JP2018520987A - 多重特異性抗体によるサイトカインの非常に強力な中和およびその利用 - Google Patents

多重特異性抗体によるサイトカインの非常に強力な中和およびその利用 Download PDF

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Abstract

本発明は、サイトカインを強力に中和し、したがって炎症性疾患および自己免疫疾患の予防および処置に有用であり得る多重特異性抗体およびその抗原結合断片を提供する。特に、本発明は、サイトカインにおける少なくとも２つの異なる重複しない部位に対して特異的に結合する少なくとも２つの異なるドメインを含んでいる多重特異性抗体またはその抗原結合断片を提供する。また、本発明は、そのような抗体および抗体断片をコードしている核酸、ならびにそのような抗体および抗体断片を産生する不死化Ｂ細胞および培養プラズマ細胞に関する。さらに、本発明は、炎症性疾患および／または自己免疫疾患のスクリーニング法ならびに診断、予防および処置における、本発明の抗体および抗体断片の使用に関する。

Description

発明の詳細な説明
本発明は、サイトカイン（特にＧＭ−ＣＳＦ）を強力に中和する多重特異性の抗サイトカイン（好ましくは抗ＧＭ−ＣＳＦ）抗体およびその抗原結合断片に関する。本発明のサイトカイン（特にＧＭ−ＣＳＦ）を強力に中和する多重特異性の抗サイトカイン（好ましくは抗ＧＭ−ＣＳＦ）抗体は、単一のサイトカイン分子上にある少なくとも２つの異なる重複しない部位に対して特異的に結合する、少なくとも２つのドメインを含んでいる。本発明はまた、そのような抗体および抗体断片をコードする核酸、ならびにそのような抗体および抗体断片を産生する不死化Ｂ細胞および培養プラズマ細胞に関する。さらに、本発明は、スクリーニング法ならびに疾患（特に炎症性疾患および自己免疫疾患）の診断、予防および処置における本発明の上記抗体および抗体断片の利用に関する。
サイトカインは、種々の細胞によって分泌される免疫調節性分子のファミリーであり、他の細胞に対して局所的または全身的に作用する。ほとんどのサイトカインは、種々の種類の、炎症性過程および宿主防御の機序の制御に関与する免疫調節活性を有している。サイトカインとしては、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンフォカイン、腫瘍壊死因子、モノカインおよびコロニー刺激因子が挙げられる。サイトカインは、広範な細胞（免疫細胞（マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球およびマスト細胞のような）ならびに内皮細胞、繊維芽細胞、および種々の間質細胞が挙げられる）によって産生され；特定のサイトカインは、１種類以上の細胞によって産生され得る。
サイトカイン 顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、変化し得るグリコシル化の程度にしたがって１４ｋＤａ〜３５ｋＤａの分子量を有している、１２７アミノ酸の単量体タンパク質である。非グリコシル化ＧＭ−ＣＳＦおよびグリコシル化ＧＭ−ＣＳＦは、インビトロにおいて類似の活性を示す（Cebon, J., Nicola, N., Ward, M., Gardner, I., Dempsey, P., Layton, J., Duhrsen, U., Burgess, A.W., Nice, E., and Morstyn, G. (1990). Granulocyte-macrophage colony stimulating factor from human lymphocytes. The effect of glycosylation on receptor binding and biological activity. J. Biol. Chem. 265, 4483-4491）。ＧＭ−ＣＳＦは、骨髄性細胞および内皮細胞の細胞表面上に発現されている（が、リンパ球上には存在しない）その受容体に対する結合によってその生理活性を発揮する（Hansen, G., Hercus, T.R., McClure, B.J., Stomski, F.C., Dottore, M., Powell, J., Ramshaw, H., Woodcock, J.M., Xu, Y., Guthridge, M., et al. (2008). The structure of the GM-CSF receptor complex reveals a distinct mode of cytokine receptor activation. Cell 134, 496-507）。上記受容体は、異種二量体であり、アルファサブユニットおよびベータサブユニットによって構成されている。ベータサブユニットはまた、インターロイキン−３受容体複合体およびインターロイキン−５受容体複合体の一部であり、ＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファサブユニットおよびＧＭ−ＣＳＦと会合して、多量体複合体（ＧＭ−ＣＳＦが、ピコモルの結合アフィニティを有して結合される）の形成に導く。
ＧＭ−ＣＳＦは、種々の細胞種（Ｔリンパ球、マクロファージ、ＮＫ細胞、マスト細胞、内皮細胞、繊維芽細胞および一部の悪性細胞が挙げられる）によって発現され得る（Gasson, J.C. (1991). Molecular physiology of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Blood 77, 1131-1145; Hamilton, J.A., and Anderson, G.P. (2004). GM-CSF Biology. Growth Factors 22, 225-231；Sergeeva, A., Ono, Y., Rios, R., and Molldrem, J.J. (2008). High titer autoantibodies to GM-CSF in patients with AML, CML and MDS are associated with active disease. Leukemia 22, 783-790）。ＧＭ−ＣＳＦは、造血前駆細胞に成長因子として作用して、顆粒球および単球を生じさせる。ＧＭ−ＣＳＦはまた、ミクログリアの発達および肺胞マクロファージの機能に必須である。さらに、ＧＭ−ＣＳＦはまた、ＧＭ−ＣＳＦ受容体を発現している、免疫系の細胞に対する炎症誘発作用を有している。これらの機能のうち最も重要なのは、種々の炎症性疾患および自己免疫疾患における単球、マクロファージおよび顆粒球の活性化（他のサイトカインおよびケモカインの産生、マトリクス分解プロテアーゼ、向上したＨＬＡ発現、ならびに接着分子またはＣＣケモカイン 受容体の向上した発現を結果として生じる）である（Hamilton, J.A. (2002). GM-CSF in inflammation and autoimmunity. Trends Immunol 23, 403-408）。ＧＭ−ＣＳＦはまた、他の炎症性因子（他のサイトカインまたはＬＰＳのような）と共同作用する（Parajuli, B., Sonobe, Y., Kawanokuchi, J., Doi, Y., Noda, M., Takeuchi, H., Mizuno, T., and Suzumura, A. (2012). GM-CSF increases LPS-induced production of proinflammatory mediators via upregulation of TLR4 and CD14 in murine microglia. J Neuroinflammation 9, 268）。これらのことから、ＧＭ−ＣＳＦは、このように免疫／炎症性カスケードの一部である。
しがたって、ＧＭ−ＣＳＦは、抗炎症性療法および抗自己免疫療法にとっての標的とみなされ得る。慢性および急性の炎症性疾患および／または自己免疫疾患（例えば、リウマチ様関節炎（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、クローン氏病、乾癬、喘息、アトピー性皮膚炎またはショック）は、ＧＭ−ＣＳＦの中和および続く炎症誘発性カスケードに基づいて、利益を受け得る。例えば、ＭＳにおいて、上昇したレベルのＧＭ−ＣＳＦは、ＭＳの活動段階と相関しており（McQualter, J.L., Darwiche, R., Ewing, C., Onuki, M., Kay, T.W., Hamilton, J.A., Reid, H.H., and Bernard, C.C. (2001). Granulocyte macrophage colony-stimulating factor: a new putative therapeutic target in multiple sclerosis. J Exp Med 194, 873-882；Noster, R., Riedel, R., Mashreghi, M.-F., Radbruch, H., Harms, L., Haftmann, C., Chang, H.-D., Radbruch, A., and Zielinski, C.E. (2014). IL-17 and GM-CSF expression are antagonistically regulated by human T helper cells. Sci Transl Med 6, 241ra80-241ra80）、ＧＭ−ＣＳＦ欠損マウスは、多発性硬化症のための実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）マウスモデルにおいて、疾患を進行させられない（McQualter, J.L., Darwiche, R., Ewing, C., Onuki, M., Kay, T.W., Hamilton, J.A., Reid, H.H., and Bernard, C.C. (2001). Granulocyte macrophage colony-stimulating factor: a new putative therapeutic target in multiple sclerosis. J Exp Med 194, 873-882）。
喘息において、上昇したレベルのＧＭ−ＣＳＦは、喘息患者の気道に認められる（Broide, D.H., and Firestein, G.S. (1991). Endobronchial allergen challenge in asthma. Demonstration of cellular source of granulocyte macrophage colony-stimulating factor by in situ hybridization. J Clin Invest 88, 1048-1053；Sousa, A.R., Poston, R.N., Lane, S.J., Nakhosteen, J.A., and Lee, T.H. (1993). Detection of GM-CSF in asthmatic bronchial epithelium and decrease by inhaled corticosteroids. Am. Rev. Respir. Dis. 147, 1557-1561）。実際に、ＩＬ−５との共同作用におけるＧＭ−ＣＳＦは、好酸球の分化、活性化および生存を促進する（Yamashita, N., Tashimo, H., Ishida, H., Kaneko, F., Nakano, J., Kato, H., Hirai, K., Horiuchi, T., and Ohta, K. (2002). Attenuation of airway hyperresponsiveness in a murine asthma model by neutralization of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). Cellular Immunology 219, 92-97）。ＧＭ−ＳＣＦ中和抗体の有効性は、喘息のマウスモデル（それらの投与が気道の反応亢進および炎症の有意な低減をもたらす）において証明された（Yamashita, N., Tashimo, H., Ishida, H., Kaneko, F., Nakano, J., Kato, H., Hirai, K., Horiuchi, T., and Ohta, K. (2002). Attenuation of airway hyperresponsiveness in a murine asthma model by neutralization of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). Cellular Immunology 219, 92-97)）。
肺疾患において、ＧＭ−ＣＳＦはまた、ある役割（高い好中球数、プロテアーゼ誘導、およびＴＮＦ−アルファの異常産生が、疾患（例えば、ＬＰＳを含んでいるバイオエアロゾルによって引き起こされる職業性肺疾患）の病因における中心的な因子であると考えられている）を有している。実際に、マウスモデルにおいて、ＬＰＳ依存性の肺の炎症は、ＧＭ−ＣＳＦ中和抗体を用いて軽減された（Bozinovski, S., Jones, J., Beavitt, S.-J., Cook, A.D., Hamilton, J.A., and Anderson, G.P. (2004). Innate immune responses to LPS in mouse lung are suppressed and reversed by neutralization of GM-CSF via repression of TLR-4. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 286, L877-L885）。
ＲＡにおいて、複数のグループが、滑膜関節液における高レベルのＧＭ−ＣＳＦを測定している（Alvaro-Gracia, J.M., Zvaifler, N.J., Brown, C.B., Kaushansky, K., and Firestein, G.S. (1991). Cytokines in chronic inflammatory arthritis. VI. Analysis of the synovial cells involved in granulocyte-macrophage colony-stimulating factor production and gene expression in rheumatoid arthritis and its regulation by IL-1 and tumor necrosis factor-alpha. J Immunol 146, 3365-3371；Haworth, C., Brennan, F.M., Chantry, D., Turner, M., Maini, R.N., and Feldmann, M. (1991). Expression of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in rheumatoid arthritis: regulation by tumor necrosis factor-alpha. Eur J Immunol 21, 2575-2579；Fiehn, C., Wermann, M., Pezzutto, A., Hufner, M., and Heilig, B. (1992). [Plasma GM-CSF concentrations in rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus and spondyloarthropathy]. Z Rheumatol 51, 121-126) and treatment with recombinant GM-CSF after chemotherapy was shown to cause flares of RA (de Vries, E.G., Willemse, P.H., Biesma, B., Stern, A.C., Limburg, P.C., and Vellenga, E. (1991). Flare-up of rheumatoid arthritis during GM-CSF treatment after chemotherapy. The Lancet 338, 517-518）。ＲＡにおけるＧＭ−ＣＳＦ中和抗体の、治療上の潜在性が、コラーゲンによって誘導されたマウスの関節炎モデルにおけるそれらの有効性から示唆された（Cook, A.D., Braine, E.L., Campbell, I.K., Rich, M.J., and Hamilton, J.A. (2001). Blockade of collagen-induced arthritis post-onset by antibody to granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF): requirement for GM-CSF in the effector phase of disease. Arthritis Res. 3, 293-298; Cornish, A.L., Campbell, I.K., McKenzie, B.S., Chatfield, S., and Wicks, I.P. (2009). G-CSF and GM-CSF as therapeutic targets in rheumatoid arthritis. Nat Rev Rheumatol 5, 554-559）。
したがって、ＧＭ−ＣＳＦを中和可能な抗体は、炎症性疾患および／または自己免疫疾患（例えば、ＭＳ、ＲＡ、他の自己免疫疾患および他の炎症性疾患）のための、新たな有効な予防法および／または治療法を代表し得る。原理的に、サイトカイン中和は、可溶性の標的サイトカインまたは細胞表面に提示されているサイトカイン受容体に結合する抗体によって実現され得る。ＭＯＲ１０３およびナミルマブは、ＲＡおよびＭＳにおける治療薬として開発されている、ＧＭ−ＣＳＦを中和するファージ由来の２つのヒトモノクローナル抗体であり（Steidl, S., Ratsch, O., Brocks, B., Durr, M., and Thomassen-Wolf, E. (2008). In vitro affinity maturation of human GM-CSF antibodies by targeted CDR-diversification. Mol Immunol 46, 135-144；Krinner, E.-M., Raum, T., Petsch, S., Bruckmaier, S., Schuster, I., Petersen, L., Cierpka, R., Abebe, D., Molhoj, M., Wolf, A., et al. (2007). A human monoclonal IgG1 potently neutralizing the pro-inflammatory cytokine GM-CSF. Mol Immunol 44, 916-925；Behrens, F., Tak, P.P., Ostergaard, M., Stoilov, R., Wiland, P., Huizinga, T.W., Berenfus, V.Y., Vladeva, S., Rech, J., Rubbert-Roth, A., et al. (2014). MOR103, a human monoclonal antibody to granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, in the treatment of patients with moderate rheumatoid arthritis: results of a phase Ib/IIa randomised, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation trial. Ann Rheum Dis）、マブリリムマブは、ＲＡ患者におけるＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファを標的にする、開発中のヒトモノクローナル抗体である（Burmester, G.R., Feist, E., Sleeman, M.A., Wang, B., White, B., and Magrini, F. (2011). Mavrilimumab, a human monoclonal antibody targeting GM-CSF receptor-α, in subjects with rheumatoid arthritis: a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase I, first-in-human study. Ann Rheum Dis 70, 1542-1549）。
しかし、単一のＧＭ−ＣＳＦ中和抗体は、インビボにおける共通するガンマ鎖サイトカインに対するモノクローナル抗体の向上した活性の根拠であり得る、依然として解離しかつ受容体を刺激し得る、寿命の長いＧＭ−ＣＳＦの巨大なプールの蓄積をインビボにおいてもたらす（Boyman, O., Kovar, M., Rubinstein, M.P., Surh, C.D., and Sprent, J. (2006). Selective stimulation of T cell subsets with antibody-cytokine immune complexes. Science 311, 1924-1927）。
以上の観点から、本発明の目的は、現在、利用可能な抗体より強力かつ効率的にサイトカイン（特にＧＭ−ＣＳＦ）を中和する抗体を提供することである。そのような抗体は、より少ない用量において使用され得、これによって、副作用のリスクを低下させ、かつコストを抑える。さらに、依然として解離しかつ受容体を刺激し得る寿命の長いＧＭ−ＣＳＦ（特にＧＭ−ＣＳＦ）の巨大なプールの蓄積を生じない、サイトカイン（特にＧＭ−ＣＳＦ）を中和する抗体を提供することが、本発明の目的である。まとめると、費用対効果および簡単な手法によって従来技術の欠点を克服する改良された抗体またはその抗原結合断片、ならびに関連する核酸分子、ベクターおよび細胞、および薬学的組成物を提供することが、本発明の目的である。
本発明の基礎をなす目的は、特許請求の範囲に記載の事項によって解決される。
以下に本発明が詳細に説明されているが、本発明は、これらが変更され得ると本明細書に記載されている特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されないと理解されるべきである。また、本明細書に使用されている専門用語は、添付の特許請求の範囲にのみよって限定される本発明の範囲を、限定することを目的としていないと理解されるべきである。特に断りがない限り、本明細書に使用されているすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解される通りの同じ意味を有している。
以下に、本発明の構成要素が説明される。これらの構成要素は、特定の実施形態とともに挙げられているが、それらは、さらなる実施形態を作るために任意の方法および任意の数において組み合わせられ得ると理解されるべきである。種々に説明されている例および好ましい実施形態は、明示的に説明されている複数の実施形態のみに、本発明を限定すると解釈されるべきではない。本明細書は、明示的に説明されている複数の実施形態を、開示されているおよび／または好ましい構成要素と組み合わせている複数の実施形態を、裏付け、かつ包含すると理解されるべきである。さらに、特に断りがない限り、本願に記載のすべての構成要素の、任意の順序の交換および組み合わせが、本願の明細書によって開示されているとみなされるべきである。
これ以降の明細書および特許請求の範囲の全体を通して、特に断りがない限り、用語「含んでいる（comprise）」およびその変化形（例えば、「含んでいる（comprises）」および「含んでいる（comprising）」）は、述べられている部材、整数またはステップの包含を意味し、述べられていない任意の他の部材、整数またはステップの排除を意味しないと理解される。用語「からなる」は、用語「含んでいる」のうち、述べられていない任意の他の部材、整数またはステップが排除されている特定の一実施形態である。本発明に関連して、用語「含んでいる」は、用語「からなる」を包含している。したがって、用語「含んでいる（comprising）」は、「含んでいる（including）」および「からなる（consiting）」を包含している（例えば、Ｘを「含んでいる」組成物は、排他的にＸからなり得る、またはさらになにかを含み得る（例えば、Ｘ＋Ｙ））。
用語「a」および「an」および「the」ならびに本発明を説明する文（特に特許請求の範囲の文）に使用されている類似の言及は、本明細書に特に断りがないか、または文脈に基づいて明らかに矛盾しない限り、単数および複数を網羅すると解釈されるべきである。本明細書における数値範囲の詳述は、範囲内にある別の値のそれぞれに対して個々に言及している省略表現法としての役割を単に目的としている。特に断りがない限り、個々の値のそれぞれは、それらが本明細書に個々に詳述されているかのように、本明細書に組み込まれている。明細書にない事項は、請求されていない任意の構成要素が、本発明の実施に必須であることを示していると、理解されるべきではない。
言葉「実質的に」は、「完全に」を排除しない（例えば、Ｙを「実質的に」含んでいない組成物は、Ｙを完全に含んでいなくていい）。必要な場合に、言葉「実質的に」は、本発明の規定から省略され得る。
数値ｘに関する用語「約」は、ｘ±１０％を意味する。
本明細書に使用されるとき、用語「疾患（disease）」は、用語「障害（disorder）」および「病気（condition）」（「病状（medical condition）」のときのように）と、（それらがすべて、ヒトまたは動物の身体の、正常な機能を損なう異常な状態（またはその一部）を示しているとき）一般的に同義であり、交換可能に使用され、顕著な徴候および症状によって典型的に明らかにされ、ヒトまたは動物にとって短い寿命または低下した生活の質の原因になる。
本明細書に使用されるとき、対象または患者の「処置」に対する言及は、阻止、予防、弱化、寛解および治療を包含していると意図されている。用語「対照」または「患者」は、すべての哺乳類（ヒトが挙げられる）を意味するために、本明細書において交換可能に使用される。対象の例としては、ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジおよびウサギが挙げられる。一実施形態において、患者はヒトである。
本明細書に使用されるとき、用語「抗体」は、本発明に係る特徴的な特性が維持されている限り、抗体の種々の形態（好ましくはモノクローナル抗体（抗体の全体、抗体断片、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、遺伝子工学的に改変された抗体が挙げられるが、これらに限定されない））を包含する。ヒト抗体またはヒト化抗体（特に組換えヒト抗体のような）が、特に好ましい。
本明細書に使用されるとき、用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有している抗体を包含することを意図されている。ヒト抗体は、最新技術においてよく知られている（van Dijk, M. A., and van de Winkel, J. G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374）。ヒト抗体はまた、内因性の抗体産生の非存在において、ヒト抗体の全種またはそれから選ばれたものを、免疫によって、産生可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）において産生され得る。ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子アレイの、そのような生殖細胞系列変異体マウスにおける、転移は、抗原投与によるヒト抗体の産生を生じる（例えば、Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555；Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258；Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 3340を参照）。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリ（Hoogenboom, H. R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388；Marks, J. D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597）において産生され得る。また、Cole et al.およびBoerner et al.の手法が、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)；およびBoerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95）。本明細書に使用されるとき、用語「ヒト抗体」はまた、例えば本発明に係る特性を生成するために可変領域において、修飾されているそのような抗体を包含する。
本明細書に使用されるとき、用語「組換えヒト抗体」は、組換え方法によって調製、発現、生成または単離されているすべてのヒト抗体（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を形質導入されている宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞など）もしくは動物（例えばマウス）から単離された抗体、または宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現されている抗体）を包含すると意図されている。そのような組換えヒト抗体は、再構成された形態において可変領域および定常領域を有している。本発明に係る組換えヒト抗体は、インビボの体細胞性超変異を受けている。したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のＶＨ配列およびＶＬ配列に由来および関連し、かつインビボのヒト抗体生殖細胞系列レパートリの範囲には天然に存在しない配列である。
本明細書に使用されるとき、用語「抗原結合断片」、「断片」および「抗体断片」は、本発明に係る抗体の特異的な結合活性およびＦｃ部分を維持している、本発明の抗体の、任意の断片を指すために、交換可能に使用される。抗体断片の例としては、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはｓｃＦｖが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗体の断片は、酵素（例えばペプシンまたはパパイン）を用いた消化を含んでいる方法、および／または化学的な還元によるジスルフィド結合の開裂によって抗体から入手され得る。代替的に、抗体の断片は、重鎖および／または軽鎖の複数の部分配列のクローニングおよび発現によって入手され得る。「断片」としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’ 断片、Ｆ（ａｂ’）２断片およびＦｖ断片が挙げられる。本発明はまた、本発明の抗体のうち重鎖および軽鎖から得られる単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）を包含する。例えば、本発明は、本発明の抗体からの複数のＣＤＲを含んでいるｓｃＦｖを含んでいる。また、重鎖または軽鎖の単量体および二量体、単一ドメイン重鎖抗体、単一ドメイン軽鎖抗体、ならびに単鎖抗体（例えば、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインがペプチドリンカーによって接続されている単鎖Ｆｖ）が、含まれる。本発明の抗体断片は、１価相互作用または多価相互作用をもたらし得、上述のような種々の構造に含まれている。例えば、ｓｃＦｖ分子は、３価の「トリアボディ」または４価の「テトラボディ」を生成するために合成され得る。ｓｃＦｖ分子は、２価のミニボディを生じるＦｃ領域のドメインを含み得る。さらに、本発明の配列は、本発明の配列が本発明のエピトープを標的化し、分子の他の領域が他の標的に結合する多重特異性分子の構成要素であり得る。例示的な分子としては、２価のＦａｂ２、３価のＦａｂ３、２価のｓｃＦｖおよびダイアボディ（Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology 9: 1126-1136）が挙げられるが、これらに限定されない。特許請求の範囲を含む本明細書は、いくつかの箇所において、抗体の、（複数の）抗原結合断片、（複数の）抗体断片、（複数の）バリアント、および／または（複数の）誘導体に明確に言及しているが、用語「抗体」または「本発明の抗体」は、すべての分類の抗体（すなわち抗体の、（複数の）抗原結合断片、（複数の）抗体断片、（複数の）バリアントおよび（複数の）誘導体）を包含する。さらに、本明細書に使用されるとき、用語「抗体」は、抗体およびその抗原結合断片の両方を包含する。
本明細書に使用されるとき、「中和抗体」は、宿主における感染を惹起および／または持続させる、病原体の能力を中和（すなわち阻止、阻害、低減、妨害または抑制する）し得る抗体である。用語「中和抗体」および「中和する抗体」もしくは「中和する複数の抗体」は、本明細書において交換可能に使用される。これらの抗体は、本明細書に記載のような、積極的なワクチン接種と共同する、適切な製剤化によって予防剤または治療剤として、診断ツールとして、または生成ツールとして単独または組み合わせにおいて使用され得る。
本明細書に使用されるとき、用語「可変領域」（軽鎖の可変領域（ＶＬ）、重鎖の可変領域ＶＨ）は、抗体を抗原に結合させることに直接に関与している軽鎖および重鎖の対のそれぞれを意味する。天然の抗体において、可変性のヒト軽鎖およびヒト重鎖の複数のドメインは、一般的な同じ構造を有しており、各ドメインは、３つの「超可変領域」（すなわち相補性決定領域、ＣＤＲ）によって接続されている、その配列が広く保存されている４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含んでいる。フレームワーク領域は、βシート立体構造をとっており、ＣＤＲはβシート構造を接続しているループを形成し得る。それぞれの鎖におけるＣＤＲは、フレームワーク領域によってそれらの３次元構造に保持されており、他の鎖からのＣＤＲとともに、抗原結合部位を形成している。抗体重鎖および抗体軽鎖のＣＤＲ３領域は、本発明に係る抗体の結合特異性／アフィニティにおいて特に重要な役割を果たしており、本発明のさらなる目的をもたらす。
本明細書に使用されるとき、用語「超可変領域」は、抗体結合を担っている、抗体の複数のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」（すなわち「ＣＤＲ」）からの複数のアミノ酸残基を含んでいる。「フレームワーク」（すなわち「ＦＲ」）領域は、本明細書に規定されているような超可変領域以外の、可変性ドメインのこれらの領域である。したがって、天然の抗体の軽鎖および重鎖は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、複数のドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含んでいる。それぞれの鎖にある複数のＣＤＲは、そのような複数のフレームワークアミノ酸によって分離されている。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原結合に最も寄与する領域である。ＣＤＲ領域およびＦＲ領域は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)の標準的な記述にしたがって決定される。
本明細書に使用されるとき、用語「定常領域」は、抗原に対する抗体の結合には直接に関与しないが、種々のエフェクタ機能を示す、抗体のドメインを指す。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、抗体または免疫グロブリンは、複数のクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭに分けられ、これらのいくつかはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）にさらに分けられる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、ε、γおよびμと呼ばれている。本発明に係る抗体はＩｇＧ型であることが好ましい。
本明細書に使用されるとき、用語「核酸または核酸分子」は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含んでいると意図されている。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得るが、二本鎖ＤＮＡであることが好ましい。
本明細書に使用されるとき、「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」は、交換可能に使用され、そのような指定のすべては、子孫を包含している。したがって、単語「形質転換体」および「形質転換された細胞」は、初代の対象細胞、および継代数に関わらずそれらから得られた培養物を包含する。すべての子孫は、故意または不慮の変異に起因して、ＤＮＡ内容物において厳密には同一でなくてもよいと理解される。最初に形質転換された細胞についてスクリーニングされたときと同じ機能または生理活性を有している種々の子孫が包含される。別の意味が意図されている箇所は、文章から明らかである。
用量はたいてい体重と関連付けて表されている。したがって、［ｇ、ｍｇまたは他の単位］／ｋｇ（またはｇ、ｍｇなど）と表されている用量は、用語「体重」が明示されていなくとも、「ｋｇ（またはｇ、ｍｇなど）体重につき」［ｇ、ｍｇまたは他の単位］を通常は指す。
用語「特異的に結合する」および類似の言及は、非特異的な固着を包含しない。
本明細書に使用されるとき、用語「ワクチン」は、少なくとも１つの抗原（好ましくは１つの免疫源）を提示する予防的または治療的な材料であると、一般的に理解される。抗原または免疫源は、ワクチン接種に好適な任意の材料から由来し得る。例えば、抗原または免疫源は、病原体（例えば細菌またはウイルス粒子など）または腫瘍もしくはがん組織に由来し得る。抗原または免疫源は、適応免疫応答をもたらす（）ために、身体の適応免疫系を刺激する。特に、「抗原」または「免疫源」は、免疫系（好ましくは適応免疫系）によって認識され得る、抗原特異的な免疫応答を惹起可能（例えば適応免疫お応答の一部として抗体および／または抗原特異的なＴ細胞の形成によって）な、物質を一般的に指す。一般的に、抗原は、ＭＨＣによってＴ細胞に提示され得るペプチドまたはタンパク質であり得るか、または当該ペプチドまたはタンパク質を含み得る。
本明細書に使用されるとき、「配列バリアント」は、基準配列における任意の変化を指す（ここで、基準配列は、「配列および配列番号の表」（配列表）に挙げられている配列（すなわち配列番号１〜１９０）のいずれかである）。したがって、用語「配列バリアント」は、ヌクレオチド配列バリアントおよびアミノ酸配列バリアントを包含している。特に、「配列バリアント」において、機能性（基準配列の）は保存されている。（すなわち配列バリアントは機能的である）。本明細書に使用されるとき、「配列バリアント」は、基準配列に対する少なくとも７０％同一、好ましくは基準配列に対する少なくとも８０％同一（より好ましくは基準配列に対する少なくとも９０％同一、それ以上に好ましくは少なくとも９０％同一および特に好ましくは少なくとも９９％同一）な配列を一般的に有している。
配列同一性は、基準配列の全長（すなわち本願に詳述されている配列）に対して、多くの場合に算出される。本明細書に言及されるとき、同一性のパーセンテージは、例えばNCBI（the National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）によって指定されている初期設定のパラメータ［Blosum 62 matrix; gap open penalty=11 and gap extension penalty=1］を用いるBLASTを用いて、決定され得る。
本明細書に使用されるとき、「核酸配列バリアント」は、基準配列における１つ以上のヌクレオチドが欠失または置換されているか、または１つ以上のヌクレオチドが基準ヌクレオチド配列の配列に挿入されている、変更された配列を有している。ヌクレオチドは、標準的な１文字表記（Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）によって本明細書には言及されている。遺伝コードの縮重によって、「ヌクレオチド配列バリアントは、それぞれの基準アミノ酸配列における変更（すなわち「アミノ酸配列バリアント」）を生じ得るか、または生じない。好ましい配列バリアントは、アミノ酸配列バリアントを生じない（サイレント変異）ヌクレオチド配列バリアントであるが、他の非サイレント変異（特に、基準配列に対する少なくとも７０％同一（好ましくは基準配列に対する少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、それ以上に好ましくは少なくとも９５％同一および特に好ましくは９９％同一）な、アミノ酸配列を生じる変異ヌクレオチド配列）も同様に範囲内にある。
本明細書に使用されるとき、用語「変異」または「変異させること」は、例えば核酸配列において（例えば、異なるアミノ酸を生じさせるために、１つのアミノ酸をコードしている、核酸分子のうちコドンを改変させること（例えば部位特異的変異生成）、または配列バリアントを合成すること（例えば、ポリペプチドをコードしている核酸分子のヌクレオチド配列を知ること、および当該ポリペプチドのバリアントをコードしているヌクレオチド配列を含んでいる核酸分子の合成を、核酸分子のヌクレオチドの１つ以上を改変する必要なしに、設計すること）によって）、変異を物理的に生成することを包含すると理解される。
「アミノ酸配列バリアント」は、基準配列における１つ以上のアミノ酸が、欠失もしくは置換されているか、または１つ以上のアミノ酸が基準アミノ酸配列の配列に挿入されている、改変された配列を有している。改変の結果として、アミノ酸配列バリアントは、基準配列に対する少なくとも７０％同一（好ましくは基準配列に対する少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８０％同一、それ以上に好ましくは少なくとも９０％同一、特に好ましくは９９％同一）なアミノ酸配列を有している。少なくとも１０％同一なバリアント配列は、１００アミノ酸の基準配列につき、１０以下改変（すなわち欠失、挿入または置換の任意の組み合わせ）を有している。
ペプチド／タンパク質の文において、「直鎖状配列」または「配列」は、配列における隣接する互いが、ペプチド／タンパク質の一次構造において連続している、アミノ末端からカルボキシル末端への方向における複数のアミノ酸の整列である。
非保存的なアミノ酸置換を有することが可能であるが、置換は、置換されたアミノ酸が基準配列における対応するアミノ酸と類似する構造的特性または化学的特性を有している、保存的なアミノ酸置換であることが好ましい。一例として、保存的なアミノ酸置換は、１種の脂肪族または疎水性のアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン）の、他の種の脂肪族または疎水性のアミノ酸による置換；１種のヒドロキシル含有アミノ酸（例えば、セリンおよびトレオニン）の、他の種のヒドロキシル含有アミノ酸による置換；１種の酸性アミノ酸（例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸）の、他の種の酸性アミノ酸による置換；１種の芳香族残基（例えば、フェニルアラニンおよびチロシン）の、他の種の芳香族残基による置換；１種の塩基性アミノ酸（例えば、リジン、アルギニンおよびヒスチジン）の、他の種の塩基性アミノ酸による置換；および１種の小さいアミノ酸（例えば、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニンおよびグリシン）の、他の種の小さいアミノ酸による置換を包含する。
アミノ酸配列の挿入は、１残基から、１００以上の残基を含んでいるポリペプチドまでの長さに及ぶアミノ末端融合および／またはカルボキシ末端融合、ならびに１つ以上のアミノ酸残基の配列内挿入を包含する。末端挿入の例としては、レポータ分子または酵素に対するアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に対する融合が挙げられる。
重要なことには、配列バリアントは、配列バリアントにおける改変が、それぞれの基準配列の機能性（例えば、サイトカイン（特にＧＭ−ＣＳＦ）の重複しない同じエピトープ／部位に結合する、および／またはサイトカイン（特にＧＭ−ＣＳＦ）を十分に中和する、抗体またはその抗原結合断片の機能性）を喪失させない機能的な配列である。そのような機能性を喪失せずに、置換、挿入または欠失され得るヌクレオチドおよびアミノ酸残基のそれぞれを決定する手引きは、当該分野によく知られているコンピュータプログラムを用いることによって見出される。
本明細書に使用されるとき、指定されている核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質「から得られる」核酸配列またはアミノ酸配列は、ポリペプチドの由来を指す。好ましくは、特定の配列から得られている核酸配列またはアミノ酸配列は、それが得られているその配列またはその部分と実質的に同一なアミノ酸配列であり、これによって、「実質的に同一」は、以上に規定されているような配列バリアントを包含する。好ましくは、特定のペプチドまたはタンパク質から得られている核酸配列またはアミノ酸配列は、当該特定のペプチドまたはタンパク質における対応するドメインから得られている。これによって、「対応する」は、特に同じ機能性を指す。例えば、「（特定の）単一特異性抗体から得られている」、多重特異性抗体におけるＣＤＲ（すなわちＣＤＲＨ１）アミノ酸配列または核酸配列は、この単一特異性抗体の（対応する）ＣＤＲ（すなわちＣＤＲＨ１）アミノ酸配列または核酸配列（当該単一特異性抗体のうち他の（対応しない）部分ではない）から多くの場合に得られている。ペプチド、タンパク質および核酸の「対応する」部分は、このようにして当業者にとって容易に同定可能（例えば、ＣＤＲ１はＣＤＲ１に対応し、ＣＤＲ２はＣＤＲ２に対応するなど）である。同様に、他の配列「から得られている」配列は、当該配列におけるその起源を有していると、多くの場合に、当業者にとって容易に同定可能である。
好ましくは、他の核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質から得られている核酸配列またはアミノ酸配列は、開始の核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質（それが得られている）と同一であり得る。しかし、他の核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質から得られている核酸配列またはアミノ酸配列も、開始の核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質（それが得られている）に対して１つ以上の変異を有している（特に、他の核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質から得られている核酸配列またはアミノ酸配列が、開始の核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質（それが得られている）の、上述されているような機能的な配列バリアントであり得る）。例えば、ペプチド／タンパク質において、１つ以上のアミノ酸残基は他のアミノ酸残基と置換され得る、または１つ以上のアミノ酸残基の挿入もしくは欠失が生じ得る。
いくつもの文献が本明細書の全体に引用されている。本明細書に引用されている上述または後述の各文献（すべての特許、特許出願、科学刊行物、製造者の仕様書、指示書など）は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されていないことは、本発明が従来の発明によるそのような開示に遡る日に権利を有していないことの自認と解釈されるべきではない。
それらが変わり得ると本明細書に記載されている特定の方法論、プロトコルおよび試薬に本発明が限定されないことを理解すべきである。本明細書に使用されている方法論は、特定の実施形態を説明する目的のためだけにあり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定しないと意図されることを理解すべきである。特に断りがない限り、本明細書に使用されているすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるような同じ意味を有している。
本発明は、他の知見のなかでも、同じサイトカイン（特にＧＭ−ＣＳＦ）における重複しない異なる部位に結合する３つの抗体のカクテルが、現在、利用可能な抗体ＭＯＲ１０３またはナミルマブより、質量を基準にして、強力であるという発見に基づいている。特に、３つの抗体のカクテルが使用されるとき、寿命の長いＧＭ−ＣＳＦの巨大なプールの蓄積が生じず、複数の抗体が、Ｆｃ依存的な様式において急速にインビボにおいて分解される免疫複合体を形成する。これは、本発明者らを、上述の抗体の組み合わせによってもたらされる多重特異性抗体を設計することに促した。意外にも、そのような多重特異性抗体は、現在、利用可能なＧＭ−ＣＳＦ抗体だけでなく、抗体のカクテルと比べても、非常に向上された中和活性を有している（ここで、各抗体は、サイトカインの単一部位に対してのみ特異的である）。本発明に係る多重特異性構築物において、サイトカイン（特にＧＭ−ＣＳＦ）は、不可逆的に隔離され、受容体との相互作用に利用されなくなることが示唆されている。これらの多重特異性抗体は、サイトカイン（特にＧＭ−ＣＳＦ）依存性の種々の疾患（例えば自己免疫疾患および炎症性疾患）を処置するために、極めて低用量において使用され得る。
（多重特異性抗体またはその抗原結合断片）
第一の態様において、本発明は、
（ａ）少なくとも２つの異なるエピトープ結合部位；および
（ｂ）Ｆｃ部分
を含んでおり、
上記少なくとも２つの異なるエピトープ結合部位のそれぞれが、サイトカインの個々のエピトープに対して特異的に結合し、これによって、上記少なくとも２つの異なるエピトープ結合部位が結合する、サイトカインの複数の上記個々のエピトープは、重複しない複数のエピトープである、
単離された多重特異性の抗サイトカイン抗体またはその抗原結合断片を提供する。
そのような、本発明に係る多重特異性の抗サイトカイン（好ましくは抗ＧＭ−ＣＳＦ）抗体またはその抗原結合断片は、主として、サイトカイン（特に当該サイトカインの標的作用）を強力に中和する（例えば、本発明に係る多重特異性抗体またはその抗原結合断片は、主として、ＧＭ−ＣＳＦ（特にＧＭ−ＣＳＦの標的作用）を、強力に中和する）。そのような中和は、当業者に知られており、以下に説明されているような中和評価法において、評価され得る。
好ましくは、本発明に係る多重特異性の抗サイトカイン（好ましくは抗ＧＭ−ＣＳＦ）抗体またはその抗原結合断片は、天然に存在しないアミノ酸配列を含んでいる。
本明細書に使用されるとき、「多重特異性」抗体は、単一の抗体分子が、少なくとも２つの異なるエピトープ（例えば、サイトカイン（特にＧＭ−ＣＳＦ）における少なくとも２つの、重複しない部位）に対して結合し得る抗体を指す。異なる複数の分子にある少なくとも２つのエピトープに対して一般に結合する、最も知られている多重特異性抗体と対照的に、本発明に係る多重特異性の抗サイトカイン（好ましくは抗ＧＭ−ＣＳＦ）抗体またはその抗原結合断片の単一の分子は、単一のサイトカイン分子（特に単一のＧＭ−ＣＳＦ分子）にある、少なくとも２つの異なる重複しない部位に対して結合できる。従って、本発明に係る多重特異性抗体またはその抗原結合断片は、単一のサイトカイン（分子）に対して「多重特異性」である。
好ましくは、本発明に係る多重特異性の抗サイトカイン（好ましくは抗ＧＭ−ＣＳＦ）抗体またはその抗原結合断片は、二重特異性、三重特異性、四重特異性または五重特異性であり、より好ましくは上記抗体またはその抗原結合断片は、二重特異性、三重特異性または四重特異性であり、それ以上に好ましくは、上記抗体またはその抗原結合断片は、二重特異性または三重特異性であり、特に好ましくは、上記抗体またはその抗原結合断片は、三重特異性である。それによって、本発明に係る多重特異性の抗サイトカイン（好ましくは抗ＧＭ−ＣＳＦ）抗体またはその抗原結合断片は、単一のサイトカイン（分子）（特に単一のＧＭ−ＣＳＦ（分子））に対して、二重特異性、三重特異性、四重特異性または五重特異性であることが、意図されている。
本発明の抗体が結合する複数のエピトープ（すなわち、サイトカイン（特に単一のサイトカイン分子（例えばＧＭ−ＣＳＦ（特に単一のＧＭ−ＣＳＦ分子）））における複数の部位）は、直鎖状（連続的）または立体構造的（非連続的）であり得る。好ましくは、本発明の抗体および抗体断片は、立体構造的なエピトープに結合し、より好ましくは当該立体構造的エピトープは、非還元状態においてのみ存在する。しかし、本発明の抗体および抗体断片はまた、直鎖状のエピトープに対して結合し得、より好ましくは、当該直鎖状のエピトープは、非還元状態および還元状態のいずれにも存在する。
本発明に係る抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープ結合部位を含んでおり、当該少なくとも２つの異なるエピトープ結合部位のそれぞれは、サイトカインの個々のエピトープに対して特異的に結合し、それによって、当該少なくとも２つの異なるエピトープ結合部位が結合する、サイトカインの当該個々のエピトープは、重複しない複数のエピトープであり、特に、当該サイトカイン（例えばＧＭ−ＣＳＦ）の一次配列の重複しないエピトープである。重要なのは、本発明の抗体が結合する複数のエピトープ（すなわち、サイトカイン（特に単一のサイトカイン分子（例えばＧＭ−ＣＳＦ（特に単一のＧＭ−ＣＳＦ分子）））における複数の部位）は、異なり（すなわち同一ではなく）、かつ重複しない。単一のサイトカイン（例えばＧＭ−ＣＳＦ）分子において、本発明に係る多重特異性の抗サイトカイン（好ましくは抗ＧＭ−ＣＳＦ）抗体が結合する複数のエピトープ（「部位」とも呼ばれる）は、直接的に隣接して配置され得るか、または（例えば、リンカー、他の抗体ドメインなどによって）分離され得るが、本発明に依れば、当該複数のエピトープは必須に重複しない。それによって、重複しないことは、サイトカイン（例えばＧＭ−ＣＳＦ）のアミノ酸配列におけるあるアミノ酸が、本発明に係る抗体が結合する２つ以上のエピトープ／部位に使用されていないことを意味する。言い換えれば、サイトカイン（例えばＧＭ−ＣＳＦ）のアミノ酸配列におけるそれぞれのアミノ酸は、本発明に係る抗体が結合する１つの単一エピトープの部分であるか、または本発明に係る抗体が結合するいずれのエピトープの部分でもない。
従って、本発明に係る抗体またはその抗原結合断片はまた、サイトカイン（例えばＧＭ−ＣＳＦ）のうち、それらが結合するエピトープの位置決定に使用され得る。
本発明に係る抗体またはその抗原結合断片は、サイトカイン（例えばＧＭ−ＣＳＦ）における少なくとも２つの異なる重複しない部位に対して特異的に結合するための、少なくとも２つの異なるドメインを含んでいる。言い換えれば、本発明に係る抗体またはその抗原結合断片は、サイトカイン（例えばＧＭ−ＣＳＦ）における第一の部位に対して特異的に結合する少なくとも１つの第一のドメイン、および少なくとも１つの第二のドメイン、を含んでいる。ここで、当該少なくとも１つの第二のドメインは、上記少なくとも１つの第一のドメインと異なり、かつサイトカイン（例えばＧＭ−ＣＳＦ）における第二の部位に対して特異的に結合する。これによって、サイトカイン（例えばＧＭ−ＣＳＦ）における当該第二の部位は、上記サイトカイン（例えばＧＭ−ＣＳＦ）における第一の部位と異なり、かつ重複しない。
本明細書において、サイトカイン（例えばＧＭ−ＣＳＦ）に対して特異的に結合する抗体の複数のドメインは、「結合ドメイン」、「エピトープ結合ドメイン」または「エピトープ結合部位」とも呼ばれる。好ましくは、抗体のそのようなエピトープ結合部位は、別個のエピトープに対して特異的に結合するための少なくとも最小の必要性を満たす（従って「エピトープ結合部位」を構成する）、例えば単一特異性抗体に由来し得る、少なくとも１つの、好ましくは３つの、およびより好ましくは６つのＣＤＲを含んでいる。従って、それは、抗体のそのようなエピトープ結合部位が、エピトープ結合部位をともに形成している６つのＣＤＲ（例えば、単一特異性抗体の重鎖に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに同じ単一特異性抗体の、対応する軽鎖に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を含んでいる場合により好ましい。それ以上に好ましくは、本発明に係る多重特異性抗サイトカイン（好ましくは抗ＧＭ−ＣＳＦ）抗体の、そのようなのエピトープ結合部位は、（例えば（同一の）単一特異性抗体に由来し得る）重鎖可変領域および／または（対応する）軽鎖可変領域を含み得る。
原則的には、本発明に係る多重特異性の抗サイトカイン（好ましくは抗ＧＭ−ＣＳＦ）抗体またはその抗原結合断片の、異なるエピトープ結合部位のそれぞれは、上記抗体において、１回以上（好ましくは、２回、３回、４回、５回または６回以上）現れ得る。例えば、天然のＩｇＧは、同一のエピトープをいずれも認識する同一の２つのＦａｂを含んでいるので、２価であり、単一特異性である。従って、本発明に係る多重特異性抗体またはその抗原結合断片は、少なくとも２価（すなわち、抗体にそれぞれ１回現れる２つの異なるエピトープ結合部位の場合）である。さらに、本発明に係る多重特異性抗体またはその抗原結合断片はまた、例えば、それぞれ一回現れる、３つの異なるエピトープ結合部位の場合、または一方が一回現れ、かつ他方が二回現れる、２つの異なるエピトープ結合部位の場合、３価であってもよく；例えば一回現れ、それぞれ一回現れる、４つの異なるエピトープ結合部位の場合、または２つがそれぞれ一回現れ、かつ第三のエピトープ結合部位が二回現れる、３つの異なるエピトープ結合部位の場合、またはそれぞれ二回現れるか、もしくは一方が一回現れ、かつ他方が三回現れる、２つの異なるエピトープ結合部位の場合、４価であってもよく；５価であってもよく；６価であってもよく；７価であってもよく；８価であってもよく；９価であってもよく；１０価であってもよく；１１価であってもよく；１２価であってもよく；１３価であってもよく；１４価などであってもよい。
好ましくは、異なるエピトープ結合部位のそれぞれは、本発明に係る抗体分子において、二回現れる。言い換えれば、本発明に係る抗体分子は、抗体またはその抗原結合断片によって含まれる、サイトカインにおける、少なくとも２つの異なる、重複しない部位に対して特異的に結合する異なるドメインのそれぞれを、厳密に２コピー含んでいる。従って、本発明に係る多重特異性抗体またはその抗原結合断片は、好ましくは、４価、６価、８価、１０価、１２価、１４価、などであり、それによって、抗体分子は、異なるエピトープ結合部位のそれぞれを、厳密に２コピー含んでいる。より好ましくは、本発明に係る多重特異性の抗サイトカイン（好ましくは抗ＧＭ−ＣＳＦ）抗体またはその抗原結合断片は、二重特異性の４価抗体、三重特異性の６価抗体、または四重特異性の８価抗体であり、それ以上に好ましくは、本発明に係る多重特異性抗体またはその抗原結合断片は、二重特異性の４価抗体または三重特異性の６価抗体である。
一般的に、本発明に係る抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体または当該モノクローナル抗体の抗原結合断片であることが好ましい。モノクローナル抗体は、通常、例えば非分泌型の骨髄腫細胞と免疫脾臓細胞との融合から、例えばハイブリッド抗体産生細胞を作製することによって、Ｂリンパ球の単一のクローンによって産生される。ポリクローナル抗体と対照的に、多重特異性モノクローナル抗体は、（予め）決められているエピトープに対して結合する。それ故に、予期しない結合、特に決められていないエピトープに対する予期しない結合はほとんど避けられ、モノクローナル抗体は、ポリクローナル抗体と比較して、より安全であると考えられる。
好ましくは、本発明に係る抗体またはその抗原結合断片は、ヒト抗体、モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、または精製されている抗体である。本発明に係る抗体またはその抗原結合断片はまた、単鎖抗体であってもよい。
（Ｆｃ部分）
本発明に係る多重特異性抗抗体またはその抗原結合断片は、Ｆｃ部分を含んでいる。好ましくは、Ｆｃ部分は、ヒト起源から得られているに由来しており、例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３および／またはＩｇＧ４に由来しており、それによって、ヒトＩｇＧ１は特に好ましい。
本明細書に使用されるとき、用語「Ｆｃ部分」は、免疫グロブリン重鎖の一部分に由来する配列を指し、当該免疫グロブリン重鎖の一部分は、パパイン開裂部位（例えば、天然ＩｇＧにおける残基２１６であり、重鎖定常領域の一番目の残基を１１４番目にもっていく）の直上流のヒンジ領域から始まり免疫グロブリン重鎖のＣ末端でおわる。従って、Ｆｃ部分は、完全なＦｃ部分であってもよく、またはその一部分（例えば、ドメイン）であってもよい。完全なＦｃ部分は、少なくとも、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン（例えば、ＥＵアミノ酸位置２１６〜４４６）を含んでいる。さらなるリジン残基（Ｋ）が、時々、Ｆｃ部分のＣ末端の最末端に存在するが、成熟した抗体からしばしば切断される。Ｆｃ領域内部におけるアミノ酸位置のそれぞれは、技術的に承認されたKabatのＥＵ番号付与システムに基づき、番号付けされている。Kabatらによる “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, U.S. Dept. Health and Human Services, 1983 and 1987、を参照のこと。
好ましくは、本発明との関連において、Ｆｃ部分は、少なくとも１つの：ヒンジ（例えば、上部、中部、および／または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはそれらのバリアント、一部分、もしくは断片、を含んでいる。好ましい実施形態において、Ｆｃ部分は、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインを含んでいる。より好ましくは、Ｆｃ部分は、完全なＦｃ部分である。Ｆｃ部分はまた、天然に存在するＦｃ部分に対して一つ以上のアミノ酸挿入、アミノ酸欠失、またはアミノ酸置換、を含んでいてもよい。例えば、少なくとも一つのヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメイン（またはそれらの一部分）は、削除されてもよい。例えば、Ｆｃ部分は、以下を含んでもよく、または以下から構成されてもよい：（ｉ）ＣＨ２ドメイン（もしくはその一部分）に対して融合されたヒンジドメイン（もしくはその一部分）、（ｉｉ）ＣＨ３ドメイン（もしくはその一部分）に対して融合されたヒンジドメイン（もしくはその一部分）、（ｉｉｉ）ＣＨ３ドメイン（もしくはその一部分）に対して融合されたＣＨ２ドメイン（もしくはその一部分）、（ｉｖ）ヒンジドメイン（もしくはその一部分）、（ｖ）ＣＨ２ドメイン（もしくはその一部分）、または（ｖｉ）ＣＨ３ドメインもしくはその一部分。
Ｆｃ部分が天然に存在する免疫グロブリン分子の完全なＦｃ部分とアミノ酸配列の点で異なり、同時に、当該Ｆｃ部分が天然に存在するＦｃ部分によって与えられる少なくとも一つの望ましい機能を維持するように、当該Ｆｃ部分は修飾されてもよい、ということが当業者によって理解されるだろう。そのような機能は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能、タンパク質Ａ結合、タンパク質Ｇ結合、および補体結合、を含んでいる。そのような機能を担う、および／またはそのような機能にとって不可欠な、天然に存在するＦｃ部分の一部分は、当業者によってよく知られている。
例えば、補体カスケードを活性化するために、Ｃ１ｑは、抗原性標的に対して付着された、少なくとも２分子のＩｇＧ１または１分子のＩｇＭに対して結合する（Ward, E. S., and Ghetie, V., Ther. Immunol. 2 (1995) 77−94）。Burton, D. R.は、アミノ酸残基３１８〜３３７を含んでいる重鎖領域は補体固定に関与する、ということについて説明した（Mol. Immunol. 22 (1985) 161−206）。Duncan, A. R.およびWinter, G.は、部位特異的変異誘発を利用して、Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０およびＬｙｓ３２２がＣ１ｑに対する結合部位を形成する、ということを報告した（Nature 332 (1988) 738−740）。Ｃ１ｑの結合における、Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０およびＬｙｓ３２２残基の役割は、補体媒介性溶解の阻害に対する、これらの残基を含んでいる短い合成ペプチドの能力によって確かめられた。
例えば、ＦｃＲ結合は、（抗体の）Ｆｃ部分とＦｃ受容体（ＦｃＲｓ）との相互作用によって媒介されることが可能であり、当該Ｆｃ受容体（ＦｃＲｓ）は造血細胞上の分化した細胞表面受容体である。Ｆｃ受容体は免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、当該Ｆｃ受容体は、免疫複合体のファゴサイトーシスによる、抗体で被覆された病原体の除去と、抗体依存的細胞介在性細胞毒性（ＡＤＣＣ；Van de Winkel, J. G., and Anderson, C. L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511−524）を介する、赤血球および、対応する抗体で被覆された様々な他の細胞の対象（例えば腫瘍細胞）の溶解と、の両方を媒介することが示される。ＦｃＲｓは、免疫グロブリンのクラスに対するＦｃＲｓの特異性によって定義される；ＩｇＧ抗体に対するＦｃ受容体はＦｃγＲと称され、ＩｇＥに対してはＦｃεＲとして、ＩｇＡに対してはＦｃαＲとして、等々称され、そして新生児のＦｃ受容体はＦｃＲｎと称される。Ｆｃ受容体結合は、例えば、以下に記載されている：Ravetch, J. V., and Kinet, J. P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457−492； Capel, P. J., et al., Immunomethods 4 (1994) 25−34； de Haas, M., et al., J Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330−341；およびGessner, J. E., et al., Ann. Hematol. 76 (1998) 231−248。
天然のＩｇＧ抗体のＦｃドメインによる受容体（ＦｃγＲ）の架橋結合は、多種多様の作動体機能を引き起こし、当該作動体機能は、ファゴサイトーシス、抗体依存性細胞障害、および炎症性介在物質の放出、ならびに、免疫複合体の除去および抗体産生の調節、を含んでいる。ヒトにおいて、ＦｃγＲの３つのクラスが特徴付けられており、それらは以下である：（ｉ）ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、当該ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）は、高い親和性をともなって単量体ＩｇＧに結合し、かつマクロファージ、単球、好中球および好酸球上に発現される；（ｉｉ）ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、当該ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）は、中間から低い親和性をともなって複合体化されたＩｇＧに結合し、広く、特に白血球上に、発現され、抗体介在性免疫における中心的なプレーヤーであることが知られており、かつ当該ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）は、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＣに分けられることが可能であり、これらは、免疫システムにおいて異なる機能を果たすが、同様の低い親和性をともなってＩｇＧ−Ｆｃに対して結合し、これらの受容体の外部ドメインは、高い相同性がある；および（ｉｉｉ）ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、当該ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は、中間から低い親和性をともなってＩｇＧに結合し、かつ２つの型が存在する：ＮＫ細胞、マクロファージ、好酸球、ならびにいくつかの単球およびＴ細胞、上に見つけられ、ＡＤＣＣを媒介するＦｃγＲＩＩＩＡ、ならびに、好中球上に高発現されるＦｃγＲＩＩＩＢ。ＦｃγＲＩＩＡは、致死に関与する多くの細胞上に見つけられ（例えばマクロファージ、単球、好中球）、致死過程を活性化することができると思われる。ＦｃγＲＩＩＢは、阻害過程において役割を果たすと思われ、かつＢ細胞、マクロファージ、ならびにマスト細胞および好酸球、上に見つけられる。Ｂ細胞上では、それは、さらなる免疫グロブリンの産生、およびアイソタイプの、およそ例えばＩｇＥクラスへの切り替え、を抑えるための機能と思われる。マクロファージ上では、ＦｃγＲＩＩＢは、ＦｃγＲＩＩＡを通して媒介されるようなファゴサイトーシスを、阻害するために作用する。好酸球およびマスト細胞上では、ｂ形態は、その別個の受容体に対して結合するＩｇＥを通して、これらの細胞の活性化を抑えることを助けてもよい。
ＦｃγＲＩ結合に関して、天然のＩｇＧにおける、Ｅ２３３〜Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７およびＰ３２９の少なくとも一つにおける修飾は、ＦｃγＲＩに対する結合を減少させる。ＩｇＧ１およびＩｇＧ４の中へ置換された、ＩｇＧ２の位置２３３〜２３６における残基は、ＦｃγＲＩに対する結合を、１０３倍まで減少させ、抗体感作赤血球に対するヒト単球の応答を取り除いた（Armour, K. L.ら Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613−2624）。ＦｃγＲＩＩ結合に関して、ＦｃγＲＩＩＡについての減少した結合が、例えば、Ｅ２３３〜Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｒ２９２およびＫ４１４の少なくとも一つのＩｇＧ変異について、見つけられた。ＦｃγＲＩＩＩ結合に関して、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する減少した結合が、例えば、Ｅ２３３〜Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｓ２３９、Ｅ２６９、Ｅ２９３、Ｙ２９６、Ｖ３０３、Ａ３２７、Ｋ３３８およびＤ３７６の少なくとも一つの変異について、見つけられた。Ｆｃ受容体に対するヒトＩｇＧ１上における結合部位を位置付けるために、上述した変異部位ならびに、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＡに対する結合の測定方法が、Shields, R. L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591−6604において説明されている。
重大なＦｃγＲＩＩに対する結合に関して、天然のＩｇＧのＦｃの２つの領域は、ＦｃγＲＩＩｓおよびＩｇＧｓの相互作用のために重要であるように見え、当該２つの領域は、すなわち、（ｉ）ＩｇＧ Ｆｃの下部ヒンジ部位、特にアミノ酸残基Ｌ、Ｌ、Ｇ、Ｇ（２３４〜２３７、ＥＵ番号付与）、および（ｉｉ）ＩｇＧ ＦｃのＣＨ２ドメインの隣接領域、特に、（例えばＰ３３１の領域における）下部ヒンジ領域に隣接する上部ＣＨ２ドメインにおける、ループおよびストランドである（Wines, B.D., et al., J. Immunol. 2000; 164: 5313 − 5318）。さらに、ＦｃＲｎおよびタンパク質ＡはＩｇＧ Ｆｃ上の異なる部位に対して結合するのに対して、ＦｃγＲＩはＩｇＧ Ｆｃ上の同一の部位に対して結合するように見え、これは、ＣＨ２−ＣＨ３境界面においてであるように見える（Wines, B.D., et al., J. Immunol. 2000; 164: 5313 − 5318）。
例えば、Ｆｃ部分は、ＦｃＲｎ結合または延長された半減期のために必要とされることが、技術的に知られているＦｃ部分の少なくとも一部分、を含んでいてもよく、当該一部分で構成されてもよい。代替的にまたはさらに、本発明の抗体のＦｃ部分は、タンパク質Ａ結合のために必要とされることが、技術的に知られているうちの少なくとも一部分を含み、および／または本発明の抗体のＦｃ部分は、タンパク質Ｇ結合のために必要とされることが、技術的に知られているＦｃ分子の少なくとも一部分を含む。好ましくは、維持される機能は、サイトカイン−免疫複合体、例えばＧＭ−ＣＳＦ−免疫複合体、の除去であり、これは、ＦｃγＲ結合によって介在されると仮定される。従って、好ましいＦｃ部分は、ＦｃγＲ結合のために必要とされることが技術的に知られている少なくとも一部分を含んでいる。上記に概略が説明されたように、好ましいＦｃ部分は、従って、少なくと以下の（ｉ）および（ｉｉ）を含んでいてもよい：（ｉ）天然のＩｇＧのＦｃの下部ヒンジ部位、特にアミノ酸残基Ｌ、Ｌ、Ｇ、Ｇ（２３４〜２３７、ＥＵ番号付与）、および（ｉｉ）天然のＩｇＧのＦｃのＣＨ２ドメインの隣接領域、特に、（例えばＰ３３１の領域における）下部ヒンジ領域に隣接する上部ＣＨ２ドメインにおける、ループおよびストランド、例えば、天然のＩｇＧ ＦｃのＰ３３１のあたり（例えば、天然のＩｇＧ Ｆｃのアミノ酸３２０と３４０（ＥＵ番号付与）との間）の上部ＣＨ２ドメインにおける、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、または１０の連続したアミノ酸の領域。
好ましくは、本発明に係る多重特異性の抗サイトカイン（好ましくは抗ＧＭ−ＣＳＦ）抗体またはその抗原結合断片は、Ｆｃ領域を含んでいる。本明細書に使用されるとき、用語「Ｆｃ領域」は、抗体重鎖の２つ以上のＦｃ部分によって形成される、免疫グロブリンの一部分を指す。例えば、Ｆｃ領域は、単量体Ｆｃ領域であってもよく、または「一本鎖」Ｆｃ領域（すなわち、ｓｃＦｃ領域）であってもよい。単鎖Ｆｃ領域は、（例えば、単一の連続核酸配列においてコードされている）単一のポリペプチド鎖の内部で連結されたＦｃ部分から構成される。例示的なｓｃＦｃ領域は、国際公開特許公報２００８／１４３９５４Ａ２号の中に開示されている。好ましくは、Ｆｃ領域は二量体Ｆｃ領域である。「二量体Ｆｃ領域」または「ｄｃＦｃ」は、２つの別個の免疫グロブリン重鎖のＦｃ部分によって形成される二量体を指す。二量体Ｆｃ領域は、（例えば、天然に存在する免疫グロブリンのＦｃ領域の）２つの同一のＦｃ部分のホモ二量体であってもよく、または２つの非同一のＦｃ部分のヘテロ二量体であってもよい。
Ｆｃ領域のＦｃ部分は、同一のまたは異なった、クラスおよび／もしくはサブクラスであってもよい。例えば、Ｆｃ部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリン（例えば、ヒト免疫グロブリン）に由来してもよい。好ましくは、Ｆｃ領域のＦｃ部分は、同一のクラスおよびサブクラスである。しかしながら、Ｆｃ領域（またはＦｃ領域の一つ以上のＦｃ部分）はまた、キメラであってもよく、ここで、キメラＦｃ領域は、異なる免疫グロブリンのクラスおよび／またはサブクラスに由来するＦｃ部分を含んでいてもよい。例えば、二量体または一本鎖Ｆｃ領域の、少なくとも２つのＦｃ部分は、異なる免疫グロブリンのクラスおよび／またはサブクラスからであってもよい。さらに、または代替的に、キメラＦｃ領域は、１つ以上のキメラＦｃ部分を含んでいてもよい。例えば、キメラＦｃ領域または部分は、第一のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２，またはＩｇＧ３サブクラス）の免疫グロブリンに由来する一つ以上の一部分を含んでいてもよく、その上、Ｆｃ領域または部分の残りは異なるサブクラスである。例えば、ＦｃポリペプチドのＦｃ領域または部分は、第一のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２，またはＩｇＧ４サブクラス）の免疫グロブリンに由来するＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン、ならびに、第２のサブクラス（例えば、ＩｇＧ３サブクラス）の免疫グロブリンからのヒンジ領域を含んでいてもよい。例えば、Ｆｃ領域または部分は、第一のサブクラス（例えば、ＩｇＧ４サブクラス）の免疫グロブリンに由来するヒンジおよび／またはＣＨ２ドメイン、ならびに、第二のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２，またはＩｇＧ３サブクラス）の免疫グロブリンからのＣＨ３ドメイン、を含んでいてもよい。例えば、キメラＦｃ領域は、第一のサブクラス（例えば、ＩｇＧ４サブクラス）についての免疫グロブリンからのＦｃ部分（例えば、完全なＦｃ部分）、および、第二のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２，またはＩｇＧ３サブクラス）の免疫グロブリンからのＦｃ部分、を含んでいてもよい。例えば、Ｆｃ領域または部分は、ＩｇＧ４免疫グロブリンからのＣＨ２ドメイン、および、ＩｇＧ１免疫グロブリンからのＣＨ３ドメインを含んでいてもよい。例えば、Ｆｃ領域または部分は、ＩｇＧ４分子からのＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメイン、ならびに、ＩｇＧ１分子からのＣＨ３ドメインを含んでいてもよい。例えば、Ｆｃ領域または部分は、抗体の特定のサブクラスからのＣＨ２ドメインの一部分、例えば、ＣＨ２ドメインのＥＵ位置２９２〜３４０、を含んでいてもよい。例えば、Ｆｃ領域または部分は、ＩｇＧ４部分に由来するＣＨ２のアミノ酸位置２９２〜３４０、および、ＩｇＧ１部分に由来するＣＨ２の残り（代替的に、ＩｇＧ１部分に由来してもよいＣＨ２の２９２〜３４０、および、ＩｇＧ４部分に由来するＣＨ２の残り）を含んでいてもよい。
さらに、Ｆｃ領域または部分は、（さらに、または代替的に）例えば、キメラヒンジ領域を含んでいてもよい。例えば、キメラヒンジは、例えば一部分、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４分子（例えば、上部および下部中部ヒンジ配列）に由来していてもよく、かつ一部分、ＩｇＧ３分子（例えば、中部ヒンジ配列）に由来してもよい。別の実施例において、Ｆｃ領域または部分は、一部分、ＩｇＧ１分子に由来し、かつ一部分、ＩｇＧ４分子に由来するキメラヒンジ、を含んでいてもよい。別の実施例において、キメラヒンジは、ＩｇＧ４分子からの上部および下部ヒンジドメインと、ＩｇＧ１分子からの中部ヒンジドメインと、を含んでいてもよい。そのようなキメラヒンジは、例えば、ＩｇＧ４ヒンジ領域の中部ヒンジドメインにおけるＥＵ位置２２８において、プロリン置換（Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ）を導入することによって作製されてもよい。別の実施形態において、キメラヒンジは、ＥＵ位置２３３〜２３６におけるアミノ酸を含み得、当該アミノ酸は、ＩｇＧ２抗体からであり、および／またはＳｅｒ２２８Ｐｒｏ変異であり、ここで、ヒンジの残りのアミノ酸はＩｇＧ４抗体からである（例えば、配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰのキメラヒンジ）。さらに、本発明に係る抗体のＦｃ部分に使用されてもよいキメラヒンジは、米国公開特許公報第２００５／０１６３７８３Ａ１号において説明されている。
「Ｆｃ領域」の定義の中に具体的に含まれるものは、「無糖化された（aglycosylated）Ｆｃ領域」である。用語「無糖化されたＦｃ領域」は、例えば、Ｆｃ領域の一つ以上のＦｃ部分において、ＥＵ位置２９７におけるＮグリコシル化部位にて、共有結合的に連結されたオリゴ糖またはグリカンを欠いているＦｃ領域を指す。例えば、無糖化されたＦｃ領域は、完全に無糖化されていてもよく、すなわち、Ｆｃ領域のＦｃ部分の全てが炭水化物を欠いていてもよい。代替的に、無糖化されたＦｃ領域は、部分的に無糖化（すなわち、ヘミ−グリコシル化）されてもよい。無糖化されたＦｃ領域は、脱グリコシル化されたＦｃ領域、すなわち、例えば化学的または酵素的に、Ｆｃ炭水化物が取り除かれたＦｃ領域、であってもよい。代替的に、またはさらに、無糖化されたＦｃ領域は、非グリコシル化（nonglycosylated）（すなわち非グルコシル化（unglycosylated））され（すなわち、Ｆｃ炭水化物なしで（例えばグリコシル化パターン（例えばＥＵ位置２９７または２９９におけるＮグリコシル化部位）をコードしている１以上の残基の変異、タンパク質に炭水化物を天然に結合させない生物（例えば細菌）における発現、またはグリコシル化機序が遺伝子操作またはグリコシル化阻害剤（例えば糖転移酵素阻害剤）の添加によって欠損させられている宿主細胞もしくは宿主生物における発現によって）発現された抗体）得る。代替的に、Ｆｃ領域は、「グリコシル化されたＦｃ領域」であり、すなわち、Ｆｃ領域は、すべての有効なグリコシル化部位において完全にグリコシル化される。
本発明において、Ｆｃ部分、またはＦｃ領域は、ヒト免疫グロブリンの配列（例えば、ヒトＩｇＧ分子からのＦｃ領域またはＦｃ部分）に由来するアミノ酸配列を有するか、または当該アミノ酸配列からなることが好ましい。しかしながら、ポリペプチドは、別の哺乳類種からの一つ以上のアミノ酸を含んでいてもよい。例えば、霊長類のＦｃ部分または霊長類の結合部位が、対象のポリペプチドにおいて含まれていてもよい。代替的に、マウスの一つ以上のアミノ酸が、Ｆｃ部分の中にまたはＦｃ領域の中に、存在してもよい。
好ましくは、本発明に係る多重特異性の抗サイトカイン（好ましくは抗ＧＭ−ＣＳＦ）抗体は、特に、上記に記載したようなＦｃ部分に加えて、他の部分を含んでおり、当該他の部分は、定常領域、特にＩｇＧの定常領域、好ましくはＩｇＧ１の定常領域、より好ましくはヒトＩｇＧ１の定常領域、に由来する。より好ましくは、本発明に係る多重特異性抗体は、特に、上記に記載したようなＦｃ部分に加えて、定常領域の他の部分の全て、特にＩｇＧの定常領域の他の部分の全て、好ましくはＩｇＧ１の定常領域の他の部分の全て、より好ましくはヒトＩｇＧ１の定常領域の他の部分の全て、を含んでいる。
上記に概略が説明されたように、本発明に係る特に好ましい多重特異性抗体は、ヒトＩｇＧに由来する（完全な）Ｆｃ領域を含んでいる。より好ましくは、本発明に係る多重特異性抗体は、特に、ヒトＩｇＧに由来する（完全な）Ｆｃ領域に加えて、また、ＩｇＧの定常領域の他の部分の全て、好ましくはＩｇＧ１の定常領域の他の部分の全て、より好ましくはヒトＩｇＧ１の定常領域の他の部分の全て、も含んでいる。
（サイトカイン）
本発明に係る多重特異性の抗サイトカイン（好ましくは抗ＧＭ−ＣＳＦ）抗体またはその抗原結合断片は、サイトカイン、好ましくはＧＭ−ＣＳＦに対して結合する。サイトカインは、通常、細胞の情報伝達において重要である小さなタンパク質（〜５−２０ｋＤａ）である。上記サイトカインは、細胞によって放出され、他の細胞の挙動に影響を及ぼし、時々、当該サイトカイン自身を放出している細胞の挙動に影響を及ぼす。サイトカインは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンフォカイン、腫瘍壊死因子、モノカインおよびコロニー刺激因子、を含むが、一般的にホルモンは含まない。サイトカインは、免疫細胞様マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、およびマスト細胞、ならびに内皮細胞、線維芽細胞、および様々な間質性細胞を含んでいる広範囲の細胞によって産生され、それによって、所定のサイトカインは、２つ種類以上の細胞によって産生されてもよい。
ケモカインは、細胞間の化学誘引（化学走性）を媒介する。サイトカインタンパク質は、挙動および構造上の特徴に基づき、ケモカインに分類されている。化学走性を媒介することで知られていることに加えて、ケモカインは、大きさに関してすべて約８〜１０ｋＤａであり、保存された位置において、当該ケモカインの３次元形状を形成するために重要である４つのシステイン残基を有している。これらのタンパク質は、歴史的に、いくつかの他の名前の下に知られており、当該他の名前は、サイトカインのＳＩＳファミリー、サイトカインのＳＩＧファミリー、サイトカインのＳＣＹファミリー、血小板因子−４スーパーファミリーまたはインタークリン、を含んでいる。ケモカインは、４つの主なサブファミリー：ＣＸＣ、ＣＣ、ＣＸ３ＣおよびＸＣに分類され得る。
ＣＣケモカイン（またはβ−ケモカイン）タンパク質は、そのアミノ末端の近くに、２つの隣接したシステイン（アミノ酸）を有している。哺乳類について、このサブグループに属する少なくとも２７の識別可能なグループ員が報告されており、ＣＣケモカインリガンド（ＣＣＬ）−１〜−２８、と呼ばれており；ＣＣＬ１０はＣＣＬ９と同一である。このサブファミリーのケモカインは、通常、４つのシステインを含んでいる（Ｃ４−ＣＣケモカイン）が、少数のＣＣケモカインは、６つのシステインを保有する（Ｃ６−ＣＣケモカイン）。Ｃ６−ＣＣケモカインは、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２３およびＣＣＬ２８を含む。ＣＣケモカインは、単球、ならびに、ＮＫ細胞および樹状細胞のような他の細胞型の遊走を引き起こす。ＣＣケモカインの例は、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１またはＣＣＬ２）を含んでおり、当該単球走化性タンパク質−１は、単球が、血流から離れて周囲の組織に入り、組織マクロファージになることを引き起こす。ＣＣＬ５（またはＲＡＮＴＥＳ）は、受容体ＣＣＲ５を発現している、Ｔ細胞、好酸球および好塩基球のような細胞を誘引する。血漿において増加したＣＣＬ１１レベルは、マウス及びヒトにおける加齢（および減少した神経発生）と関連する。ＣＣケモカインは、例えば、ＣＣＬ１−ＣＣＬ２８を含む。
ＣＸＣケモカイン（またはα−ケモカイン）のＮ末端の２つのシステインは、１つのアミノ酸によって分離されており、当該１つのアミノ酸は、「Ｘ」を用いるこの名前で表される。哺乳類において記載された１７の異なるＣＸＣケモカインがあり、これらは２つの分類に再分され、当該２つの分類は、ＣＸＣモチーフの一番目のシステインの直前に、グルタミン酸−ロイシン−アルギニン（または略してＥＬＲ）の特異的なアミノ酸配列（またはモチーフ）を有している分類（ＥＬＲ−ポジティブ）、およびＥＬＲモチーフを有していない分類（ＥＬＲ−ネガティブ）である。ＥＬＲ−ポジティブＣＸＣケモカインは、好中球の遊走を特異的に誘導し、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２と相互作用する。ＥＬＲ−ポジティブＣＸＣケモカインの例は、インターロイキン−８（ＩＬ−８）であり、当該インターロイキン−８は、好中球が、血流から離れて周囲の組織の中に入ることを引き起こす。ＥＬＲモチーフを欠いている他のＣＸＣケモカイン、例えばＣＸＣＬ１３、はリンパ球に対して化学誘引である傾向がある。ＣＸＣケモカインはＣＸＣケモカイン受容体に結合し、７つのＣＸＣケモカイン受容体が現在までに発見されており、ＣＸＣＲ１−７と表されている。ＣＸＣケモカインは、例えば、ＣＸＣＬ１−ＣＸＣＬ１７を含む。
ケモカインの第三のグループは、Ｃケモカイン（またはγケモカイン）として知られており、当該第三のグループは、当該第三のグループがたった２つのシステイン；一つのＮ末端のシステインおよび下流にひとつのシステイン、を有するという点で、全ての他のケモカインと異なっている。このサブグループについて、２つのケモカインが記載されており、当該２つのケモカインは、ＸＣＬ１（リンフォタクチン−α）およびＸＣＬ２（リンフォタクチン−β）と呼ばれている。
第四のグループもまた、発見されており、グループ員は、２つのシステインの間に３つのアミノ酸を有しており、ＣＸ３Ｃケモカイン（またはｄ−ケモカイン）と称される。現在までに、ただ一つのＣＸ３Ｃケモカインが発見されており、フラクタルカイン（またはＣＸ３ＣＬ１）と呼ばれている。ただ一つのＣＸ３Ｃケモカインは、分泌されたものと、当該ただ一つのＣＸ３Ｃケモカインを発現する細胞の表面につながれたものとの両方であり、その結果、当該ただ一つのＣＸ３Ｃケモカインは化学遊走および接着分子としての両方として役目を果たす。
インターフェロン（ＩＦＮｓ）はサイトカインのグループであり、例えば、ウイルス、細菌、寄生虫、または腫瘍細胞のような病原体の存在に応答して、産生され、かつ放出される。典型的なシナリオにおいて、ウイルスが感染した細胞は、すぐ近くの細胞がそれらの抗ウイルス防御を高めることを引き起こすインターフェロンを、放出するだろう。２０より多い、識別可能なＩＦＮ遺伝子およびタンパク質が、ヒトを含む動物において同定されている。ヒトインターフェロンは、受容体の型に基づいて３つの主な型：Ｉ型ＩＦＮ、ＩＩ型ＩＦＮ、およびＩＩＩ型ＩＦＮ、に分類されており、当該ヒトインターフェロンは当該受容体を通して情報伝達をする。全ての３つの部類に属しているＩＦＮｓは、ウイルス感染と戦うために、かつ免疫システムの調節のために、重要である。
全てのＩ型ＩＦＮｓは、ＩＦＮ−α／β受容体（ＩＦＮＡＲ）として知られている、特異的な細胞表面受容体複合体に対して結合し、当該ＩＦＮ−α／β受容体はＩＦＮＡＲ１鎖およびＩＦＮＡＲ２鎖からなる。ヒトにおいて存在するＩ型インターフェロンは、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κおよびＩＦＮ−ωである。概して、Ｉ型インターフェロンは、ウイルスが体に侵入したことを当該体が認識したとき、産生される。Ｉ型インターフェロンは、線維芽細胞および単球によって産生される。しかしながら、Ｉ型ＩＦＮ−αの産生は、インターロイキン−１０として知られる別のサイトカインによって妨げられ得る。いったん活性化されると、Ｉ型インターフェロンは、ウイルスが当該ウイルスのＲＮＡおよびＤＮＡを産生し複製することを抑制する分子を、産み出すことができる。全般的に見れば、ＩＦＮ−αは、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎の感染を処置するために使用されることが提案されており、一方ＩＦＮ−βは、多発性硬化症を処置するために使用されることが提案されている。
インターフェロンＩＩ型はまた、免疫インターフェロンとしても知られており、特に、インターロイキン−１２によって活性化される。さらに、ＩＩ型インターフェロンは、ヘルパーＴ細胞、特に１型、によって放出される。しかしながら、ＩＩ型インターフェロンは、ヘルパーＴ細胞２型の増殖を阻むことができる。これまでのことは、Ｔｈ２免疫応答の阻害およびＴｈ１免疫応答のさらなる誘導、という結果を招き、これは、多発性硬化症のような身体を衰弱させる疾患の進行を引き起こす。ＩＦＮ ＩＩ型はＩＦＮＧＲに対して結合し、当該ＩＦＮＧＲはＩＦＮＧＲ１鎖およびＩＦＮＧＲ２鎖からなる。ヒトにおける例示的なＩＮＦ ＩＩ型は、ＩＦＮ−γである。
インターフェロンＩＩＩ型は、ＩＬ１０Ｒ２（また、ＣＲＦ２−４とも呼ばれている）およびＩＦＮＬＲ１（また、ＣＲＦ２−１２とも呼ばれている）からなる受容体複合体を通して情報伝達する。近年、Ｉ型ＩＦＮｓおよびＩＩ型ＩＦＮｓよりも多く発見されているが、近年の情報は、ウイルス感染のいくつかの型におけるＩＩＩ型ＩＦＮｓの重要性を実証している。
インターロイキンは、白血球（white blood cells）（白血球（leukocytes））によって発現されることが初めて理解されたサイトカイン、のグループである。免疫システムの機能は、大部分においてインターロイキンに依存しており、いくらかのインターロイキンのまれな欠乏症が記載されており、インターロイキンの全ては、自己免疫疾患または免疫不全を特徴づけている。インターロイキンの大部分は、ヘルパーＣＤ４Ｔリンパ球によって、ならびに、単球、マクロファージ、および内皮細胞を通して、合成されている。インターロイキンは、ＴおよびＢリンパ球、ならびに造血細胞の発達および分化を促進する。インターロイキンの例は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５、およびＩＬ−３６、を含む。
リンフォカインは、リンパ球によって産生されるサイトカイン、のサブ集団である。リンフォカインは、概してＴ細胞によって産生され、その細胞間の情報伝達による免疫システム応答を指揮するための、タンパク質介在物質である。リンフォカインは多くの役割を有しており、当該役割は、マクロファージおよび他のリンパ球を含んでいる他の免疫細胞の、感染された場所への誘引、ならびに、それに続く、免疫応答を始めるためにそれらを準備するためのそれらの活性化、を含んでいる。循環性リンパ球は、非常に小さい濃度のリンフォカインを検出することが可能であり、その後、当該循環性リンパ球は、濃度勾配を免疫応答が必要とされる濃度勾配へと上昇することが可能である。リンフォカインは、Ｂ細胞が抗体を産生するのを助ける。ヘルパーＴ細胞によって分泌される重要なリンフォカインとしては、以下を含む：ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、およびインターフェロン−ガンマ。
腫瘍壊死因子（またはＴＮＦファミリー）は、細胞死（アポトーシス）を引き起こし得るサイトカインの一群を指す。配列、機能、および構造の類似性に基づいて、ＴＮＦファミリーの一部として１９のタンパク質（種々の機能を有するサイトカインである、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（カセクチンまたはＴＮＦアルファとしても知られている）が挙げられる）が同定されている。例えば、腫瘍壊死因子は、ある種の腫瘍細胞株の細胞溶解を引き起こすことができ、悪液質の誘導に関与しており、直接作用によってまたはインターロイキン−１分泌の刺激によって熱を引き起こす強力な発熱物質であり、また、ある種の状況下において細胞増殖を刺激することができ、かつ細胞分化を誘導することができる。上記１９のタンパク質は、インビトロおよびインビボにおいて広範囲の腫瘍細胞に対して細胞傷害性でありリンパ球によって産生された２つの関連したサイトカインである、リンフォトキシン−アルファ（ＬＴ−アルファ）およびリンフォトキシン−ベータ（ＬＴ−ベータ）；Ｂ細胞の発達および活性化に重要であると思われるサイトカインである、Ｔ細胞抗原ｇｐ３９（ＣＤ４０Ｌ）；Ｔ細胞の活性化において役割を果たし、共刺激されたＴ細胞の増殖を誘導し、かつ細胞傷害性Ｔ細胞の産出を向上させるサイトカインである、ＣＤ２７Ｌ；Ｔ細胞の増殖を誘導するサイトカインである、ＣＤ３０Ｌ；細胞死に関与する細胞表面タンパク質である、ＦＡＳＬ；Ｔ細胞刺激に寄与する誘導性のＴ細胞表面分子である、４−１ＢＢＬ；Ｔ細胞増殖とサイトカイン産生とを共刺激する細胞表面たんぱく質である、ＯＸ４０Ｌ；ならびに、アポトーシスを誘導するサイトカインである、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、を含む。
全てのこれらＴＮＦファミリー構成員は、それらの特異的な受容体によって認識されるホモ三量体の（またはＬＴ−アルファ／ベータの場合にはヘテロ三量体の）複合体を、形成すると思われる。モノマー間の強い水素結合が、三次構造を安定化する。その一例は、M. musculusのＴＮＦアルファにおけるＡｓｎ３４−Ａｒｇ８２水素結合である。このファミリーに対するＰＲＯＳＩＴＥパターンは、全ての構成員を通して保存されている、タンパク質の中心部分におけるベータ−ストランドに位置する。ＴＮＦファミリーの全ての構成員は、分泌されたリンフォトキシン、および増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）を除いて、免疫細胞から突き出るＩＩ型膜貫通タンパク質である。そのような膜結合ＴＮＦリガンドは、当該膜結合ＴＮＦリガンドが他の細胞上においてそれらの同系の受容体と接触し結合したとき、しばしば、もとの免疫細胞へ情報伝達する。ＴＮＦファミリーの構成員の例は、ＣＤ４０ＬＧ（ＴＮＦＳＦ５）；ＣＤ７０（ＴＮＦＳＦ７）；ＥＤＡ；ＦＡＳＬＧ（ＴＮＦＳＦ６）；ＬＴＡ（ＴＮＦＳＦ１）；ＬＴＢ（ＴＮＦＳＦ３）；ＴＮＦ、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０Ｌ）；ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ１５３）；ＴＮＦＳＦ９；ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）；ＴＮＦＳＦ１１（ＲＡＮＫＬ）；ＴＮＦＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ）；ＴＮＦＳＦ１３；ＴＮＦＳＦ１３Ｂ；ＴＮＦＳＦ１４；ＴＮＦＳＦ１５；ＴＮＦＳＦ１８、を含む。
モノカインはサイトカインであり、モノカインは、主に単球およびマクロファージによって、産生される。モノカインの例は、ＩＬ−１、ＴＮＦアルファ、インターフェロンアルファおよびインターフェロンベータ、ならびにコロニー刺激因子、を含む。
コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）は、分泌された糖タンパク質であり、造血幹細胞の表面上において受容体タンパク質に結合し、その結果、細胞が増殖することおよび特定の種類の血液細胞に分化することを引き起こし得る、細胞内情報伝達経路を活性化する。他の、造血微細環境の膜結合物質と対照的に、コロニー刺激因子は、通常、可溶性である。これは、ときどき、ＣＳＦｓの定義として用いられる。コロニー刺激因子は、パラクリン、エンドクリン、またはオートクリンの情報伝達によって伝達する。コロニー刺激因子の例は、ＣＳＦ１（「マクロファージコロニー刺激因子」としても知られている）、ＣＳＦ２（「顆粒球マクロファージコロニー刺激因子」；ＧＭ−ＣＳＦおよびサルグラモスチムとしても知られている）、ＣＳＦ３（「顆粒球コロニー刺激因子」；Ｇ−ＣＳＦおよびフィルグラスチムとしても知られている）、および、プロメガポエチンのような合成のＣＳＦｓ、を含む。
本発明との関連において、特に、サイトカインにおける２つの異なる、重複しない部位に対して結合する２つの異なるドメインを有する多重特異性の、抗サイトカイン（好ましくは抗ＧＭ−ＣＳＦ）抗体、が結合するサイトカインは、コロニー刺激因子またはインターフェロンであることが好ましい。コロニー刺激因子のうちで、天然に存在するＣＳＦｓが好ましく（特にＣＳＦ１、ＣＳＦ２（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＣＳＦ３（Ｇ−ＣＳＦ））、また、ＧＭ−ＣＳＦがより好ましい。インターフェロンのうちで、Ｉ型およびＩＩ型インターフェロンが好ましく、Ｉ型インターフェロンがより好ましく、インターフェロンβがさらにより好ましい。従って、サイトカインは、好ましくはＧＭ−ＣＳＦまたはインターフェロンベータであり、より好ましいサイトカインはＧＭ−ＣＳＦである。
（リンカー）
好ましくは、本発明に係る抗体またはその抗原結合断片は、さらに以下を含んでいる：
（ｃ）少なくとも１つのリンカー。
一般的に、本発明に係る多重特異性の抗サイトカイン（好ましくは抗ＧＭ−ＣＳＦ）抗体、の２つの構成要素の間の連結は、直接的であってもよく、または間接的であってもよい。すなわち、２つの構成要素は直接的に隣接するか、または２つの構成要素は、複合体の付加的な構成要素によって、例えばリンカーによって、連結されてもよい。特に、本発明に係る多重特異性抗体のいくつかの構成要素は、他の構成要素がリンカーによって連結されるのに対して、直接的に連結されてもよい。好ましくは、本発明に係る多重特異性抗体は、例えば、２つのＶＨ配列、２つのＶＬ配列、ならびに／またはＶＨ配列およびＶＬ配列の間の重鎖において、リンカーを含んでいる（「ＶＨ配列」は単一特異性抗体の重鎖に由来し、従って、たとえそれが本発明に係る多重特異性抗体の重鎖または軽鎖の中に存在しているかもしれないとしても、「ＶＨ」と称される。また、「ＶＬ配列」は単一特異性抗体の軽鎖に由来し、従って、たとえそれが本発明に係る多重特異性抗体の重鎖または軽鎖の中に存在しているかもしれないとしても、「ＶＬ」と称される。）。従って、軽鎖において、リンカーは、好ましくは、２つのＶＨ配列、２つのＶＬ配列、ならびに／またはＶＨ配列およびＶＬ配列の間で存在してもよい。さらに、リンカーが、本発明に係る多重特異性抗体の重鎖において、定常ドメイン、例えば（例えばＩｇＧ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３における）ＣＨ３、およびＶＨ／ＶＬ配列、の間で存在する場合もまた、好ましい。
本明細書に使用されるとき、用語「連結された」、「融合された」、または「融合」は、互換的に使用されてもよい。これらの用語は、化学的結合または組み換え体手段を含んでいるいかなる手段によるものであっても、２つ以上の要素または構成要素の結合を表す。化学的結合（例えばヘテロ二官能性架橋結合剤を使用する化学的結合）の方法は、技術的に知られている。好ましくは、本発明に係る抗体の構成要素は、２つ以上のタンパク質、ポリペプチド、もしくはそれらの断片の共有結合的な連結または付着によって、例えばそれらの個々のペプチド骨格を介して、例えばそれらの構成要素またはペプチド断片をコードしている単一のタンパク質分子の発現を通して、連結される。好ましい融合はインフレームである。すなわち、コードしている核酸分子のレベル上で、２つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、本来の複数のＯＲＦの正確なリーディングフレームを維持する方法において、融合され、連続的なより長いＯＲＦを形成する。従って、結果として生じる組み換え融合タンパク質は、本来の複数のＯＲＦによってコードされたポリペプチドに対応する２つ以上のタンパク質断片（当該断片は、自然状態では、本来ならそのようにして結合されない）、を含んでいる単一のポリペプチドである。リーディングフレームは、従って、融合された遺伝子の断片の全体にわたって連続的に作製されるけれども、タンパク質断片は、例えば、（インフレームの）ペプチドリンカーによって、物理的にまたは空間的に分離されてもよい。
従って、多重特異性抗体の２つの構成要素を連結するリンカーは、ペプチドリンカーであってもよい。代替的に、リンカーはまた、非ペプチド性、例えば架橋結合剤、であってもよいが、ペプチドリンカーが好ましい。
非ペプチド性スペーサーは、エステル、チオエステル、およびジスルフィドを含み得るか、またはエステル、チオエステル、およびジスルフィドであってもよい。ペプチドまたはタンパク質の架橋結合のための架橋結合剤は、例えば、（ｉ）アミンとアミンとの架橋結合剤であり、例えば、第一級アミンの選択的結合のための、ＮＨＳ−エステルおよびイミドエステル反応基に基づくホモ二官能性アミン特異的タンパク質架橋結合試薬；短期および長期において有効であり、開裂可能であり、不可逆的であり、膜透過性であり、ならびに、細胞表面多様である；（ｉｉ）スルフィドリルと炭水化物との架橋結合剤であり、例えば、共有結合的な架橋結合の結合および形成のための、マレイミドならびにヒドラジド反応基に基づく架橋結合試薬；（ｉｉｉ）スルフィドリルとスルフィドリルとの架橋結合剤であり、例えば、安定したチオエーテル結合を形成するための、タンパク質およびペプチドチオール（還元されたシステイン）の選択的かつ共有結合的な架橋結合のための、マレイミドもしくはピリジルジチオール反応基に基づくホモ二官能性スルフィドリル特異的架橋結合試薬；（ｉｖ）光反応性架橋結合剤であり、例えば、２段階活性化を介して受容体−リガンド相互作用複合体に関与する、タンパク質、核酸および他の分子構造を結合するための、アリールアジド、ジアジリン、ならびに他の光−反応性（光−活性型）化学的ヘテロ二官能性架橋結合試薬；（ｖ）アミンとスルフィドリルとの架橋結合剤であり、例えば、タンパク質および他の分子の、第一級アミン（リジン）ならびにスルフィドリル（システイン）基の間の結合のためのヘテロ二官能性タンパク質架橋結合試薬；スペーサーアームの異なる長さおよび型が利用可能である；ならびに（ｖｉ）アミンとアミンとの架橋結合剤であり、例えば、カルボキシルとアミンとの架橋結合剤であり、例えば、カルボキシル基（グルタマート、アスパルタート、Ｃ末端）を第一級アミン（リジン、Ｎ末端）に結合するための、カルボジイミド架橋結合試薬、ＤＤＣおよびＥＤＣ（ＥＤＡＣ）、かつまた、アミン結合のための、カルボキシラートの安定した活性化のためのＮヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）。
ペプチド性リンカーは、好ましくは、約１〜３０アミノ酸から構成され、それによって、「短いリンカー」は、好ましくは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸から、より好ましくは、約１、２、３、４、５、または６アミノ酸から、それ以上に好ましくは４〜６アミノ酸から、特に好ましくは５アミノ酸から、構成され、これは、好ましくは、配列番号１４３またはその機能的な配列バリアントにしたがってもよい。対照的に、「長いリンカー」は、好ましくは約１０〜３０アミノ酸から、より好ましくは約１２〜２５アミノ酸から、および、それ以上に好ましくは約１４〜２０アミノ酸から、構成される。特に好ましい長いリンカーは、１５〜１７アミノ酸、好ましくは１６アミノ酸、を有し、より好ましくは、配列番号１４４またはその機能的な配列バリアントにしたがう。本発明に係る多重特異性抗体において、長いリンカーは、好ましくは、ＶＨ配列と対応するＶＬ配列と（「対応する」は、本明細書中では、一緒にエピトープ結合部位を形成しているＶＨおよびＶＬ配列、を指す）、例えば、同一の単一特異性抗体に由来するＶＨ配列とＶＬ配列と、を連結する。短いリンカーは、好ましくは、ＶＨ／ＶＬ配列と、例えば異なる単一特異性抗体からの、「対応していない」ＶＨ／ＶＬ配列と、を連結してもよく、および／または好ましくは、定常ドメインを、例えば（例えばＩｇＧ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３における）ＣＨ３を、ＶＨ／ＶＬ配列と連結してもよい。
好ましいリンカーは、配列番号１４３もしくは配列番号１４４もしくはそれらの機能的な配列バリアントにしたがうアミノ酸配列を含んでいるか、または当該アミノ酸配列からなる。
代替的に、ペプチド性リンカーのアミノ酸配列は、Ｎ末端またはＣ末端のフランキング領域のアミノ酸配列と同一であってもよい。代替的に、ペプチド性リンカーは、例えば上記天然のフランキング領域の保存されたアミノ酸置換の結果生じるアミノ酸配列のような、非天然のアミノ酸配列から構成され得る。特定の実施形態において、ペプチド性スペーサーは、いずれのＣｙｓ（Ｃ）残基も含んでいない。好ましい実施形態において、リンカー配列は、Ｇｌｙ（Ｇ）またはβアラニン残基（Ａ）を、少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも４０％、それ以上に好ましくは少なくとも５０％、および特に好ましくは少なくとも７０％、含んでいる。より好ましくは、リンカー配列は、Ｇｌｙ（Ｇ）残基を、少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも４０％、それ以上に好ましくは少なくとも５０％、および特に好ましくは少なくとも７０％、含んでいる。適切なリンカー配列は、当業者によって容易に、選択され得、かつ調製され得る。リンカー配列は、Ｄおよび／またはＬアミノ酸から構成されてもよい。
（抗体の構成および構築型）
原則的には、本発明に係る多重特異性抗体は、当該抗体が、サイトカイン（例えばＧＭ−ＣＳＦ）における、少なくとも２つの異なる、重複しない部位に対して特異的に結合する少なくとも２つの異なるドメイン、および、Ｆｃ部分、を含んでいる限り、任意の抗体形式であってもよい。
例えば、抗体は、Ｆｃ部分を有する多重特異性抗体断片であってもよい。特に、Ｆｃ部分を有する二重特異性抗体断片についての例は、タンデムｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−Ｆｃノブ−イントゥ−ホール（knobs-into-holes）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ、およびｓｃＤｉａｂｏｄｙ−Ｆｃであり、これらは、例えば、Chan, A.C. and Carter, P.J. (2010) Nat Rev Immu 10: 301−316の図３ｂに示され、また、上記文献中に説明されている。
本発明に係る抗体は、任意の免疫グロブリンクラス（例えばＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭなど）およびサブクラス（例えばＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４など）に基づいていてもよい。好ましくは、本発明に係る多重特異性抗体は、ＩｇＧ（「ＩｇＧ型」とも称される）に基づいている。ＩｇＧクラスの範囲内において、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブクラスに基づいていてもよく、それによって、ＩｇＧ１（「ＩｇＧ１型」とも称される）に基づいている抗体が好ましい。好ましくは、本発明の抗体は、κ軽鎖またはλ軽鎖を有していてもよい。
ＩｇＧに基づく多重特異性抗体形式は、当業者によく知られている。好ましい、ＩｇＧに基づく抗体形式は、例えば、ハイブリッドハイブリドーマ、一般的な軽鎖を有するノブ−イントゥ−ホール、様々なＩｇＧ−ｓｃＦｖ形式、様々なｓｃＦｖ−ＩｇＧ形式、ツー−イン−ワンＩｇＧ（two-in-one IgG）、二重（または多重、それぞれ、例えば、３回、４回、など）ＶドメインＩｇＧ、ＩｇＧ−Ｖ、およびＶ−ＩｇＧを含み、これらは、二重特異性のＩｇＧに基づく抗体、または結果としてＩｇＧ型の多重特異性抗体となるそれらの任意の組み合わせについて、Chan, A.C. and Carter, P.J. (2010) Nat Rev Immu 10: 301−316の図３ｃに示され、また、上記文献中に説明されている。他の好ましい、ＩｇＧに基づく抗体形式は、例えば、ＤＡＦ、クロスＭａｂ、ＩｇＧ−ｄｓｓｃＦｖ、ＤＶＤ、ＩｇＧ−ｄｓＦＶ、ＩｇＧ−ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖおよびＦｖ２−Ｆｃを含み、これらはWeidle U.H. et al. (2013) Cancer Genomics and Proteomics 10: 1 − 18の図１Ａに示され、また、上記文献中に説明されている。
好ましくは、本発明に係る多重特異性抗体またはその抗原結合断片は、ＩｇＧ型であり、好ましくはＩｇＧ１型であり、より好ましくは、ＩｇＧ１ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３型の重鎖定常領域とＩｇＧ ＧＫ型の軽鎖定常領域とを含んでおり、それ以上に好ましくは、配列番号１４０もしくはその機能的な配列バリアントにしたがうアミノ酸配列を含んでいるかまたは当該アミノ酸配列からなるＩｇＧ１ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３型、の重鎖定常領域と、配列番号１４１もしくはその機能的な配列バリアントにしたがうアミノ酸配列を含んでいるかまたは当該アミノ酸配列からなるＩｇＧ ＧＫ型、の軽鎖定常領域と、を含んでいる。
ＩｇＧは２つの天然のエピトープ結合部位を有しているので、さらなるエピトープ結合部位、すなわち「非天然の」エピトープ結合部位は、ＩｇＧ抗体形式を構築している１つまたは両方の重鎖の、ＣＨ３ドメインに対して、好ましくはＣＨ３ドメインのＣ末端に対して、好ましくは結合される。代替的に、さらなるエピトープ結合部位、すなわち「非天然の」エピトープ結合部位は、ＩｇＧ抗体形式の天然のエピトープ結合部位の、軽鎖可変領域の１つもしくは両方に対して、好ましくは軽鎖可変領域の１つもしくは両方のＮ末端に対して、および／またはＩｇＧ抗体形式の天然のエピトープ結合部位の、重鎖可変領域の１つのもしくは両方に対して、好ましくは重鎖可変領域の１つもしくは両方のＮ末端に対して、好ましくは結合される。代替的に、さらなるエピトープ結合部位、すなわち「非天然の」エピトープ結合部位は、ＩｇＧ抗体形式を構築している１つまたは両方の重鎖の、ＣＨ３ドメインに対して、好ましくはＣＨ３ドメインのＣ末端に対して、および、ＩｇＧ抗体形式の天然のエピトープ結合部位の、軽鎖可変領域の１つもしくは両方に対して、好ましくは軽鎖可変領域の１つもしくは両方のＮ末端に対して、好ましくは結合される。代替的に、さらなるエピトープ結合部位、すなわち「非天然の」エピトープ結合部位は、ＩｇＧ抗体形式を構築している１つまたは両方の重鎖の、ＣＨ３ドメインに対して、好ましくはＣＨ３ドメインのＣ末端に対して、および、ＩｇＧ抗体形式の天然のエピトープ結合部位の、重鎖可変領域の１つもしくは両方に対して、好ましくは重鎖可変領域の１つもしくは両方のＮ末端に対して、好ましくは結合される。
ＩｇＧ抗体形式の任意のそのような付着部位において、好ましくは、天然のエピトープ結合部位の軽鎖および／もしくは重鎖可変領域、ならびに／または重鎖のＣＨ３ドメイン、において、１つ以上の、例えば２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の（複数の）非天然のエピトープ結合部位は付着されてもよく、それによって、１つまたは２つの（複数の）非天然のエピトープ結合部位の付着が好ましく、１つの非天然のエピトープ結合部位の付着がより好ましい。
例えば、本発明に係る抗体がＩｇＧ形式の二重特異性抗体である場合、一方の「特異性」が、好ましくは、天然のエピトープ結合部位によって提供され、他方の「特異性」が、好ましくは、非天然のエピトープ結合部位によって提供される。特に、非天然のエピトープ結合部位は、その後、任意の上述した付着部位に対して付着されてもよく、好ましくは、天然のエピトープ結合部位の軽鎖可変領域、天然のエピトープ結合部位の重鎖可変領域、またはＩｇＧ抗体形式の重鎖のＣＨ３ドメイン、に対して付着されてもよい。
例えば、本発明に係る抗体がＩｇＧ抗体形式の三重特異性抗体である場合、一つの「特異性」（「特異性１」）は、好ましくは、天然のエピトープ結合部位によって提供され、かつ他の２つの「特異性」（「特異性２」および「特異性３」）は、好ましくは、非天然のエピトープ結合部位によって提供される。それによって、「特異性２」のための非天然のエピトープ結合部位は、任意の上述した付着部位に対して好ましくは付着されてもよく、好ましくは、天然のエピトープ結合部位の軽鎖可変領域、天然のエピトープ結合部位の重鎖可変領域、またはＩｇＧ抗体形式の重鎖のＣＨ３ドメイン、に対して好ましくは付着されてもよい。その一方、「特異性３」のための非天然のエピトープ結合部位は、好ましくは、任意の他の上述した付着部位に対して、すなわち、「特異性２」のための非天然のエピトープ結合部位が付着されていない任意の付着部位に対して、付着されてもよい。代替的に、他の２つの「特異性」（「特異性２」および「特異性３」）のための非天然のエピトープ結合部位は、好ましくは、同一の付着部位に対して付着されてもよく、例えば、他の２つの「特異性」（「特異性２」および「特異性３」）のための非天然のエピトープ結合部位は、両方ともに、天然のエピトープ結合部位の軽鎖可変領域に対して結合されるか、または他の２つの「特異性」（「特異性２」および「特異性３」）のための非天然のエピトープ結合部位は、両方ともに、天然のエピトープ結合部位の重鎖可変領域に対して結合されるか、または他の２つの「特異性」（「特異性２」および「特異性３」）のための非天然のエピトープ結合部位は、両方ともに、ＩｇＧ抗体形式の重鎖のＣＨ３ドメインに対して結合される。この場合、すなわち、他の２つの「特異性」（「特異性２」および「特異性３」）のための非天然のエピトープ結合部位が、両方とも、同一の付着部位に対して結合される場合、「特異性２」のための非天然のエピトープ結合部位、および、「特異性３」のための非天然のエピトープ結合部位は、好ましくは、連続して配置され、すなわち、一方の非天然のエピトープ結合部位のみが、直接的に（または本明細書中に記載されたようなリンカーを介して）、付着部位に対して付着されるが、他方の非天然のエピトープ結合部位は、好ましくは、一番目の非天然のエピトープ結合部位に対して連結される。
特に、本発明に係る抗体は、好ましくは、エピトープ結合部位のそれぞれを、２コピー含んでおり、それによって、当該２コピーは、ＩｇＧに基づく抗体の第一のおよび第二の重鎖の対応する位置において付着されることが好ましい。例えば（ｉ）一方のコピーがＩｇＧ抗体形式の第一の重鎖の、天然のエピトープ結合部位の重鎖可変領域に対して結合され、かつ他方のコピーがＩｇＧ抗体形式の第二の重鎖の、天然のエピトープ結合部位の重鎖可変領域に対して結合されるか；または（ｉｉ）一方のコピーがＩｇＧ抗体形式の第一の軽鎖の、天然のエピトープ結合部位の軽鎖可変領域に対して結合され、かつ他方のコピーがＩｇＧ抗体形式の第二の軽鎖の、天然のエピトープ結合部位の軽鎖可変領域に対して結合されるか；または（ｉｉｉ）一方のコピーがＩｇＧ抗体形式の第一の重鎖のＣＨ３ドメインに対して結合され、かつ他方のコピーがＩｇＧ抗体形式の第一の軽鎖のＣＨ３ドメインに対して結合されること、が好ましい。
本発明に係る多重特異性抗体についての好ましい抗体形式、およびそれらの構築は、米国公開特許公報第ＵＳ２００９／０１５５２７５Ａ１号中に説明されており、これらは、特に、抗体の定常ドメインのＦｃ領域を含んでいる、多重特異性のエピトープ結合タンパク質に関連する。従って、米国公開特許公報第ＵＳ２００９／０１５５２７５Ａ１号に開示されている抗体形式は、好ましくは、本発明に係る多重特異性抗体に使用される。
本発明に係る抗体の例示的な構築型は、構築型「Ｂｓ１」、「Ｂｓ２」、「Ｂｓ３」、「Ｔｓ１」、「Ｔｓ２」および「Ｔｓ３」を含み、これらは図４に示される。従って、本発明に係る多重特異性抗体またはその抗原結合断片は、好ましくは、Ｂｓ１、Ｂｓ２、Ｂｓ３、Ｔｓ１、Ｔｓ２およびＴｓ３を含んでいる群から選択される構築型に基づいている。より好ましくは、本発明に係る多重特異性抗体またはその抗原結合断片は、構築型Ｔｓ３に基づいており、好ましい抗体またはその抗原結合断片は、構築型Ｔｓ３に基づく三重特異性抗体である。
構築型「Ｂｓ１」は、ＩｇＧに基づく、好ましくはＩｇＧ１に基づく、二重特異性の、４価の抗体形式である。Ｂｓ１の重鎖は、（Ｎ末端からＣ末端までこの順で）以下を含んでいる：
（ａ）例えば第一の単一特異性抗体の重鎖または軽鎖に由来する、第一の可変領域；好ましくは、第一の単一特異性抗体に由来する、ＶＨ配列、すなわち、重鎖可変領域；
（ｂ）第一の可変領域（ａ）と共に第一のエピトープ結合部位を形成している、対応する第二の可変領域、例えば、第一の単一特異性抗体に由来する、対応する重鎖または軽鎖可変領域；好ましくは、第一の単一特異性抗体に由来する、ＶＬ配列、すなわち、軽鎖可変領域；
（ｃ）例えば第二の単一特異性抗体の重鎖に由来する、第三の可変領域；好ましくは、第二の単一特異性抗体に由来する、ＶＨ配列、すなわち、重鎖可変領域；および
（ｄ）ＩｇＧ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３。
好ましくは、構成要素（ａ）および（ｂ）は長いリンカーによって連結され、構成要素（ｂ）および（ｃ）は短いリンカーによって連結され、ならびに、構成要素（ｃ）および（ｄ）は直接的に連結される。Ｂｓ１の軽鎖は、（Ｎ末端からＣ末端までこの順で）以下を含んでいる：
（ｅ）第三の可変領域（ｃ）と共に第二のエピトープ結合部位を形成している、第四の可変領域、例えば、第二の単一特異性抗体に由来する、対応する軽鎖可変領域；好ましくは、第二の単一特異性抗体に由来する、ＶＬ配列、すなわち、軽鎖可変領域；および
（ｆ）ＩｇＧ ＣＫ またはＩＧ ＣＬ；好ましくはＩｇ ＣＫ。
好ましくは、構成要素（ｅ）および（ｆ）は直接的に連結される。Ｂｓ１はＩｇＧに基づいているので、Ｂｓ１は２つの同一の重鎖、および２つの同一の軽鎖を含んでいる。本明細書に使用されるとき、抗体における位置であり、Ｂｓ１における第一のエピトープ結合部位を形成しているＣＤＲ／可変領域（構成要素（ａ）および（ｂ））が配置される位置は、「位置Ａ」と称され、かつ抗体における位置であり、Ｂｓ１における第二のエピトープ結合部位を形成しているＣＤＲ／可変領域（構成要素（ｃ）および（ｄ））が配置される位置は、「位置Ｂ」と称される（図４を参照せよ）。構築において、（第二の）単一特異性抗体からの重鎖および軽鎖可変領域が、多重特異性抗体の、重鎖および軽鎖にそれぞれ用いられている、当該（第二の）単一特異性抗体は、「足場」としての機能を果たしてもよい。構築型「Ｂｓ１」の好ましい実施形態、および構築型「Ｂｓ１」の構築は、米国公開特許公報第ＵＳ２００９／０１５５２７５Ａ１号、図４Ｅおよび図４Ｆならびに対応する記述において、説明されている。
構築型「Ｂｓ２」は、ＩｇＧに基づく、好ましくはＩｇＧ１に基づく、二重特異性の、４価の抗体形式である。Ｂｓ２の重鎖は、（Ｎ末端からＣ末端までこの順で）以下を含んでいる：
（ａ）例えば第一の単一特異性抗体の重鎖に由来する、第一の可変領域；好ましくは、第一の単一特異性抗体に由来する、ＶＨ配列、すなわち、重鎖可変領域；および
（ｂ）ＩｇＧ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３。
好ましくは、構成要素（ａ）および（ｂ）は直接的に連結される。Ｂｓ２の軽鎖は、（Ｎ末端からＣ末端までこの順で）以下を含んでいる：
（ｃ）例えば第二の単一特異性抗体の重鎖または軽鎖に由来する、第二の可変領域；好ましくは、第二の単一特異性抗体に由来する、ＶＨ配列、すなわち、重鎖可変領域；
（ｄ）第二の可変領域（ｃ）と共に第一のエピトープ結合部位を形成している、対応する第三の可変領域、例えば、第二の単一特異性抗体に由来する、対応する重鎖または軽鎖可変領域；好ましくは、第二の単一特異性抗体に由来する、ＶＬ配列、すなわち、軽鎖可変領域；
（ｅ）第一の可変領域（ａ）と共に第二のエピトープ結合部位を形成している、第四の可変領域、例えば、第一の単一特異性抗体に由来する、対応する軽鎖可変領域；好ましくは、第一の単一特異性抗体に由来する、ＶＬ配列、すなわち、軽鎖可変領域；および
（ｆ）ＩｇＧ ＣＫ またはＩＧ ＣＬ；好ましくはＩｇ ＣＫ。
好ましくは、構成要素（ｃ）および（ｄ）は長いリンカーによって連結され、構成要素（ｄ）および（ｅ）は短いリンカーによって連結され、ならびに、構成要素（ｅ）および（ｆ）は直接的に連結される。Ｂｓ２はＩｇＧに基づいているので、Ｂｓ２は２つの同一の重鎖、および２つの同一の軽鎖を含んでいる。本明細書に使用されるとき、抗体における位置であり、Ｂｓ２における第一のエピトープ結合部位を形成しているＣＤＲ／可変領域（構成要素（ｃ）および（ｄ））が配置される位置は、「位置Ａ」と称され、かつ抗体における位置であり、Ｂｓ２における第二のエピトープ結合部位を形成しているＣＤＲ／可変領域（構成要素（ａ）および（ｅ））が配置される位置は、「位置Ｂ」と称される（図４を参照せよ）。構築において、（第一の）単一特異性抗体の重鎖および軽鎖可変領域が、多重特異性抗体の、重鎖および軽鎖にそれぞれ用いられている、当該（第一の）単一特異性抗体は、「足場」としての機能を果たしてもよい。構築型「Ｂｓ１」の好ましい実施形態、および構築型「Ｂｓ２」の構築は、米国公開特許公報第ＵＳ２００９／０１５５２７５Ａ１号、図４Ｃおよび図４Ｄならびに対応する記述において、説明されている。
構築型「Ｂｓ３」は、ＩｇＧに基づく、好ましくはＩｇＧ１に基づく、二重特異性の、４価の抗体形式である。Ｂｓ３の重鎖は、（Ｎ末端からＣ末端までこの順で）以下を含んでいる：
（ａ）例えば第一の単一特異性抗体の重鎖に由来する、第一の可変領域；好ましくは、第一の単一特異性抗体に由来する、ＶＨ配列、すなわち、重鎖可変領域；
（ｂ）ＩｇＧ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；
（ｃ）例えば第二の単一特異性抗体の重鎖または軽鎖に由来する、第二の可変領域；好ましくは、第二の単一特異性抗体に由来する、ＶＨ配列、すなわち、重鎖可変領域；および
（ｄ）第二の可変領域（ｃ）と共に第一のエピトープ結合部位を形成している、対応する第三の可変領域、例えば、第二の単一特異性抗体に由来する、対応する重鎖または軽鎖可変領域；好ましくは、第二の単一特異性抗体に由来する、ＶＬ配列、すなわち、軽鎖可変領域。
好ましくは、構成要素（ａ）および（ｂ）は直接的に連結され、構成要素（ｂ）および（ｃ）は短いリンカーによって連結され、ならびに、構成要素（ｃ）および（ｄ）は長いリンカーによって連結される。Ｂｓ３の軽鎖は、（Ｎ末端からＣ末端までこの順で）以下を含んでいる：
（ｅ）第一の可変領域（ａ）と共に第二のエピトープ結合部位を形成している、第四の可変領域、例えば、第一の単一特異性抗体に由来する、対応する軽鎖可変領域；好ましくは、第一の単一特異性抗体に由来する、ＶＬ配列、すなわち、軽鎖可変領域；および
（ｆ）ＩｇＧ ＣＫ またはＩＧ ＣＬ；好ましくはＩｇ ＣＫ。
好ましくは、構成要素（ｅ）および（ｆ）は直接的に結合される。Ｂｓ３はＩｇＧに基づいているので、Ｂｓ３は２つの同一の重鎖、および２つの同一の軽鎖を含んでいる。本明細書に使用されるとき、抗体における位置であり、Ｂｓ３における第一のエピトープ結合部位を形成しているＣＤＲ／可変領域（構成要素（ｃ）および（ｄ））が配置される位置は、「位置Ｃ」と称され、かつ抗体における位置であり、Ｂｓ３における第二のエピトープ結合部位を形成しているＣＤＲ／可変領域（構成要素（ａ）および（ｅ））が配置される位置は、「位置Ｂ」と称される（図４を参照せよ）。構築において、（第一の）単一特異性抗体の重鎖および軽鎖可変領域が、多重特異性抗体の、重鎖および軽鎖にそれぞれ用いられている、当該（第一の）単一特異性抗体は、「足場」としての機能を果たしてもよい。構築型「Ｂｓ３」（しかし、本発明に基づかない、他の「特異性」、すなわちエピトープ結合部位、を有する構築型「Ｂｓ３」）の原理、および当該構築型「Ｂｓ３」の構築は、また、Dimasi, N., Gao, C., Fleming, R., Woods, R.M., Yao, X.-T., Shirinian, L., Kiener, P.A., and Wu, H. (2009). The design and characterization of oligospecific antibodies for simultaneous targeting of multiple disease mediators. J Mol Biol 393, 672−692：図１（ｄ）（「Ｂｓ３Ａｂ」）、および対応する記述において説明されている。
構築型「Ｔｓ１」は、ＩｇＧに基づく、好ましくはＩｇＧ１に基づく、三重特異性の、６価の抗体形式である。Ｔｓ１の重鎖は、（Ｎ末端からＣ末端までこの順で）以下を含んでいる：
（ａ）例えば第一の単一特異性抗体の重鎖に由来する、第一の可変領域；好ましくは、第一の単一特異性抗体に由来する、ＶＨ配列、すなわち、重鎖可変領域；
（ｂ）ＩｇＧ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；
（ｃ）例えば第二の単一特異性抗体の重鎖または軽鎖に由来する、第二の可変領域；好ましくは、第二の単一特異性抗体に由来する、ＶＨ配列、すなわち、重鎖可変領域；
（ｄ）第二の可変領域（ｃ）と共に第一のエピトープ結合部位を形成している、対応する第三の可変領域、例えば、第二の単一特異性抗体に由来する、対応する重鎖または軽鎖可変領域；好ましくは、第二の単一特異性抗体に由来する、ＶＬ配列、すなわち、軽鎖可変領域；
（ｅ）例えば第三の単一特異性抗体の重鎖または軽鎖に由来する、第四の可変領域；好ましくは、第三の単一特異性抗体に由来する、ＶＨ配列、すなわち、重鎖可変領域；および
（ｆ）第四の可変領域（ｅ）と共に第二のエピトープ結合部位を形成している、対応する第五の可変領域、例えば、第三の単一特異性抗体に由来する、対応する重鎖または軽鎖可変領域；好ましくは、第三の単一特異性抗体に由来する、ＶＬ配列、すなわち、軽鎖可変領域。
好ましくは、構成要素（ａ）および（ｂ）は直接的に連結され、構成要素（ｂ）および（ｃ）ならびに構成要素（ｄ）および（ｅ）は短いリンカーによって連結され、ならびに、構成要素（ｃ）および（ｄ）ならびに構成要素（ｅ）および（ｆ）は長いリンカーによって連結される。Ｔｓ１の軽鎖は、（Ｎ末端からＣ末端までこの順で）以下を含んでいる：
（ｇ）第一の可変領域（ａ）と共に第三のエピトープ結合部位を形成している、第六の可変領域、例えば、第一の単一特異性抗体に由来する、対応する軽鎖可変領域；好ましくは、第一の単一特異性抗体に由来する、ＶＬ配列、すなわち、軽鎖可変領域；および
（ｈ）ＩｇＧ ＣＫ またはＩＧ ＣＬ；好ましくはＩｇ ＣＫ。
好ましくは、構成要素（ｇ）および（ｈ）は直接的に連結される。Ｔｓ１はＩｇＧに基づいているので、Ｔｓ１は２つの同一の重鎖、および２つの同一の軽鎖を含んでいる。本明細書に使用されるとき、抗体における位置であり、Ｔｓ１における第一のエピトープ結合部位を形成しているＣＤＲ／可変領域（構成要素（ｃ）および（ｄ））が配置される位置、ならびに、抗体における位置であり、Ｔｓ１における第二のエピトープ結合部位を形成しているＣＤＲ／可変領域（構成要素（ｅ）および（ｆ））が配置される位置、は「位置Ｃ」と称され、かつ抗体における位置であり、Ｔｓ１における第三のエピトープ結合部位を形成しているＣＤＲ／可変領域（構成要素（ａ）および（ｇ））が配置される位置は、「位置Ｂ」と称される（図４を参照せよ）。構築において、（第一の）単一特異性抗体の重鎖および軽鎖可変領域が、多重特異性抗体の、重鎖および軽鎖にそれぞれ用いられている、当該（第一の）単一特異性抗体は、「足場」としての機能を果たしてもよい。構築型「Ｔｓ１」の好ましい実施形態、および構築型「Ｔｓ１」の構築は、米国公開特許公報第ＵＳ２００９／０１５５２７５Ａ１号、図３Ａおよび図３Ｂならびに対応する記述において、説明されている。
構築型「Ｔｓ２」は、ＩｇＧに基づく、好ましくはＩｇＧ１に基づく、三重特異性の、６価の抗体形式である。Ｔｓ２の重鎖は、（Ｎ末端からＣ末端までこの順で）以下を含んでいる：
（ａ）例えば第一の単一特異性抗体の重鎖または軽鎖に由来する、第一の可変領域；好ましくは、第一の単一特異性抗体に由来する、ＶＨ配列、すなわち、重鎖可変領域；
（ｂ）第一の可変領域（ａ）と共に第一のエピトープ結合部位を形成している、対応する第二の可変領域、例えば、第一の単一特異性抗体に由来する、対応する重鎖または軽鎖可変領域；好ましくは、第一の単一特異性抗体に由来する、ＶＬ配列、すなわち、軽鎖可変領域；
（ｃ）例えば第二の単一特異性抗体の重鎖に由来する、第三の可変領域；好ましくは、第二の単一特異性抗体に由来する、ＶＨ配列、すなわち、重鎖可変領域；および
（ｄ）ＩｇＧ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３。
好ましくは、構成要素（ａ）および（ｂ）は長いリンカーによって連結され、構成要素（ｂ）および（ｃ）は短いリンカーによって連結され、ならびに、構成要素（ｃ）および（ｄ）は直接的に連結される。Ｔｓ２の軽鎖は、（Ｎ末端からＣ末端までこの順で）以下を含んでいる：
（ｅ）例えば第三の単一特異性抗体の重鎖または軽鎖に由来する、第四の可変領域；好ましくは、第三の単一特異性抗体に由来する、ＶＨ配列、すなわち、重鎖可変領域；
（ｆ）第四の可変領域（ｅ）と共に第二のエピトープ結合部位を形成している、対応する第五の可変領域、例えば、第三の単一特異性抗体に由来する、対応する重鎖または軽鎖可変領域；好ましくは、第三の単一特異性抗体に由来する、ＶＬ配列、すなわち、軽鎖可変領域；
（ｇ）第三の可変領域（ｃ）と共に第三のエピトープ結合部位を形成している、第六の可変領域、例えば、第二の単一特異性抗体に由来する、対応する軽鎖可変領域；好ましくは、第二の単一特異性抗体に由来する、ＶＬ配列、すなわち、軽鎖可変領域；および
（ｈ）ＩｇＧ ＣＫ またはＩＧ ＣＬ；好ましくはＩｇ ＣＫ。
好ましくは、構成要素（ｅ）および（ｆ）は長いリンカーによって連結され、構成要素（ｆ）および（ｇ）は短いリンカーによって連結され、ならびに、構成要素（ｇ）および（ｈ）は直接的に連結される。Ｔｓ２はＩｇＧに基づいているので、Ｔｓ２は２つの同一の重鎖、および２つの同一の軽鎖を含んでいる。本明細書に使用されるとき、抗体における位置であり、Ｔｓ２における第一のエピトープ結合部位を形成しているＣＤＲ／可変領域（構成要素（ａ）および（ｂ））が配置される位置、ならびに、抗体における位置であり、Ｔｓ２における第二のエピトープ結合部位を形成しているＣＤＲ／可変領域（構成要素（ｅ）および（ｆ））が配置される位置、は「位置Ａ」と称され、かつ抗体における位置であり、Ｔｓ２における第三のエピトープ結合部位を形成しているＣＤＲ／可変領域（構成要素（ｃ）および（ｇ））が配置される位置は、「位置Ｂ」と称される（図４を参照せよ）。構築において、（第二の）単一特異性抗体の重鎖および軽鎖可変領域が、多重特異性抗体の、重鎖および軽鎖にそれぞれ用いられている、当該（第二の）単一特異性抗体は、「足場」としての機能を果たしてもよい。構築型「Ｔｓ２」の好ましい実施形態、および構築型「Ｔｓ１」の構築は、米国公開特許公報第ＵＳ２００９／０１５５２７５Ａ１号、図４Ｇおよび図４Ｈならびに対応する記述において、説明されている。
構築型「Ｔｓ３」は、ＩｇＧに基づく、好ましくはＩｇＧ１に基づく、三重特異性の、６価の抗体形式である。Ｔｓ３の重鎖は、（Ｎ末端からＣ末端までこの順で）以下を含んでいる：
（ａ）例えば第一の単一特異性抗体の重鎖または軽鎖に由来する、第一の可変領域；好ましくは、第一の単一特異性抗体に由来する、ＶＨ配列、すなわち、重鎖可変領域；
（ｂ）第一の可変領域（ａ）と共に第一のエピトープ結合部位を形成している、対応する第二の可変領域、例えば、第一の単一特異性抗体に由来する、対応する重鎖または軽鎖可変領域；好ましくは、第一の単一特異性抗体に由来する、ＶＬ配列、すなわち、軽鎖可変領域；
（ｃ）例えば第二の単一特異性抗体の重鎖に由来する、第三の可変領域；好ましくは、第二の単一特異性抗体に由来する、ＶＨ配列、すなわち、重鎖可変領域；
（ｄ）ＩｇＧ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；
（ｅ）例えば第三の単一特異性抗体の重鎖または軽鎖に由来する、第四の可変領域；好ましくは、第三の単一特異性抗体に由来する、ＶＨ配列、すなわち、重鎖可変領域；および
（ｆ）第四の可変領域（ｅ）と共に第二のエピトープ結合部位を形成している、対応する第五の可変領域、例えば、第三の単一特異性抗体に由来する、対応する重鎖または軽鎖可変領域；好ましくは、第三の単一特異性抗体に由来する、ＶＬ配列、すなわち、軽鎖可変領域。
好ましくは、構成要素（ａ）および（ｂ）ならびに構成要素（ｅ）および（ｆ）は長いリンカーによって連結され、構成要素（ｂ）および（ｃ）ならびに構成要素（ｄ）および（ｅ）は短いリンカーによって連結され、ならびに、構成要素（ｃ）および（ｄ）は直接的に連結される。Ｔｓ３の軽鎖は、（Ｎ末端からＣ末端までこの順で）以下を含んでいる：
（ｅ）第三の可変領域（ｃ）と共に第三のエピトープ結合部位を形成している、第六の可変領域、例えば、第二の単一特異性抗体に由来する、対応する軽鎖可変領域；好ましくは、第二の単一特異性抗体に由来する、ＶＬ配列、すなわち、軽鎖可変領域；および
（ｆ）ＩｇＧ ＣＫ またはＩＧ ＣＬ；好ましくはＩｇ ＣＫ。
好ましくは、構成要素（ｅ）および（ｆ）は直接的に連結される。Ｔｓ３はＩｇＧに基づいているので、Ｔｓ３は２つの同一の重鎖、および２つの同一の軽鎖を含んでいる。本明細書に使用されるとき、抗体における位置であり、Ｔｓ３における第一のエピトープ結合部位を形成しているＣＤＲ／可変領域（構成要素（ａ）および（ｂ））が配置される位置は、「位置Ａ」と称され、抗体における位置であり、Ｔｓ３における第二のエピトープ結合部位を形成しているＣＤＲ／可変領域（構成要素（ｅ）および（ｆ））が配置される位置は、「位置Ｃ」と称され、かつ抗体における位置であり、Ｔｓ３における第三のエピトープ結合部位を形成しているＣＤＲ／可変領域（構成要素（ｃ）および（ｄ））が配置される位置は、「位置Ｂ」と称される（図４を参照せよ）。構築において、（第二の）単一特異性抗体の重鎖および軽鎖可変領域が、多重特異性抗体の、重鎖および軽鎖にそれぞれ用いられている、当該（第二の）単一特異性抗体は、「足場」としての機能を果たしてもよい。
構築型Ｂｓ１、Ｂｓ２、Ｂｓ３、Ｔｓ１、およびＴｓ２の構築についてのさらなる情報のために、文献、米国公開特許公報第２００９／０１５５２７５Ａ１号およびDimasi, N., Gao, C., Fleming, R., Woods, R.M., Yao, X.-T., Shirinian, L., Kiener, P.A., and Wu, H. (2009): The design and characterization of oligospecific antibodies for simultaneous targeting of multiple disease mediators; J Mol Biol 393, 672−692が、用いられてもよい。これらの文献において概略が説明された構築の原理は、新規の構築型Ｔｓ３に適合されてもよく、その後適用されてもよい。
（中和）
好ましくは、本発明に係る多重特異性抗体またはその抗原結合断片は、サイトカイン（特に、ＧＭ−ＣＳＦ）の標的効果を、以下の条件の下に中和する。
（ｉ）１５０ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは１２０ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ以下、より一層好ましくは５０ｎｇ／ｍｌ以下、特に好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ９０をともなった、厳密な条件；
（ｉｉ）２０ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは１５ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ以下、より一層好ましくは５ｎｇ／ｍｌ以下、特に好ましくは１ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ９０をともなった、より程度の低い厳密な条件；
（ｉｉｉ）１６０ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは１３０ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ以下、より一層好ましくは５０ｎｇ／ｍｌ以下、特に好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ９０をともなった、より厳密な条件；および／または、
（ｉｖ）１０００ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは５００ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは２５０ｎｇ／ｍｌ以下、より一層好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ以下、特に好ましくは５０ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ９０をともなった、非常に厳密な条件。
ここで、「ｘｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ９０」とは、本発明に係る抗体またはその抗原結合断片の濃度（ｘｎｇ／ｍｌ以下）を表している。上記濃度は、サイトカイン（例えばＧＭ−ＣＳＦ）の標的効果の、９０％中和（ＩＣ９０）のために必要とされる濃度である。
一般に、抗体の機能性は、サイトカイン（例えばＧＭ−ＣＳＦ）の重要な効果（「標的効果」）を中和する能力によって評価される。中和アッセイでは、例えばサイトカイン（例えばＧＭ−ＣＳＦ）の標的効果またはウイルスの感染性を、中和するために必要とされる抗体の濃度を、決定することができる。種々の中和アッセイが、当業者に知られている。そして通常、当業者は、サイトカイン（例えばＧＭ−ＣＳＦ）およびその標的効果に応じた、中和アッセイを選択する。中和アッセイに有用なサイトカイン（例えばＧＭ−ＣＳＦ）の標的効果には、例えば、サイトカイン誘導性の増殖が含まれる。上記サイトカイン誘導性の増殖は、例えば、指標細胞株、サイトカイン誘導性のサイトカイン産生、ＴＮＦ−α誘導性のＬ９２９細胞株の致死、およびＬ９２９細胞株およびＡ５４９細胞株のウイルス感染に対するＩＦＮ−γ−防御の、サイトカイン誘導性の増殖である。
下記に、中和アッセイの原理を説明するために、中和アッセイの非限定的な例を示す。
（１）異なる濃度の試験すべき抗体（例えば希釈系列）を、例えば、マイクロタイタープレート（または他の任意の適切な容器）中に用意する；
（２）標的量のサイトカイン（すなわち、所定量のサイトカイン（例えばＧＭ−ＣＳＦ））を上記抗体に加え、適切な条件（例えば、室温または３７℃にて１時間）の下で共にインキュベートする；
（３）共にインキュベートされた抗体−サイトカイン（例えば、共にインキュベートされた抗体−ＧＭ−ＣＳＦ）を、適切な培養標的細胞に（例えば、標的細胞（例えば、単層の標的細胞）を含んでいるウェル中に）移す。そして、例えば室温または３７℃にて、所定期間（例えば、１、２、３、４、５、６または７日間）インキュベートする；
（４）その後、標的効果を定量分析し、ＩＣ９０を決定することができる。
測定される効果は、通常、量依存性である。つまり、抗体の抗体価が高いほど、標的効果の中和の度合いが高い。抗体の中和特性に応じて、ＩＣ９０の値は変化する。例えば、中和特性が大きい抗体は、例えば上記アッセイにおいて標的効果を同程度に中和するために、より少量（の抗体）しか加える必要がない。
本明細書において用いられるとき「より程度の低い厳密な条件」とは、約５０ｐｇ／ｍｌのサイトカイン（例えばＧＭ−ＣＳＦ）の最終濃度、および約１０００細胞／ウェルを表す。「厳密な条件」とは、約５０ｐｇ／ｍｌのサイトカイン（例えばＧＭ−ＣＳＦ）の最終濃度、および約１００００細胞／ウェルを表す。「より厳密な条件」とは、約５００ｐｇ／ｍｌのサイトカイン（例えばＧＭ−ＣＳＦ）の最終濃度、および約１０００細胞／ウェルを表す。「非常に厳密な条件」とは、約５００ｐｇ／ｍｌのサイトカイン（例えばＧＭ−ＣＳＦ）の最終濃度、および約１００００細胞／ウェルを表す。
サイトカイン誘導性の増殖またはサイトカイン誘導性のサイトカイン産生の、中和アッセイのために適切な指標細胞株の例としては、ＴＦ−１、ＭＣ／９、Ｌ９２９、Ｄ１０、ＣＴＬＬ−２、Ｂ９、脾細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３、ＣＯＬＯ２０５、Ａ５４９、ｈＰＢＭＣ、ＮＨＤＦおよびＮａｇ７／８が挙げられる。ＴＦ−１細胞は、サイトカインＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１３、ＩＬ−４およびＩＬ−５の中和に、好ましく用いられる。ＭＣ／９細胞は、サイトカインＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−５およびＩＬ−１０の中和に、好ましく用いられる。Ｌ９２９細胞は、サイトカインＩＦＮ−ガンマおよびＴＮＦ−アルファの中和に、好ましく用いられる。Ｄ１０細胞は、サイトカインＩＬ−１アルファおよびＩＬ−１ベータの中和に、好ましく用いられる。ＣＴＬＬ−２細胞は、サイトカインＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−５の中和に、好ましく用いられる。Ｂ９細胞は、サイトカインＩＬ−６およびＩＬ−２１の中和に、好ましく用いられる。脾細胞は、サイトカインＩＬ−１２／ＩＬ−２３ｐ４０およびＩＬ−２３の中和に、好ましく用いられる。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞は、サイトカインＩＬ−１７Ａの中和に、好ましく用いられる。ＣＯＬＯ２０５細胞は、サイトカインＩＬ−２２の中和に、好ましく用いられる。Ａ５４９細胞は、サイトカインＩＦＮ−ガンマおよびＩＮＦベータの中和に、好ましく用いられる。ｈＰＢＭＣは、サイトカインＩＬ−１２／ＩＬ２３ｐ４０の中和に、好ましく用いられる。ＮＨＤＦ細胞は、サイトカインＩＬ−１７Ａの中和に、好ましく用いられる。Ｎａｇ７／８細胞は、サイトカインＴＳＬＰの中和に、好ましく用いられる。
抗体がサイトカインＧＭ−ＣＳＦを中和する能力（特に、ＧＭ−ＣＳＦ誘導性の増殖を中和する能力）を評価する場合に、好適にも散られる細胞は、ＴＦ−１細胞である。好ましいＧＭ−ＣＳＦ中和アッセイは、以下の工程を含む。
（１）異なる濃度の試験すべき抗体（例えば希釈系列）を、例えば、マイクロタイタープレート（または他の任意の適切な容器）中に用意する；
（２）標的量のＧＭ−ＣＳＦ（例えば１００ｐｇ／ｍｌ）を上記抗体に加え、適切な条件（具体的には、３７℃にて１時間）の下で共にインキュベートする；
（３）共にインキュベートされた抗体−ＧＭ−ＣＳＦを、ＴＦ−１細胞に（具体的には、ウェルあたり１０００個または１００００個のＴＦ−１細胞を含んでいる、ウェルに）移す。そして、例えば３７℃にて、３〜４日間（例えば、７２時間）インキュベートする；
（４）その後、増殖の中和を定量分析し、ＩＣ９０を決定することができる。例えば、ＧＭ−ＣＳＦの中和は、ＴＦ−１の成長が阻害される割合として、下記式により算出されうる。
［１−｛（１つのウェルのＣＣＰＭ）−（コントロール細胞成長（ＧＭ−ＣＳＦなし）の平均ＣＣＰＭ）｝／｛（コントロール細胞成長（ＧＭ−ＣＳＦあり）の平均ＣＣＰＭ）−（コントロール細胞成長（ＧＭ−ＣＳＦなし）の平均ＣＣＰＭ）｝］×１００
（ＣＣＰＭ＝補正後のカウント／分）
全てのサンプルについて、ＩＣ９０（μｇ／ｍｌ）は、非線形回帰分析によって算出されうる（例えば、GraphPad Prism 5ソフトウェアを用いて）。
上記のアッセイにおいて、より程度の低い厳密な条件とは、約５０ｐｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦの最終濃度、および約１０００細胞／ウェルのＴＦ−１を表す。厳密な条件とは、約５０ｐｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦの最終濃度、および約１００００細胞／ウェルのＴＦ−１を表す。より厳密な条件とは、約５００ｐｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦの最終濃度、および約１０００細胞／ウェルのＴＦ−１を表す。非常に厳密な条件とは、約５００ｐｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦの最終濃度、および約１００００細胞／ウェルのＴＦ−１を表す。
（可変領域およびＣＤＲ）
本発明に係る抗体またはその抗原結合断片は、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでいることが好ましい。一般に、相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインに存在する、超可変領域である。本発明に係る抗体またはその抗原結合断片は、重鎖上に少なくとも３つのＣＤＲを含んでおり、かつ、軽鎖上に少なくとも３つのＣＤＲを含んでいることが好ましい。本発明に係る抗体またはその抗原結合断片は、重鎖上に少なくとも６つのＣＤＲを含んでおり、かつ、軽鎖上に少なくとも３つのＣＤＲを含んでいることが、より好ましい。本発明に係る抗体またはその抗原結合断片は、（１）重鎖上に少なくとも９つのＣＤＲを含んでおり、かつ、軽鎖上に少なくとも３つのＣＤＲを含んでいること、または、（２）重鎖上に少なくとも６つのＣＤＲを含んでおり、かつ、軽鎖上に少なくとも６つのＣＤＲを含んでいることが、より一層好ましい。
通常、抗原のエピトープに対して（例えば、サイトカイン分子（特にＧＭ−ＣＳＦ）の特定部位に対して）特異的に結合する抗体のドメインは、「抗原受容体」または「エピトープ結合部位」とも呼ばれる。抗体のドメイン（すなわち、抗原受容体／エピトープ結合部位）は、通常、特に自然型の単特異性ＩｇＧ抗体においては、重鎖の３つのＣＤＲと、連結している軽鎖の３つのＣＤＲと、によって形成されている。換言すると、特に自然型の単特異性ＩｇＧ抗体においては、抗原受容体／エピトープ結合部位は通常２つの可変ドメインから構成されているため、それぞれの抗体受容体に６つのＣＤＲが存在する（重鎖：ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３；軽鎖：ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３）。１つの抗体、特に１つの自然型の単特異性ＩｇＧ抗体は、通常、２つの（同一の）抗原受容体を有しており、それゆえ、１２個のＣＤＲを含んでいる（すなわち２×６個のＣＤＲ）。
しかし、本発明に係る多重特異性抗体またはその抗原結合断片は、少なくとも２つの異なるドメインを含んでいる。上記少なくとも２つの異なるドメインは、サイトカイン（特にＧＭ−ＣＳＦ）の、少なくとも２つの異なる重複しない部位に対して、特異的に結合する。本発明に係る多重特異性抗体の１分子またはその抗原結合断片は、それぞれの異なるドメインについて、２つの同一のドメインを含んでいることが好ましい。上記異なるドメインはそれぞれ、サイトカインの少なくとも２つの異なる重複しない部位に対して、特異的に結合する。本発明に係る多重特異性抗体の１分子またはその抗原結合断片は、２本の重鎖および２本の軽鎖を含んでいることも、また好ましい。本発明に係る多重特異性抗体の１分子またはその抗原結合断片は、２本の重鎖および２本の軽鎖を含んでおり、（１）上記２本の重鎖は、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より一層好ましくは９５％、特に好ましくは１００％の配列同一性を有していること、および／または、（２）上記２本の軽鎖は、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より一層好ましくは９５％、特に好ましくは１００％の配列同一性を有していることが、より好ましい。したがって、本発明に係る多重特異性抗体の１分子またはその抗原結合断片が、（１）それぞれの異なるドメインについて、２つの同一のドメインを含んでおり、（２）上記異なるドメインは、サイトカイン（例えばＧＭ−ＣＳＦ）の、少なくとも２つの異なる重複しない部位に対して特異的に結合する場合は、同一ドメインの一方は、上記多重特異性抗体の第１の重鎖および第１の軽鎖から構成されていることが好ましく、他方は上記多重特異性抗体の第２の重鎖および第２の軽鎖から構成されていることが好ましい。
本発明に係る多重特異性抗体の重鎖および／または軽鎖、またはその抗原結合断片は、その「多重特異性（すなわち、異なるエピトープ結合部位）」のために、３つを超えるＣＤＲ（特に、３つを超える異なるＣＤＲ）を、（それぞれ）含んでいてよい。例えば、本発明に係る多重特異性抗体またはその抗原結合断片は、サイトカイン（特にＧＭ−ＣＳＦ）の少なくとも２つの異なる重複しない部位に対して特異的に結合する、少なくとも２つの異なるドメインを含んでいてよい。ここで、上記少なくとも２つの異なるドメインのそれぞれは、異なる単特異性抗体（例えば、ＩｇＧ型の）に由来している。このような単特異性抗体は、通常、３つのＣＤＲを重鎖に含み、かつ、３つのＣＤＲを軽鎖に含むことによって、抗原受容体／エピトープ結合部位を形成している。そのため、本発明に係る多重特異性抗体は、（１）第１の抗体の重鎖の３つのＣＤＲおよび第１の抗体の軽鎖の３つのＣＤＲ、（２）第２の抗体の重鎖の３つのＣＤＲおよび第２の抗体の軽鎖の３つのＣＤＲ、（３）任意で、第３の抗体の重鎖の３つのＣＤＲおよび第３の抗体の軽鎖の３つのＣＤＲ、などを、特に含んでいてよい。したがって、本発明に係る多重特異性抗体の重鎖および／または軽鎖に含まれているＣＤＲの数は、３の倍数（例えば、３、６、９、１２など）であることが好ましい。それゆえ、本発明に係る多重特異性抗体の、重鎖および軽鎖の両方に含まれているＣＤＲの合計が、６の倍数（例えば、６、１２、１８など）であることもまた好ましい。
特に、本発明に係る多重特異性抗体またはその抗原結合断片において、重鎖はまた、単特異性抗体の軽鎖に由来するＣＤＲまたは可変領域を含んでいてもよい。例えば、本発明に係る多重特異性抗体において、重鎖は、（１）第１の単特異性抗体に由来する重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）、ならびに（２）第２の単特異性抗体（上記第１の単特異性抗体とは異なる）に由来する重鎖可変領域（ＶＨ）、を含んでいてよい。一方で、上記第２の単特異性抗体に由来する軽鎖可変領域（ＶＬ）は、本発明に係る多重特異性抗体の軽鎖に含まれている。このような多重特異性抗体において、上記第２の単特異性抗体は、特に「足場」として用いられてよい。したがって、本発明に係る多重特異性抗体において、重鎖は、（１）第１の単特異性抗体に由来する、１つ以上（好ましくは３つ全て）の重鎖ＣＤＲおよび１つ以上（好ましくは３つ全て）の軽鎖ＣＤＲ、ならびに（２）第２の単特異性抗体（上記第１の単特異性抗体とは異なる）に由来する、１つ以上（好ましくは３つ全て）の重鎖ＣＤＲ、を含んでいてよい。一方で、上記第２の単特異性抗体に由来する、１つ以上（好ましくは３つ全て）の軽鎖ＣＤＲは、本発明に係る多重特異性抗体の、軽鎖に含まれている。このような多重特異性抗体において、上記第２の単特異性抗体は、特に「足場」として用いられてよい。
通常、特に自然型の単特異性ＩｇＧ抗体において、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）は、可変ドメイン中で非連続的に配置されている。換言すれば、重鎖および／または軽鎖中のＣＤＲは、例えばフレームワーク領域によって隔てられていてよい。ここで、フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲよりも「可変的」でない、可変ドメイン中の領域である。例えば本発明に係る抗体において、可変領域（または、それぞれの可変領域）は、好ましくは、３つのＣＤＲによって隔てられている、４つのフレームワーク領域を含んでいてよい。
上述したように、本発明に係る多重特異性抗体において、１本の鎖（好ましくは重鎖）は、３つを超えるＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）、および／または、上述の１つを超える可変領域を含んでいてよい。通常、「抗原受容体」は、ＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３、ならびにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３）によって特徴づけられる。そのため、本発明に係る多重特性抗体において、ＣＤＲは、「抗原受容体」を保存するために（すなわち、抗原（例えばサイトカイン、特にＧＭ−ＣＳＦ）の特定の部位に特異的に結合する能力を保存するために）、順番（例えば、同じ単特異性抗体に由来する、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３、および／または、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３）が維持されるように配置されていることが好ましい。つまり、例えば、第１の単特異性抗体に由来するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３の順番は、アミノ酸鎖の中で、第２の単特異性抗体に由来するいかなるＣＤＲにも遮られないことが好ましい。さらに、本発明に係る多重特異性抗体の１本の鎖（好ましくは重鎖）が、第１の単特異性抗体の重鎖および軽鎖に由来するＣＤＲを含んでいる場合、重鎖ＣＤＲは、同じ単特性抗体に由来する軽鎖ＣＤＲの隣に配置されることが好ましい。例えば、上述の配列は、−ＣＤＲＨ１（ａ）−ＣＤＲＨ２（ａ）−ＣＤＲＨ３（ａ）−ＣＤＲＬ１（ａ）−ＣＤＲＬ２（ａ）−ＣＤＲＬ３（ａ）−ＣＤＲＨ１（ｂ）−ＣＤＲＨ２（ｂ）−ＣＤＲＨ３（ｂ）−でありうる。上記配列中、（ａ）および（ｂ）は、それぞれのＣＤＲが由来している、異なる単特異性抗体を表す。また、ＣＤＲは、通常、非連続的に配置される。すなわち、ＣＤＲは、ＣＤＲではない任意のアミノ酸配列（例えば、フレームワーク領域および／またはリンカー）によって隔てられていてよい。重要なことには、本発明に係る多重特性抗体が、少なくとも２つの異なる単特異性抗体に由来するエピトープ結合部位（抗原受容体）を含んでいる場合、当該単特異性抗体のＣＤＲまたは可変領域は、本発明に係る多重特異性抗体中で、以下のように配置されている。すなわち、上記ＣＤＲ（または可変領域）が由来している、それぞれの単特異性抗体の「抗原受容体」が保存されるように（すなわち、抗原（例えばサイトカイン、特にＧＭ−ＣＳＦ）の特定の部位に特異的に結合する能力が保存されるように）、配置されている。
本明細書において、ＣＤＲアミノ酸の位置は、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従って定義される（IMGT: http://www.imgt.org/; cf. Lefranc, M.-P. et al. (2009) Nucleic Acids Res. 37, D1006-D1012）。本発明の抗体の（すなわち、本発明に係るいくつかの抗体の）、（１）ＣＤＲ、重鎖、軽鎖の配列の例、および（２）上記ＣＤＲ、重鎖、軽鎖をコードしている核酸分子の配列の例、は、配列表に開示されている。単特異性抗体の重鎖ＣＤＲに由来する、本発明に係る多重特異性抗体のＣＤＲはまた、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３とも、それぞれ表記される。同様に、単特異性抗体の軽鎖ＣＤＲに由来する、本発明に係る多重特異性抗体のＣＤＲはまた、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３とも、それぞれ表記される。したがって、例えば、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３はまた、本発明に係る多重特異性抗体の重鎖上に存在していてもよい。それゆえ、単特性抗体の重鎖可変領域に由来する、本発明に係る多重特異性抗体の可変領域はまた、ＶＨとも表記される。また、単特性抗体の軽鎖可変領域に由来する、本発明に係る多重特異性抗体の可変領域はまた、ＶＬとも表記される。したがって、例えば、ＶＬはまた、本発明に係る多重特異性抗体の重鎖上に存在していてもよい。
本発明に係る抗体またはその抗原結合断片は、（１）少なくとも１つのＣＤＲＨ１、少なくとも１つのＣＤＲＨ２および少なくとも１つのＣＤＲＨ３を含んでいる重鎖、ならびに（２）少なくとも１つのＣＤＲＬ１、少なくとも１つのＣＤＲＬ２および少なくとも１つのＣＤＲＬ３を含んでいる軽鎖、を含んでいることが好ましい。ここで、（１）上記少なくとも１つの重鎖ＣＤＲＨ３は、配列番号３、５１、６９もしくは１０７、またはその機能的な配列バリアントにしたがうアミノ酸配列を含んでおり、（２）好ましくは、上記少なくとも１つの重鎖ＣＤＲＨ３は、配列番号３もしくは６９、またはその機能的な配列バリアントにしたがうアミノ酸配列を含んでいる。重鎖が、少なくとも２つのＣＤＲＨ１、少なくとも２つのＣＤＲＨ２および少なくとも２つのＣＤＲＨ３を含んでいることもまた、好ましい。ここで、１つのＣＤＲＨ１、１つのＣＤＲＨ２および１つのＣＤＲＨ３は第１の単特異性抗体に由来しており、１つのＣＤＲＨ１、１つのＣＤＲＨ２および１つのＣＤＲＨ３は第２の単特異性抗体（上記第１の単特異性抗体とは異なる）に由来している。
本発明の多重特異性抗体またはその抗原結合断片が、（１）少なくとも１つのＣＤＲＨ１、少なくとも１つのＣＤＲＨ２および少なくとも１つのＣＤＲＨ３を含んでいる重鎖、ならびに（２）少なくとも１つのＣＤＲＬ１、少なくとも１つのＣＤＲＬ２および少なくとも１つのＣＤＲＬ３を含んでいる軽鎖、を含んでいることもまた、好ましい。ここで、上記少なくとも１つの重鎖ＣＤＲＨ３は、配列番号３、５１、６９または１０７（好ましくは配列番号３または６９）と、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一であるアミノ酸配列を含んでいる。
表１に、６つのＣＤＲのアミノ酸配列に関する配列番号を示す。上記ＣＤＲは、単特異性抗体の代表例に由来しており、本発明の多重特異性抗体の代表例において用いられている。
Figure 2018520987
バリアント抗体もまた、本発明の範囲に包含されている。したがって、本願に列挙されている配列のバリアントもまた、本発明の範囲に包含されている。このようなバリアントには、（１）免疫応答の際に、体細胞変異によってインビボで生み出された天然バリアント、または（２）不死化Ｂ細胞クローンの培養においてインビトロで生み出された天然バリアント、が含まれている。あるいは、遺伝情報の変質よってバリアントを生じさせてもよいし、転写または翻訳のエラーによってバリアントを生じさせてもよい。
さらに、改良された親和性および／または抗体価を有している上記抗体配列のバリアントを、公知の方法を用いて得てもよい。このようなバリアントも、本発明の範囲に包含されている。例えば、アミノ酸置換を用いて、より改良された親和性を有する抗体を得てよい。あるいは、ヌクレオチド配列のコドン最適化を用いて、抗体の産生のための発現系における転写効率を改良してもよい。さらに、本発明の任意の核酸配列に指向性進化法を適用することによって、抗体特異性または中和活性のために最適化された配列を含んでいるポリヌクレオチドもまた、本発明の範囲に包含される。
好ましくは、バリアント抗体配列は、本願に列挙されている配列に対して、７０％以上（すなわち、７５％、８０％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）のアミノ酸配列の同一性を有していてよい。このようなバリアントは、通常、フレームワーク領域におけるよりも、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の上記ＣＤＲにおいて、本明細書に記載されている配列に対するより高い相同性を有している。当業者に知られているように、上記ＣＤＲよりも上記フレームワーク領域において、変異はより許容される（すなわち、機能（例えば、特異性または中和能）の欠如が限定されているか、存在しない）。
したがって、本発明は、抗体またはその抗原結合断片を包含している。ここで、本明細書で提供されている配列からの変異は、上記抗体の上記フレームワーク領域にある、または、上記抗体のフレームワーク領域をコードしている核酸残基にあることが好ましい。
本発明において、このような（バリアント）抗体は、体細胞変異の数を低減できることにおいて好ましい（すなわち、「生殖細胞系列化された」抗体：「生殖細胞系列」の形態に先祖返りしている）。抗体の生殖細胞系列配列は、例えば、ＩＭＧＴデータベースの参照によって（例えば、ＩＭＧＴの、ＶＤＪおよびＶＪの割当と再配列との解読に従って：http://www.imgt.org/; cf. Lefranc, M.-P. et al. (2009) Nucleic Acids Res. 37, D1006-D1012）決定してよい。「生殖細胞系列化された」抗体バリアントは、例えば、遺伝子合成または部位特異的変異誘発によって産生してよい。体細胞変異のレベルが低いことにより、抗体の免疫原性の潜在的なリスクが低減される。体細胞変異の数は、フレームワーク領域（ＦＲ）において低減されることが好ましい（すなわち、「フレームワーク領域が生殖細胞系列化された」抗体。本明細書においては、ＦＲ−ＧＬバリアントとも表記する）。フレームワーク領域（ＦＲ）に体細胞変異が全く含まれない（バリアント）抗体、またはその抗原結合断片およびＦＲ−ＧＬバリアントが、それぞれ、より好ましい。このような（バリアント）抗体、またはその抗原結合断片およびＦＲ−ＧＬバリアントであって、可能な限り体細胞変異が少なく、一方で（体細胞変異を（より多く）含んでいる、参照抗体／断片と比較して）中和活性が損なわれていないものが、それぞれ、特に好ましい。このような抗体は、一方で、その中和活性が損なわれていない。したがって、非常に高い抗体価および幅を示す。その一方で、抗体の免疫原性の潜在的なリスクが顕著に低減されている。
好ましい実施形態において、本発明の多重特異性抗体または抗体断片は、少なくとも１つのＣＤＲを含んでいる。上記少なくとも１つのＣＤＲの配列は、配列番号１〜７、４９〜５５、６７〜７３および１０５〜１１１のいずれか１つに対して、少なくとも９５％の配列同一性を有している。
本発明の多重特異性抗体または抗体断片は、１つを超えるＣＤＲを含んでいることが好ましい。上記１つを超えるＣＤＲの配列は、配列番号１〜７、４９〜５５、６７〜７３および１０５〜１１１のいずれか１つに対して、少なくとも９５％の配列同一性を有している。
上記抗体またはその抗原結合断片は、２つのＣＤＲを含んでいることが好ましい。上記２つのＣＤＲの配列は、配列番号１〜７、４９〜５５、６７〜７３および１０５〜１１１のいずれか１つに対して、少なくとも９５％の配列同一性を有している。したがって、上記抗体またはその抗原結合断片は、以下を含んでいることが好ましい：（ｉ）配列番号１、４９、６７および１０５のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＨ１、ならびに、配列番号４、５２、７０および１０８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＬ１；（ｉｉ）配列番号２、５０、６８および１０６のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＨ２、ならびに、配列番号５、６、５３、５４、７１、７２、１０９および１１０のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＬ２；または、（ｉｉｉ）配列番号３、５１、６９および１０７のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＨ３、ならびに、配列番号７、５５、７３および１１１のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＬ３。
上記抗体またはその抗原結合断片は、３つのＣＤＲを含んでいることが好ましい。上記３つのＣＤＲの配列は、配列番号１〜７、４９〜５５、６７〜７３および１０５〜１１１のいずれか１つに対して、少なくとも９５％の配列同一性を有している。したがって、上記抗体またはその抗原結合断片は、以下を含んでいることが好ましい：（ｉ）配列番号１、４９、６７および１０５のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＨ１、配列番号２、５０、６８および１０６のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＨ２、ならびに、配列番号３、５１、６９および１０７のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＨ３；または、（ｉｉ）配列番号４、５２、７０および１０８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＬ１、配列番号５、６、５３、５４、７１、７２、１０９および１１０のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＬ２、ならびに、配列番号７、５５、７３および１１１のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＬ３。
上記抗体またはその抗原結合断片は、４つのＣＤＲを含んでいることが好ましい。上記４つのＣＤＲの配列は、配列番号１〜７、４９〜５５、６７〜７３および１０５〜１１１のいずれか１つに対して、少なくとも９５％の配列同一性を有している。したがって、上記抗体またはその抗原結合断片は、以下を含んでいることが好ましい：（ｉ）配列番号１、４９、６７および１０５のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＨ１、配列番号２、５０、６８および１０６のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＨ２、配列番号３、５１、６９および１０７のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＨ３、ならびに、配列番号４〜７、５２〜５５、７０〜７３または１０８〜１１１のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＬ；（ｉｉ）配列番号４、５２、７０および１０８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＬ１、配列番号５、６、５３、５４、７１、７２、１０９および１１０のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＬ２、配列番号７、５５、７３および１１１のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＬ３、ならびに、配列番号１〜３、４９〜５１、６７〜６９および１０５〜１０７のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＨ。このうち、配列番号３、５１、６９および１０７のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＨ３が、特に好ましい；（ｉｉｉ）配列番号１、４９、６７および１０５のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＨ１、配列番号４、５２、７０および１０８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＬ１、配列番号２、５０、６８および１０６のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＨ２、ならびに、配列番号５、６、５３、５４、７１、７２、１０９および１１０のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＬ２；（ｉｖ）配列番号１、４９、６７および１０５のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＨ１、配列番号４、５２、７０および１０８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＬ１、配列番号３、５１、６９および１０７のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＨ３、ならびに、配列番号７、５５、７３および１１１のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＬ３；または、（ｖ）配列番号２、５０、６８および１０６のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＨ２、配列番号５、６、５３、５４、７１、７２、１０９および１１０のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＬ２、配列番号３、５１、６９および１０７のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＨ３、ならびに、配列番号７、５５、７３および１１１のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＬ３。
上記抗体またはその抗原結合断片は、５つのＣＤＲを含んでいることが好ましい。上記５つのＣＤＲの配列は、配列番号１〜７、４９〜５５、６７〜７３および１０５〜１１１のいずれか１つに対して、少なくとも９５％の配列同一性を有している。したがって、上記抗体またはその抗原結合断片は、以下の群から選択される、５つのＣＤＲを含んでいることが好ましい：配列番号１、４９、６７および１０５のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＨ１；配列番号２、５０、６８および１０６のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＨ２；配列番号３、５１、６９および１０７のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＨ３；配列番号４、５２、７０および１０８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＬ１；配列番号５、６、５３、５４、７１、７２、１０９および１１０のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＬ２；ならびに、配列番号７、５５、７３および１１１のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＬ３。
上記抗体またはその抗原結合断片は、６つのＣＤＲを含んでいることが好ましい。上記６つのＣＤＲの配列は、配列番号１〜７、４９〜５５、６７〜７３および１０５〜１１１のいずれか１つに対して、少なくとも９５％の配列同一性を有している。したがって、上記抗体またはその抗原結合断片は、以下の群から選択される、６つのＣＤＲを含んでいることが好ましい：配列番号１、４９、６７および１０５のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＨ１；配列番号２、５０、６８および１０６のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＨ２；配列番号３、５１、６９および１０７のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＨ３；配列番号４、５２、７０および１０８のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＬ１；配列番号５、６、５３、５４、７１、７２、１０９および１１０のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＬ２；ならびに、配列番号７、５５、７３および１１１のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＬ３。上記抗体またはその抗原結合断片は、以下を含んでいることがより好ましい：
（ｉ）（１）配列番号１〜５および７、もしくはその機能的な配列バリアントにしたがう、または（２）配列番号１〜４および６〜７、もしくはその機能的な配列バリアントにそれぞれしたがう、重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列、ならびに、軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列；
（ｉｉ）（１）配列番号４９〜５３および５５、もしくはその機能的な配列バリアントにしたがう、または（２）配列番号４９〜５２および５４〜５５、もしくはその機能的な配列バリアントにそれぞれしたがう、重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列、ならびに、軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）（１）配列番号６７〜７１および７３、もしくはその機能的な配列バリアントにしたがう、または（２）配列番号６７〜７０および７２〜７３、もしくはその機能的な配列バリアントにそれぞれしたがう、重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列、ならびに、軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列；および／または、
（ｉｖ）（１）配列番号１０５〜１０９および１１１、もしくはその機能的な配列バリアントにしたがう、または（２）配列番号１０５〜１０８および１１０〜１１１、もしくはその機能的な配列バリアントにそれぞれしたがう、重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列、ならびに、軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列。
上述した、本発明の抗体またはその抗原結合断片（上述したように、少なくとも１つのＣＤＲ、すなわち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上のＣＤＲを有している）の実施形態の中では、次のような抗体またはその抗原結合断片の実施形態が好ましい。すなわち、配列番号３、５１、６９および１０７のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有しているＣＤＲＨ３を含んでいる、抗体またはその抗原結合断片の実施形態が好ましい。
以下を含んでいる、本発明の単離抗体または抗原結合断片もまた、好ましい：配列番号１、４９、６７および１０５のアミノ酸配列またはその機能的な配列バリアントを有している重鎖ＣＤＲ１、配列番号２、５０、６８および１０６のアミノ酸配列またはその機能的な配列バリアントを有している重鎖ＣＤＲ２、ならびに、配列番号３、５１、６９および１０７のアミノ酸配列またはその機能的な配列バリアントを有している重鎖ＣＤＲ３。特定の実施形態において、本明細書において提供されている抗体または抗体断片は、以下のアミノ酸配列を含んでいる、重鎖を含んでいる：（ｉ）配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２、および配列番号３のＣＤＲＨ３；（ｉｉ）配列番号４９のＣＤＲＨ１、配列番号５０のＣＤＲＨ２、および配列番号２１のＣＤＲＨ３；（ｉｉｉ）配列番号６７のＣＤＲＨ１、配列番号６８のＣＤＲＨ２、および配列番号６９のＣＤＲＨ３；および／または、（ｉｖ）配列番号１０５のＣＤＲＨ１、配列番号１０６のＣＤＲＨ２、および配列番号１０７のＣＤＲＨ３。
本発明の抗体または抗原結合断片は、以下を含んでいることが好ましい：配列番号４、５２、７０および１０８のいずれかにしたがうアミノ酸配列またはその機能的な配列バリアントを有している、軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５、６、５３、５４、７１、７２、１０９および１１０のいずれかにしたがうアミノ酸配列またはその機能的な配列バリアントを有している、軽鎖ＣＤＲ２；および／または、配列番号７、５５、７３、および１１１のいずれかにしたがうアミノ酸配列またはその機能的な配列バリアントを有している、軽鎖ＣＤＲ３。特定の実施形態において、本明細書において提供されている抗体または抗体断片は、以下のアミノ酸配列を含んでいる、軽鎖を含んでいる：（ｉ）配列番号４のＣＤＲＬ１、配列番号５または６のＣＤＲＬ２、および配列番号７のＣＤＲＬ３；（ｉｉ）配列番号５２のＣＤＲＬ１、配列番号５３または５４のＣＤＲＬ２、および配列番号５５のＣＤＲＬ３；（ｉｉｉ）配列番号７０のＣＤＲＬ１、配列番号７１または７２のＣＤＲＬ２、および配列番号７３のＣＤＲＬ３；および／または、（ｉｖ）配列番号１０８のＣＤＲＬ１、配列番号１０９または１１０のＣＤＲＬ２、および配列番号１１１のＣＤＲＬ３。
本発明の他の実施形態において、本発明は、以下を含んでいる単離抗体またはその抗原結合断片を、包含している：配列番号１〜７、４９〜５５、６７〜７３および１０５〜１１１のアミノ酸配列のうち任意の６つに対して、それぞれ、少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）同一である、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびに、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列。
表２に、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の、アミノ酸配列およびそれらをコードしている核酸配列の配列番号を示す。上記重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、単特異性抗体の代表例に由来しており、本発明の多重特異性抗体の代表例に用いられている。
Figure 2018520987
上記の配列は、単特異性抗体（例えば、GCA7、GCA21、GCB59またはGCE536）の重鎖に由来するか、単特性抗体（例えば、GCA7、GCA21、GCB59またはGCE536）の軽鎖に由来するかに応じて、「ＶＨ配列」または「ＶＬ配列」と、それぞれ表記される。したがって、本発明に係る多重特異性抗体において、例えば、重鎖はまた、（例えば、１つ以上のＶＨ配列に加えて）１つ以上のＶＬ配列（当該ＶＬ配列が由来する、単特異性抗体の軽鎖に含まれていた）をも含んでいてよい。
本発明に係る単離抗体または抗原結合断片は、配列番号３７、６３、９５および１３０にしたがう配列のいずれか１つに対して、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約８８％、約９０％、約９２％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を有している、ＶＨ配列を含んでいることが好ましい。他の実施形態において、上記単離抗体または抗原結合断片は、配列番号３８、６４、９６、１３１にしたがう配列のいずれか１つに対して、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約８８％、約９０％、約９２％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％同一であるアミノ酸配列を有している、ＶＬ配列を含んでいる。
本発明に係る抗体または抗原結合断片は、以下を含んでいることが好ましい：
（ｉ）配列番号３７またはその機能的な配列バリアントにしたがうＶＨアミノ酸配列、および配列番号３８またはその機能的な配列バリアントにしたがうＶＬアミノ酸配列；および／または、
（ｉｉ）配列番号６３またはその機能的な配列バリアントにしたがうＶＨアミノ酸配列、および配列番号６４またはその機能的な配列バリアントにしたがうＶＬアミノ酸配列；および／または、
（ｉｉｉ）配列番号９５またはその機能的な配列バリアントにしたがうＶＨアミノ酸配列、および配列番号９６またはその機能的な配列バリアントにしたがうＶＬアミノ酸配列；および／または、
（ｉｖ）配列番号１３０またはその機能的な配列バリアントにしたがうＶＨアミノ酸配列、および配列番号１３１またはその機能的な配列バリアントにしたがうＶＬアミノ酸配列。
さらに、本発明に係る抗体の重鎖、またはその抗原結合断片は、配列番号３８、６４、９６および１３１にしたがうアミノ酸配列またはその機能的な配列バリアントから選択される、ＶＬアミノ酸配列を含んでいることが好ましい。上記抗体の重鎖またはその抗原結合断片は、配列番号３８および９６にしたがうアミノ酸配列またはその機能的な配列バリアントから選択される、ＶＬアミノ酸配列を含んでいることが、より好ましい。上記抗体の重鎖またはその抗原結合断片は、配列番号９６にしたがう、またはその機能的な配列バリアントであるＶＬアミノ酸配列を含んでいることが、より一層好ましい。
本発明に係る多重特異性抗体またはその抗原結合断片において、以下であることが好ましい：
（ｉ）上記抗体または抗原結合断片が、構築型Ｂｓ１、構築型Ｂｓ２、構築型Ｂｓ３、構築型Ｔｓ１、構築型Ｔｓ２および構築型Ｔｓ３からなる群より選択される構築型であること；および
（ｉｉ）上記抗体または抗原結合断片が、以下の（ａ）〜（ｈ）からなる群より選択されるＣＤＲＨ１アミノ酸配列、ＣＤＲＨ２アミノ酸配列、ＣＤＲＨ３アミノ酸配列、ＣＤＲＬ１アミノ酸配列、ＣＤＲＬ２アミノ酸配列およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含んでいること。（ａ）配列番号１〜５および７にしたがうアミノ酸配列、またはその機能的な配列バリアント；（ｂ）配列番号１〜４および６〜７にしたがうアミノ酸配列、またはその機能的な配列バリアント；（ｃ）配列番号６７〜７１および７３にしたがうアミノ酸配列、またはその機能的な配列バリアント；（ｄ）配列番号６７〜７０および７２〜７３にしたがうアミノ酸配列、またはその機能的な配列バリアント；（ｅ）配列番号４９〜５３および５５にしたがうアミノ酸配列、またはその機能的な配列バリアント；（ｆ）配列番号４９〜５２および５４〜５５にしたがうアミノ酸配列、またはその機能的な配列バリアント；（ｇ）配列番号１０５〜１０９および１１１にしたがうアミノ酸配列、またはその機能的な配列バリアント；ならびに、（ｈ）配列番号１０５〜１０８および１１０〜１１１にしたがうアミノ酸配列、またはその機能的な配列バリアント。
本発明に係る多重特異性抗体またはその抗原結合断片は、以下であることが、より好ましい：
（ｉ）構築型Ｂｓ１、構築型Ｂｓ２、構築型Ｂｓ３、構築型Ｔｓ１、構築型Ｔｓ２および構築型Ｔｓ３からなる群より選択される構築型であること；および
（ｉｉ）以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択されるＣＤＲＨ１アミノ酸配列、ＣＤＲＨ２アミノ酸配列、ＣＤＲＨ３アミノ酸配列、ＣＤＲＬ１アミノ酸配列、ＣＤＲＬ２アミノ酸配列およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列を、位置Ａおよび／またはＣのいずれかに含んでいること。（ａ）配列番号１〜５および７にしたがうアミノ酸配列、またはその機能的な配列バリアント；（ｂ）配列番号１〜４および６〜７にしたがうアミノ酸配列、またはその機能的な配列バリアント；（ｃ）配列番号６７〜７１および７３にしたがうアミノ酸配列、またはその機能的な配列バリアント；ならびに、（ｄ）配列番号６７〜７０および７２〜７３にしたがうアミノ酸配列、またはその機能的な配列バリアント。
本発明に係る多重特異性抗体またはその抗原結合断片は、以下であることが、より一層好ましい：
（ｉ）構築型Ｂｓ１、構築型Ｂｓ２、構築型Ｂｓ３、構築型Ｔｓ１、構築型Ｔｓ２および構築型Ｔｓ３からなる群より選択される構築型であること；および
（ｉｉ）（１）配列番号６７〜７１および７３にしたがう、もしくはその機能的な配列バリアントである、または、（２）配列番号６７〜７０および７２〜７３にしたがう、もしくはその機能的な配列バリアントである、ＣＤＲＨ１アミノ酸配列、ＣＤＲＨ２アミノ酸配列、ＣＤＲＨ３アミノ酸配列、ＣＤＲＬ１アミノ酸配列、ＣＤＲＬ２アミノ酸配列およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列を、位置Ａおよび／またはＣのいずれかに含んでいること。
本発明に係る多重特異性抗体またはその抗原結合断片は、以下であることが、特に好ましい：
（ｉ）構築型Ｂｓ１、構築型Ｂｓ２、構築型Ｂｓ３、構築型Ｔｓ１、構築型Ｔｓ２および構築型Ｔｓ３からなる群より選択される構築型であること；および
（ｉｉ）（１）配列番号６７〜７１および７３にしたがう、もしくはその機能的な配列バリアントである、または、（２）配列番号６７〜７０および７２〜７３にしたがう、もしくはその機能的な配列バリアントである、ＣＤＲＨ１アミノ酸配列、ＣＤＲＨ２アミノ酸配列、ＣＤＲＨ３アミノ酸配列、ＣＤＲＬ１アミノ酸配列、ＣＤＲＬ２アミノ酸配列およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列を、位置Ａに含んでいること。
本発明に係る多重特異性抗体またはその抗原結合断片は、gTs1GC1、gTs1GC2a、gTs2GC2b、gTs2GC2c、gTs3GC2d、gTs3GC2e、gBs3GC1a、gBs3GC1b、gBs2GC1c、gBs2GC1d、gBs1GC2a、gBs3GC2b、gBs1GC3a、gBs3GC3b、gBs3GC4およびgBs3GC5にしたがい、好ましくは、gTs3GC2dまたはgBs1GC3aにしたがうことが好ましい。上記多重特異性抗体またはその抗原結合断片は、Ts1GC1、Ts1GC2a、Ts2GC2b、Ts2GC2c、Ts3GC2d、Ts3GC2e、Bs3GC1a、Bs3GC1b、Bs2GC1c、Bs2GC1d、Bs1GC2a、Bs3GC2b、Bs1GC3a、Bs3GC3b、Bs3GC4およびBs3GC5であり、好ましくは、Ts3GC2dまたはBs1GC3aであることが、より好ましい。
本発明者らは、１６種類の多重特異性抗体を設計および構築した。これらを、本明細書では、Ts1GC1、Ts1GC2a、Ts2GC2b、Ts2GC2c、Ts3GC2d、Ts3GC2e、Bs3GC1a、Bs3GC1b、Bs2GC1c、Bs2GC1d、Bs1GC2a、Bs3GC2b、Bs1GC3a、Bs3GC3b、Bs3GC4およびBs3GC5と表記する（実施例５、表７を参照）。上記抗体Ts1GC1、Ts1GC2a、Ts2GC2b、Ts2GC2c、Ts3GC2d、Ts3GC2e、Bs3GC1a、Bs3GC1b、Bs2GC1c、Bs2GC1d、Bs1GC2a、Bs3GC2b、Bs1GC3a、Bs3GC3b、Bs3GC4およびBs3GC5に基づいて（特に、４種類の単特異性抗体（GCA7、GCA21、GCB59、GCE536）に由来するＶＨ配列およびＶＬ配列の組み合わせに基づいて）、本明細書において用いるとき、用語gTs1GC1、gTs1GC2a、gTs2GC2b、gTs2GC2c、gTs3GC2d、gTs3GC2e、gBs3GC1a、gBs3GC1b、gBs2GC1c、gBs2GC1d、gBs1GC2a、gBs3GC2b、gBs1GC3a、gBs3GC3b、gBs3GC4およびgBs3GC5は、それぞれの「一般」抗体("generic" antibodies)またはその抗原結合断片を意味する。上記「一般」抗体は、特定のＶＨアミノ酸配列およびＶＬアミノ酸配列（後述するように、特定のヌクレオチド配列によってコードされている）を含んでいる。
表７（実施例５）に、抗体Ts1GC1、Ts1GC2a、Ts2GC2b、Ts2GC2c、Ts3GC2d、Ts3GC2e、Bs3GC1a、Bs3GC1b、Bs2GC1c、Bs2GC1d、Bs1GC2a、Bs3GC2b、Bs1GC3a、Bs3GC3b、Bs3GC4、およびBs3GC5の、重鎖のアミノ酸配列の配列番号および軽鎖のアミノ酸配列の配列番号を、それぞれ示す（表７において、「完全な配列」と呼ばれている）。加えて、これらをコードしているヌクレオチド配列も示す。それぞれの配列を、下記の〔実施例〕にて、「配列および配列番号の表」で示す。
本明細書において用いるとき、「gTs1GC1」は、以下を含んでいる三重特異性抗体またはその抗原結合断片を表す：
（ｉ）配列番号６３にしたがうＶＨアミノ酸配列、配列番号３７にしたがうＶＨアミノ酸配列、配列番号３８にしたがうＶＬアミノ酸配列、配列番号９５にしたがうＶＨアミノ酸配列、および配列番号９６にしたがうＶＬアミノ酸配列を含んでいる、重鎖；ならびに、
（ｉｉ）配列番号６４にしたがうＶＬアミノ酸配列を含んでいる、軽鎖。
gTs1GC1は、ＩｇＧ１型であることが好ましい。ここで、（１）上記gTs1GC1の軽鎖は、配列番号１４１にしたがうＩｇＧ１ ＣＫ配列をさらに含んでおり、（２）上記gTs1GC1の重鎖は、配列番号１４０にしたがうＩｇＧ１ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３配列、および任意で、１つ以上のリンカー配列（例えば、配列番号１４３または１４４にしたがう）をさらに含んでいる。ここで、好ましくは、短いリンカーを、（１）上記配列番号１４０にしたがうＩｇＧ１ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３配列と、上記配列番号３７にしたがうＶＨアミノ酸配列との間、および（２）上記配列番号３８にしたがうＶＬアミノ酸配列と、上記配列番号９５にしたがうＶＨアミノ酸配列との間に配置してよい。また好ましくは、長いリンカーを、（１）上記配列番号３７にしたがうＶＨアミノ酸配列と、上記配列番号３８にしたがうＶＬアミノ酸配列との間、および（２）上記配列番号９５にしたがうＶＨアミノ酸配列と、上記配列番号９６にしたがうＶＬアミノ酸配列との間に配置してよい。gTs1GC1の構築型は、Ｔｓ１であることが好ましい。
本明細書において用いるとき、「gTs1GC2a」は、以下を含んでいる三重特異性抗体またはその抗原結合断片を表す：
（ｉ）配列番号１３０にしたがうＶＨアミノ酸配列、配列番号３７にしたがうＶＨアミノ酸配列、配列番号３８にしたがうＶＬアミノ酸配列、配列番号９５にしたがうＶＨアミノ酸配列、および配列番号９６にしたがうＶＬアミノ酸配列を含んでいる、重鎖；ならびに、
（ｉｉ）配列番号１３１にしたがうＶＬアミノ酸配列を含んでいる、軽鎖。
gTs1GC2aは、ＩｇＧ１型であることが好ましい。ここで、（１）上記gTs1GC2aの軽鎖は、配列番号１４１にしたがうＩｇＧ１ ＣＫ配列をさらに含んでおり、（２）上記gTs1GC2aの重鎖は、配列番号１４０にしたがうＩｇＧ１ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３配列、および任意で、１つ以上のリンカー配列（例えば、配列番号１４３または１４４にしたがう）をさらに含んでいる。ここで、好ましくは、短いリンカーを、（１）上記配列番号１４０にしたがうＩｇＧ１ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３配列と、上記配列番号３７にしたがうＶＨアミノ酸配列との間、および（２）上記配列番号３８にしたがうＶＬアミノ酸配列と、上記配列番号９５にしたがうＶＨアミノ酸配列との間に配置してよい。また好ましくは、長いリンカーを、（１）上記配列番号３７にしたがうＶＨアミノ酸配列と、上記配列番号３８にしたがうＶＬアミノ酸配列との間、および（２）上記配列番号９５にしたがうＶＨアミノ酸配列と、上記配列番号９６にしたがうＶＬアミノ酸配列との間に配置してよい。gTs1GC2aの構築型は、Ｔｓ１であることが好ましい。
本明細書において用いるとき、「gTs2GC2b」は、以下を含んでいる三重特異性抗体またはその抗原結合断片を表す：
（ｉ）配列番号９５にしたがうＶＨアミノ酸配列、配列番号９６にしたがうＶＬアミノ酸配列、および配列番号１３０にしたがうＶＨアミノ酸配列を含んでいる、重鎖；ならびに、
（ｉｉ）配列番号３７にしたがうＶＨアミノ酸配列、配列番号３８にしたがうＶＬアミノ酸配列、および配列番号１３１にしたがうＶＬアミノ酸配列を含んでいる、軽鎖。
gTs2GC2bは、ＩｇＧ１型であることが好ましい。ここで、上記gTs2GC2bの軽鎖は、配列番号１４１にしたがうＩｇＧ１ ＣＫ配列、および任意で、１つ以上のリンカー配列（例えば、配列番号１４３または１４４にしたがう）をさらに含んでいる。ここで、（１）好ましくは、短いリンカーを、上記配列番号３８にしたがうＶＬアミノ酸配列と、上記配列番号１３１にしたがうＶＬアミノ酸配列との間に配置してよく、（２）好ましくは、長いリンカーを、上記配列番号３７にしたがうＶＨアミノ酸配列と、上記配列番号３８にしたがうＶＬアミノ酸配列との間に配置してよい。また、上記gTs2GC2bの重鎖は、配列番号１４０にしたがうＩｇＧ１ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３配列、および任意で、１つ以上のリンカー配列（例えば、配列番号１４３または１４４にしたがう）をさらに含んでいる。ここで、（１）好ましくは、短いリンカーを、上記配列番号９６にしたがうＶＬアミノ酸配列、および上記配列番号１３０にしたがうＶＨアミノ酸配列に配置してよく、（２）好ましくは、長いリンカーを、上記配列番号９５にしたがうＶＨアミノ酸配列と、上記配列番号９６にしたがうＶＬアミノ酸配列との間に配置してよい。gTs2GC2bの構築型は、Ｔｓ２であることが好ましい。
本明細書において用いるとき、「gTs2GC2c」は、以下を含んでいる三重特異性抗体またはその抗原結合断片を表す：
（ｉ）配列番号９５にしたがうＶＨアミノ酸配列、配列番号９６にしたがうＶＬアミノ酸配列、および配列番号３７にしたがうＶＨアミノ酸配列を含んでいる、重鎖；ならびに、
（ｉｉ）配列番号１３０にしたがうＶＨアミノ酸配列、配列番号１３１にしたがうＶＬアミノ酸配列、および配列番号３８にしたがうＶＬアミノ酸配列を含んでいる、軽鎖。
gTs2GC2cは、ＩｇＧ１型であることが好ましい。ここで、上記gTs2GC2cの軽鎖は、配列番号１４１にしたがうＩｇＧ１ ＣＫ配列、および任意で、１つ以上のリンカー配列（例えば、配列番号１４３または１４４にしたがう）をさらに含んでいる。ここで、（１）好ましくは、短いリンカーを、上配列番号１３１にしたがうＶＬアミノ酸配列と、上記配列番号３８にしたがうＶＬアミノ酸配列との間に配置してよく、（２）好ましくは、長いリンカーを、上記配列番号１３０にしたがうＶＨアミノ酸配列と、上記配列番号１３１にしたがうＶＬアミノ酸配列との間に配置してよい。また、上記gTs2GC2cの重鎖は、配列番号１４０にしたがうＩｇＧ１ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３配列、および任意で、１つ以上のリンカー配列（例えば、配列番号１４３または１４４にしたがう）をさらに含んでいる。ここで、（１）好ましくは、短いリンカーを、上記配列番号９６にしたがうＶＬアミノ酸配列、および上記配列番号３７にしたがうＶＨアミノ酸配列に配置してよく、（２）好ましくは、長いリンカーを、上記配列番号９５にしたがうＶＨアミノ酸配列と、上記配列番号９６にしたがうＶＬアミノ酸配列との間に配置してよい。gTs2GC2cの構築型は、Ｔｓ２であることが好ましい。
本明細書において用いるとき、「gTs3GC2d」は、以下を含んでいる三重特異性抗体またはその抗原結合断片を表す：
（ｉ）配列番号９５にしたがうＶＨアミノ酸配列、配列番号９６にしたがうＶＬアミノ酸配列、配列番号１３０にしたがうＶＨアミノ酸配列、配列番号３７にしたがうＶＨアミノ酸配列、および配列番号３８にしたがうＶＬアミノ酸配列を含んでいる、重鎖；ならびに、
（ｉｉ）配列番号１３１にしたがうＶＬアミノ酸配列を含んでいる、軽鎖。
gTs3GC2dは、ＩｇＧ１型であることが好ましい。ここで、上記gTs3GC2dの軽鎖は、配列番号１４１にしたがうＩｇＧ１ ＣＫ配列をさらに含んでいる。また、上記gTs3GC2dの重鎖は、配列番号１４０にしたがうＩｇＧ１ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３配列、および任意で、１つ以上のリンカー配列（例えば、配列番号１４３または１４４にしたがう）をさらに含んでいる。ここで、好ましくは、短いリンカーを、（１）上記配列番号１４０にしたがうＩｇＧ１ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３配列と、上記配列番号３７にしたがうＶＨアミノ酸配列との間、および（２）上記配列番号９６にしたがうＶＬアミノ酸配列と、上記配列番号１３０にしたがうＶＨアミノ酸配列との間に配置してよい。また、好ましくは、長いリンカーを、（１）上記配列番号３７にしたがうＶＨアミノ酸配列と、上記配列番号３８にしたがうＶＬアミノ酸配列との間、および（２）上記配列番号９５にしたがうＶＨアミノ酸配列と、上記配列番号９６にしたがうＶＬアミノ酸配列との間に配置してよい。gTs3GC2dの構築型は、Ｔｓ３であることが好ましい。
本明細書において用いるとき、「gTs3GC2e」は、以下を含んでいる三重特異性抗体またはその抗原結合断片を表す：
（ｉ）配列番号９５にしたがうＶＨアミノ酸配列、配列番号９６にしたがうＶＬアミノ酸配列、配列番号３７にしたがうＶＨアミノ酸配列、配列番号１３０にしたがうＶＨアミノ酸配列、および配列番号１３１にしたがうＶＬアミノ酸配列を含んでいる、重鎖；ならびに、
（ｉｉ）配列番号３８にしたがうＶＬアミノ酸配列を含んでいる、軽鎖。
gTs3GC2eは、ＩｇＧ１型であることが好ましい。ここで、上記gTs3GC2eの軽鎖は、配列番号１４１にしたがうＩｇＧ１ ＣＫ配列をさらに含んでいる。また、上記gTs3GC2eの重鎖は、配列番号１４０にしたがうＩｇＧ１ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３配列、および任意で、１つ以上のリンカー配列（例えば、配列番号１４３または１４４にしたがう）をさらに含んでいる。ここで、好ましくは、短いリンカーを、（１）上記配列番号１４０にしたがうＩｇＧ１ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３配列と、上記配列番号１３０にしたがうＶＨアミノ酸配列との間、および（２）上記配列番号９６にしたがうＶＬアミノ酸配列と、上記配列番号３７にしたがうＶＨアミノ酸配列との間に配置してよい。また、好ましくは、長いリンカーを、（１）上記配列番号１３０にしたがうＶＨアミノ酸配列と、上記配列番号１３１にしたがうＶＬアミノ酸配列との間、および（２）上記配列番号９５にしたがうＶＨアミノ酸配列と、上記配列番号９６にしたがうＶＬアミノ酸配列との間に配置してよい。gTs3GC2eの構築型は、Ｔｓ３であることが好ましい。
本明細書において用いるとき、「gBs3GC1a」は、以下を含んでいる二重特異性抗体またはその抗原結合断片を表す：
（ｉ）配列番号１３０にしたがうＶＨアミノ酸配列、配列番号３７にしたがうＶＨアミノ酸配列、および配列番号３８にしたがうＶＬアミノ酸配列を含んでいる、重鎖；ならびに、
（ｉｉ）配列番号１３１にしたがうＶＬアミノ酸配列を含んでいる、軽鎖。
gBs3GC1aは、ＩｇＧ１型であることが好ましい。ここで、上記gBs3GC1aの軽鎖は、配列番号１４１にしたがうＩｇＧ１ ＣＫ配列をさらに含んでいる。また、上記gBs3GC1aの重鎖は、配列番号１４０にしたがうＩｇＧ１ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３配列、および任意で、１つ以上のリンカー配列（例えば、配列番号１４３または１４４にしたがう）をさらに含んでいる。ここで、好ましくは、短いリンカーを、上記配列番号１４０にしたがうＩｇＧ１ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３配列と、上記配列番号３７にしたがうＶＨアミノ酸配列との間に配置してよい。また、好ましくは、長いリンカーを、上記配列番号３７にしたがうＶＨアミノ酸配列と、上記配列番号３８にしたがうＶＬアミノ酸配列との間に配置してよい。gBs3GC1aの構築型は、Ｂｓ３であることが好ましい。
本明細書において用いるとき、「gBs3GC1b」は、以下を含んでいる二重特異性抗体またはその抗原結合断片を表す：
（ｉ）配列番号３７にしたがうＶＨアミノ酸配列、配列番号１３０にしたがうＶＨアミノ酸配列、および配列番号１３１にしたがうＶＬアミノ酸配列を含んでいる、重鎖；ならびに、
（ｉｉ）配列番号３８にしたがうＶＬアミノ酸配列を含んでいる、軽鎖。
gBs3GC1bは、ＩｇＧ１型であることが好ましい。ここで、上記gBs3GC1bの軽鎖は、配列番号１４１にしたがうＩｇＧ１ ＣＫ配列をさらに含んでいる。また、上記gBs3GC1bの重鎖は、配列番号１４０にしたがうＩｇＧ１ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３配列、および任意で、１つ以上のリンカー配列（例えば、配列番号１４３または１４４にしたがう）をさらに含んでいる。ここで、好ましくは、短いリンカーを、上記配列番号１４０にしたがうＩｇＧ１ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３配列と、上記配列番号１３０にしたがうＶＨアミノ酸配列との間に配置してよい。また、好ましくは、長いリンカーを、上記配列番号１３０にしたがうＶＨアミノ酸配列と、上記配列番号１３１にしたがうＶＬアミノ酸配列との間に配置してよい。gBs3GC1bの構築型は、Ｂｓ３であることが好ましい。
本明細書において用いるとき、「gBs2GC1c」は、以下を含んでいる二重特異性抗体またはその抗原結合断片を表す：
（ｉ）配列番号１３０にしたがうＶＨアミノ酸配列を含んでいる、重鎖；ならびに、
（ｉｉ）配列番号３７にしたがうＶＨアミノ酸配列、配列番号３８にしたがうＶＬアミノ酸配列、および配列番号１３１にしたがうＶＬアミノ酸配列を含んでいる、軽鎖。
gBs2GC1cは、ＩｇＧ１型であることが好ましい。ここで、上記gBs2GC1cの軽鎖は、配列番号１４１にしたがうＩｇＧ１ ＣＫ配列、および任意で、１つ以上のリンカー配列（例えば、配列番号１４３または１４４にしたがう）をさらに含んでいる。ここで、好ましくは、短いリンカーを、上記配列番号３８にしたがうＶＬアミノ酸配列と、上記配列番号１３１にしたがうＶＬアミノ酸配列との間に配置してよい。また、好ましくは、長いリンカーを、上記配列番号３７にしたがうＶＨアミノ酸配列と、上記配列番号３８にしたがうＶＬアミノ酸配列との間に配置してよい。また、上記gBs2GC1cの重鎖は、配列番号１４０にしたがうＩｇＧ１ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３配列をさらに含んでいる。gBs2GC1cの構築型は、Ｂｓ２であることが好ましい。
本明細書において用いるとき、「gBs2GC1d」は、以下を含んでいる二重特異性抗体またはその抗原結合断片を表す：
（ｉ）配列番号３７にしたがうＶＨアミノ酸配列を含んでいる、重鎖；ならびに、
（ｉｉ）配列番号１３０にしたがうＶＨアミノ酸配列、配列番号１３１にしたがうＶＬアミノ酸配列、および配列番号３８にしたがうＶＬアミノ酸配列を含んでいる、軽鎖。
gBs2GC1d cは、ＩｇＧ１型であることが好ましい。ここで、上記gBs2GC1dの軽鎖は、配列番号１４１にしたがうＩｇＧ１ ＣＫ配列、および任意で、１つ以上のリンカー配列（例えば、配列番号１４３または１４４にしたがう）をさらに含んでいる。ここで、好ましくは、短いリンカーを、上記配列番号１３１にしたがうＶＬアミノ酸配列と、上記配列番号３８にしたがうＶＬアミノ酸配列との間に配置してよい。また、好ましくは、長いリンカーを、上記配列番号１３０にしたがうＶＨアミノ酸配列と、上記配列番号１３１にしたがうＶＬアミノ酸配列との間に配置してよい。また、上記gBs2GC1dの重鎖は、配列番号１４０にしたがうＩｇＧ１ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３配列をさらに含んでいる。gBs2GC1dの構築型は、Ｂｓ２であることが好ましい。
本明細書において用いるとき、「gBs1GC2a」は、以下を含んでいる二重特異性抗体またはその抗原結合断片を表す：
（ｉ）配列番号９５にしたがうＶＨアミノ酸配列、配列番号９６にしたがうＶＬアミノ酸配列、および配列番号１３０にしたがうＶＨアミノ酸配列を含んでいる、重鎖；ならびに、
（ｉｉ）配列番号１３１にしたがうＶＬアミノ酸配列を含んでいる、軽鎖。
gBs1GC2aは、ＩｇＧ１型であることが好ましい。ここで、上記gBs1GC2aの軽鎖は、配列番号１４１にしたがうＩｇＧ１ ＣＫ配列をさらに含んでいる。また、上記gBs1GC2aの重鎖は、配列番号１４０にしたがうＩｇＧ１ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３配列、および任意で、１つ以上のリンカー配列（例えば、配列番号１４３または１４４にしたがう）をさらに含んでいる。ここで、好ましくは、短いリンカーを、上記配列番号９６にしたがうＶＬアミノ酸配列と、上記配列番号１３０にしたがうＶＨアミノ酸配列との間に配置してよい。また、好ましくは、長いリンカーを、上記配列番号９５にしたがうＶＨアミノ酸配列と、上記配列番号９６にしたがうＶＬアミノ酸配列との間に配置してよい。gBs1GC2aの構築型は、Ｂｓ１であることが好ましい。
本明細書において用いるとき、「gBs3GC2b」は、以下を含んでいる二重特異性抗体またはその抗原結合断片を表す：
（ｉ）配列番号９５にしたがうＶＨアミノ酸配列、配列番号１３０にしたがうＶＨアミノ酸配列、および配列番号１３１にしたがうＶＬアミノ酸配列を含んでいる、重鎖；ならびに、
（ｉｉ）配列番号９６にしたがうＶＬアミノ酸配列を含んでいる、軽鎖。
gBs3GC2bは、ＩｇＧ１型であることが好ましい。ここで、上記gBs3GC2bの軽鎖は、配列番号１４２にしたがうＩｇＧ１ ＣＬ配列をさらに含んでいる。また、上記gBs3GC2bの重鎖は、配列番号１４０にしたがうＩｇＧ１ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３配列、および任意で、１つ以上のリンカー配列（例えば、配列番号１４３または１４４にしたがう）をさらに含んでいる。ここで、好ましくは、短いリンカーを、上記配列番号１４０にしたがうＩｇＧ１ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３配列と、上記配列番号１３０にしたがうＶＨアミノ酸配列との間に配置してよい。また、好ましくは、長いリンカーを、上記配列番号１３０にしたがうＶＨアミノ酸配列と、上記配列番号１３１にしたがうＶＬアミノ酸配列との間に配置してよい。gBs3GC2bの構築型は、Ｂｓ３であることが好ましい。
本明細書において用いるとき、「gBs1GC3a」は、以下を含んでいる二重特異性抗体またはその抗原結合断片を表す：
（ｉ）配列番号９５にしたがうＶＨアミノ酸配列、配列番号９６にしたがうＶＬアミノ酸配列、および配列番号３７にしたがうＶＨアミノ酸配列を含んでいる、重鎖；ならびに、
（ｉｉ）配列番号３８にしたがうＶＬアミノ酸配列を含んでいる、軽鎖。
gBs1GC3aは、ＩｇＧ１型であることが好ましい。ここで、上記gBs1GC3aの軽鎖は、配列番号１４１にしたがうＩｇＧ１ ＣＫ配列をさらに含んでいる。また、上記gBs1GC3aの重鎖は、配列番号１４０にしたがうＩｇＧ１ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３配列、および任意で、１つ以上のリンカー配列（例えば、配列番号１４３または１４４にしたがう）をさらに含んでいる。ここで、好ましくは、短いリンカーを、上記配列番号９６にしたがうＶＬアミノ酸配列と、上記配列番号３７にしたがうＶＨアミノ酸配列との間に配置してよい。また、好ましくは、長いリンカーを、上記配列番号９５にしたがうＶＨアミノ酸配列と、上記配列番号９６にしたがうＶＬアミノ酸配列との間に配置してよい。gBs1GC3aの構築型は、Ｂｓ１であることが好ましい。
本明細書において用いるとき、「gBs3GC3b」は、以下を含んでいる二重特異性抗体またはその抗原結合断片を表す：
（ｉ）配列番号９５にしたがうＶＨアミノ酸配列、配列番号３７にしたがうＶＨアミノ酸配列、および配列番号３８にしたがうＶＬアミノ酸配列を含んでいる、重鎖；ならびに、
（ｉｉ）配列番号９６にしたがうＶＬアミノ酸配列を含んでいる、軽鎖。
gBs3GC3bは、ＩｇＧ１型であることが好ましい。ここで、上記gBs3GC3bの軽鎖は、配列番号１４２にしたがうＩｇＧ１ ＣＬ配列をさらに含んでいる。また、上記gBs3GC3bの重鎖は、配列番号１４０にしたがうＩｇＧ１ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３配列、および任意で、１つ以上のリンカー配列（例えば、配列番号１４３または１４４にしたがう）をさらに含んでいる。ここで、好ましくは、短いリンカーを、上記配列番号１４０にしたがうＩｇＧ１ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３配列と、上記配列番号３７にしたがうＶＨアミノ酸配列との間に配置してよい。また、好ましくは、長いリンカーを、上記配列番号３７にしたがうＶＨアミノ酸配列と、上記配列番号３８にしたがうＶＬアミノ酸配列との間に配置してよい。gBs3GC3bの構築型は、Ｂｓ３であることが好ましい。
本明細書において用いるとき、「gBs3GC4」は、以下を含んでいる二重特異性抗体またはその抗原結合断片を表す：
（ｉ）配列番号６３にしたがうＶＨアミノ酸配列、配列番号１３０にしたがうＶＨアミノ酸配列、および配列番号１３１にしたがうＶＬアミノ酸配列を含んでいる、重鎖；ならびに、
（ｉｉ）配列番号６４にしたがうＶＬアミノ酸配列を含んでいる、軽鎖。
gBs3GC4は、ＩｇＧ１型であることが好ましい。ここで、上記gBs3GC4の軽鎖は、配列番号１４１にしたがうＩｇＧ１ ＣＫ配列をさらに含んでいる。また、上記gBs3GC4の重鎖は、配列番号１４０にしたがうＩｇＧ１ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３配列、および任意で、１つ以上のリンカー配列（例えば、配列番号１４３または１４４にしたがう）をさらに含んでいる。ここで、好ましくは、短いリンカーを、上記配列番号１４０にしたがうＩｇＧ１ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３配列と、上記配列番号１３０にしたがうＶＨアミノ酸配列との間に配置してよい。また、好ましくは、長いリンカーを、上記配列番号１３０にしたがうＶＨアミノ酸配列と、上記配列番号１３１にしたがうＶＬアミノ酸配列との間に配置してよい。gBs3GC4の構築型は、Ｂｓ３であることが好ましい。
本明細書において用いるとき、「gBs3GC5」は、以下を含んでいる二重特異性抗体またはその抗原結合断片を表す：
（ｉ）配列番号６３にしたがうＶＨアミノ酸配列、配列番号３７にしたがうＶＨアミノ酸配列、および配列番号３８にしたがうＶＬアミノ酸配列を含んでいる、重鎖；ならびに、
（ｉｉ）配列番号６４にしたがうＶＬアミノ酸配列を含んでいる、軽鎖。
gBs3GC5は、ＩｇＧ１型であることが好ましい。ここで、上記gBs3GC5の軽鎖は、配列番号１４１にしたがうＩｇＧ１ ＣＫ配列をさらに含んでいる。また、上記gBs3GC5の重鎖は、配列番号１４０にしたがうＩｇＧ１ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３配列、および任意で、１つ以上のリンカー配列（例えば、配列番号１４３または１４４にしたがう）をさらに含んでいる。ここで、好ましくは、短いリンカーを、上記配列番号１４０にしたがうＩｇＧ１ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３配列と、上記配列番号３７にしたがうＶＨアミノ酸配列との間に配置してよい。また、好ましくは、長いリンカーを、上記配列番号３７にしたがうＶＨアミノ酸配列と、上記配列番号３８にしたがうＶＬアミノ酸配列との間に配置してよい。gBs3GC5の構築型は、Ｂｓ３であることが好ましい。
本発明に係る多重特異性単離抗体または抗原結合断片は、gTs3GC2dの全ＶＨ配列および全ＶＬ配列にそれぞれ含まれている、全てのＣＤＲを含んでいることが好ましい。あるいは、本発明に係る多重特異性単離抗体または抗原結合断片は、gBs1GC3aの全ＶＨ配列および全ＶＬ配列にそれぞれ含まれている、全てのＣＤＲを含んでいることが好ましい。どのＶＨ配列またはＶＬ配列（アミノ酸配列の配列番号）が、どのＣＤＲ（アミノ酸配列の配列番号）が含んでいるかを、下記表３に示す。併せて、上記ＶＨ配列またはＶＬ配列が由来する単特異性抗体の代表例も示す。あるいは、本発明に係る多重特異性単離抗体または抗原結合断片は、gTs1GC1の全ＶＨ配列および全ＶＬ配列にそれぞれ含まれている、全てのＣＤＲを含んでいる。あるいは、本発明に係る多重特異性単離抗体または抗原結合断片は、gTs1GC2aの全ＶＨ配列および全ＶＬ配列にそれぞれ含まれている、全てのＣＤＲを含んでいる。あるいは、本発明に係る多重特異性単離抗体または抗原結合断片は、gTs2GC2bの全ＶＨ配列および全ＶＬ配列にそれぞれ含まれている、全てのＣＤＲを含んでいる。あるいは、本発明に係る多重特異性単離抗体または抗原結合断片は、gTs2GC2cの全ＶＨ配列および全ＶＬ配列にそれぞれ含まれている、全てのＣＤＲを含んでいる。あるいは、本発明に係る多重特異性単離抗体または抗原結合断片は、gTs2GC2cの全ＶＨ配列および全ＶＬ配列にそれぞれ含まれている、全てのＣＤＲを含んでいる。あるいは、本発明に係る多重特異性単離抗体または抗原結合断片は、gTs3GC2dの全ＶＨ配列および全ＶＬ配列にそれぞれ含まれている、全てのＣＤＲを含んでいる。あるいは、本発明に係る多重特異性単離抗体または抗原結合断片は、gTs3GC2dの全ＶＨ配列および全ＶＬ配列にそれぞれ含まれている、全てのＣＤＲを含んでいる。あるいは、本発明に係る多重特異性単離抗体または抗原結合断片は、gTs3GC2eの全ＶＨ配列および全ＶＬ配列にそれぞれ含まれている、全てのＣＤＲを含んでいる。あるいは、本発明に係る多重特異性単離抗体または抗原結合断片は、gBs3GC1aの全ＶＨ配列および全ＶＬ配列にそれぞれ含まれている、全てのＣＤＲを含んでいる。あるいは、本発明に係る多重特異性単離抗体または抗原結合断片は、gBs3GC1bの全ＶＨ配列および全ＶＬ配列にそれぞれ含まれている、全てのＣＤＲを含んでいる。あるいは、本発明に係る多重特異性単離抗体または抗原結合断片は、gBs2GC1cの全ＶＨ配列および全ＶＬ配列にそれぞれ含まれている、全てのＣＤＲを含んでいる。あるいは、本発明に係る多重特異性単離抗体または抗原結合断片は、gBs2GC1dの全ＶＨ配列および全ＶＬ配列にそれぞれ含まれている、全てのＣＤＲを含んでいる。あるいは、本発明に係る多重特異性単離抗体または抗原結合断片は、gBs1GC2aの全ＶＨ配列および全ＶＬ配列にそれぞれ含まれている、全てのＣＤＲを含んでいる。あるいは、本発明に係る多重特異性単離抗体または抗原結合断片は、gBs3GC2bの全ＶＨ配列および全ＶＬ配列にそれぞれ含まれている、全てのＣＤＲを含んでいる。あるいは、本発明に係る多重特異性単離抗体または抗原結合断片は、gBs1GC3aの全ＶＨ配列および全ＶＬ配列にそれぞれ含まれている、全てのＣＤＲを含んでいる。あるいは、本発明に係る多重特異性単離抗体または抗原結合断片は、gBs3GC3bの全ＶＨ配列および全ＶＬ配列にそれぞれ含まれている、全てのＣＤＲを含んでいる。あるいは、本発明に係る多重特異性単離抗体または抗原結合断片は、gBs3GC4の全ＶＨ配列および全ＶＬ配列にそれぞれ含まれている、全てのＣＤＲを含んでいる。あるいは、本発明に係る多重特異性単離抗体または抗原結合断片は、gBs3GC5の全ＶＨ配列および全ＶＬ配列にそれぞれ含まれている、全てのＣＤＲを含んでいる。
Figure 2018520987
本発明に係る多重特異性抗体またはその抗原結合断片は、医薬として用いられてよい。特に、本発明に係る多重特異性抗体またはその抗原結合断片は、炎症性疾患および／または自己免疫疾患の予防、処置または弱化に用いられてよい。上述の使用に関してより詳細には、例えば薬学的組成物および医学的使用との関係において、後述する。
本発明は、抗体またはその断片を、さらに包含している。上記抗体またはその断片は、本発明の抗体または抗原結合断片として、または、本発明の抗体または抗原結合断片と競合する抗体として、同じエピトープに対して（すなわち、同じ「サイトカイン（特にＧＭ−ＣＳＦ）の少なくとも２つの異なる重複しない部位」に対して）結合する。
上述の抗体として同じエピトープに対して結合する、本発明に係る抗体またはその抗原結合断片はまた、Ｆｃ部分をも含んでいることが好ましい。
（ａ）サイトカインの少なくとも２つの異なる重複しない部位に対して特異的に結合する、少なくとも２つの異なるドメイン；および
（ｂ）Ｆｃ部分
を含んでいる、本発明に係る多重特異性抗体またはその抗原結合断片に関して、上記に説明した好ましい実施形態はまた、上記に説明した抗体として同じエピトープに対して結合する、本発明に係る抗体またはその抗原結合断片にも適用できる。
本発明の抗体にはまた、上記に説明した以下の（ａ）および（ｂ）を含んでいる、多重特異性ハイブリッド抗体分子も含まれる。
（ａ）サイトカインの少なくとも２つの異なる重複しない部位に対して特異的に結合する、少なくとも２つの異なるドメイン；および
（ｂ）Ｆｃ部分
上記多重特異性ハイブリッド抗体分子は、（１）本発明の抗体に由来する１つ以上のＣＤＲ、および（２）他の抗体に由来する１つ以上のＣＤＲ、を含んでいる。上記他の抗体は、特に、同じサイトカイン（特にＧＭ−ＣＳＦ）上の同じエピトープもしくはさらなるエピトープ、または他の抗原（例えば、他のサイトカイン、癌関連エピトープ、Ｔ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープなど）に対する抗体である。一実施形態において、上記ハイブリッド抗体は、（１）本発明の抗体に由来する３つのＣＤＲ、および（２）他の抗体（例えば、上述したように、同じまたは異なるエピトープに対する抗体）に由来する３つのＣＤＲ、を含んでいる。ハイブリッド抗体の代表例は、（ｉ）本発明に由来する３つの重鎖ＣＤＲ、および他の抗体（上述したように、同じまたは異なるエピトープに対する抗体）に由来する３つの軽鎖ＣＤＲ、または（ｉｉ）本発明に由来する３つの軽鎖ＣＤＲ、および他の抗体（上述したように、同じまたは異なるエピトープに対する抗体）に由来する３つの重鎖ＣＤＲ、を含んでいる。
（核酸分子）
他の態様において、本発明は、上述されているような本発明に係る抗体またはその抗原結合断片をコードしているポリヌクレオチドを含んでいる核酸分子も含んでいる。本発明の抗体の軽鎖、重鎖およびＣＤＲの一部またはすべてをコードしている核酸配列が好ましい。ゆえに、好ましくは、本発明の例示的な抗体の軽鎖、重鎖（特に、ＶＨ配列およびＶＬ配列）およびＣＤＲの一部またはすべてをコードしている核酸配列が本明細書中において提供される。一重特異性の抗体に由来し、本発明のいくつかの実施例の抗体において使用されるＶＨ配列およびＶＬ配列をコードしている核酸配列の配列番号は、表７から見出すことができる。下記表４は、本発明のいくつかの実施例の抗体において使用される、ＣＤＲをコードしている核酸配列の配列番号を提示する。遺伝子コードの重複性のため、本発明は、同様のアミノ酸配列をコードしているこれらの核酸配列のバリアントも含んでいる。
ゆえに、本発明は、本発明に係る抗体またはその抗原結合断片をコードしているポリヌクレオチドを含んでいる核酸分子も含んでいる。
核酸分子は、核酸成分を含んでいる分子（好ましくは、当該核酸成分からなる分子）である。用語核酸分子は、好ましくは、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を表す。特に、これは、用語「ポリヌクレオチド」と同義で使われる。好ましくは、核酸分子は、糖／リン酸主鎖のリン酸ジエステル結合で互いに共有結合しているヌクレオチドモノマーを含んでいるポリマーまたは当該ヌクレオチドモノマーからなるポリマーである。用語「核酸分子」は、修飾された核酸分子（例えば、塩基修飾、糖修飾または骨格修飾等がされているＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子）も含んでいる。
Figure 2018520987
好ましくは、本発明に係る核酸分子の配列は、配列番号８〜３６、３９〜４８、５６〜６２、６５〜６６、７４〜９４、９７〜１０４、１１２〜１２９、１３２〜１３９、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８および１９０またはそれらの機能的な配列バリアントのいずれか１つにしたがう核酸配列を含んでいる、または当該核酸配列からなる。
また、本発明に係る核酸配列は、本発明に係る抗体に使用されるＶＨ配列および／またはＶＬ配列をコードしている核酸に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を有している核酸配列を含んでいることが好ましい。ゆえに、核酸分子は、ポリヌクレオチド配列が、配列番号３９〜４８、６５〜６６、９７〜１０４および１３２〜１３９またはそれらの機能的な配列バリアントのいずれか１つにしたがう核酸配列を含んでいるか、当該核酸配列からなることが好ましい。さらに好ましくは、本発明に係る核酸分子は、本発明に係る例示的な抗体の１つの完全な重鎖または完全な軽鎖をコードしている核酸配列を含んでいるか、当該核酸配列からなる。ゆえに、核酸分子は、ポリヌクレオチド配列が、配列番号１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８および１９０またはそれらの機能的な配列バリアントのいずれか１つにしたがう核酸配列を含んでいるか、当該核酸配列からなることが好ましい。
他の実施形態において、本発明の核酸配列は、本発明の例示的な抗体の重鎖ＣＤＲまたは軽鎖ＣＤＲをコードしている核酸の配列を有している。例えば、本発明に係る核酸配列は、配列番号８〜３６、３９〜４８、５６〜６２、６５〜６６、７４〜９４、９７〜１０４、１１２〜１２９、１３２〜１３９、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８および１９０の核酸配列と、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である配列を含んでいるか、当該配列からなる。
一般に、上記核酸分子は、特定の核酸配列を挿入、削除または変更するために操作されてもよい。このような操作による変更は、制限部位を導入するための変更、コドンユーセージを改良するための変更、転写調節配列および／または翻訳調節配列を加えるか、最適化するための変更等が含まれるが、これらに限定されない。コードされるアミノ酸を変更するために、核酸を変えることもできる。例えば、抗体のアミノ酸配列への１つまたはそれ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０つ等）のアミノ酸置換、アミノ酸削除および／またはアミノ酸挿入を行うことが有用であろう。このような点変異は、エフェクター機能、抗原結合親和力、翻訳後修飾、免疫原性等を変えてもよく、共有基（例えばラベル）の結合のためのアミノ酸を導入してもよく、タグ（例えば精製目的のタグ）を導入してもよい。変異は、特定の部位に導入されてもよく、選択（例えば分子進化）に続いて、ランダムに導入されてもよい。例えば、本発明の（例示的な）抗体のＣＤＲ領域、ＶＨ配列もしくはＶＬ配列または重鎖もしくは軽鎖のいずれかをコードしている１つまたは複数の核酸を、ランダムにまたは直接的に変異させ、コードされるアミノ酸に異なる特性を導入してもよい。このような変更は、最初の変更が維持され、他のヌクレオチド部位における新たな変更が導入される反復プロセスの結果であってもよい。さらに、独立した工程で達成される変更を組み合わせてもよい。コードされるアミノ酸に導入される異なる特性は、向上された親和性が含まれてもよいが、これに限定されない。
（ベクター）
さらに、本発明に係る核酸配列を含んでいるベクター（例えば発現ベクター）が本発明の範囲に含まれる。好ましくは、ベクターは、本発明に係る核酸分子（例えば上述のような核酸分子）を含んでいる。
用語「ベクター」は、核酸分子（好ましくは、人工核酸分子（すなわち、天然に存在しない核酸分子））を表す。本発明に関するベクターは、所望の核酸配列を組み込むことまたは取り込むことに好適である。このようなベクターは、貯蔵ベクター、発現ベクター、クローニングベクター、導入ベクター等であってもよい。貯蔵ベクターは、核酸分子の好適な貯蔵ができるベクターである。ゆえに、上記ベクターは、例えば、本発明に係る所望の抗体またはその抗体断片に対応する配列も含んでいてもよい。発現ベクターは、発現産物（例えば、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質）の産生に使用されてもよい。例えば、発現ベクターは、ベクター（例えばプロモーター配列）の配列伸長（sequence stretch）に必要な配列を含んでいてもよい。クローニングベクターは、代表的にはクローニング部位を含んでいるベクターであり、核酸配列をベクターに組み込むために使用されてもよい。クローニングベクターは、例えば、プラスミドベクターまたはバクテリオファージベクターであってもよい。導入ベクターは、核酸分子を細胞または生物へ導入するのに好適なベクター（例えばウイルスベクター）であってもよい。本発明に関するベクターは、例えば、ＲＮＡベクターまたはＤＮＡベクターであってもよい。好ましくは、ベクターはＤＮＡ分子である。例えば、本明細書の意味でのベクターは、クローニング部位、選択マーカー（例えば抗生物質耐性因子）およびベクターの複製に好適な配列（例えば複製開始点）を含んでいる。好ましくは、本明細書に関するベクターはプラスミドベクターである。
〔細胞〕
このようなベクターで形質転換される細胞も本発明の範囲に含まれる。このような細胞の例は、真核細胞（例えば、酵母細胞、動物細胞または植物細胞）を含んでいるが、これらに限定されない。一実施形態において、上記細胞は、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＮＳ０細胞、骨髄腫細胞またはハイブリドーマ細胞）である。したがって、本発明は、本発明に係る抗体またはその抗原結合断片を発現している細胞；または本発明に係るベクターを含んでいる細胞も提供する。
特に、上記細胞は、本発明に係るベクター（好ましくは、発現ベクター）でトランスフェクションされてもよい。用語「トランスフェクション」は、細胞（好ましくは、真核細胞）への核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）分子）の導入を表す。本発明に関して、用語「トランスフェクション」は、当業者に知られている、細胞（好ましくは、真核細胞（例えば哺乳類細胞））への核酸分子の任意の導入方法を含んでいる。このような方法は、例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション（例えば、カチオン性脂質および／またはリポソームを基にしたリポフェクション）、リン酸カルシウム沈殿、ナノ粒子を基にしたトランスフェクション、ウイルスを基にしたトランスフェクション、またはカチオン性ポリマー（例えば、ＤＥＡＥデキストランまたはポリエチレンイミン）を基にしたトランスフェクション等が含まれる。好ましくは、導入は非ウイルス性である。
（ポリペプチド）
また、本発明は、本発明に係る抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する少なくとも２つのエピトープを含んでいるポリペプチド（例えば、単離されているまたは精製されている免疫原性ポリペプチド）に関する。例えば、本発明に係る（免疫原性）ポリペプチドは、本明細書中に記載されているような疾患の診断および／または本発明に係る抗体の産生工程、精製工程および／または検証工程および／または品質制御において、ワクチンとして使用されてもよい。好ましくは、本発明に係る（免疫原性）ポリペプチドは、本発明に係る抗体またはその抗原結合断片に特異的に結合する少なくとも２つのエピトープを含んでおり、上記ポリペプチドは、組換えポリペプチド（すなわち、天然には生じないポリペプチド）である。
モノクローナル抗体および組換え抗体は、個々のポリペプチドまたはこれらに対する他の抗原の同定および精製において特に有用である。ゆえに、本発明の抗体は、免疫測定法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着法（enzyme-linked immunosorbent assays）（ＥＬＩＳＡ）において、試薬として用いることができるという点でさらなる有用性を有している。これらの使用において、上記抗体は、分析的に検出可能な試薬（例えば、放射性同位体、蛍光分子または酵素）でラベルされてもよい。上記抗体は、抗原の分子同定および特徴付け（エピトープマッピング）にも使用されてもよい。
ゆえに、本発明の抗体に結合するポリペプチドは、数多くの使用法を有し得る。精製形態または合成形態におけるポリペプチドおよびこれらのポリペプチドバリアントは、免疫応答を引き起こすため（すなわち、ワクチンとして、または他の使用に向けた抗体の産生のため）に使用されてもよく、エピトープもしくはこれらのミモトープに免疫反応する抗体のためのスクリーニング血清のために使用されてもよい。一実施形態において、このようなポリペプチドもしくはポリペプチドバリアントまたはこのようなポリペプチドもしくはポリペプチドバリアントを含んでいる抗原は、本発明に記載されている抗体と同じ品質の抗体を含んでいる、免疫応答を引き起こすためのワクチンとして使用されてもよい。
また、本発明の抗体に結合するポリペプチドは、上記ポリペプチドに結合するリガンドのスクリーニングにおいて好適であり得る。このようなリガンドは、抗体（例えば、ラクダ、サメおよび他の種由来の抗体）、抗体の断片、ペプチド、ファージディスプレイ技術製品、アプタマー、アドネクチンまたは他のウイルスタンパク質もしくは細胞タンパク質の断片を含んでいるが、これらに限定されず、このようなリガンドは、エピトープを阻害し、それにより感染を防ぐことができる。このようなリガンドは本発明の範囲に含まれる。
〔抗体の任意のさらなる特徴〕
本発明の抗体は、例えば、処置部位への送達のための薬剤に結合してもよく、所望の細胞を含んでいる部位のイメージングを容易にするために検出可能ラベルに結合してもよい。薬剤および検出可能ラベルに抗体を結合させる方法は、検出可能ラベルを用いたイメージング方法として当業者によく知られている。ラベルされた抗体は、種々のラベルを用いる種々の測定法に用いることができる。本発明の抗体とサイトカイン（特にＧＭ−ＣＳＦ）における所望のエピトープとの抗体−抗原複合体の形態の検出は、検出可能物質を上記抗体に結合させることによって容易に実施できる。好適な検出方法としては、ラベル（例えば、放射性核種、酵素、補酵素、蛍光剤、化学発光剤、色原体、酵素基質または酵素補因子、酵素阻害剤、補欠分子族複合体、フリーラジカル、粒子、色素等）の使用が挙げられる。好適な酵素の例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンステラーゼを含んでおり；好適な補欠分子族複合体の例は、ストレプタビン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含んでおり；好適な蛍光物質は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンを含んでおり；発光物質の例は、ルミノールであり；生物発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを含んでおり；好適な放射性物質は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈを含んでいる。このようなラベルされた試薬は、種々のよく知られた測定法（例えば、放射免疫測定法、酵素免疫測定法（例えばＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法等）において使用されてもよい。ゆえに、本発明に係るラベルされた抗体は、例えば、ＵＳ３，７６６，１６２号；ＵＳ３，７９１，９３２号；ＵＳ３，８１７，８３７号；およびＵＳ４，２３３，４０２号に記載されているような測定法において使用されてもよい。
本発明に係る抗体は、治療的部分（例えば、サイトトキシン、治療剤または放射性金属イオンもしくは放射性同位体）に結合してもよい。放射性同位体の例は、Ｉ−１３１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８６、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６７、Ｂｉ−２１２、Ｂｉ−２１３、Ｐｄ−１０９、Ｔｃ−９９、Ｉｎ−１１１等が含まれるが、これらに限定されない。このような抗体共役は、特定の生物学的応答を変えるために使用されてもよく；薬剤部分は、典型的な化学治療剤に限定されるようには構築されない。例えば、上記薬剤部分は、所望の生物学的活性を有しているタンパク質またはポリペプチドであってもよい。このようなタンパク質は、例えば毒素（例えば、アブリン、リシンＡ、シューソモナスエクソトクシンまたはジフテリア毒）を含んでいてもよい。
このような治療的部分を抗体に結合させるための技術はよく知られている。例えば、Arnon et al. (1985) “Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld et al. (Alan R. Liss, Inc.), pp. 243-256；ed. Hellstrom et al. (1987) “Antibodies for Drug Delivery,” in Controlled Drug Delivery, ed. Robinson et al. (2d ed; Marcel Dekker, Inc.), pp. 623-653；Thorpe (1985) "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, ed. Pinchera et al. pp. 475-506 (Editrice Kurtis, Milano, Italy, 1985)；“Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, ed. Baldwin et al. (Academic Press, New York, 1985), pp. 303-316;およびThorpe et al. (1982) Immunol. Rev. 62:119-158を参照のこと。
あるいは、抗体またはその抗体断片は、第２の抗体またはその抗体断片に結合し、ＵＳ４，６７６，９８０号に記載されているようにヘテロ複合体抗体を形成してもよい。さらに、例えば、ＵＳ４，８３１，１７５号に記載されているように、ラベルと本発明の抗体との間にリンカーを使用してもよい。抗体またはそれらの抗原結合断片は、例えば、ＵＳ５，５９５，７２１号に記載されているように、放射性ヨード、放射性ヨードニウム、放射性イットリウムまたは当業者に知られている他の放射性粒子で直接ラベルされてもよい。処置は、例えば、ＷＯ００／５２０３１号；ＷＯ００／５２４７３号に記載されるように、同時にまたはそれ以降に投与される結合抗体および非結合抗体との処置の組み合わせからなってもよい。
本発明の抗体は、固体支持体にも結合し得る。さらに、本発明の抗体またはそれらの機能的抗体断片は、例えば循環半減期を増加させるために、ポリマーとの共有結合によって化学的に修飾されてもよい。ポリマーの例およびこれらをペプチドに結合させる方法は、ＵＳ４，７６６，１０６号；ＵＳ４，１７９，３３７号；ＵＳ４，４９５，２８５号およびＵＳ４，６０９，５４６号に示される。いくつかの実施形態において、上記ポリマーは、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から選択されてもよい。ＰＥＧは、室温で水に溶け、一般式：Ｒ（Ｏ−−ＣＨ２−−ＣＨ２）ｎ Ｏ−−Ｒ（式中、Ｒは、水素または保護基（例えば、アルキル基またはアルカノール基）であり得る）を有する。好ましくは、上記保護基は、１つと８つとの間の炭素を有し得る。例えば、当該保護基は、メチルである。記号ｎは、正の整数である。一実施形態において、ｎは１と１，０００との間である。他の実施形態において、ｎは２と５００との間である。好ましくは、ＰＥＧは、１，０００と４０，０００との間の平均分子量を有しており、より好ましくは、ＰＥＧは、２，０００と２０，０００との間の平均分子量を有しており、さらにより好ましくは、ＰＥＧは、３，０００と１２，０００との間の平均分子量を有している。さらに、ＰＥＧは、少なくとも１つのヒドロキシ基を有していてもよく、例えば、ＰＥＧは末端ヒドロキシ基を有していてもよい。例えば、これは、阻害剤における遊離アミノ基と反応するために活性化される末端ヒドロキシ基であってもよい。しかし、共有結合したＰＥＧ／本発明の抗体を達成するために、反応基の種類および量を変更してもよいことが理解されるであろう。
水溶性ポリオキシエチル化ポリオールも、本発明において有用である。これらとしては、ポオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）等が挙げられる。一実施形態において、ＰＯＧが使用される。任意の理論に縛られることなく、ポリオキシエチル化グリセロールのグリセロール主鎖は、例えば、動物およびヒトにおいて、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド中で天然に生じるものと同じ主鎖であるため、この分鎖は、体内において異物とみなされるとは限らないであろう。ＰＯＧは、ＰＥＧと同程度の分子量を有していてもよい。循環半減期を増加させるために用いられ得る他の薬剤送達系は、リポソームである。リポソーム送達系を調製する方法は、当業者に知られている。他の薬剤送達系は当該技術分野において知られており、例えばPoznansky et al. (1980)およびPoznansky (1984)において参照され、記載されている。
本発明の抗体は、精製形態において提供されてもよい。代表的には、当該抗体は、他のポリペプチドを実質的に含んでいない（例えば９０（重量）％未満の）組成物中に存在し、一般的には当該組成物の６０％未満、より一般的には当該組成物の５０％未満は、他のポリペプチドから構成される。
本発明の抗体は、非ヒト（または、異種）宿主（例えばマウス）において免疫原性であってもよい。特に、上記抗体は、非ヒト宿主において免疫原性であるが、ヒト宿主において免疫原性でないイディオトープを有してもよい。ヒトへの使用のための本発明の抗体は、宿主（例えば、マウス、ヤギ、ウサギ、ラット、霊長類でない哺乳類等）から容易には単離できず、かつ、ヒト化によってまたはゼノマウスからは一般的には得られない抗体を含んでいる。
（抗体の産生）
本発明に係る抗体は、当業者に知られている任意の方法によって産生されてもよい。例えば、ハイブリドーマ技術を用いているモノクローナル抗体を産生する一般的な方法論がよく知られている（Kohler, G. and Milstein, C,. 1975; Kozbar et al. 1983）。一実施形態では、ＷＯ２００４／０７６６７７号に記載されている、代わりとなるＥＢＶ不動化法を使用する。
ＷＯ２００４／０７６６７７号に記載されている方法を使用すると、本発明の抗体を産生するＢ細胞を、ＥＢＶおよびポリクローナルＢ細胞活性剤で形質転換できる。効率をさらに上げるため、細胞成長および分化のさらなる刺激剤を、形質転換段階の間に任意に加えてもよい。これらの刺激剤は、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２およびＩＬ−１５）であってもよい。一態様において、不死化の効率をさらに上げるために、不死化段階の間にＩＬ−２を加えるが、この使用は必須ではない。それから、これらの方法を用いて作製される不死化Ｂ細胞は、当該技術分野で知られている方法およびこれらから単離される抗体を用いて培養されてもよい。
ＷＯ２０１０／０４６７７５号に記載されている方法を使用すると、マイクロウェル培養プレートにおいて、限られた数または単一のプラズマ細胞としてプラズマ細胞を培養できる。プラズマ細胞培地から抗体を単離できる。さらに、プラズマ細胞培地からＲＮＡを抽出することができ、当該技術分野で知られている方法を用いてＰＣＲを行うことができる。上記抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域を、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ＰＣＲ）で増幅し、シークエンスし、その後ＨＥＫ２９３Ｔ細胞または他の宿主細胞にトランスフェクションされる発現ベクターにクローン化できる。当業者に知られている任意の方法を用いて、発現ベクターにおける核酸のクローニング、宿主細胞のトランスフェクション、トランスフェクションされた宿主細胞の培養および産生された抗体の単離を行うことができる。
必要に応じて、抗体は、ろ過、遠心分離および種々のクロマトグラフ法（例えば、ＨＰＬＣまたはアフィニティークロマトグラフィー）を用いてさらに精製されてもよい。抗体（例えばモノクローナル抗体）の精製技術（例えば、医薬グレードの抗体を産生するための技術）は、当該技術分野においてよく知られている。
酵素（例えば、ペプシンまたはパパイン）での消化を含んでいる方法および／または化学還元によるジスルフィド結合の切断によって、本発明の抗体の断片を上記抗体から得ることができる。あるいは、重鎖または軽鎖の配列の一部のクローニングおよび発現によって、上記抗体の断片を得ることができる。抗体「断片」は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片およびＦｖ断片を含んでいる。本発明は、本発明の抗体の重鎖および軽鎖に由来する一重鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）も含んでいる。例えば、本発明は、本発明の抗体由来のＣＤＲを含んでいるｓｃＦｖを含んでいる。一重鎖抗体（例えば、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインがペプチドリンカーによって連結されている一重鎖Ｆｖ）だけでなく、重鎖または軽鎖のモノマーおよびダイマー、単一ドメイン重鎖抗体、単一ドメイン軽鎖抗体も含んでいる。
本発明の抗体断片は、一重特異性相互作用または多重特異性相互作用を付与し、上述されているような種々の構造に含まれていてもよい。例えば、三価の「三重特異性抗体」または四価の「四重特異性抗体」を産生するために、ｓｃＦｖ分子を合成してもよい。当該ｓｃＦｖ分子は、二価のミニボディー（minibodies）を生じるＦｃ領域のドメインを含んでいてもよい。さらに、本発明の配列は、本発明の配列が本発明のエピトープを標的とし、分子の他の領域が他の標的に結合する多重特異性分子の成分であってもよい。例示的な分子は、二重特異性Ｆａｂ２、三重特異性Ｆａｂ３、二重特異性ｓｃＦｖおよび二重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない（Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology 9: 1126-1136）。
本発明の抗体または抗体断片をコードしているＤＮＡ配列を産生するため、分子生物学の標準技術が用いられてもよい。オリゴヌクレオチド合成技術を用いて、所望のＤＮＡ配列を完全にまたは部分的に合成してもよい。部位特異的突然変異誘導法およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を適宜用いてもよい。
本発明の抗体分子またはそれらの断片をコードしているＤＮＡ配列の発現のため、任意の好適な宿主細胞／ベクター系が使用されてもよい。抗体断片（例えば、Ｆａｂ断片およびＦ（ａｂ’）２断片、特に、Ｆｖ断片および一重鎖抗体断片（例えば一重鎖Ｆｖ））の発現のため、細菌（例えばE.coli）および他の細菌系が、部分的に使用されてもよい。より大きな抗体分子（例えば完全な抗体分子）の産生のため、真核（例えば哺乳類）宿主細胞発現系が使用されてもよい。好適な哺乳類宿主細胞としては、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＮＳ０細胞、骨髄腫細胞またはハイブリドーマ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明は、本発明の抗体分子をコードしているＤＮＡからのタンパク質の発現に好適な条件下で、本発明の核酸をコードしているベクターを含んでいる宿主細胞を培養する工程および上記抗体分子を単離する工程を含んでいる、本発明に係る抗体分子の産生のためのプロセスも提供する。
上記抗体分子は、重鎖ポリペプチドまたは軽鎖ポリペプチドのみを含んでいてもよく、この場合は、宿主細胞をトランスフェクションするため、配列をコードしている重鎖ポリペプチドまたは軽鎖ポリペプチドのみが用いられる必要がある。重鎖および軽鎖の両方を含んでいる生成物の産生のため、軽鎖ポリペプチドをコードしている第１のベクターおよび重鎖ポリペプチドをコードしている第２のベクターの２つのベクターで細胞系をトランスフェクションしてもよい。あるいは、単一のベクターを使用してもよく、当該ベクターは軽鎖ポリペプチドおよび重鎖ポリペプチドをコードしている配列を含んでいる。あるいは、本発明に係る抗体は、（ｉ）宿主細胞において本発明に係る核酸配列を発現させる工程および（ｉｉ）発現される抗体産物を単離する工程によって産生されてもよい。あるいは、上記方法は、（ｉｉｉ）単離されている抗体を精製する工程を含んでいてもよい。形質転換Ｂ細胞および培養プラズマ細胞を、これらが産生する、所望の特異性または機能の抗体のためにスクリーニングしてもよい。
スクリーニング工程は、任意の免疫測定法（例えばＥＬＩＳＡ）、組織または細胞（例えばトランスフェクションされた細胞）の染色、中和アッセイまたは当該技術分野で知られている、所望の特異性または機能を同定するための種々の他の方法の１つによって行われてもよい。測定法は、１つまたは複数の抗原の単なる認識を基に選択されてもよく、（例えば、単に抗原に結合している抗体よりも中和されている抗体を選択するため、標的細胞の特性（例えば、これらのシグナルカスケード、これらの形態、これらの増殖速度、他の細胞に影響を与えるこれらの能力、他の細胞または他の試薬または状況の変化による影響に対する反応、これらの分化状態等）を変えることができる抗体を選択するための）所望の機能をさらに基にして選択されてもよい。
個々の形質転換Ｂ細胞クローンは、それから、陽性形質転換Ｂ細胞培地から作製されてもよい。陽性細胞の混合物から個々のクローンを分けるためのクローニング工程は、限界希釈法、顕微鏡操作、セルソーティングまたは当該技術分野で知られている他の方法による単一細胞沈殿（single cell deposition）を用いて行われてもよい。
培養プラズマ細胞由来の核酸は、当該技術分野において知られている方法を用いて、単離され、クローン化され、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞または他の知られている宿主細胞において発現されてもよい。
本発明の不死化Ｂ細胞クローンまたはトランスフェクションされた宿主細胞は、種々の方法で（例えば、モノクローナル抗体の産生源として、所望のモノクローナル抗体をコードしている核酸（ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）の産生源として、研究のために等）使用されてもよい。
本発明は、本発明に係る抗体を産生する不死化Ｂ記憶細胞またはトランスフェクションされた宿主細胞を含んでいる組成物も提供する。
本発明の不死化Ｂ細胞クローンまたは培養プラズマ細胞は、その後の組換え発現に向けた抗体遺伝子のクローニングのための核酸の産生源としても使用されてもよい。例えば、安定性、生産性、培養のしやすさ等の理由により、組換え源からの発現は、Ｂ細胞またはハイブリドーマからの発現よりも、薬学目的においてより一般的である。
ゆえに、本発明は、（ｉ）所望の抗体をコードしているＢ細胞クローンまたは培養プラズマ細胞由来の１つまたは複数の核酸（例えば、重鎖ｍＲＮＡおよび／または軽鎖ｍＲＮＡ）を得る工程；（ｉｉ）発現ベクターへと核酸を挿入する工程および（ｉｉｉ）宿主細胞における所望の抗体の発現を可能とするために当該宿主細胞へとベクターをトランスフェクションする工程を含んでいる、組換え細胞を作製するための方法も提供する。
同様に、本発明は、（ｉ）所望の抗体をコードしているＢ細胞クローンまたは培養プラズマ細胞由来の１つまたは複数の核酸をシーケンスする工程；および（ｉｉ）宿主細胞における所望の抗体の発現を可能とするため、当該宿主細胞への挿入のために核酸を産生するために、工程（ｉ）の配列情報を用いる工程を含んでいる、組換え細胞を作製するための方法を提供する。上記核酸は、制限部位を導入するため、コドンユーセージを変えるため、および／または転写調節配列および／または翻訳調節配列を最適化するため、工程（ｉ）および工程（ｉｉ）の間に操作されてもよいが、操作される必要はない。
さらに、本発明は、所望の抗体をコードしている１つまたは複数の核酸で宿主細胞をトランスフェクションする工程を含んでいる、トランスフェクションされた宿主細胞を作製するための方法も提供する。当該方法では、上記核酸は、本発明の不死化Ｂ細胞クローンまたは培養プラズマ細胞に由来した核酸である。ゆえに、まず、上記１つまたは複数の核酸を調製し、それから宿主細胞をトランスフェクションするためにそれを用いる、という手順は、様々な場所（例えば様々な国）において様々な人々によって異なる時間において実施することができる。
本発明のこれらの組換え細胞は、それから、発現目的および培養目的のために使用されてもよい。これらは、大規模な医薬製造のための抗体の発現に特に有用である。また、これらは、薬学的組成物の有効成分として使用されてもよい。任意の好適な培養技術（例えば、静置培養、ローラーボトル培養、腹水、中空繊維型バイオリアクターカートリッジ、モジュラーミニ発酵槽、撹拌タンク、マイクロキャリア培養、セラミックコア潅流等が挙げられるが、これらに限定されない）を使用してもよい。
Ｂ細胞またはプラズマ細胞から免疫グロブリン遺伝子を得て、シークエンスする方法は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、Chapter 4 of Kuby Immunology, 4th edition, 2000を参照のこと）。
トランスフェクションされた宿主細胞は、真核細胞（例えば、植物細胞だけでなく、酵母細胞および動物細胞、特に哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ヒト細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはＨＫＢ−１１細胞）、メラノーマ細胞））であってもよい。好ましい発現宿主によって、本発明の抗体を（特に、それ自体はヒトにおいて免疫原性ではない糖鎖構造で）糖化できる。一実施形態において、上記トランスフェクションされた宿主細胞は、血清を含んでいない培地で増殖し得る。さらなる実施形態において、上記トランスフェクションされた宿主細胞は、動物由来生成物を含んでいない培養液において増殖し得る。また、上記トランスフェクションされた宿主細胞は、細胞系統を得るために培養されてもよい。
本発明は、（ｉ）本発明に係る不死化Ｂ細胞クローンまたは培養しているプラズマ細胞を作製する工程および（ｉｉ）Ｂ細胞クローンまたは培養プラズマ細胞から、所望の抗体をコードしている核酸を得る工程を含んでいる、所望の抗体をコードしている１つまたは複数の核酸分子（例えば、重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子）を産生するための方法も提供する。さらに、本発明は、（ｉ）本発明に係る不死化Ｂ細胞クローンまたは培養しているプラズマ細胞を作製する工程および（ｉｉ）Ｂ細胞クローンまたは培養プラズマ細胞由来の、所望の抗体をコードしている核酸をシーケンスする工程を含んでいる、所望の抗体をコードしている核酸配列を得るための方法を提供する。
本発明は、本発明の形質転換Ｂ細胞または培養プラズマ細胞から得られる核酸を得る工程を含んでいる、所望の抗体をコードしている１つまたは複数の核酸分子を産生する方法をさらに提供する。ゆえに、まず、Ｂ細胞クローンまたは培養プラズマ細胞を得て、それからＢ細胞クローンまたは培養プラズマ細胞から１つまたは複数の核酸を得るという手順を、様々な場所（例えば様々な国）において様々な人々によって異なる時間において実施することができる。
本発明は、（ｉ）所望の抗体を発現している、選択されるＢ細胞クローンまたは培養プラズマ細胞から１つまたは複数の核酸（例えば、重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子）を得る工程および／またはシーケンスする工程；（ｉｉ）発現ベクターを作製するため、１つまたは複数の核酸配列へと、または１つまたは複数の核酸配列を用いて、上記１つまたは複数の核酸を挿入する工程；（ｉｉｉ）所望の抗体を発現することができる宿主細胞をトランスフェクションする工程；（ｉｖ）所望の抗体が発現される条件下で、トランスフェクションされた宿主細胞を培養する工程またはサブ培養する（sub-culture）工程；および任意に（ｖ）所望の抗体を精製する工程を含んでいる、本発明に係る抗体（例えば薬学的使用のための抗体）を産生するための方法も含んでいる。
本発明は、所望の抗体が発現される条件下において、トランスフェクションされた宿主細胞集団を培養またはサブ培養する工程および任意に所望の抗体を精製する工程を含んでいる、抗体を産生する方法も提供する。上記トランスフェクションされた宿主細胞集団は、（ｉ）上述のように作製されるＢ細胞クローンまたは培養プラズマ細胞によって産生される、選択された所望の抗体をコードしている１つまたは複数の核酸を提供する工程、（ｉｉ）発現ベクターへと上記１つまたは複数の核酸を挿入する工程、（ｉｉｉ）所望の抗体を発現できる宿主細胞において上記ベクターをトランスフェクションする工程および（ｉｖ）所望の抗体を産生するために挿入された核酸を含んでいる、トランスフェクションされた宿主細胞を培養またはサブ培養する工程によって、産生されている。ゆえに、まず、組換え宿主細胞を調製し、それから抗体を発現させるためにそれを培養する、という手順は、様々な場所（例えば様々な国）において様々な人々によって非常に異なる時間において実施することができる。
（薬学的組成物）
本発明は、以下の（ｉ）〜（ｖ）の１つまたは複数を含んでいる薬学的組成物も提供する：
（ｉ）本発明に係る抗体もしくは抗体断片；
（ｉｉ）本発明に係る抗体もしくは抗体断片をコードしている核酸；
（ｉｉｉ）本発明に係る核酸をコードしているベクター；
（ｉｖ）本発明に係る抗体を発現している細胞もしくは本発明に係るベクターを含んでいる細胞；または
（ｖ）本発明に係る抗体またはその抗原結合断片に認識される免疫原性ポリペプチド。
また、上記薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体、希釈剤および／または賦形剤を含んでいてもよい。好ましくは、本発明に係る薬学的組成物は、以下の（ｉ）〜（ｖ）の１つまたは複数を含んでいる：
（ｉ）本発明に係る抗体もしくは抗体断片；
（ｉｉ）本発明に係る抗体もしくは抗体断片をコードしている核酸；
（ｉｉｉ）本発明に係る核酸をコードしているベクター；
（ｉｖ）本発明に係る抗体を発現している細胞もしくは本発明に係るベクターを含んでいる細胞；または
（ｖ）本発明に係る抗体もしくはその抗原結合断片に認識される免疫原性ポリペプチド、ならびに
薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤および／または担体。
担体または賦形剤は、投与を容易にすることができるが、上記組成物を受ける個体に対してそれ自体に害がある抗体の産生を促すべきではない。また、それが有毒であってはならない。好適な担体は、分子が大きく、ゆっくり代謝される高分子（例えば、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸共重合体および不活性ウイルス粒子）であってもよい。
薬学的に許容可能な塩は、例えば無機酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩および硫酸塩）または有機酸の塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩および安息香酸塩）を使用してもよい。
治療的組成物において薬学的に許容可能な担体は、液体（例えば、水、食塩水、グリセロールおよびエタノール）をさらに含んでいてもよい。さらに、補助物質（例えば、界面活性剤または乳化剤またはｐＨ緩衝物質）がこのような組成物に存在してもよい。このような担体により、対象による接種のためのタブレット、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ジェル、シロップ、スラリーおよび懸濁液として上記薬学的組成物を製剤することができる。
本発明の組成物は、種々の形態に調製されてもよい。例えば、当該組成物は、溶液または懸濁液として、また、注射可能物質として調製されてもよい。注射前の液体溶媒中の溶液または懸濁液として好適な固体の形態（例えば、防腐剤を含んでいる滅菌水での再構成に向けた凍結乾燥組成物（例えば、SynagisTMおよびHerceptinTM））が調製されてもよい。上記組成物は、局所投与のために（例えば、軟膏、クリームまたは粉剤として）調製されてもよい。上記組成物は、経口投与のために（例えば、タブレットまたはカプセルとして、スプレーとして、またはシロップ（任意に味が付けられたシロップ）として）調製されてもよい。上記組成物は、肺投与のために（例えば、微粉末またはスプレーを用いている吸入薬として）調製されてもよい。上記組成物は、座薬またはペッサリーとして調製されてもよい。上記組成物は、鼻投与、耳投与または眼投与のために（例えば点滴薬として）調製されてもよい。上記組成物は、対象への投与の直前に混合組成物が再構成されるように設計されるキットの形態であってもよい。例えば、凍結乾燥抗体は、滅菌水または滅菌バッファーと共にキットの形態で提供されてもよい。
上記組成物における有効成分は、抗体分子、抗体断片またはバリアントおよびこれらの派生物であり、特に、上記組成物における有効成分は、本発明に係る抗体、抗体断片またはバリアントおよびこれらの派生物であることが好ましい。したがって、これは、消化管での消化に影響されやすいものであってもよい。ゆえに、上記組成物が、消化管を用いる経路によって投与される場合は、上記組成物は、抗体の分解を防ぐが、当該抗体が消化管から吸収されると当該抗体を離すような薬剤を含んでいる組成物であってもよい。
薬学的に許容可能な担体の詳細な議論は、Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, ISBN: 0683306472において知ることができる。
本発明の薬学的組成物は、一般に、５．５と８．５との間のｐＨを有し、いくつかの実施形態において、これは６と８との間であってもよく、他の実施形態において、約７である。ｐＨは、バッファーの使用によって保たれてもよい。上記組成物は、滅菌されているかおよび／または発熱物質を含んでいない。上記組成物は、ヒトに関しては等張である。一実施形態において、本発明の薬学的組成物は、密閉容器で供給される。
本発明の範囲では、組成物はいくつかの投与の形態において存在している；当該形態としては、（例えば、注射または輸液（例えば、ボーラス注射または継続的な輸液）による）非経口投与に好適なこれらの形態が挙げられるが、これらに限定されない。生成物が注射または輸液に適している場合、これは、油性媒体または水溶性媒体中の懸濁液、溶液またはエマルションの形態を取ってもよく、これは製剤物質（例えば、懸濁剤、防腐剤、安定剤および／または分散剤）を含んでいてもよい。あるいは、滅菌された好適な液体との使用前の再構成のため、上記抗体分子は、乾燥形態であってもよい。媒体は、化合物（例えば薬学的活性化合物（特に本発明に係る抗体））を保存、輸送および／または投与するために好適である物質であると一般に理解される。例えば、上記媒体は、生理学的に許容可能な液体であってもよく、これは、薬学的活性化合物（特に本発明に係る抗体）を保存、輸送および／または投与するために好適である。製剤されるとすぐに、本発明の組成物は、対象に直接投与されてもよい。一実施形態において、上記組成物は哺乳類（例えばヒトの対象）への投与に適している。
この発明の薬学的組成物は、任意の数の経路（例えば、経口経路、静脈経路、筋肉内経路、動脈内経路、髄内（intramedullary）経路、腹腔内経路、髄腔内（intrathecal）経路、心室内経路、経皮（transdermal）経路、経皮（transcutaneous）経路、局所経路、皮下経路、鼻腔内経路、経腸経路、舌下経路、膣内経路または直腸経路が挙げられるが、これらに限定されない）によって投与されてもよい。本発明の薬学的組成物を投与するため、ハイポスプレーも使用され得る。好ましくは、上記薬学的組成物は、経口投与のために（例えば、タブレット、カプセル等として）調製されてもよく、局所投与のために調製されてもよく、注射可能物質として（例えば、液体溶液または懸濁液として）調製されてもよい。注射前の液体溶媒中の溶液または懸濁液に好適な固体の形態が調製されてもよい。
注射（例えば、静脈注射、皮膚内注射または皮下注射、または痛む場所における注射）に関して、有効成分は、好ましくは、発熱物質を含まず、好適なｐＨ、等張性および安定性を有している、薬学的に許容可能な水溶液の形態である。当業者は、等張媒体（例えば、塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、乳酸リンガー注射液）を用いている水溶性溶液をうまく調製することができる。必要に応じて、防腐剤、安定剤、バッファー、酸化防止剤および／または他の添加剤を含んでいてもよい。これが、個体に与えられる予定である、本発明に係るポリペプチド、ペプチドであろうと、核酸分子、他の薬学的に有用な化合物であろうと、投与は、（場合に応じて）「予防的に効果的な量」または「治療的に効果的な量」であることが好ましく、これは上記個体への利益が現れるのに十分である。投与される実際の量ならびに投与の速さおよび投与の時間経過は、処置されるものの性質および深刻さによって決められる。注射に関して、本発明に係る薬学的組成物は、例えば予備充填シリンジ中に提供されてもよい。
また、上記に説明されるような本発明の薬学的組成物は、任意の経口的に許容可能な投与形態（例えば、カプセル、タブレット、水溶性懸濁液または溶液が挙げられるが、これらに限定されない）で経口投与されてもよい。経口使用のためのタブレットの場合、一般に使用される担体は、ラクトースおよびコーンスターチを含んでいる。代表的には、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）も加えられる。カプセル形態の経口投与に有用な希釈剤は、ラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。水溶性懸濁液が経口使用に必要とされるとき、有効成分（すなわち、上記に説明されるような本発明の輸送積荷分子共役分子（transporter cargo conjugate molecule））は乳化剤および懸濁剤と混合される。また、必要に応じて、特定の甘味料、香味料または着色料を加えてもよい。
また、特に、処置の標的として、局所的使用によってすぐに到達できる領域または組織が含まれており、例えば、皮膚の病気または任意の他の到達できる上皮組織の病気等であるとき、本発明の薬学的組成物は局所的に投与されてもよい。好適な局所的製剤は、これらの領域または臓器のそれぞれに対して容易に調製できる。局所的使用のため、本発明の薬学的組成物は、本発明の薬学的組成物（特に上述のような成分）を含んでいる好適な軟膏に調製されてもよく、１つまたは複数の担体に懸濁されるか溶解されてもよい。局所的投与のための担体としては、鉱物油、流動パラフィン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、本発明の薬学的組成物は、好適なローションまたはクリームに製剤されてもよい。本発明に関して、好適な担体としては、鉱物油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が含まれているが、これらに限定されない。
処方処置は、単回投与計画または複数回投与計画であってもよく、本発明に関しては、複数回投与計画が好ましい。知られている、抗体を基にした医薬（特に抗サイトカイン抗体（例えば抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体）を基にした医薬）により、投与の頻度に関する案内（例えば、医薬は毎日、毎週、毎月送達されるべきである等）が提供される。また、頻度および投与量は、症状の深刻さによって決定してもよい。
例えば、本発明に係る薬学的組成物は、毎日、例えば、一日に１回または数回（例えば、一日に１回、２回、３回または４回）、好ましくは、一日に１回または２回、より好ましくは、一日に１回投与されてもよく、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日または２１日、またはそれ以上の日数の間（例えば、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５か月、６ヶ月の間毎日）投与されてもよい。好ましくは、本発明に係る薬学的組成物は、毎週、例えば、１回または２回、好ましくは週に１回、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間もしくは２１週間、またはそれ以上の週の間（例えば、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月もしくは１２ヶ月または２年、３年、４年または５年の間毎週）投与されてもよい。
特に、単回投与（例えば、毎日の投与、毎週の投与または毎月の投与）、特に、毎週の投与に関して、本発明に係る薬学的組成物中の抗体またはその抗原結合断片の量は、１５０ｍｇを超えず、好ましくは、１００ｍｇを超えず、より好ましくは、５０ｍｇを超えず、さらにより好ましくは、２０ｍｇを超えず、特に好ましくは、１０ｍｇを超えないことが好ましい。抗体のこの量は、好ましくは、例えば、上述されるように毎日、毎週等投与される、上述されるような単回投与を表す。このような低い量の本発明に係る抗体は、安定した形態（例えば凍結乾燥製剤（例えば、これまでの研究では、乾燥凍結によって保存されているモノクローナル抗体は、４０℃で３３ヶ月間、５０℃で５か月間安定であることが示されている））および手頃な費用で製造され、製剤され得る。
薬学的組成物は、代表的には、効果的な量の１つまたは複数の、本発明の抗体および／または本発明の抗体を結合するエピトープを含んでいるポリペプチド（すなわち、所望の疾患または状態を処置、改善、弱化もしくは予防するため、または検出可能な治療的効果を示すために十分な量）を含んでいる。治療的効果は、病気の強さまたは生理学的症状の抑制または弱化も含んでいる。任意の特定の対象に対する厳密な効果的な量は、対象の大きさ、重量、ならびに健康状態、状態の性質および程度、ならびに投与のために選択される治療法または治療法の組み合わせによって決めてもよい。特定の状況での効果的な量は、定期的な実験によって決められ、臨床医の判断の範囲である。本発明の目的のため、効果的な量は一般的に、上記薬学的組成物が投与される個体の体重（例えばｋｇ）に対して、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、約０．００７５ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、さらにより好ましくは約０．０２ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、特に好ましくは、約０．０３ｍｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇの本発明の抗体（例えば、薬学的組成物中の抗体の量）であってもよい。
さらに、本発明に係る薬学的組成物は、本発明に係る、少なくとも２つの抗体またはその抗原結合断片も含んでいてもよい。上記２つの抗体またはその抗原結合断片は、サイトカイン（特にＧＭ−ＣＳＦ）における重複しないエピトープの異なるセットに特異的に結合する。例えば、本発明に係る薬学的組成物は、本発明に係る第１の抗体またはその抗原結合断片および本発明に係る第２の抗体またはその抗原結合断片を含んでいてもよい。上記第１の抗体またはその抗原結合断片は、サイトカイン（特にＧＭ−ＣＳＦ）における重複しないエピトープの第１のセットに特異的に結合し、これは、上記第２の抗体またはその抗原結合断片が結合するサイトカイン（特にＧＭ−ＣＳＦ）における重複しないエピトープのセットとは異なっている。本明細書中、「サイトカイン（特にＧＭ−ＣＳＦ）における重複しないエピトープの異なるセット」は、例えば、第１のセットは、サイトカインにおけるエピトープＩおよびエピトープＩＩを含んでおり、第２の（異なる）セットは、サイトカインにおけるエピトープＩおよびエピトープＩＩＩを含んでいることを意味する。ゆえに、上記異なるセットは、重複していてもよい（すなわち、同じエピトープを含んでいてもよい）が、これらは、少なくとも１つのエピトープは常に異なっている。好ましくは、しかし、エピトープの上記異なるセットは重複しない（すなわち、第１の抗体はサイトカイン（例えばＧＭ−ＣＳＦ）における少なくとも２つの異なる部位に結合する）。上記少なくとも２つの異なる部位のそれぞれは、第２の抗体が結合する、サイトカイン（例えばＧＭ−ＣＳＦ）における少なくとも２つの異なる部位とは異なっている。例えば、本発明に係る薬学的組成物が本発明に係る、２つの抗体またはその抗原結合断片を含んでおり、第１の抗体またはその抗原結合断片がサイトカイン（特にＧＭ−ＣＳＦ）における重複しない部位ＩおよびＩＩに特異的に結合する場合、第２の抗体またはその抗原結合断片は、サイトカイン（特にＧＭ−ＣＳＦ）における重複しない部位ＩＩＩおよびＩＶに特異的に結合してもよい。このように、サイトカイン（例えばＧＭ−ＣＳＦ）におけるすべての（重複しない）部位は、本発明に係る抗体によってカバーされてもよい。
さらに、上記薬学的組成物は、２つ以上（例えば、３つ、４つ、５つ、６つ等）の本発明に係る抗体も含んでおり、少なくとも２つの含まれている抗体、好ましくは、２つ以上の含まれている抗体、より好ましくはすべての含まれている抗体がサイトカイン（例えばＧＭ−ＣＳＦ）のエピトープの異なるセットに結合する。
好ましくは、２つの本発明に係る抗体は、等モル量で上記薬学的組成物中に存在しており、好ましくは、等モルの混合物として存在している。
好ましくは、さらなる治療的効果または治療的な相乗効果を提供するため、組成物は、２つまたはそれ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ等）の本発明の抗体を含んでいてもよい。用語「相乗」は、それぞれの有効成分のそれぞれの効果の合計以上の、２つ以上の有効成分の組み合わせの効果を表すために使用される。それゆえ、２つ以上の薬剤の組み合わせの効果が活性または工程の「相乗阻害」となる場合は、当該活性または工程の阻害が、それぞれの有効成分の阻害効果の合計よりも大きいことを意図する。用語「治療的な相乗効果」は、治療的効果（多数のパラメータで測定される）がそれぞれの治療法で見られる治療的効果の合計以上である、２つまたはそれ以上の治療法の組み合わせにおいて見られる治療的効果を表す。
他の実施形態において、上記組成物は、１つまたはそれ以上（例えば、２つ、３つ等）の本発明に係る抗体および１つまたはそれ以上（例えば、２つ、３つ等）の、サイトカイン（特にＧＭ−ＣＳＦ）に対するさらなる抗体を含んでいる。さらに、他のサイトカイン（より一般には他の抗原）に特異的な抗体との本発明の抗体の投与は、本発明の範囲である。本発明の抗体は、混合／同時に投与されてもよく、他のサイトカイン（より一般には他の抗原）に特異的な抗体と別の時に投与されてもよい。
サイトカイン（特にＧＭ−ＣＳＦ）に対する本発明の抗体の例は、Ts1GC1、Ts1GC2a、Ts2GC2b、Ts2GC2c、Ts3GC2d、Ts3GC2e、Bs3GC1a、Bs3GC1b、Bs2GC1c、Bs2GC1d、Bs1GC2a、Bs3GC2b、Bs1GC3a、Bs3GC3b、Bs3GC4およびBs3GC5が含まれるが、これらに限定されない。
さらに、gTs1GC1にしたがう抗体またはその抗原結合断片を含んでいる薬学的組成物、および薬学的に許容可能な担体も好ましい。gTs1GC2aにしたがう抗体またはその抗原結合断片を含んでいる薬学的組成物、および薬学的に許容可能な担体も好ましい。gTs2GC2bにしたがう抗体またはその抗原結合断片を含んでいる薬学的組成物、および薬学的に許容可能な担体も好ましい。gTs2GC2cにしたがう抗体またはその抗原結合断片を含んでいる薬学的組成物、および薬学的に許容可能な担体も好ましい。gTs3GC2dにしたがう抗体またはその抗原結合断片を含んでいる薬学的組成物、および薬学的に許容可能な担体も好ましい。gTs3GC2eにしたがう抗体またはその抗原結合断片を含んでいる薬学的組成物、および薬学的に許容可能な担体も好ましい。gBs3GC1aにしたがう抗体またはその抗原結合断片を含んでいる薬学的組成物、および薬学的に許容可能な担体も好ましい。gBs3GC1bにしたがう抗体またはその抗原結合断片を含んでいる薬学的組成物、および薬学的に許容可能な担体も好ましい。gBs2GC1cにしたがう抗体またはその抗原結合断片を含んでいる薬学的組成物、および薬学的に許容可能な担体も好ましい。gBs2GC1dにしたがう抗体またはその抗原結合断片を含んでいる薬学的組成物、および薬学的に許容可能な担体も好ましい。gBs1GC2aにしたがう抗体またはその抗原結合断片を含んでいる薬学的組成物、および薬学的に許容可能な担体も好ましい。gBs3GC2bにしたがう抗体またはその抗原結合断片を含んでいる薬学的組成物、および薬学的に許容可能な担体も好ましい。gBs1GC3aにしたがう抗体またはその抗原結合断片を含んでいる薬学的組成物、および薬学的に許容可能な担体も好ましい。gBs3GC3bにしたがう抗体またはその抗原結合断片を含んでいる薬学的組成物、および薬学的に許容可能な担体も好ましい。gBs3GC4にしたがう抗体またはその抗原結合断片を含んでいる薬学的組成物、および薬学的に許容可能な担体も好ましい。gBs3GC5にしたがう抗体またはその抗原結合断片を含んでいる薬学的組成物、および薬学的に許容可能な担体も好ましい。
さらに、抗体Ts1GC1またはその抗原結合断片を含んでいる薬学的組成物、および薬学的に許容可能な担体も好ましい。抗体Ts1GC2aまたはその抗原結合断片を含んでいる薬学的組成物、および薬学的に許容可能な担体も好ましい。抗体Ts2GC2bまたはその抗原結合断片を含んでいる薬学的組成物、および薬学的に許容可能な担体も好ましい。抗体Ts2GC2cまたはその抗原結合断片を含んでいる薬学的組成物、および薬学的に許容可能な担体も好ましい。抗体Ts3GC2dまたはその抗原結合断片を含んでいる薬学的組成物、および薬学的に許容可能な担体も好ましい。抗体Ts3GC2eまたはその抗原結合断片を含んでいる薬学的組成物、および薬学的に許容可能な担体も好ましい。抗体Bs3GC1aまたはその抗原結合断片を含んでいる薬学的組成物、および薬学的に許容可能な担体も好ましい。抗体Bs3GC1bまたはその抗原結合断片を含んでいる薬学的組成物、および薬学的に許容可能な担体も好ましい。抗体Bs2GC1cまたはその抗原結合断片を含んでいる薬学的組成物、および薬学的に許容可能な担体も好ましい。抗体Bs2GC1cまたはその抗原結合断片を含んでいる薬学的組成物、および薬学的に許容可能な担体も好ましい。抗体Bs2GC1dまたはその抗原結合断片を含んでいる薬学的組成物、および薬学的に許容可能な担体も好ましい。抗体Bs1GC2aまたはその抗原結合断片を含んでいる薬学的組成物、および薬学的に許容可能な担体も好ましい。抗体Bs3GC2bまたはその抗原結合断片を含んでいる薬学的組成物、および薬学的に許容可能な担体も好ましい。抗体Bs1GC3aまたはその抗原結合断片を含んでいる薬学的組成物、および薬学的に許容可能な担体も好ましい。抗体Bs1GC3bまたはその抗原結合断片を含んでいる薬学的組成物、および薬学的に許容可能な担体も好ましい。抗体Bs1GC4またはその抗原結合断片を含んでいる薬学的組成物、および薬学的に許容可能な担体も好ましい。抗体Bs1GC5またはその抗原結合断片を含んでいる薬学的組成物、および薬学的に許容可能な担体も好ましい。
一実施形態において、本発明の組成物は、本発明の抗体を含んでいてもよいが、当該抗体は、当該組成物において、タンパク質全体の少なくとも５０重量％（例えば、６０重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％、９５重量％、９７重量％、９８重量％、９９重量％またはそれ以上）を構成してもよい。このような組成物において、上記抗体は、精製形態が好ましい。
本発明は、（ｉ）本発明の抗体を調製する工程；および（ｉｉ）精製された抗体を１つまたは複数の薬学的に許容可能な担体と混ぜる工程を含んでいる、薬学的組成物を調製する方法も提供する。
他の実施形態において、薬学的組成物を調製する方法は、抗体を１つまたは複数の薬学的に許容可能な担体と混ぜる工程を含んでおり、当該抗体は、本発明の形質転換Ｂ細胞または培養プラズマ細胞から得られたモノクローナル抗体である。ゆえに、まず、モノクローナル抗体を得る手順およびそれから医薬を調製する手順を、様々な場所（例えば様々な国）において様々な人々によって非常に異なる時間において実施することができる。
治療目的のための抗体またはＢ細胞の送達の代わりとして、Ｂ細胞または培養プラズマ細胞に由来する所望のモノクローナル抗体（または、その活性断片）をコードしている核酸（代表的にはＤＮＡ）を対象に送達することができ、上記核酸は、ｉｎ ｓｉｔｕにおいて対象に発現されることができ、所望の治療効果を提供する。好適な遺伝子治療および核酸送達ベクターは、当業者に知られている。
組成物は、特に、多剤投与形態に包装される場合、抗菌薬を含んでいてもよい。これらは界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）（例えばＴｗｅｅｎ８０））を含んでいてもよい。界面活性剤は、一般的には、低いレベル（例えば０．０１％未満）で存在する。組成物は、弾性力（tonicity）を付与するため、ナトリウム塩（例えば塩化ナトリウム）も含んでいてもよい。例えば、１０±２ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌ濃度が代表的である。
さらに、特に、組成物が凍結乾燥されるか、または凍結乾燥材料から再構成されている材料を含んでいる場合は、上記組成物は、糖アルコール（例えばマンニトール）または二糖（例えば、スクロールまたはトレハロース）を、例えば約１５〜３０ｍｇ／ｍｌ（例えば２５ｍｇ／ｍｌ）で含んでいてもよい。凍結乾燥のための組成物のｐＨは、凍結乾燥に先立って、５〜８の間、または５．５〜７の間、または約６．１に調製されてもよい。
本発明の組成物は、また、１つまたは複数の免疫調整剤を含んでいてもよい。一実施形態において、１つまたは複数の免疫調整剤はアジュバントを含んでいる。
〔医学的処置および使用〕
さらなる態様において、本発明は、（ｉ）炎症性疾患および／または自己免疫疾患の予防、処置または弱化；または（ｉｉ）炎症性疾患および／または自己免疫疾患の診断における、本発明に係る抗体またはその抗原結合断片、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、本発明に係る免疫原性ポリペプチドまたは本発明に係る薬学的組成物の使用を提供する。
炎症性疾患は、種々の原因によるものであってよい。本発明に関して、好ましくは、このような免疫性疾患は、処置、弱化および／または予防されてもよく、このような免疫性疾患は、物理的原因（例えば、やけど、凍傷、けが、鈍化または過敏（blunt or penetrating）、異物（例えば、破片、ほこりおよび塵）、トラウマおよび電離放射線）；生物学的原因（例えば、病原体の感染、過敏症による免疫反応およびストレス）；および化学的原因（例えば、化学刺激物、毒素およびアルコール）によるものである。
炎症性疾患（炎症性障害とも呼ばれる）は、以下の疾患を含んでおり、次のように、本発明に関して、炎症性疾患は、好ましくは、虫垂炎、滑液嚢炎、大腸炎、膀胱炎、皮膚炎、静脈炎、ＲＳＤ／ＣＲＰＳ、鼻炎、腱炎、扁桃炎、血管炎、アルツハイマー病、強直性脊椎炎、関節炎（変形性関節炎、リウマチ様関節炎（ＲＡ）、乾癬性関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、クローン病、大腸炎、皮膚炎、憩室炎、線維筋肉痛、肝炎、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、腎炎、パーキンソン病、漬瘍性大腸炎、尋常性座瘡、自己炎症性疾患、セリアック病、前立腺炎、肺胞蛋白症、糸球体腎炎、過敏症、炎症性腸疾患、骨盤内炎症性疾患、再潅流傷害、サルコイドーシス、移植拒絶反応、血管炎、間質性膀胱炎、炎症性ミオパシー、脳脊髄炎（特に急性散在性脳脊髄炎）、脊椎炎（特に硬直性脊椎炎）、抗ＡＲＳ抗体症候群、皮膚炎（特にアトピー性皮膚炎または接触性皮膚炎）、肝炎（特に自己免疫性肝炎）、自己免疫性末梢神経障害、膵炎（特に自己免疫性膵炎）、ベーチェット病、ビッカースタッフ型、脳幹脳炎、ブラウ症候群、セリアック病、シャーガス病、多発神経障害（特に慢性炎症性脱髄性多発神経障害）、骨髄炎（特に慢性再発性多発性骨髄炎）、チャーグ・ストラウス症候群、コーガン症候群、巨細胞動脈炎、ＣＲＥＳＴ症候群、血管炎（特に、皮膚小血管炎（cutaneous small-vessel vasculitis）および蕁麻疹様血管炎）、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、全身性強皮症、ドレスラー症候群、薬剤誘導性ループス、円柱状エリテマトーデス、腱付着部炎、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、結節性紅斑、特発性肺線維症、胃炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、汗腺膿瘍、特発性炎症性脱髄疾患、筋炎（特に封入体筋炎）、膀胱炎（特に間質性膀胱炎）、川崎病、扁平苔癬、ルポイド肝炎、Ｍａｊｅｅｄ症候群、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合結合組織病、脊髄炎（特に、視神経脊髄炎）、甲状腺炎（特にＯｒｄ甲状腺炎（Ord’s thyroiditis））、リウマチ（特に回帰性リウマチ）、パーソナージェ・ターナー症候群、尋常性天疱瘡、静脈周囲脳炎、結節性多発性動脈炎、多発性筋痛（特にリウマチ性多発性筋痛）、多発性筋炎、肝硬変（特に原発性胆汁性肝硬変）、胆管炎（特に原発性硬化性胆管炎）、進行性炎症性神経障害、ラスムッセン脳炎、再発性多発性軟骨炎、関節炎（特に、反応性関節炎（ライター病）およびリウマチ様関節炎）、リウマチ熱、サルコイドーシス、シュニッツラー症候群、血清病、脊椎関節症、高安動脈炎、トローザ・ハント症候群、横断性脊髄炎およびウェゲナー肉芽腫症からなる群より選択されてもよい。
自己免疫障害（自己免疫疾患とも呼ばれる）は、以下の疾患を含んでおり、ゆえに、本発明に関して、自己免疫疾患は、好ましくは、ＣＮＳの自己免疫疾患、自己炎症性疾患、セリアック病；シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、ブラウ症候群、水疱性類天疱瘡、がん、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、慢性再発性多発性骨髄炎、慢性閉塞性肺疾患、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、補体第二成分欠損症、接触性皮膚炎、頭部動脈炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、クッシング症候群、ダーカム病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、一型糖尿病、びまん性全身性硬直症、ドレスラー症候群、ループス、円柱状エリテマトーデス、湿疹、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、アディソン病、無ガンマグロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリック病；運動ニューロン疾患とも呼ばれる）、強直性脊椎炎抗リン脂質抗体症候群、抗ＡＲＳ抗体症候群、アトピー性皮膚炎、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性心筋症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性末梢神経障害、自己免疫性膵炎、自己免疫性内分泌腺症候群（Autoimmune polyendocrine syndrome）、自己免疫性プロゲステロン性症候群、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性ブドウ膜炎、バロー病／バロー同心円性硬化症、ベーチェット病、バーガー病、ビッカースタッフ型脳幹脳炎、子宮内膜症、付着部炎関連関節症、好酸球性胃腸炎、後天性表皮水疱症、胎児赤芽球症、エヴァンス症候群、化骨性線維異形成、線維化性肺胞炎（または、特発性肺線維症）、胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本脳症、橋本甲状腺炎、妊娠性類天疱瘡、汗腺膿瘍、低ガンマグロブリン血症、特発性血小板減少性紫斑病（自己免疫性血小板減少性紫斑病）、ＩｇＧ腎炎、眼部瘢痕性類天疱瘡、封入体筋炎、リウマチ様関節炎、慢性炎症性リウマチ熱、脱髄性多発神経障害、サルコイドーシス、回帰性リウマチ、間質性膀胱炎、若年性特発性精神分裂症、ＰＡＮＤＡＳ（小児自己免疫性溶連菌関連性精神神経障害）、シュミット症候群、ＡＰＳの神経精神川崎病の他の形態（neuropsychiatric Kawasaki's disease another form of APS）、シュニッツラー症候群、傍腫瘍性小脳変性症候群、白血球破砕型血清病、扁平苔癬、シューグレン症候群、硬化性苔癬、パーソネージ・ターナー、線状ＩｇＡ病、ステイル病、尋常性天疱瘡、ルポイド肝炎、自己免疫性肝炎、スティッフパーソン症候群、悪性貧血、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、ＰＯＥＭＳ症候群、紅斑性狼瘡、Ｓｗｅｅｔ症候群、交感性眼炎、メニエール病、全身性ループス、原発性胆汁性肝硬変症、ミラー・フィッシャー症候群、高安動脈炎、胆管炎、進行性炎症性神経障害、ムッハ・ハーベルマン病、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、多発性硬化症、赤芽球癆、ラスムッセン脳炎、重症筋無力症、横断性脊髄炎、レイノー現象、顕微鏡的大腸炎、潰瘍性大腸炎、筋炎、特発性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、視神経脊髄炎、デビック病およびニューロミオトニアからなる群より選択されてもよい。
代表的には、自己免疫疾患は、体内に普通に存在している物質および組織に対する身体の異常な免疫反応（自己免疫）から生じる。これは、特定の臓器に限定されてもよく（例えば自己免疫性甲状腺炎）、異なる部位における特定の組織に関連していてもよい（例えば、肺および腎臓の両方の基底膜を冒し得るグッドパスチャー症）。自己免疫疾患は、過敏症の対応する種類によって分類されてもよい：タイプＩ（例えば、自家血清に誘発される蕁麻疹）、タイプＩＩ、タイプＩＩＩまたはタイプＩＶ。
特に、少なくともいくつかの自己免疫疾患は、炎症性疾患であってもよく、その逆であってもよい。
自己免疫疾患および／または炎症性疾患は、好ましくは、本発明に関して、処置、予防および／または弱化され、自己免疫疾患および／または炎症性疾患としては、多発性硬化症、肺胞蛋白症、関節炎（特にリウマチ様関節炎）および喘息が含まれる。
本発明の範囲には、薬学的組成物に関して、上記に記載されているような抗体またはその抗原結合断片、核酸、ベクター、細胞、免疫原性ポリペプチドまたは薬学的組成物のいくつかの投与の形態および投与の経路が含まれる。これは、本明細書で記載されているような抗体またはその抗原結合断片、核酸、ベクター、細胞、免疫原性ポリペプチドの使用に関して（特に、好ましい投与の形態および投与の経路に関して）も使用される。
診断の方法は、抗体または抗体断片を試料と接触させることを含んでいる。このような試料は対象から単離されてもよく、例えば、鼻腔、鼻孔、唾液腺、肺、肝臓、膵臓、腎臓、耳、目、胎盤、消化管、心臓、卵巣、下垂体、副腎、甲状腺、脳、皮膚または血液（好ましくは血清）から得られる、例えば単離組織試料であってもよい。また、診断の方法は、抗原／抗体複合体の検出（特に、以下に示すような、抗体または抗体断片との試料の接触）を含んでいてもよい。このような診断工程は、代表的には、実験室において（すなわち、人体または動物の体にまったく触れることなく）行われる。検出方法の例は、例えばＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法（enzyme-linked immunosorbent assays））を含んでいる。
本発明は、（ａ）炎症性疾患および／または自己免疫疾患の処置または弱化のための薬剤の製造または（ｂ）炎症性疾患および／または自己免疫疾患の診断における、（ｉ）本発明に係る抗体、抗体断片またはバリアントおよびこれらの派生物、（ｉｉ）本発明に係る不死化Ｂ細胞クローン、（ｉｉｉ）本発明に係る核酸もしくはベクターまたは（ｉｖ）本発明の薬学的組成物の使用も提供する。
本発明は、炎症性疾患および／または自己免疫疾患の予防または処置のための薬剤としての使用のための本発明の組成物も提供する。これは、対象の処置および／または対象における診断のための薬剤の製造での、本発明の抗体および／またはこのような抗体が結合するエピトープを含んでいるタンパク質の使用も提供する。これは、本発明の組成物を対象に投与する工程を含んでいる、対象を処置する方法も提供する。いくつかの実施形態において、上記対象はヒトであってもよい。治療的処置の有効性の確認の１つの方法は、本発明の組成物の投与後に疾患症状を観察することを含んでいる。処置は、単回投与計画であってもよく、複数回投与計画であってもよい。
一実施形態において、本発明に係る抗体、抗体断片、不死化Ｂ細胞クローンまたは薬学的組成物は、このような処置を必要とする対象へと投与される。このような対象としては、炎症性疾患および／または自己免疫疾患のリスクが特にある対象または炎症性疾患および／または自己免疫疾患に特に罹りやすい対象が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明において記載されるような抗体およびその断片は、炎症性疾患および／または自己免疫疾患の診断のためのキットにおいて使用されてよい。さらに、本発明の抗体を結合できる、少なくとも２つのエピトープ（特にサイトカイン（例えばＧＭ−ＣＳＦ）のエピトープ）は、抗サイトカイン防御抗体（特に抗ＧＭ−ＣＳＦ防御抗体）の存在を検出するか、抗サイトカイン防御抗体（特に抗ＧＭ−ＣＳＦ防御抗体）の抗体価を決定することによって、使用手順の有効性を観察するためのキットにおいて使用されてもよい。
本発明は、１つまたは複数の薬学的に許容可能な担体とモノクローナル抗体を混ぜる工程を含んでいる、医薬を調製する方法も提供する。当該モノクローナル抗体は、本発明のトランスフェクションされた宿主細胞から得られたモノクローナル抗体である。ゆえに、まず、上記モノクローナル抗体を得て（例えば、それを発現させておよび／またはそれを精製して）、それから１つまたは複数の薬学的担体とそれを混ぜるという手順は、様々な場所（例えば様々な国）において様々な人々によって非常に異なる時間において実施することができる。
本発明の形質転換Ｂ細胞または培養プラズマ細胞をはじめとして、形質転換Ｂ細胞または培養プラズマ細胞によって発現される抗体を固定化するため、各工程における任意の最適化とともに、培養工程、サブ培養工程、クローニング工程、サブクローニング工程、シークエンスする工程、核酸調製工程等の種々の工程を行ってもよい。一実施形態において、上述の方法は、抗体をコードしている核酸に使用される最適化の技術（例えば、親和性成熟および最適化）をさらに含んでいる。本発明は、これらの工程の間で使用され、調製される、細胞、核酸、ベクター、配列、抗体等のすべてを含んでいる。
これらすべての方法において、発現宿主において用いられる核酸は、特定の核酸配列を挿入、削除または変更するために操作されてもよい。このような操作による変更は、制限部位を導入するための変更、コドンユーセージを改良するための変更、転写調節配列および／または翻訳調節配列を加えるか、最適化するための変更等が含まれるが、これらに限定されない。コードされるアミノ酸を変更するために、核酸を変えることもできる。例えば、抗体のアミノ酸配列への、１つまたはそれ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０つ等）のアミノ酸置換、アミノ酸削除および／またはアミノ酸挿入を行うことが有用であろう。このような点変異は、エフェクター機能、抗原結合親和力、翻訳後修飾、免疫原性等を変えてもよく、共有基（例えばラベル）の結合のためのアミノ酸を導入してもよく、タグ（例えば精製目的のタグ）を導入してもよい。変異は、特定の部位に導入されてもよく、選択（例えば分子進化）に続いて、ランダムに導入されてもよい。例えば、本発明の抗体のＣＤＲ領域、重鎖可変領域または軽鎖可変領域のいずれかをコードしている１つまたは複数の核酸を、ランダムにまたは直接的に変異させ、コードされるアミノ酸に異なる特性を導入してもよい。このような変更は、最初の変更が維持され、他のヌクレオチド部位における新たな変更が導入される反復プロセスの結果であってもよい。さらに、独立した工程で達成される変更を組み合わせてもよい。コードされるアミノ酸に導入される異なる特性は、向上された親和性が含まれてもよいが、これに限定されない。
本発明は、本明細書に記載されている特定の実施形態によって範囲が限定されることはない。実際に、本明細書に記載されている変更だけでなく本発明の種々の変更が、説明および添付の図面から当業者にとって明らかであろう。このような変更は、添付の請求項の範囲に含まれる。
そのほかは定義されていないが、本明細書で使用されている技術用語および科学用語のすべてが、この発明が属する分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有している。本明細書で記載されているものと同じか対応する方法および材料を本発明の実施または試験において使用してもよいが、好適な方法および材料が本明細書に記載されている。本明細書にて言及されている文献、特許明細書、特許および他の参考文献のすべては、その全体が参照によって本明細書に援用される。紛争の場合は、定義を含んでいる本明細書が制限される。
以下の図面、配列表および実施例は、本発明をさらに説明することを意図している。これらは、本発明の目的をこれらに限定することを意図していない。
〔図面の説明〕
図１は、（Ａ）〜（Ｃ）を示している。（Ａ）ＧＣＡ２１、ＧＣＡ７およびＧＣＢ５９の間におけるＳＰＲ交差競合、（Ｂ）ＧＣＡ２１、ＧＣＡ７および部位ＩＶ ＧＣＢ５９を用いてコートされている多チャンネルチップは、ＧＭ−ＣＳＦによって浸され、過剰量の同じ抗体に連続的にさらされた。（Ｃ）交差競合しない３つの抗体を、単独にか、または等モル濃度（１：１）もしくは抗体の１０倍過剰（１０：１）において加えられているＧＭ−ＣＳＦとともに、含んでいるサンプルのＳＥＣ−ＨＰＬＣプロファイル。
図２は、３つの抗体の組み合わせによる、ＧＭ−ＣＳＦの強力なインビトロ中和を示している。一定量のＧＭ−ＣＳＦ（終濃度５０ｐｇ ｍｌ−１）を、１つ以上の抗体の段階希釈物とインキュベートし、ＴＦ１細胞（１００００／ウェル）に加え、細胞増殖を、チミジンの取り込みによって３日目に測定した。（Ａ）ＴＦ−１バイオアッセイの模式図。（Ｂ）単一のモノクローナル抗体、または２つもしくは３つの非交差競合抗体の混合物の段階希釈物を、ＧＭ−ＣＳＦを中和するそれらの能力について試験した。（Ｃ）上記試験の感度を、細胞の数およびＧＭ−ＣＳＦの濃度を示されている通りに変えることによって、変更した。単一の抗体または３つの非交差競合抗体を用いて達成された阻害が、各実験条件について示されている。
図３は、ＧＭ−ＣＳＦ免疫複合体の、インビボにおけるＦｃ−依存的な排除を示している。（Ａ）特異的な抗体の存在下においてＧＭ−ＣＳＦを検出するためのサンドイッチＥＬＩＳＡ。一定量のＧＭ−ＣＳＦを、個別にまたは組み合わせて加えられた３つのモノクローナル抗体（ＧＣＡ２１、ＧＣＡ７、ＧＣＢ５９）とともに、マウス血清に加えた。ＧＭ−ＣＳＦの定量化を、捕捉のための部位Ｉおよび検出のための部位ＩＩに特異的な抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによって実施した。中性（左）またはアルカリ性緩衝液（右）における段階希釈物を加え、ＧＭ−ＣＳＦ濃度を、ＧＭ−ＣＳＦ標準物質を基準にして決定した。破線は、抗体の非存在下において測定されたＧＭ−ＣＳＦの濃度を表している。（Ｂ）メスのＢａｌｂ／ｃマウス（１群につき５匹）に、１００μｇのモノクローナル抗体（ＩｇＧ型またはＩｇＧ−ＬＡＬＡ型における、ＧＣＡ２１（１ｍＡｂ）またはＧＣＡ２１＋ＧＣＡ７＋ＧＣＢ５９（３ｍＡｂ））または２ｍｇのＰＡＰ患者からの総ＩｇＧを注入し、１６時間後に２μｇのＧＭ−ＣＳＦを注入した。未処理の血清（左）またはアルカリ処理した血清（右）における、１日目および５日目のＧＭ−ＣＳＦ濃度が、示されている。（Ｃ）ＧＭ−ＣＳＦおよび示されている抗体を２４時間前に注入したマウスの血清の異なる希釈物に応じた、ＴＦ−１細胞の増殖。（Ｄ）１つまたは３つの抗体（ＩｇＧ型またはＩｇＧ−ＬＡＬＡ型における）によって形成されたＧＭ−ＣＳＦ免疫複合体の、Ｆｃ ＲＩＩａＴＺＭ−ｂｌ細胞またはＦｃ ＲＩＩｂ発現ＴＺＭ−ｂｌ細胞に対する、抗−ＩｇＧ Ｆｃ特異抗体を用いたフローサイトメトリ―によって測定されたときの結合。
図４は、３つの二重特異性構築型Ｂｓ１、Ｂｓ２およびＢｓ３ならびに３つの三重特異性構築型Ｔｓ１、Ｔｓ２およびＴｓ３の模式図を示している。位置Ａ、Ｂおよび／またはＣ（当てはまる場合に）が、構築型のそれぞれについて示されている。異なるＧＭ−ＣＳＦ抗体のうち重鎖および軽鎖（両方）の、単鎖可変ドメイン（ＳｃＶｄ）が、足場として使用されている１つのＧＭ−ＣＳＦ抗体のうち重鎖または軽鎖のＮ末端および／またはＣ末端に付加されている。黒い楕円はＶＨドメインを表しており、濃い灰色の楕円はＶＬドメインを表している。異なるＳｃＶｄのＶＨおよびＶＬは、特定のリンカーを介して接続されている。他のリンカーが、足場として使用されている全長抗体に、互いの間にあるＳｃＶｄを接続するために使用されている。薄い灰色の楕円は、ＩｇＧ１ ＣＨドメインおよびＩｇＧ１ ＣＬドメインを表している。
図５は、ＴｓＧＣ１が非常に高いアフィニティおよび非常に緩やかな解離速度を有してＧＭ−ＣＳＦに結合していることを示している（Ａ）。（Ｂ−Ｃ）ＴｓＧＣ１は、ＧＭ−ＣＳＦに対する結合について、３つの異なる特異性のすべてを利用し得る。ＧＣＡ２１、ＧＣＡ７およびＧＣＢ５９は、ＳＲＰチップ上に不動化され、（１）ＧＭ−ＣＳＦ、（２）ＧＣＡ７、ＧＣＢ５９およびＧＣＡ２１のそれぞれ、ならびに（３）最後にＴｓＧＣ１に、連続的にさらされた。（Ｅ）ＴｓＧＣ１は、ＧＭ−ＣＳＦと高分子量複合体を形成し得る。ＴｓＧＣ１は、ＳＰＲチップ上に不動化され、ＧＭ−ＣＳＦおよび可溶性ＴｓＧＣ１に対して３回にわたって、連続的にさらされた。コントロールとしてＧＣＡ７を用いて実施された同じ実験が示されている。
図６は、単一の抗体、またはＴｓｇＣ２ｄおよびＢｓＧＣ３ａを形成している抗体の組み合わせと比べたときの、ＴｓｇＣ２ｄおよびＢｓＧＣ３ａによるＧＭ−ＣＳＦの非常に強力な中和を示している。
図７は、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＴｓＧＣ２ｄまたはＢｓＧＣ３ａによって形成されている免疫複合体の、ＦｃＲＩＩａまたはＦｃＲＩＩｂを発現しているＴＺＭ−ｂｌ細胞に対する、抗−ＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体を用いたフローサイトメトリーによって測定されるときの、結合を示している。結合は、単一の抗体、ならびにＢｓＧＣ３ａおよびＴｓＧＣ２ｄをそれぞれ形成している２つまたは３つの抗体の組み合わせの結合と比較されている。
〔実施例〕
本発明の例示的な実施形態が、以下の実施例に示されている。以下の実施例は、例示のみを目的として、本発明を使用するときに当業者を助けるためだけに与えられている。実施例は、それ以外に、本発明の範囲を限定することを決して目的としていない。
（実施例１：ＧＭ−ＣＳＦ特異抗体の単離および性質決定）
末梢血サンプルを、５人の肺胞タンパク症（ＰＡＰ）患者から回収した。ＩｇＧメモリＢ細胞を、磁気細胞分離および蛍光活性化細胞分離（特に抗ＦＩＴＣマイクロビーズ（Miltenyi Biotec）を用い、後にＣＤ２２−ＦＩＴＣ（BD Phamingen）によってＰＢＭＣを染色する）の組み合わせによって、凍結保存されていたＰＢＭＣまたは新しいＰＢＭＣから単離した。それから、Traggiai E. et al. (2004) Nat Med. 10(8):871-5および国際公開2004/076677号によって説明されているように、ＩｇＧメモリＢ細胞を、フィーダー細胞存在下の３８４ウェルマイクロプレートにおいて、ＥＢＶ（エプステインバーウイルス）およびＣｐＧを有しているクローン条件において不死化した。培養上澄を、ＧＭ−ＣＳＦ特異的ＩｇＧ抗体の存在について、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。ＧＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体を産生している４つの不死化Ｂ細胞クローンを同定した。ｃＤＮＡを陽性の培養物から合成し、抗体Ｖ遺伝子（重鎖および軽鎖の可変領域）を、配列決定し、ＩＭＧＴデータベース（http://www.imgt.org/）を用いて分析した。４つのＰＡＰ自己抗体のＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子使用率が、表５に示されている。
Figure 2018520987
すべての抗体は、HEK 293 Freestyle Cells（Invitrogen）の、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いた一過性トランスフェクションによって、ＩｇＧとして組換え産生された。抗体を、それから、ＥＬＩＳＡによるヒトＧＭ−ＣＳＦに対する結合について試験した。結合特性およびＶ遺伝子利用率が、表５に示されている。複数の抗体は、抗体MOR103およびナミルマブ（臨床開発中のＧＭ−ＣＳＦを中和するモノクローナル抗体であり、本明細書において基準抗体の役割を果たす）に匹敵する高いアフィニティを示した。ＥＣ５０値（ｎｇ／ｍｌ）を、ＥＬＩＳＡによって決定し、GraphPad Prism 5ソフトウェアを用いた非線形回帰分析によってサンプルごとに算出した。ＥＣ５０値は、６１．４〜３０７．６ｎｇ／ｍｌの範囲にあった。興味深いことに、抗体は、マウスおよびラットのＧＭ−ＣＳＦの両方と交差反応しなかった。
結合の反応速度を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定した。簡単に述べると、ＳＰＲのために、タンパク質Ａ（４５０ｎＭ）を、１０ｍＭの酢酸緩衝液に安定化させ、ＥＤＣ／ＮＨＳによってあらかじめ活性化させたProteOnセンサチップ（Biorad）上に、アミン結合を介して不動化させた（未反応の基をエタノールアミンＨＣｌ（１Ｍ）の注入によってブロックした）。ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水（ＨＢＳ）（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Tween-20）を、ランニングバッファーとして使用した。すべての注入を、１００μｌ／分の流速において行った。モノクローナル抗体を、ＨＢＳ（２００ｎＭ）において希釈し、タンパク質Ａによってコートされた、捕捉のためのチップ上に注入し、異なる濃度（４００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ）のヒトＧＭ−ＣＳＦを注入した（チップの１つのチャネルにＨＢＳを注入し、分析にとっての基準として使用した）。注入時間および解離時間は、それぞれ１２０秒および６００秒であった。ＧＭ−ＣＳＦとのｍＡｂの各結合反応を、ProteON XPR36機器（Biorad）を用いて評価し、データを、ProteOn Manager Softwareによって処理した。Ｋａ、ＫｄおよびＫＤを、Langmuirフィットモデルに当てはめて算出した。決定されたＫＤは、高いアフィニティ結合と一致する０．１８〜０．６９ｎＭの範囲であった。しかし、反応速度値は、非常に不均質であった。例えば、抗体ＧＣＡ７およびＧＣＢ５９は、類似のＫＤ値（０．３８および０．６８ｎＭ）を有していたが、異なる反応速度を示した（ＧＣＡ７は緩やかな結合／解離速度を、ＧＣＢ５９は高い結合／解離速度を特徴としていた）（表６）。
Figure 2018520987
（実施例２：４つのＰＡＰ自己抗体は、ＧＭ−ＣＳＦ上の異なる部位を認識し、高分子量免疫複合体を形成する）
異なる複数のｍＡｂの、ＧＭ−ＣＳＦに対する同時結合を評価するために、ＳＰＲ交差競合実験を、異なる複数のｍＡｂ（各２００ｎＭ）を、ＧＭ−ＣＳＦ捕捉（５０ｎＭ）の後に、連続的に注入することによって上述（実施例１）の通りに、実施した。注入時間および解離時間はそれぞれ６０秒および２０秒であった。これによって、ＧＣＡ７、ＧＣＡ２１、ＧＣＢ５９およびＧＣＥ５３６はＧＭ−ＣＳＦに対する結合についてそれらの間において交差競合しないことが分かった（図１Ａ）。興味深いことに、ＳＰＲ実験は、交差競合しない３つの抗体が単一分子のＧＭ−ＣＳＦに同時に結合し得ることを示している（図１Ｂ）。さらに、ＧＭ−ＣＳＦを過剰量の３つの抗体とインキュベートしたときに、高分子量の免疫複合体の形成が、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）によって、検出され得る（図１Ｃ）。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ実験において、交差競合しない３つのｍＡｂを、単独にか、または３つの抗体の組み合わせとして、ＰＢＳに希釈し、ＧＭ−ＣＳＦ（１：１または１０：１のモル比）と混合した（１時間、ＲＴ）。サンプルを、TSK-GEL G3000SWカラム（Tosoh、ベッド容量：１３ｍｌ、ボイド容量：４．６ｍｌ）を用いてAgilent 1100 HPLC機械（移動相としてＰＢＳ（流速：１ｍｌ／分）を用いた）によって分析した。ユニバーサル溶媒２μｍフィルタ（Agilent）を、インジェクタおよびカラムの間に置いた。検出を、２２０ｎｍの紫外吸収を有しているVariable Wavelength Detector（VWD、Agilent）によって実施した。
（実施例３：ＧＭ−ＣＳＦの強力なインビトロ中和は、重複しない部位に結合する３つの抗体の組み合わせを必要とする）
自己抗体の中和活性を、組換えＧＭ−ＣＳＦに応じたＴＦ−１細胞の増殖を阻害するそれらの能力を測定することによって評価した。この目的のために、ＴＦ−１細胞（CLS、Cell Lines Service）を、１０％のウシ胎児血清（Hyclone）、１％のペニシリン／ストレプトアビジン、１％の非必須アミノ酸、１％のピルビン酸ナトリウム、０．１％の２−メルカプトエタノール（すべてGIBCOから得た）を補ったＲＰＭＩ１６４０培地において維持した。細胞を、５％ＣＯ２を有している加湿されている３７℃のインキュベータにおいて培養した。ＧＭ−ＣＳＦ中和アッセイを、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３のいずれも有していない成長培地においてｍＡｂ（総ＩｇＧまたはアフィニティ精製された抗体）を段階希釈すること、１００ｐｇ／ｍｌの濃度においてＧＭ−ＣＳＦを加えること、ならびに９６ウェルの平底細胞培養プレート（Costar）において、１時間にわたって３７℃においてプレインキュベートすることによって、実施した。細胞を、５回にわたって洗浄し、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３のいずれも有していない成長培地において希釈し、１ウェルにつき１００００細胞を播いた（ＧＭ−ＣＳＦの終濃度は５０ｐｇ／ｍｌに等しい）。他の試験において、ＧＭ−ＣＳＦを、５００および５０００ｐｇ／ｍｌの終濃度において使用し、ウェルにつき１０００細胞を播いた。抗体非存在の、ＧＭ−ＣＳＦありまたはなしの細胞を、細胞増殖の最大レベルおよび最少レベルを決定するためのコントロールとして使用した。プレートを、５％ＣＯ２を有している加湿されている３７℃のインキュベータにおいて７２時間にわたってインキュベートし、細胞増殖を、０．２μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］−チミジン（PerkinElmer）を用いた６時間のインキュベーション後に測定した。ＧＭ−ＣＳＦ中和を、以下の式を用いて、ＴＦ−１成長のパーセンテージとして算出した。
［１−（シグナルウェルのＣＣＰＭ−ＧＭ−ＣＳＦなしで培養したコントロール細胞の平均ＣＣＰＭ）／（ＧＭ−ＣＳＦありで培養したコントロール細胞の平均ＣＣＰＭ−ＧＭ−ＣＳＦなしで培養したコントロール細胞の平均ＣＣＰＭ）］×１００（ＣＣＰＭ＝補正されたカウント／分）
ＩＣ９０（μｇ／ｍｌ）を、GraphPad Prism 5ソフトウェアを用いた非線形回帰分析によってサンプルごとに算出した。一部の実験において、マウス血清を、ＴＦ−１成長培地において力価測定し、３７℃において３０分にわたってプレインキュベートした。ＴＦ−１細胞を、洗浄し、播いた（ウェルにつき１０００細胞）。力価測定のＧＭ−ＣＳＦ（６００００〜０．３ｎｇ／ｍｌ）を、成長コントロールとして使用した。各シグナルウェルのＣＣＰＭを、血清力価測定に対してプロットした。
意外なことに、このバイオアッセイを用いると、ＧＣＡ２１、ＧＣＡ７およびＧＣＢ５９は、１ｍｇ／ｍｌの濃度において試験されたとき（データを示さず）でさえ、ＧＭ−ＣＳＦを中和できなかった（図２Ｂ）。唯一の例外は、２．４３μｇ／ｍｌのＩＣ９０値を有してＧＭ−ＣＳＦを中和したＧＣＥ５３６であり、治療抗体ナミルマブおよびＭＯＲ１０３はそれぞれ、０．８０および０．１６のＩＣ９０値を示した。興味深いことに、互いに組み合わせたとき、２つの非交差競合抗体は、用量反応および阻害率の両方について増強された中和活性を示し、ＧＣＡ２１およびＧＣＢ５９の組み合わせが最も有効であった（図２Ｂ）。際立って、３つの非交差競合抗体の組み合わせ（ＧＣＡ２１、ＧＣＡ７およびＧＣＢ５９）は、０．０８μｇ／ｍＬ（３つのｍＡｂの合計濃度として表されている）のＩＣ９０値（治療抗体ＭＯＲ１０３およびナミルマブのＩＣ９０値より低かった）を有して増殖の完全な阻害に導いた（図２Ｂ）。
質量作用の法則から予想される通り、細胞数およびＧＭ−ＣＳＦ濃度を変更することによって、アッセイの感度は劇的に影響されることが、認められた。特に、ＴＦ−１細胞の減少およびＧＭ−ＣＳＦの濃度の低下は、より高感度の試験をもたらし、単一の抗体および複数の抗体による促進された中和を示した（図２Ｃ）。対照的に、多数のＴＦ−１細胞および高用量のＧＭ−ＣＳＦを用いたとき、最も強力な中和抗体ＭＯＲ１０３およびナミルマブでさえ、４００倍過剰のモル濃度の存在下でも、ＧＭ−ＣＳＦを中和できなかった。際立って、すべての条件において、３つの非交差競合抗体の組み合わせは、ＧＭ−ＣＳＦを完全に中和できた。
（実施例４：ＧＭ−ＣＳＦ免疫複合体の、インビボにおけるＦｃ依存性のクリアランス）
ＧＭ−ＣＳＦが３つの抗体との複合体を形成し（サイトカインの生理活性の有効なインビトロ中和を生じ）得ることを証明するために、単一の自己抗体 対 複数の自己抗体のインビボ作用を試験した。この目的のために、６〜８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスの群に、ＰＡ９６患者から精製された、１００μｇの精製ｍＡｂまたは２ｍｇの総ＩｇＧを静脈内に注入した。１６時間後に、２μｇのヒトＧＭ−ＣＳＦを注入した。血清サンプルを、１日目および５日目に回収した。ＧＭ−ＣＳＦを、サンドイッチＥＬＩＳＡによって定量化した。簡単に述べると、ＧＭ−ＣＳＦの部位ＩＩに結合される１０μｇ／ｍｌの抗体を、９６ウェルMaxisorpプレート（Nunc）をコートする（それからＰＢＳ＋１０％のＦＢＳ（Gibco）によってブロックされた）ために使用した。すべての血清およびＧＭ−ＣＳＦを、力価測定し、異なる条件（未処理、および免疫複合体を分離するためのアルカリ処理後のいずれか；図３Ａ）のもとに平行して（１つのプレートにおいて、すべてのサンプルに、２５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のアルカリ解離緩衝液（２．５％のTriton X100、２Ｍのエタノールアミン、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ１１．６）を加え、他のプレートにおいて、すべてのサンプルに、２５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＰＢＳ＋１０％のＦＢＳを加えた）試験した。プレートを、ＲＴにおいて一晩、放置した。捕捉されたＧＭ−ＣＳＦの検出を、ＧＭ−ＣＳＦの部位Ｉに結合され（１時間、ＲＴ）、それから０．５μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−ＡＰ（Jackson ImmunoResearch）を結合する（１時間、ＲＴ）、１μｇ／ｍｌのビオチン化抗体を用いて実施した。プレートをそれから洗浄し、基質（ｐ−ＮＰＰ、Sigma）を加え、プレートを４０５ｎｍにおいて読み取った。
抗体の非存在において、注入されたＧＭ−ＣＳＦは、血清から急速に消失し、２４時間後に検出できなかった（図３Ｂ）。対照的に、単一の抗体（ＧＣＡ２１またはＭＯＲ１０３）を使用したとき、高レベルのＧＭ−ＣＳＦが、１日目に回収され、５日目に依然として存在した。注目すべきことに、ＧＭ−ＣＳＦ検出は、ＭＯＲ１０３の場合にアルカリ解離を必要とし、ＧＣＡ２１の場合に必要とせず、２つの抗体の異なる解離速度と一致していた（表６）。特に対照的に、マウスが、３つの非交差競合抗体（ＧＣＡ２１、ＧＣＡ７およびＧＣＢ５９）またはＰＡＰ ＩｇＧを受けたとき、少ない量または検出不可能な量のサイトカインがアルカリ解離後の１日および５日の血清に検出できただけなので、ＧＭ−ＣＳＦは急速に排除された。
ＧＭ−ＣＳＦの排除におけるＦｃ受容体の予想される役割に取り組むために、同じ抗体を、バリアント型（Ｃ１ｑまたはＦｃ−γ受容体に結合しない、いわゆるＬＡＬＡ）において試験した。野生型の抗体と同様に、単一のＬＡＬＡ抗体は、血清におけるＧＭ−ＣＳＦレベルの増大を導いた。しかし、３つの野生型抗体について観察されたことと対照的に、３つのＬＡＬＡ抗体は、ＧＭ−ＣＳＦを排除できず、アルカリ解離後の５日目にさえ血清において定量的に回収された（図３Ｂ）。
抗体に結合されているＧＭ−ＣＳＦが生物に利用可能であるか否かを求めるために、マウスの血清を、ＴＦ−１増殖を補助するそれらの能力について試験した（図３Ｃ）。ＧＣＡ２１またはＭＯＲ１０３を受けているマウスの血清は、ＴＦ−１細胞の旺盛な増殖を導き、サイトカイン受容体と会合するために十分なＧＭ−ＣＳＦ解離速度と一致していた。対照的に、３つの野生型抗体またはＰＡＰ ＩｇＧを受けているマウスの血清は、増殖を刺激できず、免疫複合体のインビボ排除と一致していた。さらに、３つのＬＡＬＡ抗体を受けているマウスの血清は、高レベルのＧＭ−ＣＳＦを含んでいるが、刺激性ではなく、この知見は、安定な免疫複合体におけるＧＭ−ＣＳＦの不可逆的な隔離と一致している。
Ｆｃγ−受容体の役割にさらに取り組むために、ＧＭ−ＣＳＦおよび野生型抗体もしくはＬＡＬＡ抗体の間に形成される免疫複合体を、異なるＦｃγ−受容体を発現しているＴＺＭ−ｂｌ細胞に結合するそれらの能力について試験した。この目的のために、特異的なＦｃγ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂまたはＦｃγＩＩＩａ）によってそれぞれトランスフェクトされている、４つのＴＺＭ−ｂｌ細胞株（NIH AIDS Research & Reference Reagent Program）を、１０％のウシ胎児血清（Hyclone）、０．０２５ＭのＨｅｐｅｓ、１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび２０μｇ／ｍｌのブラスチシジンを補ったＤＭＥＭにおいて維持した。細胞を、５％ＣＯ２を有している加湿されている３７℃のインキュベータにおいて培養した。特異的なＦｃγＲの発現を、ＦＩＴＣ複合化抗ＣＤ６４（抗ＦｃγＲＩ）、抗ＣＤ３２（抗ＦｃγＲＩＩａおよび抗ＦｃγＲＩＩｂ）および抗ＣＤ１６（抗ＦｃγＲＩＩＩａ）抗体（すべてBD Pharmingenから得た）によってＴＺＭ−ｂｌ細胞を染色することによって、評価した。トランスフェクトされていないＴＺＭ−ｂｌ細胞およびトランスフェクトされたＴＺＭ−ｂｌ細胞を、染色緩衝液（１０％のウシ胎児血清および２ｍＭのＥＤＴＡを有しているＰＢＳ）を用いて洗浄し、５００００細胞／ウェルの密度において９６ウェルプレートに播いた。単一の抗ＧＭ−ＣＳＦ ｍＡｂ（ＧＣＡ２１）または３つの非交差競合ｍＡｂ（ＧＣＡ２１、ＧＣＡ７およびおよびＧＣＢ５９）の組み合わせを、２．５μｇ／μｌの濃度において、０．０５μｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦまたは染色緩衝液（１０％のウシ胎児血清および２ｍＭのＥＤＴＡを有しているＰＢＳ）と混合した。すべての抗体のＬＡＬＡ型、および異なる特異性を有しているｍＡｂをコントロールとして含めた。サンプルを、３０分にわたって３７℃においてインキュベートして免疫複合体を形成させ、それからＴＺＭ−ｂｌ細胞にそれらを加える前の３０分にわたって４℃まで冷やした。細胞を、２回にわたって洗浄し、抗−ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異Ｆ（ａｂ’）２断片（anti-human IgG Fcγ fragment specific F(ab')2 fragment）（Jackson ImmunoResearchによって染色した。サンプルをBD FACSCanto（BD Biosciences）によって分析し、蛍光強度の中央値を、複数のサンプルの間において分析し、比較した。
強い結合は、ＦｃγＲＩＩａ発現細胞およびＦｃγＲＩＩｂ発現細胞に対してのみ、免疫複合体が３つの野生型抗体（ＬＡＬＡではない）によって形成されたときに、観察された（図３Ｄ）。これらを考慮すると、上述の結果は、単一の抗体が、強力にインビトロ中和するときにさえ、ＧＭ−ＣＳＦの半減期を延長させ、生物に利用可能なサイトカインの循環プールを構築することを示している。対照的に、３つ以上の抗体は、Ｆｃ依存的な機序を介して効率的に排除される免疫複合体の形成を導く。
（実施例５：最も高いＧＭ−ＣＳＦ中和活性を有している多重特異性抗体の遺伝子工学的作製）
サイトカインの効率的なインビボ中和および排除を実現するための、ＧＭ−ＣＳＦ上の複数の独立した部位を標的化する必要性の観点から、ＧＣＡ２１、ＧＣＡ７、ＧＣＢ５９およびＧＣＥ５３６のエピトープ結合部位、特定のリンカーならびに完全なヒトＩｇＧ Ｆｃを担持している二重特異性抗体および三重特異性抗体を、設計し、生成した（表７）。６つの異なる構築型を、多重特異性抗体を生成するために使用した（図４）。特に、３つの構築型Ｔｓ１、Ｔｓ２およびＴｓ３を、６つの異なる三重特異性の６価抗体を生成するために使用し、３つの構築型Ｂｓ１、Ｂｓ２およびＢｓ３を、１０の異なる二重特異性の４価抗体を、生成するために使用した（図４および表７）。構築型Ｂｓ１、Ｂｓ２、Ｂｓ３、Ｔｓ１、Ｔｓ２およびＴｓ３を、米国特許出願公開第2009/0155275号にしたがって設計した。
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（実施例６：多重特異性抗体の生産性および凝集の評価）
抗ＧＭ−ＣＳＦの多重特異性抗体を、２９３Ｆ細胞において産生させ、タンパク質Ａによって精製した。定量化を、製造者の指示（Thermo Scientific）にしたがって、Pierceビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイによって実施した。アッセイは、総タンパク質の比色検出および定量のための、界面活性剤と適合する、ＢＣＡに基づく形成である。生産性は、異なる抗体にしたがって変化した（Ｂｓ３ＣＧ１ａ、Ｂｓ１ＣＧ２ａ、Ｂｓ１ＣＧ３ａ、Ｂｓ３ＧＣ３ｂ、ＢｓＧＣ５は、３０μｇ／ｍｌを超える濃度において産生された）。多重特異性抗体（終濃度：１ｍｇ／ｍｌ）の凝集を、ＧＭ−ＣＳＦ（終濃度：０．１ｍｇ／ｍｌ）の存在または非存在の、ＯＤ３４０におけるそれらの濁度を測定することによって、分析した（表８）。
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（実施例７：多重特異性抗体は高いアフィニティを有してＧＭ−ＣＳＦに結合する）
すべての多重特異性抗体を、ＧＭ−ＣＳＦに対する結合についてＥＬＩＳＡによって試験した。結合は、以下の表９にＥＣ５０値によって示されている通り、ＧＭ−ＣＳＦに対する高いアフィニティを有して非常に特異的であった。多重特異性抗体の異なる結合部位の使用を、ＴｓＧＣ１をモデルとして用いたＳＰＲ実験によって試験した。この実験において、ＧＭ−ＣＳＦは、ＴｓＧＣ１を形成している３つの抗体のうち、余剰の２つによって結合されており、ＧＭ−ＳＣＦに対するＴｓ１ＧＣ１の、第３の特異性を介した、続く結合が明らかにされた。Ｔｓ１ＧＣ１は、非常に高いアフィニティ（図５Ａに示されている通りの非常に低いＫＤ）を有している。種々のＳＰＲ実験において、ＧＭ−ＣＳＦは、３つのＧＭ−ＣＳＦエピトープのうち１つのみがＴｓ１ＧＣ１によって結合せずに残されるように、Ｔｓ１ＧＣ１を構成している３つの抗体のうち、２つの抗体と複合体を形成していた（図５Ｂ〜Ｄ）。さらに、ＳＰＲチップ上に不動化されているとき、ＴｓＧＣ１は、従来の抗体（例えばＧＣＡ７）と異なり、可溶性のＧＭ−ＣＳＦおよびＴｓ１ＧＣ１に複数回にわたってチップを連続的にさらしたときに高分子量複合体を形成できた（図５Ｅ）。
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（実施例８：多重特異性抗体による非常に強力なＧＭ−ＣＳＦの中和）
ＧＭ−ＣＳＦ中和を、上述（実施例３）の通りにＴＦ−１細胞に基づくインビトロバイオアッセイを用いて試験した。ここで、２つの異なるＧＭ−ＣＳＦ濃度（５０および５００ｐｇ／ｍｌ）および２つの異なる細胞数／ウェル（１０００および１００００）を試験した。ＩＣ９０値を表１０に記録した。意外なことに、すべての多重特異性抗体は、非常に低い濃度（ほとんどの多重特異性抗体について１ｎｇ／ｍｌ未満）において試験されたすべての条件において、ＴＦ−１増殖を完全に阻害した。注目すべきことに、より程度の低い厳密な条件を用いて、ＭＯＲ１０３およびナミルマブは、最良の多重特異性抗体（ＴｓＧＣ２ａ）と比べて、それぞれ１００倍および６９０倍を超える濃度を要した。厳密な条件において、ほとんどの多重特異性抗体は、１０ｎｇ／ｍｌの濃度においてＧＭ−ＣＳＦを中和でき、ＭＯＲ１０３およびナミルマブは１ｍｇ／ｍｌを超える濃度を要した。２つの多重特異性抗体Ｔｓ３ＧＣ２およびＢｓ１ＧＣ３ａを、それらの全体的な特性について選択し、それらが得られている単一の抗体または抗体の組み合わせと比較した。
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（実施例９：多重特異性を有しているＧＭ−ＣＳＦの免疫複合体は、Ｆｃγ受容体ＩＩａおよびＩＩｂに結合する）
Ｆｃγ受容体の結合を求めるために、ＧＭ−ＣＳＦおよび多重特異性抗体の間に形成される免疫複合体を、ＦｃγＲＩＩａ受容体を発現しているＴＺＭ−ｂｌ細胞およびＦｃγＲＩＩｂ受容体を発現しているＴＺＭ−ｂｌ細胞に結合するそれらの能力について試験した。多重特異性抗体を、０．０５μｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦまたは染色緩衝液と混合した。サンプルを、３０分にわたって３７℃においてインキュベートして免疫複合体を形成可能にし、それから、ＴＺＭ−ｂｌ細胞にそれらを加える前の３０分にわたって４℃に冷却した。細胞を、２回にわたって洗浄し、抗−ヒトＩｇＧ Ｆｃγ断片特異Ｆ（ａｂ’）２断片を用いて染色した。サンプルを、BD FACSCanto（BD Biosciences）によって分析し、蛍光強度の中央値を、分析し、複数のサンプルの間において比較した。強い結合が、ＧＭ−ＣＳＦおよび異なる多重特異性抗体によって、ＦｃγＲＩＩａ発現細胞およびＦｃγＲＩＩｂ発現細胞上に形成された免疫複合体とともに、観察された（表１１）。特に、ＴｓＧＣ２ｄおよびＢｓ１ＧＣ３ａは、ＧＭ−ＣＳＦの存在下において、ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩｂに対する最も強い結合を示し、それらは、ＧＭ−ＣＳＦの存在下において、同じＦｃＲと弱く結合した（図７）。これらを考慮すると、上述の結果は、多重特異性モノクローナル抗体との免疫複合体におけるＧＭ−ＣＳＦが、Ｆｃ依存的機序を介してヒトの身体から排除され得ることを示唆している。
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（Ａ）ＧＣＡ２１、ＧＣＡ７およびＧＣＢ５９の間におけるＳＰＲ交差競合、（Ｂ）ＧＣＡ２１、ＧＣＡ７および部位ＩＶ ＧＣＢ５９を用いて覆われている多チャンネルチップは、ＧＭ−ＣＳＦによって浸され、過剰量の同じ抗体に連続的にさらされた。（Ｃ）交差競合しない３つの抗体を、単独にか、または等モル濃度（１：１）もしくは抗体の１０倍過剰（１０：１）において加えられているＧＭ−ＣＳＦとともに、含んでいるサンプルのＳＥＣ−ＨＰＬＣプロファイル。 ３つの抗体の組み合わせによる、ＧＭ−ＣＳＦの強力なインビトロ中和を示している。 ＧＭ−ＣＳＦ免疫複合体の、インビボにおけるＦｃ−依存的なクリアランスを示している。 ３つの二重特異性構築型Ｂｓ１、Ｂｓ２およびＢｓ３ならびに３つの三重特異性構築型Ｔｓ１、Ｔｓ２およびＴｓ３の模式図を示している。 ＴｓＧＣ１が非常に高いアフィニティおよび非常に緩やかな解離速度を有してＧＭ−ＣＳＦに結合していることを示している（Ａ）。（Ｂ−Ｃ）ＴｓＧＣ１は、ＧＭ−ＣＳＦに対する結合について、３つの異なる特異性のすべてを利用し得る。ＧＣＡ２１、ＧＣＡ７およびＧＣＢ５９は、ＳＲＰチップ上に不動化され、（１）ＧＭ−ＣＳＦ、（２）ＧＣＡ７、ＧＣＢ５９およびＧＣＡ２１のそれぞれ、ならびに（３）最後にＴｓＧＣ１の順にさらされた。（Ｅ）ＴｓＧＣ１は、ＧＭ−ＣＳＦと高分子量複合体を形成し得る。ＴｓＧＣ１は、ＳＰＲチップ上に不動化され、ＧＭ−ＣＳＦおよび可溶性ＴｓＧＣ１に対して３回にわたって、順にさらされた。コントロールとしてＧＣＡ７を用いて実施された同じ実験が示されている。 単一の抗体、またはＴｓｇＣ２ｄおよびＢｓＧＣ３ａを形成している抗体の組み合わせと比べたときの、ＴｓｇＣ２ｄおよびＢｓＧＣ３ａによるＧＭ−ＣＳＦの非常に強力な中和を示している。 ＣＳＦ、およびＴｓＧＣ２ｄまたはＢｓＧＣ３ａによって形成されている免疫複合体の、ＦｃＲＩＩａまたはＦｃＲＩＩｂを発現しているＴＺＭ−ｂｌ細胞に対する、抗−ＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体を用いたフローサイトメトリーによって測定されるときの結合を示している。

Claims (32)

  1. （ａ）少なくとも２つの異なるエピトープ結合部位；および
    （ｂ）Ｆｃ部分
    を含んでおり、
    上記少なくとも２つの異なるエピトープ結合部位のそれぞれが、サイトカインの個々のエピトープに対して特異的に結合し、これによって、上記少なくとも２つの異なるエピトープ結合部位が結合する、サイトカインの複数の上記個々のエピトープは、重複しない複数のエピトープである、
    単離された多重特異性の抗サイトカイン抗体またはその抗原結合断片。
  2. 上記抗体またはその抗原結合断片が、二重特異性、三重特異性、四重特異性または五重特異性であり、好ましくは上記抗体またはその抗原結合断片が、二重特異性、三重特異性または四重特異性であり、より好ましくは上記抗体またはその抗原結合断片が、二重特異性または三重特異性であり、それ以上に好ましくは上記抗体またはその抗原結合断片が、三重特異性であることを特徴とする、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  3. 上記抗体分子が、サイトカインにおける少なくとも２つの異なる重複しない部位に対して特異的に結合する上記異なるエピトープ結合部位のそれぞれを、厳密に２コピー含んでいることを特徴とする、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  4. 上記抗サイトカイン抗体が、抗コロニー刺激因子抗体および抗インターフェロン抗体からなる群から選択され、好ましくは上記抗サイトカイン抗体が、抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体および抗インターフェロン ベータ抗体からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  5. 上記抗サイトカイン抗体が抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体であることを特徴とする、請求項４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  6. 上記抗体が、二重特異性の４価抗体または三重特異性の６価抗体であることを特徴とする、請求項５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  7. 上記抗体またはその抗原結合断片が、
    （ｃ）少なくとも１つのリンカー
    をさらに含んでいることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
  8. 上記リンカーが、配列番号１４３もしくは１４４にしたがうアミノ酸配列もしくはその機能的な配列バリアントにしたがうアミノ酸配列を含んでいる、または当該アミノ酸配列もしくはその機能的な配列バリアントからなることを特徴とする、請求項７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  9. 上記抗体またはその抗原結合断片が、ＩｇＧ型であること、好ましくはＩｇＧ１型であること、より好ましくはＩｇＧ１ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３型の重鎖定常領域およびＩｇＧ１ ＣＫ型の軽鎖定常領域を含んでいること、それ以上に好ましくは配列番号１４０にしたがうアミノ酸配列もしくはその複数の機能的な配列バリアントを含んでいる重鎖定常領域、または当該アミノ酸配列もしくはその複数の機能的な配列バリアンからなる重鎖定常領域、ならびに配列番号１４１にしたがうアミノ酸配列もしくはその複数の機能的な配列バリアントを含んでいる軽鎖定常領域、または当該アミノ酸配列もしくはその複数の機能的な配列バリアントからなるＩｇＧ ＣＫ型の軽鎖定常領域を含んでいることを特徴とする、請求項１〜８いずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
  10. 上記抗体またはその抗原結合断片が、Ｂｓ１、Ｂｓ２、Ｂｓ３、Ｔｓ１、Ｔｓ２およびＴｓ３からなる群から選択される構築型であることを特徴とする、請求項１〜９いずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
  11. 上記抗体またはその抗原結合断片が、構築型Ｔｓ３にしたがっていること、好ましくは上記抗体またはその抗原結合断片が、構築型Ｔ３にしたがう三重特異性の抗体であることを特徴とする、請求項１０に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  12. 上記抗体またはその抗原結合断片が、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
  13. 上記抗体またはその抗原結合断片が、
    （ｉ）１５０ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ９０をともなった、厳密な条件；
    （ｉｉ）２０ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ９０をともなった、より程度の低い厳密な条件；
    （ｉｉｉ）１６０ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ９０をともなった、より厳密な条件；および／または
    （ｉｖ）１０００ｎｇ／ｍｌのＩＣ９０をともなった、非常に厳密な条件
    の下に、上記サイトカインを中和することを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
  14. 上記抗体またはその抗原結合断片が、少なくとも１つのＣＤＲＨ１、少なくとも１つのＣＤＲＨ２および少なくとも１つのＣＤＲＨ３を含んでいる重鎖、ならびに少なくとも１つのＣＤＲＬ１、少なくとも１つのＣＤＲＬ２および少なくとも１つのＣＤＲＬ３を含んでいる軽鎖を含んでおり、上記少なくとも１つの重鎖ＣＤＲＨ３が、配列番号３、５１、６９もしくは１０７にしたがうアミノ酸配列またはその複数の機能的な配列バリアントを含んでいること、好ましくは上記少なくとも１つの重鎖ＣＤＲＨ３が、配列番号３もしくは６９にしたがうアミノ酸配列またはその複数の機能的な配列バリアントを含んでいることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
  15. 上記抗体またはその抗原結合断片が、
    （ｉ）配列番号１〜５および７、または配列番号１〜４および６〜７にそれぞれしたがう、ＣＤＲＨ１アミノ酸配列、ＣＤＲＨ２アミノ酸配列、ＣＤＲＨ３アミノ酸配列、ＣＤＲＬ１アミノ酸配列、ＣＤＲＬ２アミノ酸配列およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列またはその複数の機能的な配列バリアント；
    （ｉｉ）配列番号４９〜５３および５５にそれぞれにしたがう、ＣＤＲＨ１アミノ酸配列、ＣＤＲＨ２アミノ酸配列、ＣＤＲＨ３アミノ酸配列、ＣＤＲＬ１アミノ酸配列、ＣＤＲＬ２アミノ酸配列およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列またはその複数の機能的な配列バリアント；
    （ｉｉｉ）配列番号６７〜７１および７３、または配列番号６７〜７０および７２〜７３にそれぞれしたがう、ＣＤＲＨ１アミノ酸配列、ＣＤＲＨ２アミノ酸配列、ＣＤＲＨ３アミノ酸配列、軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列、軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列および軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列またはその複数の機能的な配列バリアント；および／または
    （ｉｖ）配列番号１０５〜１０９および１１１、または配列番号１０５〜１０８および１１０〜１１１にしたがう、重鎖ＣＤＲＨ１アミノ酸配列、重鎖ＣＤＲＨ２アミノ酸配列、重鎖ＣＤＲＨ３アミノ酸配列、軽鎖ＣＤＲＬ１アミノ酸配列、軽鎖ＣＤＲＬ２アミノ酸配列および軽鎖ＣＤＲＬ３アミノ酸配列またはその複数の機能的な配列バリアント
    を含んでいることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
  16. 上記抗体またはその抗原結合断片が、
    （ｉ）配列番号３７にしたがうＶＨアミノ酸配列またはその複数の機能的な配列バリアント、および配列番号３８にしたがうＶＬアミノ酸配列またはその複数の機能的な配列バリアント；
    （ｉｉ）配列番号６３にしたがうＶＨアミノ酸配列またはその複数の機能的な配列バリアント、および配列番号６４にしたがうＶＬアミノ酸配列またはその複数の機能的な配列バリアント；
    （ｉｉｉ）配列番号９５にしたがうＶＨアミノ酸配列またはその複数の機能的な配列バリアント、および配列番号９６にしたがうＶＬアミノ酸配列またはその複数の機能的な配列バリアント；および／または
    （ｉｖ）配列番号１３０にしたがうＶＨアミノ酸配列またはその複数の機能的な配列バリアント、および配列番号１３１にしたがうＶＬアミノ酸配列またはその複数の機能的な配列バリアント
    を含んでいることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
  17. 上記抗体またはその抗原結合断片の上記重鎖が、配列番号４、５２、７０、１０８にしたがう複数のアミノ酸配列またはその複数の機能的な配列バリアントから選択されるＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号５、６、５３、５４、７１、７２、１０９、１１０にしたがう複数のアミノ酸配列またはその複数の機能的な配列バリアントから選択されるＣＤＲＬ２アミノ酸配列、および／または配列番号７、５５、７３、１１１にしたがう複数のアミノ酸配列またはその複数の機能的な配列バリアントから選択されるＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含んでいることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
  18. 上記抗体またはその抗原結合断片の上記重鎖が、配列番号３８、６４、９６、１３１にしたがう複数のアミノ酸配列またはその複数の機能的な配列バリアントから選択されるＶＬアミノ酸配列を含んでいること、好ましくは上記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号３８もしくは９６にしたがうＶＬアミノ酸配列またはその複数の機能的な配列バリアントを含んでいること、より好ましくは上記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号９６にしたがうＶＬアミノ酸配列またはその複数の機能的な配列バリアントを含んでいることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
  19. （ｉ）上記抗体またはその抗原結合断片が、構築型Ｂｓ１、Ｂｓ２、Ｂｓ３、Ｔｓ１、Ｔｓ２およびＴｓ３からなる群から選択される構築型であること；ならびに
    （ｉｉ）配列番号１〜７および６７〜７３にしたがう複数のアミノ酸配列からなる群から選択されるＣＤＲＨ１アミノ酸配列、ＣＤＲＨ２アミノ酸配列、ＣＤＲＨ３アミノ酸配列、ＣＤＲＬ１アミノ酸配列、ＣＤＲＬ２アミノ酸配列およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列、またはその複数の機能的な配列バリアントを、位置Ａおよび／またはＢのいずれかに含んでいること；好ましくは配列番号６７〜７１および７３、または配列番号６７〜７０および７２〜７３にしたがうＣＤＲＨ１アミノ酸配列、ＣＤＲＨ２アミノ酸配列、ＣＤＲＨ３アミノ酸配列、ＣＤＲＬ１アミノ酸配列、ＣＤＲＬ２アミノ酸配列およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列、またはその複数の機能的な配列バリアントを、位置Ａに含んでいることを特徴とする、請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
  20. 上記抗体またはその抗原結合断片が、ｇＴｓ１ＧＣ１、ｇＴｓ１ＧＣ２ａ、ｇＴｓ２ＧＣ２ｂ、ｇＴｓ２ＧＣ２ｃ、ｇＴｓ３ＧＣ２ｄ、ｇＴｓ３ＧＣ２ｅ、ｇＢｓ３ＧＣ１ａ、ｇＢｓ３ＧＣ１ｂ、ｇＢｓ２ＧＣ１ｃ、ｇＢｓ２ＧＣ１ｄ、ｇＢｓ１ＧＣ２ａ、ｇＢｓ３ＧＣ２ｂ、ｇＢｓ１ＧＣ３ａ、ｇＢｓ３ＧＣ３ｂ、ｇＢｓ３ＧＣ４、およびｇＢｓ３ＧＣ５にしたがうこと、好ましくは上記抗体またはその抗原結合断片が、ｇＴｓ３ＧＣ２ｄまたはｇＢｓ１ＧＣ３ａにしたがうことを特徴とする、請求項１〜１９のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
  21. 上記抗体またはその抗原結合断片が、Ｔｓ１ＧＣ１、Ｔｓ１ＧＣ２ａ、Ｔｓ２ＧＣ２ｂ、Ｔｓ２ＧＣ２ｃ、Ｔｓ３ＧＣ２ｄ、Ｔｓ３ＧＣ２ｅ、Ｂｓ３ＧＣ１ａ、Ｂｓ３ＧＣ１ｂ、Ｂｓ２ＧＣ１ｃ、Ｂｓ２ＧＣ１ｄ、Ｂｓ１ＧＣ２ａ、Ｂｓ３ＧＣ２ｂ、Ｂｓ１ＧＣ３ａ、Ｂｓ３ＧＣ３ｂ、Ｂｓ３ＧＣ４およびＢｓ３ＧＣ５であること、この２はＴｓ３ＧＣ２ｄまたはＢｓ１GC3aであることを特徴とする、請求項２０に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  22. 上記抗体またはその抗原結合断片が、モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、精製されている抗体または単鎖抗体であることを特徴とする、請求項１〜２１のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
  23. 医薬としての使用のための、請求項１〜２２のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
  24. 炎症性疾患および／または自己免疫疾患の予防、処置または弱化における使用のための、請求項１〜２２のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
  25. 請求項１〜２４のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片をコードしているポリヌクレオチドを含んでいる、核酸分子。
  26. 上記ポリヌクレオチド配列が、配列番号８〜３６、３９〜４８、５６〜６２、６５〜６６、７４〜９４、９７〜１０４、１１２〜１２９、１３２〜１３９、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０またはその機能的な配列バリアントのいずれか１つにしたがう核酸配列を含んでいる、または当該核酸配列からなる、請求項２５に記載の核酸分子。
  27. 上記ポリヌクレオチド配列が、配列番号３９〜４８、６５〜６６、９７〜１０４、１３２〜１３９、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０のいずれか１つにしたがう核酸配列またはその機能的な配列バリアントを含んでいる、または当該核酸配列からなる、請求項２６に記載の核酸分子。
  28. 請求項２５〜２７いずれかに記載の核酸分子を含んでいる、ベクター。
  29. 請求項１〜２４のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を発現する；または請求項２８に記載のベクターを含んでいる、細胞。
  30. 請求項１〜２４のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片に対して特異的に結合する少なくとも２つのエピトープを含んでいる、単離されている免疫原性ポリペプチドまたは精製されている免疫原性ポリペプチド。
  31. 請求項１〜２４のいずれかに記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項２５〜２７のいずれかに記載の核酸、請求項２８に記載のベクター、請求項２９に記載の細胞、または請求項３０に記載の免疫原性ポリペプチド、ならびに薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤または担体を含んでいる、薬学的組成物。
  32. （ｉ）炎症性疾患および／または自己免疫疾患の予防、処置または弱化；または（ｉｉ）炎症性疾患および／または自己免疫疾患の診断における使用のための、請求項１〜２４のいずれかに記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項２５〜２７に記載の核酸、請求項２８に記載のベクター、請求項２９に記載の細胞、または請求項３０に記載の免疫原性ポリペプチド、または請求項３１に記載の薬学的組成物。
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