-1 및 TIM3에 결합하는 이중특이성 결합 단백질을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 갖는 제1 중쇄, SEQ ID NO:7의 아미노산 서열을 갖는 제1 경쇄, SEQ ID NO:27 또는 SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 갖는 제2 중쇄 및 SEQ ID NO:26 또는 SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 갖는 제2 경쇄를 갖는 PD-1 및 TIM3에 결합하는 이중특이성 결합 단백질을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:34의 아미노산 서열을 갖는 제1 펩타이드 및 SEQ ID NO:32의 아미노산 서열을 갖는 제2 펩타이드를 갖는 OX40 및 PD-L1에 결합하는 이중특이성 결합 단백질을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:35의 아미노산 서열을 갖는 제1 펩타이드 및 SEQ ID NO:32의 아미노산 서열을 갖는 제2 펩타이드를 갖는 OX40 및 PD-L1에 결합하는 이중특이성 결합 단백질을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:36 또는 SEQ ID NO:94의 아미노산 서열을 갖는 제1 펩타이드 및 상기 SEQ ID NO:32 또는 SEQ ID NO:93의 아미노산 서열을 갖는 제2 펩타이드를 갖는 OX40 및 PD-L1에 결합하는 이중특이성 결합 단백질을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는 중쇄 및 CDR1, CDR2 및 CDR3을 갖는 경쇄를 갖는 TIM3에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하며, 상기 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO:88을 포함하고, 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO:80을 포함하고, 중쇄 CDR3은 SEQ ID NO:81을 포함하고, 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO:82를 포함하고, 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO:83을 포함하고, 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO:84를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 이중특이성 결합 단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 갖는 조성물; 이중특이성 결합 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자; 이중특이성 결합 단백질을 투여함으로써 대상체에서 암을 치료 또는 예방하는 방법; 및 이중특이성 결합 단백질을 투여함으로써 대상체에서 면역 반응을 증강시키는 방법을 제공한다.
본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, Fc 영역은 CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 CH2 및 CH3 도메인의 계면에서 아미노산 서열의 용매 노출 루프에 BD2를 포함한다.
본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 상기 용매 노출된 루프는 CH2 도메인으로부터의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 용매 노출된 루프는 아미노산 서열 ISRTP(SEQ ID NO:39)를 포함한다.
본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 상기 용매 노출된 루프는 CH3 도메인으로부터의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 용매 노출된 루프는 아미노산 서열 SNG를 포함한다.
본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 상기 용매 노출된 루프는 CH2 도메인 및 CH3 도메인의 계면으로부터의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 용매 노출 루프가 아미노산 서열 AKGQP(SEQ ID NO:40)를 포함하는 제7항의 단백질.
본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, BD2는 단쇄 가변 단편(scFv)이거나, 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함한다.
본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, BD1은 Fab 도메인, scFv, 단일 도메인 항체 및 항체 가변 도메인 중 하나 이상인 결합 도메인이거나, 이를 포함한다. 특정 구현예에서, BD1은 Fab 도메인을 포함한다.
본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, Fab 도메인은 항체 힌지 영역을 통해 Fc 영역에 연결된다. 특정 구현예에서, Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE 또는 IgD로부터의 Fc 영역 중 하나 이상인 도메인이거나, 이를 포함한다. 특정 구현예에서, Fc 영역은 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 아글라이코실화, 탈글라이코실화, 및/또는 아푸코실화(afucosylated)되거나 감소된 푸코실화를 갖는다.
본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 단백질은 BD2와 Fc 영역 사이에 단백질 링커 L1을 추가로 포함한다. 본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 단백질은 BD2와 Fc 영역 사이에 제1 단백질 링커 L1 및 제2 단백질 링커 L2를 추가로 포함한다. 본원에 기재된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, BD2는 단백질 링커 L1을 통해 Fc 영역과 결합된다. 본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, BD2는 2개의 단백질 링커 L1 및 L2를 통해 Fc 영역과 결합된다. 특정 구현예에서, L1 및 L2는 (G4S)2(SEQ ID NO:41), (G4S)3,(SEQ ID NO:42), 및 (G4S)4(SEQ ID NO:43)로부터 독립적으로 선택된다.
본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 단백질은 N-말단에서 C-말단까지 하기 폴리펩타이드 도메인: VH1-CH1-CH2(N-말단)-BD2-CH2(C-말단)-CH3을 갖는 키메라 중쇄를 포함하며; 및 BD1은 Fab 도메인을 포함하고; 여기서 VH1은 Fab 도메인의 중쇄 가변 도메인을 포함하고, CH1은 Fab의 중쇄 불변 도메인 1을 포함한다.
본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 단백질은 N-말단에서 C-말단까지 하기 폴리펩타이드 도메인: VH1-CH1-CH2-BD2-CH3을 갖는 키메라 중쇄를 포함하며; 및 BD1은 Fab 도메인을 포함하고; 여기서 VH1은 Fab 도메인의 중쇄 가변 도메인을 포함하고, CH1은 Fab의 중쇄 불변 도메인 1을 포함한다.
본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 단백질은 N-말단에서 C-말단까지 하기 폴리펩타이드 도메인: VH1-CH1-CH2-CH3(N-말단)-BD2-CH3(C-말단)을 갖는 키메라 중쇄를 포함하며; 및 BD1은 Fab 도메인을 포함하고; 여기서 VH1은 Fab 도메인의 중쇄 가변 도메인을 포함하고, CH1은 Fab의 중쇄 불변 도메인 1을 포함한다.
본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, BD2는 scFv이거나 scFv를 포함한다. 특정 구현예에서, scFv는 N-말단으로부터 C-말단까지: VH2-폴리펩타이드 링커-VL2 또는 VL2-폴리펩타이드 링커-VH2를 포함하며; 여기서 VH2는 scFv의 중쇄 가변 도메인을 포함하고, VL2는 scFv의 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 단백질은 BD2와 Fc 영역 사이에 단백질 링커 L1을 추가로 포함한다. 본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 단백질은 BD2와 Fc 영역 사이에 제1 단백질 링커 L1 및 제2 단백질 링커 L2를 추가로 포함한다.
본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, BD2는 링커(L1)를 통해 CH2 도메인, CH2 도메인 또는 Fc 영역의 CH2 및 CH3 도메인의 계면과 결합된다.
본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, BD2는 2개의 단백질 링커 L1 및 L2를 통해 CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 Fc 영역의 CH2 및 CH3 도메인의 계면과 결합된다. 다양한 구현예에서, L1 및 L2는 길이가 1-25개 아미노산인 단백질 링커로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, L1 및 L2는 (G4S)2(SEQ ID NO:41), (G4S)3,(SEQ ID NO:42), 및 (G4S)4(SEQ ID NO:43)로부터 독립적으로 선택된다.
본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 제1 및 제2 에피토프는 상이하다. 본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 구현예에서, 제1 및 제2 에피토프는 동일하다.
본 발명을 예시할 목적으로, 도면에는 본 발명의 특정 양태가 도시되어있다. 그러나, 본 발명은 도면에 도시된 양태들의 정확한 배열 및 수단에 제한되지 않는다.
도 1a 내지 1f는 본원에 기술된 특정 예시 단백질의 개략도를 도시한다. CH2 및 CH3 영역은 PyMOL을 사용하여 도 1a 내지 1c에 도시되어 있으며, 용매 노출된 표면 루프 영역을 구체로 식별한다. 도 1a는 CH2 영역의 루프를 도시하며; 도 1b는 CH2-CH3 계면의 루프를 도시하며; 및 도 1c는 CH3 영역의 루프를 도시한다. Fab 및 scFv 도메인으로서 대표적인 BD1 및 BD2 도메인을 각각 포함하는 예시적인 구조물을 도 1d 내지 1f에 예시하였다. 도 1d는 힌지 영역에 부착된 BD1 및 CH2 영역의 용매 노출 루프에 부착된 BD2를 도시한다. 도 1e는 힌지 영역에 부착된 BD1 및 CH2-CH3 계면내 용매 노출 루프에 부착된 BD2를 도시한다. 도 1f는 힌지 영역에 부착된 BD1 및 CH3 영역내 용매 노출 루프에 부착된 BD2를 도시한다.
도 2a 내지 2c는 본원에 기재된 CH2, CH2-CH3 계면 및 CH3에서의 용매 접근가능한 루프 서열의 확대도이다. BD2(scFv)를 포함하는 구조물의 예는 도 2a 내지 2c 각각에 포함된다. 도 2a는 CH2-CH3 계면의 CH2 루프 상류에서 동정된 대표적인 루프 서열 ISRTP(SEQ ID NO:39)를 예시한다. 도 2b는 CH2-CH3 계면에서의 대표적인 루프 서열 AKGQP(SEQ ID NO:40)를 예시한다. 도 2c는 CH2-CH3 계면 하류의 CH3 영역에서의 대표적인 루프 서열 SNG를 도시한다.
도 3은 PD-1 및 CTLA-4를 표적화하는 BiS2, BiS3 및 BiS5 구조물의 동시 결합을 설명한다. 트레이스 A9는 BiS2 PD-1/CTLA-4를 나타내고, 트레이스 B9는 Bis3 PD-1/CTLA-4를 나타내고, 및 트레이스 C9는 Bis5 PD-1/CTLA-4를 나타낸다.
도 4는 PD-1/CTLA-4 봉쇄를 위한 제안된 메커니즘의 개략도를 도시한다.
도 5는 PD-1 및 CTLA-4를 표적화하는 DuetMab 구조물의 동시 결합을 입증하는 옥텟 결합 분석의 결과를 나타낸다.
도 6a 내지 d는 PD-1/CTLA-4 이중특이성 결합 단백질이 리포터 유전자 분석에서 PD-1 및 CTLA-4 경로를 억제함을 보여준다. 도 6a는 PD-1 봉쇄를 통한 T-세포 활성화를 나타낸다. 도 6b는 CTLA-4 봉쇄를 통한 T-세포 활성화를 나타낸다. 도 6c는 PD-1 리포터 분석의 결과를 나타낸다. 도 6d는 CTLA-4 리포터 분석의 결과를 나타낸다.
도 7은 PD-1/CTLA-4 DuetMab 및 BiS5Ab가 포도상구균 장내독소 B(Staphylococcal enterotoxin b, SEB) 분석에서 동등한 활성을 가짐을 보여주는 SEB 분석의 결과를 나타낸다.
도 8a 내지 b는 아이소타입 및 모체 mAb 대조군과 비교되는 SEB 분석에서 PD-1/CTLA-4 DuetMab의 활성을 나타낸다.
도 9a 내지 b는 SEB 분석에서 PD-1/CTLA-4 DuetMab과 비교되는 PD-1/CTLA-4 BiS5Ab의 활성을 나타낸다.
도 10a 내지 c는 PD-1/CTLA-4 DuetMab 및 BiS5Ab가 혼합 림프구 반응(MLR) 분석에서 동등한 활성을 갖는다는 것을 보여준다. 도 10a는 분석의 개략도이다(n=4 공여체; 2개의 독립적인 실험).
도 11a 내지 d는 아이소타입 대조군과 비교되는 MLR 분석에서 PD-1/CTLA-4 DuetMab의 활성을 나타낸다(n=2 공여체, 1개의 실험).
도 12a 내지 d는 모체 mAb 대조군과 비교되는 MLR 분석에서 PD-1/CTLA-4 DuetMab의 활성을 나타낸다(n=2 공여체, 1개의 실험).
도 13a 내지 d는 경쟁 항체(n=2 공여체, 1개의 실험)와 비교되는 MLR 분석에서 PD-1/CTLA-4 DuetMab의 활성을 나타낸다.
도 14는 사이노몰구스 원숭이에서 단회 투여 약물동력학/약력학(PK/PD) 연구에 대한 연구 설계를 나타낸다.
도 15a 및 b는 PD-1/CTLA-4 DuetMab이 사이노몰구스 원숭이에서 명확한 약력학(PD)을 나타냈다는 것을 보여준다.
도 16a 및 b는 PD-1/CTLA-4 DuetMab(MEDI5752) 및 PD-1/CTLA-4 BiS5Ab(MEDI8500)가 투여된 사이노몰구스 원숭이의 T 세포 의존성 항체 반응(TDAR)을 나타낸다.
도 17은 안정한 CHO 세포가 다양한 수준의 인간 PD-1 및/또는 CTLA-4를 발현하는 PD-1/CTLA-4 이중특이성 분자를 연구하기 위한 모델 시스템을 나타낸다.
도 18a 내지 c는 PD-1/CTLA-4 DuetMab이 동일한 세포의 표면 상에서 PD-1 및 CTLA-4를 동시에 결합시키는 것을 나타낸다.
도 19a 내지 c는 과량의 PD-1을 발현하는 세포에서 CTLA-4의 포화 상태에서 항-PD-1 및 항-CTLA-4 항체의 조합에 대해 협력적 결합이 구별되는지를 결정하는 실험을 나타낸다.
도 20a 내지 d는 PD-1 및 CTLA-4 모체 단클론 항체가 표적화되지않은 수용체에 대한 측정가능한 효과없이 그들의 표적 수용체에 결합하여 점유함을 나타낸다.
도 21a 내지 d는 PD-1/CTLA-4 DuetMab이 단클론 항체의 조합과 비교하여 약 250배 낮은 농도로 과량의 PD-1을 발현하는 CHO 세포에서 CTLA-4를 포화시킨다는 것을 보여준다.
도 22a 내지 f는 PD-1/CTLA-4 DuetMab이 CTLA-4만을 발현하는 세포와 비교하여 약 500배 낮은 농도로 과량의 PD-1을 발현하는 CHO 세포에서 CTLA-4를 포화시킨다는 것을 보여준다.
도 23a 내지 b는 PD-1/CTLA-4 DuetMab이 동일한 세포의 표면상의 PD-1 및 CTLA-4에 우선적으로 시스(cis) 결합하는 것을 나타낸다. 도 23b의 Treme은 CTLA-4 mAb이다.
도 24a 내지 d는 배양된 T 세포에 대한 PD-1/CTLA-4 DuetMab 및 모체 단클론 항체의 결합 및 내재화를 나타낸다. PD-1/CTLA-4 DuetMab은 트레멜리무맙(tremelimumab)의 내재화 특성을 가지고 있다.
도 25a는 내재화 분석의 개략도를 도시한다. 도 25b는 PD-1/CTLA-4 DuetMab이 10배 과량 PD-1을 발현하는 안정한 CHO 세포에서 트레멜리무맙의 내재화 특성을 나타내는 것을 보여준다.
도 26은 PD-L1 및 CTLA-4를 표적화하는 BiS2, BiS3 및 BiS5 구조물의 동시 결합을 입증한다. 트레이스 A11은 Bis2 PD-L1CTLA-4를 나타내고, 트레이스 B11은 Bis3 PD-L1/CTLA-4를 나타내고, 및 트레이스 C11은 Bis5 PD-L1/CTLA-4를 나타낸다.
도 27a는 PD-1 및 TIM3(클론 62, 야생형)을 표적화하는 BiS3 구조물의 동시 결합을 입증한다. 도 27b는 PD-1 및 TIM3(클론 62, 야생형)을 표적화하는 DuetMab 구조물의 동시 결합을 입증한다.
도 28a 내지 28c는 세포 살해 분석에서의 단일특이성 TIM3 및 이중특이성 PD-1_TIM3PD-1 이중특이성 구조물의 세포 살해 활성의 요약을 제공한다. 도 28a는 18 시간에 공동 배양된 웰의 명 시야 이미지를 보여준다. 항-TIM-3+항-PD1 또는 TIM-3/PD-1 이중특이성 포맷의 조합은 종양 세포 사멸을 증가시키고, T 세포의 부착 세포 감소 및 블라스팅(클럼핑) 증강에 의해 평가된 T 세포 활성화를 증가시킨다. 도 28b는 흑색종 특이적 CD8+T 세포와 18시간의 동시-배양 후 종양 세포에 의한 생존력 염료 흡수 평가를 나타낸다. 도 28c는 18시간 동시-배양 후 IFNγ 분비를 나타낸다. 이중특이성 구조물은 일반적으로 가장 강력한 살해 활성을 나타내는 DuetMab 포맷에 의해, 보다 우수한 살해 활성을 나타낸다.
도 29는 클론 62의 친화도 성숙 변이인 TIM3 아암(arm) 서열을 갖는 PD-1/TIM3 DuetMab 구조물의 동시 결합을 입증한다.
도 30은 인간 TIM3 또는 인간 PD1을 과발현하는 CHO 세포에 대한, BiS3, BiS5 및 DuetMab를 포함하는 PD-1/TIM3 이중특이성 항체의 결합을 나타낸다. PD-1 및 TIM3 발현 데이타가 삽입 도면에 도시되어있다.
도 31은 활성화된 T 세포 클론(DMF4)상의 TIM3 및 PD-1 발현 데이터를 나타낸다.
도 32a 내지 c는 BiS3, BiS5 및 DuetMab을 포함하는 PD-1/TIM3 이중특이성 항체가 아이소타입 처리(3개의 공여체(처리 당 1-2 복제본/공여체), 1회 실험)에 비해 향상된 활성을 나타냄을 나타내는 CMV 항원 회수 분석 결과를 나타낸다.
도 33a 내지 d는 혼합된 림프구 반응(MLR) 분석에서 8nM 이상의 농도로 BiS3, BiS5 및 DuetMab을 포함하는 PD-1/TIM3 이중특이성 항체가 인터페론(IFNγ)을 증진시켰다는 것을 보여준다(처리 당 2 내지 4개의 복제 웰/1개의 공여체 쌍/2회의 독립적인 실험 중 1회).
도 34a 내지 c는 BiS3, BiS5 및 DuetMab을 포함하는 PD-1/TIM3 이중특이성 항체를 사용하는 PD-1 리포터 분석(이중 세포 시스템)의 결과를 도시하며, 모든 이중특이성 포맷은 모체 LO115 IgG1과 유사한 활성을 입증한다(처리 당 3 내지 5회의 독립적인 실험/3회의 생물학적 복제).
도 35는 BiS2 및 BiS3 OX40/PD-L1 이중특이성 분자를 사용한 옥텟 분석의 결과를 나타낸다.
도 36a 및 도 36b는 BiS2 및 BiS3 OX40/PD-L1 이중특이성 분자를 사용한 SEB 분석의 결과를 나타낸다.
도 37은 BiS2 및 BiS3 OX40/PD-L1 이중특이성 분자를 사용한 PD-L1 리포터 분석의 결과를 나타낸다.
도 38은 BiS2 및 BiS3 OX40/PD-L1 이중특이성 분자를 사용한 CMV Ag 회수 분석의 결과를 나타낸다.
도 39는 PD-L1 및 OX40을 표적화하는 OX40(SLR)/PD-L1 BiS5 구조물의 동시 결합을 입증하는 옥텟 결합 분석의 결과를 나타낸다.
도 40a 내지 f는 인간 또는 사이노몰구스 OX40 및 PD-L1/B7H1을 발현하는 CHO 세포에 대한, PD-L1 및 OX40을 표적화하는 이중특이성 구조물의 결합을 나타낸다.
도 41a 및 b는 유동 세포 계측법(HyperCyt)에 의해 측정된, Jurkat OX40 리포터 세포, NCI H358, CHOK1 B7H1(PD-L1)/OKT3 세포 및 HEK CD32a 세포에 대한 PD-L1 및 OX40을 표적화하는 이중특이성 구조물의 결합을 나타낸다.
도 42a 및 b는 OX40/PD-L1 이중특이성 분자를 사용하는 PD-L1 리포터 분석의 결과를 나타낸다.
도 43a 및 b는 OX40/PD-L1 이중특이성 분자를 사용하는 HEK CD32a 세포에서 OX40 리포터 분석의 결과를 나타낸다.
도 44a 및 b는 OX40/PD-L1 이중특이성 분자를 사용하여 CHOK PD-L1 과발현 세포에서 OX40 리포터 분석의 결과를 나타낸다.
도 45a 및 b는 OX40/PD-L1 이중특이성 분자를 사용하여 종양 세포로 PD-L1 매개된 OX40 작동 작용(agonism)을 나타낸다.
도 46a 내지 d는 OX40/종양 세포 분석을 위한 대조군에서 OX40/PD-L1 이중특이성 분자를 사용하여 NCI H358 PD-L1 KO 세포에 의해 어떠한 작동제가 검출되지 않았음을 나타내는 결과를 나타낸다.
도 47a 내지 d는 OX40/PD-L1 이중특이성 분자를 사용한 SEB 분석의 결과를 나타낸다.
도 48a는 OX40/PD-L1 이중특이성 분자를 시험하기 위한 Treg 억제 분석 실험의 개략도를 도시한다. 도 48b-c는 이중특이성 분자의 결합에 기초한 Treg 억제를 나타낸다.
도 49는 OX40/PD-L1 이중특이성 분자를 사용한 Treg 억제 분석의 결과를 나타낸다.
도 50은 OX40/PD-L1 이중특이성 분자를 이용한 Treg 억제 분석의 결과를 나타낸다.
도 51a 및 b는 OX40/PD-L1 이중특이성 분자를 시험하기 위한 혼합 백혈구 반응(MLR) 분석 실험의 설계를 나타낸다.
도 52a 내지 e는 OX40/PD-L1 이중특이성 분자를 사용하는 MLR 분석의 결과를 나타낸다.
도 53a 및 b는 BiS2 및 BiS5 OX40/PD-L1 이중특이성 분자가 PD-L1 또는 OX40 발현 CHO 세포에 대한 자연 살해(NK) 세포의 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC)을 매개한다는 것을 보여준다.
도 54는 BiS2 및 BiS5 OX40/PD-L1 이중특이성 분자가 PD-L1 및 OX40 발현 CHO 세포에 대한 NK 세포의 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC)을 매개한다는 것을 보여준다.
도 55는 BiS2 및 BiS5 OX40/PD-L1 이중특이성 분자가 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC)에서 PD-L1 및 OX40 발현 CHO 세포에 대한 NK 세포의 CD107a 동원을 증가시킨다는 것을 보여준다.
도 56은 BiS2 및 BiS5 OX40/PD-L1 이중특이성 분자가 활성화된 동종이형성 T 세포에 대한 NK 세포의 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC)을 매개한다는 것을 보여준다.
도 57a 및 b는 BiS5 OX40/PD-L1이 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC)에서 활성화된 동종이형성 T 세포에 대한 2개의 상이한 공여체로부터의 NK 세포의 CD107a 동원을 증가시킨다는 것을 보여준다.
도 58은 OX40/PD-L1 이중특이성 분자의 PK/PD를 비교하기 위한 연구 설계를 나타낸다.
도 59는 사이노몰구스 원숭이에서 PD-L1/OX40 이중특이성 분자에 대한 혈청 농도 시간 프로파일의 비교를 도시한다.
도 60은 PD-L1/OX40 이중특이성 분자에 의한 혈청 중의 가용성 PD-L1의 고갈을 나타낸다.
도 61a 내지 f는 PD-L1/OX40 이중특이성 분자에 대한 약동학 데이터의 요약을 제공한다. 기준선은 5일째와 투여전 0일째의 평균으로 정의된다.
도 62는 PD-1/OX40 BiS2 IgG4P 단클론 항체(mAb)의 개략도를 도시한다.
도 63은 PD-1/OX40 BiS2 mAb의 잠재적인 작용 메카니즘을 나타낸다.
도 64는 PD1-His 및 인간 OX40-Fc에 대한 PD-1(LO115)/OX40 BiS2 mAb의 2개의 상이한 로트에 대한 동시 결합 활성을 나타낸다.
도 65a는 OX40 리포터 분석의 개략도를 도시한다. 도 65b는 PD1 LO115 mAb, OX40 mAb, 대조군 mAb 및 PD1(LO115)/OX40 BiS2 mAb를 사용한 OX40 리포터 분석의 결과를 나타낸다.
도 66a는 PD-1/PD-L1 리포터 분석의 개략도를 도시한다. 도 66b는 PD1 LO115 mAb, OX40 mAb, 대조군 mAb 및 PD1(LO115)/OX40 BiS2 mAb를 사용한 PD1/PD-L1 리포터 분석의 결과를 나타낸다.
도 67은 PD-1(LO115)/OX40 이중특이성 분자 및 대조군의 BiS2 변이체를 사용한 SEB 분석의 결과를 나타낸다.
도 68은 PD-1(LO115)/OX40 이중특이성 분자 및 대조군의 BiS2 변이체를 사용하는 CMV 항원 회수 분석의 결과를 나타낸다.
도 69는 PD-1(AMP514)/OX40 이중특이성 분자 및 대조군의 BiS2 및 BiS3 변이체를 사용한 CMV 항원 회수 분석의 결과를 나타낸다.
도 70은 사이노몰구스 원숭이에서의 단일 IV 투여 후 PD1(LO115)/OX40 BiS2 mAb의 혈청 농도-시간 프로파일을 도시한다. 데이터는 그룹당 3마리의 수컷의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다. LLOQ(5 ng/mL는 점선으로 표시되고 PKC = 약동학 농도; LLOQ = 정량의 하한선.
도 71은 사이노몰구스 원숭이에서 PD-1(LO115)/OX40 BiS2 mAb의 단일 IV 투여 후% Ki67 양성 CD4+ 및 CD8+ 메모리 T 세포를 나타낸다. 데이터는 그룹당 3마리의 수컷의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다. 왼쪽 패널 A는 CD4+ 메모리 T 세포를 나타내고, 오른쪽 패널은 CD8+ 메모리 T 세포를 나타낸다. IV = 정맥내.
도 72는 사이노몰구스 원숭이 혈청에서의 PD-1/OX40의 정량에 대한 대표적인 표준 곡선을 도시한다.
도 73a 내지 e는 상이한 pH 값에서 상이한 BiS 포맷("BiS4")과 관련하여 본원에 개시된 이중특이성 결합 단백질("BiS5")의 예시적인 DSC 써모그램을 제공한다. 도 73a는 BiS4의 열적 안정성에 대한 pH의 영향을 예시한다. 도 73b는 BiS5의 열적 안정성에 대한 pH의 영향을 예시한다. 도 73c는 Tonset, Tm1, Tm2 및 Tm3을 갖는 BiS4에 대한 대표적인 곡선-피팅된 DSC 써모그램을 나타낸다. 도 73d는 Tonset, Tm1, Tm2 및 Tm3을 갖는 BiS5에 대한 대표적인 곡선-피팅된 DSC 써모그램을 나타낸다. 도 73e는 BiS4 및 BiS5 포맷에 대한 Tonset, Tm1, Tm2 및 Tm3에 대한 pH 효과를 나타내는 플롯을 도시한다.
도 74a 및 b는 4주 동안 40℃에서 저장하기 전후의 pH 7.5에서의 샘플의 HP-SEC 분석을 도시한다. 도 74a는 열 응력 전후의 BiS4 및 BiS5의 SEC 크로마토그램의 오버레이 플롯을 나타내며, 실선은 0시간(응력 없음)에서의 BiS4 및 BiS5 샘플에 대응하고, 점선은 40℃에서 4주 동안(응력받음) 배양된 BiS4 및 BiS5 샘플에 대응한다. 도 74b는 0일 및 40℃에서 4주후 측정한 BiS4 및 BiS5의 상이한 종(단량체, 단편 및 응집체)에 대한 pH 7.5의 영향을 나타내는 막대 차트를 제공한다.
도 75a 내지 c는 BiS4(삼각형 트레이스) 및 BiS5(원형 트레이스)에 대해 40℃에서 가속된 및 단기 저장 안정성에 대한 pH 7.5의 효과를 보여주는 동력학적 플롯을 제공한다. 도 75a는 4주 동안 HP-SEC에 의해 측정된 잔류 단량체의 백분율을 나타낸다. 도 75b는 4주 동안 HP-SEC에 의해 측정된 단편화의 백분율을 나타낸다. 도 75c는 4주 동안 HP-SEC에 의해 측정된 응집체의 백분율을 나타낸다. 제시된 데이터는 단일 바이알 분석에서 나온 것이다.
도 76a 내지 c는 BiS4(삼각형) 및 BiS5(원)에 대한 pH 속도 프로파일 플롯을 나타낸다. 도 76a는 상이한 pH 조건이 단량체 손실 속도에 미치는 영향을 도시한다. 40℃에서. 도 76b는 상이한 pH 조건이 40℃에서의 단편화 속도에 미치는 영향을 나타낸다. 도 76c는 상이한 pH 조건이 40℃에서 응집 속도에 미치는 영향을 도시한다.
도 77a 및 b는 BiS4 및 BiS5 단편화의 추가 분석을 나타낸다. 도 77A는 pH 7.5 및 40℃(시간 = 0에서)에서 어느 분자도 상당한 분열을 나타내지 않음을 보여준다. 도 77b는 도 77a와 동일한 조건 하에서, 40℃에서 2주간 보관한 후에, BiS4에 대해 현저한 단편화가 관찰되고, BiS5에 대한 최소 단편화가 관찰됨을 보여준다.
도 78은 pH의 함수로서 BiS4 및 BiS5 단편화(왼쪽 패널) 및 응집(오른쪽 패널)의 분석을 나타낸다. 두 가지 포맷 모두 낮은(5.5) pH에서 감소된 단편화 및 응집을 갖는 반면, BiS5는 단편화 및 응집 모두에 대해 두 pH 값 모두에서 우수한 성능을 갖는다.
도 79는 구조물(왼쪽 패널) A, B, C 및 D뿐만 아니라(오른쪽 패널) E, F, G 및 H에 대해 본원에 개시된 여러 BiS5 이중특이성 결합 단백질의 DSC 써모그램을 나타낸다. 구조물 A와 E는 IS-RTP에서 scFv를 포함하며; B 및 F는 AK-GQP에서 scFv를 포함하고; C 및 G는 S-NG에서 scFv를 포함하고; 및 D 및 H는 SN-G에서 scFv를 포함한다. 구조물 A, B, C 및 D에 대한 scFv는 2F4(IgG는 LC10임)인 반면, E, F, G 및 H에 대한 scFv는 LC10(IgG는 2F4임)이다. 다양한 TM 값은 하기 도메인, TM1 = CH2/scFv; TM2 = Fab; TM3 = CH3과 관련된다.
도 80은 본원에 개시된 이중특이성 결합 단백질(구조물 D 및 H)과 결합하는 FcRn에 대한 대표적인 데이터 세트를 도시한다. CH2-CH3 도메인에서(즉, ISTRP 루프 내에서) scFv의 위치는 FcRn 결합 활성에 영향을 미칠 수 있다.
도 81은 본원에 개시된 이중특이성 결합 단백질(FcγRIIIa-158V를 갖는 구조체 E, G 및 H)과의 FcγR 결합에 대한 대표적인 데이터 세트를 도시한다. 삽입된 도면은 FcγRIIIa-158V 주입시에 재정규화된 주요 도면과 동일한 데이터를 반영한다. 모든 구조물은 scFv 도메인의 위치에 기초한 친화도의 관찰가능한 차이와 함께 FcγR을 결합시킬 수 있었다.
도 82는 손상되지 않은 ISRTP 루프가 예시적인 이중특이성 결합 구조물(예를 들어, A 및 E)의 FcRn 결합에 중요하다는 것을 보여준다. N3 루프의 도입은 ISRTP 루프(BiS5E+N3)의 중단을 보완하지 못한다. IgG1 Fc에 삽입된 N3 루프에 도입된 scFv는 IgG를 FcRn에 결합시킬 수 없게 만든다. x-축의 시간은 초 단위로 측정된다.
도 83은 각각의 BiS1, BiS2, BiS3, BiS4 및 BiS5 구조물의 일반적인 개략적 구조 포맷을 도시한다. "k1" 및 "k2"의 표기는 실시예 3에서 논의된 동역학 분석에 사용된 바와 같은 단편화 패턴을 나타낸다.
도 84는 pH의 함수로서 각각의 BiS1, BiS2, BiS3, BiS4 및 BiS5의 단편화 속도를 나타낸다.
도 85는 pH의 함수로서 각 BiS1, BiS2, BiS3, BiS4 및 BiS5의 응집 속도를 나타낸다.
도 86은 pH의 함수로서 각 BiS1, BiS2, BiS3, BiS4 및 BiS5의 단량체 손실 속도를 나타낸다.
도 87은 각각의 BiS1, BiS2, BiS3, BiS4 및 BiS5에 대한 HPSEC 크로마토그램상의 피크에 대한 단편화 패턴 및 대응점의 표현을 나타낸다.
도 88은 환원 조건 하에서의 단편화 패턴의 대표적인 분석을 나타낸다.
도 89는 환원 및 비-환원 조건 하에서의 BiS5의 구조적 배열을 나타낸다.
도 90은 SEB 분석 포맷을 도시한다.
본 발명의 내용을 계속해서 더 상세하게 설명하기 전에, 본 발명은 특정 조성물 또는 공정 단계에 한정되지 않으며, 변경될 수 있음을 이해해야한다. 본 명세서 및 첨부된 청구의 범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥 상 다르게 지시하지 않는한 복수 대상을 포함한다는 것을 알아야한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 관련된 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 생물의학 및 분자생물학의 축약본 사전, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; 세포 및 분자생물학 사전, 3rd ed., 1999, Academic Press; 및 생화학 및 분자생물학의 옥스포드 사전, Revised, 2000, Oxford University Press은 본 발명에서 사용된 많은 용어의 일반적인 사전을 숙련된 자에게 제공한다.
아미노산은 그의 일반적으로 공지된 3개의 문자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명위원회에 의해 권장되는 1-문자 기호로 본원에서 지칭될 수 있다. 마찬가지로, 뉴클레오타이드는 일반적으로 허용되는 단일-문자 코드에 의해 지칭될 수 있다.
항체의 가변 도메인, 상보성 결정 영역(CDR) 및 프레임워크 영역(FR)에서의 아미노산의 넘버링은, 달리 지시되지 않는 한, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. 공중 보건 서비스, 국립 보건원, Bethesda, MD. (1991)에 개시된 바와 같은 Kabat 정의에 따른다. 이 넘버링을 사용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축 또는 FR 또는 CDR로의 삽입에 상응하는 더 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 중쇄 FR 잔기 82 후 H2의 잔기 52 및 삽입 잔기(예를 들어, Kabat에 따른 잔기 82a, 82b 및 82c 등) 이후 단일 아미노산 삽입(Kabat에 따른 잔기 52a)을 포함할 수 있다. 잔기의 Kabat 넘버링은 항체 서열의 상동성 영역에서 "표준" Kabat 넘버링된 서열과의 정렬에 의해 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다. 프레임워크 잔기의 최대 정렬은 종종 Fv 영역에 사용되는, 넘버링 시스템에 "스페이서" 잔기의 삽입을 필요로 한다. 또한, 주어진 Kabat 부위 번호에서 특정 개별 잔기의 정체는 종간 또는 대립형질의 차이로 인해 항체 사슬에서 항체 사슬로 다양할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항체" 및 "항체들"은 면역글로불린으로도 알려져 있으며, 단클론 항체(전장 단클론 항체 포함), 다클론 항체, 적어도 2개의 다른 에피토프 결합 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체들(예를 들어, 다중특이성 항체, 예를 들어 PCT 공개 WO2009018386, PCT 출원 PCT/US2012/045229, 이후에 참고문헌으로 포함됨), BiSAbs, 인간 항체, 인간화 항체, 카멜화 항체, 단쇄 Fvs(scFv), 단쇄 항체, 단일 도메인 항체, 도메인 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 부분), 디설파이드-결합된 Fvs(dsFv) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체(예를 들어, 본 발명의 항체에 대한 항-Id 항체를 포함함), 인트라바디, 및 상기 중 어느 것의 에피토프-결합 단편을 포함한다. 특히, 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 단편, 즉 하나 이상의 항원-결합 부위를 함유하는 분자를 포함한다. 항체는 또한 Fc 도메인에 융합된 단백질과 같은 항체 또는 그의 일부를 갖는 펩타이드 융합체를 포함한다. 면역글로불린 분자는 임의의 아이소타입(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 하위아이소타입(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 알로타입(예를 들어, Gm, 예를 들어, G1m(f, z, a 또는 x), G2m(n), G3m(g, b, 또는 c), Am, Em, 및 Km(1, 2 또는 3))일 수 있다. 항체는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 토끼, 개, 고양이, 마우스 등의 다른 포유 동물, 또는 조류(예를 들어, 닭)와 같은 다른 동물에서 유래될 수 있다.
CTLA-4
세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA-4)는 활성화된 T 세포 상에서 발현되고, CD28-매개된 T 세포 활성화 후 T-세포 반응을 확인하기 위한 보조-억제제로서 작용한다. CTLA-4는 TCR 교전(engagement) 후 나이브 및 메모리 T 세포의 조기 활성화의 진폭을 조절하고, 항종양 면역 및 자가면역 모두에 영향을 미치는 중추성 억제 경로의 일부인 것으로 여겨진다. CTLA-4는 T 세포 상에만 독점적으로 발현되며, 그의 리간드 CD80(B7.1) 및 CD86(B7.2)의 발현은 주로 항원-제시 세포, T 세포 및 다른 면역 매개 세포로 제한된다. CTLA-4 신호전달 경로를 차단하는 길항성 항-CTLA-4 항체는 T-세포 활성화를 향상시키는 것으로 보고되었다. 그러한 항체 중 하나인 이필리무맙(ipilimumab)은 전이성 흑색종의 치료를 위해 2011년 FDA의 승인을 받았다. 감염 및 종양을 치료하고 적응 면역 반응을 상향-조절하기 위한 항-CTLA-4 항체의 용도는 제안되었다(미국 특허 제6,682,736호; 제7,109,003호; 제7,132,281호; 제7,411,057호; 제7,824,679호, 제8,143,379호 제7,807,797호, 제8,491,895호, 8,883,984 호; 및 미국 공개 번호 제20150104409호 참조, 이후에 전체가 본원에 참고로 포함됨).
PD-L1
프로그램된 죽음 리간드 1(PD-L1)은 또한 T-세포 활성화를 조절하는데 관여하는 수용체 및 리간드의 복합 시스템의 일부이다. 정상 조직에서 PD-L1은 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 대식세포, 간엽 줄기 세포, 골수-유래 비만 세포 뿐만 아니라 다양한 비-조혈 세포에서 발현된다. 그것의 정상적인 기능은 그의 2개의 수용체: 프로그램된 죽음 1(PD-1 또는 CD279라고도 함) 및 CD80(B7-1 또는 B7.1이라고도 함)와의 상호작용을 통해 T-세포 활성화와 내성 사이의 균형을 조절하는 것이다. PD-L1은 또한 종양에 의해 발현되고, 종양이 숙주 면역계에 의한 검출 및 제거를 피할 수 있도록 여러 부위에서 작용한다. PD-L1은 높은 빈도의 다양한 암에서 발현된다. 일부 암에서는 PD-L1의 발현이 와 관련이 있었다. PD-L1과 그의 수용체 사이의 상호작용을 차단하는 항체는 PD-L1-의존성 면역억제 효과를 완화시키고 시험관내에서 항 종양 T 세포의 세포독성 활성을 향상시킬 수 있다. 더발루맙(durvalumab)은 PD-1 및 CD80 수용체 모두에 대한 PD-L1의 결합을 차단할 수 있는 인간 PD-L1에 대한 인간 단클론 항체이다. 감염 및 종양을 치료하고 적응성 면역 반응을 증진시키는 항-PD-L1 항체의 사용이 제안되었다(미국 특허 제8,779,108호 및 제9,493,565호 참조, 이후에 참고문헌으로 본원에 포함됨).
PD-1
프로그램된 죽음-1("PD-1")은 T 세포 조절제의 확장된 CD28/CTLA-4 패밀리의 약 31 kD 타입 I 막 단백질 구성원이다(Ishida, Y. et al. (1992) PD-1의 유도된 발현, 프로그램된 세포 죽음시에 면역글로불린 유전자 상과(Superfamily)의 신규 구성원," EMBO J. 11 :3887-3895.
PD-1은 활성화된 T 세포, B 세포 및 단핵구에서 발현된다(Agata, Y.et al.(1996) "자극된 마우스 T 및 B 림프구의 표면에서의 PD-1 항원의 발현," Int Immunol., 8(5): 765-772; Martin-Orozco, N. et al.(2007) "억제 보조자극 및 항-종양 면역", Semin. Cancer Biol. 17(4): 288-298). PD-1은 PDL-1 또는 PDL-2의 결합에 의한 활성화 후 면역계의 하향-조절에 관여하는 수용체이고(Martin-Orozco, N.et al.(2007) "억제성 보조자극 및 항-종양 면역" Semin. Cancer Biol., 17(4): 288-298), 세포 사멸 유도제로서 기능한다(Ishida, Y. et al. (1992) "PD-1의 유도된 발현, 프로그램된 세포 죽음시에 면역글로불린 유전자 상과(Superfamily)의 신규 구성원," EMBO J. 11 :3887-3895; Subudhi, S.K. et al. (2005) "면역반응의 균형: 상호자극 대 상호억제," J. Molec. Med. 83: 193-202).　본 과정은 PD-1의 과-발현을 통해 많은 종양에서 이용되어 면역 반응이 억제된다.
PD-1은 흑색종 및 비-소세포 폐암(NSCLC)의 치료에서의 임상 시험으로부터의 긍정적인 결과와 함께 종양학에서 면역 매개된 치료에 대한 잘 입증된 표적이다. PD-1/PD-L-1 상호작용의 길항적 억제는 T-세포 활성화를 증가시켜, 숙주 면역계에 의한 종양 세포의 인식 및 제거를 향상시킨다. 감염 및 종양을 치료하고 적응 면역 반응을 향상시키기 위한 항-PD-1 항체의 사용이 제안되었다(미국 특허 제7,521,051호; 제7,563,869호; 제7,595,048호 참조).
OX40
OX40(CD134; TNFRSF4)은 주로 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T 세포, 조절 T(Treg) 세포 및 자연 살해(NK) 세포에서 발견되는 종양 괴사 인자 수용체이다(Croft et al., 2009, Immunol Rev. 229:173-91). OX40은 삼량체 형태로 존재하며, OX40을 클러스터링할 수 있어, T 세포 내에서 강력한 세포 신호전달 사건을 유발하는 것으로 알려진 하나의 내인성 리간드 OX40 리간드(OX40L; CD152; TNFSF4)를 갖는다. Id. 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 OX40을 통한 신호전달은 향상된 사이토킨 생성, 그랜자임 및 퍼포린 방출 및 이펙터 및 메모리 T 세포 풀의 확장을 초래한다(Jensen et al., 2010, Semin Oncol. 37:524-32). 또한, Treg 세포에서의 OX40 신호전달은 Tregs의 확장을 억제하고, Tregs의 유도를 셧다운하며, Treg-억제 기능을 차단한다(Voo et al., 2013, J Immunol. 191:3641-50; Vu et al., 2007, Blood. 110:2501-10 참조).
면역조직화학적 연구 및 초기 유동 세포계측법 분석은 OX40이 광범위한 범위의 인간 암에 침투하는 T 세포에서 발현됨을 보여주었다(Baruah et al., 2011, Immunobiology 217:668-675; Curti et al, 2013, Cancer Res. 73:7189-98; Ladanyi et al, 2004, Clin Cancer Res. 10:521-30; Petty et al, 2002, Am J Surg. 183:512-8; Ramstad et al, 2000, Am J Surg. 179:400-6; Sarff et al, 2008, Am J Surg. 195:621-5; discussion 625; Vetto et al, 1997, Am J Surg. 174:258-65). 이론에 구속되기를 바라지는 않지만, 종양-침윤 림프구에서의 OX40 발현은 여러 인간 암에서 더 긴 생존과 관련이 있으며, 이는 OX40 신호가 항 종양 면역 반응을 확립하는데 중요한 역할을 할 수 있음을 시사한다((Ladanyi et al., 2004, Clin Cancer Res. 10:521-30; Petty et al., 2002, Am J Surg. 183:512-8).
다양한 비 임상 마우스 종양 모델에서, 항체 및 OX40 리간드 융합 단백질을 포함하는 OX40의 작용제가 유망한 결과와 함께 성공적으로 사용되어왔다(Kjaergaard et al., 2000, Cancer Res. 60:5514-21; Ndhlovu et al., 2001, J Immunol. 167:2991-9; Weinberg et al., 2000, J Immunol. 164:2160-9). OX40을 통해 T 세포를 동시자극하면 항-종양 활성이 촉진되는 경우가 있었으며, 이는 이후의 종양 유발에 대한 장기간의 보호를 제공했다(Weinberg et al., 2000, J Immunol. 164:2160-9). Treg-세포 저해와 이펙터 T 세포의 동시자극은 OX40 작동제의 종양 성장 억제에 필수적인 것으로 나타났다(Piconese et al., 2008, J Exp Med. 205:825-39). 백신, 화학요법, 방사선치료 및 면역요법과의 조합을 통해 OX40 작동제의 항-종양 효과를 향상시키기 위한 많은 전략과 기술이 연구되어왔다(Jensen et al., 2010, Semin Oncol. 37:524-32; Melero et al., 2013, Clin Cancer Res. 19:997-1008). 감염 및 종양을 치료하고 적응 면역 반응을 상향-조절하기 위한 항-OX40 항체의 사용이 제안되었다(미국 공개 번호 제20160137740호 참조, 그 전체가 본원에 참고로 포함됨).
TIM3
T-세포 억제성 수용체 Tim-3(T-세포 면역글로불린 및 뮤신-도메인 함유-3)은 IFN-γ 생성 CD4+ 헬퍼 1(Th1) 및 CD8+ T 세포독성 1(Tc1) T 세포에서 발현됨으로써 항 종양 면역을 조절하는 역할을 한다. 처음에는 Th1 및 Tc1 T-세포 반응의 지속 기간 및 규모를 제한하기 위해 특이적으로 기능하는 면역 체크포인트 수용체 역할을 하는 T-세포 억제 수용체로 확인되었다. 추가의 연구에 따르면 Tim-3 경로가 PD-1 경로와 협력하여 암의 CD8+ T 세포에서 심각한 기능장애 표현형의 발달을 촉진할 수 있다고 밝혀졌다. 또한 특정 암에서 조절 T 세포(Treg)에서도 발현된다. 일부 암에서 면역억제된 주요 면역 세포 집단에서 TIM3 경로의 관련성을 고려할 때, 이는 면역-종양학 치료를 위한 매력적인 후보자이다. Anderson, A.C., Cancer Immunol Res., (2014) 2:393-398; and Ferris, R.L., et al., J Immunol. (2014) 193:1525-1530을 참조한다.
A. 이중특이성 결합 단백질
단일 결합 도메인에 대한 특이성을 갖는 분자에 다수의 결합 부위를 첨가하는 것은 분자의 능력(예를 들어, 치료학적, 진단적 등)을 크게 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 이중특이성 항체는 동일한 표적 생체분자의 하나 이상의 영역에 결합할 수 있으며, 표적상의 단지 하나의 에피토프에 결합하는 단일-특이적 폴리펩타이드보다 더 큰 특이성을 부여한다. 대안적으로, 이중특이성 항체는 다중 표적 생체분자, 예컨대 복합체 내에 존재하는 표적, 또는 격리 및/또는 클러스터링이 요구되는 표적에 결합할 수 있다. 세 번째 시나리오에서, 동일한 이중특이성 항체는 그의 표적 분자의 국소화 및/또는 발현에 따라, 임의의 주어진 시간에 별개의 기능을 수행할 수 있다.
신규한 결합 단백질이 본원에 기재되어있다. 이러한 새로운 결합 단백질의 한 가지 구성을 "DuetMab"이라고 한다. DuetMab은 이하의 기본 구조를 갖는다: 변형된 중쇄로서, 상기 변형된 중쇄의 CH1 영역은 천연 시스테인의 비-시스테인 아미노산으로의 치환, 및 천연 비-시스테인 아미노산의 시스테인 아미노산으로의 치환을 갖는 중쇄; 변형된 대응 경쇄로서, 변형된 경쇄의 CL 영역이 천연 시스테인의 비-시스테인 아미노산으로의 치환 및 천연 비-시스테인 아미노산의 시스테인 아미노산으로의 치환을 갖는 경쇄를 갖는 Fc 영역; 제2 중쇄; 및 대응하는 제2 변형된 경쇄를 갖는 제2 Fc 영역으로서, 변형된 중쇄가 상응하는 변형된 경쇄에, 및 별도의 표적 결합 아암 상에 직접 연결되며, 제2 중쇄는 제2 상응하는 경쇄에 직접 결합되고, 천연 비-시스테인 아미노산의 시스테인 아미노산으로의 치환에 기인하는 변형된 중쇄의 치환된 시스테인, 및 천연 비-시스테인 아미노산의 시스테인 아미노산으로의 치환에 기인하는 변형된 대응하는 경쇄의 치환된 시스테인이 디설파이드 결합을 형성할 수 있는 영역. DuetMab과 관련된 개시는, 예를 들어, 본 명세서에서 그 전체가 참고로 포함된 미국 특허 제9,527,927호에서 찾을 수 있다.
이들 신규한 결합 단백질의 추가적인 예시적 구성은 "BiSAb" 또는 "BiSAbs"로 지칭된다. 예시적인 BiSAb의 개략적인 표현뿐만 아니라 특정 BiSAb의 특정 예가 본 명세서에서 제공된다. 보다 일반적으로, BiSAb는 2개의 결합 단위를 함유하는 폴리펩타이드이며, 이들 각각은 에피토프에 결합한다(예를 들어, 결합 단위 1은 제1 에피토프에 결합하고, 결합 단위 2는 제2 에피토프에 결합한다). 염기성 BiSAb는 2개의 에피토프 각각에 결합하는 2가이다.(예를 들어, 폴리펩타이드가 2개의 결합 단위 1("BD1" 또는 "BU1") 및 2개의 결합 단위 2("BD2" 또는 "BU2")를 포함함) 따라서, 결합 단위 1 및 2가 상이한 에피토프를 결합하는 경우, BiSAb는 통상적인 이중특이성 항체의 다중-특이성 및 통상적인 항체 분자의 2가성을 갖는다. 결합 단위 1 및 2가 동일한 에피토프를 결합하는 구현예에서, BiSAb는 통상적인 항체의 단일특이성을 갖지만 4가이다. 결합 단위 이외에, BiSAb는 또한 링커 폴리펩타이드 및 Fc 부분을 포함한다. 본원은 광범위한 이중특이성 결합 단백질 세트, 예컨대 면역 반응을 조절하는 분자를 표적화하는 BiSAb 및 BiSAb 코어를 포함하는 단백질에 관한 것이다. 일반적으로, 본원에 기재된 신규한 결합 단백질 플랫폼 및 예시적인 이중특이성 결합 단백질(BiSAb)은 결합 단위/도메인, 링커 폴리펩타이드 및 Fc 부분을 포함한다. 본원은 또한 그러한 BiSAb를 코딩하는 핵산 분자뿐만 아니라 그러한 핵산을 포함하고 상기 BiSAb의 생산 및 사용 방법에 사용될 수 있는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. BiSAb, BiSAb 코어를 포함하는 결합 단백질 및 BiSAb의 다양한 부분은 본원에서 보다 상세히 기술된다.
일부 양태에서, BiSAb는 특이적 결합 단백질(즉, 항체)로부터 유도된 2개의 중쇄-경쇄 쌍을 포함할 수 있으며, 중쇄 및 경쇄는 각각 가변 영역(예를 들어, VL 및 VH)을 포함하며, 이들은 함께 제1 결합 단위를 형성하며, 상기 중쇄는 각각 제2 결합 단위(예를 들어, Fc 또는 Fab에 부착된 scFv 도메인)를 추가로 포함한다. 제1 및 제2 결합 단위가 상이한 에피토프에 결합하는 경우, 각 중쇄-경쇄 쌍은 이중 특이적이며, 두 쌍은 함께 각 에피토프에 대해 2가이다. 제1 및 제2 결합 단위가 동일한 에피토프에 결합하는 경우, 각각의 중쇄-경쇄 쌍은 단일특이적이며, 두 쌍은 함께 에피토프에 대해 4가이다. 일부 양태에서, 2개의 중쇄-경쇄 쌍이 동일하다. 일부 양태에서, 2개의 중쇄-경쇄 쌍은 동일하지 않다.
특정 구현예에서, BiSAb의 도메인은 공지된 면역글로불린 도메인에 기초할 수 있다. 단클론 항체(mAb)와 같은 면역글로불린 분자는 진단 및 치료제로서 널리 사용되며, mAb의 결합 단편을 조작하는 방법은 당 분야에 잘 알려져있다. 모든 면역글로불린 분자와 마찬가지로 단클론 항체는 결합 특이성(가변 도메인) 및 아이소타입(불변 도메인)을 부여하는 가변 및 불변 도메인을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄 펩타이드 서브유닛으로 구성된다.
본원에 개시된 BiSAb는 통상적인 항체와 유사한 전체 구조를 가질 수 있지만, Fab 도메인 내의 위치에 부착된 추가의 결합 단위의 존재에 의해 구별될 수 있고, Fab 도메인으로부터 떨어진 위치에 부착되며, 힌지(Hinge) 또는 Fc 영역(예를 들어, CH2, CH3 또는 CH4 영역 내 또는 CH2-CH3 계면와 같은 영역의 계면)에 존재할 수 있다. 따라서, 단일 에피토프에 결합하기 위해 2가인 통상적인 항체와는 달리, BiSAb는 2개의 에피토프에 결합하기 위해 2가이다. 그러나, 본원에 기재된 바와 같이, BiSAb는 FcRn에 결합하는 능력 및 C1q 및 Fcγ 수용체에 결합하는 능력(예를 들어, 항체 및 보체 의존성 세포독성을 매개하는 능력을 나타냄)과 같은 종래의 항체의 수많은 바람직한 특성을 여전히 유지할 수 있다.
본원에 기술된 결합 도메인은 Fab, F(ab')2, Fab', scFv, di-scFv, sdAb 단편과 같은 mAb 단편의 일부만을 함유하는 항원 결합 단편을 포함할 수 있으며, 상기 단편은 진단 또는 치료제로서 사용되는 것으로 밝혀졌다. 또한, 가변 도메인 내의 특정 잔기는 항체 및 항체 단편의 결합 특이성 및/또는 안정성을 개선시키기 위해 변경될 수 있다. 항체 결합에 직접적으로 관여하지 않는 다른 잔기는 비-인간 항체의 영역을 "인간화"하고 mAb의 면역원성을 감소시키기 위해 대체될 수 있다.
BiSAb가 통상적인 항체와 다르긴 하지만, 예를 들어, 이들은 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합을 위해 2가(또는 단일 에피토프에 대한 결합을 위해 4가)인 반면, BiSAb의 부분 중 많은 부분은 통상적인 항체의 부분으로부터 유래되거나 이와 유사하다. 당 분야에 공지된 임의의 mAb 도메인 및/또는 단편이 본 명세서에 기재된 BiSAb에 사용될 수 있다. 특히, BiSAb는 Fab 및/또는 scFv 단편, 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. scFv의 예시적인 비-제한적 변이체는 탠덤 디-scFv, 탠덤 트라이-scFv, 디아바디 및 트라이(a)체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 일반적으로 BiSAb가 예시적인 예인, 신규 결합 단백질에 관한 것이다. 추가적인 예는 BiSAb 코어뿐만 아니라 확장된 BiSAb 코어를 포함하는 하나 이상의 추가 결합 단위 및/또는 결합 단백질을 포함하는 결합 단백질이다. BiSAb 또는 BiSAb의 특징이 본 명세서에 기술될 때마다, 이러한 설명은 결합 단백질이 2개의 결합 단위 또는 3개 이상의 결합 단위를 포함하는지 여부에 관계없이 본 발명의 신규한 결합 단백질에 일반적으로 적용된다는 것을 이해해야한다. 따라서, BiSAb라는 용어는 본원에 기재된 결합 단백질의 예이며, 문맥에 따라 BiSAb에 대한 그러한 언급은 BiSAb 코어를 포함하는 결합 단백질을 기술하는데 사용될 수도 있다.
신규한 BiSAb 구조 플랫폼.
일 양태에서, 본 발명은 도 1a-1f의 개략도에 의해 일반적으로 예시되는 도메인을 포함하는 구조적 플랫폼을 갖는 BiSAb 결합 단백질을 제공한다. 이들 도면은 예시적인 것이며, 따라서 추가의 잔기 사이의 삽입도 개시된 결합 단백질의 범위 내에 있다. 도 1a-1c는 PyMOL을 사용하여 모델링된 IgG1의 CH2-CH3 계면에서의 항체의 Fc 영역을 도시하고, 본 발명의 몇 가지 예시적인 BiSAb를 예시한다. IgG 또는 제2 결합 잔기의 구조적 완전성 또는 안정성을 손상시키지 않으면서 제2 결합 모이어티(예컨대, scFv)의 삽입을 견딜 수 있는, CH2-CH3 계면에서 또는 그 부근에서 3개의 표면 노출 루프가 확인되었다. 도 1a는 CH2-CH3 계면 근처의 CH2 영역에서 확인된 하나의 그러한 대표적인 루프 ISRTP(SEQ ID NO:39)의 개략도이다. 도 1d는 또한 ISRTP 루프의 S와 R 사이에 scFv가 삽입되는 대표적인 구조인 IS-scFv-RTP를 보여준다. 도 1b는 CH2-CH3 계면에서 확인된 대표적인 루프 AKGQP(SEQ ID NO:40)의 개략도이다. 도 1e는 대표적인 구조물 AK-scfv-GQP를 도시하며, 여기에서 scFv는 AKGQP 루프의 K와 G 사이에 삽입된다. 도 1c는 CH2-CH3 계면의 CH3 영역 다운스트림에서 확인된 대표적인 루프 SNG의 개략도이다. 도 1f는 또한 SNG 루프의 S와 N 사이에 scFv가 삽입된 대표적인 구조물 S-scfv-NG를 보여준다. 본원의 실시예는 SN-scFv-G로 지향된 구조물의 설명을 제공하며, 여기에서 scFv는 SNG 루프의 N과 G 사이에 삽입된다.
따라서, 본원의 일 양태는 2개의 동일한 중쇄-경쇄 쌍을 포함하는 BiSAb에 관한 것이며, 여기서 각각의 중쇄-경쇄 쌍은 이중특이적이며, 2개의 동일한 쌍은 각각의 에피토프에 대해 함께 2가이다. 각각의 중쇄-경쇄 쌍은 제1 에피토프(결합 단위 1)에 결합하는 Fab 도메인, 제2 에피토프(또는 예를 들어, scFv일 수 있는 결합 단위 2) 및 Fc 영역을 포함하는 제2 결합 도메인(BD2)을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 결합 도메인은 Fab 도메인과 관련될 수 있다. 일부 구현예에서, BiSAb의 Fc 영역은 제2 에피토프(결합 단위 2; 도 1d-1f에서 scFv로 도시됨)와 결합하는 제2 결합 도메인(BD2)과 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원은 2개의 키메라 중쇄를 포함하는 일반적인 플랫폼 구조를 갖는 BiSAb를 제공하며, 각각은 중쇄 가변 영역(VH1), 중쇄 불변 영역(CH1), 힌지 또는 폴리펩타이드 링커 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 Fc 영역을 포함하며, 폴리펩타이드 링커(L1 및/또는 L2)에 의해 일면 또는 양면에 선택적으로 인접한 제2 결합 도메인(BD2)은 (ⅰ) CH2 영역, (ⅱ) CH2 및 CH3 영역의 계면, 또는 (ⅲ) CH3 영역의 순서로 Fc 영역의 용매 노출된 루프와 결합된다. 본 발명의 이 양태의 BiSAb는 또한 각각이 제1 결합 도메인(BD1)의 일부를 형성하는 경쇄 가변 영역(VL1) 및 경쇄 불변 영역(CL)을 포함하는 2개의 통상적인 항체 경쇄를 포함한다. 도 1d-1f에 예시된 특정 BiSAb의 결합 도메인(BD2)은 scFv이다.
도 1d-1f는 본 명세서에서 BiSAb "코어"로도 지칭될 수 있는 BiSAb의 유용한 개략도를 제공한다. 도 1d에 나타낸 바와 같이, 폴리펩타이드 사슬은: VH1 도메인, CH1 도메인, 힌지/링커, 부분 N-말단 CH2 도메인, 임의의 링커(본원에서 L1 또는 제1 폴리펩타이드로 지칭됨), 결합 단위 2(예컨대, scFv의 VL2 및 VH2), 또 다른 임의의 링커(예를 들어, L2 또는 제2 폴리펩타이드 링커), 남은 C-말단 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 갖는 중쇄를 포함한다. 이 중쇄는 대안적인 결합 단백질 및/또는 전통적인 경쇄 영역을 갖는 BD2를 포함할 수 있기 때문에, 본 명세서에서는 키메라 중쇄라고 칭한다. BiSAb는 2개의 상기 키메라 중쇄를 포함하며, 이들은 동일하거나 상이할 수 있다. 결합 단위 1에 대한 가변 중쇄 도메인(VH)은 VH1로 언급됨에 유의한다. 특정 양태에서, 이것은 제1 에피토프에 결합하는 Fab의 가변 중쇄이다. 유사하게, 결합 단위 1에 대한 가변 경쇄 도메인(VL)은 VL1이라 칭한다. 특정 양태에서, 이것은 제1 에피토프에 결합하는 Fab의 가변 경쇄이다. 대조적으로, 결합 단위 2가 제2 에피토프에 결합하는 scFv인 양태에 대해서는 VH2 및 VL2와 같이, 숫자 "2"로 표시된다.
유사하게, 도 1e에 나타낸 바와 같이, 폴리펩타이드 사슬은 VH1 도메인, CH1 도메인, 힌지/링커, CH2 도메인, 임의의 링커(본 명세서에서 L1 또는 제1 폴리펩타이드 링커), 결합 단위 2(예컨대, scFv의 VL2 및 VH2), 또 다른 임의의 링커(예를 들어, L2 또는 제2 폴리펩타이드 링커), 및 CH3 도메인을 갖는 중쇄를 포함한다. 이 구현예에서, BiSAb는 CH2 및 CH3 영역의 계면에서의 서열에서 Fc와 결합된 scFv로 예시된 제2 결합 도메인을 포함한다.
도 1f에 나타낸 바와 같이, 폴리펩타이드 사슬은 VH1 도메인, CH1 도메인, 힌지/링커, CH2 도메인, 부분 CH3 도메인, 임의의 링커(본 명세서에서 L1 또는 제1 폴리펩타이드 링커로 지칭됨), 결합 단위 2(예컨대, scFv의 VL2 및 VH2), 또 다른 선택적인 링커(예를 들어, L2 또는 제2 폴리펩타이드 링커), CH3 도메인을 갖는 중쇄를 포함한다.
상기 구현예에서, BiSAb는 전형적으로 키메라 중쇄 서열에서 전형적 또는 변형된 항체 힌지 영역을 포함한다. 힌지 영역을 함유하는 아미노산 서열의 비-제한적 예로는 EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:44); EPKSCDKT(SEQ ID NO:45); EPKSCGKT(SEQ ID NO:46); EPKSC(SEQ ID NO:47)가 포함된다.
본 명세서에 개시된 특정 BiSAb 분자에 대한 특정 구조적 플랫폼과 관련된 양태에 대한 일반적인 포맷을 기술하였으므로, 개시된 BiSAb의 다양한 부분 및 예시적인 기능적 특성이 하기에서 보다 상세히 설명된다. 다른 구현예에서, 본원은 본원에서 간략하게 기재되는 대안적인 구조적 형태 및 배열뿐만 아니라 다른 개시 물(예를 들어, 미국 공개 번호 제20090155275호 및 미국 특허 제9,580,509호 참조)을 포함하는, 다른 BiSAb 결합 단백질을 고려하고 제공하며, 이들 각각은 본원에 참고문헌으로 포함된다.
1. 결합 단위
본 발명의 BiSAb는 2개 이상의 결합 단위 또는 결합 도메인(결합 단위/도메인 1 및 결합 단위/도메인 2)을 포함한다. 특정 양태에서, 각각의 결합 단위는 상이한 표적 분자 상에 위치한 상이한 에피토프 또는 상이한 표적상의 에피토프 중 어느 하나의 상이한 에피토프에 결합한다. BiSAb의 각 결합 단위가 한 쌍(2개의 결합 단위 1과 2개의 결합 단위 2가 있음)으로 존재하기 때문에 BiSAb는 각 에피토프에 2가 결합을 나타낸다. 각각의 결합 단위가 동일한 에피토프에 결합하는 경우, BiSAb는 에피토프에 대한 4가 결합을 나타낼 것이라는 것을 본원의 교시로부터 이해할 것이다.
특정 양태에서, 제1 결합 단위는 Fab 단편, 예를 들어, 가변 경쇄(VL1), 불변 경쇄(CL), 가변 중쇄(VH1) 및 불변 중쇄 부분(CH1)을 포함하는 통상적인 단클론 항체의 Fab 단편 또는 재조합 제조된 항원결합 단편이다. 선택적으로, Fab의 경쇄 및 중쇄는 예를 들어 적합한 항체 힌지 영역을 통한 하나 이상의 디설파이드 결합을 통해 상호연결될 수 있다. Fab는 제1 에피토프에 결합한다.
특정 양태에서, Fab는 통상적인 뮤린, 인간화, 또는 인간 항체와 같은 통상적인 단클론 항체의 서열로부터 유래되거나, 이에 기반으로 한다. 특정 양태에서, 통상적인 단클론 항체의 서열로부터 유래된 또는 이를 기반으로 한 Fab을 함유하는 BiSAb는 통상적인 항체의 하나 이상의 기능성 활성을 보유한다(예를 들어, 기능적 활성의 적어도 80% 이상(80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%) 보유). 예를 들어, 특정 양태에서, 상기 Fab를 함유하는 BiSAb는 통상적인 항체의 항원에 대한 친화도, 억제 활성, 면역계 조절 활성, 면역 반응의 활성화 또는 유도, 및/또는 세포(예를 들어, 암 세포) 살해 활성 중 하나 이상을 보유한다.
특정 양태에서, 본 발명의 BiSAb는 결합 단위 2를 포함하고, 결합 단위 2는 제2 에피토프를 결합시키는 결합 도메인을 포함한다. 결합 단위 2(또는 결합 도메인 2(BD2))는 임의의 적합한 전략을 사용하여 BiSAb와 결합될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, (예를 들어, 일부 구현예에서 Fc 영역 내에, 다른 구현예에서 Fab 영역 내에) BiSAb와 "결합된" BD2는 BD2가 Fc 부분 또는 BiSAb 구조의 Fab 부분과의 결합 및 표적 결합에 대한 배향을 보유하도록 이들 두 분자 사이에 상호작용을 한다는 것을 의미한다. 이러한 상호작용의 예는 아미노산 링커를 통한 공유 결합, Fab 영역 내, 힌지 영역 내 또는 CH2, CH3, 또는 CH2와 CH3의 계면, 또는 CH4 영역에서의 Fc 영역 내에서의 BD2의 재조합 발현을 통한 공유 결합 및 상기 동일한 영역들 사이의 반 데르 발스(van der Waals) 및 수소 결합 상호작용과 같은 비-공유 상호작용을 포함한다. 본 발명의 범주 내에 속하는 결합 도메인(또는 "BD" 또는 "결합 단위")의 비-제한적인 예는 항체 가변 영역, 항체 단편, scFv, 단일 사슬 디아바디 또는 당 분야에 공지된 다른 결합 도메인을 포함한다. 결합 도메인은 또한 2개의 특이적 에피토프를 결합하도록 고안된 이중특이성 단일 사슬 디아바디 또는 단일 사슬 디아바디를 포함한다. 일 양태에서, 본원의 다중특이적 에피토프 결합 도메인의 구축에 유용한 에피토프 결합 도메인은 US20100298541 및 US20130079280에 예시되어 있으며, 이들은 이후에 모든 목적으로 참고문헌으로 포함된다.
특정 양태에서, BiSAb는 scFv를 포함하는 결합 도메인을 포함할 수 있다. 따라서, 특정 양태에서, 결합 단위 2는 scFv를 포함한다. scFv는 가요성 폴리펩타이드 링커를 통해 가변 경쇄 도메인(VL)에 연결된 가변 중쇄 도메인(VH)을 포함하는 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 것으로 이해된다. 도 1d-1f는 예시적인 BiSAb의 개략도를 도시하며, 여기서 BD(여기서, 결합 단위 2로 나타냄)는 VL2 및 VH2로 명명될 수 있는 본원에 기재된 도메인을 갖는 scFv이다. 일부 양태에서, VH2와 VL2 사이의 폴리펩타이드 링커는 프로테아제 절단 부위를 포함한다. scFv의 VH 및 VL 도메인은 동일하거나 상이한 항체로부터 유래될 수 있다. 몇몇 양태에서, scFv의 VH 또는 VL은 관심의 표적에 결합하는 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있는 반면, VH 또는 VL 도메인의 나머지 부분은 다른 항체로부터 유래되거나, 또는 합성이다. 일부 양태에서, scFv는 항체, 예를 들어, 관심의 표적에 결합하는 당 분야에 공지된 항체의 적어도 하나의 CDR을 포함한다. 일부 양태에서, scFv는 주어진 항체의 적어도 2개의 CDR을 포함한다. 일부 양태에서, scFv는 주어진 항체의 적어도 3개의 CDR을 포함한다. 일부 양태에서, scFv는 주어진 항체의 적어도 4개의 CDR을 포함한다. 일부 양태에서, scFv는 주어진 항체의 적어도 5개의 CDR을 포함한다. 일부 양태에서, scFv는 주어진 항체의 적어도 6개의 CDR을 포함한다.
특정 양태에서, BD는 수용체의 리간드 결합 도메인 또는 리간드의 수용체 결합 도메인을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, BD는 상기 기술된 바와 같이, CTLA-4, PD-1, PD-L1, OX40 및 TIM3으로 구성된 그룹으로부터 선택된 표적 상의 하나 이상의 에피토프에 대한 결합 친화도를 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 도메인은 CTLA-4, PD-1, PD-L1, OX40 및 TIM3으로 구성된 그룹으로부터 선택된 표적에 대해 특이적 결합 활성을 나타낸다. 본원에 개시된 BiSAb는 본원에 개시된 분자 표적에 대한 결합 친화력 또는 특이적 결합 활성을 갖는 결합 도메인의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 BiSAb는 CTLA-4 및 PD-1; CTLA-4 및 PD-L1; CTLA-4 및 TIM3; PD-1 및 PD-L1; PD-L1 및 OX40; PD-1 및 TIM3; PD-L1 및 TIM3; 및 TIM3을 포함하는, 표적에 대한 이중특이성 결합을 허용하는 결합 도메인의 조합을 포함할 수 있다. 특정 표적 조합에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 BiSAb는 실시예에 예시되어 있으며, PD-1/CTLA-4; PD-L1/CTLA-4; PD-1/OX40; PD-L1/OX40; 및 PD-1/TIM3의 비-제한적인 조합을 포함한다.
일부 추가의 구현예에서, BiSAb는 BiSAb를 생성시키는데 사용된 모체 단일특이적 결합 서열의 결합 활성이 더 큰 표적 분자 중 적어도 하나에 대한 결합 활성(예를 들어, 결합 친화력 및/또는 결합 특이성)을 나타낸다. 유사한 양태에서, BiSAb는 BiSAb를 생성시키는데 사용된 모체 단일특이적 결합 서열 모두의 결합 활성보다 큰 표적 분자 둘 다에 대한 결합 활성(예를 들어, 결합 친화력 및/또는 결합 특이성)을 나타낼 수 있다. 또 다른 구현예에서, BiSAb는 BiSAb를 생성시키는데 사용된 단일특이적 결합 서열의 조합에 대한 결합 활성보다 큰 표적 분자 둘 다에 대한 결합 활성(예를 들어, 결합 친화력 및/또는 결합 특이성)을 나타낼 수 있다. 모체 단일특이적 결합 서열에 비하여 BiSAb의 결합 성질을 단독으로 또는 조합하여 향상시킴으로써, 조합하여 사용하는 경우에도 동일한 분자를 표적화하는 단일특이적 치료제의 사용에 비해 예상치 못한 이점을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 CTLA-4, PD-1, PD-L1, OX40 및 TIM3으로 구성된 그룹으로부터 선택된 표적에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 이러한 구현예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 중쇄 서열 및 경쇄 서열, 또는 중쇄 및 경쇄 서열의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 서열 및 경쇄 서열의 일부를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 가변(HCv) 영역 서열 및 경쇄 가변(LCv) 영역 서열, 또는 중쇄 및 경쇄 서열의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 HCv 및 LCv의 일부를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 중쇄 및 경쇄 서열의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 키메라성, 인간화된 또는 인간 항체일 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 다중클론 항체 또는 단클론 항체일 수 있다. 추가의 구현예에서, 항체는 단클론 항체이다.
일부 구현예에서, 상기 논의된 바와 같은 상기 "모체(parental)" 항체의 항원 결합 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 도메인이 사용되어, 본원에 개시된 이중특이성 결합 단백질(BiSAb)을 생성시킬 수 있다. 실시예에 예시된 비-한정적인 구현예는 항체 서열이 분자 표적의 조합물에 대한 이중특이성 결합을 나타내는 BiSAb를 생성하기 위해 어떻게 동정되고 조합될 수 있는지에 관한 설명을 제공한다.
scFv 분자를 포함하는 BiSAb의 안정성을 향상시키기 위해 여러 방법론이 단독으로 또는 조합되어 사용될 수 있다. 단독으로 또는 본원에 기술된 다른 방법론 중 하나 이상과 조합하여 사용될 수 있는 하나의 가능한 방법론은 scFv 부분을 안정화시키기 위해 scFv 도메인을 연결하는 링커의 길이 및/또는 조성을 조작한다.
사용될 수 있는 또 다른가능한 방법은 디설파이드 결합 형성을 촉진시키기 위해 scFv의 VH 및/또는 VL 도메인에 적어도 2개의 아미노산 치환(변형 또는 돌연변이라고도 함)을 도입하는 것이다(예를 들어 Brinkmann et al., 1993, PNAS, 90:7538-42; Zhu et al., 1997, Prot. Sci. 6:781-8; Reiter et al., 1994, Biochem. 33:5451-9; Reiter et al., 1996, Nature 14: 1239-45; Luo et al., 1995, J. Biochem. 118:825-31; Young et al., 1995, FEBS Let. 377:135-9; Glockshuber et al., 1990, Biochem. 29:1362-7 참조). 이 방법은 단독으로 또는 본원에 기술된 다른 방법 중 하나 이상과 조합하여 사용될 수 있다.
특정 양태에서, 하나 이상의 돌연변이가 scFv를 포함하는 BiSAb의 발현시 VH 및 VL 도메인 사이의 사슬간 디설파이드 결합 형성을 촉진시키기 위해 scFv의 VH 및 VL 도메인 각각에 도입될 수 있다. 또 다른 양태에서, 2개의 돌연변이는 사슬의 동일한 도메인에 도입된다. 특정 양태에서, 2개의 돌연변이는 서로 다른 사슬에 도입된다. 특정 양태에서, 다중 상보적 돌연변이가 도입되어 다중 디설파이드 결합 또는 다른 안정화 상호작용의 형성을 촉진시킨다. 특정 양태에서, 시스테인은 디설파이드 결합 형성을 촉진시키기 위해 도입된다. 시스테인으로 돌연변이될 수 있는 예시적인 아미노산은 VH2의 아미노산 43, 44, 45, 46, 47, 103, 104, 105, 및 106 및 VL2의 아미노산 42, 43, 44, 45, 46, 98, 99, 100, 및 101을 포함한다. 전술한 넘버링은 scFv의 VH2 및 VL2에 대해서만 관련있고 (및 본원에서 제공된 BiSAb 또는 SEQ ID NO의 전장 서열에서 아미노산의 위치와 관련이 없는) 위치를 확인하는 Kabat 넘버링에 기초한다. 시스테인 잔기로 돌연변이될 수 있는 아미노산 위치의 예시적인 조합은: VH44-VL100, VH105-VL43, VH105-VL42, VH44-VL101, VH106-VL43, VH104-VL43, VH44-VL99, VH45-VL98, VH46-VL98, VH103-VL43, VH103-VL44, 및 VH103-VL45를 포함한다. 일부 양태에서, VH의 아미노산 44 및 VL의 아미노산 100은 시스테인으로 돌연변이된다.
단독으로 또는 본원에 기재된 다른 방법 중 하나 이상과 조합하여 사용될 수 있는 또 다른 방법은 scFv 도메인의 순서를 선택하는 것이다. 특정 양태에서, VL 도메인에 대한 VH 도메인의 배향은 안정성을 위해 최적화된다. 특정 양태에서, scFv는 VH-링커-VL 배향이다. 특정 양태에서, scFv는 VL-링커-VH 배향이다. 본원에 개시된 신규한 BiSAb 포맷에 관한 구현예에서, scFv에서 도메인의 배향은 scFv가 BiSAb의 Fc 부분과 어떻게 결합하는지를 결정할 수 있다. 이것은 폴리펩타이드 링커의 문맥에서 보다 상세히 후술된다. 그러나 간단하게는, BD(예를 들어, scFv)가 임의의 폴리펩타이드 링커(L1) 및 (L2)에 의해 CH2, CH3 또는 CH2와 CH3의 계면에 연결되어 있다면, 도메인의 순서는 scFv의 어느 부분이 L1에 상호연결되고 scFv의 어느 부분이 L2에 상호연결되는지를 결정한다.
단독으로 또는 본원에 기술된 다른 방법과 조합하여 사용될 수 있는 추가의 방법은 scFv의 하나 이상의 표면 잔기를 돌연변이시킴으로써 하나 이상의 안정화 돌연변이를 도입하는 것이다. 일부 양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 6개 초과의 잔기가 scFv의 VH 및/또는 VL 도메인 중 하나 또는 둘 다에서 돌연변이된다. 특정 양태에서 scFv의 VH 도메인에서만 변화가 이루어진다. 특정 양태에서, 변화는 scFv의 VL 도메인에서만 이루어진다. 특정 양태에서, scFv의 VH 및 VL 도메인 모두에서 변화가 이루어진다. 각 도메인에서 동일한 수의 변화가 이루어지거나, 각 도메인에서 다른 수의 변화가 이루어질 수 있다. 특정 양태에서, 하나 이상의 변화는 변형되지 않은 모체 scFv에 존재하는 잔기로부터의 보존적 아미노산 치환이다. 다른 양태에서, 하나 이상의 변화는 변형되지 않은 모체 scFv에 존재하는 잔기로부터의 비-보존적 아미노산 치환이다. scFv의 VH 또는 VL 도메인 중 하나 또는 둘 다에서 다수의 치환이 수행되는 경우, 각각의 치환은 독립적으로 보존적 또는 비-보존적 치환이다. 특정 양태에서, 모든 치환은 보존적 치환이다. 특정 양태에서, 모든 치환은 비-보존적이다. 특정 양태에서, 치환 중 적어도 하나는 보존적이다. 특정 양태에서, 적어도 하나 또는 치환은 비-보존적이다.
그 자체로 또는 다른 방법과 조합하여 사용될 수 있는 또 다른 방법은 scFv의 VH 및/또는 VL 도메인에 존재하는 하나 이상의 잔기를 돌연변이시켜 하나 이상의 아미노산 치환을 도입하여, 알려진 항체의 VH 및/또는 VL 도메인의 컨센서스 서열의 상기 특정 위치에서 가장 빈번한 잔기를 매칭한다. 특정 양태에서, 치환은 scFv의 VH 도메인 및/또는 VL 도메인 중 하나 또는 둘 모두에서 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 6개 이상의 위치에 도입된다. 각 도메인에서 동일한 수의 변화가 이루어지거나, 각 도메인에서 상이한 수의 변화가 이루어질 수 있다. 특정 양태에서, 주어진 컨센서스와 일치하는 서열에서의 하나 이상의 변화는 변경되지않은 VH 및/또는 VL 서열에 존재하는 잔기로부터의 보존적 아미노산 치환이다. 다른 양태에서, 변화 중 하나 이상은 변형되지않은 VH 및/또는 VL 서열에 존재하는 잔기로부터의 비-보존적 아미노산 치환을 나타낸다. scFv의 VH 또는 VL 도메인 중 하나 또는 둘 다에서 다수의 치환이 이루어지는 경우, 각각의 치환은 독립적으로 보존적 또는 비-보존적 치환이다. 특정 양태에서, 모든 치환은 보존적 치환이다. 특정 양태에서, 모든 치환은 비-보존적 치환이다. 특정 양태에서, 치환 중 적어도 하나는 보존적이다. 특정 양태에서, 적어도 하나 또는 치환은 비-보존적이다.
scFv 부분을 변형시키거나 안정화시키는데 유용한 것으로 기술된 임의의 변형이 Fab 부분을 변형시키는데 적용될 수 있음을 유의해야한다. 예를 들어, BiSAb의 Fab 부분의 가변 도메인은 안정성, 항원 결합 등을 개선하기 위해 변형될 수 있다. 더욱이, Fab 또는 scFv 부분은 면역원성을 감소시키도록 변형될 수 있다.
특정 양태에서, 결합 단위 2(BD)는 scFv, 예를 들어 가변 경쇄(VL2) 및 가요성 링커, 예컨대 글라이신-세린 링커에 의해 상호연결된 가변 중쇄(VH2)를 포함하는 통상적인 단클론 항체로부터 유도된 scFv이다. 선택적으로, scFv의 가변 경쇄 및 가변 중쇄는 하나 이상의 디설파이드 결합을 통해 추가로 상호연결될 수 있으며, 상기 기술한 바와 같이, 하나 이상의 돌연변이 또는 변이를 포함할 수 있다. scFv는 제2 에피토프에 결합한다. 특정 양태에서, 제2 에피토프는 결합 단위 1에 의해 결합된 제1 에피토프와 상이하다. 다른 양태에서, 제2 에피토프는 결합 단위 1에 의해 결합된 제1 에피토프와 동일하다. 특정 양태에서, scFv는 통상적인 뮤린, 인간화된 또는 인간 항체와 같은 통상적인 단클론 항체의 서열로부터 유래되거나, 이를 기반으로 한다. 특정 양태에서, 통상적인 단클론 항체의 서열로부터 유래되거나 이를 기반으로 한 scFv를 함유하는 BiSAb는 통상적인 항체의 하나 이상의 기능적 활성을 보유한다(예를 들어, 기능적 활성의 적어도 80% 또는 그 이상(80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)를 보유함). 예를 들어, 특정 양태에서, 상기 scFv를 함유하는 BiSAb는 항원에 대한 친화력, 억제 활성 또는 종래의 항체의 세포 살해 활성 중 하나 이상을 보유한다.
특정 양태에서, BiSAb는 결합 단위 1 및 결합 단위 2의 임의의 조합을 포함하여, 본원에 기술된 결합 단위 1 및 결합 단위 2 중 임의의 것을 포함한다. 예를 들어, 특정 양태에서, 본 발명은 특정 표적에 결합하는(예를 들어, 특정 표적 상의 에피토프에 결합하는) Fab, 예컨대 특정 아미노산 서열을 포함하거나 특정 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 Fab 및/또는 특정 표적에 결합하는(예를 들어, 특정 표적 상의 에피토프에 결합하는) scFv, 예컨대 특정 아미노산 서열을 포함하거나 특정 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 scFv를 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.
위에 보다 상세하게 설명한 바와 같이, 결합 단위 1과 결합 단위 2는 링커 폴리펩타이드 1(L1, L2)을 통한 공유 결합을 통해 BiSAb와 결합될 수 있다. 일반적으로, 연결은 BiSAb의 키메라 중쇄를 통해 이루어지므로, 중쇄 CH2 도메인, 중쇄 CH3 도메인 또는 중쇄 CH2 도메인 및 CH3 도메인의 계면을 통해 상호연결이 이루어지거나, 일부 구현예에서 힌지 영역 또는 Fab 도메인 내에 존재할 수 있다. L1 및 L2는 서로 독립적으로 길이 및 서열이 변할 수 있으며, 예시적인 구성이 본원에 설명된다. 본 발명은 목적하는 표적(들) 및 본원에 기재된 특이적 L1 및 L2 폴리펩타이드 링커에 결합하는 특정 결합 단위의 임의의 조합을 포함하는 결합 단위 및 링커 폴리펩타이드의 임의의 조합을 포함하는 BiSAb를 고려한다.
2. Fc 영역
본원에서 사용된 "Fc 영역"은 불변 영역의 단편, 유사체, 변이체, 돌연변이체 또는 유도체를 포함하는 면역글로불린, 바람직하게는 인간 면역글로불린의 불변 영역으로부터 유래된 도메인을 포함한다. 적합한 면역글로불린은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 다른 부류, 예컨대 IgA, IgD, IgE 및 IgM을 포함한다. Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 변경된 Fc 영역일 수 있다. 면역글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 2개의 불변 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 및 선택적으로 CH4 도메인을 포함한다. 본 발명의 BiSAb는 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 Fc 영역을 포함한다.
a. 변경된 Fc 영역
변경된 Fc 영역(본원에서 "변이체 Fc 영역"이라고도 함)은 본 발명의 BiSAb의 이펙터 기능 및/또는 반감기를 변경시키는데 사용될 수 있다. 분자의 기능적 및/또는 약동학적 성질을 변화시키기 위해, Fc 영역에서 하나 이상의 변경이 이루어질 수 있다. 그러한 변경은 IgG, 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC), 또는 항체 의존성 세포-매개된 식균작용(ADCP)을 위한 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC) 또는 FcγR 결합의 감소 또는 증가를 초래할 수 있다. 본 발명은 기능을 증진 또는 감소시키거나 원하는 이펙터 기능을 제공함으로써 이펙터 기능을 미세하게 조정하기 위해 변화된 BiSAb를 포함한다. 따라서, 본 발명의 일 양태에서, BiSAb는 변이체 Fc 영역(즉, 이하에 논의되는 바와 같이 변경된 Fc 영역)을 포함한다. 변이체 Fc 영역을 포함하는 BiSAb는 본원에서 "Fc 변이체 BiSAb"로도 지칭된다. 본원에서 사용된 "천연"은 변형되지않은 모체 서열을 지칭하며, 천연 Fc 영역을 포함하는 BiSAb는 본원에서 "천연 Fc BiSAb"로 지칭된다. Fc 변이체 BiSAb는 당업자에게 널리 공지된 수많은 방법에 의해 생성될 수 있다. 비-제한적인 예는 항체 코딩 영역을(예를 들어, 하이브리도마로부터) 단리하고, Fc 영역에서 하나 이상의 원하는 치환을 생성하는 것을 포함한다. 대안적으로, BiSAb의 항원-결합 부분(예를 들어, 가변 영역)은 변이체 Fc 영역을 코딩하는 벡터 내로 서브클로닝될 수 있다. 일 양태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 Fc 영역과 비교하여 유사한 수준의 유도 이펙터 기능을 나타낸다. 또 다른 양태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 Fc와 비교하여 보다 큰 이펙터 기능의 유도를 나타낸다. 또 다른 양태에서, 변이체 Fc 영역은 천연 Fc와 비교하여 보다 낮은 이펙터 기능의 유도를 나타낸다. 변형된 Fc 영역의 몇몇 특정 양태는 하기에 상세히 기재되어 있다. 이펙터 기능을 측정하는 방법은 당 분야에 잘 알려져있다.
일반적으로, 이펙터 기능은 아미노산 치환, 아미노산 첨가, 아미노산 결실 및 Fc 아미노산에 대한 번역 후 변형(예를 들어, 글라이코실화)의 변화를 포함하는 Fc 영역의 변화를 통해 변형되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 하기 기술된 방법은 본 발명의 BiSAb의 이펙터 기능, FcR에 대한 Fc 영역의 결합 특성의 비(예를 들어, 친화도 및 특이성)를 미세 조정하여 원하는 특성을 갖는 BiSAb를 얻도록 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 Fc 영역은 제1 불변 영역 면역글로불린 도메인을 제외하고 항체 분자의 불변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 것으로 이해된다. 따라서, Fc는 IgA, IgD 및 IgG의 마지막 2개의 불변 영역 면역글로불린 도메인 및 IgE 및 IgM의 마지막 3개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, 및 선택적으로 이들 도메인에 대한 가요성 힌지 N 말단의 전부 또는 일부를 지칭한다. IgA 및 IgM의 경우, Fc는 J 사슬을 포함할 수 있다. IgG의 경우, Fc는 면역글로불린 도메인 C감마2 및 C감마3(Cγ2 및 Cγ3) 및 선택적으로 C감마1(Cγ1) 및 C감마2(Cγ2) 사이의 하부 힌지 부분을 포함한다. Fc 영역의 경계가 변할 수 있지만, 본원에서 사용된 바와 같이, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 카복실-말단에 잔기 A231을 포함하며, 넘버링은 Kabat에 기재된 바와 같은 EU 지표에 따른다. Fc는 이 영역을 단독으로 또는 이 영역을 항체, 항체 단편 또는 Fc 융합 단백질과 관련하여 지칭할 수 있다. 다형성은 EU 인덱스에 의해 넘버링된 IgG1의 위치 270, 272, 312, 315, 356 및 358을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 다수의 상이한 Fc 위치에서 관찰되었고, 따라서 제시된 서열과 종래의 서열 사이에 약간의 차이가 존재할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 천연 Fc BiSAb에 비해 Fc 리간드(예를 들어, Fc 수용체, C1q)에 대한 결합 특성이 변경된 Fc 변이체 BiSAb를 포함한다. 결합 특성의 예는 결합 특이성, 평형 해리 상수(Kd), 해리 및 결합 속도(각각 koff 및 kon), 결합 친화도 및/또는 결합능을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 평형 해리 상수(Kd)는 k off /k on 으로 정의된다. 특정 양태에서, 낮은 Kd를 갖는 Fc 변이체 영역을 포함하는 BiSAb는 높은 Kd를 갖는 BiSAb보다 바람직할 수 있다. 그러나 어떤 경우에는 koff 또는 kon의 값이 Kd의 값보다 더 적절할 수 있다. 당해 분야의 숙련자는 주어진 용도에 대해 어떤 동력학 파라미터가 가장 중요한지를 결정할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 양성 조절제(예를 들어, FcγRIIIA)에 대한 결합 및/또는 억제성 Fc 수용체(예를 들어, FcγRIIB)에 대한 개선된 결합을 감소시키는 변형은 ADCC 활성을 감소시키는데 적합할 것이다. 따라서, 상이한 수용체에 대한 결합 친화도(예를 들어, 평형 해리 상수(Kd)의 비)는 본 발명의 Fc 변이체 BiSAb의 ADCC 활성이 증가되거나 감소되는지 여부를 나타낼 수 있다. 또한, C1q에 대한 결합을 감소시키는 변형은 CDC 활성을 감소시키거나 제거하는데 적합할 것이다.
일 양태에서, Fc 변이체 BiSAb는 천연 Fc BiSAb와 비교하여, FcRn, 동형 FcγRIA, FcγRIB 및 FcγRIC를 포함하는 FcγRI(CD64); FcγRII(동형 FcγRIIA, FcγRIIB 및 FcγRIIC를 포함하는 CD32); 및 FcγRIII(CD16, 동형 FcγRIIIA 및 FcγRIIIB 포함)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 하나 이상의 Fc 수용체에 대한 변경된 결합 친화도를 나타낸다.
특정 양태에서, Fc 변이체 BiSAb는 Fc 리간드에 대해 증가된 친화도를 갖는다. 다른 양태에서, Fc 변이체 BiSAb는 천연 Fc BiSAb와 비교하여 Fc 리간드에 대한 감소된 친화도를 갖는다.
특정 양태에서, Fc 변이체인 BiSAb는 Fc 수용체 FcγRIIIA에 대한 결합을 증강시켰다. 또 다른 특정 양태에서, Fc 변이체 BiSAb는 Fc 수용체 FcγRIIB에 대한 결합을 증강시킨다. 또 다른 특정 양태에서, Fc 변이체 BiSAb는 Fc 수용체 FcγRIIIA 및 FcγRIIB 모두에 대한 결합을 증강시킨다. 특정 양태에서, FcγRIIIA에 대한 향상된 결합을 갖는 Fc 변이체 BiSAb는 천연 Fc BiSAb와 비교하여 FcγRIIB 수용체의 결합에 수반되는 증가를 갖지 않는다. 특정 양태에서, Fc 변이체 BiSAb는 Fc 수용체 FcγRIIIA에 대한 결합을 감소시킨다. 또 다른 특정 양태에서, Fc 변이체인 BiSAb는 Fc 수용체 FcγRIIB에 대한 결합이 감소되었다. 또 다른 특정 양태에서, Fc 변이체인 BiSAb는 Fc 수용체 FcRn에 대한 결합을 증강시킨다. 또 다른 특정 양태에서, FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIB에 대해 변경된 친화도를 나타내는 Fc 변이체 BiSAb는 Fc 수용체 FcRn에 대한 결합을 증강시킨다. 또 다른 특정 양태에서, FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIB에 대해 변경된 친화도를 나타내는 Fc 변이체 BiSAb는 천연 Fc BiSAb와 비교하여 C1q에 대한 결합을 변경시킨다.
또 다른 양태에서, Fc 변이체 BiSAb는 천연 Fc BiSAb와 비교하여 C1q에 대한 증가된 또는 감소된 친화력을 나타낸다. 또 다른 특정 양태에서, C1q에 대해 변경된 친화도를 나타내는 Fc 변이체 BiSAb는 Fc 수용체 FcRn에 대한 결합을 증강시킨다. 또 다른 특정 양태에서, C1q에 대해 변경된 친화도를 나타내는 Fc 변이체 BiSAb는 천연 Fc BiSAb와 비교하여 FcγRIIIA 및/또는 FcγRIIB와의 결합이 변경되었다.
항체는 당 분야에 항체 이펙터 기능으로서 집합적으로 알려진 다수의 과정을 통해 표적화된 항원의 공격 및 파괴를 지시할 수 있는 것으로 인식된다. "항체-의존성 세포-매개된 세포독성" 또는 "ADCC"로 알려진 이러한 과정 중 하나는 특정 세포독성 세포(예를 들어, 자연 살해(NK) 세포, 호중구 및 대식세포)에 있는 Fc 감마 수용체(FcγRs) 상에 결합된 분비된 Ig가 이들 세포독성 이펙터 세포가 항원-담지 표적 세포에 특이적으로 결합하여 이후에 표적 세포를 세포독소로 사멸시키는 것을 가능하게 하는 형태의 세포독성을 지칭한다. 표적 세포의 표면으로 향하는 특이적 고-친화도 IgG 항체는 세포독성 세포를 "아암(arm)"하여 그러한 살해에 요구된다. 표적 세포의 용해는 세포외이며, 직접적인 세포-세포 접촉이 필요하며, 보체를 포함하지 않는다. 이펙터 기능이라는 용어에 의해 포함되는 또 다른 프로세스는 보체 시스템에 의한 항체-매개된 표적 세포 파괴의 생화학적 사건을 지칭하는 보체-의존성 세포독성(이하, "CDC"라고 함)이다. 보체 시스템은 항체와 결합하여 병원성 세균 및 기타 외래 세포를 파괴하는 정상적인 혈장에서 발견되는 복잡한 단백질 시스템이다. 이펙터 기능이라는 용어에 의해 포함되는 또 다른 프로세스는 하나 이상의 이펙터 리간드를 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포상의 결합된 항체를 인식하고 그 후에 표적 세포의 식균작용을 일으키는 세포-매개된 반응을 지칭하는 항체 의존성 세포-매개된 식균작용(ADCP)이다.
Fc 변이체 BiSAb는 하나 이상의 FcγR 매개된 이펙터 세포 기능을 결정하기 위한 시험관내 기능 분석에 의해 특징화되는 것으로 고려된다. 특정 양태에서, Fc 변이체 BiSAb는 (본원에 기술되고 개시된 것과 같은) 생체내 모델에서 시험관내 기반 분석에서의 모델들과 유사한 결합 특성 및 이펙터 세포 기능을 갖는다. 그러나, 본원은 시험관내 기반 분석에서 원하는 표현형을 나타내지 않지만 생체내에서 원하는 표현형을 나타내는 Fc 변이체 BiSAb를 배제하지 않는다.
Fc 영역을 포함하는 단백질의 혈청 반감기는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합 친화도를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "항체 반감기"는 투여 후 항체 분자의 평균 생존 시간의 척도인 항체의 약동학적 특성을 의미한다. 항체 반감기는 환자의 신체(또는 다른 포유동물) 또는 그의 특정 구획, 예를 들어 혈청에서, 또는 다른 조직에서 측정된 것과 같은 공지된 양의 면역글로불린의 50%를 제거하는데 필요한 시간, 즉 순환 반감기로 나타낼 수 있다. 반감기는 면역글로불린 또는 면역글로불린의 종류에 따라 서로 다를 수 있다. 일반적으로, 항체 (또는 BiSAb) 반감기의 증가는 투여된 BiSAb에 대한 순환 중 평균 체류 시간(MRT)을 증가시킨다.
반감기의 증가는 환자에게 투여되는 약물의 양을 감소시킬뿐만 아니라 투여 빈도를 감소시킨다. BiSAb의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어, 미국 특허 제5,739,277호에 기재된 바와 같이 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프를 BiSAb(특히, 항체 단편)에 혼입시킬 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "샐비지 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는 역할을 하는 IgG 분자(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다. 대안적으로, 증가된 반감기를 갖는 본 발명의 BiSAb는 Fc와 FcRn 수용체 사이의 상호작용에 관여하는 것으로 확인된 아미노산 잔기를 변형시킴으로써 생성될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,821,505호 및 제7,083,784호 참조). 또한, 본 발명의 BiSAb의 반감기는 당 분야에서 널리 사용되는 기술에 의해 PEG 또는 알부민에 대한 접합에 의해 증가될 수 있다.
추가의 결합 도메인의 본원에 기술된 바와 같은 Fc 영역 내로의 삽입 및/또는 항원에 의한 후속 결합은 Fc 활성에 영향을 미칠 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 결합 항원은 FcgR, C1q 및 FcRn에 대한 결합 친화도 및 활성을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 이것은 다양한 항체-의존적 과정을 조절하기 위해 항원-의존적 스위치를 생성할 것이다. 일 양태에서, 항원 결합은 FcRn과의 상호작용을 감소시켜 유리 BiSAb가 FcRn과 상호작용하고 정상적인 반감기를 갖도록 하지만, BiSAb-Ag 복합체의 신속한 제거/세포 내재화를 허용할 수 있다. 또한 이는 BD2-항원 매개된 상호작용이 BD1에 결합된 항원의 제거에 영향을 미칠 수 있도록 할 수 있었다. 추가적인 양태에서, BiSAb는 BD2에 직접 삽입된 Fc 영역(Fc-BD2)을 포함할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 Kabat에 개시된 바와 같은 EU 지표에 의해 넘버링된, 221, 225, 228, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 250, 251, 252, 254, 255, 256, 257, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 279, 280, 284, 292, 296, 297, 298, 299, 305, 308, 313, 316, 318, 320, 322, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 339, 341, 343, 370, 373, 378, 392, 416, 419, 421, 428, 433, 434, 435, 436, 440, 및 443으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 변형(예를 들어, 아미노산 치환, 아미노산 삽입, 아미노산 결실)을 포함하는 Fc 변이체를 제공한다. 임의로, Fc 영역은 당업자에게 공지된 추가 및/또는 대체 위치에서의 변형을 포함할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,624,821호; 제6,277,375호; 제6,737,056호; 제7,083,784호; 제7,317,091호; 제7,217,797호; 제7,276,585호; 제7,355,008호 참조). 추가의 유용한 아미노산 위치 및 특정 치환은 미국 특허 제6,737,056호의 표 2 및 6-10; US 2006/024298의 도 41에 제시된 표; US 2006/235208의 도 5, 도 12 및 도 15에 제시된 표; US 2006/0173170의 도 8, 9 및 10에 제시된 표 및 WO 09/058492의 도 8-10, 13 및 14에 제시된 표에 예시되어 있다.
특정 양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 Kabat에 개시된 바와 같은 EU 지표에 의해 넘버링된, 221K, 221Y, 225E, 225K, 225W, 228P, 234D, 234E, 234N, 234Q, 234T, 234H, 234Y, 234I, 234V, 234F, 235A, 235D, 235R, 235W, 235P, 235S, 235N, 235Q, 235T, 235H, 235Y, 235I, 235V, 235E, 235F, 236E, 237L, 237M, 237P, 239D, 239E, 239N, 239Q, 239F, 239T, 239H, 239Y, 240I, 240A, 240T, 240M, 241W, 241 L, 241Y, 241E, 241 R. 243W, 243L 243Y, 243R, 243Q, 244H, 245A, 247L, 247V, 247G, 250E, 250Q, 251F, 252L, 252Y, 254S, 254T, 255L, 256E, 256F, 256M, 257C, 257M, 257N, 262I, 262A, 262T, 262E, 263I, 263A, 263T, 263M, 264L, 264I, 264W, 264T, 264R, 264F, 264M, 264Y, 264E, 265A, 265G, 265N, 265Q, 265Y, 265F, 265V, 265I, 265L, 265H, 265T, 266I, 266A, 266T, 266M, 267Q, 267L, 268E, 269H, 269Y, 269F, 269R, 270E, 280A, 284M, 292P, 292L, 296E, 296Q, 296D, 296N, 296S, 296T, 296L, 296I, 296H, 296G, 297S, 297D, 297E, 298A, 298H, 298I, 298T, 298F, 299I, 299L, 299A, 299S, 299V, 299H, 299F, 299E, 305I, 308F313F, 316D, 318A, 318S, 320A, 320S, 322A, 322S, 325Q, 325L, 325I, 325D, 325E, 325A, 325T, 325V, 325H, 326A, 326D, 326E, 326G, 326M, 326V, 327G, 327W, 327N, 327L, 328S, 328M, 328D, 328E, 328N, 328Q, 328F, 328I, 328V, 328T, 328H, 328A, 329F, 329H, 329Q, 330K, 330G, 330T, 330C, 330L, 330Y, 330V, 330I, 330F, 330R, 330H, 331G, 331A, 331L, 331M, 331F, 331W, 331K, 331Q, 331E, 331S, 331V, 331I, 331C, 331Y, 331H, 331R, 331N, 331D, 331T, 332D, 332S, 332W, 332F, 332E, 332N, 332Q, 332T, 332H, 332Y, 332A, 333A, 333D, 333G, 333Q, 333S, 333V, 334A, 334E, 334H, 334L, 334M, 334Q, 334V, 334Y, 339T, 370E, 370N, 378D, 392T, 396L, 416G, 419H, 421K, 428L, 428F, 433K, 433L, 434A, 424F, 434W, 434Y, 436H, 440Y 및 443W로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 치환을 포함하는 Fc 변이체를 제공한다. 선택적으로, Fc 영역은 미국 특허 제6,737,056호의 표 2 및 6-10; US 2006/024298의 도 41에 제시된 표; US 2006/235208의 도 5, 12, 및 15에 제시된 표; US 2006/0173170의 도 8, 9 및 10에 제시된 표 및 US20090041770의 도 8, 9 및 10에 제시된 표에 예시되어 있다.
특정 양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 Kabat에 개시된 바와 같은 EU 지표에 의해 넘버링된, 228, 234, 235 및 331로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 적어도 하나의 변형(예를 들어, 아미노산 치환, 아미노산 삽입, 아미노산 결실)을 포함하는 Fc 변이체 BiSAb를 제공한다. 일 양태에서, 변형은 Kabat에 기재된 EU 지표에 의해 넘버링된 228P, 234F, 235E, 235F, 235Y 및 331S로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 치환이다.
또 다른 특정 양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 IgG4 Fc 영역이고, Kabat에 개시된 바와 같은 EU 지표에 의해 넘버링된, 228 및 235로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 적어도 하나의 변형을 포함하는, Fc 변이체 BiSAb를 제공한다. 또 다른 특정 양태에서, Fc 영역은 IgG4 Fc 영역이고, 비-자연 발생 아미노산은 Kabat에 기재된 EU 지표에 의해 넘버링된 228P, 235E 및 235Y로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 특정 양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 Kabat에 개시된 바와 같은 EU 지표에 의해 넘버링된, 239, 330 및 332로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 적어도 하나의 비-천연 발생 아미노산을 포함하는 Fc 변이체 BiSAb를 제공한다. 일 양태에서, 변형은 Kabat에 기재된 EU 지표에 의해 넘버링된 239D, 330L, 330Y 및 332E로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환이다. 미국 특허 제7,317,091호를 참조하며, 이는 전체가 본원에 참고로 포함된다.
특정 양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 Kabat에 개시된 바와 같은 EU 지표에 의해 넘버링된, 252, 254, 및 256으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 적어도 하나의 비-천연 발생 아미노산을 포함하는 Fc 변이체 BiSAb를 제공한다. 일 양태에서, 변형은 Kabat에 기재된 EU 지표에 의해 넘버링된 252Y, 254T 및 256E로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환이다. 예를 들어, 미국 특허 제7,083,784호를 참조하며, 이는 전체가 본원에 참고로 포함된다.
특정 양태에서, 본 발명은 Fc 영역이 Kabat에 개시된 바와 같은 EU 지표에 의해 넘버링된, 위치 428에서 비-천연 발생 아미노산을 포함하는 Fc 변이체 BiSAb를 제공한다. 일 양태에서, 428번 위치에서의 변형은 Kabat에 기재된 EU 지표에 의해 넘버링된 428T, 428L, 428F 및 428S로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 미국 특허 제7,670,600호를 참조하며, 그 전체가 본원에 참고문헌으로 포함된다. 또 다른 양태에서, Fc 변이체 BiSAb는 Kabat에 기재된 바와 같이 EU 지표에 의해 넘버링된 434번 위치의 비-자연 발생적 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 일 양태에서, 434번 위치에서의 변형은 Kabat에 기재된 EU 지표에 의해 넘버링된 434A, 434S 및 434F로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 다른 양태에서, 본 발명은 Fc 변이체 BiSAb를 제공하며, 여기에서 Fc 영역은 Kabat에 기재된 바와 같이 EU 지표에 의해 넘버링된 428 및 434번 위치에 비-자연 발생 아미노산을 포함한다. 특정 양태에서, Fc 영역은 428L, 434S를 포함한다. 미국 특허 제8,088,376호를 참조한다.
특정 양태에서, IgG 항체에 의해 유도된 이펙터 기능은 단백질의 Fc 영역에 연결된 탄수화물 모이어티에 강하게 의존한다(Claudia Ferrara et al., 2006, Biotechnology and Bioengineering 93: 851-861). 따라서, Fc 영역의 글라이코실화는 이펙터 기능을 증가시키거나 감소시키도록 변형될 수 있다(예를 들어, Umana et al, 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473; 미국 특허 제6,602,684호; 제6,946,292호; 제7,064,191호; 제7,214,775호; 제7,393,683호; 제7,425,446호; 제7,504,256호; POTELLIGENTTM 기술(Biowa, Inc. Princeton, N.J.); GLYCOMABTM 글라이코실화 엔지니어링 기술(GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland)). 따라서, 일 양태에서 본 발명의 BiSAb의 Fc 영역은 아미노산 잔기의 변경된 글라이코실화를 포함한다. 또 다른 양태에서, 아미노산 잔기의 변경된 글라이코실화는 이펙터 기능을 낮춘다. 또 다른 양태에서, 아미노산 잔기의 변경된 글라이코실화는 이펙터 기능을 증가시킨다. 특정 양태에서, Fc 영역은 감소된 푸코실화를 갖는다. 또 다른 양태에서, Fc 영역은 아푸코실화된다(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2005/0226867호 참조). 일 양태에서, 증가된 이펙터 기능, 특히 ADCC를 갖는 상기 BiSAb는 모세포에 의해 생성된 폴리펩타이드에 비해 100배 이상의 높은 ADCC를 갖는 매우 탈푸코실화된 폴리펩타이드를 생산하도록 조작된 숙주 세포(예를 들어, CHO 세포, 렘나 미노르(Lemna minor))에서 생성된다(Mori et al., 2004, Biotechnol Bioeng 88:901-908; Cox et al., 2006, Nat Biotechnol., 24:1591-7).
IgG 분자상의 올리고사카라이드에 시알산을 첨가하면 소염 활성을 증가시키고, 세포독성을 변경시킬 수 있다(Keneko et al., Science, 2006, 313:670-673; Scallon et al., Mol. Immuno. 2007 Mar;44(7):1524-34). 상기 언급된 연구는 증가된 시알릴화를 갖는 IgG 분자가 항-염증 특성을 갖는 반면, 감소된 시알릴화를 갖는 IgG 분자가 증가된 면역자극 특성(예를 들어, ADCC 활성 증가)을 갖는다는 것을 입증한다. 따라서, BiSAb는 특정 용도에 적합한 시알릴화 프로파일에 의해 변형될 수 있다(미국 공개 번호 제2009/0004179호 및 국제 공개 번호 WO 2007/005786).
일 양태에서, 본 발명의 BiSAb의 Fc 영역은 천연 Fc 영역과 비교하여 변경된 시알릴화 프로파일을 포함한다. 일 양태에서, 본 발명의 BiSAb의 Fc 영역은 천연 Fc 영역과 비교하여 증가된 시알릴화 프로파일을 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명의 BiSAb의 Fc 영역은 천연 Fc 영역과 비교하여 감소된 시알릴화 프로파일을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명의 Fc 변이체는 Ghetie et al., 1997, Nat Biotech. 15:637-40; Duncan et al, 1988, Nature 332:563-564; Lund et al., 1991, J. Immunol 147:2657-2662; Lund et al, 1992, Mol Immunol 29:53-59; Alegre et al, 1994, Transplantation 57:1537-1543; Hutchins et al., 1995, Proc Natl. Acad Sci U S A 92:11980-11984; Jefferis et al, 1995, Immunol Lett. 44:111-117; Lund et al., 1995, Faseb J 9:115-119; Jefferis et al, 1996, Immunol Lett 54:101-104; Lund et al, 1996, J Immunol 157:4963-4969; Armour et al., 1999, Eur J Immunol 29:2613-2624; Idusogie et al, 2000, J Immunol 164:4178-4184; Reddy et al, 2000, J Immunol 164:1925-1933; Xu et al., 2000, Cell Immunol 200:16-26; Idusogie et al, 2001, J Immunol 166:2571-2575; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Jefferis et al, 2002, Immunol Lett 82:57-65; Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490); 미국 특허 제5,624,821호; 제5,885,573호; 제5,677,425호; 제6,165,745호; 제6,277,375호; 제5,869,046호; 제6,121,022호; 제5,624,821호; 제5,648,260호; 제6,528,624호; 제6,194,551호; 제6,737,056호; 제7,122,637호; 제7,183,387호; 제7,332,581호; 제7,335,742호; 제7,371,826호; 제6,821,505호; 제6,180,377호; 제7,317,091호; 제7,355,008호에 개시된 것과 같은 다른 공지된 Fc 변이체와 조합될 수 있다. Fc 도메인의 다른 변형 및/또는 치환 및/또는 첨가 및/또는 결실은 당업자에게 명백할 것이다.
천연 Fc를 포함하는 BiSAb 포맷으로 제시된 폴리펩타이드가 실시예에 나타낸 바와 같이 FcRn 및 C1q에 결합하고 ADCC를 매개하는 능력을 보유한다는 것은 주목할 만하다. 따라서, 특정 양태에서, BiSAb는 FcRn 및/또는 C1q 및/또는 하나 이상의 Fcγ 수용체(FcγR)와 결합하는 능력을 보유한다. 예를 들어, 특정 양태에서, BiSAb는 BiSAb가 결합하는 에피토프 중 하나에 결합하는 통상적인 항체와 비교하여, FcRn 및/또는 C1q 및/또는 하나 이상의 FcγR과 결합하는 능력의 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%를 보유한다. 특정 양태에서, BiSAb는 하나 또는 2개의 통상적인 항체의 결합 도메인으로부터 생성되고, 활성의 비교는 상기 통상적인 항체 중 하나 또는 둘 모두에 대해 이루어진다.
변경된 Fc 영역은 또한 중쇄 이종이량체를 생성하는데 사용될 수 있어, 2개의 상이한 중쇄-경쇄 쌍을 포함하는 BiSAb를 생성한다. 이종이량체의 형성을 용이하게 하기 위해, Fc 영역 쌍 사이의 계면은 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화하도록 조작된다. 특정 양태들에서, 계면은 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 치환시킴으로써 "돌출부"가 생성된다. 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 제2 항체 분자의 계면에 큰 측쇄(들)와 동일하거나 유사한 크기의 상보적 "공동(cavities)"이 생성된다. 이것은 동종이량체와 같은 다른 원치 않는 최종-생성물보다 이종이량체의 수율을 증가시키는 메커니즘을 제공한다. CH3 변형은 예를 들어 하나의 중쇄 상에 Y407V/T366S/L368A 및 다른 중쇄 상에 T366W를 포함하고; 하나의 중쇄 상에 S354C/T366W를, 다른 중쇄 상에 Y349C/Y407V/T366S/L368A를 포함한다. 하나의 사슬 상에 돌출부를 형성하고 다른 사슬 상에 공동을 발생시키는 추가적인 변형은 미국 특허 제7,183,076호; US 2014/0348839; 및 Merchant et al., 1998, Nat. Biotech 16: 677-681에 기술되어 있다. 돌출부-공동 배치를 야기할 수 있는 변형의 일부 비-제한적인 예가 표 1a에 제시되어있다. 이종이량체를 생성하는데 사용될 수 있는 다른 변형은 정전기적으로 정합된 Fc 영역의 동시-발현이 이종이량체화를 초래하도록 Fc 이합체 계면을 가로 질러 전하의 극성을 변경시키는 것들을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 전하 극성을 변경시키는 변형은 하기 표 1b에 제시된 것들을 포함하지만 이에 한정되지 않는다(또한, US20090182127; Gunasekaran et al., 2010, JBC 285:19637-46 참조). 또한, Davis et al. (2010, Prot. Eng. Design & Selection 23:195-202)은 인간 IgG 및 IgA CH3 도메인의 유도체인 가닥-교환 조작된 도메인(SEED) CH3 영역을 사용하는 이종이량체 Fc 플랫폼을 기술하고 있다(또한, WO 2007/110205 참조).
[표 1a]
[표 1b]
당업자는 일부 양태에서 Fc 융합 단백질이 Fc 영역을 포함하는 분자의 동종이량체 성질로 인해 이량체를 형성할 수 있음을 이해할 것이다. 일부 양태에서, 결합 단백질(예를 들어, BiSAb)의 Fc 영역은 이종이량체화(예를 들어, 키메라성 돌연변이, 상보적 돌연변이, 도킹 및 락(dock and lock) 돌연변이, 구멍 돌연변이로의 노브, 가닥-교환 조작된 도메인(SEED) 돌연변이, 등, 예를 들어, 미국특허 제7,183,076호; Merchant et al. (1998) Nat. Biotech 16:677-681; Ridgway et al. (1996) Protein Engineering 9:617-621; Davis et al. (2010) Prot. Eng. Design & Selection 23:195-202; WO 2007/110205; WO 2007/147901; Gunasekaran et al. (2010) JBC 285:19637-46 참조, 이후에 모두 참고문헌으로 포함됨)를 촉진 및/또는 유지시키기 위해 돌연변이에 의해 구별적으로 조작될 수 있다. 따라서, 결합 단백질은 예를 들어, 제1 Fc 영역 또는 그의 단편에 융합된 제1 결합 단백질, 결합 도메인 또는 BiSAb 및 제2 Fc 영역 또는 이의 단편에 융합된 제2(즉, 상이한) 결합 단백질, 결합 도메인 또는 BiSAb를 포함하는 이종이량체를 형성하도록 조작될 수 있으며, 상기 제1 및 제2 Fc 영역 또는 이의 단편은 이종이량체화되도록 조작되었다.
3. 글라이코실화
가변 영역에서의 변형된 글라이코실화는, 폴리펩타이드의 이펙터 기능을 변경시키기 위한 글라이코실화 능력에 추가하여, 표적 항원에 대한 항체 (또는 BiSAb)의 친화도를 변경시킬 수 있다. 일 양태에서, 본 BiSAb의 가변 영역에서의 글라이코실화 패턴이 변형된다. 예를 들어, 아글라이코실화된 BiSAb가 제조될 수 있다(즉, BiSAb는 글라이코실화가 없다). 글라이코실화는 예를 들어, 표적 항원에 대한 BiSAb의 친화도를 증가시키도록 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어 BiSAb 서열 내 하나 이상의 글라이코실화 부위를 변경함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글라이코실화 부위를 제거함으로써 그 부위에서 글라이코실화를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 이러한 아글라이코실화는 항원에 대한 BiSAb의 친화력을 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 제5,714,350호 및 제6,350,861호에 보다 상세히 기술되어있다. Fc 영역에 존재하는 글라이코실화 부위(예를 들어, IgG의 아스파라긴 297)의 제거를 초래하는 하나 이상의 아미노산 치환이 또한 이루어질 수 있다. 더욱이, 글라이코실화된 BiSAb는 필요한 글라이코실화 시스템이 없는 박테리아 세포에서 생성될 수 있다.
4. 폴리펩타이드 링커
링커는 BiSAb 키메라 중쇄의 도메인/영역을 연속 분자로 결합시키는데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, BiSAb는 하나, 둘 또는 그 이상의 링커 폴리펩타이드(예를 들어, L1 및 L2)를 포함할 수 있다. 또한, BiSAb는 scFv의 가변 중쇄 및 경쇄를 상호연결하는 가요성 링커와 같은 부가적인 링커를 포함할 수 있다. 부가적으로, BiSAb는 scFv의 가변 중쇄 및 경쇄를 상호연결하는 가요성 링커 및 다른 결합 단위를 BiSAb 코어 구조에 연결시키는 다른 링커와 같은 부가적인 링커를 포함할 수 있다.
링커의 예시적인 비-제한적인 예는 적어도 4개의 잔기를 포함하는 폴리펩타이드 사슬이다. 그러한 링커의 일부는 가요성이고, 친수성일 수 있고, 그들 자신의 2차 구조를 거의 또는 전혀 갖지 않을 수 있다(링커 부분 또는 가요성 링커 부분). 적어도 4개의 아미노산의 링커는 분자가 조립된 후에 서로 가까이에 위치한 도메인 및/또는 영역을 결합시키는데 사용될 수 있다. 더 길거나 더 짧은 링커가 또한 사용될 수 있다. 따라서, 링커는 길이가 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 약 50개 잔기일 수 있다. 다수의 링커가 분자의 일부를 상호연결시키는데 사용될 때, 링커는 동일하거나 상이할 수 있다(예를 들어, 동일하거나 상이한 길이 및/또는 아미노산 서열).
링커는 절단 시약에 의해 선택적으로 절단될 수 있는 적어도 하나의 결합을 함유하는 절단가능한 링커일 수 있다. 절단가능한 링커는 링커 서열의 전부 또는 일부의 제거를 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 링커는 프로테아제 절단 부위를 함유하도록 조작될 수 있으므로, 링커의 중간 또는 링커의 적어도 한쪽 단부에서 절단이 발생한다. 예를 들어, 트롬빈 부위는 링커의 2개의 인접한 말단 각각에서 조작될 수 있다. 사용된 링커의 유형에 따라, 절단은 또한 TCEP, TFA 및 DTT와 같은 약제에 의해 매개될 수 있다. 링커는 절단 시약이 절단 생성물로부터 링커로부터 모든 잔기를 제거하도록 설계될 수 있다. 다른 예시적인 비-제한적인 링커는 결합이 예를 들어 내인성 효소 또는 다른 내인성 인자의 존재 하에, 또는 단순히 신체 또는 신체의 세포내에 존재하는 수성 유체에서, 생체내 조건 하에 선택적으로 절단될 수 있는 전구 약물 링커를 포함한다. BiSAb가 하나 이상의 폴리펩타이드 링커를 포함할 때, 각각의 링커는 상이할 수 있거나, 적어도 하나의 링커가 다른 것일 수 있다. 몇몇 양태에서, BiSAb는 절단가능한 링커를 포함한다. 특정 양태에서, BiSAb는 scFv를 포함하며, 상기 scFv는 VH2와 VL2 사이의 절단가능한 링커를 포함한다.
링커(들)는 원하는 구조의 형성을 용이하게 한다. 링커는 (Gly-Ser)n 잔기를 포함할 수 있으며, 일부 Glu 또는 Lys 잔기는 용해도를 증가시키기 위해 전체적으로 분산된다. 대안적으로 또는 부가적으로, 링커는 임의의 세린 잔기를 포함하지 않을 수 있으며, 상기 링커는 링커가 O-결합된 글라이코실화를 조건으로 하는 경우 바람직할 수 있다. 몇몇 양태에서, 예를 들어, 링커의 이량체화가 BiSAb의 도메인을 적절히 폴딩된 구성으로 가져오는데 사용된다면, 링커는 시스테인 잔기를 함유할 수 있다. 일부 양태에서, BiSAb는 폴리펩타이드의 도메인을 결합시키는 적어도 2개의 폴리펩타이드 링커를 포함한다. 다른 양태에서, BiSAb는 적어도 3개의 폴리펩타이드 링커를 포함한다. 다른 양태에서, BiSAb는 4개 이상의 폴리펩타이드 링커를 포함한다.
일부 양태에서, 폴리펩타이드 링커는 Fc 모이어티의 일부를 포함한다. 예를 들어, 일부 양태에서, 폴리펩타이드 링커는 IgG1, IgG2, IgG3 및/또는 IgG4 항체의 면역글로불린 힌지 도메인의 일부를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드 링커는 IgG1, IgG2, IgG3 및/또는 IgG4의 돌연변이된 면역글로불린 힌지 도메인의 일부를 포함한다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드 링커는 IgG1, IgG2, IgG3 및/또는 IgG4 항체의 면역글로불린 힌지 영역/도메인의 적어도 5, 7, 8 또는 15개의 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드 링커는 IgG1, IgG2, IgG3 및/또는 IgG4 항체의 변형된 면역글로불린 힌지 영역/도메인의 적어도 5, 7, 8 또는 15개의 아미노산 잔기를 포함한다.
폴리펩타이드 링커는 3개의 시스테인을 자연적으로 포함하는 힌지 영역의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 선택된 힌지 영역은 절삭되거나 그렇지 않으면 시스테인 잔기 중 단지 하나 또는 두개가 잔류하도록 완전한 및/또는 천연-발생 힌지 영역에 대해 변경되거나 치환된다. 유사하게, 다른 특정 양태에서, 폴리펩타이드 링커는 시스테인 잔기의 수가 아미노산 치환 또는 결실에 의해 감소되는 힌지 영역의 돌연변이된 또는 달리 변경된 부분, 예를 들어 본원에 기술된 0, 1 또는 2개의 시스테인 잔기를 함유하는 돌연변이된 또는 달리 변경된 힌지 영역을 포함할 수 있다.
돌연변이된 또는 달리 변경된 힌지 도메인은 따라서 하나 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 야생형 면역글로불린 힌지 도메인으로부터(또는 사용되어) 유도되거나 생성될 수 있다. 특정 양태에서, 힌지 영역의 돌연변이된 또는 달리 변경된 부분은 0 또는 단지 1개의 시스테인 잔기를 함유할 수 있으며, 상기 돌연변이된 또는 달리 변경된 힌지 영역은 각각 1개 이상, 또는 2개 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 야생형 면역글로불린 힌지 영역으로부터 유도되거나 유도된 것이다. 힌지 영역의 돌연변이된 또는 달리 변경된 부분에서, 야생형 면역글로불린 힌지 영역의 시스테인 잔기는 바람직하게는 결실되거나 또는 디설파이드 결합을 형성할 수 없는 아미노산으로 치환된다. 일부 양태에서, 힌지 영역의 돌연변이된 또는 달리 변경된 부분은 4개의 인간 IgG 아이소타입 서브클래스, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중 임의의 것을 포함할 수 있는 인간 IgG 야생형 힌지 영역으로부터 유도되거나 유도된 것이다.
일부 양태에서, 폴리펩타이드 링커는 면역글로불린 경쇄(EU 잔기 220)와 함께 디설파이드 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역의 부분을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드 링커는 EU 잔기 C220에서 아미노산 치환을 포함하는 힌지 영역의 변경된 부분을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드 링커는 아미노산 치환 C220V를 포함한다.
일부 양태에서, 폴리펩타이드 링커는 힌지-관련 자발적 자가-절단을 방지하는 아미노산 치환을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드 링커는 EU 위치 D221 위치의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드 링커는 아미노산 치환 D221G를 포함한다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드 링커는 아미노산 D221이 부족하다.
상기 논의된 바와 같이, 일부 구현예는 gly-ser 링커를 포함하거나 이로 구성된 하나 이상의 폴리펩타이드 링커를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "gly-ser 링커"는 글리신 및 세린 잔기로 구성된 펩타이드를 지칭한다. 예시적인 gly-ser 링커는 구조식 (Gly4Ser)n의 아미노산 서열을 아울러 포함하며, 여기서 n은 양의 정수(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)이다. gly-ser 링커의 일부 바람직한 비-제한적인 예는 (Gly4Ser)2, (SEQ ID NO:41) 및 (Gly4Ser)4, (SEQ ID NO:42) 뿐만 아니라 (Gly4Ser)3 (SEQ ID NO:43)을 포함한다. 또 다른 양태에서, 2개 이상의 gly-ser 링커가 폴리펩타이드 링커에 직렬로 도입된다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드 링커는 힌지 영역의 적어도 일부(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 분자로부터 유도됨) 및 일련의 gly-ser 아미노산 잔기(예를 들어, gly-ser 링커, 예컨대 (Gly4Ser)n(여기서, n은 2, 3 또는 4임))를 포함한다.
특정 양태에서, 링커(예를 들어, L1 및/또는 L2 및/또는 L3 등)는 힌지 부분 및 링커 부분, 예컨대 gly-ser 링커를 포함하는 링커 부분 모두를 포함한다. 다른 양태에서, L1 및/또는 L2는 단지 힌지 부분 또는 단지 링커 부분, 예컨대 gly-ser 링커를 포함한다. 다른 양태에서, L1 및 L2는 gly-ser 링커 부분을 포함한다. 특정 양태에서, BiSAb 내의 gly-ser 링커는 동일한 길이인 반면, 다른 양태에서, BiSAb 내의 gly-ser 링커 부분(예를 들어, L1 및 L2)은 상이한 길이이다. BiSAb가 scFv를 포함하는 경우, scFv의 중쇄 및 경쇄는 가요성 링커에 의해 BiSAb(예를 들어, BD1, Fab, Fc 등)에 연결될 수 있다. 상기 가요성 링커는 일반적으로 힌지 부분을 포함하지 않지만, gly-ser 링커 또는 다른 가요성 링커이다. scFv의 도메인을 상호연결하는 가요성 링커의 길이 및 아미노산 서열은 용이하게 선택되고 최적화될 수 있다(예를 들어, (Gly4Ser)n(SEQ ID NO:48)(여기서 n은 2, 3 또는 4 이상임)).
다양한 결합 단위 및 도메인을 (예를 들어, 결합 도메인/유닛(예를 들어, Fab-scFv), 또는 Fc(예를 들어, L1 및 L2를 통한 scFv)에 대한 결합 도메인/유닛 사이를) 상호연결시키는데 사용되는 폴리펩타이드 링커와 무관하게, BiSAb는 부가적인 폴리펩타이드 링커를 선택적으로 포함할 수 있다. 이러한 추가 폴리펩타이드 링커의 길이 및 서열은 독립적으로 선택된다. 예를 들어, BiSAb는 scFv의 가변 중쇄 및 경쇄를 상호연결하는 가요성 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함할 수 있다. 상기 가요성 폴리펩타이드 링커는 gly-ser 링커를 포함할 수 있다. 일반적으로, 이 링커는 힌지 부분을 포함하지 않는다.
여기에서, BD2에 인접한 링커의 길이를 변화시키는 것은 BD2 항원 결합 부위의 배향 및 나머지 BiSAb 분자에 대한 공간에 영향을 미칠 수 있다고 생각된다. 예를 들어, 짧은 N-말단 링커 및 긴 C-말단 링커는 결합 부위가 한 방향으로 일치하는 배향을 생성할 수 있는 반면, 긴 N-말단 및 짧은 C-말단 링커는 반대의 배좌의 배향을 부여할 수 있다. 따라서, 링커 길이는 BD2 항원 결합 부위를 배향시키기 위해 조절될 수 있으며, BD1 및 BD2 및/또는 BD2, 및 Fc 또는 다른 도메인에서 항체 분자를 결합시키는 다른 개체 사이의 입체 효과를 생성 또는 회피하는데 중요한 영향을 미칠 수 있다.
5. BiSAb의 구체적인 구성
상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 일 양태는 (도 1a-1f에 도시된) 2개의 중쇄-경쇄 쌍을 포함하는 BiSAb 구조 배열(플랫폼)에 관한 것이다. 이 양태의 일부 구현예에서, BiSAb 키메라 중쇄의 폴리펩타이드 서열은 항체 중쇄 가변 도메인(VH1)을 포함하는 폴리펩타이드 서열, 항체 중쇄 불변 도메인 1(CH1)을 포함하는 폴리펩타이드 서열, Fc 도메인의 부분, 제1 폴리펩타이드 링커(L1)를 포함하는 폴리펩타이드 서열, 결합 도메인(BD2)을 포함하는 폴리펩타이드 서열, 제2 폴리펩타이드 링커(L2)를 포함하는 폴리펩타이드 서열, 및 Fc 도메인의 잔기를 포함하는 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, Fc 도메인은 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. 따라서, 특정 구현예는 N-말단에서 C-말단으로 하기 배향의 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있는 BiSAb 키메라 중쇄를 제공한다: VH1-CH1-CH2(N-말단)-L1-BD2-L2-CH2(C-말단)-CH3; VH1-CH1-CH2-L1-BD2-L2-CH3; 및 VH1-CH1-CH2-CH3(N-말단)-L1-BD2-L2-CH3(C-말단). BiSAb 경쇄의 폴리펩타이드 서열은 경쇄 가변 도메인(VL1) 및 경쇄 불변 도메인(CL)을 포함할 수 있다. 따라서, BiSAb 경쇄는 N-말단에서 C-말단까지 하기 배향의 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다: VL1-CL. VH1, VL1 및 CL은 제1 에피토프를 결합하는 "결합 단위 1"(BD1)의 부분을 나타내기 위해 사용된다. BD2는 제2 에피토프를 결합하는 "결합 단위 2"의 부분을 나타내는데 사용된다.
결합 도메인이 scFv인 양태에서, BiSAb 키메라 중쇄는 항체 중쇄 가변 도메인(VH1)을 포함하는 폴리펩타이드 서열, 항체 중쇄 불변 도메인 1(CH1)을 포함하는 폴리펩타이드 서열, 제1 폴리펩타이드 링커(L1)를 포함하는 폴리펩타이드 서열, 항체 경쇄 가변 도메인(VL2)을 포함하는 폴리펩타이드 서열, 가요성 링커를 포함하는 폴리펩타이드 서열, 항체 중쇄 가변 도메인(VH2)을 포함하는 폴리펩타이드 서열, 제2 폴리펩타이드 링커(L2)를 포함하는 폴리펩타이드 서열 및 항체 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다. 따라서, BD2로서 scFv를 포함하는 BiSAb의 키메라 중쇄는 N-말단에서 C-말단으로 하기 배향의 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다: VH1-CH1-CH2(N-말단)-L1-VL2-L3-VH2-L2-CH2(C-말단)-CH3; VH1-CH1-CH2-L1-VL2-L3-VH2-L2-CH3; VH1-CH1-CH2-CH3(N-말단)-L1-VL2-L3-VH2-L2-CH3(C-말단); VH1-CH1-CH2(N-말단)-L1-VH2-L3-VL2-L2-CH2(C-말단)-CH3; VH1-CH1-CH2-L1-VH2-L3-VL2-L2-CH3; 및 VH1-CH1-CH2-CH3(N-말단)-L1-VH2-L3-VL2-L2-CH3(C-말단).
키메라 중쇄는 아미노산 서열(예를 들어, 각각의 폴리펩타이드 도메인의 아미노산 서열)을 포함하는 폴리펩타이드 사슬이다. 키메라 중쇄는 아미노산 서열(예를 들어, 각각의 폴리펩타이드 도메인의 아미노산 서열)을 포함하는 폴리펩타이드 사슬이다. VH1, VL1 및 CL이 결합 단위 1의 일부를 나타내는데 사용되며, VH1 및 VL1은 제1 에피토프를 결합하는 부분을 나타낸다. VH2 및 VL2는 제2 에피토프를 결합하는 결합 단위 2의 부분을 나타내기 위해 사용된다. 특정 양태에서, 추가의 scFv 결합 도메인은 BiSAb 코어를 구성하는 폴리펩타이드의 N-말단 및/또는 C-말단에 존재한다(여기에서, BiSAb 코어는 결합 단위(BD) 3 및/또는 4 및/또는 5를 추가로 포함함). 특정 양태에서, 하나 이상의 scFv 결합 도메인이 BiSAb 코어 내에 존재한다. 각각의 추가 scFv는 VH3, VH4, VH5로 표시되는 항체 중쇄 가변 영역 및 VL3, VL4, VL5로 표시되는 상응하는 항체 경쇄 가변 영역을 포함한다.
6. 라벨, 접합체 및 모이어티
특정 특징에서, 약물 및 다른 분자는 부위-특이적 접합을 통해 BiSAb를 표적화될 수 있다. 예를 들어, BiSAb는 (결합 단위 및/또는 Fc 도메인으로 조작된 시스테인을 포함하는) 시스테인 조작된 도메인을 포함할 수 있으며, 이는 접합 반응을 위한 유리 티올기를 생성한다. 특정 양태에서, BiSAb는 특정 접합 부위를 통합하도록 조작된다. 일부 양태에서, 본 발명은 Fc 변이체 BiSAb를 제공하며, 여기서 Fc 영역은 EU 지표에 의해 넘버링된, 위치 239, 282, 289, 297, 312, 324, 330, 335, 337, 339, 356, 359, 361, 383, 384, 398, 400, 440, 422, 및 442 중 하나 이상에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 양태에서, Fc 영역은 하기 위치 그룹 중 하나 이상에 치환을 포함한다: a) 289 및 440; b) 330 및 440; c) 339 및 440; d) 359 및 440; e) 289 및 359; f) 330 및 359; g) 339 및 359; h) 289 및 339; i) 330 및 339; j) 289 및 330; k) 339 및 442; l) 289, 339 및 442; m) 289, 330 및 339; n) 330, 339 및 442; 및 o) 289, 330, 및 442. 다른 양태에서, 본 발명은 Fab 아암의 CH1 도메인이 EU 지표에 의해 넘버링된, 위치 131, 132, 134, 135, 136 및 139 중 하나 이상에서의 치환을 포함하는 BiSAb를 제공한다. 일 양태에서, 치환은 시스테인, 라이신, 티로신, 히스티딘, 셀레노시스테인 및 셀레노메티오닌으로부터 선택된 아미노산으로의 치환을 포함한다. 특정 양태에서, 치환은 시스테인이다. 안정한 시스테인 조작된 항체를 생성시키는 방법은 미국 특허 제7,855,275호, 미국 특허 출원 제20110033378호 및 미국 특허 제20120213705호에 기재되어 있으며, 그 내용은 전체가 본원에 참고로 포함된다.
7. 예시적인 표적
본원에 기술된 다양한 DuetMab 및 BiSAb 플랫폼과 관련된 양태 및 구현예가 임의의 원하는 표적 또는 표적들에 결합하도록 생성될 수 있지만, 본 명세서에 개시된 BiSAb는 바람직하게 표적 분자의 특정 쌍을 표적화한다(예를 들어, 결합 단위 1은 표적 중 하나와 결합하고, 및 결합 단위 2는 다른 표적과 결합한다). 상기 논의된 바와 같이, 및 하기 실시예에서 예시된 바와 같이, 본원에 기술된 항체, DuetMab 및 BiSAb는 수혜 대상체에서, 또는 배양된 면역 세포에서 면역 반응을 조절하는 분자로 표적화된다. 일부 구현예에서, 결합 도메인은 CTLA-4, PD-1, PD-L1, OX40 및 TIM3으로 구성된 그룹으로부터 선택된 표적에 대해 특이적 결합 활성을 나타낸다. DuetMab 및 BiSAb는 도메인이 본원에 개시된 표적에 대해 결합 친화력을 가지거나 표적에 특이적으로 결합하는 다양한 순서 및 배향으로 상이한 결합 도메인의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 DuetMabs 및 BiSAb는 표적에 대한 이중특이적 결합을 허용하는 결합 도메인의 조합을 포함할 수 있다; CTLA-4 및 PD-1; CTLA-4 및 PD-L1; 및 CTLA-4; CTLA-4 및 TIM3; PD-1 및 PD-L1; PD-L1 및 OX40; PD-1 및 TIM3; PD-L1 및 TIM3;. 특정 표적 조합을 결합시키는 결합 도메인을 포함하는 DuetMabs 및 BiSAb는 실시예에 예시되어 있으며, PD-1/CTLA-4; PD-L1/CTLA-4; PD-1/TIM3; 및 PD-L1/OX40의 비-제한적인 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, BiSAb는 BiSAb를 생성시키는데 사용되는 조합된 개별 단일특이적 결합 단백질의 결합 특성에 비해 향상된 결합 특성을 갖는다.
특정 양태에서, 본 발명의 DuetMab 또는 BiSAb는 동일한 표적 상의 2개의 상이한 에피토프를 결합시킨다(예를 들어, 결합 단위 1이 표적 상의 제1 에피토프를 결합시키고, 결합 단위 2가 동일한 표적 상의 제2 에피토프를 결합시킴).
일부 양태에서, 본 발명의 DuetMab 또는 BiSAb의 다중체성 성질은 특정 세포 유형 또는 분자 표적에 라벨 또는 치료제를 표적화하는 능력을 부여한다. 예를 들어, DuetMab 또는 BiSAb의 하나의 기능성 도메인은 세포 표면의 표적에 결합할 수 있지만, 동일한 DuetMab 또는 BiSAb 내의 또 다른 기능성 도메인은 검출에 유용한 합텐 또는 라벨링제에 결합한다. 유사하게, 하나의 기능성 도메인이 세포 표적에 결합하는 반면, 제2 기능성 도메인은 독소에 결합할 수 있다. 두 가지 결합 반응이 단일 분자를 통해 매개되기 때문에, 독소는 세포 표적에 근접하여 위치되어, 세포독성 기능에 영향을 줄 수 있다.
B. BiSAbs를 코딩하는 핵산 분자
본 발명은 BiSAb를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 일 양태는 본 발명의 임의의 BiSAb를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 핵산 분자는 본원에 개시된 임의의 BiSAb 분자뿐만 아니라 본원에 개시된 임의의 개별 결합 도메인(예를 들어, scFv)의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩할 수 있다. 당해 분야의 숙련자는 그러한 폴리뉴클레오타이드 분자가 당 분야에 일반적으로 공지된 바와 같이 특정 유기체에 대한 코돈 빈도뿐만 아니라 핵산 코돈 축퇴가 주어지는 뉴클레오타이드 서열이 변할 수 있음을 인식할 것이다.
C. BiSAb를 생산하고 후속 정제하기 위한 벡터 및 숙주 세포
본 발명은 BiSAb를 제조하는 방법에 관한 것이다. 특정 양태에서, 본원에 개시된 BiSAb의 전부 또는 일부를 코딩하는 재조합 핵산 분자는 발현 구조물 내의 하나 이상의 조절 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. BiSAb 경쇄 및 키메라 중쇄를 코딩하는 핵산 서열은 임의의 배향(예를 들어, 중쇄의 전방에서 경쇄 또는 그 반대 방향)으로 동일한 발현 벡터에서 클로닝되거나, 2개의 상이한 벡터에서 클로닝될 수 있다. 하나의 벡터를 사용하여 발현이 수행된다면, 2개의 코딩 유전자는 그들 자신의 유전 요소(예를 들어, 프로모터, RBS, 리더, 정지, polyA 등)를 가질 수 있거나, 유전 요소의 단일 세트로 클로닝될 수 있지만, 시스트론 요소와 연결될 수 있다. 조절 뉴클레오타이드 서열은 일반적으로 발현에 사용되는 숙주 세포에 적합할 것이다. 다양한 유형의 적당한 발현 벡터 및 적합한 조절 서열이 다양한 숙주 세포에 대해 당 분야에 공지되어 있다. 전형적으로, 상기 하나 이상의 조절 뉴클레오타이드 서열은 프로모터 서열, 리더 또는 신호 서열, 리보솜 결합 부위, 전사 개시 및 종결 서열, 번역 개시 및 종결 서열, 및 인핸서 또는 활성제 서열을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 당해 분야에 공지된 구성적 또는 유도성 프로모터가 본 명세서에 의해 고려된다. 프로모터는 자연 발생 프로모터, 또는 하나 이상의 프로모터의 요소를 결합하는 하이브리드 프로모터일 수 있다. 발현 구조물은 에피솜(episome)상의 세포, 예컨대 플라스미드에 존재할 수 있거나, 발현 구조물은 염색체에 삽입될 수 있다.
특정 양태에서, 발현 벡터는 형질전환된 숙주 세포의 선택을 허용하기 위한 선택가능한 마커 유전자를 함유한다. 선택가능한 마커 유전자는 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 사용된 숙주 세포에 따라 변할 것이다. 특정 양태에서, 본 발명은 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 적어도 하나의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 발현 벡터에 관한 것이다. 조절 서열은 당 분야에 공지되어 있으며, 코딩된 폴리펩타이드의 발현을 지시하도록 선택된다. 따라서, 조절 서열이라는 용어는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 조절 요소를 포함한다. 예시적인, 비-제한적인 조절 서열은 Goeddel; 유전자 발현 기술: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990)에 기술되어 있다. 발현 벡터의 설계는 형질전환될 숙주 세포의 선택 및/또는 발현되기를 원하는 단백질의 유형과 같은 인자에 좌우될 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 특정 벡터의 복제 수, 그 복제 수를 조절하는 능력 및 벡터에 의해 코딩된 임의의 다른 단백질, 예컨대 항생제 마커의 발현도 고려되어야 한다.
본 발명은 또한 본 발명의 BiSAb를 제조하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, BiSAb를 코딩하는 하나 이상의 발현 벡터(예를 들어, 키메라 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 단일 벡터, 또는 하나는 키메라 중쇄를 코딩하고 하나는 경쇄를 코딩하는 2개의 벡터)로 형질감염된 숙주 세포는 폴리펩타이드의 발현이 일어날 수 있게 하는 적절한 조건 하에 배양될 수 있다. BiSAb는 세포 및 폴리펩타이드를 함유하는 배지의 혼합물로부터 분비되고 단리될 수 있다. 대안적으로, BiSAb는 세포질 또는 막 분획 내에 보유될 수 있고, 세포는 수거되고, 용해되고, 단백질은 분리된다. 세포 배양물에는 숙주 세포, 배지 및 기타 부산물이 포함된다. 세포 배양에 적합한 배지는 당 분야에 잘 알려져 있다. BiSAb는 이온-교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 한외여과, 전기영동 및 면역친화도 정제를 포함하여, 단백질 정제 분야에 공지된 기술을 사용하여 세포 배양 배지, 숙주 세포 또는 둘 다로부터 단리될 수 있다. 특정 양태에서, BiSAb는 그의 정제를 용이하게 하는 도메인을 함유하는 융합 단백질로서 제조된다.
재조합 핵산은 클로닝된 유전자 또는 그의 일부를 원핵 세포, 진핵 세포(효모, 조류, 곤충 또는 포유류) 또는 둘 모두에서 발현하기에 적합한 벡터에 결찰시킴으로써 제조될 수 있다. 재조합 폴리펩타이드의 생산을 위한 발현 비히클은 플라스미드 및 다른 벡터를 포함한다. 예를 들어, 적당한 벡터는 하기 유형의 플라스미드들을 포함한다: pBR322-유래의 플라스미드, pEMBL-유래의 플라스미드, pEX-유래의 플라스미드, pBTac-유래의 플라스미드 및 대장균(E. coli)과 같은 원핵 세포에서의 발현을 위한 pUC-유래의 플라스미드. 특정 양태에서, 포유류 발현 벡터는 박테리아내 벡터의 증식을 촉진시키는 원핵생물 서열, 및 진핵 세포에서 발현되는 하나 이상의 진핵생물 전사 단위 모두를 함유한다. pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo 및 pHyg 유래된 벡터는 진핵 세포의 형질감염에 적합한 포유류 발현 벡터의 예이다. 이들 벡터 중 일부는 pBR322와 같은 박테리아 플라스미드로부터의 서열로 변형되어, 원핵 세포 및 진핵 세포 모두에서 복제 및 약물 내성 선택을 용이하게 한다. 대안적으로, 소의 유두종 바이러스(BPV-1) 또는 엡스타인-바아 바이러스(pHEBo, pREP-유래의 및 p205)와 같은 바이러스의 유도체가 진핵 세포내에서 단백질의 일시적 발현에 사용될 수 있다. 플라스미드의 제조 및 숙주 생물의 형질전환에 사용되는 다양한 방법이 당 분야에 공지되어있다. 원핵 세포 및 진핵 세포 모두를 위한 다른 적합한 발현 시스템 및 일반적인 재조합 과정에 대해서는 Molecular Cloning　A Laboratory　Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 챕터 16 및 17을 참조한다. 경우에 따라, 바큘로바이러스 발현 시스템을 사용하여 재조합 폴리펩타이드를 발현하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 바큘로바이러스 발현 시스템의 예로는 pVL-유래의 벡터(예컨대, pVL1392, pVL1393 및 pVL941), pAcUW-유래의 벡터(예컨대, pAcUW1) 및 pBlueBac-유래의 벡터(예컨대, pBlueBac III 함유 β-gal)가 있다.
일단 분자가 생성되면, 이는 예를 들어 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화력, 특히 특정 항원 단백질 A 또는 단백질 G에 대한 친화력, 및 크기별 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차별화된 용해도 또는 단백질 정제를 위한 기타 표준 기술을 사용하여 단백질, 면역글로불린 분자 또는 다른 다중 분자의 정제를 위해 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 정제될 수 있다. 또한, 본원에 개시된 분자는 정제를 용이하게 하기 위해 일상적으로 사용되는 이종 폴리펩타이드 서열(예를 들어, 친화력 태그)에 융합될 수 있다.
BiSAb가 어떻게 생성되고 정제되는지에 관계없이, BiSAb의 기능적 결합 활성을 확인하기 위해 결합 분석, 예를 들어 이중 ELISA 분석이 수행될 수 있다(정제 전 및/또는 후에). 이러한 결합 분석은 당 분야에 일반적으로 공지되어있다.
D. 약학적 제형
특정 양태에서, 본 발명은 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물은 BiSAb를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 조성물일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 또한 DuetMab, BiSAb, DuetMab의 조합, 또는 BiSAb의 조합 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물일 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 약학적 조성물은 약제로서 사용된다.
E. 용도
본원에서 논의된 바와 같이, DuetMab 및 BiSAb는 예를 들어 면역억제 활성을 억제함으로써 및/또는 표적 분자(들)과 결합된 면역 반응을 유도함으로써, 면역요법에 반응할 수 있는 암 및 세포 증식성 질환 또는 질병과 관련된 표적을 결합시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이상 신호 및/또는 억제된 면역 반응은 원하지 않는 세포 증식 및 암에 기여할 수 있다. 따라서, DuetMabs. BiSAb 및 본원에 개시된 항체는 암에 대해 표적화된 억제, 감소 또는 불충분한 면역 반응과 관련된 원하지 않는 세포 증식 및/또는 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 특히, 종양의 종양 성장 곡선 및/또는 종양의 부피는 대상체, 예컨대, 예를 들어 암을 앓는 인간 환자에서 면역 반응을 유도 및/또는 자극하는 BiSAb의 DuetMab의 투여에 의해 감소될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 본원에 개시된 결합 단백질을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 다양한 방법에 관한 것이다. 일 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 갖는 또는 발병 위험이 있는 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 대상체의 암에 대한 면역 반응을 활성화시킨다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 대상체의 암에 대한 면역 반응을 향상시킨다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 대상체에서 억제되는 면역 반응 경로를 활성화시키고, 상기 활성화는 대상체에서 암을 표적화하는 면역 반응을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 대상체의 암을 표적화하는 면역 반응 경로를 강화시킨다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 암을 치료하는 방법은 대상체에서 암의 성장을 정지시키거나 늦추는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 암을 치료하는 방법은 대상체의 다른 영역으로 암의 전이를 정지시키거나 늦추는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 암을 치료하는 방법은 대상체에서 암세포를 사멸시키는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 암을 치료하는 방법은 대상체에서 암세포의 증식 및/또는 퍼짐을 정지시키는 단계를 포함한다.
상기 양태의 다양한 구현예에서, 상기 방법은 종양 질환 및/또는 암 질환에 대한 대상체의 치료에 관한 것이다. 구현예에서, 암은 대상체에서 유도된 면역 반응에 민감한 암의 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 암은 난소암, 유방암, 결장직장암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁암, 고환암, 방광암, 두경부암, 흑색종, 췌장암, 신장 세포 암종, 또는 폐암 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 암은 소화기관 또는 위장 암(예를 들어 항문 암; 담관 암; 간외 담관 암; 충수 암; 유암종, 위장암; 결장암; 소아 결장직장암을 포함한 결장직장암; 소아 식도암을 포함하는 식도암; 담낭암; 소아 위암을 포함하는 위장(위)암; 성인(원발성) 간세포 암 및 소아 간세포 암을 포함하는 간세포 암(예를 들어, 간세포 암종); 소아 췌장암을 포함하는 췌장암; 육종, 횡문근육종; 섬 세포 췌장암; 직장 암; 및 소장암); 폐암(예를 들어, 비-소세포 폐암(NSCLC) 및 소세포 폐암(SCLC)); 두경부암(예를 들어, 입술 및 공동암; 소아 구강암을 포함한 구강암; 하인두암; 소아 후두암을 포함한 후두암; 잠복원발(occult primary)을 갖는 전이성 편평 경부암; 구강암; 비강 및 부비동암; 소아 비인두암을 포함하는 비인두암; 구강인두암; 부갑상선암; 인두암; 소아 타액선 암을 포함한 타액선 암; 인후 암; 및 갑상선암); 난소암 및 유방암으로부터 선택된다.
상기 방법에서, 대상체에게 투여되는 결합 단백질의 양은 면역 반응을 유도하고, 면역 반응을 증가시키며, 암의 성장을 중지 또는 지연시키고, 암의 전이를 중지 또는 지연시키고, 암 세포를 살해하고, 및/또는 대상체에서 암세포의 증식 및/또는 확산을 늦추거나 중지시키기에 효과적이다.
상기 방법의 구현예에서, 결합 단백질은 본원에 개시된 바와 같은 DuetmAb 또는 BiSAb를 포함한다. 상기 방법의 일부 구현예에서, 결합 단백질은 본원에 개시된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 인간 및 비-인간 동물, 특히 포유동물을 포함하는 것으로 의도된다. 대상체의 예는 인간 대상체, 예를 들어 질환, 예를 들어 본원에 기술된 질환, 예컨대 암을 갖는 인간 환자, 또는 정상 대상체를 포함한다. "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 비-포유동물(예컨대, 닭, 양서류, 파충류) 및 포유동물, 예컨대 비-인간 영장류, 가축 동물 및/또는 농업에 유용한 동물(예컨대, 양, 개, 고양이, 소, 돼지 등) 및 설치류(예컨대 마우스, 래트, 햄스터, 기니아 피그 등)를 포함한다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간 환자이다.
"치료" 또는 "치료하는"은 치료적 치료 및 예방적 또는 방지적 조치 모두를 지칭한다. 치료가 필요한 대상체는 이미 질환이 있는 대상체뿐만 아니라 상기 질환을 갖기 쉬운 대상체 또는 상기 질환이 예방된 대상체를 포함한다. 치료를 필요로 하는 질환 또는 대상체에 관해서 사용되는 경우, 용어는 이에 따라 질병 진행의 중단 또는 감속, 질병의 완화, 증상의 예방, 질병 및/또는 증상 중증도의 감소, 또는 치료되지 않은 대상과 비교하여 질병 길이의 감소를 포함한다. 구현예에서, 치료 방법은 치료되는 특정 질병의 하나 이상의 임상 징후를 경감시킬 수 있다.
하기 실시예는 상기에 제공된 본 발명의 특정 양태 및 구현예를 예시하기 위해 제공되며, 설명의 범위 또는 첨부된 청구 대상을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
재료 및 방법
면역 반응 조절 분석
사이토메갈로바이러스(CMV) 항원 회수 분석법을 사용하여 본원에 기재된 특정 면역치료 분자에 의해 유도된 잠재적인 면역 반응을 평가하였다. 분석을 위한 시약은 하기를 포함한다:
- CMV 반응성 냉동 말초 혈액 단핵 세포(PBMC);
- AIM V® 배지(Life Technologies, cat #12055-091);
- 인산 완충 식염수(PBS, Life technologies, cat #20012-043);
- PepTivator®, CMVpp65 펩타이드 풀(Miltenyi Biotec, cat #130-093-438, 50μg/ml);
- 오발부민(Thermo scientific cat #77120, 1mg/ml);
- Costar, 96 웰 플레이트 비-TC 처리됨(코닝, cat #3788); 및
- 면역요법 분자.
일반적인 분석 프로토콜:
분석 전날, 동결된 PBMC를 따뜻한 AIM V 배지에서 해동시켰다. 세포를 Costar 96 원형 웰 플레이트에서 2회 세척하였다. 세포 농도를 1x106 세포/mL의 농도로 조정하였다.
세포의 분취량(100μL)을 개별 웰에 분배하여, 플레이트의 외부 컬럼 및 행을 공백으로 남겼다. 세포를 밤새 휴지시켰다.
다음날, 2X PepTivator CMV 펩타이드 풀(0.1μg/ml-0.05μg/ml 최종) 및 2X 면역요법 분자를 함유하는 100㎕의 AIMV 배지를 웰에 첨가하였다.
72시간 후, 각 웰로부터의 25 ㎕의 상청액을 예비-차단되고 세척된 MSD 플레이트(항-인간 IFN 감마)에 옮겼다. 표준 첨가 후, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 배양 기간 후, MSD 플레이트를 3회 세척하였다. 세척 후, SULFO-TAG 검출 항체 25 μL를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 플레이트를 다시 세척하고, 판독 전에 150㎕의 2X MSD 판독 완충액을 첨가하였다.
포도상구균 장내독소(Staphylococcal enterotoxin) A/B(SEA/SEB) 분석 프로토콜
IL-2 면역 반응에 대한 DuetMab 또는 BiSAb의 효과를 측정하기 위해 SEB 또는 SEA 분석 프로토콜 중 어느 하나에 사용되는 시약은 하기를 포함한다:
- 백혈구 추상체(NHSBT 코드 NC24, Addenbrookes 병원제);
- 50ml 팔콘(Falcon) 튜브(BD 352070);
- Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare 17-1440-02);
- 항-CD3(클론 OKT3; 1mg/ml; eBioscience; cat 번호: 16-0037-85);
- 염화 암모늄 용액(Stemcell Technologies 07850);
- -20℃에서 저장한 1mg/ml의 포도상구균 장내독소 A(SEA; Sigma, S-9399) 또는 포도상구균 장내독소 B(SEB; Sigma, S-4881) 스톡 용액
- 배양 배지(모두 Life Technologies제): 10% v/v 열 불활성화된 FCS(90005M) 및 100U/ml 페니실린 + 100ug/ml 스트렙토마이신(15140-122)이 보충된 글루타맥스(glutamax)(61870)를 갖는 RPMI1640;
- V-바닥 플레이트(Greiner BioOne 651201);
- 96-웰 평판(Corning Costar 7107).
IL-2 DELFIA ELISA를 위한 시약은 하기를 포함한다:
- FLUONUNC Maxisorp ELISA 플레이트(Nunc 437958);
- 유로퓸-표지된 스트렙타비딘, SA-Eu(Perkin-Elmer 1244-360);
- DELFIA® 분석 완충액(Perkin-Elmer, #4002-0010);
- DELFIA® 증강 용액(Perkin-Elmer 4001-0010); 사용하기 전, RT에서;
- 분석 희석액: 0.1% BSA이 보충된, 멸균 여과된 DELFIA 세척 완충액(0.05% Tween-20, 20mM Tris, 150mM NaCl; pH 7.2-7.4);
- 분유(Marvel; Premier Foods);
- 시료 희석제(상기와 같이, RPMI1640 + 10% FCS + 1% 페니실린/스트렙토마이신);
- PBS(ThermoFisher 14190235);
- PBS-Tween(PBS 중 0.01% Tween-20);
- 인간 IL-2 ELISA 키트(Duoset DY202, R&D Systems);
- 자동 플레이트 로더(Biostack)가 장착된 Biotek 플레이트 와셔(EL406).
일반적인 분석 프로토콜
밀도 구배 원심분리(Ficoll-Paque PLUS; GE Healthcare)를 사용하여 인간 혈액 백혈구 추상체(NHS 혈액 및 이식 서비스 코드 NC24)로부터 PBMC를 분리한 다음, 염화 암모늄 용액(Stemcell Technologies)에 적혈구를 용해시켰다. 항-인간 CD3(PBS 0.5ug/ml에서의 클론 OKT3; eBioscience)을 평평한-바닥 96 웰 플레이트(Corning Costar 7107)에 37℃에서 2시간 동안 코팅하였다. 그런 다음, 배양 배지(10% v/v 열 불활성화된 소 혈청 및 100 U/100ug/㎖ 스트렙토마이신/페니실린(각각)(Life Technologies)이 보충된 RPMI1640-Glutamax)에 PBMC의 0.2x106 세포를 웰 당 첨가하였다. 포도상구균 장내독소 A 또는 B(SEB; Sigma Aldrich)를 0.0088 내지 0.1ug/mL 범위 내에서 첨가하여, PBMC를 추가로 자극하고, 최종 시험 농도에 후보 DuetMab 또는 BiSAb를 첨가하였다. 37℃에서 3일 배양한 후 5% CO2 상등액을 세포에서 제거하고, 제조사의 지침(R&D Systems Duoset 제품 코드 DY202)에 따라 상업적 ELISA를 사용하여 IL-2 분비를 측정하였다.
혼합된 백혈구 반응(MLR) 분석 프로토콜(신선한 혈액)
MLR 세포-기반 분석법을 사용하여, 본원에 개시된 DuetMab 및 BiSAb에 반응하여 T 세포 기능의 생체외 상관관계를 제공하였다. 신선한 혈액 샘플에서 MLR 분석을 수행하는데 사용되는 시약은 하기를 포함한다:
- 8 mL CPT 헤파린 튜브;
- AIM-V 배지(혈청 없음) Gibco # 12055-091, 첨가제 없음;
- 원추형 튜브 50ml
- 2ml 저온보존 바이알;
- ACK 용해 버퍼(Gibco # A10492-01);
- 96 웰 조직 배양 처리된 U-바닥 플레이트 BD 팔콘(falcon) #3077;
- 양성 대조군으로서 PHA(Roche) 1mg/ml(최종 농도 10ug/ml);
일반적인 분석 프로토콜
PBMC는 CPT 헤파린 튜브 내로 흡입된 혈액 샘플로부터 제조되었다. 튜브를 25℃에서 브레이크없이 2700 rpm으로 20분 동안 원심분리한다. 혈청의 최상층이 흡인된다. 나머지 물질을 부드럽게 피펫팅하였고, CPT 튜브 플러그 위에 모든 것을 수집하고, 50ml 원뿔형 튜브에 배치되었다. 세포에 AIM-V 배지를 첨가하여 세포를 세척하였다(1500 rpm에서 3회, 25℃에서 5분간 브레이크). 적혈구 용해물 완충액(예를 들어, 약 3ml 완충액으로 약 5분)을 사용하여 남아있는 적혈구를 용해시켰다. 나머지 세포를 AIM-V 배지로 2회 세척하였다(1500 rpm, 25℃에서 5분간 브레이크). 필요한 경우, 펠릿을 단일 튜브로 통합하고, AIM-V 배지에 재현탁하고, 세포 수를 측정하였다.
MLR 분석을 수행하기 위해, 세포를 공여체 당 50ul, AIM-V 배지 중 웰 당 공여체 당 200,000개의 세포로 96 웰 플레이트에 도말하였다(총 400,000/100ul). 후보 분자는 무 혈청 AIM-V 배지로 희석된 웰당 50 ㎕를 첨가하였다(4x). 72시간 후, 플레이트를 촬영하고, 인간 TH1/TH2(MSD) 사이토카인 분석을 위해 30 ul의 상등액을 제거하였다.
인간 TH1/TH2 MSD 10-플렉스 프로토콜
이 분석은 본원에 개시된 DuetMab 및 BiSAb의 투여에 반응하여 배양 상등액 중에 존재하는 사이토카인의 양을 결정하는데 사용되었다. 분석을 수행하기 위해, 200 mg의 차단제 B를 플레이트 당 20 ml의 PBS에 용해시켜 차단제를 제조하였다. 150ul의 용해된 차단제를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 실온에서 2시간 동안 또는 4℃에서 밤새 진탕시켰다. 상기 웰을 PBST 완충액으로 3회 세척하였다. 냉동된 캘리브레이터 블렌드 10ul을 1ml의 희석액으로 희석하여 교정기를 캘리브레이터를 제조하고, 이어서 4배로 연속 희석하였다. 웰을 분리하기 위해 25ul의 캘리브레이터(표준)와 25ul의 샘플을 첨가했다. 웰을 실온에서 2시간 동안 진탕 배양하였다. 배양 후, 웰을 PBST로 3회 세척하였다.
검출 항체를 제조하고 필요한 농도로 희석하고, 각 웰에 첨가하였다. 2시간 후. 실온에서 진탕 배양하고, 웰을 PBST 중에서 세척하였다(3x). MSD 기기에서 판독하기 전에 판독 버퍼를 각 웰에 첨가하였다.
종양 특이적 살해 분석 프로토콜
인간 gp100209-217 펩타이드에 대한 반응성을 갖는 인간 CD8+ T 세포주(JR6C12)는 Dr. Steven Rosenberg(National Cancer Institute, Bethesda, MD)에 의해 친절하게 제공되었다. JR6C12 세포를 96 웰 평평한 바닥 플레이트에서 1:1 비율(20,000 JR6C12 + 20,000 Mel624)로 37℃에서 18시간 동안 CFSE(CellTrace CFSE 증식 키트, ThermoFisher) 표지된 인간 흑색종 라인(Mel624)과 공동-배양하였다. 후보 분자를 69 nM 농도로 동시-배양시간 0에 첨가하였다. 18시간 후, 명시야 현미경에 의해 웰을 시각화하였다. 상등액을 MSD 분석을 위해 수집하고, 부착 세포를 생존력 염색 이전에 PBS로 트립신 처리하고 세척(2x)하였다(Zombie UV 고정가능한 생존력 키트, Biolegend). CFSE 표지된 세포의 생존력 염색 흡수를 LSRFortessa(BD) 상에서 유동세포계측법에 의해 평가하였다.
실시예 1. 결합 도메인 부착을 위한 후보 Fc 위치의 확인
오픈-소스 소프트웨어 PyMOL 분자 시각화 시스템을 사용하여, 결합 도메인 부착을 위한, 노출된 표면 루프와 같은 후보 영역을 동정하기 위해 CH2 및 CH3 영역뿐만 아니라 CH2-CH3 계면에서 또는 그 부근에서 항체 구조를 조사하였다. 이러한 영역은 IgG 또는 제2 결합 도메인 자체의 구조적 완전성 또는 안정성을 손상시키지 않으면서 제2 결합 도메인(예를 들어, scFv)의 삽입을 수용할 것이다. 분석으로부터, 3개의 영역이 확인되었다(도 1a-1c에서 구체(sphere)로 나타냄). 도 1d, 1e 및 1f는 도 1a, 1b 및 1c에서 각각 확인된 루프 각각에서 제2 결합 도메인(예시를 목적으로 한 scFv와 함께)의 부착을 나타내는 결합 단백질의 구현예를 도시한다.
도 2a는 CH2-CH3 계면 근처의 CH2 영역에서 동정되고, 서열 ISRTP(SEQ ID NO:39)를 포함하는 확인된 대표적인 루프 중 하나의 아미노산 서열의 보다 상세한 개략도를 제공한다. 결합 도메인은 예를 들어, 실시예에 예시된 바와 같은 scFv 도메인(예를 들어, I-scFv-SRTP, IS-scFv-RTP, ISR-scFv-TP, 또는 ISRT-scFv-P scFV-ISRTP, 및 ISRTP-scFV(여기서 "-scFv-"는 결합 도메인이 결합될 수 있는 네이티브 루프 서열의 지점을 식별함))을 삽입하는 것과 같은 임의의 수의 대표적인 구조물을 생성하기 위해 이 아미노산 서열 내에 삽입될 수 있다. 도 2b는 CH2-CH3 계면에서 확인되고 아미노산 서열 AKGQP(SEQ ID NO:40)를 포함하는 루프의 대표적인 유사한 개략도이다. 본원에 기술된 대표적인 구조는 A-scFv-KGQP, AK-scFv-GQP, AKG-scFv-QP, AKGQ-scFv-P, scFV-AKGQ, AKGQ-scFV(여기서, "-scFv-"는 결합 도메인이 결합될 수 있는 네이티브 루프 서열의 지점을 확인함)를 포함하는, 본원에 기술된 상기 루프 서열에 부착된 (예를 들어, scFv 도메인과 같은) 결합 도메인을 포함할 수 있다. 도 2c는 CH3 영역 내에서 CH2-CH3 계면의 하류로 확인되고, 아미노산 서열 SNG를 포함하는 대표적인 루프의 개략도를 제공한다. 상기 두개의 다른 루프 영역에 대한 예시적인 구현예의 관점에서 논의된, 상기 루프 서열에 대한 대표적인 구조물은 scFV-SNG, S-scFv-NG SN-scFv-G 및 SNG-scFV를 포함한다.
실시예 2. 결합 단위의 조합을 포함하는 일련의 모체 항체 및 이중특이성 결합 단백질의 생성 및 특징화
일련의 단클론 항체를 개발 및 특징화하였다. 상기 "모체(parental)" 항체로부터 유래된 항원-결합 서열의 조합(예를 들어, CDRs, HCv, LCv, HC, LC)을 사용하여, 일련의 이중특이성 결합 단백질이 생성되었고, 결합된 표적 항원에 대해 이중특이성 결합 활성을 갖는 것으로 나타났다. 이중특이성 결합 단백질은 본원에 개시된 특정 구조 플랫폼 모티프(즉, "BiS5")를 갖도록 설계되었다.
모체 항체 서열은 하기 표에 기재되어있다:
[표 2a]
[표 2b]
실시예 2(a) PD-1/CTLA-4 이중특이성 결합 단백질
이론에 구애됨이 없이, PD-1 및 CTLA-4 차단제의 조합에 대한 강력한 임상적 및 전임상의 근거가 있다. 따라서, PD-1과 CTLA-4 조합의 위험/이익 비율을 최대화하는 것이 바람직할 것이다(도 4).
PD-1 및 CTLA-4에 결합하는 하기의 이중특이성 결합 단백질을 표 2에서 상기 확인된 모체 서열을 사용하여 생성하였다. Bis2, Bis3 및 Bis5로 동정된 단백질을 하기에서 확인된 서열로 생성하고, 동시에 하기 논의된 바와 같은 옥텟(octet) 결합 분석을 사용하여 항원 결합 활성을 평가하였다.
[표 3]
옥텟 결합 분석(BiS2, BiS3 및 BiS5)
본원에 개시된 이중특이성 결합 분자의 결합을 평가하기 위해, Ni-NTA 바이오센서 팁이 장착된 옥텟 QK 및 10X 동역학 완충액을 사용하였다(ForteBio, Menlo Park, CA). 이 특정 일련의 이중특이성 결합 단백질에 대해, His-태그된 PD-L1-Fc, his-태그된 PD-1-Fc 및 CTLA-4-Fc(인간 재조합 단백질)를 R&D Systems(Minneapolis, MN)에서 구입했다. 모든 결합 분석은 25℃에서 수행되었다.
분석하기 전에 샘플 플레이트를 1000 rpm으로 교반하였다. Ni-NTA 바이오센서 팁을 5분간 1X 동역학 완충액에 미리-적셨다. 1X 동역학 완충액은 또한 기준선 측정용 러닝(running) 완충액으로서, 및 항원 및 이중특이성 항체용 희석 완충액으로서 사용되었다. Ni-NTA 바이오센서 팁을 약 1분 동안 100 nM his-태그된 PD-L1-Fc(하기 (b) 참조) 또는 his-태그된 PD-1-Fc에 항원 포획을 위해 침지시켰다. 항원-코팅된 바이오센서 팁을 약 5분 동안 10 μg/ml 이중특이성 항체에 각각 침지시킨 다음, 2분 동안 100 nM CTLA-4-Fc 항원을 함유하는 웰 컬럼으로 옮겼다. 결합 결과는 도 3에 개시되어 있다.
PD-1 및 CTLA-4에 결합하는 DuetMab 포맷의 이중특이성 결합 단백질을 표 2에서 상기 확인된 모체 서열을 사용하여 생성하였다. PD-1/CTLA-4 DuetMab을 하기 표 4의 서열에 의해 생성하고, 및 PD-1/CTLA-4 Bis5와 비교를 포함하여 하기 논의된 바와 같이 평가하였다.
[표 4]
옥텟 결합 분석(DuetMab)
2개의 독특한 항원에 대한 동시 결합 연구를 옥텟 분석에 의해 수행하였다. 바이오틴화된 인간 PD-1을 스트렙타비딘 센서 위에 로딩하고, DuetMab PD-1/CTLA-4와 먼저 순차적으로 상호반응시킨 다음 가용성 CTLA-4 항원과 반응시켰다. PBS pH 7.2, 3 mg/ml BSA, 0.05%(v/v) Tween 20(분석 완충액)에서 5 μg/ml로 바이오틴화된 인간 PD-1을 포획하기 위해 스트렙타비딘(SA) 바이오센서(ForteBio)를 사용하였다. 세척 단계 후, 로딩된 바이오센서를 먼저 133 nm에서 DuetMab PD-1/CTLA-4 이중특이성 항체를 운반 샘플 웰에 연속적인 연결 및 분리 상호작용을 실시하고, 그후 200 nm에서 인간 CTLA-4 항원을 운반하는 웰에 연속적인 연결 및 분리 상호작용을 실시하였다. 결합 결과는 도 5에 개시되어 있다.
PD-1/CTLA-4 DuetMab 이중특이성 항체의 본질적인 동역학도 BiaCore를 통해 평가하였다. 결합 실험은 BIAcore T200 기기(BIAcore)를 사용하여 수행하였다. 항체를 포획하기 위해, 마우스 항-huIgG-Fab를 CM5 칩 상에 2000RU의 표적 응답으로 고정시켰다. 100nM의 DuetMab 또는 mAb를 20μL/분으로 5분간 유동시켜, 포획된 항체의 약 100 반응 단위를 달성하였다. 그후, 항원을 5분 동안 50μl/분의 유속으로 연속 주입하였다. 동역학 파라미터(kon 및 koff) 및 해리 상수(KD)는 BIAevaluation 4.1 소프트웨어를 사용하여 비선형 적합도로부터 계산하였다. 결합 결과를 표 5에 나타내었다.
[표 5]
리포터 유전자 분석
리포터 유전자 분석으로부터의 결과는 PD-1/CTLA-4 이중특이성 결합 단백질이 PD-1 및 CTLA-4 경로를 억제함을 보여준다(도 6a-d). BiS5 결합 단백질은 모체와 비교하여 PD-1 효능을 유지하였지만 항-CTLA-4 IgG와 비교하여 약 3배 감소된 효능을 가졌다. DuetMab 항체는 PD-1 효능이 약 9배 감소하고 CTLA-4가 약 16배 감소했다(IgG4P와 비교). 당 분야에서는 CTLA-4 표적화가 감소되었지만 기능적 활성을 유지하는 분자가 필요하다(예를 들어, SEB 분석에서 아래에 나타낸 바와 같음). 따라서, PD-1/CTLA-4 이중특이성 결합 단백질은 환자에게 안전 혜택을 제공할 잠재력을 가지고 있다.
포도상구균 장내독소 B(SEB) 분석
SEB 분석으로부터의 결과는 DuetMab 및 BiS5Ab가 SEB 1차 면역 세포 분석(도 7)에서 동등한 활성을 갖고, DuetMab이 DummyDuet 대조군 아암과 비교하여 더 큰 활성을 나타냄을 보여주었다(도 8a). DuetMab은 모체 분자의 조합에 대해 대략 동등한 활성을 나타내었고, LO115 또는 CTLA-4 항체 MEDI1123(트레멜리무맙)과 비교하여 더 큰 활성을 보였다(도 8b). 마지막으로, BiS5 및 DuetMab은 새로운 아이소타입 대조군의 조합에 비해 더 큰 활성을 나타냈다(도 9a-b). 데이터는 2회의 독립적인 실험을 통해 4명의 공여체로부터 얻어졌으며, 이러한 특정 분석에는 IFNγ의 사용이 필요했다.
혼합 백혈구 반응(MLR) 분석
MLR 분석을 수행하여 PD-1/CTLA-4 이중특이성 분자를 시험하였다. PD-1/CTLA-4 DuetMab 및 BiS5Ab는 혼합 림프구 반응(MLR) 분석에서 동등한 활성을 나타냈다(도 10a-c). PD-1/CTLA-4 DuetMab은 DummyDuet/아이소타입 대조군 아암의 조합에 비해 더 큰 활성을 보였다.(도 11a-d). PD-1/CTLA-4 DuetMab은 모체 항체 대조군의 조합에 비해 거의 동등한 활성을 갖는다(도 12a-d). 마지막으로, PD-1/CTLA-4 DuetMab은 경쟁 PD-1/CTLA-4 조합과 비교하여 거의 동등한 활성을 갖고, 항-PD-1 단독(예를 들어, 펨브롤리주맙(pembrolizumab) 및 니볼루맙(nivolumab))보다 더 큰 활성을 나타냈다(도 13a-d).
약동학 및 약력학(PK/PD) 연구
사이노몰구스 원숭이의 단일 용량 약동학/약력학(PK/PD)을 시험하기 위한 연구를 수행하였다. 연구 설계는 도 14에 도시되어 있다. DuetMab은 사이노몰구스 원숭이에서 명확한 약력학(PD)을 보여 주었으며, 두 분자 모두에서 강력한 PD 반응이 관찰되었다(도 15a-b). 따라서, 생체 내 환경에서 PD-1/CTLA-4 이중특이성 결합 단백질의 생존력을 확인하는 것은,
T 세포 의존성 항체 반응(TDAR)
사이노몰구스 원숭이에게 지시된 용량(0.5, 5, 50 mg/kg)의 DuetMab 또는 BiS5 이중특이성 분자를 정맥내(복재 정맥 또는 뇌의 정맥 내) 투여하였다. 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 단백질을 멸균 조건 하에 적당량의 주사용 멸균수로 재구성하였다. 저용량 KLH 용액을 2회에 걸쳐 각 동물의 등에 피하 투여하였다(1일 및 29일). 추가 분석을 위한 혈액 샘플을 모든 동물로부터 얻었다. KLH-특이적 IgM 및 IgG 항체 역가의 평가를 수행하였다. 원숭이 혈청내 항-KLH 항체를 ELISA를 사용하여 검출하였다.
PD-1/CTLA-4 DuetMab(도 16a) 및 PD-1/CTLA-4 BiS5Ab(도 16b)가 투여된 사이노몰구스 원숭이에서 T 세포 의존성 항체 반응(TDAR)이 관찰되었다.
다양한 수준의 인간 PD-1 및/또는 CTLA-4를 발현하는 CHO 세포
다양한 수준의 인간 PD-1 및/또는 CTLA-4를 발현하는 안정한 CHO 세포를 사용하여 PD-1/CTLA-4 이중특이성 분자를 연구하기 위한 모델 시스템을 개발하였다(도 17). 형광-표지된 가용성 PD-1 및 CTLA-4 단백질을 사용하여 유동-세포계측법에 의해 세포-결합된 DuetMab상의 유리 항원 결합-아암을 검출하였다. 이 분석의 결과는 PD-1/CTLA-4 DuetMab이 동일한 세포의 표면상의 PD-1 및 CTLA-4와 동시에 결합한다는 것을 보여준다(도 18a-c).
CTLA-4는 클라트린-코팅된 피트 내로 연속적으로 세포내이입되어, 임의의 주어진 시간에서 세포 표면에서 발현되는 수용체의 작은 분획만을 얻는다. 세포 표면 CTLA-4의 재사용은 신속하며, CTLA-4 표면의 80% 이상이 5분 이내에 내재화된다. 따라서, 과다 PD-1을 발현하는 세포상의 CTLA-4의 포화 상태에서 PD-1/CTLA-4 DuetMab과 항-PD-1 및 항-CTLA-4 항체의 조합을 차별적으로 동시작동성 결합시키는 지의 여부를 연구하기 위한 실험이 수행되었다(도 19a-c). 각 표적 항원의 수용체 점유율은 표지된 항-PD-1 및 항-CTLA-4 mAb를 사용하여 독립적으로 결정하였다.
모체 단클론 항체는 표적화되지않은 수용체에 측정가능한 효과없이 그들의 표적 수용체에 결합하고 점유한다는 것을 발견하였다(도 20a-d). PD-1/CTLA-4 DuetMab는 단클론 항체의 조합과 비교하여 약 250배 낮은 농도로 과량의 PD-1을 발현하는 CHO 세포 상에서 CTLA-4를 포화시켰다(도 21a-d). CTLA-4만을 발현하는 세포와 비교하여 약 500배 낮은 농도로 과량의 PD-1을 발현하는 CHO 세포 상에서 PD-1/CTLA-4 DuetMab은 CTLA-4를 포화시켰다(도 22a-f). PD-1/CTLA-4 DuetMab은 전체 미리-혼합된 CHO 군집 내에서 이중 덩어리 형성의 정량에 의해 결정된 바와 같이 동일한 세포 표면 상의 PD-1 및 CTLA-4에 우선적으로 시스 결합했다(도 23a-b). 그러나, PD-1/CTLA-4 DuetMab은 또한 단일 발현 세포에 트랜스로 결합할 수 있다. PD-1/CTLA-4 DuetMab은 모체 항-CTLA-4 항체, 트레멜리무맙의 내재화 특성을 나타냈다(도 24a-d). 이론에 얽매이지 않고, 이 분자가 나타내는 효과는 PD-1의 하향조절을 유도할 가능성이 있다. PD-1/CTLA-4 DuetMab의 내재화 특성은 또한 10배 초과 PD-1을 발현하는 안정한 CHO 세포에서도 관찰되었다(도 25b).
실시예 2(b) PD-L1/CTLA-4 이중특이성 결합 단백질
PD-L1 및 CTLA-4에 결합하는 하기의 이중특이성 결합 단백질은 표 2에서 상기 확인된 모체 서열을 사용하여 생성하였다. Bis2, Bis3 및 Bis5로 동정된 단백질을 하기 표 6의 서열로 생성하고, 하기 동정된 서열은 상기 섹션 2(a)에서 기술된 바와 같은 옥텟 결합 분석을 사용하여 동시 항원 결합 활성에 대해 평가하였다(도 26)
[표 6]
실시예 2(c) PD-1/TIM3 이중특이성 결합 단백질
PD-1 및 TIM3에 결합하는 하기의 이중특이성 결합 단백질(표 7)을 상기 표 2에서 확인된 모체 서열을 사용하여 생성하였다. Bis3, Bis5 및 DuetMab로 식별된 단백질을 하기에서 확인된 서열로 생성하고, 옥텟 분석에 의한 동시 결합 연구에 대하여 평가하였다. 간단히 말하면, 스트렙타비딘(SA) 바이오센서(ForteBio)를 사용하여, PBS pH 7.2, 3 mg/ml BSA, 0.05%(v/v) Tween 20(분석 완충액)에서 2 μg/ml의 바이오틴화된 인간 TIM3-IgV 도메인을 포획하였다. 세척 단계 후, 먼저 상기 로딩된 바이오센서를 200nM에서 이중특이성 항체를 보유하는 샘플 웰 및 이어서 200nM에서 PD-1 항원을 갖는 웰로 연속적으로 결합 및 해리 상호작용을 수행하였다. 바이오틴화된 인간 TIM3-IgV 도메인을 스트렙타비딘 센서 상에 로드한 다음 먼저 이중특이성 분자와 순차적으로 상호작용시킨후, PD-1 항원과 순차적으로 상호작용시킨다. 결합 결과를 도 27a-27b에 나타내었다.
[표 7]
종양-특이적 살해 활성 분석
로젠버그(Rosenberg) 클론-흑색종 살해 분석.
TIM3/PD-1 이중특이성 결합 분자 및 모체 TIM3 항체의 일반적인 세포 살해 활성을 로젠버그 클론(Rosenberg Clone): JR6C12 및 흑색종(Melanoma) 세포주: Mel324를 사용하여 시험하였다.
일반적인 분석 프로토콜
JR6C12 세포는 이펙터로서 기능하고, 흑색종 환자로부터 확대되고 gp100-흑색종 항원에 특이적인 인간 CD8+ T 세포주이다. 치료 잠재력을 평가하기 위해, Mel624 종양 세포를 형광 표지하고 TIM3 및/또는 PD-1에 결합하는 이펙터 항체(JR6C12) 및 후보 항체를 첨가하였다. 세포를 16시간 동안 공동 배양하였다. 도 28a의 다중 패널은 항-PD1 또는 PD-1/TIM3 이중특이성 분자(표 7에 기재됨)와 조합하여 TIM3 62의 첨가가 T 세포 활성화 및 종양 살해를 향상시키는 시각적 표현을 제공한다.
또한, 도 28b-28c에 도시된 바와 같이, PD-1/TIM3 이중특이성 분자는 (b) 종양 세포 생존력 염색 흡수 및 (c) IFN-감마 분비에 의해 평가된 바와 같이 항-TIM3, 항-PD-1 또는 아이소타입 대조군 단일요법에 비해 가장 큰 종양 살해 능력을 입증한다.
클론 62 이외에, DuetMab 포맷으로 PD-1 및 TIM3에 결합하는 또 다른 이중특이성 결합 단백질을 표 2에서 상기 확인된 모체 서열을 사용하여 생성하였다. PD-1/TIM3 DuetMab은 하기 표 8의 서열로 생성하였다. TIM3 아암의 서열은 클론 62의 친화도 성숙 변이체인 O13-1로부터 얻어졌으며, 항-PD-1 아암의 서열은 LO115로부터 얻어졌으며, 이것은 상기 기술된 PD-1/CTLA-4 DuetMab 이중특이성 항체에 대하여 사용한 PD-1 아암과 동일하다. PD-1/TIM3 BiS3 및 BiS5와의 비교를 포함하여, PD-1(LO115)/TIM3(O13-1) 이중특이성 항체를 하기 논의된 바와 같이 평가하였다.
[표 8]
옥텟 결합 분석법(DuetMab, TIM3 아암 친화도 성숙 변이체)
2개의 독특한 항원, PD-1 및 TIM3에 대한 동시 결합 연구를 옥텟 분석에 의해 수행하였다. 바이오틴화된 인간 TIM3을 스트렙타비딘 센서 위에 로딩하고, PD-1/TIM3 DuetMab와 먼저 순차적으로 상호반응시킨 다음 가용성 PD-1 항원과 반응시켰다. PBS pH 7.2, 3 mg/ml BSA, 0.05%(v/v) Tween 20(분석 완충액)에서 5 μg/ml로 바이오틴화된 인간 PD-1을 포획하기 위해 스트렙타비딘(SA) 바이오센서(ForteBio)를 사용하였다. 세척 단계 후, 로딩된 바이오센서를 클론 62 TIM3의 친화도 성숙 변이체인 TIM3 아암(O13-1)을 갖는 DuetMab PD-1/CTLA-4 이중특이성 항체를 운반하는 샘플 웰로 먼저 연속적으로 결합 및 해리 상호작용을 수행하고, 그후 200 nM에서 로딩한 다음 인간 PD-1 항원을 보유하는 웰에 연속적인 결합 및 해리 상호작용을 수행하였다. 결합 결과는 도 29에 개시되어 있다.
PD-1/TIM3 DuetMab 이중특이성 항체의 본질적인 동역학도 BiaCore를 통해 평가하였다. 결합 실험은 BIAcore T200 기기(BIAcore)를 사용하여 수행하였다. 항체를 포획하기 위해, 마우스 항-huIgG-Fab를 CM5 칩 상에 2000RU의 표적 응답으로 고정시켰다. 100nM의 DuetMab 또는 mAb를 20μL/분으로 5분간 유동시켜, 포획된 항체의 약 100 반응 단위를 달성하였다. 그후, 항원을 5분 동안 50μl/분의 유속으로 연속 주입하였다. 동역학 파라미터(kon 및 koff) 및 해리 상수(KD)는 BIAevaluation 4.1 소프트웨어를 사용하여 비선형 적합도로부터 계산하였다. 결합 결과를 표 9에 나타내었다.
[표 9]
인간 TIM3 또는 인간 PD-1(도 30 및 표 25), PD-1 및 TIM3 발현(DMF4)을 과발현하는 CHO 세포에 결합된 BiS3, BiS5 및 DuetMab을 포함하는 PD-1/TIM3 이중특이성 항체가 도 31에 도시되어 있다.
[표 25]
CMV Ag 회수 분석
BiS3, BiS5 및 DuetMab을 포함하는 PD-1/TIM3 이중특이성 항체는 아이소타입 처리와 비교하여 CMV 항원 회수 분석에서 CD8+ T 세포 증식을 강화시켰다(도 32a-c).
혼합된 백혈구 반응(MLR) 분석
BiS3, BiS5 및 DuetMab를 포함하는 PD-1/TIM3 이중특이성 항체는, 단일- 및 조합 요법보다 활동이 증가하는, 혼합된 림프구 반응(MLR) 분석에서 인터페론(IFNγ) 분비를 향상시켰다(도 33a-d).
BiS3, BiS5 및 DuetMab를 포함하는 PD-1/TIM3 이중특이성 항체는 PD-1(87% PD-1 단일 양성)을 주로 발현하는 jurkat NFκB 리포터 계통에서 모체 LO115 IgG1과 유사한 활성을 나타내었다(도 34a-c).
요약하면, PD-1/TIM-3에 대해 3개의 이중특이성 포맷(DuetMab, Bis3 및 Bis5)이 생성되었다. 모든 이중특이성 포맷은 항 PD-1과 동등하거나 더 우수한 시험관내 기능을 나타내며, 이는 상기 분자가 현재의 면역-종양학 전략에 우월한 이점을 제공할 수 있음을 시사한다.
실시예 2(d) OX40/PD-L1 이중특이성 결합 단백질
PD-L1 및 OX40을 결합시키는 하기의 이중특이성 결합 단백질을 표 2에서 상기 확인된 모체 서열을 사용하여 생성하였다. Bis2, Bis3 및 Bis5로 확인된 단백질을 하기 표 10의 서열로 생성하고, 동시에 하기 논의된 옥텟 결합 분석을 사용하여 항원 결합 활성을 분석하였다.
[표 10]
옥텟 결합 분석
본원에 개시된 이중특이성 결합 분자의 결합을 평가하기 위해, Ni-NTA 바이오센서 팁이 장착된 옥텟 QK 및 10X 동역학 완충액을 사용하였다(ForteBio, Menlo Park, CA). 이 특정 일련의 이중특이성 결합 단백질에 대해, His-태그된 PD-L1-Fc, his-태그된 PD-1-Fc 및 hOX40-Fc(인간 재조합 단백질)를 R&D Systems(Minneapolis, MN)에서 구입했다. 모든 결합 분석은 25℃에서 수행되었다.
샘플 플레이트를 분석 전에 1000 rpm으로 교반하였다. Ni-NTA 바이오센서 팁을 5분간 1X 동역학 완충액에 미리 적시었다. 1X 반응 완충액은 또한 기준선 측정용 러닝 완충액으로서, 및 항원 및 이중특이성 항체용 희석 완충액으로서 사용되었다. Ni-NTA 바이오센서 팁을 약 1분 동안 100 nM his-태그된 PD-L1-Fc(하기 (b) 참조) 또는 his-태그된 PD-1-Fc에 항원 포획을 위해 침지시켰다. 항원-코팅된 바이오센서 팁을 약 5분 동안 10 μg/ml 이중특이성 항체에 각각 침지시킨 다음, 2분 동안 100 nM hOX40-Fc 항원을 함유하는 웰 컬럼으로 옮겼다. 결합 결과는 BiS2/BiS3 OX40Ab/PD-L1 분자가 PD-L1-His 및 hOX40-Fc 모두에 결합하고, BiS2 OX40Ab/PD-L1이 BiS3 OX40Ab/PD-L1보다 큰 친화도로 결합한다는 것을 보여준다. BiS2 PD-1/OX40을 대조군으로 사용하였다(도 35).
포도상구균 장내독소 B(SEB) 분석
상기한 프로토콜을 사용하는 SEB 분석은 OX40/PD-L1 이중특이성 분자가 BiS2 및 BiS3 포맷 모두에서 활성이 있음을 보여 주었다(도 36a-b).
PD-L1 리포터 분석
재료:
- 세포주 및 배양 조건:
- 인간 PD-1 Jurkat NFAT 루시퍼라제 클론 2 리포터
- CHO scFv OKT3(UBC)를 발현하는 PD-L1(모든 세포는 가습 조직 배양물 배양기에서 37℃에서 RPMI 1640 배지 + 10% FBS 및 1X pen/strep 항생제(RPMI 완전 배지)에서 유지됨).
- RPMI-1640, LifeTechnologies cat # A1049101
- 열 불활성화된 신생 송아지 혈청(FBS), LifeTechnologies cat # 26010074
- 완전한 RPMI 배지: RPMI-1640 + 10% FBS
- 100X 페니실린/스트렙토마이신, LifeTechnologies cat # 15140-122
- 96 웰 TC 처리된 평평한 바닥 배양 플레이트, Costar 3903, VWR cat # 29444-010
- SteadyGlo 루시퍼라제 분석 시스템(Luciferase Assay System), Promega, cat # E2510
- 시험 항체
- EnVision 멀티라벨(Multilabel) 플레이트 리더, Perkin Elmer
방법:
PD-L1 억제의 중화를 위한 2-세포 생체활성 분석을 위해, PD-L1 발현 CHO scFv OKT3 세포를 트립신처리하고, 따뜻한 RPMI 완전 배지로 중화시키고, 50 mL 원추형 튜브에 수집하였다. 세포를 RT에서 5분간 380g으로 펠렛화한 다음, 신선한 RPMI 완전 배지에 현탁시키고 Vi 세포 계수기로 계수하였다. CHO scFv OKT3 세포를 발현하는 PD-L1 발현을 0.4e6/mL로 조정하고 웰 당 25μL(10,000 세포)를 플레이트 레이아웃으로 나타낸 바와 같이 플레이팅하였다. 세포를 3시간 동안 플레이트에 부착시켰다. 그 후, 시험 시약(2X 최종 농도)을 함유하는 50 ㎕의 RPMI를 CHO 세포 상에 분주하고, 추가로 1시간 동안 배양하였다. 이 배양은 시험 시약이 CHO 세포 표면의 PD-L1에 결합하는 시간을 제공한다. 1시간에, PD-1 발현 Jurkat NFAT 루시퍼라제 리포터 세포를 50 mL 원추형 튜브에 모으고, 실온에서 5분간 380 g으로 펠렛화하고, 신선하고 따뜻한 RPMI 완전 배지에 재현탁하였다. 세포를 1.2e6/mL로 조절하고, PD-L1 발현 CHO scFv OKT3 세포 및 시험 물질을 갖는 웰에 25μL(30,000) 세포를 플레이팅하였다.
PD-1 Jurkat 리포터 세포 활성화를 위해 세포 및 시험 시약을 18시간 동안 추가로 배양하였다. 그 후, SteadyGlo 루시퍼라제 시약을 제조하고, 각 웰에 100 ㎕씩 분주하였다. 완전한 용해는 15분 동안 RT(200 rpm 오비탈 쉐이커)에서 조심스럽게 진탕함으로써 달성되었다. 용해 후, 루시퍼라제 활성을 US96 발광 프로토콜을 사용하는 Envision 멀티라벨(Multilabel) 플레이트 판독기로 측정하였다. 루시퍼라제 RLU를 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism) 소프트웨어에서 로그[시험 시약]에 대해 플롯팅하고, 시그모이드 용량-반응 곡선의 비-선형 회귀 분석, 4-매개변수 적합성을 사용하여 PD-L1 길항에 대한 EC50 값을 결정하였다.
결과:
출발점 100nM(PD-L1)의 5점 투여량 적정을 사용하여 PD-L1/PD-1 모체 및 NIP228(G4P) 대조군에 대해 OX40/PD-L1 BiS2/3를 시험하였다. OX40-PD-L1 BisAb는 PD-L1(4736) 모체보다 활성이고, 더 강한 작용을 갖는 것으로 나타났다(도 37). BiS2 및 BiS3 포맷도 비슷하게 수행된다.
CMV Ag 회수 분석법
(상기한 프로토콜을 사용하는) CMV Ag 회수 분석에서, BiS2 및 BiS3 분자는 조합과 비교하여 동일한 활성을 나타냈다(도 38).
상기 논의된 모든 결합 및 면역 반응 분석은 본원에 개시된 이중특이성 결합 분자가 두 표적 분자에 대한 특이적인 결합을 나타내고 - 몇몇 경우에는 개개의 단일특이적 모체 결합 분자(항체)의 조합보다 더 큰 결합 활성을 나타내고, 면역 반응을 유도하거나 증진시킬 수 있다. 또한, 분자는 암 세포주에 대해 세포 살해 활성을 갖는 것으로 나타났다. 따라서, 데이터는 이러한 분자 및 이중특이성 플랫폼 구조가 면역-종양학 치료제의 우수한 후보물질이라는 것을 보여준다.
옥텟 결합 분석(OX40(SLR)/PD-L1 BiS5)
본원에 개시된 이중특이성 결합 분자의 결합을 평가하기 위해, Ni-NTA 바이오센서 팁이 장착된 옥텟 QK 및 10X 동역학 완충액을 사용하였다(ForteBio, Menlo Park, CA). 이 특정 일련의 이중특이성 결합 단백질에 대해, His-태그된 PD-L1-Fc, his-태그된 PD-1-Fc 및 hOX40-Fc(인간 재조합 단백질)를 R&D Systems(Minneapolis, MN)에서 구입했다. 모든 결합 분석은 25℃에서 수행되었다. 결합 결과는 BiS5 OX40Ab/PD-L1 분자가 PD-L1-His 및 hOX40-Fc 둘다에 결합한다는 것을 보여준다(도 39).
인간 또는 사이노몰구스 OX40 및 PD-L1/B7H1을 발현하는 CHO 세포를 발현하는 CHO 세포에 결합된 PD-L1/OX40 BiS5(도 40a-f). PD-L1/OX40 BiS5 구조물의 결합은 또한 유동 세포계측법(HyperCyt)에 의해 측정되었다(도 42). OX40 IgG4P 및 OX40/PD-L1 이중특이성은 Jurkat OX40 리포터 세포에 결합하였다. PD-L1 IgG 및 OX40/PD-L1 이중특이성은 NCI H358 및 CHOK1 B7H1(PD-L1)/OKT3 세포에 결합하였다. 모든 IgG와 이중특이성은 HEK CD32a 세포에 결합하였다.
PD-L1 및 OX40 리포터 분석
(상기 논의된 프로토콜을 사용하는) PD-L1 리포터 분석에서, 이중특이성을 함유하는 모든 PD-L1 scFv 및 양성 대조군 IgG는 활성을 나타내었다(도 42a-b). 단일 아암 OX40 대조군 및 아이소타입 대조군은 이 분석에서 어떠한 활성도 나타내지 않았다. EC50 값과 언덕 경사는 항 PD-L1 모체 대조군 및 PD-L1 Bis2, Bis3 및 Bis5 구조물에 대한 이전의 분석에서 얻어진 값과 일치한다.
HEK CD32a 세포를 사용하는 OX40 리포터 유전자 분석에서, 이중특이성 구조물은 서로 동일한 활성을 가지며, Fc 매개된 작동작용이 관찰되었다(도 43a-b). OX40/PD-L1 Bis5 N434A IgG1은 OX40 IgG4P 및 MEDI0562(OX40 IgG1)와 동등한 EC50 활성을 가졌다.
세포를 과발현하는 CHOK1 PD-L1을 사용하는 OX40 리포터 유전자 분석에서, OX40/PD-L1 이중특이적 항체는 동등한 작용을 나타낸다(도 44a-b). OX40/PD-L1 Bis5 N434A IgG1은 시험된 OX40/PD-L1 Bis5 이중특이성 MAb의 다른 Fc 변이체에 대해 동등한 EC50 활성을 나타냈다. OX40 IgG 또는 PD-L1 IgG에 대한 항진증은 검출되지 않았다. 따라서, PD-L1 매개된 OX40 작용이 입증되었다.
OX40/PD-L1 이중특이성 분자를 사용하여 종양 세포로 PD-L1 매개된 OX40 작용제가 검출되었다(도 45a-b). OX40/PD-L1 이중특이성 분자는 이 분석에서 동일한 작용 - 종 모양의 곡선을 나타냈다. OX40 IgG에 대한 작용이 관찰되지 않았기 때문에, OX40 IgG + PD-L1 IgG 조합에 비해 이중특이성을 이용하는 이점이 있음을 입증하였다. NCI H358 PD-L1 KO 세포(도 46a-d)에서는 작용이 관찰되지 않았으며, 이는 세포에서 관찰되는 NCI H358 작동작용이 PD-L1 특이적이라는 것을 나타낸다.
포도상구균 장내독소 B(SEB) 분석
SEB 분석에서, OX40/PD-L1 이중특이성 분자는 OX40 및 PD-L1에 대한 개별 항체의 조합보다 더 큰 활성을 갖는다(도 47a-d). 특히, G4P 구조물은 G1 구조물보다 더 큰 활성을 가졌다. 야생형, YTE 함유 변이체 및 N434A 변이체는 동등한 활성을 나타냈다.
Treg 억제 분석
OX40/PD-L1 이중특이성 분자를 시험하기 위해 Treg 억제 분석을 수행하였다(도 48a-c). OX40/PD-L1 이중특이성 분자는 PD-L1의 존재 하에서만 CD4+Teff에서 활성화되었다(도 49 및 도 50). 이론에 구애됨이 없이, 이는 OX40의 트랜스 가교결합을 나타낸다. OX40/PD-L1 이중특이성 분자는 Treg 억제 효과를 억제하였지만, 플레이트-고정화된 PD-L1에 결합함으로써 가교될 때만 억제되었다.
혼합 백혈구 반응(MLR) 분석
OX40/PD-L1 이중특이성 분자를 시험하기 위해 MLR 분석을 수행하였다(도 51a-b). OX40/PD-L1 이중특이성 분자는 OX40 및 PD-L1에 대한 개별 항체의 조합보다 더 큰 활성을 나타냈다(도 52a-e).
항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC) 분석
OX40/PD-L1 이중특이성 분자를 시험하기 위해 ADCC 분석을 수행하였다. 20:1의 이펙터 대 표적(E:T) 비율에서, 이펙터 세포로서 새로 단리된 NK 세포 및 표적 세포로서 각각 CHOK1 PD-L1 B7H1 및 CHOK1 OX40 과발현 세포를 사용한 ADCC 분석. 5시간 후에 표지된 표적 세포로부터 유로퓸(Europium)의 방출을 사용하여 표적 세포 용해를 분석하였다. ADCC 분석에서, OX40/PD-L1 BiS2 및 BiS5는 PD-L1 또는 OX40 발현 CHO 세포에 대한 ADCC를 매개하였다(도 53 및 54).
10:1의 E:T 비율에서, 이펙터 세포로서 새로 단리된 NK 세포 및 표적 세포로서 CHO K1을 과발현시키는 PD-L1 및 OX40을 사용하여 CD107a 동원 분석(mobilisation assay)을 수행하였다. NK 세포의 세포 표면 상에 대한 CD107a 동원은 4시간 후에 유동 세포 계측법에 의해 분석되었다. BiS2 및 BiS5 OX40/PD-L1 이중특이성 분자는 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC) 분석에서 PD-L1 및 OX40 발현 CHO 세포에 대한 NK 세포의 CD107a 동원을 증가시켰다(도 55). BiS2 및 BiS5 OX40/PD-L1 이중특이성 분자는 OX40 및 PD-L1을 상향-조절한 활성화된 동종이형성 T 세포에 대한 NK 세포의 CD107a 동원을 증가시켰다(도 56). BiS5 OX40/PD-L1은 활성화된 동종이형성 T 세포에 대한 2개의 상이한 공여체로부터의 NK 세포의 CD107a 동원을 증가시켰다(도 57a-b).
약동학 및 약력학(PK/PD) 연구
OX40/PD-L1 이중특이성 분자의 PK/PD를 비교하기 위해 연구가 고안되었다(도 58). PD-L1/OX40 이중특이성 분자에 대한 혈청 농도 시간 프로파일을 사이노몰구스 원숭이에서 비교하였다(도 59 및 표 11). Bis5 OX40/PD-L1 IgG1 N434A 분자의 평균 T1/2는 WT Bis5 분자보다 컸으며; Bis5 OX40/PD-L1 IgG1 N434A 분자에 대한 제거율은 WT Bis5 분자에 비해 적었다. 두 분자 모두 유사하게 혈청에서 가용성 PD-L1을 감소시켰고, Ki67+ 전체 메모리 CD4+ T 세포, 전체 메모리 CD8+ T 세포 및 NK 세포의 비율을 유의하게 증가시켰다.
[표 11]
OX40/PD-L1 이중특이성 분자는 혈청 용해성 PD-L1 농도를 분석 LLOQ 아래로 감소시켰다(도 60). N434A 돌연변이는 BiS5-OX40/PD-L1-G1의 약동학을 향상시켰다. 특히, CL은 약 절반으로 감소했으며; T1/2와 AUCinf의 상응하는 2-배 증가가 있었으며; Cmax 및 Vss는 영향을 받지 않았다. 이것은 단클론 항체의 PK에 대한 이 돌연변이의 이전에 보고된 효과와 일치한다. 따라서, BiS5-OX40/PD-L1-G1 IO BisAb에 대한 mAb-유사 PK에 대한 진전이 이루어졌다. BiS5-OX40/PD-L1-G1 BiSAbs의 혈청 농도는 2주에 정량화 한계(BLOQ)를 밑돌았으며, ADA와 관련이 있을 수 있다.
PD-L1 OX40 Bis5 그룹을 대조군(항 PcrV-Psl 대조군) Ab 그룹과 비교하여, 전체 메모리 CD4, 전체 메모리 CD8 및 NK 세포 증식(Ki67+ 세포의 퍼센트)에서 실질적 및 통계적으로 유의한 증가가 관찰되었다(도 61a-f). 전체 메모리 CD4, 전체 메모리 CD8, NK 세포 증식(Ki67+)에서 PD-1 LO115 PD-L1 OX40 Bis5 그룹간에 유의한 차이가 있는 경향이 나타났다. PD-L1 OX40 Bis5 N434A(반감기 연장) 버전과 G1 버전 사이의 증식에는 통계적으로 유의한 차이가 없었다. PD-L1 OX40 Bis5 N434A 및 IgG1 버전은 생물학적으로 활성인 이중특이성 분자이다.
실시예 2(e). OX40/PD-1 이중특이성 결합 단백질
PD-1 및 OX40에 결합하는 하기의 이중특이성 결합 단백질을 표 2에서 상기 확인된 모체 서열을 사용하여 생성하였다. Bis2 및 Bis3으로 동정된 단백질을 하기 표 24의 서열로 생성하였으며, 하기에 논의된 바와 같이 옥텟 결합 분석법을 사용하여 동시 항원 결합 활성에 대하여 평가하였다.
[표 24]
PD-1/OX40 BiS2 단클론 항체(mAb)는 인간 및 사이노몰구스 원숭이 PD-1 및 인간 및 사이노몰구스 원숭이 OX40에 동시에 결합하도록 조작된 이중특이성 항체이다(도 62; 회색으로 묘사된 PD-1 결합 단백질 및 밝은 회색으로 묘사된 OX40 결합 단백질). 이론에 구속됨이 없이, 제안된 작용 기작은 OX40 및 PD-1 모두에 대한 시스 결합 후 T 세포에 대한 이중 신호전달 효과, T 세포 동시-자극성 표면 수용체 OX40의 작용 및 면역억제성 PD-1의 차단을 제시한다(도 63).
옥텟 결합 분석법
PD1-His 및 인간 OX40-Fc에 대한 PD-1(LO115)/OX40 BiS2 mAb의 2개의 상이한 로트에 대해 동시 결합 활성이 나타났다(도 64).
OX40 리포터 분석
PD-1(LO115)/OX40 BiS2 mAb는 다른 OX40 작동제와 유사한 활성을 나타냈다(도 65a-b). 단백질을 4℃에서 보관하고, 즉시 사용하고, 3회 동결/해동하여 4℃에서 7일 동안 보관하고 40℃에서 7일 동안 보관하였다. 활성은 상대적인 빛 단위 대mAb의 농도로 보고되었다. EC50은 0일째에 4℃에서 PD1(LO115)/OX40 BiS2 mAb에 대해 약 2 nM이었다.
PD-1/PD-L1 리포터 분석
PD-1(LO115)/OX40 BiS2 mAb는 다른 PD-1 작동제와 유사한 활성을 나타냈다(도 66a-b). 단백질을 4℃에서 보관하고 즉시 사용하고, 3회 동결/해동하여 4℃에서 7일 동안 보관하고, 40℃에서 7일 동안 보관하였다. 활성은 상대적인 빛 단위 대mAb의 농도로 보고되었다. EC50은 0일째에 4℃에서 PD1(LO115)/OX40 BiS2 mAb에 대해 약 1nM이었다. 1차 인간 시험관내 효능 분석 2세트를 수행하였다; 항원-회수 T 세포 분석 및 포도상구균 장내독소 B(SEB)를 이용한 T 세포 동시-자극.
포도상구균 장내독소 B(SEB) 분석
SEB 분석에서, PD-1(LO115)/OX40 BiS2 mAb는 배양 3일 후에 세포의 상등액에서 검출된 IL-2의 수준의 증가를 유도하였다(도 67). 따라서, PD-1/OX40 BiS2 mAb는 그의 인간 표적 항원에 동시에 결합할 수 있고, 시험관내에서 T 세포를 공동-자극할 수 있다.
항원-회수 분석에서, PD-1/OX40 BiS2 mAb는 모체 mAb 및 모체 mAb의 조합(도 68 및 도 69)과 비교하여 인터페론(IFN)-γ의 수준의 증가를 유도하였다.
CMV Ag 회수 분석
CMV Ag 리콜 분석(상기한 프로토콜을 사용함)의 결과, BiS2 및 BiS3 분자는 조합과 비교하여 동일한 활성을 나타내지 않았다(도 70). 상기 데이터는 PD-1/OX40 BiS2 IgG4P mAb가 시험관내 및 생체내에서 활성임을 보여준다. PD1/OX40 BiS2와 구조가 상이한 PD-1/OX40 BiS3는 검출가능하게 활성이지 않았다. 따라서, PD-1/OX40 BiS3(비활성)은 BiS2(활성)와 상이하다.
약동학 및 약력학(PK/PD) 연구
사이노몰구스 원숭이는 PD-1/OX40 BiS2 mAb의 기능적 활성을 시험하기 위해 약리학적으로 관련된 비임상적 종으로 간주되었다. PD-1/OX40 BiS2 mAb의 약동학(PK) 및 약력학(PD)은 사이노몰구스 원숭이의 비-GLP(Good Laboratory Practices) 연구에서 평가하였다. 0.1 mg/kg 내지 30 mg/kg의 용량 범위에서 단일 정맥내(IV) 용량을 투여한 후 사이노몰구스 원숭이(n=3; 수컷)에서 PD-1(LO115)/OX40 BiS2 mAb PK 및 PD(% Ki67 양성 CD4+ 및 CD8+ 전체 메모리 T 세포)를 평가하였다. PBMC를 투여 전, 및 투여 후 1일, 8일, 11일 및 15일에 수집하고, 동결보존하고, 및 유동 세포계측법으로 분석하기 전에 해동시켰다. 요약하면, PD1(LO115)/OX40 BiS2 mAb는 0.6-1.7일의 짧은 반감기를 갖는 대략 선형 PK를 나타내었다(도 70; 표 12).
[표 12]
평균 피크 농도(Cmax)는 0.1 mg/kg에서 2.0 μg/ml으로부터 30 mg/kg에서 607 μg/ml로 대략적으로 비례하여 증가하였다. AUC∞는 0.1 mg/kg에서 1.7 μgㆍ일/mL로부터 30 mg/kg에서 577 μgㆍ일/mL로 대략적으로 용량-비례적으로 증가하였다. 정상-상태 분포 용량은 43.2 mL/kg 내지 85.6 mL/kg 범위였다. PD 결과(도 71)는 CD4+ 전체 메모리 T 세포증식(Ki67)의 용량-의존적 증가 및 CD8+ 전체 메모리 T 세포 증식(Ki67)의 증가를 나타냈다. 사이노몰구스 원숭이 혈청에서 PD-1/OX40의 정량에 대한 대표적인 표준 곡선이 도시된다(도 72).
실시예 3. BiSAb 구조물의 물리적 및 화학적 안정성
다른 이중특이성 결합 단백질 구조적 전략 및 플랫폼에 비해 본원에 기재된 바와 같은 BiSAb 구조물의 물리적 및 화학적 안정성을 평가하고 평가하기 위해 일련의 실험을 수행하였다. 특히, 아래에 논의된 일련의 안정성 연구는 BiSAb의 안정성(예컨대, 가수 분해, 단편화, 응집, 열 안정성)에 대한 다양한 pH 범위의 효과를 확인 및 분석하였다. 데이터가 보여주는 바와 같이, 다양한 BiSAb 포맷의 다양한 예시적인 구현예에 대해, 본원에 개시된 BiSAb(하기 연구의 "BiS5"로 및 하기 표 13에 나타낸 D/H 포맷으로 확인됨)는 다른 모든 BiSAb 구조 모티프와 비교하여, 예기치 않은 놀랍고도 물리적이고 화학적인 안정성을 입증하였다.
[표 13]
실시예 3.1
본원에 개시된 BiS 포맷("BiS5")과 "BiS4"로 확인된, 힌지 영역(즉, Fc 및 Fab 영역 사이)에서 연결된 2개의 결합 도메인(scFv 도메인)을 포함하는 또 다른 BiS 포맷 사이에서 추가의 비교를 수행하였다. BiS4 및 BiS5 단백질은 중국 햄스터 난소(CHO)에서 발현되고, 일상적인 크로마토그래피 방법으로 정제되었다. 위에서 언급했듯이, 이 두 가지 포맷은 유사한 Fab 및 scFv 서열을 가지며, 이들 사이의 주된 차이는 scFv 도메인의 위치이다(BiS4의 경우, scFv는 힌지 영역에 위치되어 있으며, 이 특정 BiS5의 경우 scFv는 본원에서 논의된 바와 같이, CH3 도메인의 SNG 루프에 위치되어 있음). 정제된 BiS 분자를 PBS 완충액에 공급하고, 1.54 M-1cm-1의 흡광 계수를 사용하여 NanoDrop ND-1000(Thermo Scientific, Wilmington, Delaware)을 사용하여 단백질 농도를 결정하였다.
pH 스크린 및 단기 안정성 연구
pH 스크린 연구를 위해, BiS4 및 BiS5 항체를 약 12mg/mL로 농축시키고, 6가지 상이한 pH 조건, 20mM 소듐 숙시네이트(pH 5.0), 히스티딘/히스티딘 HCl(pH 5.5, 6.0 및 6.5) 및, 인산 나트륨(pH 7.0 및 7.5)에 대해 투석하고, 모두 240mM 수크로오스를 함유한다. Slide-A-Lyzer 투석 카세트(10 kDa 분자량 컷오프(MWCO), Thermo-Fisher, Rockford, Illinois)를 사용하여 투석을 수행하였다. 투석 완료 후, 0.02% 폴리소르베이트 80을 첨가하고, 단백질의 최종 농도를 약 10mg/mL로 조정하였다. 0.22μm 필터(Millipore, Billerica, Massachusetts)를 사용하여 사전 소독된 층류 후드에서 BiS4 및 BiS5 제형을 살균하였다. 1 밀리리터 분취량을 3 mL 붕규산 유리 I형 바이알(West Pharmaceutical Services, Exton, Pennsylvania)에 분배하였다. 샘플을 40℃에서 보관하고, 0시 및 1, 2, 3 및 4주 동안 보관한 후 SEC로 분석하였다.
시차 주사 열량계(DSC)
온도 조절된 자동-샘플러(Malvern Instruments Ltd., Westborough, Massachusetts)에 연결된 VP-모세관 DSC를 사용하여 시간 0 샘플에 대한 시차 주사 열량계 써모그램을 수득하였다. 써모그램을 얻기 위해 1 mg/mL의 단백질 농도를 20℃ 내지 100℃의 온도 범위에서 90℃/h의 스캔 속도에 따라 사용했다. 5.0 내지 7.5의 다양한 pH 조건에서 BiS4 및 BiS5의 써모그램은 버퍼 빼기 및 기준선 보정을 수행했다. 데이터 분석은 Origin 7 SR4 소프트웨어 패키지용 DSC 플러그-인을 사용하여 수행하였다. 실험 결과는 용융 온도(Tm) 값을 계산하기 위해 3가지 전이가 있는 다중상태 모델에 적합했다. 첫 번째 열 전이에 대한 열용량(C p ) 값이 500 cal mol-1℃-1에 도달한 지점을 개시 온도(Tonset)로 간주했다.
고-성능 크기-배제 크로마토그래피(HP-SEC)
크기에 기초하여 단량체로부터 응집체 및 단편 종을 분리하기 위해, 안정성 샘플을 7.8 × 30 cm2, 5μm, 250Å, Tosho TSKgel G3000SWxl(TOSOH Biosciences, King of Prussia, Pennsylvania) 및 해당 가드 컬럼으로 200-400 nm UV 흡광도 스펙트럼을 기록할 수 있는 포토 다이오드 어레이 검출기를 갖춘 애질런트(Agilent) 고-성능 액체 크로마토그래피 시스템을 사용하여 분석하였다. 종을 분리하기 위해, 0.1M 인산이수소 무수물, 0.1M 황산나트륨, 0.01% 나트륨 아자이드을 함유하는 이동상, pH 6.8 및 1mL 분-1의 유속을 사용하였다. 주입된 단백질의 양은 약 250㎍이었다. 280nm의 흡광도 스펙트럼을 사용하여 BiS4와 BiS5의 분리를 모니터링하였다. 가용성 응집체(다량체 및 이량체), 단량체 및 단편에 대한 피크 면적을 정량화하였다. 그런 다음, 각 종의 백분율을 계산하고 배양 시간에 대하여 플롯팅하여, 동역학 플롯을 생성하였다. 각 동역학 플롯의 기술기를 계산하여 구강당 단량체 손실, 단편화 및 응집 속도에 대한 pH 프로파일 곡선을 작성했다.
BiS4 및 BiS5의 열 안정성
BiS4 및 BiS5의 열적 안정성에 대한 pH의 영향을 모세관 DSC를 사용하여 얻은 써모그램 분석을 통해 평가하고, 6가지 상이한 pH 조건에서 생성하였다. 도 74a 및 74b는 각각 pH 5.0 내지 7.5의 BiS4 및 BiS5의 DSC 써모그램의 오버레이를 도시한다. 도 74c 및 74d에 도시된 바와 같이, 각각의 써모그램은 전이 온도 Tm1, Tm2, 및 Tm3을 갖는 3개의 열 전개 반응을 나타낸다. 제1 전이(Tm1)는 CH2 및 scFv 도메인의 동시 전개와 관련되는 경향이 있는 반면, 제2(Tm2) 및 제3(Tm3) 전이는 CH3 및 Fab 도메인의 전개와 관련된다. 두 포맷 모두에서 Tonset, Tm1, Tm2 및 Tm3의 증가가 pH 6.5까지 증가하면서 관찰되었다(도 73a, 73b, 73e 및 하기 표 14). BiS4 및 BiS5의 경우, 모든 pH 조건(도 73e 및 표 15)에서 Tonset, Tm2 및 Tm3에서 차이는 관찰되지 않았으며, 이는 힌지 영역 또는 CH3 도메인 중의 scFv의 존재가 CH3 및 Fab의 열 안정성에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다. 흥미롭게도, 모든 pH 조건에서 BiS5에 대한 Tm1의 약간의 증가가 관찰되었으며, 이는 scFv가 CH3 도메인에 위치할 때, scFv, CH2 또는 둘 모두의 열 안정성의 증가를 나타낸다.
[표 14]
BiS4 및 BiS5의 물리적 및 화학적 안정성
상이한 pH 값(5.0 내지 7.5 범위)에서 BiS4 및 BiS5 포맷의 물리적 및 화학적 안정성을 40℃에서 4주 동안 평가하였다. "시간 0"에서의 HP-SEC 크로마토그램 을 사용하여 HP-SEC 크로마토그램의 총 면적, 단량체, 응집체 및 단편 함량을 다른 시점과 비교했다. 4주와 비교하여 pH 7.5 시간에서 BiS4 및 BiS5의 대표 크로마토그램을 도 74a에 나타내었다. 모든 샘플은 낮은 수준의 가용성 응집체를 갖고, 및 단편이 있거나 없는 단량체를 주로 함유한다. 시간이 0일 때(실선), 샘플의 대부분은 단량체이며, 약간의 농도 차이로 인하여 두 샘플 사이의 피크 높이의 작은 차이를 제외하고는 다른 주목할만한 차이가 없다(도 74a). 점선은 40℃에서 4주 동안 보관한 후 동일한 pH 조건에서 두 포맷의 HP-SEC 크로마토그램의 오버레이를 보여준다. 가속된 온도 스트레스 조건 하에서 두 가지 포맷 모두 초기 피크, 초기-용리 피크(다중 종), 단량체의 감소 및 높은 수준의 단편(도 74a)을 보여준다. 단편화로 인한 단량체의 손실은 BiS5와 비교하여 BiS4에서 더 두드러졌는데, 이는 BiS5가 화학적으로 더 안정하다는 것을 나타낸다. 그들의 구조, 가능한 단편화 부위와 유지 시간에 기초하여, 본 발명자들은 작은 단편 피크(RT ~10.8분)가 Fab이고, 큰 단편 피크(RT ~9.8분)와 숄더 피크(RT ~8.7분)가 scFv를 갖는 Fab, 및 Fab, scFv, 및 Fc를 각각 갖는 상응하는 고 분자량 단편(HMWF)이라고 생각한다.
BiS4 및 BiS5의 물리적 및 화학적 안정성에 대한 scFv의 위치 효과를 더 잘 평가하기 위해, 각 종에 대한 퍼센트 면적을 시간 0 및 40℃에서 pH 7.5에 대해 막대 차트로 플롯팅하였다(도 74b). 도 74b에 도시된 바와 같이,시간 0에서, BiS4 및 BiS5에 대한 단량체 순도는 유사하다. 40℃에서 4주 동안 배양된 샘플은 형성된 단편의 종류와 정도에 큰 차이를 보였다. BiS4 샘플의 경우 숄더 피크(RT ~8.7분), 큰 단편(RT ~9.8분) 및 작은 단편(RT ~10.8분)의 11.8%, 7.2% 및 3.5%가 각각 형성되었다(도 74b). 놀랍게도, BiS5 샘플은 scFv를 도메인의 양측에서 Fc로 테더링(tethering)하여 작은 단편(RT ~10.8 분)의 단지 1.4%만을 나타냈다(도 89).
도 75a 내지 75c는 pH 7.5 샘플에 대해 40℃에서 배양된 BiS4 및 BiS5에 대한 응집, 단편화 및 단량체 손실의 동역학을 나타낸다. BiS4 샘플은 BiS5에 비해 단량체의 손실 속도가 더 빨랐다(도 75a). pH 7.5에서 BiS4 및 BiS5에 대한 단량체 손실 속도는 각각 27.4%/월 및 4.5%/월이었다(도 75a). BiS4의 경우, 단량체 손실의 대부분이 단편화로 인해 23.9%/월이었고, 응집으로 인해 3.5%/월(도 75b 및 75c)이었으며, 더 적다. 흥미롭게도 BiS5의 경우, 단편화 속도(1.7%/월)에 비해 응집이 약간 더 높은 비율(2.8%/월)인 것으로 보였다(도 75b 및 75c).
BiS4 및 BiS5 포맷의 물리적 및 화학적 안정성, 단량체 손실 속도, 단편화 및 1개월당 응집에 대한 pH의 효과에 대한 추가 분석을 6가지 pH 조건에 대해 상기 값을 플로팅함으로써 수행하였다(도 76a 내지 76c). pH 5.0 내지 7.5 범위의 6가지 pH 조건 모두에 걸쳐, 단량체 손실 속도는 BiS4와 비교하여 BiS5 포맷에 비해 더 낮았으며(도 76a), 이는 본원에 개시된 BiS5 포맷이 다른 이중특이성 단백질 포맷에 대해 예기치 않게 우수한 물리적 및 화학적 안정성을 가진다는 것을 시사한다. BiS4의 경우, 단량체 분해의 대부분은 더 낮은 pH 조건에서도 단편화로 인한 것이었다(도 76b). BiS5는 시험한 모든 pH 조건에서 BiS4에 비해 더 낮은 단편화 속도를 나타냈다. 놀랍게도, BiS5의 단편화 속도는 BiS4에 비해 넓은 pH 범위에서 편평하고 낮은 것으로 보였다. 특정 이론에 구애됨이 없이, BiS5에서 관찰된 낮은 단편화 속도는 Fc와 연결하는 scFv의 양쪽 말단에 있는 G4S 링커로부터 일어날 수 있다. Fc에 연결되는 G4S 링커 중 하나의 단편화는 다른 G4S 링커를 통해 여전히 Fc에 연결될 수 있으므로 scFv를 방출하지 않을 수 있다. BiS4 및 BiS5에서, 응집 속도는 시험된 모든 pH 조건(도 76c)에서 유사한 것으로 보였으며, 이는 scFv의 위치가 응집 동역학에 최소한의 영향을 미침을 의미하며, 모세관 DSC(위에서 논의한 도 73e 및 표 14)를 사용하여 측정한 모든 pH 조건에서 두 포맷 사이의 Tonset 변화는 관찰되지 않았다. pH 7.5 및 40℃에서(시간=0에서), 어느 분자도 상당한 단편화를 나타내지 않았지만(도 77a), 40℃에서 동일한 조건 하에서 2주간 보관한 후, 상당한 단편화가 BiS4에 대해 관찰되었으며, BiS5에 대하여 최소한의 단편화가 관찰되었다(도 77b). BiS4와 BiS5는 모두 낮은(5.5) pH에서 단편화와 응집을 감소시키는 반면, BiS5는 단편화와 응집 모두에 대하여 두 pH 값에서 우수한 성능을 가졌다(도 78). 이 일련의 실험은 본원에 개시된 BiS5가 우수한 화학적 안정성 및 BiS4의 것과 유사한 물리적 안정성을 보유함을 입증한다.
실시예 3.2
본원에 개시되고 구조물 A-H로 확인된 이중특이성 결합 단백질의 상이한 구현예의 물리적 및 화학적 안정성을 평가하기 위해 추가의 연구를 수행하였다(상기 표 13 및 관련 실시예 참조). DSC, 가속화된 저장 안정성, 및 FcRn 및 FcgR 결합 분석을 사용하여 이들 구조물을 하기와 같이 분석하였다.
시차 주사 열량계 분석
이 데이터 세트에 대한 DSC 실험은 Microcal VP-DSC 주사 마이크로열량계(Microcal)를 사용하여 수행하였다. DSC에 사용된 모든 용액과 샘플을 0.22 μm 필터를 사용하여 여과하고, 열량계에 넣기 전에 탈기시켰다. DSC 연구에 사용된 항체는 분석 SEC에 의해 결정된 바와 같이 > 98% 모노머였다. DSC 분석에 앞서 모든 샘플을 25 mM 히스티딘-HCl(pH 6.0)에서 철저히 투석(적어도 3회의 완충액 교환)하였다. 이 투석으로부터의 완충액을 후속 DSC 실험을 위한 기준 완충액으로 사용하였다. 샘플 측정에 앞서, 샘플 측정에서 기준선 측정(완충액 대 완충액)을 뺐다. 투석된 샘플(1 mg/ml 농도)을 샘플 웰에 첨가하고, DSC 측정을 1℃/분 주사 속도로 수행하였다. 데이터 분석 및 디콘볼루션(deconvolution)은 Microcal이 제공한 Origin™ DSC 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 디콘볼루션 분석은 비-2-상태 모델을 사용하여 수행되었으며, 최상의 핏은 100회의 반복 사이클을 사용하여 얻었다. Tonset은 써모그램이 0이 아닌 기울기를 갖는 것으로 보이는 정성적 온도로 정의되며, Tm은 한 세트에서 분자의 반이 펼쳐지는 온도로 정의되며, 써모그램 상의 각 피크 최대에 대응하는 온도 값으로 계산된다.
상이한 구조물에 대한 결과가 도 79에 제시되어있다. 일반적으로, scFv로서 2F4를 포함하는 구조물 A, C, D는 scFv로서 LC10을 포함하는 구조물 E, G, H와 비교할 때 TM1이 더 낮다. 이론에 구애됨이 없이, TM1 값의 차이는 2F4 가변 도메인에 비해 본질적으로 LC10 scFv 도메인의 열 안정성이 본질적으로 우수하기 때문일 수 있다. 상기 데이타는 scFv로서 2F4를 갖는 구조물 A-D가 scFv로서 LC10을 갖는 구조물 E-H보다 열적으로 덜 안정하다는 것을 시사한다.
가속화된 저장 안정성 분석
구조물의 농도를 1mg/mL로 정규화하였다. 각각의 이중특이성 구조물 또는 IgG 대조군 1 mL를 1.5 ml 에펜도르프 튜브에 분주하였다. 샘플을 45℃에서 2주 동안 정적 배양기에서 배양하였다. 샘플을 3일, 7일 및 14일에 분석하고 안정성을 평가했다. 각 시점에서 시각적 검사를 수행하여 임의의 증가된 탁도 또는 침전량을 기록했다. 샘플을 0.2um 스핀 컬럼을 사용하여 여과하고, 샘플 120ul을 HPLC 바이알에 분주하여, 바이알의 바닥에 기포가 남지 않도록 확인했다. 그런 다음 샘플을 Agilent 1100 시리즈 HPLC-SEC에서 시험하여 러닝 완충액으로서 0.1M 소듐 포스페이트, 0.1M 소듐 설페이트, pH6.8을 갖는 TSK-GEL G3000SWXL(300x7.8mm) Tosoh Bioscience 컬럼을 사용하여 응집 및 분해에 대하여 체크하였다. 샘플 60μL를 1mL/min의 유속으로 주입하고 가동시켰다. 단량체 보유 시간(분), 총 피크 면적, 단량체%, 응집물%, 단편%, 단량체 손실%를 포획하여, 분석용 SEC 분석에 사용하였다. 결과는 표 15에 요약되어 있다.
[표 15]
본원에 기재된 바와 같이, 상기 구조물에서 scFv 도메인의 위치는 하기와 같다(여기서 "-"는 scFv를 나타냄): A 및 E는 IS-RTP에 있고; 및 B와 F는 AK-GQP에 있으며; C와 G는 S-NG에 있으며; 및 D와 H는 SN-G에 있다. 다양한 TM 값은 하기 도메인과 관련된다: TM1 = CH2/scFv; TM2 = Fab; TM3 = CH3. 데이터는 ISRTP(A) 및 SNG(C) 루프에 삽입된 2F4 scFv를 갖는 구조물 A 및 C가 동일한 위치에 삽입된 LC10 scfv를 갖는 구조물 E 및 G보다 응집되기 쉬움을 보여주는 경향이 있다. 이러한 관찰은 scFv 도메인의 서열 동일성 및 행동이 이중특이성 결합 단백질 구조물의 안정성에 영향을 미칠 수 있음을 제시한다. 더욱이, 상기에서, 2F4 scFv를 함유하는 구조물 D는 A 및 C와 유사한 낮은 안정성을 가질 것으로 예측될 수 있었지만; 2F4 scFv를 SNG 루프에 삽입하는 것은 분자를 안정화시키고 응집체를 형성하는 경향을 감소시키는 것으로 보인다. 함께 가속화된 안정성 연구는 scFv 서열 및 Fc 영역 내의 위치가 BiSAb 구조물의 안정성에서 측정가능한 역할을 할 수 있음을 나타낸다.
FcRn 및 FcγR 결합 분석
BIAcore 3000 장치(BIAcore)를 사용하여 결합 실험을 수행하였다. 항체를 포획하기 위해, 1000 RU IsdH(Fab) 항원을 CM5 칩 상에 고정시켰다. 100 nM의 BiSAb 구조물 또는 mAb 대조군을 5분 동안 20 μL/분으로 유동시켜, 항체를 포획하였다. 5uM huFcRn 또는 FcγR I, IIa, IIb, IIIa-158V 또는 IIIA158F를 20분 동안 5μL/분으로 유동시켰다. FcRn 결합은 pH 6.0의 PBS + 5uM EDTA에서 수행한 반면, FcRn 결합은 pH 7.4의 PBS + 5uM EDTA에서 수행하였다.
구조물 A, C, D, E, G 및 H를 FcRn 결합에 대해 평가하였다. 이중특이성 구조물 E 및 H의 각각 및 FcRn에 결합하는 2F4 IgG에 대한 대표적인 데이터가 도 80에 도시되어있다. CH2-CH3 계면의 scFv 하류를 갖는 구조물은 FcRn 결합을 보유하는 것으로 보인다(예를 들어, D&H 구조물). CH2-CH3 계면의 ISRTP 루프 상류내에 위치한 scFv를 갖는 구조물은 검출가능한 FcRn 결합을 제거하는 것으로 보인다(예를 들어, A 및 E 구조물). ISRTP 루프는 FcRn 결합에 중요하다고 알려진 Fc(M252Y/S254T/T256E)의 알려진 반감기 연장 YTE 돌연변이의 영역 내에 있다.
FcγRII, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa-158F 및 FcγRIIIa-158V에 대한 결합에 대해 구조물 A, C, D, E, G 및 H를 시험하였다. 대표적인 데이터는 FcγRIIIa-158V에 결합하는 구조물 E, G 및 H에 대해 도 81에 나타내었다. 시험된 모든 구조물은 상이한 친화도를 가짐에도 불구하고, FcγR에 대한 결합을 보유하였다(도 81, 삽입). 표 16은 FcγR에 대한 다양한 구조물의 관찰된 결합 경향을 나타낸다.
[표 16]
CH2-CH3 계면의 ISRTP 루프 상류에 삽입된 scFv를 갖는 구조물(A 및 E)과의 FcγR 결합에서 관찰된 차이는 CH2-CH3 계면의 SNG 루프 하류에 삽입된 scFv를 갖는 다른 구조물(C, D, G 및 H)과 비교할 때 일관되게 감소된 FcγR 결합을 나타낸다.
구조물 A 및 E에서의 FcRn 결합이 개선되거나 회복될 수 있는지 여부를 평가하려는 시도는 Fc 영역에 반감기 연장 루프(N3)를 도입함으로써 이루어졌다. 도 82는 데이터를 나타내며, E 구조체의 경우, BiS5Ab E 또는 N3 루프 도입된 구조 E(BiS5Ab E + N3)는 FcRn에 결합할 수 없다는 것을 보여준다. 또한, LC10 scFv를 N3 루프(N3 scFv)에 삽입하고 ISRTP 루프를 온전하게 유지하면서 FcRn 결합을 검출가능한 수준 이하로 감소시켰다. 이들 데이터는 적어도 E 구조물에 대해, 본 명세서에 개시된 각각의 구조체가 아니라면, ISRTP 루프 및 N3 루프(존재한다면) 모두가 FcRn 결합을 유지하기 위해 온전하고 변형되지 않을 필요가 있음을 지시한다.
실시예 3.3
BiS4와 본원에 개시된 이중특이성 결합체 구조물(BiS5) 간의 비교 이외에, BiS1, BiS2 및 BiS3으로 확인된 3개의 다른 BiS 구조 모티프 플랫폼을 평가하기 위한 연구가 수행되었다(도 83 참조). 도 83을 참조하여 이해되는 바와 같이, 이들 플랫폼은 결합 도메인 중 하나(scFv 도메인으로 예시됨)의 위치에 따라 다양하다. 다섯 가지 모티프 중 오직 BiS4와 BiS5만이 큰 단백질에 대한 부착 지점으로 2개의 링커 부분을 포함하고, 다른 부분(BiS1, BiS2 및 BiS3)은 단일 링커에 의해 부착된다.
간략하게, 각 구조물의 대표적인 분자를 실시예 3.1 및 3.2에서 논의한 기술을 사용하여 안정성을 분석하였다. 각 구조물 샘플을 pH 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 및 7.5의 완충액에 첨가하고, 2개월 동안 40℃에서 보관하였다. 그후, 샘플을 HP-SEC를 사용하여 단편화 속도(도 84), 응집 속도(도 85) 및 단량체 손실률(도 86)에 대해 분석했다. 이러한 조건 하에서, 분석은 본원에 개시된 이중특이성 결합 단백질 포맷("BiS5" 및 상기 표 13에 나타낸 바와 같은 D/H 포맷)이 모든 pH 조건에서 다른 모든 포맷에 비해 우수한 물리적 및 화학적 안정성을 갖는다는 것을 나타내었다.
SEC 데이터는 또한 다양한 피크를 BiS 분자의 상응하는 단편에 매핑시키는데 사용되었다(도 87). 매핑은 분자의 힌지 및 링커 영역에서 발생하는 단편화, 단편의 크기, 이론적 단편화, 및 다른 포맷으로 관찰된 단편 종에 관해, 예상된 단편 종이 어떻게 정렬되는지의 가정을 기반으로 한다. 각 포맷의 저 분자량 단편(LMWF) 사이에는 좋은 해상도가 있지만, 모든 포맷의 단량체와 고 분자량 단편(HMWF) 사이에는 해상도가 낮거나 전혀 없다. 표 17의 정보를 기반으로, HP-SEC 기술은 단클론 항체보다 더 큰 정도로 BiS 포맷에서의 단편화를 과소평가한다고 결론지었다. 이하에 논의된 대로 대체 분석이 개발되었다.
[표 17]
(i) 분해 동안, 작은 단편이 검출되면, 상응하는 큰 단편이 존재해야하고; (ii) 2차 단편화(단편들의 단편들)는 안정성 시험 기간 동안 크게 일어나지 않고; 및 (iii) 링커 영역 및/또는 힌지 영역에서 단편화가 발생한다는 가정에 기초한 몰 흡광 계수를 사용하여 HMWF의 단편화율을 계산하기 위해 대체 분석을 개발하였다. 단편화 율은 하기 관계를 기반으로 결정되었다:
[표 18]
또한, 디설파이드 결합 형성이 단편화 및 안정성에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위해, 단리 속도의 분석을 환원 조건 하에서 구조물을 사용하여 수행하였다. 이 분석의 대표적인 데이터는 (도 86)에 제시되어있다. 환원 조건 하에, BiS1을 제외하고는 모든 BiS 형식에 대해 높은 단편화 율이 관찰되었다(표 19). 환원 조건 하에 보다 높은 단편화 율은 BiS5 구조체의 scFv 모이어티가 CH3 영역에 테더링되어 있음을 확인시켜주는 것으로 결론지었다(도 89).
[표 19]
[표 20]
상기 개시된 안정화 디설파이드 결합의 특성을 추가로 조사하였다. 그 결과를 하기 표 23 및 표 24에 나타낸다. 2개의 상이한 특이성에 상응하는 이중특이성 항체가 scFv에서 안정화 디설파이드 결합을 갖거나 갖지 않는 BiS4 및 BiS5(SN-G 루프에 삽입된 scFv)에서 생성되었다. 가속화된 안정성 연구는 안정화 디설파이드 결합없이 BiS4 구조물이 안정화 VL-VH 디설파이드 결합을 도입함으로써 저하된 분해로 인해 상당한 단량체 손실을 가졌음을 나타냈다. 이러한 결과는 BiS5 구조물의 scFv 내 안정화 디설파이드 결합의 제거가 그의 안정성에 유의한 영향을 미치지 않았음을 나타낸다.
[표 21]
[표 22]
상기 모든 데이터에 기초하여, 본 명세서에 개시된 이중특이성 결합 단백질 포맷은 시험된 모든 포맷 중에서 가장 안정한 것으로 보인다. 또한, BiSAb5는 단편화 및 응집을 최소화하는 관점에서 시험된 더 낮은 pH 값(예를 들어, 5.0, 5.5 및 6.0)에서 가장 안정한 것으로 나타난다. 이와 같이, 본원에 개시된 BisAb의 예기치 않은 놀라운 안정성 특성은 이중특이성 결합 분자를 조작하는데 사용되는 다른 구조적 플랫폼 및 포맷에 비해 추가적인 이점을 제공한다.
참고문헌에 의한 통합
본원에 언급된 모든 공보 및 특허는 각각의 개별 공보 또는 특허가 구체적으로 및 개별적으로 참고문헌으로 인용된 바와 같이, 본원에 전체적으로 참고 문헌으로 포함된다.
본 발명의 특정 양태들이 논의되었지만, 상기 명세서는 예시적이고 제한적이지 않다. 본 명세서의 다수의 변형은 본 명세서 및 청구 범위를 검토하면 당업자에게 명백해질 것이다. 본 발명의 전체 범위는 하기 청구범위를 참조함으로써, 균등물의 전체 범위, 및 명세서와 함께 상기 변형과 함께 결정되어야한다.
SEQUENCE LISTING <110> MedImmune, LLC <120> BISPECIFIC BINDING PROTEINS AND USES THEREOF <130> IOBS-100 <150> 62/332,788 <151> 2016-05-06 <160> 97 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 711 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr 20 25 30 Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln 115 120 125 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser 130 135 140 Leu Arg Leu Ser Cys Ala 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 16 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys 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cgaccaaagg tccgagcgtg tgcccgctgg caccgagcag caaaagcacc 420 tctggtggca ccgcagcact gggttgtctg gtgaaagatt attttccgga accggttacc 480 gtttcttgga atagcggtgc actgaccagc ggtgttcata cctttccggc agtcctgcag 540 agcagcggtc tgtatagcct gtctagcgtt gttaccgttc cgagcagcag cctgggcacc 600 cagacctata tttgcaatgt gaatcataaa ccgagcaata ccaaagttga taaacgcgtt 660 gaaccgaaaa gcgtggacaa aactcacacg tgcccaccgt gcccagcacc tgagttcgag 720 gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 780 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 840 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 900 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 960 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagccagcat cgagaaaacc 1020 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtct acaccctgcc cccatgccgg 1080 gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg tggtgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1140 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1200 cccgtgctgg actccgacgg 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Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 340 345 350 Tyr Cys Ala Arg Arg Ala Pro Asn Ser Phe Tyr Glu Tyr Tyr Phe Asp 355 360 365 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 370 375 380 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 385 390 395 400 Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 405 410 415 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 420 425 430 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 435 440 445 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn 450 455 460 Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser 465 470 475 480 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly 485 490 495 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 500 505 510 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 515 520 525 Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 530 535 540 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 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Claims (58)

  1. SEQ ID NO:34의 아미노산 서열을 포함하는 제1 펩타이드, 및 SEQ ID NO:32의 아미노산 서열을 포함하는 제2 펩타이드를 포함하는, OX40 및 PD-L1에 결합하는 이중특이성 결합 단백질.
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