KR20240088574A - 인플루엔자 바이러스에 대한 단일 도메인 항체 및 이의 용도 - Google Patents
인플루엔자 바이러스에 대한 단일 도메인 항체 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인플루엔자 바이러스(Influenza virus)에 대한 단일 도메인 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌(Hemagglutinin)에 특이적으로 결합하는 단일 도메인 항체를 제작하고, 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 상기 단일 도메인 항체의 안전성 및 인플루엔자 A 바이러스에 대한 중화능이 우수함을 확인하였으므로, 상기 단일 도메인 항체를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인플루엔자 A 바이러스 감염 예방, 치료 또는 진단용 조성물의 유효성분으로 용이하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 인플루엔자 바이러스(Influenza virus)에 대한 단일 도메인 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌(Hemagglutinin)에 특이적으로 결합하는 단일 도메인 항체를 포함하는 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스(Influenza virus)는 전세계적으로 공중 보건에 상당히 위협이 되는, 연간 인플루엔자 유행병 및 때때로 광역적인 전염병을 야기시킨다. 계절성 인플루엔자 감염은 특히 어린이, 면역약화된 환자 및 노령층에서, 매년 200,000명 내지 500,000명의 사망률과 연관된다. 사망률은 전형적으로 광역적인 전염성 인플루엔자 발발 계절 동안 더 증가된다. 특히 서비스가 불충분한 개체군에서, 인플루엔자 감염을 예방하고 치료하기 위한 강력한 항바이러스성 치료제가 여전히 요구된다.
인플루엔자 바이러스는 A형, B형 및 C형의 3가지 유형이 존재한다. 인플루엔자 A 바이러스는 인간, 돼지, 닭 및 흰담비를 포함하여, 광범위한 새 및 포유동물을 감염시킬 수 있다. 인플루엔자 A 바이러스는 표면 당단백질 헤마글루티닌(Hemagglutinin; HA) 및 뉴라미니다아제(Neuraminidase; NA)를 코딩하는 2개 유전자의 항원성 영역 내 대립유전자 변이를 기반으로 아형(Subtype)으로 분류될 수 있다. 아종명을 표기할 때에는 H1N1과 같은 형태로 표기한다. 인간에게 인플루엔자를 일으키는 인플루엔자 A형 바이러스의 아종으로는 주로 H1, H2, H3과 N1, N2와의 조합으로 이루어진 것이 많다. 각각의 바이러스 아형은 상이한 병원성 프로파일을 갖는 다양한 균주로 변이되었다. 일부는 특정 아종에 병원성이 있지만, 다른 종에서는 병원성이 없고, 일부는 여러 종에서 병원성을 갖는다. 사람에게 발병되어 사망자가 발생한 인플루엔자 A형 바이러스의 아종으로는, 1918년 스페인 독감을 일으킨 H1N1, 1950 년대 말에 아시아 독감을 일으킨 H2N2, 1960년대 말에 홍콩 독감을 일으킨 H3N2, 2000년대 중반까지 인플루엔자 범유행을 일으킨 H5N1, 2013년 중국에서 발병한 H7N9 외에, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, H5N2, H10N7 등이 있다.
한편 기존의 단일클론 중화항체 개발의 경우, 단일클론 항체(150 kDa)의 분자 질량은 상대적으로 커서, 조직 침투가 어렵고, 투여 부위 주변으로의 확산이 쉽지 않아, 치료 효과가 불충분해지기 쉬우며, 면역원성 발생의 위험성 또한 높은 것으로 알려져 있다. 그리고 또 한편으로는 이러한 문제 극복을 위해 완전 인간화를 추구하고 있는데, 이 경우 기존 항체보다 긴 개발 기간 및 높은 생산 단가의 문제가 있으며, 항체 자체의 새로운 안정성 이슈가 발생하는 등 여러 가지 요인으로 인해 개발이 쉽지 않은 상황이다.
이러한 기존 항체 치료제의 대안으로 새롭게 연구되고 있는 것으로 단일 도메인 항체(Single domain antibody, sdAb)이다. 단일 도메인 항체는 나노바디(Nanobody, VHH, Nb)라고도 불리며, 낙타과 동물 등에서 발견되는 중쇄 전용 항체(hcAb)의 항원 인식 가변 부위(variable region)를 말한다. 나노바디는 기존 단일클론 항체와 비교하여 구조적으로 높은 항원 친화성 및 항원 특이성을 가지면서, 더 작은 크기(기존 단일클론 항체의 1/10 크기, 15 kDa)를 가지고 있어 조직 침투성이 상대적으로 높은 특성을 가지고 있다. 아울러 인간 항체와의 유사성(homology)이 높아 면역원성 위험성도 낮다는 장점이 있다. 산업적 활용에 있어서도 나노바디 구조는 높은 열 안정성을 가지고 있어서, 진단키트 제작에의 활용에 용이하고, 항체 제품으로 제작시 완제품에 대한 보관 및 사용에서 높은 편의성을 제공한다.
이에, 본 발명자들은 나노바디 제작 기술에 기반한, 인플루엔자 바이러스를 표적화하는 신규 나노바디를 개발함으로써, 본 출원에 이르렀다.
본 발명의 목적은 인플루엔자 바이러스(Influenza virus)에 대한 단일 도메인 항체 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌(Hemagglutinin)에 특이적으로 결합하는 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 sdAb는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 sdAb는 적어도 1개 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있고, 상기 적어도 1개 이상의 아미노산 치환이 보존적 치환일 수 있으며, 아미노산의 비-유전자 코딩 아미노산 또는 합성 아미노산으로의 치환일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 sdAb는 단량체성 또는 다량체성일 수 있다. 다량체성일 경우 상기 sdAb 간 펩티드 링커를 통해 융합될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 sdAb가 Fc 단편에 융합된 중쇄-단독 항체(HCAb)를 제공한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 HCAb는 단량체성 또는 다량체성일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 Fc 단편에 sdAb가 펩티드 링커를 통해 융합될 수 있고, 상기 Fc 단편은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 HCAb는 적어도 1개 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있고, 상기 적어도 1개 이상의 아미노산 치환이 보존적 치환일 수 있으며, 아미노산의 비-유전자 코딩 아미노산 또는 합성 아미노산으로의 치환일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, (a) 상기 sdAb를 포함하는 제 1 항원 결합 부분; 및 (b) 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 부분을 포함하는 항체를 제공한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 항체는 이중특이적 또는 다중특이적일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 제 2 항원 결합 부분는 제 1 항원 결합 부분과 펩티드 링커를 통해 서로 융합될 수 있고, 상기 제 2 항원 결합 부분은 전장 항체, Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 단일쇄 Fv(scFv), scFv-scFv, 미니바디, 디아바디 또는 제 2 sdAb일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 인플루엔자 A 바이러스는 H1N1일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는, 핵산 분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는, 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은
(a) 항체가 발현되도록 하는 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(b) 발현된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 단계
를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 A 바이러스 감염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 인플루엔자 A 바이러스는 H1N1일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 인플루엔자 A 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 다음 단계를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 검출 방법을 제공한다:
(a) 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 검출 대상 시료를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 검출 대상 시료에 포함된 인플루엔자 A 바이러스의 결합 여부를 확인하는 단계.
아울러, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 유효성분으로 포함하는, 독감 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 독감은 인플루엔자 A 바이러스 감염에 의한 것일 수 있다.
본 발명에서는 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌(Hemagglutinin)에 특이적으로 결합하는 단일 도메인 항체를 제작하였고, 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 상기 단일 도메인 항체의 안전성 및 인플루엔자 A 바이러스에 대한 중화능이 우수함을 확인하였으므로, 상기 단일 도메인 항체를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인플루엔자 A 바이러스 감염 예방, 치료 또는 진단용 조성물의 유효성분으로 용이하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 불활화한 인플루엔자 A 바이러스(Influenza A virus)를 알파카에 면역하는 방법을 모식화한 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 불활화한 인플루엔자 A 바이러스를 알파카에 면역 후 인플루엔자 A 헤마글루티닌(Hemagglutinin, HA)-His 항원(인플루엔자 A-HA-His 항원)에 대한 항체 생성을 확인한 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 파이오패닝을 통해 증폭된 각 단계별 폴리 파아지(poly phage)와 인플루엔자 A-HA-His 항원의 결합을 확인한 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 선별한 후보 단일 파아지(mono phage)와 인플루엔자 A-HA-His 항원의 결합을 확인한 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 최종 선별한 단일 도메인 항체와 인플루엔자 A-HA-His 항원의 친화도를 확인한 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 최종 선별한 단일 도메인 항체의 세포 독성을 확인한 도이다.
도 7은 인플루엔자 A 바이러스 감염 동물모델에 본 발명의 일 실시예에 따라 최종 선별한 단일 도메인 항체를 투여하는 방법을 모식화한 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 최종 선별한 단일 도메인 항체를 0.15 mg/kg, 0.5 mg/kg 또는 1.5 mg/kg 투여한 인플루엔자 A 바이러스 감염 동물모델의 체중 변화 및 생존율을 확인한 도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 최종 선별한 단일 도메인 항체를 1.5 mg/kg 또는 3 mg/kg 투여한 인플루엔자 A 바이러스 감염 동물모델의 체중 변화를 확인한 도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 최종 선별한 단일 도메인 항체를 0.15 mg/kg, 0.5 mg/kg 또는 1.5 mg/kg 투여한 인플루엔자 A 바이러스 감염 동물모델의 폐 조직 내 바이러스 역가를 확인한 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 불활화한 인플루엔자 A 바이러스를 알파카에 면역 후 인플루엔자 A 헤마글루티닌(Hemagglutinin, HA)-His 항원(인플루엔자 A-HA-His 항원)에 대한 항체 생성을 확인한 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 파이오패닝을 통해 증폭된 각 단계별 폴리 파아지(poly phage)와 인플루엔자 A-HA-His 항원의 결합을 확인한 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 선별한 후보 단일 파아지(mono phage)와 인플루엔자 A-HA-His 항원의 결합을 확인한 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 최종 선별한 단일 도메인 항체와 인플루엔자 A-HA-His 항원의 친화도를 확인한 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 최종 선별한 단일 도메인 항체의 세포 독성을 확인한 도이다.
도 7은 인플루엔자 A 바이러스 감염 동물모델에 본 발명의 일 실시예에 따라 최종 선별한 단일 도메인 항체를 투여하는 방법을 모식화한 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 최종 선별한 단일 도메인 항체를 0.15 mg/kg, 0.5 mg/kg 또는 1.5 mg/kg 투여한 인플루엔자 A 바이러스 감염 동물모델의 체중 변화 및 생존율을 확인한 도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 최종 선별한 단일 도메인 항체를 1.5 mg/kg 또는 3 mg/kg 투여한 인플루엔자 A 바이러스 감염 동물모델의 체중 변화를 확인한 도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 최종 선별한 단일 도메인 항체를 0.15 mg/kg, 0.5 mg/kg 또는 1.5 mg/kg 투여한 인플루엔자 A 바이러스 감염 동물모델의 폐 조직 내 바이러스 역가를 확인한 도이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시형태를 들어 상세히 설명한다. 본 발명의 실시형태는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 용어 "에피토프"는 항체에 특이적 결합을 할 수 있는 단백질 결정요인을 의미한다. 에피토프는 일반적으로 분자, 예컨대 아미노산 또는 당 측쇄의 화학적 활성 표면 그룹화로 이루어지고 일반적으로 특이적 3차원 구조 특징, 뿐만 아니라 특이적 전하 특징을 갖는다.
용어 "치료"는 본원에 개시된 장애 또는 질환, 예를 들어 질환의 증상 또는 합병증을 늦추거나, 중단시키거나, 중지시키거나, 제어하거나, 정지시키거나, 완화하거나 또는 개선하는 것, 또는 그의 진행을 역전시키는 것일 수 있지만, 반드시 모든 질환 또는 장애 증상의 완전한 제거를 나타내는 것은 아닌 모든 과정을 의미한다.
용어 "예방"은 질환 또는 장애, 예를 들어 질환의 예방적 치료, 또는 질환 또는 장애의 발병 또는 진행을 지연시키는 것을 의미한다.
용어 "개체" 또는 "대상체"는, 비제한적으로, 인간, 소과, 말, 고양이, 개, 설치류, 또는 영장류를 포함하는, 포유동물을 지칭한다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다.
용어 "항체"는 이의 가장 넓은 의미로 사용되고, 이들이 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한, 비제한적으로 단클론성 항체, 다클론성 항체, 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중특이적 항체), 전장 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 다양한 항체 구조를 포괄한다. 용어 "항체"는 종래의 4-쇄 항체, 단일 도메인 항체, 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
기본 4-쇄 항체 유닛은 2개의 동일한 경 (L) 쇄 및 2개의 동일한 중 (H) 쇄로 구성된 헤테로사량체성 당단백질이다. IgM 항체는 J 쇄로 불리는 추가의 폴리펩티드와 함께 기본 헤테로사량체 유닛들 중 5개로 이루어지고, 10개의 항원-결합 부위를 함유하는 반면, IgA 항체는 J 쇄와 조합으로 다가 집합체를 형성하기 위해 중합화할 수 있는 기본 4-쇄 유닛들 중 2-5개를 포함한다. IgG의 경우에, 4-쇄 유닛은 일반적으로 약 150,000 달톤이다. 각각의 L 쇄는 1개의 공유 디설파이드 결합에 의해 H 쇄에 연결되는 반면, 2개의 H 쇄는 H 쇄 아이소타입에 의존하여 하나 이상의 디설파이드 결합에 의해 서로에 연결된다. 각각의 H 및 L 쇄는 또한 규칙적으로 이격된 쇄간 디설파이드 브릿지를 갖는다. 각각의 H 쇄는 N-말단에서, α 및 γ 쇄의 각각에 대하여 가변 도메인 (VH) 이어서 3개의 불변 도메인 (CH) 그리고 μ 및 ε 아이소타입에 대하여 4개의 CH 도메인을 갖는다. 각각의 L 쇄는 N-말단에서, 이의 다른 단부에 가변 도메인 (VL) 이어서 불변 도메인을 갖는다. VL은 VH와 정렬되고 CL은 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)과 정렬된다. VH 및 VL의 짝짓기는 단일 항원-결합 부위를 함께 형성한다. 임의의 척추동물 종으로부터 L 쇄는, 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반하여, 카파 및 람다로 불리는, 2개의 분명히 구별되는 유형들 중 하나로 배정될 수 있다. 그들의 중쇄의 불변 도메인 (CH)의 아미노산 서열에 의존하여, 면역글로불린은 상이한 클래스 또는 아이소타입으로 배정될 수 있다. 면역글로불린의 5개의 클래스가 있다: α, δ, ε, γ 및 μ, 각각으로 지정된 중쇄를 갖는, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM. γ 및 α 클래스는 CH 서열 및 기능에서 상대적으로 소수의 차이에 근거하여 서브클래스로 추가 분할되고, 예를 들면, 인간은 하기 서브클래스를 발현시킨다: IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2.
용어 "중쇄-단독 항체" 또는 "HCAb"는, 중쇄를 포함하지만 4-쇄 항체에서 일반적으로 발견된 경쇄가 부족한 기능성 항체를 지칭한다.
용어 "단일-도메인 항체", "나노바디" 또는 "sdAb"는 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)를 갖는 단일 항원-결합 폴리펩티드를 지칭한다. sdAb 단독은 상응하는 CDR-함유 폴리펩티드와 짝짓기 없이 항원에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 단일-도메인 항체는 낙타과 HCAb로부터 조작되고, 그들의 중쇄 가변 도메인은 "VHH" (중쇄 항체의 중쇄의 가변 도메인)으로서 본원에서 지칭된다. 기본 VHH는 N-말단부터 C-말단까지 하기 구조를 갖는다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, 여기에서 FR1 내지 FR4는 프레임워크 영역 1 내지 4 각각을 지칭하고, CDR1 내지 CDR3은 상보성 결정 영역 1 내지 3을 지칭한다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 "VH" 및 "VL" 각각으로서 지칭될 수 있다. 이들 도메인은 일반적으로 (동일한 클래스의 다른 항체에 비하여) 항체의 최대 가변성 부분이고 항원 결합 부위를 함유한다. 낙타과 종으로부터 중쇄-단독 항체는 "VHH"로서 지칭되는 단일 중쇄 가변 영역을 갖는다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정한 분절이 항체들 중 서열에서 광범위하게 상이하다는 사실을 지칭한다. V 도메인은 항원 결합을 매개하고 이의 특정 항원에 대하여 특정 항체의 특이성을 정의한다. 하지만, 가변성은 가변 도메인의 전체 범위에 걸쳐서 고르게 분포되지 않는다. 대신에, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 둘 모두에서 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 초가변 영역 (HVR)로 불리는 3개의 분절에서 농축된다. 가변 도메인의 더욱 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은, 루프 연결을 형성하는, 3개의 CDR로 연결된, 베타-시트 구성을 주로 채택하는, 그리고 일부 경우에 베타-시트 구조의 일부를 형성하는, 4개의 FR 영역을 포함한다. 각각의 쇄에서 CDR은 FR 영역에 의해 아주 근접하여 함께 유지되고, 다른 쇄로부터 CDR은 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다 (Kabat, Elvin A., Sequence of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)을 참고한다). 불변 도메인은 항원에 대한 항체의 결합에 직접적으로 관여되지 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예컨대 항체-의존적 세포 독성에서 항체의 참여를 나타낸다.
용어 "불변 도메인"은, 항원-결합 부위를 함유하는, 면역글로불린의 다른 부분, 가변 도메인에 비하여 더 많은 보존된 아미노산 서열을 가지고 있는 면역글로불린 분자의 부분을 지칭한다. 불변 도메인은 중쇄의 CH1, CH2 및 CH3 도메인 (집합적으로, CH) 및 경쇄의 CHL (또는 CL) 도메인을 함유한다.
용어 "전장 항체", "온전한 항체", 또는 "전체의 항체"는, 항체 단편과 대조적으로, 이의 실질적으로 온전한 형태로 항체를 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. 특이적으로, 전장 4-쇄 항체는 Fc 영역을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 가진 것들을 포함한다. 전장 중쇄-단독 항체는 중쇄 가변 도메인 (예컨대 VHH) 및 Fc 영역을 포함한다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들면, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 일부 경우에, 온전한 항체는 하나 이상의 이펙터 기능을 가질 수 있다.
"항체 단편" 또는 "항원-결합 단편"은 온전한 항체의 한 부분, 바람직하게는 온전한 항체의 항원 결합 및/또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 비제한적으로 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 (scFv) 분자; 단일 도메인 항체 (예컨대 VHH), 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. "Fv"는 완전 항원-인식 및 -결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 단편은 치밀한, 비-공유 회합에서 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 영역 도메인의 이량체로 이루어진다. "단일-쇄 Fv" 또한 약칭 "sFv" 또는 "scFv"는 단일 폴리펩티드 쇄에 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, scFv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위하여 원하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH와 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. "디아바디"는 V 도메인의 쇄내가 아닌 쇄간 짝짓기가 달성되도록 VH와 VL 도메인 사이의 짧은 링커 (약 5-10개의 잔기)를 가진 sFv 단편을 작제하고, 그것에 의해 2가 단편, 즉, 2개의 항원-결합 부위를 갖는 단편을 초래함으로써 제조된 작은 항체 단편을 지칭한다. 이중특이적 디아바디는 2개의 항체의 VH 및 VL 도메인이 상이한 폴리펩티드 쇄에서 존재하는 2개의 "교차" sFv 단편의 헤테로이량체이다.
용어 "인간화된 항체"는 "키메라 항체"의 서브셋으로서 사용된다.
비-인간 (예를 들면, 라마 또는 낙타과) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 일부 구현예에서, 인간화된 항체는 수령체의 (이하에서 정의된) CDR로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화성, 및/또는 수용력을 갖는 비-인간 종 (공여체 항체) 예컨대 마우스, 랫트, 토끼, 낙타, 라마, 알파카, 또는 비-인간 영장류의 CDR로부터의 잔기로 대체되는 인간 면역글로불린 (수령체 항체)이다.
일부 사례에서, 인간 면역글로불린의 프레임워크 ("FR") 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화된 항체는 수령체 항체에서 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능, 예컨대 결합 친화성을 추가로 개선하기 위해 실시될 수 있다.
용어 "초가변 영역", "HVR", 또는 "HV"는, 본원에서 사용된 경우 서열에서 초가변성이고/거나 구조적으로 정의된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 단일 도메인 항체는 3개의 HVR (또는 CDR): HVR1 (또는 CDR1), HVR2 (또는 CDR2), 및 HVR3 (또는 CDR3)을 포함한다. HVR3 (또는 CDR3)은 3개의 HVR의 최고 다양성을 표시하고, 항체에 미세 특이성 부여에서 고유의 역할을 한다고 알려져 있다. 예를 들면, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)을 참고한다.
용어 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 카밧 시스템에 의해 정의된 바와 같이 초가변 영역을 지칭하는데 사용된다. Kabat, Elvin A., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)을 참고한다. 카밧 상보성 결정 영역 (CDR)는 서열 가변성에 근거하고 가장 흔하게 사용된다.
용어 "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 바와 같이 HVR 잔기 이외의 가변-도메인 잔기이다.
용어 "특이적"은 항원의 특정 에피토프에 대하여 항원 결합 단백질 (예컨대 sdAb)의 선택적 인식을 지칭한다.
천연 항체는, 예를 들어, 단일특이적이다. 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "다중특이적"은 항원 결합 단백질이 폴리에피토프 특이성을 갖는 (즉, 1개의 생물학적 분자에서 2개의, 3개의, 또는 초과의, 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있거나 2개의, 3개의, 또는 초과의, 상이한 생물학적 분자에서 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는) 것을 나타낸다. 본원에서 사용된 바와 같이 "이중특이적"은 항원 결합 단백질이 2개의 상이한 항원-결합 특이성을 갖는 것을 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "단일특이적"은 동일한 항원의 동일한 에피토프를 결합시키는 하나 이상의 결합 부위 각각을 갖는 항원 결합 단백질을 나타낸다.
용어 "가"는 항원 결합 단백질에서 결합 부위의 명시된 수의 존재를 나타낸다. 예를 들어, 용어 "2가" "3가", "4가", "5가" 및 "6가"는 항원 결합 단백질에서 2개의 결합 부위, 3개의 결합 부위, 4개의 결합 부위, 5개의 결합 부위, 및 6개의 결합 부위의 존재를 나타낸다.
"항체 이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 그들 생물학적 활성을 지칭하고, 항체 아이소타입으로 다양하다. 항체 이펙터 기능의 예는 하기를 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체 (예를 들면, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화. "보체 의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에서 표적 세포의 용해를 지칭한다. 고전적 보체 경로의 활성화는 보체 시스템의 제 1 성분 (C1q)의 그들의 동족 항원에 결합되는 (적당한 서브클래스의) 항체에 대한 결합에 의해 개시된다. "항체-의존적 세포-매개된 세포독성" 또는 ADCC는 특정한 세포독성 세포 (예를 들면, 자연 살해 (NK) 세포, 중성구 및 대식세포)에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)에 결합되어 있는 분비된 Ig가 이들 세포독성 이펙터 세포를 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합시키고 후속으로 표적 세포를 세포독소로 사멸시키는 세포독성의 한 형태를 지칭한다.
본원에서 용어 "Fc 영역" 또는 "단편 결정화가능 영역"은, 천연-서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하는, 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 본원에서 기재된 항체에서 사용하기 위한 적합한 천연-서열 Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2 (IgG2A, IgG2B), IgG3 및 IgG4를 포함한다.
"결합 친화성"은 일반적으로 분자 (예를 들면, 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너 (예를 들면, 항원) 사이의 비-공유 상호작용의 총계의 강도를 지칭한다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같이, "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화성을 지칭한다. 결합 친화성은 Kd, Koff, Kon, 또는 Ka로 표시될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 평형 해리 상수 "KD" 또는 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 지칭하고, 평형에서 항체 분자의 용액에 존재하는 모든 항체-결합 도메인의 이분의 일을 차지하는데 필요한 항원의 농도를 기재하고, M의 단위로 표현된다. KD의 측정은 모든 결합 제제가 용액내인 것을 전제한다. 해리 상수 (KD 또는 Kd)는 항원에 대한 항체의 친화성을 나타내는 지표로서 사용된다. 예를 들어, 쉬운 분석은 다양한 마커 제제들로 마킹된 항체를 이용하는 스캐차드(Scatchard) 방법에 의해, 뿐만 아니라 키트에 부착된 사용자의 매뉴얼 및 실험 작동 방법에 따른, 일반의약품, 측정 키트 이용에 의해 가능하다. 이들 방법을 사용하여 유래될 수 있는 KD 값은 M (Mols)의 단위로 표현된다.
펩티드, 폴리펩티드 또는 항체 서열에 대하여 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성" 및 "상동성"은, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해, 필요하면, 서열 정렬 및 갭 도입 후, 그리고 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환 고려 없이, 특이적 펩티드 또는 폴리펩티드 서열에서 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에서 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성의 결정 목적을 위한 정렬은 당업계에서 기술 내에 있는 다양한 방식으로, 예를 들어, 공공연하게 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 MEGALIGNTM (DNATAR) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당업계에서 숙련가는, 비교될 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬 측정을 위한 적당한 파라미터를 결정할 수 있다.
본 발명은 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌(Hemagglutinin)에 특이적으로 결합하는 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 예컨대, 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 sdAb, 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 중쇄-단독 항체(HCAb) (예를 들면, 인간 면역글로불린 G (IgG)의 결정성 단편(Fc 단편)에 상기 sdAb가 융합된 sdAb-Fc 융합 단백질), 또는 다른 sdAb, 전장 4-쇄 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (예를 들면, Fab 또는 scFv)에 상기 sdAb가 융합된 다중특이적 항원 결합 단백질, 그리고 이의 제조 및 용도에 관한 것이다.
이에, 본 발명은 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 sdAb를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명에서, 상기 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 sdAb를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 sdAb 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다.
본 발명에서, 상기 sdAb는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열에 적어도 80%(예컨대 적어도 임의의 80%, 58%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 서열 상동성을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 sdAb는 단량체성 또는 다량체성일 수 있다. 또한, 다량체성일 경우, 예를 들면, 본원에서 기재된 sdAb 및 이와 상이한 2개 이상의 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 sdAb를 포함하는, 다중특이적 및 다가 (예컨대 이중특이적 및 2가)일 수 있고, 또는 동일한 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌에 특이적으로 결합하는 sdAb의 2개 이상의 카피를 포함하는, 단일특이적 및 다가 (예를 들면, 2가)일 수 있다. 또한, sdAb 간 펩티드 링커를 통해 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 인접한 도메인이 서로에 대하여 자유롭게 움직이도록 가요성 잔기 (예컨대 글리신 및 세린)을 포함한다. 예를 들어, 글리신-세린 더블릿은 적합한 펩티드 링커일 수 있다. 또한, 펩티드 링커는 임의의 적합한 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 적어도 약 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100개 또는 더 많은 아미노산 길이이다.
본 발명에서, 상기 sdAb는 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌, 구체적으로 에 인플루엔자 A 바이러스 H1N1의 헤마글루티닌의 에프토프에 결합한다.
또한, 상기 sdAb와 헤마글루티닌 사이의 결합의 KD는 10-6 M 내지 10-13 M, 10-6 M 내지 10-12 M, 10-6 M 내지 10-11 M, 10-6 M 내지 10-10 M, 10-6 M 내지 10-9 M, 또는 10-6 M 내지 10-8 M일 수 있다.
또한, 상기 sdAb의 EC50은 FACS 분석에서 500 nM 미만일 수 있고, 구체적으로 0.1 nM 내지 500 nM, 0.1 nM 내지 400 nM, 0.1 nM 내지 300 nM, 0.1 nM 내지 200 nM, 0.1 nM 내지 100 nM, 0.1 내지 50 nM, 0.1 내지 10 nM, 1 nM 내지 500 nM, 1 nM 내지 400 nM, 1 nM 내지 300 nM, 1 nM 내지 200 nM, 1 nM 내지 100 nM, 1 내지 50 nM 또는 1 내지 10 nM일 수 있다.
본 발명에 따른 단일 도메인 항체(sdAb)는 중쇄-단독 항체로부터의 중쇄 가변 도메인 (예를 들면, 낙타과에서 VHH (중쇄 항체의 중쇄의 가변 도메인)), 종래의 4-쇄 항체로부터 유래된 경쇄, 단일 도메인 (예컨대 VH 또는 VL)이 자연적으로 결여된 결합 분자, 인간화된 중쇄 단독 항체, 인간 중쇄 분절을 발현시키는 유전자이식 마우스 또는 랫트에 의해 생산된 인간 단일 도메인 항체, 및 항체로부터 유래된 것들 이외 조작된 도메인 및 단일 도메인 스캐폴드를 비제한적으로 포함할 수 있다. sdAb는 마우스, 랫트, 인간, 낙타, 라마, 칠성장어, 어류, 상어, 염소, 토끼, 및 소과를 비제한적으로 포함하는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 또한 낙타과 이외 종으로부터의 자연 발생 sdAb 분자를 포함할 수 있다.
또한, sdAb는 경쇄가 결여된 중쇄 항체로서 공지된 자연 발생 단일 도메인 항원 결합 분자로부터 유래된다. 그와 같은 단일 도메인 분자는, 예를 들어 WO 94/04678 및 Hamers-Casterman, et al., (1993) Nature 363:446-448에서 개시된다. 경쇄가 자연적으로 결여된 중쇄 분자로부터 유래된 가변 도메인은 본원에서 VHH로서 공지되어 이것을 4개의 쇄 면역글로불린의 종래의 VH와 구별시킨다. 그와 같은 VHH 분자는 낙타과 종, 예를 들어, 낙타, 라마, 비쿠냐, 단봉 낙타, 알파카 및 과나코에서 생성된 항체로부터 유래될 수 있다. 낙타과 이외의 다른 종은 경쇄가 자연적으로 결여된 중쇄 분자를 생산할 수 있고, 그와 같은 VHH는 본원의 범위 내이다
또한, sdAb는 재조합, CDR-그라프팅, 인간화, 낙타화, 탈-면역화 및/또는 시험관내 생성될 수 있다 (예를 들면, 파아지 디스플레이에 의해 선택된다). 일부 구현예에서, 프레임워크 영역의 아미노산 서열은 프레임워크 영역에서 특이적 아미노산 잔기의 "낙타화"에 의해 변경될 수 있다. 낙타화는 중쇄 항체의 VHH 도메인에서 상응하는 위치(들)에 발생하는 아미노산 잔기의 하나 이상에 의해 종래의 4-쇄 항체로부터 (자연 발생) VH 도메인의 아미노산 서열에서 아미노산 잔기의 하나 이상의 대체 또는 치환을 지칭하며, 당업계에 공지된 방식으로 수행될 수 있다.
또한, sdAb는 인간 중쇄 분절을 발현시키는 유전자이식 마우스 또는 랫트에 의해 생산된 인간 sdAb일 수 있다. 예를 들면, 특허 US20090307787A1, US8,754,287, US20150289489A1, US20100122358A1, 및 WO 2004049794를 참고한다.
또한, 특정 항원 또는 표적에 대한 자연 발생 VHH 도메인은 낙타과 VHH 서열의 (미접촉 또는 면역) 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 그와 같은 방법은 상기 항원 또는 표적을 이용하는 그와 같은 라이브러리, 또는 그 자체로 공지된 하나 이상의 스크리닝 기술을 이용하는 이의 적어도 일부분, 단편, 항원성 결정요인 또는 에피토프 스크리닝을 관여시킬 수 있거나 아닐 수 있다. 그와 같은 라이브러리 및 기술은 예를 들어 특허 WO 99/37681, WO 01/90190, WO 03/025020 및 WO 03/035694에서 기재된다. 대안적으로, (미접촉 또는 면역) VHH 라이브러리로부터 유래된 개선된 합성 또는 반-합성 라이브러리, 예컨대 예를 들어 특허 WO 00/43507에서 기재된 바와 같이, 기술 예컨대 무작위 돌연변이유발 및/또는 CDR 셔플링에 의해 (미접촉 또는 면역) VHH 라이브러리로부터 수득된 VHH 라이브러리는 사용될 수 있다.
또한, sdAb는 종래의 4-쇄 항체로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, Ward et al., Nature 1989 Oct. 12; 341 (6242): 544-6, Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490; 특허 WO 06/030220; 및 WO 06/003388를 참고한다.
또한, 본 발명에 따른 sdAb는 키메라 항체일 수 있다. 특정한 키메라 항체는, 예를 들면, 특허 US4,816,567; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))에서 기재된다. 일부 구현예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들면, 낙타과 종, 예컨대 라마로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함할 수 있다. 또한, 키메라 항체는 인간화될 수 있다. 전형적으로, 비-인간 항체는 인간화되어 인간에 대한 면역원성을 감소시키는 반면, 친계 비-인간 항체의 특이성 및 친화성을 유지시킨다. 일반적으로, 인간화된 항체는 HVR, 예를 들면, CDR, (또는 이의 부분)이 비-인간 항체로부터 유래되고, FR (또는 이의 부분)이 인간 항체 서열로부터 유래되는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화된 항체는 임의로 또한 인간 불변 영역의 적어도 한 부분을 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 인간화된 항체에 있어서 일부 FR 잔기는, 예를 들면, 항체 특이성 또는 친화성을 회복 또는 개선하기 위해, 비-인간 항체 (예를 들면, HVR 잔기가 유래되는 항체)로부터 상응하는 잔기로 치환된다.
본 발명에서, 상기 sdAb를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 HCAb 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다.
구체적으로, HCAb는 본원에 기재된 sdAb가 하나 이상의 CH2 및/또는 CH3 도메인, 예를 들면 Fc 단편에 융합된 것이다.
상기 CH2 및/또는 CH3 도메인은 면역글로불린으로부터 유래된다. 상기 면역글로불린은 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM일 수 있고, 구체적으로 IgG 일 수 있다. 일부 구현예에서, HCAb는 IgG, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 Fc 단편을 포함할 수 있고, 상기 Fc 단편은 인간 Fc, 예컨대 인간 IgG1 (hIgG1) Fc, hIgG2 Fc, hIgG3 Fc 또는 hIgG4 Fc일 수 있다.
상기 HCAb는 단량체성 또는 다량체성일 수 있다. 또한, 다량체성일 경우, 예를 들면, 본원에서 기재된 sdAb 및 이와 상이한 2개 이상의 sdAb를 포함하는, 다중특이적 및 다가 (예컨대 이중특이적 및 2가)일 수 있고, 또는, 동일한 sdAb의 2개 이상의 카피를 포함하는, 단일특이적 및 다가 (예를 들면, 2가)일 수 있다.
본 발명에서, 상기 sdAb 및 CH2 및/또는 CH3 도메인, 구체적으로 Fc 단편은 펩티드 링커를 통해 융합될 수 있다. 상기 펩티드 링커의 길이, 가요성 정도 및/또는 다른 특성은, 하나 이상의 특정 항원 또는 에피토프에 대하여 비제한적으로 친화성, 특이성 또는 결합능을 포함하는, 특성에서 일부 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 더 긴 펩티드 링커는 2개의 인접한 도메인이 서로를 입체적으로 방해하지 않는다는 것을 보장하도록 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 인접한 도메인이 서로에 대하여 자유롭게 움직이도록 가요성 잔기 (예컨대 글리신 및 세린)을 포함한다. 예를 들어, 글리신-세린 더블릿은 적합한 펩티드 링커일 수 있다. 또한, 펩티드 링커는 임의의 적합한 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 적어도 약 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100개 또는 더 많은 아미노산 길이이다.
또한, 상기 펩티드 링커는 자연 발생 서열, 또는 비-자연 발생 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 중쇄-단독 항체의 힌지 영역으로부터 유래된 서열이 링커로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 특허 WO 1996/34103를 참고한다. 일부 구현예에서, 상기 펩티드 링커는 hIgG1 힌지, hIgG2 힌지, hIgG3 힌지, hIgG4 힌지 또는 이들의 변이체일 수 있다.
본 발명에서, 상기 sdAb를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다른 sdAb, 전장 4-쇄 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 sdAb가 융합된 다중특이적 항원 결합 단백질(MABP) (예를 들어, (이하, BABP로 지칭되는) sdAb가 융합된 이중특이적 항원 결합 단백질(BABP)) 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다.
상기 BABP는 (a) 본원에 기재된 sdAb를 포함하는 제 1 항원 결합 부분; 및 (b) 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 2 항원 결합 부분을 포함한다.
상기 제 2 에피토프는 헤마글루티닌 이외 항원, 또는 헤마글루티닌에서의 제 2 에피토프일 수 있다.
상기 제 2 항원 결합 부분은 전장 항체, Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 단일쇄 Fv(scFv), scFv-scFv, 미니바디, 디아바디 또는 제 2 sdAb일 수 있다. 또한, 제 2 항원 결합 부분은 VH를 포함하는 중쇄 및 VL을 포함하는 경쇄를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제 1 항원 결합 부분은 중쇄의 N-말단, 경쇄의 N-말단, Fc 영역의 N-말단, 중쇄의 C-말단, 또는 경쇄의 C-말단에서 제2 항원 결합 부분에 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 제 2 항원 결합 부분은 Fab 또는 scFv를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제 1 항원 결합 부분은 Fab 또는 scFv의 C-말단에서 제 2 항원 결합 부분에 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 제 2 항원 결합 부분은 전장 4-쇄 항체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제 1 항원 결합 부분은 펩티드 링커를 통해 제 2 항원 결합 부분에 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 제 2 항원 결합 부분은 Fc 영역, 예컨대 IgG1 Fc, IgG2 Fc, IgG3 Fc 또는 IgG4 Fc을 포함할 수 있다.
상기 MABP는 적어도 2개의 상이한 에피토프를 특이적으로 결합시키는 적어도 2개의 항원 결합 부분을 포함한다. 적어도 2개의 항원 결합 부분 중 일부는, MABP가 2개의 상이한 에피토프용 결합 부위를 갖는 한, 동일할 수 있다. 또한, MABP는 본원에서 기재된 sdAb를 각각 포함하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 또는 초과의 상이한 항원 결합 부분 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
또한, MABP는 헤마글루티닌의 제1 에피토프 및/또는 제2 에피토프에 대하여 가수의 임의의 적합한 수, 및 특이성의 임의의 적합한 수를 가질 수 있다.
본 발명에서, 상기 sdAb를 포함한 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 변이체를 포함한다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 인코딩하는 핵산 서열에의 적당한 변형 도입에 의해, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 그와 같은 변형은, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내에서 잔기의 결실, 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합은 최종 작제물에 이르도록 만들어질 수 있고, 단 최종 작제물은 원하는 특징, 예를 들면, 항원-결합을 보유한다. 일부 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 그와 같은 변경이 항원을 결합시키는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한 하나 이상의 초가변 영역(HVR) 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화성을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경은 HVR에서 실시될 수 있다. 그와 같은 변경은 HVR "핫스팟" 또는 CDR의 외부일 수 있다.
본 발명에서, 상기 sdAb를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 진단 모이어티 또는 생체적합성 조절제와 연결되거나, 그에 융합되거나, 그에 접합되거나 (예를 들어, 공유 또는 비-공유), 또는 달리 그와 회합될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들어, 생물독소, 바이오마커, 정제 태그 등), 단백질, 중합체, 핵산 분자, 소분자, 모방제, 합성 약물, 무기 분자, 유기 분자 또는 방사성동위원소가 접합 또는 회합될 수 있다.
또한, 상기 sdAb를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 생물학적 분자(예를 들어, 펩티드 또는 뉴클레오티드), 소분자, 형광단, 또는 방사성동위원소일 수 있는 진단제 또는 검출가능한 작용제, 마커 또는 리포터에 접합 또는 회합될 수 있다.
또한, 본 발명은 본원에 개시된 sdAb를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 항체가 발현되도록 하는 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 발현된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명에서, 본원에 개시된 sdAb를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어, 항체 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리되고 서열분석될 수 있다. 단리되고 서브클로닝된 하이브리도마 세포 (또는 파지 또는 효모 유래 콜로니)는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서의 역할을 할 수 있다. 보다 특히, 단리된 DNA (변형될 수 있음)는 항체의 제조를 위해 불변 및 가변 영역 서열을 클로닝하는데 사용될 수 있다.
하나의 예시적인 방법은 선택된 세포로부터의 RNA의 추출, cDNA로의 전환, 및 항체 특이적 프라이머를 사용한 PCR에 의한 증폭을 수반한다. 적합한 프라이머는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 본원에 예시된 바와 같이 많은 상업적 공급원으로부터 용이하게 이용가능하다. 조합 라이브러리의 스크리닝에 의해 단리된 재조합 인간 또는 비-인간 항체를 발현시키기 위해, 항체를 코딩하는 DNA를 재조합 발현 벡터 내로 클로닝하고, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모, 및 박테리아를 포함한 숙주 세포 내에 도입된다. 일부 구현예에서, 달리 목적하는 구축물을 생산하지 않는 원숭이 COS 세포, NS0 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 골수종 세포 내로 조정자가 도입되어 그에 의해 발현된다.
본 발명에서, 상기 핵산 분자는 벡터 내에, 적절한 경우에 핵산의 발현을 제어하는 프로모터와 함께 존재한다. 상기 벡터는 그의 가장 일반적인 의미로 사용되고, 핵산이 예를 들어 원핵 및/또는 진핵 세포 내로 도입되고 적절한 경우에 게놈 내로 통합될 수 있게 하는, 핵산을 위한 임의의 중간 비히클을 포함한다. 이러한 종류의 벡터는 바람직하게는 세포 내에서 복제되고/거나 발현된다. 벡터는 플라스미드, 파지미드, 박테리오파지 또는 바이러스 게놈을 포함할 수 있다. 상기 플라스미드는 일반적으로 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있는 염색체외 유전 물질 구축물, 통상적으로 원형 DNA 듀플렉스에 관한 것이다.
관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법을 사용하여 항체 코딩 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 포함하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이들 방법은, 예를 들어, 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다.
본 발명에서, 상기 숙주 세포 또는 재조합 숙주 세포는 발현 벡터가 도입된 세포를 의미한다. 재조합 숙주 세포 및 숙주 세포는 특정한 대상 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손도 의미한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후속 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 사실상 모세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본원에 사용된 용어 숙주 세포의 범주 내에 포함된다. 이러한 세포는 상기 기재된 바와 같은 벡터를 포함할 수 있다.
또한, 관련 기술분야에서 인식되는 분자 생물학 기술 및 현재의 단백질 발현 방법론을 사용하여, 본원에 개시된 항체의 실질적인 양이 생산될 수 있다. 보다 구체적으로, 이러한 항체를 코딩하는 핵산 분자는 다양한 유형의 숙주 세포를 포함한 널리 공지되고 상업적으로 입수가능한 단백질 생산 시스템 내로 통합되어, 전임상, 임상, 또는 상업적인 양의 목적하는 제약 제품을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체를 코딩하는 핵산 분자는 선택된 숙주 세포 내로의 효율적인 통합 및 후속적인 항체의 높은 발현 수준을 제공하는 벡터 또는 발현 벡터 내로 조작된다.
바람직하게는 본원에 개시된 항체를 코딩하는 핵산 분자 및 이들 핵산 분자를 포함하는 벡터는 적합한 포유동물, 식물, 박테리아 또는 효모 숙주 세포의 형질감염에 사용될 수 있지만, 원핵 시스템이 또한 사용될 수 있다. 형질감염은 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 임의의 공지된 방법에 의해 이루어질 수 있다. 이종 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포 내로 도입하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 덱스트란-매개 형질감염, 인산칼슘 침전, 폴리브렌-매개 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 리포솜 내 폴리뉴클레오티드(들)의 캡슐화, 및 DNA의 핵 내로의 직접 미세주사를 포함한다. 또한, 핵산 분자를 바이러스 벡터에 의해 포유동물 세포 내로 도입할 수 있다. 포유동물 세포를 형질전환하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 식물 세포를 형질전환하는 방법이 또한 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 아그로박테리움-매개 형질전환, 바이오리스틱 형질전환, 직접 주사, 전기천공, 및 바이러스 형질전환을 포함한다. 박테리아 및 효모 세포를 형질전환하는 방법이 또한 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
많은 상업적으로 입수가능한 다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 본원에 개시된 항체를 발현시키는데 사용될 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 관심 코딩 서열이 발현되고 후속해서 정제될 수 있는 비히클을 나타낼 뿐만 아니라, 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질전환되거나 형질감염된 경우에 본 발명의 분자를 계내 발현할 수 있는 세포를 나타낸다. 이러한 시스템은 조정자 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 미생물, 예컨대 박테리아 (예를 들어, 이. 콜라이(E. coli), 비. 서브틸리스(B. subtilis), 스트렙토미세스(streptomyces)); 조정자 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질감염된 효모 (예를 들어, 사카로미세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia)); 조정자 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나 또는 조정자 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터 (예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질감염된 식물 세포 시스템 (예를 들어, 니코티아나(Nicotiana), 아라비돕시스(Arabidopsis), 좀개구리밥, 옥수수, 밀, 감자 등); 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래되거나 (예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터) 프로모터를 함유하는 재조합 발현 구축물을 보유하는 포유동물 세포 시스템 (예를 들어, COS, CHO, BHK, 293, 3T3 세포)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 개시된 항체가 재조합 발현 또는 본원에 개시된 다른 기술 중 어느 하나에 의해 생산되었으면, 이는 면역글로불린의 정제에 대해 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 또는 보다 일반적으로 단백질의 정제에 대한 임의의 다른 표준 기술에 의해 정제될 수 있다.
또한, 본 발명은 본원에 개시된 sdAb를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 유효성분으로 함유하는, 인플루엔자 A 바이러스 감염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효량의 본원에 개시된 sdAb를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 A 바이러스 감염 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 인플루엔자 A 바이러스 감염 예방 또는 치료에 사용하기 위한 본원에 개시된 sdAb를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 용도를 제공한다.
본 발명에서, 상기 sdAb를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대한 내용은 전술한 바와 동일하므로, 구체적인 설명은 상기 내용을 원용하고, 이하에서는 약학적 조성물 및 용도의 특유한 구성에 대해서만 설명하도록 한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 본원에 기재된 항체의 형태, 의도된 전달 방식, 및 수많은 다른 변수에 따라, 관련 기술분야에서 인식되는 기술을 사용하여 목적하는 바와 같이 제제화될 수 있다. 또한, 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 투여를 용이하게 하거나 또는 전달을 위해 제약상 최적화된 제제로 활성 화합물을 가공하는 것을 보조하는 비교적 불활성 물질인 부형제 및 보조제를 포함하는 적합한 제약상 허용되는 담체를 함유하도록 제제화될 수 있다. 예를 들어, 비히클, 보조제, 및 희석제를 포함한 다양한 제약상 허용되는 담체는 수많은 상업적 공급원으로부터 용이하게 입수가능하다. 또한, 제약상 허용되는 보조 물질 분류, 예컨대 pH 조정제 및 완충제, 장성 조정제, 안정화제, 습윤제 등이 또한 입수가능하다. 특정의 비제한적 예시적인 담체는 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 및 그의 조합을 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 경장, 비경구 또는 국소 투여를 위해 제제화될 수 있다. 비경구 및 비-비경구 약물 전달을 위한 부형제 뿐만 아니라 제제가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 비경구 투여에 적합한 제제는 수용성 형태의 활성 화합물, 예를 들어, 수용성 염의 수용액을 포함한다. 또한, 유성 주사 현탁액에 적절한 활성 화합물의 현탁액이 투여될 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예를 들어, 참깨 오일, 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들어, 에틸 올레에이트 또는 트리글리세리드를 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있고, 예를 들어, 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨, 및/또는 덱스트란을 포함한다. 임의로, 현탁액은 또한 안정화제를 함유할 수 있다. 또한 리포솜을 사용하여 세포로의 전달을 위해 작용제를 캡슐화할 수 있다.
경장 투여에 적합한 제제는 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐, 환제, 코팅된 정제를 비롯한 정제, 엘릭시르, 현탁액, 시럽 또는 흡입제 및 그의 제어 방출 형태를 포함한다.
일반적으로, 본원에 개시된 항체는 이를 필요로 하는 대상체에게 경구, 정맥내, 동맥내, 피하, 비경구, 비강내, 근육내, 심장내, 뇌실내, 기관내, 협측, 직장, 복강내, 피내, 국소, 경피, 및 척추강내, 또는 달리 이식 또는 흡입에 의한 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 경로에 의해 생체내 투여될 수 있다. 투여의 적절한 제제 및 경로는 의도된 용도 및 치료 요법에 따라 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 인플루엔자 A 바이러스 감염의 치료 또는 예방을 위한 약학적으로 유효량으로 투여된다. 상기 약학적으로 유효량은 의사 또는 다른 임상의에 의해 추구되는, 대상체에서 생물학적 또는 의학적 반응을 도출할 항체 또는 이를 포함하는 약학적 조성물의 양을 의미한다. 또한, 예방 및/또는 치료 효과를 갖는 요법의 양을 달성하기 위해 특정 빈도로 다중 용량의 항체 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 투여할 수 있다.
상기 약학적으로 유효량은 전형적으로 치료될 대상체의 체중, 그의 신체 상태, 치료될 상태의 광범위함, 및 치료될 대상체의 연령에 따라 좌우된다. 일반적으로, 본원에 개시된 항체는 용량당 약 10 ng/kg 체중 내지 약 100 mg/kg 체중 범위, 약 50 μg/kg 체중 내지 약 5 mg/kg 체중 범위, 약 100 μg/kg 체중 내지 약 10 mg/kg 체중 범위, 약 100 μg/kg 체중 내지 약 20 mg/kg 체중 범위, 0.5 mg/kg 체중 내지 약 20 mg/kg 체중 범위의 양으로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 항체는 적어도 약 100 μg/kg 체중, 적어도 약 250 μg/kg 체중, 적어도 약 750 μg/kg 체중, 적어도 약 3 mg/kg 체중, 적어도 약 5 mg/kg 체중, 또는 적어도 약 10 mg/kg 체중의 용량으로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약 100 mg 내지 약 10,000 mg의 용량, 약 200 mg 내지 약 9,000 mg의 용량, 약 300 mg 내지 약 8,000 mg 용량, 약 400 mg 내지 7,000 mg 용량, 500 mg 내지 5,000 mg 용량으로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 통상적으로 환자에게 다수회 투여된다. 예시적인 치료 요법은 2주마다 1회, 1개월 1회, 또는 3 내지 6개월마다 1회 투여를 수반한다. 예를 들어, 환자는 사이클로서 4주마다, 예를 들어 28일마다 1회 항체를 (예를 들어, 정맥내 제제로서) 제공받을 수 있다. 투여 빈도는 환자에서의 항체의 약동학적 프로파일에 따라 조정될 수 있다. 예를 들어, 항체의 반감기는 2주 투여 빈도를 필요로 할 수 있다. 일부 방법에서, 상이한 결합 특이성을 갖는 2종 이상의 항체가 동시에 투여될 수 있고, 이러한 경우에 투여되는 각각의 항체의 투여량은 제시된 범위 내에 속한다.
투여량 및 빈도는 환자에서의 항체의 반감기에 따라 달라진다. 일반적으로, 인간 항체가 가장 긴 반감기를 나타내고, 그 다음으로 인간화 항체, 키메라 항체, 및 비인간 항체이다. 투여량 및 투여 빈도는 치료가 예방적인지 또는 치료적인지에 따라 달라질 수 있다.
치료 요법의 지속기간은 치료될 질환, 환자의 연령 및 상태, 환자의 질환의 병기 및 유형, 환자가 치료에 어떻게 반응하는지 등에 좌우된다. 임상의는 요법의 효과를 면밀하게 관찰하고 필요에 따라 임의의 조정을 행할 수 있다.
또한, 본 발명은 본원에 개시된 sdAb를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 유효성분으로 함유하는, 인플루엔자 A 바이러스 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인플루엔자 A 바이러스, 구체적으로 인플루엔자 A 바이러스 H1N1과 결합을 형성하였는지 여부를 용이하게 확인, 검출 및 정량하기 위하여, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표지된 상태로 제공될 수 있다. 즉 검출가능한 표지에 링크(예: 공유 결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기 링크는 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 검출가능한 표지 사이에 직접 형성되는 것도 가능하지만, 링크를 통해서도 형성 가능하다. 상기 링커는 당업계에 공지된 어떠한 것도 사용 가능하며, 적합한 펩타이드 링커의 서열은 다음과 같은 요소를 고려하여 선택될 수 있다: (a) 유연한 연장된 컨포메이션에 적용될 수 있는 능력; (b) 에피토프와 상호작용하는 이차구조를 생성하지 않는 능력; 및 (c) 에피토프와 반응할 수 있는 소수성 잔기 또는 전하를 갖는 잔기의 부재.
또한, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 발색효소, 방사성 동위원소, 크로모포어(chromopore), 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나로 표지될 수 있다.
상기 표지는 구체적으로 예를 들면, 발색효소에 해당하는 퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)); 방사성 동위원소에 해당하는 124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P,35S; 크로모포어(chromophore); 발광물질 또는 형광물질에 해당하는 FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots)일 수 있고, 이에 제한되지 않는다.
유사하게, 상기 검출 가능한 표지는 항체 에피토프(epitope), 기질(substrate), 보조인자(cofactor), 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다. 이러한 표지는 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 합성하는 과정 중에 수행할 수도 있고, 이미 합성된 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 추가로 수행될 수도 있다.
상기 검출 가능한 표지를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 각각의 표지에 대하여 종래 공지된 검출 방법을 이용하여 검출하는 것이 가능하다. 구체적으로 예를 들어 형광 신호 FITC를 표지로 이용하는 경우, 형광광도계(Fluorometer)를 이용하여 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 연결되어진 FITC의 최대 파장(Excitation: 495 nm, Emission: 520 nm)에서 각 항체 또는 이의 항원-결합 단편 농도에 대한 형광세기를 측정하는 방법을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 본원에 개시된 sdAb를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에는 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 안정성을 유지하기 위해, 분말 상태 또는 적절한 완충액에 용해된 상태 또는 4℃유지된 상태로 제공될 수 있다.
인플루엔자 A 바이러스 검출을 용이하게 하기 위하여, 본 발명의 검출 키트에 포함되는 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상술한 바와 같이 표지된 상태로 제공될 수 있다. 한편, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 표지되지 않은 채로 제공되는 경우에는, 시험관 내 또는 검출 대상에 포함된 인플루엔자 A 바이러스와의 결합여부 또는 그 위치를 탐색하기 위한 성분을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 검출 방법을 제공한다:
(a) 본원에 개시된 sdAb를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 검출 대상 시료를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 검출 대상 시료에 포함된 인플루엔자 A 바이러스의 결합 여부를 확인하는 단계.
본 발명의 "검출 대상 시료"는 인플루엔자 A 바이러스가 존재할 가능성이 있으며, 그 존재 여부를 확인할 필요가 있는 대상 시료를 의미한다. 구체적으로 예를 들면, 혈액, 소변, 눈물, 땀, 타액, 림프 및 뇌척수액 등 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 단계(b)에서의 결합 여부 확인은 본 발명의 다른 양태인 인플루엔자 A 바이러스 검출용 조성물에 관하여 상술한 내용을 참조할 수 있고, 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다.
아울러, 본 발명은 본원에 개시된 sdAb를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 유효성분으로 포함하는 독감 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 독감은 인플루엔자 A 바이러스, 구체적으로 인플루엔자 A 바이러스 H1N1 감염에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 상기 진단용 조성물에는 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 외에 인플루엔자 A 바이러스 검출에 사용될 수 있는 기타 부성분들이 포함될 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바가 동일하게 적용될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 알파카 면역 및 인플루엔자 A 바이러스(Influenza A virus) 헤마글루티닌(Hemagglutinin)에 대한 항체 형성 확인
<1-1> 알파카 면역
인플루엔자 A 바이러스(Influenza A virus) 불활화를 위하여, 인플루엔자 A 바이러스(H1N1 A/California/04/2009 (CA/04), H1N1 A/Puerto Rico/8/1934(PR/8))를 유정란에 주입하여 3일간 배양하고, 원심분리 및 정제 과정을 거쳐 배양한 바이러스를 수득하였다. 36.5% 포름알데히드 용액(Formaldehyde solution)을 바이러스 양의 0.2%로 혼합하여 수득한 바이러스를 불활화하였다. 불활화하여 제작한 항원은 각 바이러스에 감수성이 높은 MDCK 세포에 분주하여 배양하고, CPE를 확인하는 방법으로 감염 여부를 판단하였으며 모두 음성임을 확인하였다.
그 다음, 도 1의 모식도와 같이 불활화한 바이러스는 IMS1313 면역보조제와 혼합하여 1마리의 수컷 알파카에 2회에 걸쳐 근육주사를 통해 각각 면역하였다.
<1-2> ELISA를 이용한 면역 반응 분석
면역 전, 1차 면역 후 및 2차 면역 후, 알파카로부터 10 ml 채혈하여 ELISA를 통해 면역 반응을 분석하였다.
구체적으로, 5 ug/ml의 인플루엔자 A 헤마글루티닌(Hemagglutinin, HA)-His 항원(이하, '인플루엔자 A-HA-His 항원'이라 함)을 마이크로플레이트에 분주하여 4℃에서 밤새 코팅하였다. 마이크로플레이트는 PBST로 3회 세척 후, 5% 스킴 밀크(skim milk)를 처리하여 상온에서 2시간 동안 블로킹(blocking)하였다. 이후 PBST로 3회 세척 후, 면역 전(0일), 1차 면역 후(12일), 2차 면역 후(18일)에 확보한 혈청 시료를 단계별 희석 농도로 처리하였다. 이후 PBST로 5회 세척 후, goat anti-Llama IgG HRP 항체를 이용하여 인플루엔자 A-HA-His 항원에 결합된 항체를 검출하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 시험 결과 1차 면역 후(12일) 및 2차 면역 후(18일) 채혈한 혈청 시료에서 인플루엔자 A-HA-His 항원(pan H1N1-HA)에 대한 항체 생성을 확인하였다.
<실시예 2> 단일 도메인 항체 라이브러리 제작 및 평가
인플루엔자 A-HA-His 항원에 결합하는 단일 도메인 항체를 코딩하는 유전자 증폭을 위해 혈액으로부터 피콜(Ficoll)을 이용하여 말초혈액단핵세포(PBMC)를 분리하였다. 분리한 PBMC에서 추출한 총 RNA로부터 특이 프라이머(specific primer)를 이용하여 단일 도메인 항체를 코딩하는 유전자 단편을 증폭하고, pComb3x vector에 클로닝하였다.
그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이, 제작된 면역 라이브러리의 크기는 8.06×107이고, 삽입율(Insert) 및 다양성(Diversity)은 100%로임을 확인하였다.
| total library size(cfu) | Insert | Diversity | |
| pComb3x-Influenza A library | 8.06×107 | 16/16(100%) | 16/16(100%) |
<실시예 3> 단일 도메인 항체 라이브러리 증폭
상기 <실시예 2>에서 제작한 면역 라이브러리를 XL1-blue 균주에 형질전환(transformation)하였다. 형질전환한 XL1-blue 균주는 2% 글루코스, 100 ug/ml 암피실린을 함유한 10 ml의 2XYT 배지에 첨가하여 37℃ 진탕교반기에서 배양하였다. OD600에서 흡광도가 0.5가 될 때까지 배양하고 M13K07 phage(Invitrogen)를 1×1011 pfu/ml가 되도록 첨가하였다. 이후 37℃에서 30분간 정치배양 후 37℃ 진탕교반기에서 200 rpm으로 30분 추가 배양하였다. 배양액은 상온, 4000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 이후 100 ug/ml 암피실린, 50 ug/ml 카나마이신을 함유한 2XYT배지 10 ml를 첨가하여 배양액의 펠렛을 재부유하고 30℃ 진탕배양기에서 250 rpm으로 하룻밤 동안 배양하였다. 이후 4℃, 4000 rpm에서 30분간 원심분리하였다. 상등액은 PEG 침전법을 이용하여 침전하고, 4℃, 12,000 rpm에서 30분간 원심분리하였다. 펠렛은 PBS로 재부유하고, 4℃, 13,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 새로운 튜브에 옮겨 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.
<실시예 4> 바이오패닝(bio-panning)
면역 항원에 특이적인 단일 도메인 항체를 선별하기 위해 마이크로플레이트에 5 ug/ml의 인플루엔자 A-HA-His 항원을 분주하여 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 단일 도메인 항체를 선별하기 위한 실험에 사용될 라이브러리(상기 <실시예 3>의 라이브러리)는 96-웰 마이크로플레이트에 분주하여 상온에서 30분간 반응하였다. 이후 새로운 웰에 라이브러리를 옮기고 상온에서 30분간 반응하는 작업을 4회 반복하여 라이브러리의 비특이적 결합율을 감소시켰다. 라이브러리는 1.7 ml 튜브에 옮기고 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.
인플루엔자 A-HA-His 항원이 코팅된 마이크로 플레이트는 PBST로 5회 세척한뒤 5% 스킴 밀크를 첨가하여 상온에서 2시간동안 블로킹하였다. 이후 PBST로 5회 세척 후 비특이적 결합률이 감소된 라이브러리를 바인딩 용액(2.5% 스킴 밀크, 5% 트리톤 x-100(triton x-100))과 함께 5×1012 virions/well로 분주하여 상온에서 30분간 반응하였다. 이후 세척 용액(5% 트리톤 x-100)으로 10회 세척 후 PBST로 3회 추가 세척하였다. 인플루엔자 A-HA-His 항원에 특이적으로 결합된 단일 도메인 항체에 대한 파아지는 20 ug/ml 인플루엔자 A-HA-His 항원을 첨가한 뒤 상온, 500 rpm으로 30분간 반응하여 선택적으로 용출시켰다. 용출된 파아지는 대수증식기의 XL-1 blue 세포에 감염시킨 뒤, 2XYT 한천 배지에 도말하였다. 두번째 선별을 위한 패닝을 위해 위와 동일한 조건 하에서 반복하였다. 한천배지에 생성된 단일 파아지 클론은 각각 증폭하여 ELISA를 이용하여 스크리닝하였다.
그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, 1 단계 바이오패닝을 통해 확보한 선별된 파아지는 2단계 바이오패닝을 거치면서 3.24배 증폭되는 것을 확인하였다.
| Input phage (cfu/ml) |
Positive phage (cfu/ml) |
Negative phage (cfu/ml) |
Ratio (Positive/ Negative) |
Ratio (Output/ Input) |
Enrichment Ratio |
|
| 1 round | 6.80E+11 | 1.95E+07 | 8.60E+06 | 2.27 | 2.87E-05 | 1.00 |
| 2 round | 3.20E+11 | 2.97E+07 | 1.16E+06 | 25.61 | 9.28E-05 | 3.24 |
<실시예 5> 폴리 파아지 ELISA(Poly phage ELISA)
상기 <실시예 4>의 바이오패닝을 통해 증폭된 각 단계별 폴리 파아지(poly phage)와 인플루엔자 A-HA-His 항원의 결합을 확인하기 위해 마이크로플레이트에 1 ug/ml의 농도로 인플루엔자 A-HA-His 항원을 분주하여 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 이후 PBST로 3회 세척하고, 5% 스킴 밀크를 첨가하여 상온에서 2시간 동안 블로킹하였다. 이후 PBST로 3회 세척하고, 각 단계별 폴리 파아지 1×1013 virions/ml를 처리하여 상온에서 1시간 동안 반응하였다. 상기 플레이트는 PBST로 3회 세척하고 Anti-M13 g8p antibody HRP(1:5000, antibody design laboratories)를 처리하고 상온에서 1시간 동안 반응하였다. 이후 PBST로 3회 세척 후 TMB substrate(Biolegend)를 첨가하고 상온에서 10분 동안 반응 후 450 nm에서 검출하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 바이오패닝을 통해 선별된 2, 3 단계 폴리 파아지가 바이오 패닝 전 단계인 1 단계 폴리 파아지보다 인플루엔자 A-HA-His 항원에 대한 선택적인 결합이 증가함을 확인하였다.
<실시예 6> 단일 파아지 ELISA(Mono phage ELISA)
상기 <실시예 4>의 바이오패닝을 통해 선별된 단일 파아지(mono phage)와 인플루엔자 A-HA-His 항원의 결합을 확인하기 위해 마이크로플레이트에 1 ug/ml의 농도로 인플루엔자 A-HA-His 항원을 분주하여 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 이후 PBST로 3회 세척하고, 5% 스킴 밀크를 첨가하여 상온에서 2시간 동안 블로킹하였다. 이후 PBST로 3회 세척하고 단일 파아지 1×1013 virions/ml를 처리하여 상온에서 1시간 동안 반응하였다. 상기 플레이트는 PBST로 3회 세척하고 Anti-M13 g8p antibody HRP(1:5000, antibody design laboratories)를 처리하고 상온에서 1시간 동안 반응하였다. 이후 PBST로 3회 세척 후 TMB substrate (Biolegend)를 첨가하고 상온에서 10분 동안 반응 후 450 nm에서 검출하였다.
그 결과, 도 4에서 나타낸 바와 같이, 선별한 10개의 후보 단일 파아지가 인플루엔자 A-HA-His 항원에 선택적으로 결합하는 것을 확인하였다.
<실시예 7> 단일 도메인 항체의 발현 및 정제
상기 <실시예 6>의 선별된 10개의 후보 단일 파아지를 이용하여 염기서열 분석을 진행한 후, 1종의 단일 파아지를 최종 선별하였다. 최종 선별된 1종의 단일 파아지의 염기서열은 하기 [표 3]에 나타내었다. 또한, 최종 선별된 1종의 단일 파아지 클론을 이용하여 TGEX-Fc 발현 벡터에 클로닝하였다.
| 단일 도메인 항체 | 서열(5'→3') | 서열번호 |
| 염기 서열 |
ATGGCCCAGTTGCAGCTCGGGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTGGATTATTATGGCATAGGCTGGTTCCGCCAGGCCCCAGGGAAGGAGCGTGAGGGGGTCTCATGTATTAGTAGTTTCGGTGGTAGCACACACTATGCAGACTCCATGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACACCGCCAAGAATACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACAGCCGTTTATTACTGTGCAGCAGCGGAGGTAGTAGCTGGCTGCTTGACGGAATCCGAGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA | 1 |
| 아미노산 서열 |
MAQLQLGESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYYGIGWFRQAPGKEREGVSCISSFGGSTHYADSMKGRFTISRDTAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAAEVVAGCLTESEYDYWGQGTQVTVSS | 2 |
단일 도메인 항체의 발현을 위해 생존률 95~99%의 Expi-CHO 세포를 계수하여 7×106 세포수로 25 ml의 Expi-CHO 발현 배지(Gibco)에 첨가하고, 8% CO2가 유지되는 37℃ 진탕배양기에서 125 rpm으로 하룻밤 동안 배양하였다. 이후 80 ul의 ExpiFectamine™ CHO Reagent(Gibco, 100033021)와 920 ul의 OptiPRO™ medium 혼합액에 20 ug의 플라스미드 DNA와 1 ml의 OptiPRO™ medium 혼합액을 첨가하여 상온에서 5분간 반응한 뒤 배양된 세포에 첨가하였다. 세포는 8% CO2가 유지되는 진탕배양기에서 125 rpm으로 20시간 배양하였다. 이후 150 ul의 ExpiFectamine CHO enhancer와 6 ml의 ExpiCHO Feed를 넣고 5% CO2가 유지되는 32℃ 진탕배양기에서 125 rpm으로 5일간 배양하였다.
배양된 세포는 4℃에서 4000 rpm으로 30분간 원심분리하고, 상등액을 0.2 um 실린지 필터를 이용하여 여과하였다. 이후 HiTrap protein G HP 컬럼(column)에 상등액을 로딩하고, PBS로 세척 한 뒤 IgG 용출 버퍼(elution buffer, Thermo)를 이용하여 단일 도메인 항체를 컬럼으로부터 분리하였다. 용리된 시료는 1M Tris-HCl (pH 9.0)을 첨가하여 중화한 뒤 사용하기 전까지 4℃ 에서 보관하였다.
<실시예 8> 단일 도메인 항체와 면역 항원의 친화도 평가
상기 <실시예 7>의 단일 도메인 항체와 인플루엔자 A-HA-His 항원의 친화도 상수(KD)를 Octet RED 96e(ForteBio) 장비를 이용하여 측정하였다.
구체적으로, 항-인간 Fc가 코팅된 바이오센서팁(Fortebio)을 5 ug/ml의 단일 도메인 항체가 분주된 96-웰 마이크로플레이트(Greiner)에서 1.5 nm 수준으로 포화하였다. 인플루엔자 A-HA-His 항원은 1.56 ~ 25 nM로 1X 키네틱 버퍼(kinetic buffer, ForteBio)응 이용하여 2배수로 단계별 희석하고, 30℃, 1000 rpm으로 교반하면서 반응하였다. 시료의 결합과 해리 반응은 각각 200, 400초 동안 분석하였다. 결과 데이터는 1:1 상호작용 모델(Global fitting) 방법을 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 단일 도메인 항체는 인플루엔자 A-HA-His 항원에 대하여 1 pM 이하의 항원 친화도 상수(KD)를 나타냄을 확인하였다.
<실시예 9> 단일 도메인 항체의 i
n vitro
중화능 평가
상기 <실시예 7>의 단일 도메인 항체의 in vitro 중화능 평가를 수행하였다.
구체적으로, 혈청 중화 시험(Serum neutralization test)을 위해 인플루엔자 A 바이러스 감수성이 높은 MDCK 세포를 마이크로플레이트에 3x104 cells/well로 분주하여 하룻밤 동안 배양하였다. 이후 단계별로 희석한 단일 도메인 항체 각각과 인플루엔자 A 바이러스(H1N1 A California04/2009(CA/04), H1N1 A/Puerto Rico, NY, USA) 200 TCID50를 혼합하고 37℃에서 1시간 동안 반응하였다. 혼합액을 MDCK 세포에 처리하여 72시간 동안 관찰하면서 CPE를 확인하여 중화능을 분석하였다.
또한, 헤마글루티닌 억제 시험(Hemagglutinin inhibition test)을 위해 단일 도메인 항체를 단계별로 희석하여 96-웰 마이크로플레이트에 분주(25 μl)하고 4 HA unit의 바이러스(25 μl)와 혼합한 후 상온에서 40분 인큐베이션하고, 1%의 cRBC(chicken Red Blood)를 각 well에 분주(50 μl)하였다.
그 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이, 단일 도메인 항체가 인플루엔자 A 바이러스에 대해 우수한 중화능을 나타냄을 확인하였다.
| 인플루엔자 A 바이러스 | Hemaglutinin inhibition titer | Serum neutralization test |
| A/California/04/2009 | 215 | 23 |
| A/Puerto Rico/8/1934 | 22 | N.D. |
<실시예 10> 단일 도메인 항체의
in vitro
안전성 평가
상기 <실시예 7>의 단일 도메인 항체의 in vitro 안전성 평가를 수행하였다.
구체적으로, Quanti-MaxTM WST-8 cell viability assay kit(BIOMAX, South Korea)를 이용하여 단일 도메인 항체의 안전성 평가를 진행하였다. MDCK 세포를 5×103 cells/well로 96-웰 세포배양 플레이트에 분주하고 37℃, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 인큐베이션한 후, PBS 상에서 단계별로 희석한 단일 도메인 항체를 10 μl씩 세포에 투입하였다. 37℃의 5% CO2 조건에서 48시간 동안 인큐베이션한 후 상기 키트를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 0.8 mg/ml 이하의 단일 도메인 항체 농도에 대하여 세포 독성이 없음을 확인하였다.
<실시예 11> 단일 도메인 항체의
in vivo
안전성 및 효능 평가
상기 <실시예 7>의 단일 도메인 항체의 in vivo 안전성 및 효능 평가를 수행하였다.
구체적으로, 도 7의 모식도와 같이 18 내지 20 g의 9주령 Balb/c 마우스에 인플루엔자 A 바이러스(A/California/04/2009, 1MLD50 및 2MLD50)를 감염시킨 후 5일간 하루에 한번(QD) 단일 도메인 항체를 복강내 투여(IP injection)하였다.
시험을 진행하는 동안 각 시험군의 체중 및 생존율을 측정하여 안전성을 평가하였다.
또한, 바이러스 감염 후 2일과 7일차에 마우스를 안락사하고 폐 조직을 확보하였다. 확보된 폐 조직은 유제하고 상층액을 이용하여 TCID50 테스트를 통해 폐 조직 내 바이러스의 역가를 비교하여 효능을 평가하였다.
그 결과, 도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, 바이러스 1MLD50 감염한 경우 양성 대조군(PC)에서는 50%만 생존하였으나, 저용량 단일 도메인 항체 투여군(0.15 mg/kg, 0.5 mg/kg 및 1.5 mg/kg)에서는 모두 생존하였다. 체중 또한 모든 저용량 단일 도메인 항체 투여군에서 음성 대조군(NC)과 큰 차이 없이 유지되었다. 또한, 고용량 단일 도메인 항체 투여군(3 mg/kg)에서도 음성 대조군에 비하여 체중 변화가 없음을 확인하였다. 이를 통해 단일 도메인 항체의 안전성이 우수함을 확인하였다.
또한, 도 10에 나타낸 바와 같이, 바이러스 1MLD50 감염한 경우 TCID50의 Detection limit는 1.5 TCID50/ml(log10)로 나타났고, 저용량 단일 도메인 항체 투여군(0.5 mg/kg 및 1.5 mg/kg)에서 7일차에 TCID50가 detection limit 아래로 측정되어, 잔여 바이러스가 없는 것을 확인하였다. 이를 통해 단일 도메인 항체의 항바이러스 효능이 우수함을 확인하였다.
Claims (18)
- 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌(Hemagglutinin)에 특이적으로 결합하는 단일 도메인 항체(sdAb)를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제 1항에 있어서, 상기 sdAb는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제 2항에 있어서, 적어도 1개 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제 3항에 있어서, 적어도 1개 이상의 아미노산 치환이 보존적 치환인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제 4항에 있어서, 적어도 1개의 아미노산 치환이 아미노산의 비-유전자 코딩 아미노산 또는 합성 아미노산으로의 치환인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 sdAb가 Fc 단편에 융합된 중쇄-단독 항체(HCAb)인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제 6항에 있어서, 상기 HCAb는 단량체성 또는 다량체성인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제 6항에 있어서, 상기 Fc 단편은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제 6항에 있어서, 상기 sdAb가 펩티드 링커를 통해 Fc 단편에 융합되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제 1항에 있어서, 상기 인플루엔자 A 바이러스는 H1N1인 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
- 제 1항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 핵산 분자.
- 제 11항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
- 제 12항의 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
- 제1항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 A 바이러스 감염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 인플루엔자 A 바이러스 검출용 조성물.
- 다음 단계를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 검출 방법:
(a) 제1항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 검출 대상 시료를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 검출 대상 시료에 포함된 인플루엔자 A 바이러스의 결합 여부를 확인하는 단계.
- 제1항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 유효성분으로 포함하는, 독감 진단용 조성물.
- 제17에 있어서, 상기 독감은 인플루엔자 A 바이러스 감염에 의한 것인, 독감 진단용 조성물.
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