CN102216327A - 中和抗甲型流感病毒抗体及其用途 - Google Patents
中和抗甲型流感病毒抗体及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及结合血凝素并中和甲型流感病毒的至少两种不同组1亚型或至少两种不同组2亚型感染的抗体及其抗原结合片段。本发明还涉及编码这样的抗体及抗体片段的核酸、产生这样的抗体及抗体片段的永生B细胞和培养的单浆细胞以及结合这样的抗体及抗体片段表位。此外，本发明还涉及所述抗体、抗体片段和表位在筛选方法中以及在甲型流感病毒感染的诊断、治疗和预防中的用途。
Description
本专利申请要求分别于2008年7月25日和2009年5月27日提交的美国临时专利申请第61/083,838号和第61/181,582号的权益，上述专利申请公开的全文以引用的方式并入本文，如同在本文中记载一样。
背景技术
对甲型流感病毒应答的中和抗体被认为对给定的病毒亚型是特异性的。存在16种通过血凝素(HA)定义的甲型流感亚型。16种HA，即H1-H16可分为两组。组1由H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13和H16亚型组成，组2包括H3、H4、H7、H10、H14和H15亚型。尽管所有的亚型都存在于鸟类中，但主要是H1、H2和H3在人类中引发疾病。H5、H7和H9亚型在人类中引起散发性严重感染并可能引起新的大流行病。H1和H3病毒不断地进化形成新的变体，这种现象称为抗原漂移。由此，对以前的病毒应答而产生的抗体对于新的漂移病毒保护性很差或没有保护性。其结果是每年必须要制备新疫苗以用于抵抗预计要出现的H1和H3病毒，这个过程很昂贵且并不总是有效。这同样适用于H5流感疫苗的制备。事实上，还不清楚基于越南或印度尼西亚甲型流感病毒分离体的现有H5疫苗是否能抵抗未来的流行性H5病毒。
由于这些原因，非常期望拥有诱导能够中和所有甲型流感病毒亚型及其每年的变体(2006年，由Gerhard等人进行了综述)的广谱中和抗体的疫苗。此外，广谱中和异亚型抗体也可用在预防和治疗中。
已经表征了识别甲型流感病毒的抗体。M2的抗体(只在被感染细胞上表达，而不在感染性病毒上表达的一种不变的小蛋白质)已经显示出一些体内保护效果，这可能是通过用NK细胞或胞毒性T细胞靶向感染的细胞并加以破坏来实现的。但是，HA是中和抗体的首要目标。其包含约500个氨基酸的大胞外域，其被宿主来源的酶裂解以产生通过二硫键连接的两个多肽。较大的N-末端片段(HA1，320至330个氨基酸)形成包含受体结合位点和大部分被病毒中和抗体识别的决定簇的膜远端的球状域。较小的C-末端部分(HA2，约180个氨基酸)形成将球状域锚定在细胞或病毒膜的茎状结构。亚型之间的序列同源性程度在HA1多肽(亚型之间34％-59％同源性)中小于HA2多肽(51％-80％的同源性)。最保守的区是裂解位点周围的序列，特别是HA2N-末端的11个氨基酸，其称为为融合肽，在所有的甲型流感病毒亚型中均是保守的。这个区的部分以表面环暴露于HA前体分子(HA0)，但是当HA0裂解为HA1/HA2时，则变得不可接近。总之，在不同的HA亚型中，特别是在HA1-HA2连接区和在HA2区中都存在保守区。但是，这些区对于中和抗体可能是不易接近的。
目前在确认中和一种以上甲型流感病毒亚型的抗体中只取得了有限的成功，并且其中和宽度狭窄且效力低。Okuno等人(1993)用流感病毒A/Okuda/57(H2N2)免疫小鼠并分离了单克隆抗体(C179)，该单克隆抗体(C179)结合HA2中的保守构象表位，并在动物模型中体外和体内中和组1的H2、H1和H5亚型甲型流感病毒(Okuno等人，1993；Smirnov等人，2000；Smirnov等人，1999)。
最近，Gioia等人描述了接种了传统季节性流感疫苗的某些个体患者的血清中存在H5N1病毒的中和抗体(Gioia等人，2008)。作者认为中和活性可能是由于神经氨酸酶(N1)的抗体。可是没有分离出单克隆抗体，也没有表征靶表位。目前尚不清楚血清抗体是否中和其它甲型流感病毒亚型。
尽管经过了数十年的研究，但是还没有投入市场的广谱中和或抑制甲型流感病毒感染或缓解由甲型流感病毒引发的疾病的抗体。因此，需要鉴定抵御多种甲型流感病毒亚型的新抗体。
发明内容
本发明部分地基于从接种了季节性流感疫苗的个体分离结合HA并中和多于一种甲型流感病毒亚型感染的自然产生的人单克隆抗体以及本发明的抗体所结合的新表位。因此，在本发明的一个方面中，本发明包括一种中和多于一种选自组1或组2的甲型流感病毒亚型的感染的抗体或其抗原结合片段。
在本发明的一实施方案中，本发明包括中和甲型流感病毒的至少两种不同组1亚型或至少两种不同组2亚型感染的抗体或其抗原结合片段。在本发明的另一实施方案中，本发明包括一种抗体或其抗原结合片段，其包含至少一个互补决定区(CDR)序列，该序列与SEQ ID NO：1-6、17-22、33-38、49-53、64-68、78-82、93-98、109-114、125-127或133-135中的任一个有至少95％的序列同一性，其中所述抗体中和甲型流感病毒。
在本发明的另一实施方案中，本发明包括选自以下序列的重链CDR1：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：133；选自以下序列的重链CDR2：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：126和SEQ ID NO：134；以及选自以下序列的重链CDR3：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：127和SEQ ID NO：135，其中所述抗体中和甲型流感病毒。在本发明的另一实施方案中，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包括选自以下序列的轻链CDR1：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：96和SEQ ID NO：112；选自以下序列的轻链CDR2：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：113；和选自以下序列的轻链CDR3：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：114，其中所述抗体中和甲型流感病毒。
在本发明的另一实施方案中，本发明包括一种抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区；或含有SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：30的氨基酸序列的轻链可变区；或含有SEQ ID NO：45的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：46的氨基酸序列的轻链可变区；或含有SEQ ID NO：60的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：61的氨基酸序列的轻链可变区；或含有SEQ ID NO：74的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：75的氨基酸序列的轻链可变区；或含有SEQ ID NO：89的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：90的氨基酸序列的轻链可变区；或含有SEQ ID NO：105的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：106的氨基酸序列的轻链可变区；或含有SEQ ID NO：121的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：122的氨基酸序列的轻链可变区，并且其中所述抗体中和甲型流感病毒。
在本发明的另一实施方案中，本发明包括一种由永生B细胞克隆FB54、FB139、FC6、FC41、FE43、FE53、FE17、FB75、FB110、FB177、FB79、FC1c、FB118、FB179、FB186、FE9b、FE25、FE54、FG20、FB15b或FC54表达的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体中和甲型流感病毒。
在另一方面，本发明包括一种含有编码本发明的抗体或抗体片段的多核苷酸的核酸分子。在另一方面，本发明包括一种含有本发明的核酸分子的载体或表达本发明的抗体或其抗原结合片段的细胞。在另一方面，本发明包括含有结合本发明的抗体或抗原结合片段的表位的分离或纯化的免疫原性多肽。
本发明还包括一种药物组合物，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段、本发明的核酸分子、包含本发明的核酸分子的载体、表达本发明的抗体或抗体片段的细胞或者本发明的免疫原性多肽以及药学可接受的稀释剂或载体(carrier)。本发明还包括一种药物组合物，其包含第一抗体或其抗原结合片段，以及第二抗体或其抗原结合片段，其中所述第一抗体是本发明的抗体，而第二抗体是中和甲型流感病毒感染的抗体或其抗原结合片段。
本发明的抗体或其抗原结合片段、本发明的核酸、包含本发明的核酸的载体、表达本发明的载体的细胞、包含结合本发明的抗体或抗体片段的表位的分离或纯化的免疫原性多肽或者本发明的药物组合物(i)在制备用于治疗甲型流感病毒感染的药物中的用途；(ii)在疫苗中的用途；或(iii)在甲型流感病毒感染的诊断中的用途也包括在本发明的范围内。此外，本发明的抗体或其抗原结合片段在通过检查抗甲型流感病毒疫苗的抗原是否含有正确构象中的特异表位来监测所述疫苗的质量中的用途也包括在本发明的范围内。
在另一方面，本发明包括一种减少甲型流感病毒感染或降低甲型流感病毒感染风险的方法，该方法包括向有需要的对象给予治疗有效量的本发明的抗体或抗原结合片段。
在另一方面，本发明包括一种特异性地结合本发明的抗体或其抗原结合片段的表位，其用于(i)治疗中；(ii)制备用于治疗甲型流感病毒感染的药物；(iii)作为疫苗；或(iv)筛选能够中和甲型流感病毒感染的配体。
附图说明
图1A-E示出了预防性地分别用抗体FE17或FE43处理，并在24小时后用H1N1A/PR/8/34、H6N1A/teal/HK/W312/97、H5N1A/VN/1203/04、H5N1A/INDO/5/05或H7N7A/NL/219/03攻击的小鼠的存活图。
图1F示出了对非致死性病毒H9N2A/ck/HK/G9/97的体内中和活性的结果。对小鼠i.p.注射FE43、FE17、对照抗体或白鼬超免疫血清，并在24小时后用105TCID50的H9N2病毒攻击。图中示出了感染后的第4天肺中的病毒效价。
发明详述
本发明部分地基于从接种了季节性甲型流感疫苗的个体中发现和分离广谱中和不同甲型流感病毒亚型的自然产生的人抗体。这些抗体是期望的，因为只要求一种或少数几种抗体来中和不同的甲型流感病毒亚型。此外，由这些抗体所识别的表位可以是能够诱导广谱抗不同甲型流感病毒亚型的季节性和候选流行隔离的疫苗的一部分。
因此，在一方面，本发明提供了一种中和至少两种组1或组2亚型的甲型流感病毒的抗体及其抗原结合片段。在一实施方案中，本发明提供了一种中和甲型流感病毒的两种不同组1亚型或两种不同组2亚型的感染的抗体或其抗原结合片段。
在本发明的另一方面，本发明提供了对不同甲型流感病毒亚型的HA具有广谱特异性的中和抗体及其抗原结合片段。在一实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段特异性地结合在两种或更多种甲型流感病毒组1或组2亚型中是保守的HA的茎区的表位。在另一实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段特异性地结合在两种或更多种的甲型流感病毒组1或组2亚型中是保守的HA的球状头部区的表位。
人单克隆抗体、分泌本发明的抗体的永生B细胞克隆或转染的细胞以及编码本发明的抗体的核酸也包括在本发明的范围内。
如本文所用，术语“抗原结合片段”、“片段”和“抗体片段”互换地使用，指保持抗体的抗原结合活性的本发明的抗体的任何片段。示例性的抗体片段包括但不限于单链抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或scFv。如本文所用，术语“抗体”包括抗体及其抗原结合片段。
如本文所用，术语“广谱特异性”指可以结合和/或中和甲型流感病毒的两种或更多种组1亚型或者两种或更多种组2亚型的本发明的抗体或抗原结合片段。
如本文所用，“中和抗体”指这样的抗体，其可以中和，即预防、抑制、减少、阻碍或干扰病原体引发和/或维持宿主内感染的能力。术语“中和抗体”和“中和…的抗体”或“中和…的多种抗体”在本文中互换地使用。如本文所述，这些抗体可以单独使用，或作为预防剂或治疗剂在合适的制剂中与作为诊断工具或制备工具的活性接种疫苗联合使用。
本发明的抗体或抗原结合片段中和多于一种组1亚型(H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13和H16以及它们的变体)的甲型流感病毒亚型，或多于一种组2亚型(H3、H4、H7、H10、H14和H15以及它们的变体)的甲型流感病毒亚型。在一实施方案中，本发明的抗体中和多于一种组1和组2亚型的甲型流感病毒亚型。
本发明的抗体和抗体片段能够中和甲型流感病毒亚型的各种组合。在一实施方案中，抗体可以中和甲型流感病毒H1和H2亚型、或H1和H5亚型、或H1和H9亚型、或H2和H5亚型、或H2和H9亚型、或H5和H9亚型，或H3和H7亚型、或H1、H2、H5亚型，或H1、H2和H9亚型、或H1、H5和H9亚型、或H2、H5和H9亚型或H1、H2、H5和H9亚型。在一实施方案中，除了中和甲型流感病毒H6亚型外，本发明的抗体和抗原结合片段中和一种或多种的上述组合。
本发明的抗体和抗原结合片段具有高中和效力。中和50％甲型流感病毒所需的本发明的抗体浓度可以例如为约50μg/ml或更低。在一实施方案中，中和50％甲型流感病毒所需的本发明的抗体浓度为约50、45、40、35、30、25、20、17.5、15、12.5、11、10、9、8、7、6、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5或约1μg/ml或更低。在另一实施方案中，中和50％甲型流感病毒所需的本发明的抗体浓度为约0.9、0.8、0.75、0.7、0.65、0.6、0.55、0.5、0.45、0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.075、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.008、0.006、0.004、0.003、0.002或约0.001μg/ml或更低。这意味着仅需低浓度的抗体来中和50％的甲型流感病毒。可使用本领域的技术人员已知的标准中和测定来测量特异性和效力。
本发明的抗体
本发明提供了一种对HA具有特定广谱特异性且其中和多于一种组1的甲型流感病毒亚型或者多于一种组2的甲型流感病毒亚型的抗体。本发明的抗体结合在两种或更多种甲型流感病毒组1亚型中或者在两种或更多种甲型流感病毒组2亚型中是保守的HA的区中的表位。
在一实施方案中，本发明提供了一种结合在两种或更多种组1或组2甲型流感病毒亚型中是保守的HA的茎区中的表位的抗体。在另一实施方案中，本发明提供了一种结合在两种或更多种的组1或组2甲型流感病毒亚型中是保守的HA的球状头部区中的表位的抗体。
在另一实施方案中，本发明提供了一种抗体如分离的抗体或纯化的抗体，其特异性地结合HA的茎区或球状头部区中的保守表位，并干扰病毒的复制和扩散。本发明还提供了一种抗体如分离的抗体或纯化的抗体，其特异性地结合HA的茎区或球状头部区中的保守表位，并抑制病毒进入细胞。不受任何理论的约束，在示例性实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段结合甲型流感病毒的茎区中的保守表位，并通过干扰融合步骤来抑制病毒进入细胞。蛋白的表位或抗原决定簇对应于由抗体的结合位点(或互补位)特异性识别的分子的那些部分。因此，表位是需要互补的互补位来进行操作性识别的相关实体。在蛋白的不同变体中保守的表位指相同的互补位可以通过接触这些分子的相同部分来特异性地识别这些不同变体。
本发明的抗体可以是单克隆的如人单克隆抗体或重组抗体。本发明还提供了本发明的抗体片段，特别是保留了抗体的抗原结合活性的片段。尽管在某些地方，包括权利要求书的说明书明确指出了抗原结合片段、抗体片段、抗体的变体和/或衍生物，但是应当理解，术语“抗体”或“本发明的抗体”包括所有的抗体类别，即抗原结合片段、抗体片段、抗体的变体和衍生物。
在一实施方案中，本发明的抗体和抗体片段中和甲型流感病毒的至少两种不同组1亚型或者至少两种不同组2亚型。示例性甲型流感病毒亚型包括但不限于H5N1(A/Vietnam/1203/04)、H1N1(A/New Caledonia/20/99)、H1N1(A/Salomon Island/3/2006)、H3N2(A/Wyoming/3/03)和H9N2(A/chicken/Hong Kong/G9/97)。在另一实施方案中，抗体对2、3、4、5、6、7或更多的组1甲型流感病毒亚型或组2甲型流感病毒亚型是特异性的。
在示例性实施方案中，本发明包括一种对甲型流感病毒亚型H1和H5(例如H1N1和H5N1)是特异性的抗体或其抗体片段。在另一实施方案中，抗体或其抗体片段对甲型流感病毒亚型H1和H9(例如H1N1和H9N2)是特异性的。在另一实施方案中，抗体或其抗体片段对甲型流感病毒亚型H1、H5和H9(例如H1N1、H5N1和H9N2)是特异性的。在本申请的前面部分提供了其它的示例性甲型流感病毒的亚型。
本发明的示例性抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的氨基酸序列的SEQ ID编号列于表1。
表1.示例性甲型流感病毒中和抗体的VH和VL多肽SEQ ID NO
| 抗体 | 重链的SEQ ID NO | 轻链的SEQ ID NO |
| FB54 | 13 | 14 |
| FB139 | 29 | 30 |
| FC6 | 45 | 46 |
| FC41 | 60 | 61 |
| FE43 | 74 | 75 |
| FE53 | 89 | 90 |
| FE17 | 105 | 106 |
| FB75 | 121 | 122 |
| FB110 | 121 | 122 |
| FB177 | 121 | 122 |
| FB79 | 131 | |
| FC1c | 139 |
在一实施方案中，本发明的抗体或抗体片段包含重链可变区，其具有与SEQ ID NO：13、29、45、60、74、89、105、121、131或139中任一所述的序列约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在另一实施方案中，本发明的抗体或抗体片段包含轻链可变区，其具有与SEQ ID NO：14、30、46、61、75、90、106或122中任一所述的序列约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在另一实施方案中，本发明的抗体的重链可变区可由核酸编码，该核酸具有与SEQ ID NO：15、31、47、62、76、91、107、123、132或140中任一所述的序列约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的序列。在另一实施方案中，本发明的抗体的轻链可变区可由核酸编码，该核酸具有与SEQ ID NO：16、32、48、63、77、92、108或124中任一所述的序列约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
抗体重链的CDR分别指CDRH1、CDRH2和CDRH3。相似地，抗体轻链的CDR分别是指CDRL1、CDRL2和CDRL3。CDR氨基酸的位置根据IMGT编号系统定义为CDR1-IMGT位置27至38、CDR2-IMGT位置56至65以及CDR3-IMGT位置105至117。
表2分别提供了本发明的示例性抗体的重链和轻链的六个CDR的氨基酸序列的SEQ ID NO。
表2.示例性甲型流感病毒中和抗体的CDR多肽的SEQ ID序列号
在一实施方案中，本发明的抗体或抗体片段包含至少一个CDR，该CDR的序列与SEQ ID NO：1-6、17-22、33-38、49-53、64-68、78-82、93-98、109-114、125-127或133-135中的任一个具有至少95％的序列同一性，其中所述抗体中和甲型流感病毒。
在另一实施方案中，本发明提供了包含重链的抗体，所述重链包含一种或多种(即一种、两种或所有三种)FB54、FB139、FC6、FC41、FE43、FE53、FE17、FB75、FB110、FB177、FB79、FC1c、FB118、FB179、FB186、FE9b、FE25、FE54、FG20、FB15b或FC54的重链CDR。在示例性实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段包含选自以下序列的重链CDR1：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：133；选自以下序列的重链CDR2：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：126和SEQ ID NO：134；以及选自以下序列的重链CDR3：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：127和SEQ ID NO：135。
在另一实施方案中，本发明提供了包含轻链的抗体，所述轻链包含一种或多种(即一种、两种或所有三种)FB54、FB139、FC6、FC41、FE43、FE53、FE17、FB75、FB110、FB177、FB79、FC1c、FB118、FB179、FB186、FE9b、FE25、FE54、FG20、FB15b或FC54的轻链CDR。在示例性实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段包含选自以下序列的轻链CDR1：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：96、和SEQ ID NO：112；选自以下序列的轻链CDR2：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：113；以及选自以下序列的轻链CDR3：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：114。
在示例性实施方案中，本发明提供包含重链的抗体，所述重链包含氨基酸序列为SEQ ID NO：1的CDRH1、氨基酸序列为SEQ ID NO：2的CDRH2和氨基酸序列为SEQ ID NO：3的CDRH3；或者氨基酸序列为SEQID NO：17的CDRH1、氨基酸序列为SEQ ID NO：18的CDRH2和氨基酸序列为SEQ ID NO：19的CDRH3；或者氨基酸序列为SEQ ID NO：33的CDRH1、氨基酸序列为SEQ ID NO：34的CDRH2和氨基酸序列为SEQ IDNO：35的CDRH3；或者氨基酸序列为SEQ ID NO：49的CDRH1、氨基酸序列为SEQ ID NO：50的CDRH2和氨基酸序列为SEQ ID NO：51的CDRH3；或者氨基酸序列为SEQ ID NO：64的CDRH1、氨基酸序列为SEQID NO：65的CDRH2和氨基酸序列为SEQ ID NO：66的CDRH3；或者氨基酸序列为SEQ ID NO：78的CDRH1、氨基酸序列为SEQ ID NO：79的CDRH2和氨基酸序列为SEQ ID NO：80的CDRH3；或者氨基酸序列为SEQID NO：93的CDRH1、氨基酸序列为SEQ ID NO：94的CDRH2和氨基酸序列为SEQ ID NO：95的CDRH3；或者氨基酸序列为SEQ ID NO：109的CDRH1、氨基酸序列为SEQ ID NO：110的CDRH2和氨基酸序列为SEQ ID NO：111的CDRH3；或者氨基酸序列为SEQ ID NO：125的CDRH1、氨基酸序列为SEQ ID NO：126的CDRH2和氨基酸序列为SEQ ID NO：127的CDRH3；或者氨基酸序列为SEQ ID NO：133的CDRH1、氨基酸序列为SEQ ID NO：134的CDRH2和氨基酸序列为SEQ ID NO：135的CDRH3。
在示例性实施方案中，本发明提供包含轻链的抗体，所述轻链包含氨基酸序列为SEQ ID NO：4的CDRL1、氨基酸序列为SEQ ID NO：5的CDRL2和氨基酸序列为SEQ ID NO：6的CDRL3；或者氨基酸序列为SEQ ID NO：20的CDRL1、氨基酸序列为SEQ ID NO：21的CDRL2和氨基酸序列为SEQ ID NO：22的CDRL3；或者氨基酸序列为SEQ ID NO：36的CDRL1、氨基酸序列为SEQ ID NO：37的CDRL2和氨基酸序列为SEQ ID NO：38的CDRL3；或者氨基酸序列为SEQ ID NO：52的CDRL1、氨基酸序列为SEQ ID NO：5的CDRL2和氨基酸序列为SEQ ID NO：53的CDRL3；或者氨基酸序列为SEQ ID NO：36的CDRL1、氨基酸序列为SEQ ID NO：67的CDRL2和氨基酸序列为SEQ ID NO：68的CDRL3；或者氨基酸序列为SEQ ID NO：81的CDRL1、氨基酸序列为SEQ ID NO：21的CDRL2和氨基酸序列为SEQ ID NO：82的CDRL3；或者氨基酸序列为SEQ ID NO：96的CDRL1、氨基酸序列为SEQ ID NO：97的CDRL2和氨基酸序列为SEQ ID NO：98的CDRL3；或者氨基酸序列为SEQ ID NO：112的CDRL1、氨基酸序列为SEQ ID NO：113的CDRL2和氨基酸序列为SEQ ID NO：114的CDRL3。
在一实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含表2所列的抗体FB54的所有CDR，并中和甲型流感病毒感染。在另一实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含表2所列的抗体FB139的所有CDR，并中和甲型流感病毒感染。在另一实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含表2所列的抗体FC6的所有CDR，并中和甲型流感病毒感染。在另一实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含表2所列的抗体FC41的所有CDR，并中和甲型流感病毒感染。在另一实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含表2所列的抗体FE43的所有CDR，并中和甲型流感病毒感染。在另一实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含表2所列的抗体FE53的所有CDR，并中和甲型流感病毒感染。
在另一实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含表2所列的抗体FE17的所有CDR，并中和甲型流感病毒感染。在另一实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含表2所列的抗体FB75的所有CDR，并中和甲型流感病毒感染。在另一实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含表2所列的抗体FB110的所有CDR，并中和甲型流感病毒感染。在另一实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含表2所列的抗体FB177的所有CDR，并中和甲型流感病毒感染。在另一实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含表2所列的抗体FB79的所有CDR，并中和甲型流感病毒感染。在另一实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含表2所列的抗体FC1c的所有CDR，并中和甲型流感病毒感染。
本发明的示例性抗体包括但不限于FB54、FB139、FC6、FC41、FE43、FE53、FE17、FB75、FB110、FB177、FB79、FC1c、FB118、FB179、FB186、FE9b、FE25、FE54、FG20、FB15b或FC54。
本发明还包括一种抗体或其片段，其与本发明的抗体或与本发明的抗体竞争的抗体结合相同的表位。
本发明的抗体还包括杂合抗体分子，其包含本发明的抗体的一种或多种CDR以及针对相同表位的另一抗体的一种或多种CDR。在一实施方案中，这样杂合抗体包含三种本发明的抗体的CDR以及三种针对相同表位的另一抗体的CDR。示例性杂合抗体包括i)三种本发明的抗体的轻链CDR以及三种针对相同表位的另一抗体的重链CDR；或ii)三种本发明的抗体的重链CDR以及三种针对相同表位的另一抗体的轻链CDR。
变体抗体也包括在本发明的范围内。因此，本申请中所列举的序列的变体也包括在本发明的范围内。这样的变体包括通过在免疫应答中体内体细胞突变或通过培养永生B细胞克隆时在体外产生的自然变体。或者，如上所述，也可能因为遗传密码简并性而产生变体，或由于转录和翻译错误而生成变体。
此外，具有改进的亲合力和/或效力的抗体序列的变体可以通过采用本领域已知的方法来获得，并包括在本发明的范围内。例如，氨基酸取代可以用于获得具有进一步改进的亲合力的抗体。或者，核苷酸序列的密码子优化也可以用来改进制备抗体的表达系统中的翻译效率。此外，包含通过对本发明的任何核酸序列应用定向进化法来优化抗体特异性或中和活性的序列的多核苷酸也在本发明的范围内。
在一实施方案中，变体抗体的序列可以与本申请中所引用的序列具有70％或更多的(即75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多)氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，这样的序列同一性是相对于参考序列的全长(即，本申请中所引用的序列)来计算的。在一些其它实施方案中，本文中所使用的百分比同一性是通过使用BLAST版本2.1.3利用由NCBI(the National Center for Biotechnology Information；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)指定的默认参数[Blosum 62矩阵；间隙开放罚分＝11以及间隙延伸罚分＝1]来确定的。
在另一方面，本发明还包括编码本发明的抗体的轻链和重链及CDR的部分或全部的核酸序列。本文提供了编码本发明的示例性抗体的轻链和重链及CDR的部分或全部核酸序列。表3提供了编码本发明的示例性抗体的CDR、重链和轻链可变区的核酸序列的SEQ ID编号。由于遗传密码的冗余性，会存在编码相同氨基酸序列的这些序列的变体。
表3.示例性甲型流感病毒中和抗体的CDR、VH和VL多核苷酸的SEQ ID编号
在一实施方案中，变体抗体序列可以与本申请中所引用的序列具有70％或更多(即75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多)氨基酸序列同一性。在另一实施方案中，本发明的核酸序列具有编码本发明的抗体的重链或轻链CDR的核酸的序列。例如，本发明的核酸序列包含与下列核酸序列至少75％相同的序列：SEQ ID NO：7-12、15、16、23-28、31、32、39-44、47、48、54-59、62、63、69-73、76、77、83-88、91、92、99-104、107、108、115-120、123、124、128-130、132、136-138或140。
本发明的范围内还包括诸如表达载体的包含本发明的核酸序列的载体。用这样的载体转化的细胞也包括在本发明的范围内。这样的细胞的实例包括但不限于真核细胞，如酵母细胞、动物细胞或植物细胞。在一实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞，如人细胞、CHO、HEK293T、PER.C6、NS0、骨髓瘤细胞或杂交瘤细胞。
本发明还涉及结合能够结合本发明的抗体的表位的单克隆抗体，包括但不限于选自FB54、FB139、FC6、FC41、FE43、FE53、FE17、FB75、FB110、FB177、FB79、FC1c、FB118、FB179、FB186、FE9b、FE25、FE54、FG20、FB15b和FC54的单克隆抗体。
单克隆和重组抗体对它们所针对的单独的多肽或其它抗原的鉴定和纯化特别有用。本发明的抗体还具有其它应用，其中它们可用作免疫测定、放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)中的试剂。在这些应用中，可以用诸如放射性同位素、荧光分子或酶的分析上可检测的试剂来标记抗体。所述抗体还可用于抗原的分子鉴定和表征(表位作图)。
可以将本发明的抗体偶联至用于递送到治疗位点的药物，或偶联至可检测标记以有助于含有诸如感染了甲型流感病毒的细胞的所关注细胞的位点的成像。将抗体偶联至药物或和可检测标记的方法在本领域是已知的，同样采用可检测标记进行成像的方法在本领域也是已知的。标记的抗体可以通过使用各种标记而应用于各种测定。本发明的抗体与所关注的表位(甲型流感病毒表位)之间形成的抗体-抗原复合体的检测可以通过将可检测的物质附着到抗体来便利地实现。合适的检测方式包括诸如放射性核素、酶、辅酶、荧光剂、化学发光剂、色原、酶底物或辅因子、酶抑制剂、酶活动基(prosthetic)复合物、自由基、颗粒、染料等的标记的使用。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的酶活动基复合物的实例包括链酶抗生物素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基氨荧光素、丹酰氯或藻红素；发光材料的实例是鲁米诺；生物发光材料的实例包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；并且合适的放射性材料的实例包括125I、131I、35S或3H。这样的标记的试剂可用于各种已知测定，如放射性免疫测定、如ELISA的酶免疫测定、荧光免疫测定等。(参见，如US 3,766,162、US 3,791,932、US 3,817,837和US 4,233,402)。
可以将本发明的抗体偶联至诸如细胞毒素、治疗剂或者放射性金属离子或放射性同位素的治疗部分。放射性同位素的实例包括但不限于I-131、I-123、I-125、Y-90、Re-188、Re-186、At-211、Cu-67、Bi-212、Bi-213、Pd-109、Tc-99、In-111等。这样的抗体偶联物可以用于修饰给定的生物应答，不应将药物部分解释为仅限于传统的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有期望的生物学活性的蛋白或多肽。这样的蛋白可以包括例如毒素，如相思豆毒蛋白、蓖麻蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素。
将这样的治疗部分偶联至抗体的技术是已知的。参见，例如，Arnon等人.(1985)″Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy，″in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，ed.；Reisfeld等人.(Alan R.Liss，Inc.)，pp.243-256；ed.；Hellstrom等人.(1987)″Antibodies for Drug Delivery，″in Controlled Drug Delivery，ed.；Robinson等人.(2d ed；Marcel Dekker，Inc.)，pp.623-653；Thorpe(1985)″Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy：A Review，″in Monoclonal Antibodies′84：Biologicai and Clinical Applications，ed.；Pinchera等人.pp.475-506(Editrice Kurtis，Milano，Italy，1985)；“Analysis，Results，and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy，”in Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy，ed.；Baldwin等人.(Academic Press，New York，1985)，pp.303-316；和Thorpe等人.(1982)Immunol.Rev.62：119-158。
或者，如US 4,676,980所述，可以将抗体或其抗体片段偶联至第二抗体或其抗体片段以形成抗体异偶联物(heteroconjugate)。此外，在标记与本发明的抗体之间可以使用连接物(linker)(如US 4,831,175)。抗体或其抗原结合片段可以直接用放射性碘、铟、钇或本领域已知的其它放射性粒子标记(例如US 5,595,721)。治疗可以由同时或相继地给予偶联和未偶联的抗体的治疗组合组成(例如WO00/52031；WO00/52473)。
还可以将本发明的抗体附着至固体载体物。另外，可以将本发明的抗体或其功能性抗体片段化学修饰而共价偶联至聚合物以例如增加它们的循环半衰期。聚合物的实例以及将它们附着到肽的方法示于US 4,766,106、US 4,179,337、US 4,495,285和US 4,609,546。在一些实施方案中，聚合物可以选自多元醇聚氧乙烯醚和聚乙二醇(PEG)。PEG在室温下溶于水并具有以下通式：R(O--CH2--CH2)nO--R，其中R可以是氢或诸如烷基或链烷醇基团的保护基团。在一实施方案中，保护基团可以具有1至8个碳原子。在另一实施方案中，保护基团是甲基。符号n是正整数。在一实施方案中，n 为1至1,000。在另一实施方案中，n为2至500。在一实施方案中，PEG的平均分子量为1,000至40,000。在另一实施方案中，PEG的平均分子量为2,000至20,000。在另一实施方案中，PEG的平均分子量为3,000到12,000。在一实施方案中，PEG具有至少一个羟基。在另一实施方案中，PEG具有末端羟基。在另一实施方案中，末端羟基被活化来与抑制剂上的自由氨基反应。然而，应当理解，可以改变反应性基团的类型和数量来获得本发明中的共价偶联的PEG/抗体。
水溶性多元醇聚氧乙烯醚在本发明中也很有用。它们包括山梨醇聚氧乙烯醚、葡萄糖聚氧乙烯醚、聚氧乙烯醚丙三醇(POG)等。在一实施方案中，使用了POG。不受任何理论的约束，由于聚氧乙烯醚丙三醇的甘油主链与天然存在于诸如动物和人中的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯的主链相同，所以这种支化不一定在体内被视为为外来物质。在一些实施方案中，POG的分子量范围与PEG相同。另一种可以用于延长循环半衰期的药物递送系统是脂质体。制备脂质体递送系统的方法在Gabizon等人(1982)，Cafiso(1981)和Szoka(1980)中讨论。其它药物递送系统在本领域是已知的，并在诸如引用的Poznansky等(1980)和Poznansky(1984)中描述。
本发明的抗体可以纯化的形式提供。通常，抗体会存在于基本上不含其它多肽的组合物中，例如，其中少于90重量％、通常少于60重量％以及更常见地少于50重量％的组合物是由其它多肽构成的。
本发明的抗体在诸如小鼠的非人(或异种)宿主中可以是免疫原性的。特别地，抗体可以具有在非人宿主中是免疫原性的、而在人宿主中是非免疫原性的独特位。用于人的本发明的抗体包括不容易从诸如小鼠、山羊、兔、大鼠、非灵长类哺乳动物等的宿主中分离，并通常不能通过人源化或从异种鼠获得的那些抗体。
本发明的抗体可以是任何同种型(如IgA、IgG、IgM，即α、γ、或μ重链)，但一般为IgG。在IgG同种型中，抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类。本发明的抗体可以具有κ或λ轻链。
抗体的制备
本发明的抗体可以用本领域中已知的任何方法来制备。例如采用杂交瘤技术制备单克隆抗体的常用方法是已知的(Kohler，G.和Milstein，C，.1975；Kozbar等人1983)。在一实施方案中，使用了可选的在WO2004/076677中描述的EBV永生方法。
利用在WO2004/076677中描述的方法，可以将产生本发明的抗体的B细胞在多克隆B细胞激活剂的存在下用EBV转化。用EBV转化是标准技术，并且可以容易地加以改变来包括多克隆B细胞激活剂。
任选地，在转化步骤中可以加入另外的细胞生长和分化刺激物以进一步提高效率。这些刺激物可以是诸如IL-2和IL-15的细胞因子。在一方面，在永生步骤中加入IL-2以进一步改进永生的效率，但是其使用并非必需的。然后，利用这些方法制备的永生B细胞可利用本领域中已知的方法来培养，并将抗体从其中分离。
利用在英国专利申请第0819376.5号中描述的方法，可以在微孔培养板中培养单浆细胞。可以从单浆细胞培养物分离抗体。此外，利用本领域已知的方法可以从单浆细胞培养物提取RNA并可以进行单细胞PCR。抗体的VH和VL区可以通过RT-PCR扩增、测序并克隆至随后转染入HEK293T细胞或其它宿主细胞的表达载体中。可以利用本领域技术人员已知的任何方法来进行核酸在表达载体中的克隆、宿主细胞的转染、转染的宿主细胞的培养以及产生的抗体的分离。
若需要，也可以利用过滤、离心以及诸如HPLC或亲和力色谱的各种色谱法进一步纯化抗体。诸如单克隆抗体的抗体的纯化技术，包括制备药物级抗体的技术在本领域是已知的。
本发明的抗体的片段可以通过包括利用诸如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶的酶消化和/或通过化学还原的二硫键裂解在内的方法从抗体获得。或者，抗体的片段可以通过克隆或表达部分的重链或轻链的序列来获得。抗体“片段”可以包括Fab、Fab’、F(ab′)2和Fv片段。本发明还包含源自本发明的抗体的重链和轻链的单链Fv片段(scFv)，例如本发明包括含有本发明的抗体的CDR的scFv。本发明还包括重链或轻链的单体和二聚体、单结构域重链抗体、单结构域区轻链抗体以及单链抗体，例如重链和轻链可变结构域由肽连接物连接的单链Fv。
本发明的抗体片段可以赋予单价或多价的相互作用，并可以包含在上述的各种结构中。例如，可以合成scFv分子来产生三价的“三链抗体”和四价的“四链抗体”。scFv分子可以包含形成二价微型体(minibody)的Fc区的结构域。此外，本发明的序列可以是多特异性分子的组分，其中本发明的序列靶向本发明的表位，并且分子的其它区结合其它靶标。示例性分子包括但不限于双特异性Fab2、三特异性Fab3、双特异性scFv和双抗体(Holliger和Hudson，2005，Nature Biotechnology 9：1126-1136)。
分子生物学的标准技术可以用于制备编码本发明的抗体或抗体片段的DNA序列。可以利用寡核苷酸合成技术部分或全部合成期望的DNA序列。也可以适当地使用定点诱变和聚合酶链式反应(PCR)技术。
任何合适的宿主细胞/载体系统可以用于编码本发明的抗体分子或其片段的DNA序列的表达。诸如大肠杆菌的细菌和其它微生物系统可以部分地用于抗体片段诸如Fab和F(ab’)2片段，和特别是Fv片段和诸如单链Fv的单链抗体片段的表达。诸如哺乳动物的真核宿主细胞表达系统可以用于包括完整抗体分子在内的较大抗体分子的制备。合适的哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、HEK293T、PER.C6、NS0、骨髓瘤细胞或杂交瘤细胞。
本发明还提供了一种用于制备本发明的抗体分子的方法，该方法包括在适合于导致从编码本发明的抗体分子的DNA表达蛋白的条件下培养包含编码本发明的核酸的载体的宿主细胞，并分离抗体分子。
抗体分子可以仅包含重链或轻链多肽，在这种情况下，仅需要用重链或轻链多肽编码序列来转染宿主细胞。对于制备既含有重链又含有轻链的产物，可以用两种载体来转染细胞系，其中第一载体编码轻链多肽，而第二载体编码重链多肽。或者，可以使用单链载体，该载体包含编码轻链和重链多肽的序列。
或者，本发明的抗体可以通过以下步骤制备：i)在宿主细胞中表达本发明的核酸序列，和ii)分离表达的抗体产物。此外，该方法还可以包括iii)纯化抗体。
转化的B细胞、培养的单浆细胞和转染的HEK293T细胞的筛选
可以筛选转化的B细胞和培养的单浆细胞的用于制备具有期望的特异性或功能的那些抗体。
筛选步骤可以通过以下方法来完成：诸如ELISA的任何免疫测定、组织或细胞(包括转染的细胞)染色、中和测定或本领域已知的用于鉴定期望的特异性或功能的多种其它方法中的一种。测定可以基于一种或多种抗原的简单识别来选取；或者还可以基于期望的功能来选取，例如，选择中和抗体而不仅仅是抗原结合抗体，选择可以改变靶向的细胞的特性的抗体，该特性为例如它们的信号转导级联放大、它们的形状、它们的生长速率、它们的影响其它细胞的能力、它们的对其它细胞或其它试剂或条件改变的应答、它们的分化状态等。
单独的转化的B细胞克隆则可以通过阳性转化的B细胞培养来制备。从阳性细胞混合物分离单独的克隆的克隆步骤可以利用有限稀释、显微操作、通过细胞分选的单细胞沉积以在本领域其它已知的方法来完成。
利用本领域已知的方法将来自培养的单浆细胞的核酸进行分离、克隆并在HEK293T细胞或其它宿主细胞中表达。
本发明的永生B细胞克隆或转染的HEK293T细胞可以用于多种用途：如作为单克隆抗体的来源、作为编码所关注的单克隆抗体的核酸(DNA或mRNA)的来源，用于研究等。
本发明提供了一种组合物，其包含产生中和甲型流感病毒的至少两种不同组1亚型或至少两种不同组2亚型的抗体的永生B记忆细胞或转染的宿主细胞。
表位
如上所述，本发明的抗体可以用于对它们所结合的表位进行作图。本发明人已经发现中和甲型流感病毒感染的抗体针对HA上所发现的表位。在一实施方案中，抗体针对在两种或更多种甲型流感病毒亚型中是保守的HA的茎区或球状头部区中的一个或多个表位。本发明的抗体所结合的表位可以是线性的(连续)或构象的(不连续)。
本发明的抗体所识别的表位可以具有多种用途。纯化或合成形式的表位及其模拟表位可以用于提高免疫应答(即，作为疫苗，或用于其它用途的抗体的制备)，或用于筛选与表位或其模拟表位发生免疫反应的抗体的血清。在一实施方案中，这样的表位或模拟表位或者含有这样的表位或模拟表位的抗原可以用作疫苗以提高免疫应答。本发明的抗体和抗体片段还可以用于监测疫苗质量的方法。特别地，抗体可以用于检查疫苗中的抗原是否含有正确构象中的正确免疫原性表位。
表位还可以用于筛选结合所述表位的配体。这样的配体包括但不限于抗体(包括来自骆驼、鲨鱼和其它物种的那些)、抗体片段、肽、噬菌体展示技术产物、适配体、adnectin或者其它病毒或细胞蛋白的片段，可以阻断表位并因而预防感染。这样的配体包括在本发明的范围内。
重组表达
本发明的永生B细胞克隆或培养的浆细胞还可以用作克隆随后的重组表达的抗体基因的核酸的来源。对于药物目的，重组来源的表达比B细胞或杂交瘤的表达更常见，这是基于诸如稳定性、再现性、培养容易程度等原因。
因此，本发明提供了一种制备重组细胞的方法，该方法包括如下步骤：(i)从编码所关注的抗体的B细胞克隆或培养的单浆细胞获得一种或多种核酸(如重链和/或轻链mRNA)；(ii)将核酸插入表达载体；以及(iii)将载体转染入宿主细胞以允许所关注的抗体在该宿主细胞中表达。
类似地，本发明提供了一种制备重组细胞的方法，该方法包括如下步骤：(i)对来自B细胞克隆或培养的单浆细胞的编码所关注的抗体的核酸进行测序；和(ii)利用从步骤(i)中获得的序列信息制备用于插入宿主细胞以允许所关注的抗体在该宿主细胞中表达的核酸。核酸可以但并非必需在步骤(i)和步骤(ii)之间操作以引入限制位点、改变密码子的使用和/或优化转录和/或翻译调节序列。
本发明还提供了一种制备转染的宿主细胞的方法，该方法包括用一种或多种编码所关注的抗体的核酸转染宿主细胞的步骤，其中所述核酸是源自本发明的永生B细胞克隆或培养的单浆细胞的核酸。因此，首先制备核酸，然后用其转染宿主细胞的步骤可以在不同的时间，由不同的人员，在不同的地点(例如，在不同的国家)进行。
然后，本发明的这些重组细胞可以用于表达和培养目的。它们对于用于大规模药物制备的抗体表达特别有用。它们还可以用作药物组合物的活性成分。可以使用任何合适的培养技术，包括但不限于静置培养、滚瓶培养、腹水、中空纤维型生物反应器盒、模式微型发酵器、搅拌槽、微载体培养、陶瓷芯灌注等。
从B细胞或浆细胞获得和测序免疫球蛋白基因的方法在本领域是已知的(如参见Kuby Immunology，第4版，第4章，2000)。
转染的宿主细胞可以是真核细胞，包括酵母和动物细胞，特别是哺乳动物细胞(例如CHO细胞、NS0细胞、诸如PER.C6(Jones等人2003)或HKB-11(Cho等人2001；Cho等人2003)细胞的人细胞、骨髓瘤细胞(US5,807,715和US 6,300,104等))以及植物细胞。优选的表达宿主可以将本发明的抗体糖基化，特别是用在人体内本身不是免疫源性的碳水化合物结构进行糖基化。在一实施方案中，转染的宿主细胞能够在无血清培养基中生长。在另一实施方案中，转染的宿主细胞可以在不含任何动物来源产物的培养物中生长。可以培养转染的宿主细胞以产生细胞系。
本发明提供了一种制备一种或多种编码所关注的抗体的核酸分子(例如，重链和轻链基因)的方法，该方法包括如下步骤：(i)制备本发明的永生B细胞克隆或培养本发明的浆细胞；(ii)从B细胞克隆或培养的单浆细胞获得编码所关注的抗体的核酸。本发明还提供了一种获得编码所关注的抗体的核酸序列的方法，该方法包括如下步骤：(i)制备本发明的永生B细胞克隆或培养本发明的单浆细胞；(ii)对来自B细胞克隆或培养的浆细胞的编码所关注的抗体的核酸进行测序。
本发明还提供了一种制备编码所关注的抗体的核酸分子的方法，该方法包括获得从本发明的转化的B细胞克隆或培养的浆细胞获得的核酸的步骤。因此，首先获得B细胞克隆或培养的浆细胞，然后从B细胞克隆或培养的浆细胞获得核酸的步骤可以在不同的时间，由不同的人员，在不同的地点(例如，在不同的国家)进行。
本发明提供了制备抗体(如用于药物用途)的方法，该方法包括如下步骤：(i)从表达所关注的抗体的所选B细胞克隆或培养的浆细胞获得一种或多种核酸(如重链和轻链基因)和/或对来自表达所关注的抗体的所选B细胞克隆或培养的浆细胞一种或多种核酸(如重链和轻链基因)进行测序；(ii)将核酸插入表达载体或利用核酸序列制备表达载体；(iii)转染可以表达所关注的抗体的宿主细胞；(iv)在表达所关注的抗体的条件下，培养或传代培养转染的宿主细胞；以及任选地(v)纯化所关注的抗体。
本发明还提供了一种制备抗体的方法，该方法包括如下步骤：在表达所关注的抗体的条件下，培养或传代培养转染的宿主细胞群；以及任选地纯化所关注的抗体，其中所述转染的宿主细胞群通过以下步骤制备：(i)提供编码所选的所关注的所选抗体的核酸，所述核酸如上所述由B细胞克隆或培养的浆细胞产生，(ii)将核酸插入表达载体，(iii)将载体转染可以表达所关注的抗体的宿主细胞，以及(iv)培养或传代培养包含插入的核酸的转染的宿主细胞以制备所关注的抗体。因此，首先制备重组宿主细胞，然后培养其以表达抗体的步骤可以在不同的时间，由不同的人员，在不同的地点(例如，在不同的国家)进行。
药物组合物
本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的抗体和/或抗体片段和/或编码这样的抗体的核酸和/或由本发明的抗体所识别的表位。药物组合物还可以含有药学可接受的载体以允许给药。载体本身不应当诱导对接受所述组合物的个体有害的抗体的产生，且不应当有毒。合适的载体可以是大的、缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物和非活性病毒颗粒。
可以使用药学可接受的盐，例如，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐的无机酸盐，或诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐的有机酸盐。
治疗组合物中药学可接受的载体还可以另外含有诸如水、盐水、甘油和乙醇的液体。此外，诸如润湿剂或乳化剂或pH缓冲物质的辅助物质也可以存在于这样的组合物中。这样的载体允许将药物组合物配制成由受试者摄取的片剂、丸剂、锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂和混悬液的形式。
在本发明的范围内，给药形式可以包括适用于非肠道给药的那些方式，如通过诸如团(bolus)注射或连续输液的注射或输液方式。当产物用于注射或输液时，其可以采用油性或水性媒介物中的混悬液、溶液或乳液的形式，并且其可以含有诸如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂的配方剂(formulatory agent)。或者，抗体分子可以是在使用前用适当的无菌液体还原的干粉形式。
一旦配制好，本发明的组合物可以直接给予受试者。在一实施方案中，使组合物适合于给予给人受试者。
本发明的药物组合物可以通过多种途径给药，包括但不限于口服、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、腹膜内、鞘内、心室内、透皮、经皮、局部、皮下、鼻内、肠道、舌下、阴道内或直肠途径。无针注射也可以用于给予本发明的药物组合物。通常，治疗组合物可以制备为诸如液体溶液或混悬液的可注射剂。在注射前，还可以制备适合于液体媒介物中的溶液或混悬液的固体形式。
组合物的直接递送一般通过皮下注射、腹膜内注射、静脉内注射或肌肉内注射，或者通过递送至组织间隙来完成。还可以将组合物给予至病变部位。治疗剂量可以是单剂量方案或多剂量方案。已知的基于抗体的药物提供了关于例如是否应该每天、每周、每月等递送药物的给药频率的指导。频率和剂量还取决于症状的严重程度。
可以将本发明的组合物制备成各种形式。例如，可以将组合物制备成液体溶液或是混悬液的可注射剂。在注射前，还可以制备适合于液体媒介物中的溶液或混悬液的固体形式(例如，如SynagisTM和HerceptinTM的冻干组合物，其用含防腐剂的无菌水还原)。可以将组合物制备成诸如软膏、乳膏或粉末以用于局部给药。可以将组合物制备成诸如片剂或胶囊、喷雾剂、或糖浆(任选地调味)以用于口服。利用细粉末或喷雾剂，可以将组合物制备成诸如吸入剂以用于肺部给药。可以将组合物制备成栓剂或阴道栓剂。可以将组合物制备成诸如滴剂以用于鼻、耳或眼给药。组合物可以采用试剂盒的形式，该试剂盒的设计使得在向受试者给药前还原组合的组合物。例如，冻干的抗体可以提供为包含无菌水或无菌缓冲液的试剂盒形式。
应当理解，组合物中的活性成分会是抗体分子、抗体片段或其变体及衍生物。因此，组合物易于在胃肠道中降解。因此，如果组合物通过利用胃肠道途径进行给药，则组合物会需要含有保护抗体免于降解，但一旦从肠胃道中吸收就释放抗体的物质。
药学可接受的载体的深入讨论参见Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy，20th edition，ISBN：0683306472。
本发明的药物组合物一般具有5.5至8.5的pH值，在一些实施方案中，pH值可以为6至8，并且在另一实施方案中，pH值约为7。可以通过使用缓冲液来维持pH值。组合物可以是无菌和/或不含热原的。对于人，组合物可以是等渗的。在一实施方案中，本发明的药物组合物在密闭的容器中提供。
药物组合物会包含有效量的本发明的一种或多种抗体和/或包含结合本发明的抗体的表位的多肽，即足以治疗、改善或预防期望的疾病或疾病状况或者足以表现出可检测的疗效的量。疗效还包括身体症状的缓解。对于任何特定的受试者的精确有效量会取决于他们的体重与健康状况、疾病状况的性质和程度以及选择给药的治疗剂或治疗剂的组合。对于给定情形，所需的有效量由常规实验确定并且由临床医生决定。对于本发明的目的，给予个体的本发明的组合物的有效剂量一般为约0.01mg/kg至约50mg/kg或约0.05mg/kg至约10mg/kg。已知的基于抗体的药物提供了这方面的指导，例如HerceptinTM是通过静脉内输液21mg/ml的溶液来给药，并且初始给药剂量为4mg/kg体重，每周维持剂量为2mg/kg体重；RituxanTM每周以375mg/m2的剂量给药；等。
在一实施方案中，组合物可以包括多于一种(如2、3、4、5种等)本发明的抗体以提供加合或协同疗效。在另一实施方案中，组合物可以包含一种或多种(如2、3、4、5种等)本发明的抗体以及一种或多种(如2、3、4、5种等)抗甲型流感病毒的其它抗体。例如，一种抗体可以结合HA表位，而另一种抗体可以结合HA上不同的表位(如一种抗体可以结合茎区中的表位，而另一种抗体可以结合球状头部区中的表位)，或者结合神经氨酸酶和/或基质蛋白上的表位。此外，本发明的抗体与甲型流感疫苗或与对除了甲型流感病毒之外的有特异性的抗体一起给药在本发明的范围内。本发明的抗体可以与甲型流感疫苗或与对除了甲型流感病毒之外的有特异性的抗体组合/同时或者在不同时间给药。
在另一实施方案中，本发明提供了一种包含两种或更多种抗体的药物组合物，其中第一抗体是本发明的抗体并对HA表位具有特异性，而第二抗体对神经氨酸酶表位、第二HA表位和/或基质表位具有特异性。例如，本发明提供了一种包含两种或更多种抗体的药物组合物，其中第一抗体是本发明的抗体并对甲型流感病毒HA的茎中的表位具有特异性，而第二抗体对神经氨酸酶表位、HA的球状头部中的表位、HA的茎中的第二表位和/或基质表位具有特异性。甲型流感病毒HA的茎中的第二表位或球状头部中的表位可以但不必需在多于一种的甲型流感病毒亚型中是保守的。
在另一实例中，本发明提供了一种包含两种或更多种抗体的药物组合物，其中第一抗体是本发明的抗体并对甲型流感病毒HA的球状头部中的表位具有特异性，而第二抗体对神经氨酸酶表位、HA的茎中的表位、HA的球状头部中的第二表位和/或基质表位具有特异性。甲型流感病毒HA的球状头部中的第二表位或茎中的表位可以但不必需在多于一种的甲型流感病毒亚型中是保守的。
在另一实施方案中，本发明提供了一种包含两种或更多种抗体的药物组合物，其中第一抗体对神经氨酸酶表位具有特异性，而第二抗体对第二神经氨酸酶表位、HA表位和/或基质表位具有特异性。
在另一实施方案中，本发明提供了一种包含两种或更多种抗体的药物组合物，其中第一抗体对基质表位具有特异性，而第二抗体对第二基质表位、HA上的表位和/或神经氨酸酶上的表位具有特异性。
在一实施方案中，对甲型流感病毒靶蛋白具有特异性的本发明的抗体包括但不限于FB54、FB139、FC6、FC41、FE43、FE53、FE17、FB75、FB110、FB177、FB79、FC1c、FB118、FB179、FB186、FE9b、FE25、FE54、FG20、FB15b或FC54。在另一实施方案中，对甲型流感病毒靶蛋白具有特异性的本发明的抗体包括但不限于FB54、FB139、FC6、FC41、FE43、FE53、FE17、FB75、FB110、FB177、FB79或FC1c。
在一实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含抗体FB54或其抗原结合片段以及药学可接受的载体。在另一实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含抗体FB139或其抗原结合片段以及药学可接受的载体。在另一实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含抗体FC6或其抗原结合片段以及药学可接受的载体。在另一实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含抗体FC41或其抗原结合片段以及药学可接受的载体。在另一实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含抗体FE43或其抗原结合片段以及药学可接受的载体。在另一实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含抗体FE53或其抗原结合片段以及药学可接受的载体。
在另一实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含抗体FE17或其抗原结合片段以及药学可接受的载体。在另一实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含抗体FB75或其抗原结合片段以及药学可接受的载体。在另一实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含抗体FB110或其抗原结合片段以及药学可接受的载体。在另一实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含抗体FB177或其抗原结合片段以及药学可接受的载体。在另一实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含抗体FB79或其抗原结合片段以及药学可接受的载体。在另一实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含抗体FC1c或其抗原结合片段以及药学可接受的载体。
本发明的抗体可以与如化疗化合物、放疗等的其它治疗剂一起给药(组合地或单独地)。在一实施方案中，治疗化合物包括诸如TamifluTM的抗病毒化合物。相对于单独给予的单一治疗剂，这样的联合疗法提供了加合或协同改善的疗效。术语“协同”用来描述两种或更多种活性剂的组合效果好于每种各自的活性剂单独效果的总和。因此，如果两种或更多种试剂的组合效果引起活性或过程的“协同抑制”，则是指该活性或过程的抑制效果好于每种各自的活性剂的抑制效果的总和。术语“协同疗效”指在采用两种或更多种治疗组合时所观察到的疗效，其中疗效(如通过若干参数中的任何参数所测量的)好于采用各自单独的疗法时所观察到的疗效的总和。
可以将抗体给予以前对甲型流感病毒感染的治疗没有应答，即对抗甲型流感治疗没有显示是耐受的那些受试者。这样的治疗可以包括以前用抗病毒剂进行的治疗。这可能是因为例如感染了甲型流感病毒的抗病毒抗性株。
在一实施方案中，本发明的组合物可以包含本发明的抗体，其中抗体可以构成组合物中总蛋白的至少50重量％(如60重量％、70重量％、75重量％、80重量％、85重量％、90重量％、95重量％、97重量％、98重量％、99重量％或更多)。在这样的组合物中，抗体为纯化的形式。
本发明提供了一种制备药物的方法，该方法包括以下步骤：(i)制备本发明的抗体；和(ii)将纯化的抗体与一种或多种药学可接受的载体混合。
本发明还提供了一种制备药物的方法，该方法包括将抗体与一种或多种药学可接受的载体混合的步骤，其中抗体是获得自本发明的转化的B细胞或培养的浆细胞的单克隆抗体。因此，首先获得单克隆抗体，然后制备药物的步骤可以在不同的时间，由不同的人员，在不同的地点(如在不同的国家)进行。
作为递送抗体或B细胞以用于治疗目的的选择，可以向受试者递送编码源自B细胞或培养的浆细胞的所关注的单克隆抗体(或其活性片段)的核酸(通常为DNA)，从而使得核酸可以在受试者中原位表达以提供期望的疗效。合适的基因疗法和核酸递送载体在现有技术中是已知的。
本发明的组合物可以是免疫原性组合物，并且在一些实施方案中，其可以是包含抗原的疫苗组合物，所述抗原包含由本发明的抗体所识别的表位。本发明的疫苗可以是预防性的(即预防感染)或者是治疗性的(即治疗感染)。
特别地，如果包装为多剂量形式，组合物可以包含抗微生物剂。它们可以包含去垢剂，如Tween(聚山梨酯)，如Tween 80。去垢剂一般以低水平存在，如＜0.01％。组合物还可以包含钠盐(如氯化钠)以提供张力。通常，NaCl的浓度为10±2mg/ml。
此外，组合物可以包含例如约15-30mg/ml(例如25mg/ml)的糖醇(如甘露醇)或二糖(如蔗糖或海藻糖)，特别是它们要被冻干，如果或者它们包含从冻干材料还原的材料。用于冻干的组合物的pH值可以在冻干之前调节至约6.1。
本发明的组合物还可包含一种或多种免疫调节剂。在一实施方案中，一种或多种免疫调节剂包括佐剂。
本发明的表位组合物可以引发细胞介导的免疫应答以及体液免疫应答，以有效地抗流感病毒感染。这种免疫应答可以诱导持久的(如中和)抗体和在暴露于甲型流感病毒时可以迅速应答的细胞介导的免疫性。
医学治疗和用途
本发明的抗体和抗体片段或其衍生物及变体可用于甲型流感病毒感染的治疗、甲型流感病毒感染的预防或甲型流感病毒感染的诊断。
诊断方法可以包括使抗体或抗体片段与样品接触。这些样品可以是从诸如鼻通道、鼻窦腔、唾液腺、肺、肝、胰腺、肾、耳、眼、胎盘、消化道、心脏、卵巢、垂体、肾上腺、甲状腺、脑或皮肤提取的组织样品。诊断方法还可以包括抗原/抗体复合物的检测。
因此，本发明提供了(i)本发明的抗体、抗体片段或其变体及衍生物；(ii)本发明的永生B细胞克隆；(iii)能够结合本发明的抗体的表位；或(iv)配体，优选能够结合表位的抗体，所述表位结合本发明的抗体，以用于治疗中。
本发明还提供了治疗受试者的方法，该方法包括向受试者给予本发明的抗体、抗体片段或其变体及衍生物，或配体，优选能够结合表位的抗体，所述表位结合本发明的抗体。在一实施方案中，该方法使得减少受试者的甲型流感病毒感染。在另一实施方案中，该方法预防受试者的甲型流感病毒感染、减少受试者的甲型流感病毒感染的风险或延缓受试者的甲型流感病毒感染。
本发明还提供了(i)本发明的抗体、抗体片段或其变体及衍生物；(ii)本发明的永生B细胞克隆；(iii)能够结合本发明的抗体的表位；或(iv)配体，优选能够结合表位的抗体，所述表位结合本发明的抗体，在制备用于预防或治疗甲型流感病毒感染的药物中的用途。
本发明提供了本发明的组合物作为用于预防或治疗甲型流感病毒感染药物的用途。本发明还提供了本发明的抗体和/或包含这样的抗体所结合的表位的蛋白在制备用于治疗和/或诊断受试者的药物中的用途。本发明还提供了治疗受试者的方法，该方法包括向受试者给予本发明的组合物的步骤。在一些实施方案中，受试者可以是人。一种检查疗效的方法包括在给予本发明的组合物后监测疾病症状。治疗可以采用单剂量方案或多剂量方案。
在一实施方案中，向需要这样的治疗的受试者给予本发明的抗体、抗体片段、永生B细胞克隆、表位或组合物。这样的受试者包括但不限于特别是面临甲型流感病毒感染风险或对甲型流感病毒感染易感的受试者，包括例如免疫功能低下的受试者。
本发明的抗体或抗体片段可用于被动免疫或主动免疫。
本发明中所述抗体及其片段也可以用于诊断甲型流感病毒感染的试剂盒。此外，能够结合本发明的抗体的表位可以用在试剂盒中，以通过检测保护性抗甲型流感病毒抗体的存在来监测疫苗接种程序的效率。本发明所述的抗体、抗体片段或其变体及衍生物也可以用在试剂盒中，以监测具有期望的免疫原性的疫苗的生产。
本发明还提供一种制备药物的方法，该方法包括将单克隆抗体与一种或多种药学可接受的载体混合的步骤，其中所述单克隆抗体是获得自本发明的转染的宿主细胞的单克隆抗体。因此，首先获得(如通过表达和/或纯化)单克隆抗体，然后将其与药物载体混合的步骤可以在不同的时间，由不同的人员，在不同的地点(如在不同的国家)进行。
从本发明的转化的B细胞或培养的浆细胞开始，可进行以下各种步骤使由转化的B细胞或培养的浆细胞表达的抗体永存：培养、传代培养、克隆、亚克隆、测序、核酸制备等，对每一步骤可任选地优化。在优选的实施方案中，上述方法还包括应用于编码抗体的核酸的优化技术(如亲和力成熟或优化)。本发明涵盖了在这些步骤中使用和制备的所有细胞、核酸、载体、序列、抗体等。
在所有这些方法中，可以操作表达宿主中所用的核酸来插入、缺失或修饰某些核酸序列。这样的操作的变化包括但不限于引入限制位点、修改密码子的使用、增加或优化转录和/或翻译调控序列等的变化。也可以改变核酸以改变编码的氨基酸。例如，在抗体的氨基酸酸序列引入一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)氨基酸取代、缺失和/或插入可以是有用的。这样的点突变可以改变效应物功能、抗原结合亲和力、翻译后修饰、免疫原性等；可以引入氨基酸以附着共价基团(如标记)或者可以引入标签(如为了纯化目的)。可以将突变引入特异位点或者可以随机引入，随后进行选择(如分子进化)。例如，可以将一个或多个编码任何本发明的CDR区、重链可变区或轻链可变区中的核酸随机地或定向突变以在编码的氨基酸中引入不同的特性。这样的改变可以是迭代过程的结果，其中保留了初始的改变，并在其它核苷酸位置引入新改变。此外，可以合并在独立步骤中完成的变化。引入编码的氨基酸的不同特性可以包括但不限于增强的亲和力。
一般概念
术语“包含”涵盖“包括”以及“由…组成”，如“包含”X的组合物可以仅由X组成，或者可以包含诸如X+Y的其它成分。
词语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可以是完全不含Y。根据需要，可将词语“基本上”从本发明的定义中略去。
关于数值x的术语“约”是指，例如x±10％。
如本文所用的术语“疾病”指一般意义上的同义，并可以与术语“病症”和“疾病状况”(如在身体疾病状况中)互换地使用，其中所有都反映了损害正常功能的人或动物身体或其一个部位的异常状况，通常通过区分病征和症状来表现，并使人类、或动物的寿命缩短或生存质量下降。
如本文所用，对于受试者或患者的“治疗”旨在包括预防、防治和治疗。术语“受试者”或“患者”在本文中互换地使用来指包括人在内的所有哺乳动物。受试者的实例包括人、牛、狗、猫、马、山羊、绵羊、猪和兔。在一实施方案中，患者是人。
实施例
在以下的实施例中提供了本发明的示例性的实施方案。以下的实施例仅通过示例的方式给出，并用于帮助普通技术人员实施本发明。实施例并非意图以任何方式来在其它方面限制本发明的范围。
实施例1.永生B细胞的产生和抗甲型流感病毒的异亚型抗体的鉴定
对健康志愿者接种季节性流感疫苗。接种后早期(2周)，在所有供体的血浆中，疫苗特异的IgG抗体效价均增加。为了检测可能的异种抗体应答，对血清中和携带A/VN/1194/04的H5HA的假型的能力进行了测试。值得注意的是，几个供体表现出通过接种疫苗而增强的预增强(pre-boost)异亚型血清中和活性，在一些个体中IC50效价高达20,000(数据未显示)。这些结果表明，一些个体具有可以被流感疫苗所回忆的记忆B细胞，其对由H1和H5HA所共有的保守表位是特异性的。
为了表征在多克隆水平上观察到的异亚型抗体应答，从在接种疫苗2周后对接种疫苗产生最强H5中和应答的4个供体收集的冻存外周血单核细胞(PBMC)分离记忆B细胞。在CpG寡脱氧核苷酸2006的存在下，用EBV使CD22+IgM-、IgD-、IgA-IgG+记忆B细胞永生，并辐照同种异体PBMC。两周后，筛选培养上清的H5假型中和抗体的存在。通过感染性H1N1病毒(A/SI/3/2006)，利用结合与中和测定进一步测试阳性培养物。将对H5假型和H1N1病毒中和均呈阳性的培养物亚克隆，并通过亲和力色谱纯化抗体以进一步表征。
我们从第一次筛选分离了18种单克隆抗体，其在ELISA中结合H1和H5HA，并表现出中和H5假型(H5pp)以及H5N1、H1N1、H3N2和H9N2感染性病毒的不同能力(表4)。
表4.
(1)将不同抗体浓度用H5假型孵育，并添加至所述HEK293T细胞(Temperton，等人，Emerg Infect Dis 11，411-416，2005)。在第3天测量萤光素酶活性。
(2)在添加至MDCK细胞的单层之前，将不同抗体浓度在室温下用100TCID50的病毒孵育1hr。将细胞单层再孵育2-3天，并检查细胞致病效应(CPE)。中和效价定义为最低抗体浓度的倒数，在该浓度下，100TCID50的合适野生型病毒对MDCK细胞的感染性在50％的孔中被完全中和。感染性通过第4天存在的CPE来鉴定，并且效价通过Reed-Muench法计算。
(3)作为对照，还包括了H1-特异性抗体(FA6和FC98)。
我们从第二次筛选分离了另外的8种单克隆抗体。将这些抗体与从第一次筛选分离的13种抗体一起进一步表征结合不同甲型流感病毒亚型的HA(表5)。
表5.
符号-表明在最高测试浓度下抗体没有中和。
然后在假型中和测定中功能性表征抗体(表6)。大多数抗体对所有H5假型代表性分支0、1、2.1、2.2和2.3表现出广谱中和模式。诸如FB54、FB110、FC6、FC41和FE43的一些抗体以低于0.4μg/ml的IC90值中和了假型，所以它们是非常强效的。这些数据表明，一些分离的人抗体对抗原性不同的H5假型具有广谱和强效的中和活性。
表6.
随后测试抗体中和属于组1和组2亚型的人和禽感染性甲型流感病毒的能力(表7A、表7B)。大多数抗体表现出相当宽的病毒中和，这些抗体能够中和两种或更多种属于组1亚型，即H1N1、H2N2、H5N1、H6N1和H9N2的甲型流感病毒。
表7A.
符号-表明在最高测试浓度下抗体没有中和。
表7B.
符号-表明在最高测试浓度下抗体没有中和。
测试三种所选的茎特异性(见下文)抗体(FE43、FC41和FB110)和球状头部特异性(见下文)抗体(FE17)抗一组人和动物H1N1病毒，其跨越了几十年抗原进化并包括最近的流行病毒A/CA/07/09(表8)。FE17中和了六种病毒中的四种，FB110、FC41和FE43中和了包括流行A/CA/07/09株在内的所有六种H1N1分离物。综上所述，这些发现表明分离的异亚型中和抗体的能力对甲型流感病毒的抗原进化不敏感。
表8.
实施例2.异亚型中和抗体使用的抗原位点和VH基因
在试图理解分离的抗体是否结合位于HA1或HA2上的表位时，我们用H5N1A/VN/1194/04病毒的重组HA进行了蛋白印迹(WB)分析。没有抗体在WB中反应，这表明它们可能识别构象表位。因此，我们评价了在pH5.0的条件下处理之前和之后结合HA转染的(A/VN/1194/04)HEK293T细胞的抗体，该条件引发HA分子中的不可逆构象变化。唯一例外的是FE17，所有抗体染色H5转染的对照细胞，但不与酸处理的细胞反应。不受任何关于表位结合的特定理论的约束，结果表明它们结合在酸处理时丧失的预融合决定簇(表9)。
为了进一步研究抗体所结合的抗原位点的一致性，我们测量了抗体干扰具有已知表位特异性的参考抗体的结合的能力：i)C179，结合HA的茎区中的表位的小鼠单克隆抗体(Okuno等人，1993)，和ii)FLD21，结合HA球状头部的人H5HA特异性单克隆抗体。用重组的三聚H5HA(A/VN/1203/04)涂布ELISA板，并在室温下用过量的人抗体孵育一小时，然后添加限制浓度的C179或FLD21，随后利用特定的次级试剂进行检测。唯一例外的是FE17，所有的抗体都完全与C179竞争结合H5HA，但是它们没有影响FLD21的结合(表9)。相反地，FE17与FLD21竞争结合HA，但却不影响C179结合。这些发现表明，在体外，FE17结合球状头部中的表位，而所有其它异亚型抗体结合位于HA茎区的表位，该表位与H5HA分子上的C179表位重叠。
表9.
(1)来自H5N1病毒A/VN/1203/04的HA
为了进一步研究分离的异亚型中和抗体的异质性，我们测序了Ig基因。14种抗体使用了与不同VL配对的VH1-69种系序列(表10)。其它抗体使用了与VL2-23配对的VH3-23或者使用了与VL1-44配对的VH4-39。
表10.
nd：未进行
基于反应性模式和VH基因的使用，上述结果与三种指定为类型1、类型2和类型3的异亚型抗体的分离是一致的。不受任何关于表位识别或中和的种系使用的特定理论的约束，类型1抗体识别位于HA茎区中用酸处理即丧失的构象表位，并使用VH1-69种系序列。类型2抗体识别位于HA茎区中的酸敏感性构象表位，但不使用VH1-69种系序列。如FE17所示，类型3的抗体识别在H1亚型和一些H5亚型间共有的HA球状头部中的表位。类型1和类型2抗体对H1N1病毒表现出非常低的血凝抑制效价，这与这些抗体结合HA茎区的观点是一致的(表11)。与此相反，球状头部特异性抗体表现出强效的血凝抑制。
表11.
实施例3.异亚型中和抗体的表位特异性
为作图由异亚型中和抗体所识别的表位，我们试图利用流感病毒A/SI/2/06分离病毒逃逸突变体。在FE17的存在下分离的7个逃逸突变体在球状头部带有点突变(根据H3编号，HA1的位置145上的S至N)。这一发现符合交叉竞争数据及FE 17不能结合A/INDO/5/05的H5，其在同一位置带有S至P取代。与此相反，尽管做了几次尝试，我们未能从FE43和FB110分离逃逸突变体。这些发现表明异亚型抗体所识别的茎区较不易发生变异，而不丧失病毒适合度。
实施例4.人抗体的体内预防效果
为了确定抗体在体外表现的中和活性是否能预测它们的体内预防效果，对BALB/c小鼠用25或2.5mg/kg的FE17、FE43或对照抗体进行腹膜内(i.p.)被动免疫，并在24小时后用50MLD50(50％小鼠致死剂量)的以下流感病毒进行攻击：H1N1A/PR/8/34、H6N1A/teal/HK/W312/97、H5N1A/VN/1203/04、H5N1A/INDO/5/05或H7N7A/NL/219/03。FE43在任何测试浓度下保护小鼠免受PR8致死攻击，而FE17以剂量依赖性的方式提供保护，为接受了25mg/kg抗体的动物提供了100％的保护，为注射了2.5mg/kg抗体的动物提供了80％的保护(图1A)。有趣的是，尽管在体外没有可检测的病毒中和活性，但是在25mg/kg下，FE43保护所有小鼠幸免于致死的分支IH5N1A/VN/1203/04病毒，而在2.5mg/kg下则只提供了部分保护(图1B)。如体外中和活性所预测的，两种剂量的FE17都保护了小鼠幸免于致死的H5N1A/VN/1203/04病毒攻击。用分支2H5N1A/INDO/5/05病毒攻击后，只有在最高剂量下才观察到E43的保护(图1C)。与体外表现的中和活性一致，FE43充分地保护了小鼠幸免于两种测试剂量的致死剂量的禽H6N1A/teal/HK/W312/97病毒的攻击，而所有注射了FE17的小鼠却没有得到保护(图1D)。正如所预计的，没有抗体对致死的H7N7A/NL/219/03病毒攻击提供保护(图1E)。
为了评价对非致死性H9N2A/ck/HK/G9/97病毒的体内中和活性，对小鼠i.p.注射FE43、FE17、对照抗体或白鼬超免疫血清，并在24小时后用105TCID50的H9N2病毒攻击。在p.i.第4天将小鼠处死，收集小鼠的肺以测量复制病毒效价。与体外表现的中和活性一致，注射了FE43的小鼠在它们的肺中表现出2-log的病毒复制减少，而使用对照抗体时没有观察到明显的差异(图1F)。
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Claims (32)
1.一种中和甲型流感病毒的至少两种不同组1亚型或至少两种不同组2亚型感染的人抗体或其抗原结合片段。
2.如权利要求1所述的抗体，其中所述甲型流感病毒亚型选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16。
3.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中中和50％甲型流感病毒所需的抗体浓度是50μg/ml或更低。
4.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中中和50％甲型流感病毒所需的抗体浓度是10μg/ml或更低。
5.如权利要求1、2、3或4所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述组1亚型是H1、H2、H5或H9。
6.如权利要求1、2、3或4所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述组2亚型是H3或H7。
7.如权利要求1、2、3或4所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗体片段中和三种、四种、五种或更多种甲型流感病毒亚型的感染。
8.如权利要求1至6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体中和以下甲型流感病毒亚型的感染：(i)H1和H2；(ii)H1和H5；(iii)H1和H9；(iv)H2和H5；(v)H2和H9；(vi)H5和H9；(vii)H3和H7；(viii)H1、H2和H5；(ix)H1、H2和H9；(x)H1、H5和H9；或(xi)H1、H2、H5和H9。
9.一种抗体或其抗原结合片段，其包含至少一个互补决定区(CDR)序列，所述互补决定区(CDR)序列与SEQ ID NO：1-6、17-22、33-38、49-53、64-68、78-82、93-98、109-114、125-127或133-135中的任一个具有至少95％的序列同一性，其中所述抗体中和甲型流感病毒。
10.一种抗体或其抗原结合片段，其包含选自以下序列的重链CDR1：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：133；选自以下序列的重链CDR2：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：126和SEQ ID NO：134；以及选自以下序列的重链CDR3：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：127和SEQ ID NO：135，其中所述抗体中和甲型流感病毒。
11.一种抗体或其抗原结合片段，其包含选自以下序列的轻链CDR1：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：96和SEQ ID NO：112；选自以下序列的轻链CDR2：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：97和SEQ ID NO：113；以及选自以下序列的轻链CDR3：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：114，其中所述抗体中和甲型流感病毒。
12.如权利要求10或11所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有以下氨基酸序列的重链：CDRH1为SEQ ID NO：1、CDRH2为SEQ ID NO：2和CDRH3为SEQ ID NO：3；或者CDRH1为SEQ ID NO：17、CDRH2为SEQ ID NO：18和CDRH3为SEQ ID NO：19；或者CDRH1为SEQ ID NO：33、CDRH2为SEQ ID NO：34和CDRH3为SEQ ID NO：35；或者CDRH1为SEQ ID NO：49、CDRH2为SEQ ID NO：50和CDRH3为SEQ ID NO：51；或者CDRH1为SEQ ID NO：64、CDRH2为SEQ ID NO：65和CDRH3为SEQ ID NO：66；或者CDRH1为SEQ ID NO：78、CDRH2为SEQ ID NO：79和CDRH3为SEQ ID NO：80；或者CDRH1为SEQ ID NO：93、CDRH2为SEQ ID NO：94和CDRH3为SEQ ID NO：95；或者CDRH1为SEQ ID NO：109、CDRH2为SEQ ID NO：110和CDRH3为SEQ ID NO：111；或者CDRH1为SEQ ID NO：125、CDRH2为SEQ ID NO：126和CDRH3为SEQ ID NO：127；或者CDRH1为SEQ ID NO：133、CDRH2为SEQ ID NO：134和CDRH3为SEQ ID NO：135。
13.如权利要求10、11或12所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有以下氨基酸序列的轻链：CDRL1为SEQ ID NO：4、CDRL2为SEQ ID NO：5和CDRL3为SEQ ID NO：6；或者CDRL1为SEQ ID NO：20、CDRL2为SEQ ID NO：21和CDRL3为SEQ ID NO：22；或者CDRL1为SEQ ID NO：36、CDRL2为SEQ ID NO：37和CDRL3为SEQ ID NO：38；或者CDRL1为SEQ ID NO：52、CDRL2为SEQ ID NO：5和CDRL3为SEQ ID NO：53；或者CDRL1为SEQ ID NO：36、CDRL2为SEQ ID NO：67和CDRL3为SEQ ID NO：68；或者CDRL1为SEQ ID NO：81、CDRL2为SEQ ID NO：21和CDRL3为SEQ ID NO：82；或者CDRL1为SEQ ID NO：96、CDRL2为SEQ ID NO：97和CDRL3为SEQ ID NO：98；或者CDRL1为SEQ ID NO：112、CDRL2为SEQ ID NO：113和CDRL3为SEQ ID NO：114。
14.如权利要求1至13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO：13、29、45、60、74、89、105、121、131或139中任一个的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性的重链可变区。
15.如权利要求1至14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO：14、30、46、61、75、90、106或122中任一个的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性的轻链可变区。
16.一种抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区；或者含有SEQ ID NO：29的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQID NO：30的氨基酸序列的轻链可变区；或者含有SEQ ID NO：45的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：46的氨基酸序列的轻链可变区；或者含有SEQ ID NO：60的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：61的氨基酸序列的轻链可变区；或者含有SEQ ID NO：74的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：75的氨基酸序列的轻链可变区；或者含有SEQID NO：89的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：90的氨基酸序列的轻链可变区；或者含有SEQ ID NO：105的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：106的氨基酸序列的轻链可变区；或者含有SEQ ID NO：121的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO：122的氨基酸序列的轻链可变区；其中所述抗体中和甲型流感病毒。
17.如前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是FC41、FE43、FB110或FE17。
18.如前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是单克隆抗体、纯化的抗体、分离的抗体、单链抗体、Fab、Fab’、F(ab′)2、Fv或scFv。
19.一种抗体或其抗原结合片段，其结合与如前述的权利要求中任一项所述的抗体相同的表位，其中所述抗体或其抗原结合片段中和甲型流感病毒。
20.如前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其用于治疗甲型流感病毒感染。
21.一种由永生B细胞克隆FB54、FB139、FC6、FC41、FE43、FE53、FE17、FB75、FB110、FB177、FB79、FC1c、FB118、FB179、FB186、FE9b、FE25、FE54、FG20、FB15b或FC54表达的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体中和甲型流感病毒。
22.一种包含编码如前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸的核酸分子。
23.如权利要求22所述的核酸分子，其中所述多核苷酸序列与SEQ ID NO：7-12、15、16、23-28、31、32、39-44、47、48、54-59、62、63、69-73、76、77、83-88、91、92、99-104、107、108、115-120、123、124、128-130、132、136-138或140中任一个的核酸序列至少75％相同。
24.一种载体，其包含如权利要求22或23所述的核酸分子。
25.一种细胞，其表达如权利要求1至21中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或者包含如权利要求24所述的载体。
26.一种分离或纯化的免疫原性多肽，其包含结合如权利要求1至21中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的表位。
27.一种药物组合物，其包含如权利要求1至21中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求22或23所述的核酸、如权利要求24所述的载体、如权利要求25所述的细胞或如权利要求26所述的免疫原性多肽以及药学可接受的稀释剂或载体。
28.一种药物组合物，其包含第一抗体或其抗原结合片段以及第二抗体或其抗原结合片段，其中所述第一抗体是如权利要求1至21中任一项所述的抗体，并且所述第二抗体中和甲型流感病毒感染。
29.如权利要求1至21中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求22或23所述的核酸、如权利要求24所述的载体、如权利要求25所述的细胞、如权利要求26所述的免疫原性多肽或者如权利要求27或28所述的药物组合物(i)在制备用于治疗甲型流感病毒感染的药物中的用途；(ii)在疫苗中的用途；或(iii)在甲型流感病毒感染的诊断中的用途。
30.如权利要求1至21中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在通过检查抗甲型流感病毒疫苗的抗原是否含有正确构象中的特异性的表位来监测所述疫苗的质量中的用途。
31.一种减少甲型流感病毒感染或降低甲型流感病毒感染的风险的方法，所述方法包括向有需要的对象给予治疗有效量的如权利要求1至21中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
32.一种特异性结合如权利要求1至21中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的表位，其用于(i)治疗中；(ii)制备用于治疗甲型流感病毒感染的药物；(iii)作为疫苗；或(iv)筛选能够中和甲型流感病毒感染的配体。
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