TW202222834A

TW202222834A - Ｐｄ－ｌ１抗體及其應用

Info

Publication number: TW202222834A
Application number: TW110145621A
Authority: TW
Inventors: 王�忠; 朱梓焱; 李玉娟; 張盟
Original assignee: 大陸商博際生物醫藥科技（杭州）有限公司
Priority date: 2020-12-08
Filing date: 2021-12-07
Publication date: 2022-06-16
Also published as: WO2022121846A1

Abstract

本發明涉及一種結合至人PD-L1的單株抗體、其抗原結合片段、其藥物組合物以及其在治療癌症過程中的應用。該單株抗體具有對PD-L1的高親和力，能夠在混合淋巴細胞反應中與IL-2的分泌水平表現出良好的劑量依賴性，並且可以被應用於治療癌症。

Description

PD-L1抗體及其應用

本發明涉及結合至人計畫性死亡配體1的單株抗體、其抗原結合片段、其藥物組合物以及其在治療癌症過程中的應用。

計畫性死亡配體1(programmed death-ligand 1，PD-L1)，又可稱為分化簇274(cluster of differentiation 274，CD274)或者B7同源蛋白1(B7 homolog1。B7-H1)，屬於腫瘤壞死因子超家族，是由290個胺基酸殘基組成的I型跨膜糖蛋白，包含一個lgV樣區、一個lgC樣區、一個跨膜疏水區和一個30個胺基酸的胞內尾部，完整分子量為40kDa。與其他B7家族成員一樣，PD-L1也能夠向T細胞提供共刺激訊號。PD-L1 mRNA在幾乎所有組織中都有表現，但PD-L1蛋白只在少部分組織中持續表現，包括肝臟、肺、扁桃體以及免疫豁免組織如眼、胎盤等。PD-L1也表現於活化的T細胞、B細胞、單核細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞等。在正常生理條件下，PD-L1 mRNA處於嚴格的轉錄後調節之下，但PD-L1蛋白在各種人類癌症的細胞表面上大量表現。

PD-L1的受體為PD-1。計畫性死亡受體1(programmed death-1,PD-1)是CD28超家族一員，該家族還包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1是免疫球蛋白超家族中的I型跨膜蛋白，有288個胺基酸，是已知的主要免疫檢查點之一，主要表現於CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NKT 細胞、B細胞和活化的單核細胞等免疫細胞表面。PD-L1與PD-1的結合可以限制抗原呈現細胞或者樹突狀細胞與T細胞的相互作用，進一步抑制T細胞的代謝，抑制抗凋亡細胞Bcl-X2的分泌，減少效應細胞因子IL-2、IFN-γ的分泌，誘導T細胞耗竭和凋亡，從而降低免疫T細胞參與的免疫反應，行使負向調節功能。

腫瘤部位PD-L1的表現可以透過多種路徑保護腫瘤細胞免受傷害。研究表明，腫瘤細胞相關PD-L1可以增加腫瘤特異性T細胞的凋亡，而PD-L1單株抗體可以減弱這種作用。在癌症中，PD-L1和PD-1/PD-L1路徑可以保護腫瘤免受細胞毒性T細胞的侵害，最終通過使腫瘤微環境中的細胞毒性T細胞失活來抑制抗腫瘤免疫反應，並且防止淋巴結中新的T細胞的激發和活化以及隨後招募至腫瘤。PD-L1不僅僅是PD-1的配體，它也可以作為受體傳遞反向的訊號保護腫瘤細胞免受FAS-FASL等其他抗腫瘤路徑誘導的凋亡。

PD-L1透過增加抗原特異性T細胞株的凋亡而在腫瘤免疫中發揮重要作用。PD-L1被發現表現於各種腫瘤病人的組織中，包括非小細胞肺癌、肺癌、胃癌、結腸癌、肝癌、肝內膽管癌、胰臟癌、卵巢癌、乳癌、子宮頸癌、頭頸鱗狀細胞癌、鼻咽癌、食道癌、膀胱癌、皮膚癌、腎細胞癌、口腔鱗狀細胞癌、尿道上皮細胞癌等。細胞惡化過程中，由於基因突變等原因會產生新的蛋白分子，這些蛋白在細胞內降解後的某些肽段可以在細胞表面表現而成為腫瘤抗原。免疫系統可以通過免疫監察識別腫瘤抗原並清除腫瘤細胞，而腫瘤細胞可以利用PD-L1逃避免疫攻擊。

因此，PD-L1稱為開發腫瘤免疫治療藥物的熱門靶點。PD-L1 訊號傳遞的抑制已經被提出作為增強T細胞免疫以治療癌症的方法。目前，全球僅有三款獲批上市的PD-L1產品，分別是阿斯利康公司的德瓦魯單抗(Durvalumab)、羅氏基團的阿特珠單抗(Atezolizumab)、以及默克與輝瑞聯合研發的阿維魯單抗(Avelumab)。因此，有必要提供更多的PD-L1抗體以滿足市場需求。

本發明提供一種結合至人PD-L1的單株抗體或其抗原結合片段，其中，所述單株抗體或其抗原結合片段包含：(1)重鏈互補決定區CDR1、CDR2、CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，所述CDR2包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列，所述CDR3包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列；及(2)輕鏈互補決定區CDR1’、CDR2’、CDR3’，所述CDR1’包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列，所述CDR2’包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，所述CDR3’包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述單株抗體或其抗原結合片段包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區，其中，重鏈恆定區為SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列，輕鏈恆定區為SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列。

另一方面，本發明提供一種結合至人PD-L1的單株抗體或其抗原結合片段，其中，所述單株抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中重鏈可變區包含選自SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，輕鏈可變區包含SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21 所示的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述單株抗體或其抗原結合片段包含重鏈恆定區及輕鏈恆定區，其中，重鏈恆定區為SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列，輕鏈恆定區為SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列。

另一方面，本發明提供一種結合至人PD-L1的單株抗體或其抗原結合片段，其中，所述單株抗體或其抗原結合片段包含重鏈及輕鏈，其中重鏈為SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列，輕鏈為SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列。

另一方面，本發明提供一種結合至人PD-L1的單株抗體或其抗原結合片段，其中，所述抗原結合片段選自PD-L1抗體的scFv、(scFv)₂、Fab、Fab'或F(ab')₂。

另一方面，本發明還提供一種治療對象中的癌症的藥物組合物，其包含本發明所述的結合至人PD-L1的單株抗體或其抗原結合片段以及藥學上可接受的載體。

另一方面，本發明還提供一種治療對象中的癌症的藥物組合物，其包含本發明所述的結合至人PD-L1的單株抗體或其抗原結合片段以及第二治療劑。

另一方面，本發明還提供本發明所述的結合至人PD-L1的單株抗體或其抗原結合片段在製備用於治療癌症的藥物中的應用。

另一方面，本發明還提供一種編碼前述的單株抗體或其抗原結合片段的核苷酸序列。

另一方面，本發明還提供一種包含前述核苷酸序列的載體。

另一方面，本發明還提供一種包含前述載體的非人類的宿主細胞。此外，本發明還提供生成本發明的抗體或其抗原結合片段的細胞株，包含本發明的核苷酸的重組表現載體，以及透過培養抗體生產細胞株來製備抗體的方法。

另一方面，本發明還提供一種治療對象中癌症的方法，其包括將治療有效量的本發明單株抗體或其抗原結合片段中的任一個或本發明的藥物組合物中任一個施用至該對象。

本發明提供的單株抗體以高度親和力結合人PD-L1，與IL-2的分泌水平表現出良好的劑量依賴性，增強T細胞免疫反應。這些抗體可以被用作抗腫瘤的免疫增強劑，也可以被用作診斷試劑，用於檢測癌症或其他疾病患者的血液或組織中的人PD-L1。

〔圖1〕025單株抗體的生物大分子相互作用分析結果。

〔圖2〕Atezolizumab的生物大分子相互作用分析結果。

〔圖3〕hIgG1的生物大分子相互作用分析結果。

〔圖4〕測試單株抗體(025)、陽性對照(Atezolizumab)及陰性對照(hIgG1)的平衡解離常數。*：不可用，因為未結合到PD-L1。

〔圖5〕ELISA法檢測人源化後的PD-L1單株抗體的結合活性。

〔圖6〕基於細胞的阻斷測定法測試人源化後的PD-L1單株抗體。

〔圖7〕基於細胞的阻斷測定法測試人源化後的PD-L1單株抗體的重複實驗。

〔圖8〕Jurkat螢光素酶測定法檢測人源化後的PD-L1單株抗體。

〔圖9〕人源化後的PD-L1單株抗體對IL-2的分泌水平的影響。

〔圖10〕人源化後的PD-L1單株抗體對IFN-g的分泌水平的影響。

〔圖11〕使用CHOK1-PD-L1細胞株，透過FACS檢測人源化後的PD-L1單株抗體的結合活性。

〔圖12〕抗PD-L1抗體對腫瘤生長的藥效和對小鼠體重的影響。

定義

如本文中使用的，術語「抗體」是指表現所需生物學活性(例如抑制配體與其受體的結合或透過抑制配體誘導的受體訊號轉導)的抗體的任何形式。「抗體片段」及「抗原結合片段」是指抗體的抗原結合片段及抗體類似物，其通常包括至少部分母抗體的抗原結合區或可變區(例如一個或多個CDR)。抗體片段保留母抗體的至少某些結合特異性。通常，當基於莫耳來表示活性時，抗體片段保留至少10%的母體結合活性。較佳地，抗體片段保留至少20%、50%、70%、80%、90%、95%或100%或更多的母體抗體對標靶的結合親和力。因此，如本文使用的，抗體片段的例子包括但不限於：Fab、Fab'、F(ab')₂及Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子，例如sc-Fv；奈米抗體；結構域抗體；及由抗體片段形成的多特異性抗體。

「Fab片段」由一條輕鏈和一條重鏈的CH1及可變區組成。Fab分子的重鏈不能與另一個重鏈分子形成二硫鍵。「Fc」區含有包含抗體的CH1和CH2結構域的兩個重鏈片段。兩個重鏈片段由兩個或多個二硫鍵並通過CH3結構域的疏水作用保持在一起。

「Fab'片段」含有一條輕鏈和包含VH結構域和CH1結構域以及CH1和CH2結構域之間區域的一條重鏈的部分，由此可在兩個Fab'片段的兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵以形成F(ab')₂分子。

「F(ab')₂片段」含有兩條輕鏈和兩條包含CH1和CH2結構域之間的恆定區的部分的重鏈，由此在兩條重鏈間形成鏈間二硫鍵。因此，F(ab')₂片段由透過兩條重鏈間的二硫鍵保持在一起的兩個Fab'片段組成。「Fv區」包含來自重鏈和輕鏈二者的可變區，但缺少恆定區。

「單鏈Fv抗體」(或「scFv抗體」)是指包含抗體的VH和VL結構域的抗體片段，其中這些結構域存在於單個多肽鏈中。一般而言，Fv多肽在VH和VL結構域之間包含額外的多肽接頭，該接頭使得scFv能形成用於抗原結合的所需結構。

如本文所用，術語「人源化的抗體」是指包含衍生自除人以外的哺乳動物的抗體的CDR、以及人抗體的框架區(FR)和恆定區的抗體。

抗PD-L1單株抗體

本文所用術語「單株抗體」是指從基本上同種抗體群中獲得的抗體，即除了可能少量存在的可能的天然突變體外，構成所述群的各個抗體是一致的。單株抗體具有高度特異性，可針對單個的抗原位點。此外，與通常包括針對多個不同的決定簇(表位)的多種不同抗體的常規(多株)抗體製備物相反，每種單株抗體僅針對抗原上的單個決定簇。修飾語「單株」表示從基本上同種抗體群獲得的抗體的特性，不能理解為需要通過任何特定方法來製備所述抗體。例如，用於本發明的單株抗體可透過融合瘤或重組DNA方法製備。單株抗體可以包括「嵌合」抗體。

在本發明的一個方面，本發明的結合至人PD-L1的單株抗體或其抗原結合片段包含：(1)重鏈互補決定區CDR1、CDR2、CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列，所述CDR2包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列，所述CDR3包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列；及(2)輕鏈互補決定區CDR1’、CDR2’、CDR3’，所述CDR1’包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列，所述CDR2’包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，所述CDR3’包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述單株抗體或其抗原結合片段包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區，其中，重鏈恆定區為SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列，輕鏈恆定區為SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列。

在本發明的另一個方面，本發明的結合至人PD-L1的單株抗體或其抗原結合片段包含：(1)重鏈可變區，其包含選自SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列；以及(2)輕鏈可變區，其包含選自SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述單株抗體或其抗原結合片段包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區，其中，重鏈恆定區為SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列，輕鏈恆定區為SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列。

在一些實施方式中，所述結合至人PD-L1的單株抗體或其抗原結合片段的可變區選自以下組合：(a)重鏈可變區為SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列，輕鏈可變區為SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列；或(b)重鏈可變區為SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列，輕鏈可變區為SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列；(c)重鏈可變區為SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，輕鏈可變區為SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列；或(d)重鏈可變區為SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列，輕鏈可變區為SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述單株抗體或其抗原結合片段包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區，其中，重鏈恆定區為SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列，輕鏈恆定區為SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列。

在本發明的另一個方面，本發明的結合至人PD-L1的單株抗體或其抗原結合片段包含：(1)重鏈，其包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列；以及(2)輕鏈，其包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列。

可以預期的是，本發明的單株抗體或其抗原結合片段的結合結構域可以帶有訊息肽，其通常位於分泌蛋白的N端，一般由15~30個胺基酸組成。當訊息肽序列合成後，被訊息辨識顆粒(SRP)所識別，蛋白質合成暫停或減緩，訊息辨識顆粒將核糖體攜帶至內質網上，蛋白質合成重新開始。在訊息肽的引導下，新合成的蛋白質進入內質網腔，而訊息肽序列則在訊息肽酶的作用下被切除。如終止轉移序列存在於新生肽鏈的C端，也可以不被訊息肽酶切除，如卵白蛋白含有內部訊息肽。它的前體與成熟形式都沒有被訊息肽酶切除的過程。

「特異性結合」是指本發明的單株抗體或其抗原結合片段能夠特異性地與各人標靶分子的至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個或更多胺基酸相互作用。抗體的「特異性結合」主要由兩個參數來表徵：定性參數(結合表位或抗體結合位置)和定量參數(結合親和力或結合強度)。抗體結合表位可透過FACS法、肽點表位作圖法、質譜法或肽ELISA法測定。Biacore法及/或ELISA法可測定抗體與特定表位的結合強度。通常將訊噪比作為結合特異性的代表性測定計算方法。在這樣的訊噪比中，訊號代表抗體結合至目標表位的強度，而雜訊代表抗體與其他非目標表位結合的強度。較佳地，對於目標表位的訊噪比為約50時可以認為所評估的抗體以特異性方式結合至目標表位，即「特異性結合」。

如果抗原結合蛋白(包括抗體)以如通過解離常數(KD，或對應的Kb，如以下定義的)值確定的高結合親和力與抗原結合，則抗原結合蛋白(包括抗體)與抗原「特異性地結合」。在一些實施方式中，所述解離常數

5.662×10^-11M。如本文使用的術語「KD」是指特定抗體-抗原相互作用的平衡解離常數。

變體

如本文中使用的，序列「變體」是指在一個或多個胺基酸殘基處不同於所示的序列但保留所得到的分子的生物學活性的序列。

「保守修飾的變體」或「保守的胺基酸取代」是指本領域技術人員已知的胺基酸取代，進行這種取代通常不改變所得到的分子的生物學活性。一般而言，本領域技術人員公認在多肽非必需區的單個胺基酸取代基本上不改變生物學活性。

本文所用的兩個序列之間的「%同一性」是指所述序列共有的等同位置的數目的函數(即%同源性=等同位置數/總位置數x 100)，其中會考慮到空位數目及各空位長度，所述空位需要在進行兩個序列最佳比對時引入。序列比較和兩個序列之間%同一性的確定可用數學演算法來完成。例如，兩個胺基酸序列之間的%同一性可用E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17(1988))的演算法來確定，該演算法業已被引入到ALIGN程式(2.0版)中，其使用PAM120權重殘基表，空位長度罰分為12，空位罰分為4。另外，兩個胺基酸序列之間的%同一性可用Needleman和Wunsch(J.MoI.Biol.48：444-453(1970))演算法來確定，該演算法已被引入到GCG套裝軟體的GAP程式(可在www.gcg.com中得到)中，其使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，空位權重為16、14、12、10、8、6或4，長度權重為1、2、3、4、5或6。

當提及配體/受體、抗體/抗原或其它結合對時，「特異性」結合是指在蛋白及/或其它生物試劑的異質群體中確定是否存在所述蛋白的結合反應。因此，在所指定的條件下，特定的配體/抗原與特定的受體/抗體結合，並且並不以顯著量與樣品中存在的其它蛋白結合。

「等同變體」是指在生物學活性和功能上與所示序列(如胺基酸序列)相同或實質性相似但序列上與所示序列具有約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%同一性的序列。

抗體純化

當使用重組技術時，抗體可產生在細胞內、周質空間或直接分泌到培養基中。若抗體在細胞內產生，則作為第一步，例如通過離心或超濾去除顆粒碎片(宿主細胞或裂解的片段)。當抗體分泌到培養基中時，通常首先用市售的蛋白質濃縮篩檢程式(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)濃縮來自所述表現系統的上清液。可在任何前述步驟中使用蛋白酶抑制劑(例如PMSF)以抑制蛋白水解，可使用抗生素以防止外來污染物生長。

根據待回收的抗體，還可利用其它蛋白質純化技術，例如離子交換柱上分級分離、乙醇沉澱、反相HPLC、矽膠層析術、陰離子或陽離子交換樹脂(例如聚天冬胺酸柱)層析術、聚焦層析、SDS-PAGE及硫酸銨沉澱。在一個實施方式中，糖蛋白可通過以下方法來純化：使糖蛋白吸附到凝集素基底上(例如凝集素親和柱)，以從製備物中去除含岩藻糖的糖蛋白並由此富集無岩藻糖的糖蛋白。

藥物組合物

「藥物組合物」是指用於人的藥物製劑。該藥物組合物包含本發明的結合至人PD-L1的單株抗體或其抗原結合片段以及載體、穩定劑及/或賦形劑的合適製劑。本發明提供包含本發明的單株抗體或其抗原結合片段的藥物製劑。為了製備藥物組合物或無菌組合物，讓抗體或其抗原結合片段與可藥用載體或賦形劑混合。可透過與生理學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑混合，來製備呈例如凍乾粉、漿液、水溶液劑或混懸劑形式的治療及診斷藥物的製劑。

可透過標準藥物方法，在細胞培養物或實驗動物中測定單獨給予或與免疫抑制劑聯合給予的抗體組合物的毒性和治療功效，所述方法例如為用於測定LD50(使群體的50%致死的劑量)和ED50(有效治療群體的50%的劑量)的方法。毒性和治療效果之間的劑量比是治療指數，可表示為LD50與ED50之比。從這些細胞培養物測定及動物研究中獲得的資料可用於調配用於人的劑量範圍。所述化合物的劑量較佳在包括毒性極少或無毒性的ED50的循環濃度範圍內。可根據採用的劑型及所用的給藥途徑，使劑量在該範圍內變化。

合適的給藥途徑包括胃腸外給藥(例如肌內、靜脈內或皮下給藥)及口服給藥。可按多種常規方式給予用於藥物組合物或用於實踐本發明方法的抗體，這些方法例如有經口攝取、吸入、局部施用或經皮膚、皮下、腹膜內、胃腸外、動脈內或靜脈內注射。在一個實施方式中，靜脈內給予本發明的結合化合物。在另一個實施方式中，皮下給予本發明的結合化合物。或者，人們可以以局部而非全身方式(通常為長效製劑或緩釋製劑)給予抗體，例如經由將抗體直接注射到作用位點。此外，人們可以在靶向藥物遞送系統中給予抗體。

由臨床醫生例如用本領域已知或懷疑影響治療或預期影響治療的參數或因子來測定合適的劑量。通常，開始劑量比最佳劑量稍低，此後少量增加直到達到相對於任何不良副作用所要的或最佳的作用效果。重要的診斷測量包括測量例如發炎症狀或所產生的發炎性細胞激素的水平。

可透過連續輸注或透過以一定間隔(例如一天、一周或每周1-7次)給藥來提供抗體、抗體片段及細胞激素。可透過靜脈內、皮下、腹膜內、經皮膚、局部、經口、經鼻、經直腸、肌內、大腦內、脊柱內或透過吸入來提供劑量。較佳劑量方案是包括避免顯著的不合乎需要的副作用的最大劑量或給藥頻率的方案。周總劑量通常為至少0.05μg/kg體重，更通常為至少0.2μg/kg，最通常為至少0.5μg/kg，典型地為至少1μg/kg，更典型地為至少10μg/kg，最典型地為至少109μg/kg，較佳為至少0.2mg/kg，更佳為至少1.0mg/kg，最佳為至少2.0mg/kg，理想地為至少10mg/kg，更理想地為至少25mg/kg，而最理想地為至少50mg/kg。基於莫耳/kg計算，小分子治療劑例如肽模擬物、天然產物或有機化學藥劑的所需劑量與抗體或多肽的劑量接近相同。

本發明藥物組合物還可以含有其它藥劑，包括但不限於細胞毒劑、細胞生長抑制劑、抗血管形成藥物或抗代謝藥物、靶向腫瘤藥物、免疫刺激劑或免疫調節劑或與細胞毒劑、細胞生長抑制劑或其它毒性藥物綴合的抗體。也可與其它治療形式(例如手術、化療、及放射)一起施用所述藥物組合物。典型的獸醫、實驗或研究物件包括猴、狗、貓、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、馬及人。

具體地，本發明的結合至人PD-L1的單株抗體或其抗原結合片段可與第二治療劑組合使用。在具體實施例中，第二治療劑及本發明的單株抗體或其抗原結合片段於實質上相同的時間施用。個體有時會同時使用第二治療劑及本發明的單株抗體或其抗原結合片段。在一種實施方式中，該第二治療劑或其他典型施用至癌症病患的藥劑及本發明的單株抗體或其抗原結合片段可組合成藥物組合物；在其他具體實施例中，兩者分別施用。

術語「第二治療劑」是有利地與抗PD-L1抗體組合的任一試劑。可有利地與抗PD-L1抗體組合的示例性試劑包括但不限於抑制PD-L1活性的其他試劑(包括其他抗體或其抗原結合片段、肽抑制劑、小分子拮抗劑等)及/或干擾PD-L1上游或下游訊息傳導的試劑。

本發明的一方面提供了用本發明的結合至人PD-L1的單株抗體或其抗原結合片段治療癌症的方法。更具體地，本發明提供了增強T細胞功能和抗腫瘤免疫力的方法，包含施用治療有效量的任何上述結合至人PD-L1的單株抗體或其抗原結合片段或藥物組合物。

增強T細胞功能和抗腫瘤免疫力為治療癌症提供了廣譜方法。因此，可以通過施用本發明的結合至人PD-L1的單株抗體或其抗原結合片段或藥物組合物來治療多種類型的癌症。

治療

當用「給予」和「治療」提及動物、人、實驗物件、細胞、組織、器官或生物液時，是指將外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受治療者、細胞、組織、器官或生物液接觸。「給予」和「治療」可指例如治療方法、藥物動力學方法、診斷方法、研究方法及實驗方法。治療細胞包括讓試劑與細胞接觸以及讓試劑與流液接觸，其中所述流液與細胞接觸。「給予」和「治療」還意味著例如透過試劑、診斷劑、結合組合物或透過其他細胞對細胞進行體外和離體治療。

如本文中所使用的，術語「抑制」或「治療」包括延緩與疾病有關的症狀的發展及/或減輕所述疾病將要或預期發展的這些症狀的嚴重程度。所述術語還包括減緩已有症狀、防止另外的症狀及減緩或防止這些症狀的潛在原因。因此，所述術語表示已將有益結果賦予患有疾病的脊椎動物對象。

治療有效量

如本文中所使用的，術語「治療有效量」或「有效量」是指當將本發明的結合至人PD-L1的單株抗體或其抗原結合片段單獨給予或與另外的治療劑聯合給予細胞、組織或受治療者時，其有效防止或減緩待治療的疾病或病症的量。治療有效劑量進一步指所述化合物足以導致症狀減緩的量，所述減緩症狀例如為治療、治癒、防止或減緩相關醫學狀態，或提高對所述病徵的治療率、治癒率、防止率或減緩率。當施用給個體單獨給予的活性成分時，治療有效量是指該單獨的成分。當施用組合時，治療有效量是指產生治療效果的活性成分的聯合的量，而不論其是聯合給予、連續給予還是同時給予。治療有效量將減輕症狀通常至少10%；通常至少20%；較佳至少約30%；更佳至少40%和最佳至少50%。

在本發明中，「約」是指數值在由本領域一般技術人員所測定的具體值的可接受誤差範圍內，所述數值部分取決於怎樣測量或測定(即測量體系的限度)。例如，在本領域每一次實行中「約」可意味著在1內或超過1的標準差。或者，「約」或「基本上包含」可意味著至多20%的範圍。此外，特別對於生物學系統或過程而言，該術語可意味著至多一個數量級或數值的至多5倍。除非另外說明，否則當具體值在本申請和申請專利範圍中出現時，「約」或「基本上包含」的含義應該假定為在該具體值的可接受誤差範圍內。

癌症

本發明的結合至人PD-L1的單株抗體或其抗原結合片段可以用於治療癌症。所述癌症包括但不限於：胃癌、肺癌、肝癌、肝內膽管癌、結腸癌、胰臟癌、卵巢癌、神經膠質瘤、腎癌、尿道上皮細胞癌、乳癌、子宮頸癌、頭頸鱗狀細胞癌、鼻咽癌、食道癌、膀胱癌、腎細胞癌、皮膚癌、及口腔鱗狀細胞癌。在一些實施方式中，所述癌症是高度免疫原性癌。在一些實施方案中，所述癌症是表達PD-L1的癌症。

實施例

生物大分子相互作用分析(Biacore)

抗體：測試抗體均購自博際生物醫藥科技(杭州)有限公司：025(Lot# P20170915007，IgG1,κ)，該單株抗體的重鏈互補決定區序列如SEQ ID NO：1-3所示，輕鏈互補決定區序列如SEQ ID NO：4-6所示，重鏈可變區的序列如SEQ ID NO：7所示，輕鏈可變區的序列如SEQ ID NO：8所示。對照抗體Atezolizumab(Lot# 20140734A3，IgG1,k)、hIgG1(Lot# 20170406004，hIgG1,k)、hIgG4(Lot# 151031001，hIgG4,k)購自ChemPartner(上海)。

Biacore：運行緩衝區為HBS-EP+。流速為30μL/min。用被抗人Fc IgG捕獲的配體(抗體)在感測器晶片表面上滴定分析物(抗原)。連續稀釋樣品進樣，關聯階段為180s。在甘胺酸pH 1.5下，以10μL/min的速度進行30s。用於分析的機器型號為：T200，分析溫度為25℃，分析方法為多循環動力學。結果：025單株抗體的平衡解離常數為5.662×10^-11M(圖1)；Atezolizumab單株抗體的平衡解離常數為2.747×10^-10M(圖2)。單株抗體025的平衡解離常數均低於Atezolizumab的平衡解離常數(圖4)，說明025比Atezolizumab具有更高的結合親和力。同型對照hIgG1不與PD-L1抗原結合(圖3)，表明測試的單株抗體對PD-L1具有特異性。

人源化後的抗體親和力分析

對025單株抗體進行人源化，人源化後的抗體的可變區序列如下表2所示，抗體的恆定區序列如表3所示。人源化後的抗體親和力分析如下表4所示。

其中，L7/H5抗體的全序列如下所示，其中CDR序列以粗體示出，可變區序列以斜體示出：

重鏈(SEQ ID NO：24)：

輕鏈(SEQ ID NO：25)：

人源化後的PD-L1單株抗體與PD-L1蛋白的結合活性

ELISA試驗：執行ELISA方法以確定單株抗體與PD-L1蛋白之間的相互作用。簡而言之，將抗體在含有50ul 1ug/ml hPD-L1-ECD-hFc蛋白的培養盤中吸附並在4℃培養過夜，用PBST洗培養盤3次。然後用含有1%BSA的PBST在室溫下封閉培養盤2小時。用PBST洗培養盤3次，加入單株抗體溶液50ul/孔，並在37℃培養1小時。用PBST洗培養盤3次，加入二抗50ul/孔，並在37℃培養0.5小時。用PBST洗滌培養盤3次，然後加入100ul/孔TMB保持15min。用50ul/孔1N HCl終止反應。使用Molecular device spectra max plus384測量培養盤在450nm處的讀數。

結果：如圖5所示，單株抗體L1-H1、L2-H2、L3-H3、L5-H5及Atezolizumab都能以相似的強度結合PD-L1蛋白。其中，L1-H1具有相對最高的結合力。hIgG1和hIgG4與PD-L1蛋白沒有結合，表明了單株抗體具有特異性結合。單株抗體L1-H1、L2-H2、L3-H3、L5-H5的Top值和半最大效應濃度(EC50)值均略大於Atezolizumab的Top值和EC50值，表明單株抗體L1-H1、L2-H2、L3-H3、L5-H5比Atezolizumab的結合強度高。

基於細胞的阻斷測定法測試人源化後的PD-L1單株抗體

細胞株：CHOK1-Mock-A1、CHOK1-PD-L1細胞株購自ChemPartner。

細胞阻斷試驗：以1000rpm離心5分鐘收集細胞。然後將細胞重新懸浮於2E6細胞/ml FACS緩衝液(1×PBS中含有2%FBS)中，並在96孔培養盤中(100ul/孔)鋪盤，並在室溫下培養20分鐘。使用FACS緩衝液稀釋抗體製備成抗體溶液。使用FACS緩衝液製備60μg/ml(2×)的Bio-PD1-Fc溶液。以300g離心5分鐘，棄去上清液。然後用50μl抗體溶液重新懸浮細胞。加入50μl Bio-PD1溶液，輕輕搖動培養盤，使溶液充分混合。在4℃下培養培養盤1小時，200μl/孔洗培養盤2次。在FACS緩衝液中準備1：1000的Steptavidin-Alexa 488 Solution。將細胞以100μl/孔重新懸浮於SA-Alexa488溶液中。在4℃下培養培養盤1小時，200μl/孔洗培養盤2次。將細胞重新懸浮於100μl PBS中。在電腦上進行FACS分析。

結果：如圖6所示，L1-H1、L2-H2、L3-H3、L5-H5均具有與陽性對照(Atezolizumab)相當的阻斷作用。在重複實驗中，L1-H1、L2-H2、L3-H3、L5-H5均具有阻斷作用(圖7)。

Jurkat-NFAT螢光素酶測定

用胰蛋白酶消化細胞並用培養基終止消化。離心並用培養基重新懸浮細胞，將Hep3B-OS8-PDL1細胞置於96孔培養盤中，並在37℃培養過夜。在測定當天，在測定培養基中準備抗體溶液。從預鋪盤的Hep3B-OS8-PDL1(購自ChemPartner)細胞中除去培養基。然後將50μl抗體溶液添加到培養盤中。培養20-30分鐘。使用測定培養基代替生長培養基收穫Jurkat-NFAT-PD1細胞。然後加入50μl Jurkat-NFAT-PD1(購自ChemPartner)細胞到培養盤中。將測定培養盤在加濕的37℃，5%CO₂培養箱中培養6小時。通過ONE-Glo^TM螢光素酶測定系統測量螢光素酶活性。

結果：PD-L1單株抗體的螢光素酶測定結果如圖8所示。由圖8可以看出，L1-H1單株抗體能較好的活化Jurkat細胞。L2-H2、L3-H3和L5-H5單株抗體都能更好地活化Jurkat細胞。

混合淋巴細胞反應(MLR)

細胞：DC(Donor#328)、CD4+ T(Donor#26)購自ChemPartner。

PBMC分離：首先，用相同體積的無菌PBS稀釋來自單個供體的血液樣本，例如，將15ml無菌PBS加入15ml新鮮全血中，並輕輕搖勻。將15ml Ficoll-Pague培養基轉移到新的50ml離心管中，確保Ficoll和血液的體積比為3：4，然後小心地將稀釋的血液樣本添加到Ficoll培養基的表面，通過盡可能柔軟的方式混合來避免混合。這樣就可以清楚地看到兩種液體的層。將試管輕輕移至離心機，在離心過程中，以最大加速度和最小減速度設置，以400 xg，20℃離心30min。離心後總共可以觀察到四個介面，從上到下它們是血漿、單核細胞層、Ficoll培養基和RBC。在此過程中，請儘量輕柔地移動試管，以免混淆分離出的各層。小心吸取單核細胞層並將其轉移到另一個新的無菌離心管中。還要注意的另一件事是，吸取一定體積的血漿要比Ficoll介質好得多。然後將無菌PBS緩衝液添加到收集的PBMC中，以3：1的體積比洗滌。用50ml PBS洗滌細胞兩次，然後用流式細胞儀計數。在最大加速度和最大減速度設置下以200 xg，20℃離心10分鐘。棄去上清液，然後在4℃下用5ml RCLB重新懸浮細胞5-10分鐘(不超過10分鐘)。用含10%FBS的15ml RPMI-1640培養基(Gibico,Cat#A10491-01)終止反應。丟棄上清液，然後用10%FBS+RPMI 1640重新懸浮細胞進行測定，並在測定前避免冷凍。

DC培養：用RPMI-1640培養基(無血清)將分離的人PBMC稀釋至約1E6細胞/ml。然後將其以25ml/培養皿的濃度分配到150mm細胞培養皿(AXYGEN,Cat#430599)中，在37度培養箱中培養3小時。吸取並棄去每個培養皿中的上清液，在含有10%FBS的RPMI-1640培養基中加入含有250U/ml IL-4和500U/ml GM-CSF的新鮮培養基，在37度培養箱中培養1天。吸取並棄去每個培養皿中的上清液，在含有10%FBS的RPMI-1640培養基中加入含有250U/ml IL-4和500U/ml GM-CSF的新鮮培養基，在培養箱中37度培養。在第3天和第5天，用新鮮的IL-4和GM-CSF替換三分之一的細胞培養基。在含有10%FBS的RPMI-1640培養基中將DC用1ug/ml的LPS熟化約24小時，然後用10ml PBS，500g x2洗滌DC 5分鐘。

抑制過程：調節DC(刺激劑)至終濃度1×10⁶細胞/ml，用10ug/ml絲裂黴素C(1X)，37℃抑制DC的增殖45min。500g x3，5分鐘。然後用10ml PBS清洗DC兩次。

CD4+ T細胞分離：根據製造商指南的步驟，從新鮮分離的人PBMC中純化CD4+ T細胞(EasySep^TM人CD4+ T細胞分離試劑盒)。

單株抗體溶液製備：根據安排用含有10%FBS的RPMI 1640培養基製備單株抗體稀釋液。

MLR：使用X-VIVO15培養基(LONZA,Cat#04-418Q)調節CD4+ T細胞(反應者)和DC(刺激劑)的密度，將CD4+ T細胞(反應者)調節至終濃度1×10⁶細胞/ml，將DC(刺激劑)調節至終濃度2×10⁵細胞/ml。以1：1的體積比混合刺激細胞和反應細胞。用X-VIVO15培養基將每個mAb稀釋至終濃度500nM。向96孔培養盤的每個孔中加入50μl稀釋的Ab溶液。將200μl CD4+ T細胞(反應者)和DC(刺激劑)的混合細胞懸液加到96孔培養盤中，每孔的最終體積為250μl。分別於37度培養混合物72小時進行IL-2測試和120小時進行IFN-γ測試。及時收穫表面活性劑並將其冷凍在-20度以下以進行ELISA測試。定量ELISA：根據人IL-2 DuoSet ELISA試劑盒(R&D,Cat#DY202)或人IFN-γ DuoSet ELISA試劑盒(R&D,Cat#DY285B)的測定步驟進行操作。

結果：如圖9所示，測試的所有三種PD-L1單株抗體(L1-H1、L2-H2和L5-H5)和陽性對照抗體Atezolizumab在IL-2的分泌水平上均表現出良好的劑量依賴性。但在IFN-g的分泌水平上卻沒有(圖10)，也許CD4+ T細胞(D # 26)在與DC細胞(D # 328)和單株抗體反應之前已經處於活化狀態。

透過FACS檢測PD-L1單株抗體的結合活性

FACS：以1000rpm離心5分鐘收集細胞。然後將細胞重新懸浮於FACS緩衝液(1×PBS中含有2%FBS)中，並置於96孔培養盤(100ul/孔)中，並在室溫下培養20分鐘。以300g離心5分鐘，然後棄去上清液。將細胞重新懸浮於含有一抗(100ul/孔)的FACS緩衝液中，並於4度培養60分鐘。用PBS洗滌細胞2次，以300g離心5分鐘，然後棄去上清液。將細胞重新懸浮於含有二抗(100ul/孔)的FACS緩衝液中，並於4度培養60分鐘。用1×PBS洗滌細胞2次，並在300g離心5分鐘，然後棄去上清液。將細胞重新懸浮於1×PBS中。在電腦上執行FACS分析。

結果：圖11表明L1-H1、L2-H2和L5-H5特異性結合在CHOK1細胞上表達的PD-L1。L1-H1、L2-H2和L5-H5均具有與陽性對照Atezolizumab相當的EC50，這表明這三種人源化的單株抗體都能與PD-L1有效/敏感結合。並且，L1-H1、L2-H2和L5-H5比陽性對照Atezolizumab具有更高的MFI(圖11)，說明與陽性對照Atezolizumab相比，L1-H1、L2-H2和L5-H5與PD-L1的結合親和力更高。

PD-L1抗體顯著抑制體內腫瘤生長

在第0天時，對每隻PD-L1/PD-1基因嵌入小鼠移植100萬個MC38-PD-L1細胞(n=40)。當小鼠體內腫瘤達到50-100mm³左右時，將小鼠隨機分組，每組6隻。每3天注射100ug PBS或抗PD-L1抗體(L7/H5)。每 3天測量腫瘤體積和體重。

結果：如2所示，抗PD-L1抗體組和對照組的小鼠的腫瘤體積均逐漸增大，但抗PD-L1抗體組的小鼠的腫瘤體積明顯增長的更慢，且抗PD-L1抗體組的小鼠的體重與對照組小鼠的體重無明顯差異。說明抗PD-L1抗體有抑制腫瘤生長的作用，並且在同樣劑量下，沒有對體重產生影響。

<110> 博際生物醫藥科技(杭州)有限公司

<120> PD-L1抗體及其應用

<130> 192022-21D-TWP

<160> 25

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈互補決定區CDR1

<400> 1

<210> 2

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈互補決定區CDR2

<400> 2

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈互補決定區CDR3

<400> 3

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈互補決定區CDR1'

<400> 4

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈互補決定區CDR2'

<400> 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈互補決定區CDR3'

<400> 6

<210> 7

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體025的重鏈可變區

<400> 7

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體025的輕鏈可變區

<400> 8

<210> 9

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H1

<400> 9

<210> 10

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H2

<400> 10

<210> 11

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H3

<400> 11

<210> 12

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H4

<400> 12

<210> 13

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H5

<400> 13

<210> 14

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> H6

<400> 14

<210> 15

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L1

<400> 15

<210> 16

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L2

<400> 16

<210> 17

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L3

<400> 17

<210> 18

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L5

<400> 18

<210> 19

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L6

<400> 19

<210> 20

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L7

<400> 20

<210> 21

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L8

<400> 21

<210> 22

<211> 329

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈恆定區

<400> 22

<210> 23

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 輕鏈恆定區

<400> 23

<210> 24

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L7/H5抗體重鏈

<400> 24

<210> 25

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> L7/H5抗體輕鏈

<400> 25

Claims

一種結合至人計畫性死亡配體1(PD-L1)的單株抗體或其抗原結合片段，其中

重鏈互補決定區CDR1包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列；

重鏈互補決定區CDR2包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列；

重鏈互補決定區CDR3包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列；

輕鏈互補決定區CDR1’包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列；

輕鏈互補決定區CDR2’包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列；

輕鏈互補決定區CDR3’包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列。
如請求項1之單株抗體或其抗原結合片段，其中

重鏈可變區包含選自SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列或其等同變體；

輕鏈可變區包含選自SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列或其等同變體。
如請求項1之單株抗體或其抗原結合片段，其中可變區選自以下組合：

(a)重鏈可變區包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列或其等同變體，輕鏈可變區包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列或其等同變體；

(b)重鏈可變區包含SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列或其等同變體，輕鏈可變區包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列或其等同變體；或

(c)重鏈可變區包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列或其等同變體，輕鏈可變區包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列或其等同變體；或

(d)重鏈可變區包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列或其等同變體，輕鏈可變區包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列或其等同變體。
如請求項1之單株抗體或其抗原結合片段，其中重鏈恆定區包含SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列或其等同變體，輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列或其等同變體。
如請求項1之單株抗體或其抗原結合片段，其中重鏈包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列或其等同變體，輕鏈包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列或其等同變體。
如請求項1之單株抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段選自PD-L1抗體的scFv、(scFv)₂、Fab、Fab'或F(ab')₂。
一種治療對象中的癌症的藥物組合物，其包含請求項1-5中任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段以及藥學上可接受的載體。
一種治療對象中的癌症的藥物組合物，其包含請求項1-5中任一項所述之單株抗體或其抗原結合片段以及第二治療劑。
如請求項7或8之藥物組合物，其中該癌症選自胃癌、肺癌、肝癌、肝內膽管癌、結腸癌、胰臟癌、卵巢癌、神經膠質瘤、腎癌、尿道上皮細胞癌、乳癌、子宮頸癌、頭頸鱗狀細胞癌、鼻咽癌、食道癌、膀胱癌、腎細胞癌、皮膚癌、及口腔鱗狀細胞癌。
一種編碼請求項1-6中任一項之單株抗體或其抗原結合片段的核苷酸序列。
一種包含請求項10之核苷酸序列的載體。
一種含有請求項11之載體的非人類的宿主細胞。