CN108601829B - 抗pd-1抗体及其治疗用途 - Google Patents

抗pd-1抗体及其治疗用途 Download PDF

Info

Publication number
CN108601829B
CN108601829B CN201680079355.1A CN201680079355A CN108601829B CN 108601829 B CN108601829 B CN 108601829B CN 201680079355 A CN201680079355 A CN 201680079355A CN 108601829 B CN108601829 B CN 108601829B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
ser
thr
leu
val
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201680079355.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108601829A (zh
Inventor
王结义
董利群
王耀林
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lyvgen Biopharma Holdings Ltd
Original Assignee
Lyvgen Biopharma Holdings Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lyvgen Biopharma Holdings Ltd filed Critical Lyvgen Biopharma Holdings Ltd
Publication of CN108601829A publication Critical patent/CN108601829A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108601829B publication Critical patent/CN108601829B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明提供了抗PD‑1抗体及其在治疗PD‑1信号传导相关疾病，如癌症、感染性疾病如病毒感染、或其它免疫相关疾病中的用途。

Description

抗PD-1抗体及其治疗用途
交叉·相关申请的参考
本申请要求2015年11月18日提交的题为“Anti-PD-1抗体及其治疗用途”的中国专利申请No.2015107995388的申请日权益，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)，也被称为CD279，是表达于免疫细胞，包括T细胞的细胞表面受体。PD-1与两个配体PD-L1和PD-L2结合。PD-1与其配体的结合触发PD-1介导的信号传导途径，这被认为是免疫应答负调控。PD-1是免疫球蛋白(Ig)超家族的成员，其包括CD28和CTLA-4。PD-1和其它家族成员是I型跨膜糖蛋白，含有负责配体结合的胞外Ig结构域和结合信号介导分子的胞质尾(Keir ME等.Annu Rev Immunol.2008；26:677-704)。PD-1的胞质尾包含两个基于酪氨酸的信号基序，一个ITIM(免疫受体酪氨酸抑制基序)和ITSM(免疫受体酪氨酸转换基序)。在刺激后，PD-1募集酪氨酸磷酸酶SHP-2到ITSM基序，引起T细胞的效应分子，例如CD3ζ，PKCθ和ZAP70的去磷酸化。
PD-1敲除小鼠产生自发性自身免疫疾病，包括狼疮样增生性关节炎(NishimuraH.等.,1998,Int.Immunol.10:1563-1572)，致死性心肌病(Nishimura H.等.,2001,Science 291:319-322)和I型糖尿病(Wang J.等.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,2005,102:11823-11828)。总体而言，对基因敲除动物的分析使得我们理解，PD-1的功能主要在于诱导和调节外周免疫耐受。因此，对PD-1途径的治疗性阻断可能对克服免疫耐受有帮助。这种选择性阻断可用于癌症或感染的治疗，以及在疫苗接种(预防性或治疗性)期间提供免疫力。
肿瘤通过创建免疫抑制微环境逃避免疫监视。在许多原发性肿瘤组织活检中，已经在肿瘤浸润的淋巴细胞或肿瘤细胞中发现PD-1和PD-L1表达，并且已知其参与了免疫逃避(Ribas A.Cancer Discov.2015,5(9):915-9)。这样的组织包括肺，肝脏，卵巢，宫颈，皮肤，结肠，神经胶质瘤，膀胱，乳腺，肾脏，食道，胃，口腔鳞状细胞，膀胱上皮细胞和胰腺的癌症，以及头部和颈部的肿瘤(Brown J.A.等.,J.Immunol.,2003，170:1257-1266；Dong H.等.,Nat.Med.,2003,8:793-800；Wintterle等.,Cancer Res.,2003,63:7462-7467；StromeS.E.等.,Cancer Res.,2003,63:6501-6505；Thompson R.H.等.,Cancer Res.,2006,66:3381-5；Thompson等.,Clin.Cancer Res.,2007,13:1757-61；Nomi T.等.,Clin.CancerRes.,2007,13:2151-7)。
PD-1作为免疫检查点，通过阻止T细胞活化而在下调免疫系统中起重要作用，从而减少自身免疫并促进自身耐受。PD-1的抑制效果是通过促进淋巴结的抗原特异性T细胞细胞凋亡，同时降低调节性T细胞的凋亡，这一双重机制来完成的。鉴于其免疫抑制作用，PD-1的抑制剂被认为能激活免疫系统来攻击肿瘤，因此用于治疗癌症和其它免疫相关疾病。阻断PD-1与其配体之间的相互作用以增强肿瘤特异性CD8T细胞免疫能够消除肿瘤细胞(Topalian S.等.Curr Opin Immunol.2012,24(2):207-12)。实际上，抗PD-1或其配体PD-L1的抗体已显示出治疗黑色素瘤和肺癌的临床效用。
发明内容
本发明是基于抗PD-1抗体，SSI-361的开发，它表现出结合PD-1高亲和力，并成功地阻断了PD-1介导的信号传导和增强了T细胞的活化。
因此，本发明的一个方面提供了分离的抗PD-1抗体，其包含与SHB-617抗体相同的重链可变区互补决定区(CDR)和/或轻链可变区CDR。该抗体可包含：(i)重链可变区(VH)，其包含如GFSLSTSGT(SEQ ID NO.:13)所示的重链互补决定区(HC CDR)1、如CWEDS(SEQ IDNO.:14)所示的HC CDR2、和如EDSGYFWFPY(SEQ ID NO.:15)所示的HC CDR3；和(ii)轻链可变区(VL)，其包含如KAGQNVNNYLA(SEQ ID NO.:16)所示的轻链互补决定区(LC CDR)1、如NANSLQT(SEQ ID NO.:17)所示的LC CDR2、和如QQYNSWTT(SEQ ID NO.:18)所示的LC CDR3。
在一些实施方案中，本文所述的分离的抗PD-1抗体包含为VH链，其包含与下述序列至少80％(例如，85％，90％，95％，97％，或以上)同源性的氨基酸序列：
QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGTCVSWIRQPPGKALEWLATICWEDSKGYNPSLKSRLTISKDTSKNQAVLTMTNMDPVDTATYYCARREDSGYFWFPYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.:12)。任选地，或额外地，抗PD-1抗体包含为VL链，其包含与下述序列至少80％(例如，85％，90％，95％，97％，或以上)同源性的氨基酸序列：
NIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKAGQNVNNYLAWYQQKPGKAPKVLIFNANSLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSWTTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO.:11)。
在一些实例中，本文所述的分离的抗PD-1抗体包含VH，其包括氨基酸序列QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGTCVSWIRQPPGKALEWLATICWEDSKGYNPSLKSRLTISKDTSKNQAVLTMTNMDPVDTATYYCARREDSGYFWFPYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.:12)；和/或VL链，其包括氨基酸序列
NIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKAGQNVNNYLAWYQQKPGKAPKVLIFNANSLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSWTTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO.:11)。
在一些实例中，本文所述的抗PD-1抗体包含VH链，其包括氨基酸序列
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGTCVSWIRQPSGKGLEWLATICWEDSKGYNPSLKNRLTISKDTSNNQAFLKITSVDTADSAIYY CARREDSGYFWFPYWGQGTLVSVS(SEQ ID NO.:12)；和/或VL链，其包括氨基酸序列
NIQMTQSPSLLSASVGDRVTLSCKAGQNVNNYLAWYQQKLGEPPKVLIFNANSLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYFCQQYNSWTTFGAGTKLELKR(SEQ ID NO.:11)。
在一些实施方案中，本文所述的抗PD-1抗体结合于SSI-361相同的表位或与SSI-361竞争性地与PD-1结合。
本文所述的任意抗PD-1抗体可以是全长抗体(例如，IgG分子)或其抗原结合片段(例如，Fab或F(ab’)2或单链抗体scFv)。在一些实例中，抗体可以是嵌合抗体或人源化抗体。在其它实例中，本文所述的抗体可以是多特异性抗体的一部分，其结合于PD-1和一个或多个其它靶抗原。在另一些其它实施例中，本文所述的抗体偶联于合适的试剂，例如治疗剂或诊断剂，以形成偶联物，例如，抗体药物偶联物(ADC)。
在另一方面，本发明提供了一种分离的核酸或核酸集合，其共同编码本文所述的任意抗PD-1抗体。这样的核酸可以是一种载体，例如表达载体，其中，编码抗体的VH和VL链中一个或两个的核苷酸序列可操作地连接于合适的启动子。
在一些实例中，所述分离的编码抗PD-1抗体的核酸包含VH编码在第一核苷酸序列和编码VL的第二核苷酸序列。在其它实例中，VH和VL链的编码序列位于不同的核酸。
在另一些实例中，本发明提供了一种载体或载体集合(例如，包含两个载体)，其共同包含编码本文所述的任意抗PD-1抗体的核酸。这样的宿主细胞可以在允许所述抗体的表达的合适条件下进行培养。所述宿主细胞可以被收集，用于分离抗体，从而生产抗体。
此外，本发明提供了一种药物组合物，其包含本文所述的任意抗PD-1抗体(例如，游离形式或偶联与如本文所述合适的试剂)，或本文所述的任何核酸/核酸集合，和药学上可接受的载体。这样的药物组合物可以用于治疗PD-1信号传导相关疾病(如癌症，感染性疾病如病毒感染(如，甲型肝炎，乙型肝炎，或丙型肝炎),以及其它免疫相关疾病)。
在另一个方面，本发明提供了治疗PD-1信号传导相关疾病的方法(例如，本文所述的那些)，所述方法包括给需要的对象施用有效量的本文所述的任意药物组合物，或者单独施用，或者与一种或更多其他治疗剂(例如，本文所述的那些)组合施用。
使用任意所述抗PD-1抗体，编码核酸，抗体偶联物(例如ADC)，或药物组合物，用于制备治疗本文所述的任何目标疾病的药物的用途，也包含在本发明的范围内。
本发明的一个或多个实施方案的细节阐述于以下说明书中。依据以下附图和几个实施例的详细描述，以及从所附的权利要求，其它特征或本发明的优点是显而易见的。
附图说明
图1显示了一系列抗PD-1嵌合抗体刺激记忆T细胞应答的比较情况的曲线图，其中包括SHB-128、SHB-152、SHB-168和SHB-617抗人PD-1嵌合抗体。抗PD-L1和人IgG用作阳性和阴性对照。
图2是具有Chothia CDR定义(框出的)、编号和队列的SHB-617VL(SEQ ID NO.:1)结构域与人受体构架VK1-L1(SEQ ID NO.:2)和JH4(SEQ ID NO.:3)的比较情况。
图3是具有Chothia CDR定义(框出的)、编号和队列SHB-617VH(SEQ ID NO.:4)结构域与人受体构架VH2-2-70(SEQ ID NO.:5)和JH4(SEQ ID NO.:6)的比较情况。
图4是人源化的(SEQ ID NO.:7)和亲代鼠的(SEQ ID NO.:8)SHB-617VL结构域的队列。框出的是CDR L1、L2和L3。
图5是人源化的(SEQ ID NO.:9)和亲代鼠的(SEQ ID NO.:10)SHB-617VH结构域的队列。框出的是CDR H1、H2和H3。
图6显示了与人和猴PD-1蛋白的结合的ELISA图。图A：人PD-1结合ELISA。图B：Rehsus猴PD-1结合ELISA。图C：食蟹猴PD-1结合ELISA。
图7显示了与细胞的人PD-1的结合的FACS图。
图8显示了描绘对人配体与细胞的人PD-1结合的阻断的两幅图。
图9显示了描绘对人T细胞活化的刺激的两幅柱状图。
图10显示了SSI-361在食蟹猴中的药代动力学曲线图。
图11显示了用抗PD-1抗体或PBS作为载体对照处理的MC38-huPD-L1荷瘤小鼠的体重变化图。当平均肿瘤体积达到68.3mm3时，将小鼠随机分成3个研究组(n＝8)，每个研究组用PBS，PD-1Ab01(SSI-361)或PD-1Ab02(nivolumab)进行处理。每周进行两次处理，持续3周。误差棒表示平均值±SEM。在PD-1Ab01和PD-1Ab02处理后未观察到对体重的显著影响。
图12显示了用抗PD-1抗体或PBS作为载体对照处理的MC38-huPD-L1荷瘤小鼠的肿瘤体积变化图。当平均肿瘤体积达到68.3mm3时，将小鼠随机分成3个研究组(n＝8)，每个研究组用PBS，PD-1Ab01(SSI-361)或PD-1Ab02(nivolumab)处理。每周进行两次处理，持续3周。误差棒表示平均值±SEM。在移植有MC38-hPD-L1肿瘤细胞的hPD-1KI小鼠中，PD-1Ab01和PD-1Ab02显示出强抗肿瘤活性。
图13显示了用于评估示例性抗PD-1抗体的体内肿瘤治疗功效的示例性实验设计图。
图14包括显示hPD-1KI小鼠中各抗PD-1抗体抑制MC38癌细胞诱导的肿瘤生长的效果图。图A：用PD-1Ab01(SSI-361)处理的小鼠；图B：用PD-1Ab02(nivolumab)处理的小鼠。
图15显示了抗PD-1抗体治疗过程中小鼠的体重变化图。当C57BL/6小鼠中MC38的平均肿瘤体积达到110.4mm3时，将B16F1细胞接种到左侧。误差棒表示平均值±SEM。在三个研究组中未观察到对体重的显著影响。
图16包括显示抗PD-1抗体对PD-L1阳性肿瘤的抗肿瘤作用的图。用MC38癌细胞(PD-L1阳性)，在每只小鼠的右侧皮下接种，用于发展肿瘤。每周两次测量所有动物的肿瘤体积。当C57BL/6小鼠中MC38细胞诱导的平均肿瘤体积达到110.4mm3时，用B16F1细胞在动物的左侧皮下接种。误差棒表示平均值±SEM。对于MC38肿瘤，在PD-1Ab01和PD-1Ab02处理的小鼠中没有可测量的生长(图A和B)，而在C57BL/6小鼠中，MC38肿瘤显示正常的生长曲线(图C)。B16F1的生长在三个研究组中没有明显差异。
序列的简要说明
SEQ ID NO.:1是VL链可变区SHB-617VL的氨基酸序列，与图2相关联。
SEQ ID NO.:2是VK1-L1的氨基酸序列，与图2相关联。
SEQ ID NO.:3是JK4的氨基酸序列，与图2相关联。
SEQ ID NO.:4是VH链可变区SHB-617VH的氨基酸序列，与图3相关联。
SEQ ID NO.:5是VH2-2-70的氨基酸序列，与图3相关联。
SEQ ID NO.:6是JH 4的氨基酸序列，与图3相关联。
SEQ ID NO.:7是人源化的SHB-617(SSI-361)VL的氨基酸序列，如图4所示。
SEQ ID NO.:8是亲代鼠SHB-617VL的氨基酸序列，如图4所示。
SEQ ID NO.:9是人源化的SHB-617(SSI-361)VH的氨基酸序列，如图5所示。
SEQ ID NO.:10是亲代鼠SHB-617VH的氨基酸序列，如图5所示。
SEQ ID NO.:11是SSI-361(人源化的SHB-617)的LC的氨基酸序列。
SEQ ID NO.:12是SSI-361(人源化的SHB-617)的HC的氨基酸序列。
SEQ ID NOs:13-15分别是SSI-361的重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NOs:16-18分别是SSI-361的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO.:19是SHB-617的全长重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO.:20是SHB-617的全长重链的编码序列。
SEQ ID NO.:21是SHB-617的全长轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO.:22是SHB-617的全长轻链的编码序列。
SEQ ID NO.:23是SSI-361的全长重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO.:24是SSI-361的全长轻链的氨基酸序列。
具体实施方式
本文描述了抗PD-1抗体，编码该抗体的核酸，通过激活T细胞增强免疫应答功能的用途，以及治疗PD-1信号传导相关疾病如癌症的用途。
抗PD-1抗体
PD-1是表达于免疫细胞，包括T细胞和B细胞的细胞表面受体，负调节免疫反应。人PD-1被PDCD1基因编码。作为例子，人PD-1的氨基酸序列公开于GenBank登录号NP_005009中。
抗PD-1抗体(复数形式可互换使用)是免疫球蛋白分子，其能够通过位于免疫球蛋白分子可变区的至少一个抗原识别位点，特异性结合的PD-1蛋白或其片段。如本文所用，术语“抗体”不仅包括完整的(即全长)多克隆或单克隆抗体，而且还包括其抗原结合片段(例如Fab，Fab’，F(ab’)2，FV)，单链抗体(scFv)，其突变体，包含抗体部分的融合蛋白，人源化抗体，嵌合抗体，双抗体，线性抗体，单链抗体，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和任意其他修饰的免疫球蛋白分子构造，其包含所需特异性的抗原识别位点，包括抗体的糖基化变体，抗体的氨基酸序列变体和共价修饰的抗体。所述抗体包括任何类型的抗体，如IgD，IgE，IgG，IgA或IgM(或其子类)，以及不属于任何特定种类的抗体。根据抗体重链恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类。免疫球蛋白有五大类：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA。对应于不同类的免疫球蛋白的重链恒定域分别称作α，δ，ε，γ和μ的亚基结构，不同类的免疫球蛋白的三维构型是众所周知的。
要使用在本文描述的方法的抗体可以是小鼠，大鼠，人或任何其他来源(包括嵌合或人源化抗体)。在一些实例中，所述抗体包含修饰的恒定区，如一个恒定区是免疫惰性，例如不触发补体介导的裂解，或者不刺激抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。ADCC活性可使用在美国专利5,500,362号中公开的方法进行评估。在其他实施方案中，恒定区包括改顺序(欧洲免疫学杂志(1999)29：2613-2624；PCT申请PCT/GB99/01441；和/或英国专利申请9809951.8号)。
任何本文描述的抗体的可以是单克隆或多克隆的。“单克隆抗体”是指均质抗体群，“多克隆抗体”是指异源抗体群。这两个术语不限制抗体的来源或者其所用的方法。
在一些实例中，本文公开的特异性抗体结合的靶的PD-1抗原。认为“特异性结合”(在本文可互换使用)到目标或的表位是本领域公知的术语和方法，以确定这种特异性结合也是本领域中公知的。分子被认为显示出“特异性的抗体结合”，如果它与靶点反应更频繁，更迅速，更大的持续时间。抗体“特异性结合”于靶抗原，如果它以更大的亲和力，亲合力，更容易和/或以比其结合其他物质的更大的持续时间结合。例如，抗体特异(或优先)地结合到PD-1的表位是结合本PD-1的表位具有更大的亲和力，亲合力，更容易和/或以比其结合其它PD-1的表位或非PD-1表位更大的持续时间的抗体。还应当理解通过阅读该定义，例如，抗体特异性结合第一靶抗原可以或可以不特异性或优先结合第二靶抗原。因此，“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(虽然其可包括)专一结合。通常，但不一定，结合就是优先结合。
抗PD-1抗体是抗体能够结合PD-1抗原并抑制PD-1介导的信号传导途径，从而增强免疫应答，例如T细胞的活化。在一些实例中，本文中所描述的抗PD-1抗体至少20％抑制PD-1的信号传导途径，至少40％，至少50％，至少75％，至少90％，至少100％，或由至少2倍，至少5倍，至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，或至少1000倍。
抗PD-1抗体与PD-1抗原的结合亲和力可以小于约100nM，约50nM，约10nM，约1nM，约500PM，约100pM，约50pM，约2pM。结合亲和力可表示为：KD解离常数，KD越小结合亲力越大。确定抗体PD-1的结合亲和力的一种方式是通过表面复共振来测定(BIAcore3000TM表面等离子共振(SPR)系统，的BIAcore，INC，Piscaway新泽西州)。动力学结合速率(kon)和分解率(koff)一般在25℃获得；平衡解离常数(KD)值的计算方法：KD＝koff/kon
本文所描述的抗PD-1抗体可以结合到相同于SHB-617的表位，其VH氨基酸序列和VL氨基酸序列在图2，3，4和5中提供。或者是可竞争SHB-617结合到PD-1靶抗原的抗体。这样的抗体可以表现出至少相对于SHB-617的20％(例如，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，或更高)抑制由PD-1介导的活性。
这种抗PD-1抗体可以包括重链CDRs和/或轻链CDRs相同于SHB-617CDRs，例如，图2和图3所显示CDR区(跟据Chothia编号方案所决定。可替代地或另外地，本文描述的抗PD1抗体可以包含为VH的CDR1，CDR2和CDR3的至少75％(例如，80％，85％，90％，95％，或98％)相同SHB-617，和/或为VL的CDR1，CDR2，和CDR3至少75％(例如，80％，85％，90％，95％，或98％)相同于SHB-617的对应的CDRs。
“互补决定区”或“CDR”是本领域中已知为是指抗体可变区中的非邻接的氨基酸的序列，其赋予抗原特异性和结合亲和力。在一般情况下，有在每条重链可变区的三(3)个CDR和在每一个轻链可变区的三(3)的CDR。一个给定的CDR的精确氨基酸序列的边界可以使用任意数量的公知的方案中，包括那些由Kabat等人所述来确定。这些文献包括Kabat(1991),5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(theKabat"numbering scheme),Al-Lazikani et al.,(1997)JMB 273,927-948(the Chothia"numbering scheme),MacCallum et al.,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)(the Contactnumbering scheme),Lefranc M P et al.,Dev Comp Immunol,2003January；27(1):55-77(the IMGT numbering scheme),and Honegger A and Pluckthun A,J Mol Biol,2001Jun.8；309(3):657-70,(the AHo numbering scheme).
一个给定的CDR的边界可以根据用于识别该方案而有所不同。例如，所述的Kabat方案是基于结构比，而Chothia方案基于结构信息。联系人方案基于复合物晶体结构的分析，并在许多方面与Chothia编号方案类似。因此，除非另有规定，术语“互补决定区”或一个给定的抗体的“CDR”应被理解通过任何以上描述的已知的方案所限定为包括互补决定区。
如果，用相同的编号方案确定的，抗体具有相同的VH和/或VL的CDR作为SHB-617，这样的抗体被视为具有相同的CDR作为SHB-617和本发明的范围之内。例如，这样的抗体可具有相同的VH和/或VL的CDR作为克隆SHB-617如由Chothia编号方案所决定。在另一实例中，本发明的范围内的抗PD-1抗体可具有相同的VH和/或VL的CDR作为克隆SHB-617如通过Kabat编号方案来确定。
可替代地，本文描述的抗PD-1抗体可以包含VH至少75％(例如，80％，85％，90％，95％，或98％)相同SHB-617VH(成熟或前体)和/或VL至少75％(例如，80％，85％，90％，95％，或98％)相同于SHB-617VL(成熟前体的)。
两个氨基酸序列的“同一性百分比”是使用Karlin和Altschul的算法来确定(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68,1990,modified as in Karlin and AltschulProc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77,1993)。这样的算法并入NBLAST和XBLAST程序Altschul(版本2.0)，J.Mol.Biol.215:403-10,1990.BLAST蛋白质检索可以用XBLAST程序进行，得分＝50，字长＝3，以获得同源的氨基酸序列与感兴趣的蛋白质分子。当两个序列之间存在的一些间隙，空位BLAST可以如Altschul描述被利用(Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402,1997)。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各自程序的默认参数(例如，XBLAST和NBLAST)。
在其它实例中，本文所描述的抗PD-1抗体可以包含VH变种，其包括多达5个(例如，1，2，3，4或5)在VHCDR区的氨基酸残基变化(VHCDR1，CDR2和/或CDR3)相比SHB-617的CDR，和/或VL变种，其包括多达5个(例如，1，2，3，4或5)在VLCDR区的氨基酸残基变化(VLCDR1，CDR2和/或CDR3)相比SHB-617的CDRs。
如本文所描述的抗PD-1抗体可以是从SHB-617衍生的嵌合抗体，这样的嵌合抗体可以包括来自SHB-617衍生为VH和VL(本文描述的那些)和重恒定区和轻恒定区来自人抗体。嵌合抗体是指具有从第一物种来自第二物种的可变区或可变区的一部分，和恒定区的抗体。典型地，在这些嵌合抗体，包括轻链和重链模拟的可变区的抗体的可变区是来自于哺乳动物(例如，非人哺乳动物，如小鼠，兔和大鼠)中的一个物种，而恒定部分的序列与另一个哺乳动物衍生的诸如人的抗体中的序列。在一些实施方案中，氨基酸修饰可以在可变区和/或恒定区来制备。
在其它实例中，本文所描述的抗PD-1抗体是SHB-617“人源化抗体”。人源化抗体可以改变非人类抗体，以人序列取代某些抗体片段(例如，构架区)，从而减少在人体中免疫原性。本文所描述的人源化抗体可以是任何抗体形式。在一些实施方案中，它们是完整的免疫球蛋白分子(全长抗体)，包括IgG，IgA的，IgD的，IgE和IgM抗体。在其他实施方案中，人源化抗体的抗原结合片段，例如，Fab，F(ab’)2，scFv和Fv。在某些情况下，它们也可以是单链抗体或双特异性抗体。
人源化抗体可设计如下。首先对非人抗体VH及VL各可变区进行三维分子建模，分析按照本领域中已知的方法，例如，Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:10029-10033(1989)。接着，使用鉴定相同的分子建模分析预测框架氨基酸残基对正确的CDR结构的形成起非常重要作用。同时，从人抗体基因数据库搜索查询与非人类抗体氨基酸序列具有高同源抗体基因，从而选择人VH及VL受体基因。
所选择的人受体基因CDR区可以替换为从非人抗体或其功能变体CDR区。在必要时，被预测为与CDR区相互作用重要母体链的框架区内的残基(见上面的描述)可以被用于替代在人受体基因的相应残基。
本文所述提供从SHB-617而来的嵌合体和人源化抗PD-1抗体氨基酸序列及抗体基因列于下方(也参见图2-5；和实施例1-3)：
SHB-617序列(鼠/人IgG4/卡帕嵌合体)
全长重链的氨基酸序列(448 AA，SEQ ID NO.:19)
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGTCVSWIRQPSGKGLEWLATICWEDSKGYNPSLKNRLTISKDTSNNQAFLKITSVDTADSAIYYCARREDSGYFWFPYWGQGTLVSVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
全长重链的编码序列(SEQ ID NO.:20)
CAGGTGACACTCAAGGAAAGCGGACCTGGAATCCTCCAACCTTCCCAGACTCTTTCCCTGACCTGTAGCTTCTCCGGGTTCTCCTTGTCCACCTCTGGCACATGCGTGTCATGGATCAGACAGCCATCTGGGAAGGGCTTGGAGTGGCTGGCAACAATTTGCTGGGAGGATTCAAAGGGGTACAACCCCAGTCTGAAGAACAGGCTGACCATTAGCAAGGACACCAGCAACAATCAGGCCTTCCTGAAAATTACTAGCGTCGATACAGCTGACAGCGCCATCTACTACTGCGCCCGCCGGGAGGACAGCGGGTACTTTTGGTTTCCCTATTGGGGCCAGGGCACTCTCGTCTCCGTGAGCAGTgctagcactaaggggccatcagtgttccccctggccccatgcagccggagtacaagcgaatccactgccgcccttggatgcctcgtgaaggattacttccccgagcccgtgaccgtgagttggaacagcggagccttgacaagcggcgtccacacattccccgccgtcctccagtctagcgggctttacagcctcagctccgtcgtgaccgtccctagttcctccctcggaactaagacatacacttgcaacgtggatcataagccctcaaacacaaaggtcgataagcgggtcgagagcaaatacggcccaccatgcccaccttgtcccgcccccgagtttttggggggcccctctgtgttcctctttcctcctaagcctaaggacactctcatgattagccggacacccgaggtcacctgcgtcgtcgtggacgtgagccaggaggaccctgaagtgcagttcaattggtatgtggacggggtcgaggtccacaacgccaagacaaagccaagagaggagcagtttaacagtacctaccgggtcgtgagtgtgctgacagtgcttcaccaggactggctgaacgggaaggagtataagtgcaaggtgtccaacaagggcctcccctcaagcatcgagaagactatctctaaggccaaggggcagcccagagagccacaggtgtatacattgccccctagccaggaggagatgactaaaaaccaggtgtctctgacctgtctggtcaaaggcttctacccctccgatatcgctgtggagtgggagtccaacggacagccagaaaacaactacaagaccacacctcccgtcctggatagcgacggctcatttttcctatacagcaggctgaccgtggacaaatccagatggcaggagggcaacgtgttctcctgcagcgtgatgcatgaggccctgcacaaccactacactcagaagtccctgtccctgagcctgggcaaatag
全长轻链的氨基酸序列(213 AA，SEQ ID NO.:21)
NIQMTQSPSLLSASVGDRVTLSCKAGQNVNNYLAWYQQKLGEPPKVLIFNANSLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYFCQQYNSWTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
全长轻链的编码序列(SEQ ID NO.:22)：
AATATCCAGATGACCCAGTCCCCTTCCCTCCTCAGCGCTTCCGTGGGAGATAGGGTGACACTCAGTTGCAAGGCAGGACAGAACGTGAACAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCTGGGCGAACCTCCAAAGGTCCTTATCTTCAACGCCAACAGCCTGCAGACCGGGGTGCCCTCACGGTTTTCTGGGTCTGGGAGCGGCACAGACTTTACTTTGACTATTAGCTCCTTGCAGCCCGAGGACGTCGCCACATATTTCTGTCAGCAATACAACAGCTGGACCACCTTCGGGGCCGGCACAAAGCTGGAGCTGAAAcgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaag tctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag
人源化的SHB-617(SSI-361)可变区
>SSI-361_VL的氨基酸序列(SEQ ID NO.:11)
NIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKAGQNVNNYLAWYQQKPGKAPKVLIFNANSLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSWTTFGGGTKVEIKR
>SSI-361_VH的氨基酸序列(SEQ ID NO.:12)
QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGTCVSWIRQPPGKALEWLATICWEDSKGYNPSLKSRLTISKDTSKNQAVLTMTNMDPVDTATYYCARREDSGYFWFPYWGQGTLVTVSS
具有人IgG4S228P/kappa的人源化SHB-617(SSI-361)
重链全长序列(448 AA，SEQ ID NO.:23)
QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGTCVSWIRQPPGKALEWLATICWEDSKGYNPSLKSRLTISKDTSKNQAVLTMTNMDPVDTATYYCARREDSGYFWFPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
轻链全长序列(213 AA，SEQ ID NO.:24)
NIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKAGQNVNNYLAWYQQKPGKAPKVLIFNANSLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSWTTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
本文还描述了上述披露示例人源化抗PD-1抗体SSI-361的功能性变体。这样的功能变体可以包括为VH，其包含的氨基酸序列至少85％(例如，90％，92％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％)相同于SSI-361，和/或为VL具有的氨基酸序列中的至少85％(例如，90％，92％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％)相同于SSI-361.这些变体能够结合到PD-1，特别是人的PD-1抗原。在一些实例中，所述变体具有抗原结合亲和力相对于上述的示例性人源化抗体相似(例如，具有的Kd<100×10-9M)。
在一些实施方案中，上述的功能性变体包含一个或多个突变(例如，保守取代)中的任一在VH或VL的FR(相比SSI-361)。优选地，这样的突变不会发生在被预测为与一种或多个CDRs相互作用氨基酸残基(见实施例2下文)。正如本领域已知的，FR区中的突变是不太可能影响抗体的抗原结合活性。在其他实施方案中，功能性变体本文所述的包含一个或多个突变(例如，1，2，或3)在一个CDR区的一个或多个。优选地，这种功能性变体保持相同的区域/残基负责抗原结合作为母体，如CDR的内部相同的特异性决定残基。
任何抗PD-1抗体可以通过常规的方法，例如，重组技术来制备。见，例如，Green等,Nature Genetics 7,13；和美国专利号5545806和5569825。
当制备一个全长抗体，编码本文所述的任何抗PD-1抗体VH及VL的序列可以连接于人免疫球蛋白的Fc区和所得基因的编码全的编码序列全长抗体重和轻链可以表示并装配在合适的宿主细胞，例如，植物细胞，哺乳动物细胞，酵母细胞，或昆虫细胞。
抗原结合片段可通过常规方法制备。例如，F(ab’)2片段可通过胃蛋白酶消化的全长抗体分子；Fab片段可以通过还原F(ab’)2片段的二硫桥产生产生。或者，这样的片段可通过重组技术通过表达在合适的宿主细胞中的重链和轻链片段制备(例如，大肠杆菌，酵母，哺乳动物，植物，或昆虫细胞)，并让它们在体内或体外组装以形成所需的抗原结合片段。
单链抗体可通过重组技术通过将一核苷酸序列编码的重链可变区和核苷酸序列编码的轻链可变区来制备。优选地，柔性接头结合两个可变区之间。
如上所述产生人源化抗PD-1抗体可以进行检查，以确定其性能，如抗原结合活性和生物功能，以下的常规方法，例如，实施例3下面描述的那些。
本文还公开了编码本文描述的任何抗PD-1抗体的核酸，载体如包含这些核酸的表达载体或重组病毒，和包含所述载体的宿主细胞。在一个实例中，两个重链和轻链编码序列包含在一个表达载体，每个重链编码序列和轻链编码序列可以可操作地连接到合适的启动子。可替代地，这两个重链和轻链的表达可以由相同的启动子来驱动。在另一实例中，每个抗体的重链和轻链克隆在给个体载体。在后一种情况下，编码重链和轻链的表达载体可以被共转染到一个宿主细胞中的两条链，其可以被组装以形成完整的抗体在体内或体外的表达。备选地，表达载体编码重链和编码轻链可引入不同宿主细胞中表达各重链和轻链，然后可以被纯化和组装以形成完整的抗体。合适的宿主细胞包括，但不限于，哺乳动物细胞(例如，CHO细胞或293细胞)，植物细胞，昆虫细胞，酵母细胞，或细菌细胞。能够表达SSI-361或其片段的重组病毒，如溶瘤细胞病毒(oncolytic viruses)，可用于治疗性应用。
本发明还提供一种免疫偶联，包含任何本文中所描述的抗PD-1抗体和合适的试剂，其可以是治疗剂或诊断剂。在一些实例中，本文公开抗PD-1抗体连接到细胞毒性剂，放射性同位素，或药物。制备这种免疫缀合物在本领域中是公知的。例如见，WO 2014/160160,美国专利号5208020和5416064，及Chari等，1992癌症研究。52：127-131。例如，可将抗体与双功能试剂如N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)改性以引入活性二硫化物部分。如果需要的话，该代理也可以缀合到抗体可以被修饰，以引入硫醇基团以下常规实践。反应与含硫醇试剂将产生其中抗体和试剂通过二硫键连接的免疫缀合物。
抗PD-1抗体用途
本文所描述的抗PD-1抗体(游离形式或作为免疫缀合物)可以用作治疗剂和诊断剂，以及作为研究工具应用于生物化学，分子生物学和医学研究工作。
因此，本文所公开的用于治疗与PD-1的信号传导有关的疾病的方法(例如，癌症，感染性疾病如病毒感染(如，甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎或C)，以及其它免疫相关疾病)，其包括给予需要所述治疗的个体本文所述的任何抗PD-1抗体的有效量，这种抗体也可用于增强免疫反应，如T细胞的活化在需要治疗的受试者。在一个实例中，需要刚刚提到的治疗的对象(例如，人类患者)是具有，怀疑具有，或有风险有癌症发展的患者。在某些实施方案中，本文所述的任何抗PD-1抗体可用于治疗PD-L1阳性肿瘤。例如，适合治疗的人类病人可以通过检查该病人是否携带PD-L1阳性癌细胞来确定。本文所述的适合治疗的人类病人可以是携带PD-L1阳性癌细胞的癌症患者。
如本文所用，“治疗”一词是指一种组合物，包括一种或多种活性剂对受试者的施用或给药。患者具有与PD-1介导相关的病症/疾病(例如，本文描述的那些)，症状的疾病/紊乱，或者向疾病/病症的诱因，其宗旨是治疗，治愈，减轻，解除，改变，矫正，缓解，改善或影响疾病/病症，这种病的症状/病症，或朝向该疾病/病症的倾向。
本文所用的“有效量”指的是赋予治疗效果上的问题，无论是单独或与一种或多种其它活性剂组合所需的每种活性剂的量。有效量而有所不同，所确认的本领域技术人员在，根据特定的条件被治疗的病症的严重程度，个体患者参数，包括年龄，身体状况，身高，性别和体重，治疗的持续时间，所述并行治疗的性质(如果有的话)，管理和像的保健医生的知识和经验范围内的因素的具体路线。这些因素是公知的那些普通技术人员在本领域中，并且可以与不超出常规的实验来解决。它通常优选的是其使用的各个组件或组合的最大剂量，也就是最高安全，根据剂量，以合理的医学判断。但是像本领域的普通技术人员可理解的，患者可能跟据医疗原因，心理原因或几乎任何其他原因坚持要求较低剂量或可耐受的剂量。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体本文所述的量是有效地抑制了PD-1信号(例如，至少20％，30％，50％，80％，100％，200％，400降低PD1信号％，或500％相比，空白对照)。在其他实施方案中，抗PD-1抗体本文所述的量是有效的活化免疫应答(例如，至少20％，30％，50％，80％，100％，200％，400％，或500％相比于空白对照)。
通常，对于任何本文描述的抗体的施用，初始候选剂量可以是约2毫克/公斤。为了本发明的目的，典型的日剂量的范围为约任何0.1微克/公斤至3微克/公斤到30微克/公斤至300微克/公斤至3毫克/公斤，30毫克/公斤至100毫克/公斤或更多，这取决于上述因素。对于持续数天或更长的重复施用，根据状况，治疗或持续直到不良症状发生。示例性的给药方案包括施用初始剂量为约2毫克/公斤，随后是约1毫克/公斤的抗体的每周维持剂量，或之后的约1毫克/公斤每隔一周的维持剂量。然而，其它剂量方案可能是有用的，这取决于药物代谢动力学衰变该医生希望达到的图案。例如，每周1-4次给药是预期的。在一些实施方案中，剂量范围从约3微克/公斤到约2毫克/公斤(约3微克/公斤，约30微克/公斤，约300微克/公斤，约3毫克/公斤)可被使用。在一些实施方案中，给药频率每周是一次，每2周，每4周，每5周，每6周，每7周，每8周，每9周，或每10周一次；或每月一次，每2个月，或每3个月，或更长的时间一次。此疗法的进展易于通过常规技术和测定法监测。给药方案(包括使用的抗体)可以随时间变化。
能够实践本文所公开的处理中，任何抗PD-1抗体或编码核酸的可与药学上可接受的载体混合以形成用于给予需要该治疗的受试者的药物组合物。药学上可接受的载体是与组合物中的活性成分(多个)相容(和优选地，能够稳定它的)，而不是有害于要治疗的受试者。例如，增溶剂如环糊精，如本文所述其中形成具有抗PD-1抗体更可溶络合物，或核酸编码这样，或多种增溶剂，可以用作药物载体用于递送激动剂/拮抗剂。其它载体的实例包括胶体二氧化硅，硬脂酸镁，月桂基硫酸钠，和D&C黄#10，例如，见Remington’sPharmaceutical Sciences,Edition 16,Mack Publishing Co.,Easton,Pa(1980)；andGoodman and Gilman’s"The Pharmacological Basis of Therapeutics",TenthEdition,Gilman,J.Hardman and L.Limbird,eds.,McGraw-Hill Press,155-173,2001.
配制为用于治疗用途的药物组合物，可用于存储由混合的药剂具有纯度与任选的药学上可接受的载体，赋形剂或稳定剂在所希望的程度来制备(Remington’sPharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))，以冻干配制剂或水溶液的形式。可接受的载体，赋形剂，或稳定剂是无毒的收件人在所采用的剂量和浓度，并且包括缓冲剂如磷酸盐，柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基氯化铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚，丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸酯的烷基如甲基或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸，或赖氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；形成盐的抗衡离子如钠；金属配合物(例如，Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂例如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
治疗目标疾病，上面提到的药物组合物的有效量可以通过合适的途径给予受试者(例如人)。需要治疗的受试者可以是有风险，或怀疑患有与PD-1介导有关病症的患者。这样的患者可以通过常规体检来鉴定。
本文所述的治疗性多核苷酸或多肽可使用基因递送载体被递送。基因递送载体可以是病毒或非病毒来源的(一般参见，Jolly,Cancer Gene Therapy(1994)1:51；Kimura,Human Gene Therapy(1994)5:845；Connelly,Human Gene Therapy(1995)1:185；andKaplitt,Nature Genetics(1994)6:148)。这样的编码序列的表达可以使用内源哺乳动物的或异源启动子和/或增强子被诱导。编码序列的表达可以是组成型或调节。
递送所需多核苷酸的表达在期望的细胞的病毒为基础的载体是公知的现有技术。示例性的基于病毒的载体包括，但不限于，重组逆转录病毒(见，例如，PCT PublicationNos.WO 90/07936；WO 94/03622；WO 93/25698；WO 93/25234；WO 93/11230；WO 93/10218；WO 91/02805；U.S.Pat.Nos.5,219,740and 4,777,127；GB Patent No.2,200,651；and EPPatent No.0 345 242)，甲病毒为基础的载体(例如，辛德毕斯病毒载体，塞姆利基森林病毒(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)，罗斯河病毒(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR 1249；ATCC VR-532)，和腺相关病毒(AAV)载体(见，例如，PCT Publication Nos.WO 94/12649,WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984and WO 95/00655)。DNA联接到杀死的腺病毒也可以使用(Curiel,Hum.Gene Ther.(1992)3:147)。
非病毒递送载体和方法也可使用，包括，但不限于，聚阳离子凝聚的DNA连接或单独切断了杀死腺病毒(见，例如，Curiel,Hum.Gene Ther.(1992)3:147)；配体连接的DNA(例如，Wu,J.Biol.Chem.(1989)264:16985)；真核细胞输送载体细胞(见，例如，美国专利No.5,814,482；PCT Publication Nos.WO 95/07994；WO 96/17072；WO 95/30763；and WO 97/42338)和核酸电荷中和或融合细胞膜。裸DNA也可以采用。示例性的裸DNA导入方法在PCT公开号WO 90/11092和美国专利号5580859中所述。脂质体，可作为基因递送载体在专利中描述(U.S.Pat.No.5,422,120；PCT Publication Nos.WO 95/13796；WO 94/23697；WO 91/14445；and EP Patent No.0524968)。其他方式见Philip,Mol.Cell.Biol.(1994)14:2411,and in Woffendin,Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)91:1581。
如果需要的话，本文所述的药物组合物，含有抗PD-1抗体或其编码核酸(多个)，可以共同施用第二治疗剂。第二治疗剂的选择取决于疾病的待处理的类型。例如，如果目标疾病是癌症，所述第二剂可以是抗癌剂(例如，他莫昔芬，紫杉醇，替尼，塞米松，和赫赛汀)。
当这里所描述的药物组合物是共用于与第二治疗剂，无论是组合物中的第二药剂的或，或两者的亚治疗剂量，可以在受试者中具有可用于治疗，或有发展与细胞信号由PD-1介导相关的疾病或病症的风险。目标疾病包括癌症(例如，本文中描述的那些)，感染性疾病等引起的病毒，细菌，或真菌感染，或免疫缺陷，如T细胞功能障碍相关的其他疾病的疾病。由病毒感染引起的疾病包括，但不限于，甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎病毒。
这里所用的“亚治疗剂量”是指一种剂量，这是小于会产生治疗效果的剂量(如果受试者施用在没有其他试剂或试剂)。因此，亚治疗剂量在不使用本发明的药剂时给药对象不会产生所需治疗结果。许多试剂治疗剂量是在临床使用的是在医药领域公知的，和另外的治疗剂量可以由本领域技术人员无需过度的实验来确定。治疗剂量已经于如Remington的Pharmaceutical Sciences，第22版(2012)的引用已广泛地描述；还有许多其他医学界作为指导疾病和病症的治疗的医学文献。
常规方法，已知的医学领域的普通技术人员，可以用于施用药物组合物给受试者，这取决于疾病的要治疗的类型或疾病的部位。此组合物还可以通过其它常规途径，例如，口服，肠胃外给药，通过吸入喷雾，局部，直肠，经鼻，口腔，阴道或通过植入库。本文所用的术语“肠胃外”包括皮下，皮内，静脉内，肌内，关节内，动脉内，滑膜内，胸骨内，鞘内，病灶内和颅内注射或输注技术。此外，它可以施用到通过施用可注射的贮库途径，例如使用1-，3-，或6个月的贮库可注射或可生物降解的材料和方法的主题。
注射组合物可以含有各种载体如植物油，二甲基乙酰胺(dimethylactamide)，二甲基甲酰胺，乳酸乙酯，碳酸乙酯，肉豆蔻酸异丙酯，乙醇，多元醇(甘油，丙二醇，液体聚乙二醇，等等)。对于静脉内注射，水溶性抗体可以通过点滴方法，由此含有抗体和生理上可接受的赋形剂的药物制剂输注给药。生理上可接受的赋形剂可以包括，例如，5％葡萄糖，0.9％盐水，林格溶液或其它合适的赋形剂。肌内制剂，例如，抗体的一个合适的可溶盐形式的无菌制剂，可以溶解和施用的药用赋形剂诸如水换注射液，0.9％盐水，或5％葡萄糖溶液。
当用编码本文所述用作治疗剂的抗PD-1抗体核酸作治疗，核酸或载体表达该抗体可以递送受试者(Akhtar等,1992,Trends Cell Bio.2,139).例如，它可以通过使用脂质体，水凝胶，环糊精，生物可降解的纳米胶囊，或生物粘附性微球被引入到细胞中。或者，所述核酸或载体可在本地通过直接注射或通过使用输注泵递送。其它方法包括通过使用缀合物和生物可降解的聚合物的使用各种运输和载体系统。
为了便于输送，任何抗PD-1抗体或其编码核酸可以结合有伴侣剂。如本文所用，“缀合”是指两个实体相关联，优选以足够亲和力，这两个实体之间的关联的治疗益处的实现。轭包括共价或非共价键合，以及其它形式的关联，如任一实体对截留或内的其它，或上或内的第三实体(两个实体，例如，胶束)。
伴侣剂可以是天然存在的物质，如蛋白质(例如，人血清白蛋白，低密度脂蛋白，或球蛋白)，碳水化合物(例如，葡聚糖，支链淀粉，壳多糖，脱乙酰壳多糖，菊糖，环糊精或透明质酸)，或脂质。它也可以是一个重组或合成分子，例如合成聚合物，例如，一种合成的聚氨基酸。聚氨基酸的实例包括聚赖氨酸(PLL)，聚L-天冬氨酸，聚L-谷氨酸，苯乙烯-马来酸酐共聚物，聚(L-丙交酯-共-glycolied)共聚物，二乙烯基醚-马来酸酐共聚物，N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)，聚乙二醇(PEG)，聚乙烯醇(PVA)，聚氨基甲酸酯，聚(2-ethylacryllic酸)，N-异丙基丙烯酰胺的聚合物，和聚膦嗪。
在一个实例中，伴侣剂是微胶粒，脂质体，纳米颗粒，或微球体，其中的寡核苷酸/干扰RNA被封装。制备这种微胶粒，脂质体，纳米颗粒，或微球体是公知的现有技术。见，例如，美国专利5108921；5354844；5416016；和5,527,5285。
在另一实例中，伴侣剂作为基底用于连接一个或多个膜融合或缩合剂的。
阿膜融合剂是响应局部pH值。例如，在核内体中遇到的pH值，它可以导致在其直接环境，物理变化，例如，在渗透性质的变化扰乱或增大核内体膜的渗透性，从而有利于释放的反义寡核苷酸进入宿主细胞的细胞质中。优选的促融合剂改变电荷，例如，在pH低于生理范围时变得质子化(例如，在pH 4.5-6.5)。促融合剂可以是含有能够经历电荷改变的氨基分子(如质子)当暴露于特定的pH值范围。这种促融合剂包括具有聚链的聚合物(例如，聚乙烯亚胺)和膜破坏剂(如，mellittin)。其他的例子包括多组氨酸，polyimidazole，聚吡啶，聚丙烯亚胺，和聚缩醛物质(例如，阳离子聚缩醛)。
与反义寡核苷酸甲冷凝剂相互作用，导致它以冷凝(例如，减少寡核苷酸的大小)，从而保护它免于降解。优选地，所述缩合剂包括：部分(例如，带电的部分)，其与通过，寡核苷酸相互作用，例如，离子相互作用。缩合剂的实例包括聚赖氨酸，精胺，亚精胺，聚胺或季盐，假肽-聚胺，肽聚胺，聚胺树枝状聚合物，精氨酸，脒，鱼精蛋白，阳离子脂质，阳离子卟啉，和α-螺旋肽。
组合治疗
本文还提供了如本文所述的与任何抗PD-1这里所描述的抗体和合适的第二药剂的组合疗法为任何与PD-1的信号传导相关的疾病。术语联合治疗，如本文所使用的，包括这些试剂的给药(例如，抗PD-1抗体，例如本文所述的那些和第二种合适的治疗剂)以顺序的方式，也就是，其中每种治疗剂的给药在不同的时间这些治疗剂，或至少两种药剂的，以基本同步的方式，以及施用。每种药剂的顺序或基本上同时给予可受任何适当的途径，包括但不限于，口服途径，静脉途径，肌内，皮下途径，并直接吸收通过粘膜组织。所述剂可以通过相同的途径或不同的途径给药。例如，第一药剂(例如，抗PD-1抗体)可以口服给药，而第二药剂(例如，抗癌症剂，抗感染剂；或免疫调节剂)可以被静脉内给药。此外，所选择的组合的试剂可以通过静脉注射施用，而组合的其它药剂可以口服给药。可替代地，例如，两个或多个代理可以通过静脉内或皮下注射施用。
如本文所用，术语“连续”的意思，除非另有规定，其特点是正规的顺序或次序，例如，如果一个剂量方案包括抗PD-1抗体的施用和第二剂，顺序给药方案可以之前包括抗PD-1抗体的施用，同时，基本同时，或施用第二药剂，但两种药剂之后将被施用在一个普通的顺序或次序。术语“分开的”是指，除非另有规定，保持除了从另一个。术语“同时”的意思，除非另有说明，或发生在相同的时间内完成，也就是说，本发明的药剂施用同时。术语“基本上同时”是指该试剂彼此分钟内施用(例如，在10分钟之内)，并打算涵盖联合施用以及连续施用，但如果施用是连续它是在时间上分离的只有很短的时间(如时间，将采取一个医生来管理两种化合物另发)。如本文所用，同时施用和基本上同时给药可以互换使用。顺序给药是指在时间上分离的本文所述药剂的施用。
联合疗法还可以接受在进一步结合本文中所描述与其它生物活性成分的试剂的施用。其中联合疗法还包括放射治疗，放射治疗可以在任何合适的时间进行，只要从治疗剂和放射治疗的组合的协同作用的有益效果达到进行。例如，在适当的情况下，有益的作用仍由天甚至数周时达到辐射治疗被暂时从治疗剂的施用除去，也许。当目标疾病是癌症，抗PD-1抗体也可以前或手术或放疗后使用。
但是应当理解的是，任何组合如本文所述的，可以使用任何顺序用于治疗本文中所述的对象疾病。本文所述的组合可以由许多因素，包括但不限于抑制或预防目标疾病进展，减轻了组合的另一种药剂的副作用的有效性，或效力的基础上选择减轻的目标有关的疾病症状的效果。例如，本文所述的联合治疗可减少任何由组合的每个个别成员有关的副作用。
合适的试剂为与任何共使用实施例抗PD-1抗体包括抗体结合的共刺激受体(例如，CD137/4-1BB，OX40，CD40，ICOS，CD27，HVEM或GITR)，的药剂诱导的免疫原性细胞死亡(例如，化疗剂，放射治疗剂，抗血管生成剂，或用于靶向治疗的试剂)中，抑制一个检查点的分子的试剂(例如，CTLA4，LAG3，TIM3，B7H3，B7H4，BTLA，或TIGIT)，一个癌症疫苗，修饰免疫酶(例如，IDO1或iNOS)的，靶向Treg细胞，用于过继细胞疗法，或者其调节髓样细胞的试剂。
用于增强免疫反应和治疗PD-1信号相关疾病试剂盒
本发明还提供试剂盒用于增强免疫应答和/或治疗与PD-1信号有关的疾病的使用。此类试剂盒可包括一个或多个容器，包括如本文所述的抗PD-1抗体。在一些实施方案中，试剂盒可以包括用于根据本文所述任何方法的使用说明。所包括的指令可以包括抗PD-1抗体给药的说明，以加强免疫应答和/或如本文所述的治疗对象疾病。所述试剂盒可进一步包括基于鉴定个体是否具有本文所述的那些PD-1信号传导有关的疾病。
关于使用抗PD-1抗体的指令一般包括信息如剂量，给药时间表，和给药途径用于预期治疗。所述容器可以是单位剂量，散装包(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。在本发明的试剂盒提供的指令通常写在标签或包装插页(指示例如，包括在试剂盒的纸页)，但机器可读指令(例如，携带的磁或光存储盘上的指示)也可以接受的。
所述标签或包装插页指示该组合物用于治疗本文所公开的任何目标疾病的或减轻这种疾病的一种或多种症状，可以提供用于实施本文所述任何方法。
本发明的试剂盒在合适的包装中。合适的包装包括但不限于，小瓶，瓶，罐，软包装(例如密封的聚脂薄膜或塑料袋)和类似物。还预期的是包装组合使用与特定设备，例如吸入器，鼻施用装置(例如，雾化器)或输液设备，诸如微型泵。一种试剂盒，可以具有无菌存取口(例如容器可以是静脉内溶液袋或具有可刺穿的塞子皮下注射针头的小瓶)。容器还可以具有无菌存取口(例如容器可以是静脉内溶液袋或具有可刺穿的塞子皮下注射针头的小瓶)。在组合物中的至少一种活性剂是抗PD-1抗体如本文所述。
本文描述的试剂盒可包括一种或多种另外的治疗剂，例如那些如上所述在“联合治疗”。
试剂盒可任选地提供额外的组分，例如缓冲液和解释性的信息。通常，试剂盒包括一个容器，在标签或包装插页或与容器相关联。在一些实施方案中，本发明提供的上述试剂盒的制造，包括内容的文章。
通用技术
本发明的实践将采用，除非另有说明，分子生物学的常规技术(包括重组技术)，微生物学，细胞生物学，生物化学和免疫学，这是本领域的技术范围内。这些技术在文献中充分解释，诸如，分子克隆：实验室手册，第二版冷泉港出版社；(Sambrook等，1989。)寡核苷酸合成(MJ步态，编，1984年。)；在分子生物学方法，Humana公司出版社；细胞生物学：实验室笔记本(JE Cellis，编辑，1998年)科学出版社；动物细胞培养(RI Freshney编，1987年)；介绍细胞和组织培养(JP马瑟和PE罗伯茨，1998年)中全会出版社；细胞与组织培养：检验操作规程(A.多伊尔，JB格里菲思和DG纽厄尔，EDS，1993-8)，J。Wiley和Sons；酶学方法(学术出版社有限公司)；手册实验免疫学(DM堰和CC布莱克威尔，合编)；基因转移载体的哺乳动物细胞(JM米勒和MP Calos合编，1987年)；在分子生物学当前协议(调频Ausubel等，编，1987)；PCR：聚合酶链式反应，(Mullis的，等人，编着，1994)；当前协议中免疫学(JE Coligan等人编着，1991)；分子生物学短期协议(Wiley和Sons，1999年)；免疫学(CA詹韦和P.斯格特，1997年)；抗体(P.芬奇，1997年)；抗体：一个实用的方法(。D.凯蒂，编，IRL出版社，1988至1989年)；单克隆抗体：一个实用的方法(P.牧羊人和C.院长，编，牛津大学出版社，2000。)；使用抗体：实验室手册(E.Harlow和D.巷(冷泉港实验室出版社，1999)；该抗体(M.萨内蒂和JD卡普拉编，哈伍德学术出版社，1995年)。
无需进一步详细说明，据信本领域的技术人员可根据上面的描述，利用本发明至其最大限度。以下的具体实施方案，因此，应解释为仅仅是说明性的，并且不限制本发明的以任何方式的其余部分。本文引用的所有出版物都通过用于本文引用的目的或主题引入作为参考。
实施例1：先导抗PD-1抗体的产生
试剂和方法
人PD-1蛋白(目录号1086-PD，Fc嵌合体)，PD-L1(目录号156-B7，Fc嵌合体)，和针对人PD-1(目录号AF1086)的抗原亲和纯化的多克隆山羊IgG购自R&D系统(美国)。单克隆小鼠抗人PD-1IgG(克隆J116，目录号16-9989-82)购自eBiosciences(美国)。表达人PD-1的稳定的CHO细胞系通过转染全长人PD-1cDNA(基因ID：5133)构建。
检测抗PD-1抗体的捕获ELISA通过先用链霉亲和素包被再用生物素-PD-1包被ELISA板获得。用偶联了辣根过氧化物酶的二抗(羊抗小鼠或大鼠IgG)检测结合PD-1的抗体样品。
利用CHO-PD-1细胞系，通过FACS检测抗PD-1抗体。与抗体样品孵育后，通过FACS用PE或FITC标记的二抗标记并用流式检测CHO-PD-1细胞。
利用CHO-PD-1细胞，通过FACS检测PD-1和PD-L1结合的阻断。PD-L1与CHO-PD-1细胞孵育，随后与抗PD-1抗体样品竞争性结合。随后，用Alexa 488偶联的抗人Fc段二抗检测结合的PD-L1。
杂交瘤细胞的构建以及先导抗体的鉴定
BALB/c小鼠和Wistar大鼠用重组人PD-1蛋白(R&D，#1086-PD，Fc嵌合体)进行免疫。通过捕获ELISA和生物素-PD-1监测免疫动物的抗PD-1血清滴度，以人Fc作为反向筛选(counter screen)。用FACS和CHO-PD-1细胞进一步确定阳性滴度。将滴度最高的小鼠和大鼠处死后，分离脾脏细胞，按标准杂交瘤实验方法与SP2/0骨髓瘤细胞融合。
用捕获ELISA和生物素-PD-1筛选了20块小鼠杂交瘤细胞96孔板，鉴定出334个阳性孔。随后用人Fc反向筛选对阳性样品进行测试，鉴定出85个克隆为PD-1特异性。然后，用FACS检测这些特异性克隆与CHO-PD-1细胞的结合，鉴定出最好的34个克隆用于进一步的阻断PD-L1与CHO-PD-1结合的筛选试验(利用FACS)。
进一步地，用捕获ELISA和生物素-PD-1筛选了25块大鼠杂交瘤细胞96孔板，鉴定出207个阳性孔。随后用人Fc反向筛选对阳性样品进行测试，鉴定出54个克隆为PD-1特异性。然后，用FACS检测这些特异性克隆与CHO-PD-1细胞的结合，鉴定出最好的30个克隆用于进一步的阻断PD-L1与CHO-PD-1结合的筛选试验(利用FACS)。
利用阻断PD-1和PD-L1结合试验筛选阳性杂交瘤细胞，鉴定出24个能特异性结合PD-1并具有阻断PD-L1与细胞PD-1结合活性的克隆。然后，对13个最好的杂交瘤(5个大鼠的和8个小鼠的)进行克隆，从8个单细胞克隆中生产并纯化出抗体，包括1个大鼠IgM，7个小鼠IgG杂交瘤。确认这些纯化的抗体可以与人PD-1蛋白和细胞PD-1结合，并且可以阻断PD-L1与细胞PD-1的结合。
对这些确认的杂交瘤细胞的抗体可变区进行如下测序。简言之，从冷冻的杂交瘤细胞中抽提总RNA，利用同种-特异性反义引物或通用引物，按照SuperScript III第一链合成系统操作手册，从RNA线性化cDNA。按照GenScript的RACE标准操作方法，扩增抗体的VH和VL片段。按标准分子克隆方法，将扩增的抗体片段分别克隆进标准克隆载体中。用菌落PCR筛选方法鉴定插入了正确尺寸的克隆。挑选出5个含有正确VH和VL插入尺寸的单克隆进行测序。发现5个不同克隆的VH和VL基因几乎完全相同。该一致的序列被认为是杂交瘤细胞所产生的抗体的序列。
合成了编码抗PD-1抗体可变区的cDNA序列，与包含铰链区S228P(EU编号；Kabat编号241)稳定突变的(Angal等,Mol.Immunol 30:105,1993)的人IgG4重链恒定区或人的κ轻链恒定区组成嵌合体。利用包含相应重链和轻链序列的质粒进行HEK293瞬转表达。用蛋白A亲和层析方法，对这些嵌合抗体进行纯化，纯化的抗体对PBS透析平衡后，检测内毒素(<5EU/mg)和单体含量>95％。
对这些嵌合性抗体进行功能性分析，检测其体外活化人T细胞功能的活性。从近期免疫过破伤风疫苗的志愿者中分离新鲜的PBMC。将细胞重悬于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，细胞密度1*10^6/ml，200ul/孔铺于96孔板内。PBS-BSA中稀释待测抗体，并加入PBMC培养基，终浓度为0、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30ug/ml。孵育30min后，向PBMC培养基中加入破伤风类毒素抗原(Astarte Biologics,cat#1002)，将板放回培养箱中，37℃，5％CO2培养7天。利用ELISA(eBioscience,88-7316-88)检测培养上清中的IFN-γ。使用的阳性对照抗体为抗人PD-L1抗体(eBioscience#16-5983)。结果显示，SHB-617(鼠/人IgG4/κ)嵌合体诱导最高最强的活化T细胞的IFNγ分泌(图1)。SHB-617衍生自大鼠IgM。SHB-617的活性显示，其结合结构域具有阻断PD-1功能的独特活性。
实施例2：先导抗PD-1抗体的人源化
如本文所述对抗体进行人源化，进一步表征得到人源化抗体。分析先导抗体SHB-617的氨基酸序列并参照了最新的Chothia CDR定义(Al-Lazikani等,1997)。可变区的CDR结构域(L1,L2,L3,H1,H2和H3)如图2,3所示。除非特别指明，使用Chothia 1987编号，位置编号为序数。
SHB-617可变区与人胚系(germlines)进行序列对比。依照整体序列的一致性、配对部分位置以及相似的CDR规范位置，一个最符合受体框架的胚系轻链和重链家族序列被鉴定出来，轻链的VK1-L1和重链的VH2-2-70。将J-片段基因上的FR4与亲代序列进行对比，选择J片段JK4和JH4分别作为轻链和重链。亲代序列在受体框架上的排列如图2,3所示。
通过CDR嫁接法，将人源化SHB-617连接到选定的人框架内，构建亲本结构模型以及人源化序列。注意位于FR2区域(Cys35)和CDR H2区域(Cys54)的两个半胱氨酸残基。在许多鼠源胚系序列中半胱氨酸残基常存在于这些位置，并可能形成二硫键以稳定VH区。在各个模型的残基H:Cys35和H:Cys54之间，建立额外的重链内二硫键，用于建模。FR2上的H:Cys35残基被保留于人源化序列中。另外，由于这个位点构象的缘故，将胚系FR3上的H:Asn67残基替换成苏氨酸并不合适，因此，本发明将其替换成丝氨酸，使其更适合局部构象。轻链框架并没有做回复突变。人源化以及亲本的轻重链可变区排列如图4、5所示。
利用包含铰链区S228P(EU编号；Kabat编号241)稳定突变的(Angal等,Mol.Immunol 30:105,1993)的人IgG4重链恒定区或人的κ轻链恒定区，构建人源化SSI-361中的重组的全人IgG4/κ。从HEK293细胞或CHO细胞中表达并纯化人源化的SSI-361抗体。
实施例3：抗PD-1嵌合抗体的评估
用Biacore测定结合PD-1抗原亲和常数
CM5sensor chip流室(GE Healthcare Life Sciences)用新鲜50mmol/L NHS和200mmol/L EDC激活360秒(10μL/分钟)，注入溶于10mmol/L NaAC(pH 5.0)的抗His IgG于活化的流室上(10μL/分钟)300秒，HBS-EP+(10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA and0.05％P20,pH 7.4)为运行缓冲液。未结合的活化位点用1mol/L乙醇胺(10μL/分钟)阻断420秒。在2个流室上分别重复该过程2次以固定蛋白。维持低流速过夜以平衡固定的蛋白。人的PD1用流细胞2捕获(10μL/分钟)后，将梯度稀释的SSI-361(3.125nM,6.25nM,12.5nM,25nM and 50nM)注于抗原结合的流室上(30ul/分钟，180秒)，注入双份单浓度抗原以解离600秒。没有结合抗原的流细胞1作为对照流室。为去除流室表面结合的抗体和抗原，注入10mM pH1.5的盐酸甘氨酸60秒(10μL/分钟,流室1-2)。每个浓度的待测抗体都重复以上步骤。亲和常数(表1)用Biacore X100评估软件2.0的1:1相互作用模型计算得出。数据均减去作为本底水平的流细胞1数值。
表1.Biacore分析SSI-361的结合动力学
抗原 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
人PD1 2.296E+5 1.165E-3 5.072E-9
ka：缔合常数；kd：解离常数；KD：亲和常数。
PD-1结合ELISA
用PBS缓冲液将待检测的抗PD-1抗体稀释至1ug/ml，100ul/孔体积加至高吸附的ELISA板内(Costar,Cat#3590,high binding)，4℃放置过夜。将96孔板中PBS缓冲液拍掉，加入200ul/孔封闭液(eBioscience,5*ELISA/ELISPOT Diluent,Cat#00-4202-55)，室温孵育1h进行封闭。拍去封闭液，用PBST缓冲液洗板3次后，加入100ul/孔用封闭液梯度稀释(0,0.001,0.01,0.1,1,10ug/ml)的his-tagged人PD-1protein(Sino Biological Inc.Cat#10377-H08H-100)，或his-tagged rhesus monkey PD-1-His(Sino Biological Inc.Cat#90305-K08H-100)，置室温孵育1h。用PBST缓冲液洗板4次后，加入100ul/孔用封闭液1:2000稀释的anti-His-HRP(Genscript Cat#A00612)，置室温孵育1h。用PBST缓冲液洗板4次后，加入100ul底物TMB，室温孵育约15min，加入50ul/孔1M H2S04终止反应。用FlexStation 3酶标仪450nm处读取吸收值，用Graphpad 5.0,"log(agonist)vs.response--Variableslope"计算SSI-661ELISA结合EC50值为0.33nM(人PD-1)and 0.39nM(猴PD-1)，见图6A&B。
用PBS缓冲液将食蟹猴PD1-Fc tag(Sino Biological Inc.Cat#90311-C02H)稀释至2ug/ml，100ul/孔体积加至高吸附的ELISA板内(Costar,Cat#3590,high binding)，4℃放置过夜。将96孔板中PBS缓冲液拍掉，加入200ul/孔封闭液，室温孵育1h进行封闭。拍去封闭液，用PBST缓冲液洗板3次后，加入100ul/孔用封闭液梯度稀释的待测抗PD-1抗体(0,0.001,0.01,0.1,1,10ug/ml)，置室温孵育1h。用PBST缓冲液洗板3次后，加入100ul/孔用封闭液1:4000稀释的anti-Hu IgG-HRP(goat-anti-human Ig kappa-HRP,Mil lipore,Cat#AP502P)，置室温孵育1h。用PBST缓冲液洗板4次后，加入100ul底物TMB，室温孵育约15min，加入50ul/孔1M H2S04终止反应。用FlexStation 3酶标仪在450nm处读取吸收值，计算SSI-661与食蟹猴PD-1ELISA结合EC50值为0.08nM(图6C)。
PD-1结合FACS
将高表达人PD-1的CHO细胞以1000rpm的转速离心5分钟，收集沉淀并用预冷的流式缓冲液重悬，细胞计数，细胞密度调整为5*10^6/ml，每个反应分装100ul。每个反应加入50ul 3*梯度稀释的待测抗PD-1抗体(0,0.01,0.1,1,10ug/ml)，混匀候4℃避光孵育60分钟。加入1ml流式缓冲液(3％BSA in PBS)，洗2次。加入100ul二抗(20ul/test PE MouseAnti-Human IgG in staining buffer.BD,Cat#555787)。将细胞重悬，4℃避光孵育60分钟。用流式缓冲液洗两次细胞，并用2％的多聚甲醛重悬细胞进行固定，进行流式检测(BD,FACScalibur)。如图7所示,SSI-361at 1μg/mL(～6.7nM)饱和了CHO细胞PD-1结合.
阻断PD-1和PD-L1/2结合
将高表达PD-1的CHO细胞以1000rpm的转速离心5分钟，收集沉淀并用预冷的流式缓冲液重悬，细胞计数，细胞密度调整为5*10^6/ml，每个反应分装100ul。每个反应加入50ul 4x梯度稀释的待测抗PD-1抗体at1ug/ml，以及50ul4x PD-L1(Human PD-L1(His Tag)(Sino Biological Inc.Cat#10084-H08H-100)，终浓度为2ug/ml)或50ul 4x PD-L2(HumanPD-L2(His Tag)(Sino Biological Inc.Cat#10292-H08H-100)，终浓度为1ug/ml)。混匀后4℃避光孵育4h。加入1ml流式缓冲液，洗2次。加入100ul 2ug/ml anti-His Tag Antibody[iFluor 488](GenScript,Cat#A01800-100))。将细胞重悬，4℃避光孵育60分钟。用流式缓冲液洗两次细胞，并用2％的多聚甲醛重悬细胞进行固定，进行流式检测。SSI-361有效阻断了PD-1和PD-L1/2结合(图8)。
T细胞功能
密度梯度法分离近期免疫过破伤风疫苗的人PBMC，重悬于10％胎牛血清的RPMI-1640培养基。调整细胞密度1*10^6/ml，200ul/孔铺于96孔板内。加入稀释的待测抗体(终浓度为3ug/ml)孵育30min。加入1ug/ml破伤风抗原(Astarte Biologics,cat#1002)，37℃，5％CO2培养箱中培养7天。7天后收集上清，ELISA(eBioscience,88-7316-88)检测IFNγ的浓度。SSI-361增强了破伤风抗原诱导IFNγ产生(图9A)。
本发明也用混合人淋巴细胞反应(MLR)测量SSI-361活性。密度梯度法分离人PBMC新鲜人PBMC，重悬于无血清RPMI-1640培养基中，调整细胞密度为2*10^6/ml，每孔2ml接种于6孔板，37℃，5％CO2培养箱中放置1.5小时，将悬浮细胞吸走，向贴壁细胞中加入2ml含有50ng/ml GM-CSF(粒细胞集落剌激生长因子)和35ng/ml IL-4(Peprotech,AF-HDC)的RPMI1640培养基，培养7天。每2天换一次含细胞因子的新鲜培液。第7天加1ug/ml LPS刺激，继续培养1天得到成熟树突细胞。再用10ug/ml丝裂霉素(Sigma,M0503-2MG)处理1.5h后，彻底清洗去掉残余丝裂霉素。
用EasySepTMHuman T Cell Isolation Kit(Stemcell,Cat#17951)分离人T细胞.PBMC用EasySepTM缓冲液稀释成5*10^7/ml，加入Isolation Cocktail抗体50ul/ml细胞，混匀后室温静置5分钟。再加入RapidSpheres磁珠50ul/ml，混匀后室温静置5分钟。加入EasySepTM缓冲液至5ml体积，将管子置于EASYSEPTMMAGNETS磁铁中，静置5分钟。倒出缓冲液至新的离心管，里面含有所需T细胞，非T细胞将留在管壁内。
将上述树突细胞及同种异体的T细胞分别离心重悬成浓度为1*10^6/ml和1*10^5/ml，于96孔板中每孔各加入100ul，抗体用培液按一定倍数稀释成终浓度为3ug/ml,加入96孔板细胞中,37℃，5％CO2培养箱中培养5天，收上清用ELISA(eBioscience,88-7316-88or88-7025-88)检测IFNγ的水平。SSI-361增强了MLR诱导IFNγ产生(图9B).
在食蟹猴药物动力学(PK)
将待检测抗PD-1抗体SSI-361用PBS稀释按5mg/kg剂量尾静脉注射4只雄性食蟹猴，体重大约3kg。于0,5,30min,1,2,4,8hr,1,3,5,8,11,15,22,29and 36天(16个时间点)经外周静脉穿刺的取血。分离血清后冻存于-80℃。ELISA检测血清中抗体浓度。用PBS缓冲液将重组人PD-1蛋白(Sino Biological Inc.Cat#10377-H08H-100)稀释至2ug/ml，100ul/孔体积加至高吸附的ELISA板内(Costar,Cat#3590,high binding)，4℃放置过夜。将96孔板中PBS缓冲液拍掉，加入200ul/孔封闭液，室温孵育1h进行封闭。拍去封闭液，用PBST缓冲液洗板3次后，加入100ul/孔用封闭液稀释的待测血清or SSI-361standards，置室温孵育1h。用PBST缓冲液洗板3次后，加入100ul/孔用封闭液1:4000稀释的anti-Hu IgG-HRP(goat-anti-human Ig kappa-HRP,Millipore,Cat#AP502P)，置室温孵育1h。用PBST缓冲液洗板4次后，加入100ul底物TMB，室温孵育约15min，加入50ul/孔1M H2S04终止反应。用FlexStation 3酶标仪在450nm处读取吸收值。根据标准曲线，计算试样中的SSI-661浓度，并示于图10。PK参数如表2所示。
表2.SSI-361在食蟹猴中单次静脉注射药物动力学.药物动力学参数。
Figure BDA0001734960710000231
实施例4：Syngenic小鼠模型中抗PD-1抗体抗肿瘤的体内功效
IFNγ本研究的目的是在人PD-1敲入(hPD-1KI)小鼠中验证SSI-361(PD-1Ab01)与市售抗体Opdivo(nivolumab)PD-1Ab02在治疗由MC38-huPD-L1细胞(用人PD-L1转染的结肠腺癌细胞)诱导的肿瘤中的体内功效。下表3提供了示例性的实验设计：
表3实验设计
Figure BDA0001734960710000232
Figure BDA0001734960710000241
剂量的体积为10μl/g。
IFNγ本研究使用了24只雄性hPD-1KI小鼠(背景菌株：C57BL/6)，7.7周龄(从给药开始)。将小鼠关在20-24℃和30-70％湿度的独立通气笼(IVC)系统中，每个笼中有2只动物。整个研究期间，动物可以自由获得辐照灭菌的干燥颗粒食物以及US和臭氧灭菌的饮用水。
IFNγ在RPMI-1640培养基(无酚红)中，将MC38-huPD-L1细胞以悬浮培养物的形式体外培养，浓度为1×107个细胞/ml。利用0.1ml RPMI-1640培养基中的1×106个细胞，在每只小鼠的右侧皮下接种，用于发展肿瘤。每周两次检查接种动物的肿瘤体积。在接种后的第9天，将动物随机分成3个不同的治疗组。这些动物的平均肿瘤体积达到68.3mm3。每组8只动物，每两只关在一个笼子里。根据表3所示的实验设计向荷瘤小鼠施用抗PD-1抗体。在将小鼠随机分成三个研究组后开始施用抗PD-1抗体，其表示为第0天。处理在第17天结束。
IFNγ检查肿瘤生长和治疗对动物正常行为的影响，如活动性，目测的食物和水消耗，体重增加/减少(体重每周两次或每隔一天测量)，眼/毛发垫和任何其他异常影响。基于每个子集内的动物数量记录死亡情况和观察到的临床症状。在第4次给药后24小时，通过尾部压区收集10ul血液至预先标记的装有40ul PBS的管内，混合并在-80℃下储存。
IFNγ使用卡尺在两个维度上每周两次测量肿瘤体积，并使用以下公式以mm3表示体积：TV＝0.5a×b2，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。按照以下公式，进一步利用TV进行肿瘤生长抑制(TGI)分析：％TGI＝(1-(Ti-T0)/(Ci-C0))×100％，其中Ti和Ci是指第I天治疗组和对照组的平均肿瘤体积(MTV)，和
T0和C0是指第0天治疗组和对照组的MTV。TV还用于T-C分析，遵循以下公式：T-C＝Tn-Cn，其中Tn是指治疗组中肿瘤体积达到n(例如，1000mm3)的时间(治疗后的天数)(天)；Cn是指对照组中肿瘤体积达到n(例如：1000mm3)的时间(治疗后的天数)(天)。
IFNγ根据实验设计，该研究在第6次给药后两周终止。当观察到以下迹象时，将动物单独或全部安乐死：(a)当动物濒临死亡，严重窘迫或无法获得足够的食物或水时；(b)当体重持续下降且体重减轻>20％时；或(c)
个体小鼠的肿瘤体积达到3000mm3或整组的MTV达到1500mm3时。
IFNγ在各个时间点计算每组的肿瘤体积和体重的平均值和平均值的标准差(SEM)。使用Graph Pad Prism软件进行统计学分析。通过Student’s t检验确定肿瘤生长的显著差异。P值<0.05被认为是显著的。
IFNγ图11提供了治疗过程中的体重变化。在PD-1Ab01和PD-1Ab02治疗后未观察到对体重的显著影响。下表4和表5分别显示了不同时间点不同组的肿瘤体积和肿瘤的生长抑制(数据代表“平均值±SEM”)：
表4肿瘤体积
Figure BDA0001734960710000251
表5肿瘤的生长抑制
Figure BDA0001734960710000252
此外，如图12所示，在该研究中，两种抗PD-1抗体均显示出显著的肿瘤抑制活性。
总之，该研究利用hPD-1KI小鼠中的同源MC38-huPD-L1肿瘤细胞异种移植证实了两种示例性抗PD-1抗体的治疗功效。在治疗过程中，治疗小鼠中未观察到显著的体重变化。
PBS处理组(BIW，6次剂量)的平均肿瘤体积达到1008.8mm3，而两种抗PD-1抗体均显著降低肿瘤体积。Ab01和Ab02的TGI(％)值分别为104.24％和87.76％。与载体对照组相比，两种抗体的肿瘤抑制水平均具有统计学显著性(P<0.05)。
实施例5：抗PD-1抗体治疗同源小鼠模型中MC38和B16F1癌细胞诱导的肿瘤的疗效
IFNγ该研究旨在利用MC38(PD-L1阳性)和B16F1(PD-L1阴性)同源小鼠模型评估人源化抗PD-1抗体的体内治疗效果。图13提供了示例性的实验设计。
IFNγ在该研究中使用具有人PD-1敲入的转基因小鼠(hPD-1KI)，并使用C57BL/6小鼠作为对照。hPD-1KI小鼠显示出对肿瘤异种移植模型中的抗人PD-1抗体治疗有反应。图14将hPD-1KI小鼠和C57BL/6小鼠关在20-24℃和30-70％湿度的独立通气笼中，每笼1-3只动物。整个研究期间，动物可以自由获得辐照灭菌的干燥颗粒食物以及US和臭氧灭菌的饮用水。
IFNγ在10％FBS存在下，在RPMI 1640中培养MC38细胞(结肠腺癌细胞)和B16F1细胞(皮肤黑素瘤细胞)。将MC38细胞以悬浮培养物的形式体外培养，浓度为5×106个细胞/ml。
随后，用0.1ml RPMI-1640培养基中的5×105个细胞，对来自实施例4的PD-1小鼠(其通过上述PD-1抗体治疗而治愈)以及对照幼鼠的右侧皮下接种，用于发展肿瘤。每周两次检查接种动物的肿瘤体积。当C57BL/6小鼠中MC38细胞诱导的肿瘤平均体积达到110.4mm3时，将B16F1细胞(0.1ml RPMI-1640培养基中2×105个细胞)皮下接种到同一动物的左侧，用于发展肿瘤。检查肿瘤生长和治疗对动物正常行为的影响，如活动性，目测的食物和水消耗，体重增加/减少(体重每周两次或每隔一天测量)，眼/毛发垫和任何其他异常影响。基于每个子集内的动物数量记录死亡情况和观察到的临床症状。
IFNγ使用卡尺在两个维度上每周两次测量肿瘤体积，并使用以下公式以mm3表示体积：TV＝0.5a×b2，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。
IFNγ根据实验设计，在MC38细胞接种后9天将B16F1细胞接种到左侧。每周两次检查所有动物的肿瘤体积，持续24天。随后，当观察到以下迹象时，将动物单独或全部安乐死：(a)当动物濒临死亡，严重窘迫或无法获得足够的食物或水时；(b)当体重持续下降且体重减轻>20％时；或(c)
整组的MTV达到1500mm3时。
如图15所示，三个研究组中均没有观察到对体重的显著影响。抗PD-1抗体处理小鼠的肿瘤体积显著低于对照C57BL/6小鼠，如下表6所示(肿瘤体积值是指平均值±SEM)：
此外，该研究获得的结果显示，在预先经PD-1Ab01和PD-1Ab02处理的小鼠中没有可检测的生长；相反，MC38细胞诱导的肿瘤在C57BL/6小鼠中显示出正常的生长曲线。图16显示了B16F1的生长在三个研究组中没有明显差异。
总体而言，该研究证明抗PD-1抗体成功诱导了记忆性抗肿瘤免疫，其抑制了hPD-1KI小鼠中特定肿瘤的生长。用抗PD-1抗体处理的小鼠在实验过程中也没有显示出显著的体重变化。
表6肿瘤体积
Figure BDA0001734960710000271
其他实施
所有在本说明书中公开的所有特征可以任何组合进行组合。在本说明书中公开的每个特征可被用于相同，等效或类似目的的替代特征所代替。因此，除非明确声明，否则公开的每个特征仅是一系列的等效或类似特征的一个例子。
从上面的描述，本领域的技术人员可以容易地确定本发明的基本特征，在不脱离其精神和范围的前提下，可以进行各种改变，并且本发明的修改，以使其适应各种用途和条件。因此，其它实施方案也在权利要求书内。
序列表
<110> 礼进生物医药科技（上海）有限公司
<120> 抗PD-1抗体及其治疗用途
<130> P2018-0940
<150> CN 2015107995388
<151> 2015-11-18
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Gly Gln Asn Val Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Pro Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Phe Asn Ala Asn Ser Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Trp Thr Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105
<210> 2
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro
85 90 95
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 4
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Thr Cys Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Thr Ile Cys Trp Glu Asp Ser Lys Gly Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Ala
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly Tyr Phe Trp Phe Pro Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Ser Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Arg Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Arg Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Phe Tyr Ser Thr Ser
50 55 60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile
100
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10 15
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gly Gln Asn Val Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Phe Asn Ala Asn Ser Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Trp Thr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 黑鼠(Rattus rattus)
<400> 8
Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Gly Gln Asn Val Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Pro Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Phe Asn Ala Asn Ser Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Trp Thr Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105
<210> 9
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Thr Cys Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Thr Ile Cys Trp Glu Asp Ser Lys Gly Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Ala
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly Tyr Phe Trp Phe Pro Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 121
<212> PRT
<213> 黑鼠(Rattus rattus)
<400> 10
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Thr Cys Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Thr Ile Cys Trp Glu Asp Ser Lys Gly Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Ala
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly Tyr Phe Trp Phe Pro Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Ser Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gly Gln Asn Val Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Phe Asn Ala Asn Ser Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Trp Thr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 12
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Thr Cys Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Thr Ile Cys Trp Glu Asp Ser Lys Gly Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Ala
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly Tyr Phe Trp Phe Pro Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Thr
1 5
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Cys Trp Glu Asp Ser
1 5
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Glu Asp Ser Gly Tyr Phe Trp Phe Pro Tyr
1 5 10
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Lys Ala Gly Gln Asn Val Asn Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Asn Ala Asn Ser Leu Gln Thr
1 5
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Gln Gln Tyr Asn Ser Trp Thr Thr
1 5
<210> 19
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Thr Cys Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Thr Ile Cys Trp Glu Asp Ser Lys Gly Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Ala
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly Tyr Phe Trp Phe Pro Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 20
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
caggtgacac tcaaggaaag cggacctgga atcctccaac cttcccagac tctttccctg 60
acctgtagct tctccgggtt ctccttgtcc acctctggca catgcgtgtc atggatcaga 120
cagccatctg ggaagggctt ggagtggctg gcaacaattt gctgggagga ttcaaagggg 180
tacaacccca gtctgaagaa caggctgacc attagcaagg acaccagcaa caatcaggcc 240
ttcctgaaaa ttactagcgt cgatacagct gacagcgcca tctactactg cgcccgccgg 300
gaggacagcg ggtacttttg gtttccctat tggggccagg gcactctcgt ctccgtgagc 360
agtgctagca ctaaggggcc atcagtgttc cccctggccc catgcagccg gagtacaagc 420
gaatccactg ccgcccttgg atgcctcgtg aaggattact tccccgagcc cgtgaccgtg 480
agttggaaca gcggagcctt gacaagcggc gtccacacat tccccgccgt cctccagtct 540
agcgggcttt acagcctcag ctccgtcgtg accgtcccta gttcctccct cggaactaag 600
acatacactt gcaacgtgga tcataagccc tcaaacacaa aggtcgataa gcgggtcgag 660
agcaaatacg gcccaccatg cccaccttgt cccgcccccg agtttttggg gggcccctct 720
gtgttcctct ttcctcctaa gcctaaggac actctcatga ttagccggac acccgaggtc 780
acctgcgtcg tcgtggacgt gagccaggag gaccctgaag tgcagttcaa ttggtatgtg 840
gacggggtcg aggtccacaa cgccaagaca aagccaagag aggagcagtt taacagtacc 900
taccgggtcg tgagtgtgct gacagtgctt caccaggact ggctgaacgg gaaggagtat 960
aagtgcaagg tgtccaacaa gggcctcccc tcaagcatcg agaagactat ctctaaggcc 1020
aaggggcagc ccagagagcc acaggtgtat acattgcccc ctagccagga ggagatgact 1080
aaaaaccagg tgtctctgac ctgtctggtc aaaggcttct acccctccga tatcgctgtg 1140
gagtgggagt ccaacggaca gccagaaaac aactacaaga ccacacctcc cgtcctggat 1200
agcgacggct catttttcct atacagcagg ctgaccgtgg acaaatccag atggcaggag 1260
ggcaacgtgt tctcctgcag cgtgatgcat gaggccctgc acaaccacta cactcagaag 1320
tccctgtccc tgagcctggg caaatag 1347
<210> 21
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Gly Gln Asn Val Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Pro Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Phe Asn Ala Asn Ser Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Trp Thr Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 22
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aatatccaga tgacccagtc cccttccctc ctcagcgctt ccgtgggaga tagggtgaca 60
ctcagttgca aggcaggaca gaacgtgaac aactacctgg cctggtacca gcagaagctg 120
ggcgaacctc caaaggtcct tatcttcaac gccaacagcc tgcagaccgg ggtgccctca 180
cggttttctg ggtctgggag cggcacagac tttactttga ctattagctc cttgcagccc 240
gaggacgtcg ccacatattt ctgtcagcaa tacaacagct ggaccacctt cggggccggc 300
acaaagctgg agctgaaacg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 360
gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 420
agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 480
agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 540
agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 600
agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ag 642
<210> 23
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Thr Cys Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Thr Ile Cys Trp Glu Asp Ser Lys Gly Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Ala
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly Tyr Phe Trp Phe Pro Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 24
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gly Gln Asn Val Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Phe Asn Ala Asn Ser Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Trp Thr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210

Claims (22)

1.一种分离的抗PD-1抗体，其中，所述抗体包含与抗体SSI-361相同的重链可变区(VH)互补决定区(CDR)，和相同的轻链可变区(VL)CDR，且所述的抗体SSI-361具有SEQ ID NO.:11所示的轻链可变区和SEQ ID NO.:12所示的重链可变区。
2.如权利要求1所述的分离的抗PD-1抗体，其中，所述抗体包含：
(i)重链可变区(VH)，所述重链可变区包含如GFSLSTSGT(SEQ ID NO.:13)所示的重链互补决定区(HC CDR)1、如CWEDS(SEQ ID NO.:14)所示的HC CDR2、和如EDSGYFWFPY(SEQ IDNO.:15)所示的HC CDR3；和
(ii)轻链可变区(VL)，所述轻链可变区包含如KAGQNVNNYLA(SEQ ID NO.:16)所示的轻链互补决定区(LC CDR)1、如NANSLQT(SEQ ID NO.:17)所示的LC CDR2、和如QQYNSWTT(SEQID NO.:18)所示的LC CDR3。
3.如权利要求1或2所述的分离的抗PD-1抗体，其中，所述的抗体是全长抗体或其抗原结合片段。
4.如权利要求3所述的分离的抗PD-1抗体，其中，所述的全长抗体是IgG分子。
5.如权利要求3所述的分离的抗PD-1抗体，其中，所述的抗原结合片段是Fab或F(ab’)2或scFv
6.如权利要求1或2所述的分离的抗PD-1抗体，其中，所述的抗体是嵌合抗体或人源化抗体。
7.如权利要求1或2所述的分离的抗PD-1抗体，其中，所述的VH包含与下述序列至少80％同源性的氨基酸序列：
QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGTCVSWIRQPPGKALEWLATICWEDSKGYNPSLKSRLTISKDTSKNQAVLTMTNMDPVDTATYYCARREDSGYFWFPYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.:12)。
8.如权利要求1或2所述的分离的抗PD-1抗体，其中，所述的VL包含与下述序列至少80％同源性的氨基酸序列：
NIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKAGQNVNNYLAWYQQKPGKAPKVLIFNANSLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSWTTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO.:11)。
9.如权利要求2所述的分离的抗PD-1抗体，其中，所述的VH由氨基酸序列
QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGTCVSWIRQPPGKALEWLATICWEDSKGYNPSLKSRLTISKDTSKNQAVLTMTNMDPVDTATYYCARREDSGYFWFPYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.:12)组成；并且所述的VL由氨基酸序列
NIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKAGQNVNNYLAWYQQKPGKAPKVLIFNANSLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSWTTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO.:11)组成。
10.一种分离的核酸或核酸集合，其共同编码权利要求1、2或9中任一项所述的抗PD-1抗体。
11.如权利要求10所述的分离的核酸或核酸集合，其中，所述的核酸或核酸集合是载体或载体集合。
12.如权利要求11所述的分离的核酸或核酸集合，其中，所述的载体是表达载体或重组病毒。
13.如权利要求10所述的分离的核酸或核酸集合，其是单个核酸，所述的单个核酸包含编码VH的第一核苷酸序列和编码VL的第二核苷酸序列。
14.如权利要求10所述的分离的核酸或核酸集合，其是核酸集合，所述的核酸集合包含第一核酸和第二核酸，所述的第一核酸包含编码VH的第一核苷酸序列，所述的第二核酸包含编码VL的第二核苷酸序列。
15.一种载体或载体集合，其包含权利要求10所述的核酸或核酸集合。
16.如权利要求15所述的载体或载体集合，其是表达载体。
17.一种宿主细胞，其包含权利要求15或16所述的载体或载体集合。
18.一种免疫偶联物，其包含与治疗剂或诊断剂连接的权利要求1、2或9中任一项所述的抗PD-1抗体。
19.一种药物组合物，其包含权利要求1、2或9中任一项所述的抗PD-1抗体，编码所述抗体核酸或核酸集合，或与治疗剂或诊断剂连接的所述抗体的免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。
20.一种权利要求19所述的药物组合物的用途，其中，所述的药物组合物用于制备药物，所述药物用于治疗PD-1信号传导相关疾病。
21.如权利要求20所述的用途，其中，所述的PD-1相关疾病是癌症，感染性疾病，或免疫相关疾病。
22.一种用于制备抗PD-1抗体的方法，其中，所述方法包括：
(i)在允许所述抗体表达的条件下培养权利要求17所述的宿主细胞；和
(ii)收集所述宿主细胞或培养基用于分离所述抗体。
CN201680079355.1A 2015-11-18 2016-11-17 抗pd-1抗体及其治疗用途 Active CN108601829B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510799538.8A CN106699889A (zh) 2015-11-18 2015-11-18 抗pd-1抗体及其治疗用途
CN2015107995388 2015-11-18
PCT/US2016/062407 WO2017087599A1 (en) 2015-11-18 2016-11-17 Anti-pd-1 antibodies and therapeutic uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108601829A CN108601829A (zh) 2018-09-28
CN108601829B true CN108601829B (zh) 2020-04-24

Family

ID=58717802

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510799538.8A Pending CN106699889A (zh) 2015-11-18 2015-11-18 抗pd-1抗体及其治疗用途
CN201680079355.1A Active CN108601829B (zh) 2015-11-18 2016-11-17 抗pd-1抗体及其治疗用途

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510799538.8A Pending CN106699889A (zh) 2015-11-18 2015-11-18 抗pd-1抗体及其治疗用途

Country Status (6)

Country Link
US (1) US10913797B2 (zh)
EP (1) EP3377102B1 (zh)
CN (2) CN106699889A (zh)
AU (1) AU2016356686B2 (zh)
CA (1) CA3005749A1 (zh)
WO (1) WO2017087599A1 (zh)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG10201913303XA (en) 2015-07-13 2020-03-30 Cytomx Therapeutics Inc Anti-pd-1 antibodies, activatable anti-pd-1 antibodies, and methods of use thereof
JP6883579B2 (ja) 2015-08-11 2021-06-09 ウーシー バイオロジクス（ケイマン）インコーポレイテッド 新規抗ｐｄ−１抗体
CN114605548A (zh) 2015-09-01 2022-06-10 艾吉纳斯公司 抗-pd-1抗体及其使用方法
SG11201803520PA (en) 2015-11-03 2018-05-30 Janssen Biotech Inc Antibodies specifically binding pd-1 and their uses
EP3471753A1 (en) 2016-06-20 2019-04-24 Kymab Limited Anti-pd-l1 and il-2 cytokines
MA50948A (fr) 2016-12-07 2020-10-14 Agenus Inc Anticorps et procédés d'utilisation de ceux-ci
MX2019012076A (es) 2017-05-30 2019-12-09 Bristol Myers Squibb Co Composiciones que comprenden un anticuerpo anti gen-3 de activacion del linfocito (lag-3) o un anticuerpo anti-lag-3 y un anticuerpo anti muerte celular programada 1 (pd-1) o anti ligando 1 de muerte celular programada (pd-l1).
MX2019012032A (es) 2017-05-30 2019-10-30 Bristol Myers Squibb Co Tratamiento de tumores positivos a gen 3 de activacion de linfocitos (lag-3).
WO2019109238A1 (en) 2017-12-05 2019-06-13 Lyvgen Biopharma Co., Ltd. Anti-cd137 antibodies and uses thereof
US11976123B2 (en) 2018-04-20 2024-05-07 Lyvgen Biopharma Holdings Limited Anti-CD40 antibodies and uses thereof
WO2020069382A1 (en) * 2018-09-28 2020-04-02 Lyvgen Biopharma Co., Ltd. Anti-cd137 binding molecules having engineered fc domains and therapeutic uses thereof
CN112996818B (zh) 2018-09-28 2022-06-21 礼进生物医药科技（上海）有限公司 具有经过工程化的Fc结构域的抗CD40结合分子及其治疗用途
CN111100846A (zh) * 2018-10-26 2020-05-05 上海元宋生物技术有限公司 表达pd-1结合蛋白的溶瘤病毒及其应用
EP3883969A4 (en) * 2018-11-19 2022-11-16 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. ANTI-PD-1 ANTIBODIES AND THEIR USES
CN111349162A (zh) * 2018-12-21 2020-06-30 神州细胞工程有限公司 人源化抗pd-1抗体及其用途
CN111423510B (zh) * 2019-01-10 2024-02-06 迈威(上海)生物科技股份有限公司 重组抗人pd-1抗体及其应用
CN114026120B (zh) 2019-05-10 2024-03-19 礼进生物医药科技（上海）有限公司 人源化抗cd137抗体及其用途
KR20220030956A (ko) 2019-07-05 2022-03-11 오노 야꾸힝 고교 가부시키가이샤 Pd-1/cd3 이중 특이성 단백질에 의한 혈액암 치료
TW202120550A (zh) 2019-08-08 2021-06-01 日商小野藥品工業股份有限公司 雙特異性蛋白質
WO2021055994A1 (en) 2019-09-22 2021-03-25 Bristol-Myers Squibb Company Quantitative spatial profiling for lag-3 antagonist therapy
AU2020380384A1 (en) 2019-11-08 2022-05-26 Bristol-Myers Squibb Company LAG-3 antagonist therapy for melanoma
US20230063151A1 (en) * 2020-01-29 2023-03-02 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Cd40-l blockade to enhance synthetic antibody therapy
TW202204418A (zh) * 2020-07-16 2022-02-01 大陸商和鉑醫藥（上海）有限責任公司 Ｐｄ－１抗原結合蛋白及其應用
MX2023001160A (es) * 2020-07-31 2023-02-22 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co Ltd Composicion farmaceutica del anticuerpo anti-pd-1 y uso del mismo.
AU2021331476A1 (en) 2020-08-28 2023-05-04 Bristol-Myers Squibb Company Lag-3 antagonist therapy for hepatocellular carcinoma
MX2023004493A (es) 2020-10-23 2023-05-10 Bristol Myers Squibb Co Terapia de agonista del gen-3 de activacion del linfocito (lag-3) para cancer de pulmon.
WO2022103780A1 (en) * 2020-11-10 2022-05-19 Lyvgen Biopharma Holdings Limited Bi-specific antibodies comprising anti-cd137 binding molecules
US20240181052A1 (en) 2021-03-29 2024-06-06 Juno Therapeutics, Inc. Methods for dosing and treatment with a combination of a checkpoint inhibitor therapy and a car t cell therapy
CN117412767A (zh) 2021-05-25 2024-01-16 雪绒花免疫公司 C-x-c基序趋化因子受体6（cxcr6）结合分子及其使用方法
GB202107994D0 (en) 2021-06-04 2021-07-21 Kymab Ltd Treatment of cancer
MX2024005053A (es) 2021-10-29 2024-05-10 Bristol Myers Squibb Co Terapia con antagonista del gen de activacion de linfocitos 3 (lag-3) para cancer hematologico.
MX2024008831A (es) 2022-01-26 2024-07-25 Bristol Myers Squibb Company Terapia combinada para carcinoma hepatocelular.
AU2023226078A1 (en) 2022-02-25 2024-08-22 Bristol-Myers Squibb Company Combination therapy for colorectal carcinoma.
WO2023235847A1 (en) 2022-06-02 2023-12-07 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
WO2024137776A1 (en) 2022-12-21 2024-06-27 Bristol-Myers Squibb Company Combination therapy for lung cancer
US20240294651A1 (en) 2023-01-30 2024-09-05 Kymab Limited Antibodies

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101213297A (zh) * 2005-05-09 2008-07-02 小野药品工业株式会社 程序性死亡-1(pd-1)的人单克隆抗体及单独使用或与其它免疫治疗剂联合使用抗pd-1抗体来治疗癌症的方法
WO2010036959A2 (en) * 2008-09-26 2010-04-01 Dana-Farber Cancer Institute Human anti-pd-1, pd-l1, and pd-l2 antibodies and uses therefor
WO2012145493A1 (en) * 2011-04-20 2012-10-26 Amplimmune, Inc. Antibodies and other molecules that bind b7-h1 and pd-1
WO2013169693A1 (en) * 2012-05-09 2013-11-14 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating cancer using an il-21 polypeptide and an anti-pd-1 antibody
WO2014206107A1 (zh) * 2013-06-26 2014-12-31 上海君实生物医药科技有限公司 抗pd-1抗体及其应用
WO2015075725A1 (en) * 2013-11-25 2015-05-28 Ccam Biotherapeutics Ltd. Compositions comprising anti-ceacam1 and anti-pd antibodies for cancer therapy
WO2015112800A1 (en) * 2014-01-23 2015-07-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Human antibodies to pd-1

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4777127A (en) 1985-09-30 1988-10-11 Labsystems Oy Human retrovirus-related products and methods of diagnosing and treating conditions associated with said retrovirus
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
GB8702816D0 (en) 1987-02-07 1987-03-11 Al Sumidaie A M K Obtaining retrovirus-containing fraction
US5219740A (en) 1987-02-13 1993-06-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Retroviral gene transfer into diploid fibroblasts for gene therapy
US5422120A (en) 1988-05-30 1995-06-06 Depotech Corporation Heterovesicular liposomes
AP129A (en) 1988-06-03 1991-04-17 Smithkline Biologicals S A Expression of retrovirus gag protein eukaryotic cells
WO1990007936A1 (en) 1989-01-23 1990-07-26 Chiron Corporation Recombinant therapies for infection and hyperproliferative disorders
US5354844A (en) 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
DE69034078T2 (de) 1989-03-21 2004-04-01 Vical, Inc., San Diego Expression von exogenen Polynukleotidsequenzen in Wirbeltieren
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
EP1645635A3 (en) 1989-08-18 2010-07-07 Oxford Biomedica (UK) Limited Replication defective recombinant retroviruses expressing a palliative
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
US5527528A (en) 1989-10-20 1996-06-18 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Solid-tumor treatment method
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
NZ237464A (en) 1990-03-21 1995-02-24 Depotech Corp Liposomes with at least two separate chambers encapsulating two separate biologically active substances
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DE69233013T2 (de) 1991-08-20 2004-03-04 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of National Institute Of Health, Office Of Technology Transfer Adenovirus vermittelter gentransfer in den gastrointestinaltrakt
WO1993010218A1 (en) 1991-11-14 1993-05-27 The United States Government As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Vectors including foreign genes and negative selective markers
GB9125623D0 (en) 1991-12-02 1992-01-29 Dynal As Cell modification
FR2688514A1 (fr) 1992-03-16 1993-09-17 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant.
JPH07507689A (ja) 1992-06-08 1995-08-31 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 特定組織のターゲティング方法及び組成物
EP0644946A4 (en) 1992-06-10 1997-03-12 Us Health VECTOR PARTICLES RESISTANT TO HUMAN SERUM INACTIVATION.
GB2269175A (en) 1992-07-31 1994-02-02 Imperial College Retroviral vectors
WO1994012649A2 (en) 1992-12-03 1994-06-09 Genzyme Corporation Gene therapy for cystic fibrosis
DK0695169T3 (da) 1993-04-22 2003-03-17 Skyepharma Inc Multivesikulære liposomer med indkapslet cyclodextrin og farmakologisk aktive forbindelser samt fremgangsmåder til anvendelse af disse
CA2166118C (en) 1993-06-24 2007-04-17 Frank L. Graham Adenovirus vectors for gene therapy
US6015686A (en) 1993-09-15 2000-01-18 Chiron Viagene, Inc. Eukaryotic layered vector initiation systems
DE69435224D1 (de) 1993-09-15 2009-09-10 Novartis Vaccines & Diagnostic Rekombinante Alphavirus-Vektoren
PT797676E (pt) 1993-10-25 2006-05-31 Canji Inc Vector adenoviral recombinante e metodos de utilizacao
RU2160093C2 (ru) 1993-11-16 2000-12-10 Скайефарма Инк. Везикулы с регулируемым высвобождением активных ингредиентов
CA2158977A1 (en) 1994-05-09 1995-11-10 James G. Respess Retroviral vectors having a reduced recombination rate
AU4594996A (en) 1994-11-30 1996-06-19 Chiron Viagene, Inc. Recombinant alphavirus vectors
WO1997042338A1 (en) 1996-05-06 1997-11-13 Chiron Corporation Crossless retroviral vectors
US7393531B2 (en) * 2003-01-21 2008-07-01 Arius Research Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of MCSP
EP2170959B1 (en) * 2007-06-18 2013-10-02 Merck Sharp & Dohme B.V. Antibodies to human programmed death receptor pd-1
US9498532B2 (en) 2013-03-13 2016-11-22 Novartis Ag Antibody drug conjugates
CN112457403B (zh) * 2013-09-13 2022-11-29 广州百济神州生物制药有限公司 抗pd1抗体及其作为治疗剂与诊断剂的用途

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101213297A (zh) * 2005-05-09 2008-07-02 小野药品工业株式会社 程序性死亡-1(pd-1)的人单克隆抗体及单独使用或与其它免疫治疗剂联合使用抗pd-1抗体来治疗癌症的方法
WO2010036959A2 (en) * 2008-09-26 2010-04-01 Dana-Farber Cancer Institute Human anti-pd-1, pd-l1, and pd-l2 antibodies and uses therefor
CN102264762A (zh) * 2008-09-26 2011-11-30 达纳-法伯癌症研究公司 人抗pd-1、pd-l1和pd-l2的抗体及其应用
WO2012145493A1 (en) * 2011-04-20 2012-10-26 Amplimmune, Inc. Antibodies and other molecules that bind b7-h1 and pd-1
WO2013169693A1 (en) * 2012-05-09 2013-11-14 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating cancer using an il-21 polypeptide and an anti-pd-1 antibody
WO2014206107A1 (zh) * 2013-06-26 2014-12-31 上海君实生物医药科技有限公司 抗pd-1抗体及其应用
CN104250302A (zh) * 2013-06-26 2014-12-31 上海君实生物医药科技有限公司 抗pd-1抗体及其应用
WO2015075725A1 (en) * 2013-11-25 2015-05-28 Ccam Biotherapeutics Ltd. Compositions comprising anti-ceacam1 and anti-pd antibodies for cancer therapy
WO2015112800A1 (en) * 2014-01-23 2015-07-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Human antibodies to pd-1

Also Published As

Publication number Publication date
EP3377102C0 (en) 2023-08-09
US20180346569A1 (en) 2018-12-06
WO2017087599A1 (en) 2017-05-26
EP3377102A4 (en) 2019-07-10
AU2016356686B2 (en) 2023-06-15
AU2016356686A1 (en) 2018-06-14
EP3377102A1 (en) 2018-09-26
US10913797B2 (en) 2021-02-09
EP3377102B1 (en) 2023-08-09
CA3005749A1 (en) 2017-05-26
CN108601829A (zh) 2018-09-28
CN106699889A (zh) 2017-05-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108601829B (zh) 抗pd-1抗体及其治疗用途
US20240132609A1 (en) Combination therapies with anti cd40 antibodies
RU2744959C2 (ru) Новые анти-pd-l1 антитела
KR102291971B1 (ko) 종양 성장 및 전이를 억제하기 위한 면역 조절 요법과 병용되는 세마포린-4d 억제성 분자의 용도
CN110511278B (zh) 抗b7-h6抗体、融合蛋白及其使用方法
CN113286634A (zh) 对gucy2c特异性的抗体及其用途
CN107614522A (zh) 多特异性免疫调节性抗原结合构建体
KR20170080607A (ko) Cd73에 특이적인 결합 분자 및 이의 용도
JP7203904B2 (ja) 抗ｃｃｒ４抗体を用いてサイトカイン発現を媒介する方法
US20190218260A1 (en) Compositions and methods for enhancing immunogenic cross-presentation of tumor antigens
US20180094058A1 (en) Compositions and methods for preventing tumor growth and treating cancer by targeting lectin galactoside-binding soluble 3 binding protein
JP2020536495A (ja) 抗ｌａｇ−３抗体及びその使用
CA3207791A1 (en) Anti-cd112r antibody and use thereof
EP4375300A1 (en) Pharmaceutical composition and use
KR20240046533A (ko) 항-ccr8 항체 및 그것의 용도
RU2723940C2 (ru) Биспецифические антигенсвязывающие полипептиды
CN116323657B (zh) 同时靶向PD-L1和TGFβ的双功能分子及其医药用途
CN114616251A (zh) 靶向PD-1和TGFβ的重组蛋白
WO2022121846A1 (zh) Pd-l1抗体及其应用
US20230365714A1 (en) Antibodies capable of binding to ror2 and bispecific antibodies binding to ror2 and cd3
RU2815066C2 (ru) Молекулы, связывающие мезотелин и cd137
WO2024088424A1 (zh) 新型抗ctla4抗体
TWI790193B (zh) 調控免疫反應之方法及抗體
JP2024517985A (ja) 抗－ＣＤ３００ｃモノクローナル抗体及びその癌の予防または治療用バイオマーカー
TW202235444A (zh) 結合人類ＴＧＦβ和ＰＤ－Ｌ１的雙功能分子及其應用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant