WO2018030777A1 - 항-인플루엔자 바이러스 항체의 안정한 액체 약제학적 제제 - Google Patents

항-인플루엔자 바이러스 항체의 안정한 액체 약제학적 제제 Download PDF

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이준원
한원용
김수정
오준석
김소영
김광우
신연경
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㈜셀트리온
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    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Definitions

  • the present invention relates to stable liquid pharmaceutical preparations of anti-influenza virus antibodies.
  • Influenza is a respiratory disease caused by influenza virus infection, which causes an epidemic in winter every year, and is known to be particularly vulnerable to the elderly and children. Influenza viruses are divided into types A, B, and C, of which A and B are transmitted to humans and animals. Influenza A viruses can be further subdivided according to the HA (Hemagglutinin) and NA (Neuraminidase) subtypes (H1N1, H3N2, etc.), which are present on the surface of the virus. Combination of 17 types of HA and 10 types of NA of the influenza A virus known to date enables the development of viruses with various subtypes.
  • HA Hemagglutinin
  • NA Neuroaminidase subtypes
  • the gene of influenza virus is composed of several fragments.
  • a new subtype of influenza virus may be generated through rearrangement of the gene, and this antigenic mutation (Antigenic) shifts are unpredictable, making it difficult to defend against current vaccines. Therefore, in order to cope with the new influenza, there is an urgent need for influenza virus therapeutics with a wider range of treatments.
  • Korean Patent Application No. 10-2011-0020061 and Korean Patent Application No. 10-2012-0107512 are major phylogenetic groups 1 (H1, H2, H5, and H9) and phylogenetic groups It showed a neutralizing effect on 2 (H3, H7).
  • Korean Patent Application No. 10-2014-0036601 confirmed the preventive and therapeutic effects on influenza viruses belonging to phylogenetic group 1 and group 2 through the composition of two or more types of antibodies disclosed in the Korean patent application.
  • the antibody has stability at low temperature (5 ° C), room temperature (25 ° C), and high temperature (40 ° C) in order to be used as a liquid pharmaceutical preparation for prevention and treatment.
  • low temperature 5 ° C
  • room temperature 25 ° C
  • high temperature 40 ° C
  • the development of stable formulations with minimal aggregation and degradation of antibodies is essential.
  • Antibody stability can be influenced by factors such as ionic strength, pH, temperature, repeated cycles of freeze / thaw, antibody concentration, and shear stress.
  • Active antibodies are subject to physical instability, including denaturation, aggregation (formation of soluble and insoluble aggregates), precipitation, and adsorption and chemical instability including racemization, beta-elimination or disulfide exchange, hydrolysis, deamidation, and oxidation. Loss may occur.
  • Such physical and chemical instability can potentially result in the formation of antibody byproducts or derivatives having reduced biological activity, increased toxicity, and / or increased immunogenicity.
  • the present inventors have described the low temperature (5 ° C), room temperature (25 ° C), and high temperature (40 ° C) of an antibody or a mixture of two or more different anti-influenza virus antibodies in which an influenza virus prevention or treatment has been confirmed.
  • the present invention was completed by confirming the stability and long-term storage stability.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a stable liquid pharmaceutical formulation comprising an anti-influenza virus antibody or a mixture of two or more different anti-influenza virus antibodies.
  • Another problem to be solved by the present invention is to store a low temperature (5 °C), room temperature (25 °C), and high temperature (40 °C) while containing an anti-influenza virus antibody or a mixture of two or more different anti-influenza virus antibodies It is to provide a liquid pharmaceutical formulation having excellent stability and long term (12 months) storage stability.
  • an anti-influenza virus antibody or two or more different anti-influenza virus antibodies capable of intravenous, intramuscular, intradermal, subcutaneous, intraperitoneal, topical, or a combination thereof.
  • an anti-influenza virus antibody or two or more different anti-influenza virus antibodies capable of intravenous, intramuscular, intradermal, subcutaneous, intraperitoneal, topical, or a combination thereof.
  • the present invention (A) anti-influenza virus antibody or two or more different anti-influenza virus antibody mixture; (B) surfactants; (C) sugars or derivatives of sugars; And (D) a stable liquid pharmaceutical formulation comprising an amino acid.
  • the anti-influenza virus antibody or two or more different anti-influenza virus antibody mixtures comprise antibodies that bind to epitopes in the hemagglutinin (HA) protein of influenza A virus. Can be.
  • the antibody may bind to an epitope in the stem region of the hemagglutinin (HA) protein of influenza A virus.
  • HA hemagglutinin
  • the epitope of the antibody comprises i) positions 18, 25, 27, 32, 33, 38, 40, 54, 55, 278, 291, 292, 310, 311, 312, and Any one or more amino acid residues selected from the group consisting of 318; And ii) positions 18, 19, 20, 21, 38, 39, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 52, 53, 56, 57, 58, 60, and 99 of the HA2 polypeptide. It can include any one or more amino acid residues.
  • the epitope comprises amino acid residues at position 318 of the HA1 polypeptide and may comprise amino acid residues at positions 41, 42, 45, 48, 49, 52, and 53 of the HA2 polypeptide.
  • the epitope may comprise amino acid residues at positions 18, 38, 40, 291, 292, and 318 of the HA1 polypeptide.
  • the epitope may comprise amino acid residues at positions 18, 19, 20, 21, 41, 42, 45, 48, 49, 52, and 53 of the HA2 polypeptide.
  • the epitope comprises amino acid residues at positions 18, 38, 40, 291, 292, and 318 of the HA1 polypeptide, and positions 18, 19, 20, 21, 41, 42, 45, 48, 49, 52, And 53 amino acid residues.
  • the epitope may comprise amino acid residues at positions 278 and 318 of the HA1 polypeptide.
  • the epitope may comprise positions 38, 39, 41, 42, 45, 48, 49, 52, and 53 amino acid residues of the HA2 polypeptide.
  • the epitope comprises amino acid residues at the position of the HA1 polypeptide and / or HA2 polypeptide of an HA first monomer, and positions 25, 32, and 33 amino acid residues of the HA1 polypeptide of a second monomer adjacent to the first monomer. It may further include.
  • the epitope comprises amino acid residues at positions 278 and 318 of the HA1 polypeptide and comprises amino acids residues 38, 39, 41, 42, 45, 48, 49, 52, and 53 amino acid residues of the HA2 polypeptide. It may include.
  • the epitope comprises amino acid residues at the positions of the HA1 polypeptide and HA2 polypeptide of the HA first monomer and further comprises positions 25, 32, and 33 amino acid residues of the HA1 polypeptide of the second monomer adjacent to the first monomer. Can be.
  • the epitope comprises amino acid residues at positions 278 and 318 of the HA1 polypeptide, positions 38, 39, 41, 42, 45, 48, 49, 52, 53, 58, and 99 amino acid residues.
  • the epitope comprises amino acid residues at the positions of the HA1 polypeptide and HA2 polypeptide of the HA first monomer, and further comprises positions 25, 27, 32, and 33 amino acid residues of the HA1 polypeptide of the second monomer adjacent to the first monomer. It may include.
  • the epitope comprises amino acid residues at positions 54, 55, 278, 291 and 318 of the HA1 polypeptide and positions 19, 20, 21, 38, 39, 41, 42, 45 of the HA2 polypeptide , 46, 48, 49, 52, 53, 56, 57, and 60 amino acid residues.
  • the epitope comprises amino acid residues at the positions of the HA1 polypeptide and HA2 polypeptide of the HA first monomer, and positions 25, 32, 33, 310, 311, and HA1 polypeptide of the HA second monomer adjacent to the HA first monomer; May further comprise 312 amino acid residues.
  • the anti-influenza virus antibody is i) a light chain variable region having at least 95% sequence identity to the light chain variable region of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 43 and the heavy chain variable region of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 44
  • An antibody comprising a heavy chain variable region having at least 95% sequence identity to the antibody;
  • an antibody comprising a light chain variable region having at least 95% sequence identity to the light chain variable region of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 45 and a heavy chain variable region having at least 95% sequence identity to the heavy chain variable region of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 46;
  • an antibody comprising a light chain variable region having at least 95% sequence identity
  • the anti-influenza virus antibody comprises at least 95% sequence identity to a light chain having at least 95% sequence identity to the light chain of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 57 and a heavy chain of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 58
  • An antibody comprising a heavy chain having ii) an antibody comprising a light chain having at least 95% sequence identity to the light chain of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 59 and a heavy chain having at least 95% sequence identity to the heavy chain of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 60; iii) an antibody comprising a light chain having at least 95% sequence identity to the light chain of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 61 and a heavy chain having at least 95% sequence identity to the heavy chain of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 62; iv) an antibody comprising a light chain having at least 95% sequence identity to the light chain of the polypeptide sequence of SEQ ID NO:
  • two or more different anti-influenza virus antibody mixtures are: i) a light chain variable comprising a CDR1 region of SEQ ID NO: 1, a CDR2 region of SEQ ID NO: 2, and a CDR3 region of SEQ ID NO: 3 An antibody comprising a region and a heavy chain variable region comprising a CDR1 region of SEQ ID NO: 4, a CDR2 region of SEQ ID NO: 5, and a CDR3 region of SEQ ID NO: 6; And ii) a light chain variable region comprising the CDR1 region of SEQ ID NO: 7, the CDR2 region of SEQ ID NO: 8, and the CDR3 region of SEQ ID NO: 9 and the CDR1 region of SEQ ID NO: 10, the CDR2 region of SEQ ID NO: 11, and SEQ ID NO: 12 It may include an antibody comprising a heavy chain variable region comprising a CDR3 region.
  • An antibody comprising a heavy chain variable region having at least 95% sequence identity to the heavy chain variable region of the polypeptide sequence;
  • the two or more different anti-influenza virus antibody mixtures comprise i) a light chain having at least 95% sequence identity to the light chain of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 57 and a heavy chain of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 58 An antibody comprising a heavy chain having at least 95% sequence identity to the antibody; And ii) a light chain having at least 95% sequence identity to the light chain of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 59 and a heavy chain having at least 95% sequence identity to the heavy chain of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 60.
  • the anti-influenza virus antibody is a MHAA4549A antibody of Genentech; MEDI8852 antibody from Mediiche; CR6261 antibody, CR8020 antibody, CR9114 antibody, CR8033 antibody, CR8071 antibody from Cruceel; F10 antibody from the Dana-Farber Cancer Institute; VIS410 antibody from Vastera; TCN-032 antibody from Teraclolon Science; And / or FI6 antibodies of the Swiss Biomedical Research Institute (IRB).
  • the mixing ratio of two different antibodies may be 9: 1 to 1: 9. .
  • the concentration of (A) anti-influenza virus antibody or a mixture of two or more different anti-influenza virus antibodies may be 10 to 150 mg / mL.
  • the (B) surfactant may comprise polysorbate, poloxamer, or mixtures thereof.
  • the (B) surfactant may comprise polysorbate 20, polysorbate 40, polysorbate 60, polysorbate 80, or a mixture of two or more thereof.
  • the (B) surfactant may comprise polysorbate 80.
  • the concentration of the (B) surfactant may be 0.01 to 1.0% (w / v).
  • the sugar (C) may comprise monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, polysaccharides, or mixtures of two or more thereof.
  • the derivative of sugar (C) may comprise sugar alcohols, sugar acids, or mixtures thereof.
  • (C) sugars comprise monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, polysaccharides, or mixtures of two or more thereof, and (C) derivatives of sugars may include sugar alcohols, sugar acids, or mixtures thereof Can be.
  • the sugar or derivative of sugar may comprise sorbitol, mannitol, trehalose, sucrose, or a mixture of two or more thereof.
  • the concentration of (C) sugar or derivatives of sugar may be 0.1 to 15% (w / v).
  • the amino acid (D) may comprise free amino acids, amino acid salts, or mixtures thereof.
  • the amino acid (D) may comprise aspartic acid, histidine, lysine, arginine, or salts thereof.
  • the amino acid (D) may comprise histidine, histidine salt, or mixtures thereof.
  • the concentration of (D) amino acid may be 1 to 20 mM.
  • the pH may be 5.5 to 6.5.
  • the purity of the antibody monomer measured after storage for 6 weeks at 40 ⁇ 2 °C may be 95% or more.
  • the purity of the antibody monomer measured after 3 months or more stored at 5 ⁇ 3 °C / ambient relative humidity conditions may be 95% or more.
  • the purity of the antibody monomer measured after 6 months or more stored at 5 ⁇ 3 °C / ambient relative humidity conditions may be 95% or more.
  • the stable liquid pharmaceutical formulation may be for intravenous, intramuscular, intradermal, subcutaneous, intraperitoneal, topical, or a combination thereof.
  • a pre-filled syringe is filled with said stable liquid pharmaceutical formulation.
  • the auto-injector includes the pre-field syringe therein.
  • the kit may comprise said stable liquid pharmaceutical formulation and container.
  • the stable liquid pharmaceutical formulation may be for the prevention, diagnosis or treatment of influenza virus.
  • it may be a method of preparing the stable liquid pharmaceutical formulation.
  • the stable liquid pharmaceutical preparations of the anti-influenza virus antibodies according to the present invention are excellent in low temperature (5 ° C), room temperature (25 ° C), and high temperature (40 ° C) storage stability and long-term (12 months) storage stability. Intramuscular, intradermal, subcutaneous, intraperitoneal topical, or a combination thereof is possible.
  • Stable liquid pharmaceutical formulations may comprise (A) an anti-influenza virus antibody or a mixture of two or more different anti-influenza virus antibodies; (B) surfactants; (C) sugars or derivatives of sugars; And (D) amino acids.
  • antibody is used in its broadest sense and may include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, recombinant antibodies, single chain antibodies, hybrid antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies, or fragments thereof. have. Other naturally occurring antibodies with other altered structures, such as camelid antibodies, are also included in this definition.
  • Intact antibody refers to an immunoglobulin molecule consisting of four polypeptide chains in which two heavy chains and two light chains are connected to each other by disulfide bonds.
  • Fragments of the antibody are in particular Fab, F (ab '), F (ab') 2, Fv, dAb, Fd, complementarity determining region (CDR) fragments, single-chain antibodies (scFv), bivalent single-chains
  • Antibodies single-chain phage antibodies, diabodies, triabodies, tetrabodies, polypeptides containing one or more fragments of immunoglobulin sufficient to bind a particular antigen to the polypeptide, and the like.
  • Each heavy chain consists of a heavy chain variable region and a heavy chain constant region.
  • the heavy chain constant region consists of three domains (CH1, CH2, and CH3).
  • Each light chain consists of a light chain variable region and a light chain constant region.
  • the light chain constant region consists of one domain (CL).
  • the heavy chain variable region and the light chain variable region can be further subdivided into hypervariable regions called complementarity determining regions (CDRs), arranged with more conserved regions called framework regions (FR).
  • CDRs complementarity determining regions
  • FR framework regions
  • Each heavy and light chain variable region consists of three CDRs and four FRs, which are arranged in the following order from amino terminus to carboxy terminus: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
  • CDRs of the variable regions in the present invention were determined by conventional methods according to the system devised by Kabat et al. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th), National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) )] Reference). Although the CDR numbering used in the present invention used the Kabat method, antibodies including the CDRs determined according to other methods such as the IMGT method, the Chothia method, and the AbM method are also included in the present invention.
  • Antibodies in the present invention include functional variants of the antibody.
  • Functional variants of the antibody are considered functional variants of the antibodies of the invention, provided that they can compete with the antibodies of the invention to specifically bind to influenza virus.
  • Functional variants may include, but are not limited to, derivatives having substantially similar primary structural sequences.
  • Functional variants may optionally be antibodies comprising an amino acid sequence comprising substitutions, insertions, deletions, or combinations of one or more amino acids in comparison to the amino acid sequence of the parent antibody.
  • functional variants may include truncated forms of amino acid sequences at one or both of the amino terminus or carboxy terminus.
  • Functional variants of the invention may have the same or different, higher or lower binding affinity compared to the parent antibodies of the invention, but can still bind to influenza virus.
  • Functional variants within the scope of the present invention include about 50-99%, about 60-99%, about 80-99%, about 90-99%, about 95-99%, or about 97-99 with the antibodies disclosed herein.
  • % Amino acid sequence identity Gap or Bestfit known to those skilled in the art can be used in computer algorithms to optimally arrange the amino acid sequences to be compared and to define similar or identical amino acid residues.
  • Functional variants may be obtained by organic parenteral methods or modified by known general molecular biological methods, including but not limited to PCR methods, mutagenesis using oligomeric nucleotides, and partial mutagenesis. .
  • type of antibody may be classified into, but is not limited to, the type of constant domain or constant region possessed by its heavy chain.
  • five major kinds of antibodies namely IgA, IgD, and IgE , IgG, and IgM are present, many of which may be further classified into subclasses (isotypes) such as IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2.
  • an “epitope” is an area of the antigen that is bound by an antibody that targets the antigen, and includes, but is not limited to, specific amino acids in direct contact with the antibody.
  • epitopes may include chemically active surface groups of molecules such as amino acids, sugar side chains, phosphoryl or sulfonyl groups, and may be specific three-dimensional structural features and / or specific charge features.
  • influenza A virus is an enveloped virus belonging to the Orthomyxoviridae, which is a negative-polar and single-strand of eight segments.
  • RNA ribonucleic acid
  • A, B, and C groups and is divided into several subtypes according to major surface proteins HA (hemaggutinin) and NA (neuraminidase).
  • HA hemaggutinin
  • NA neuroaminidase
  • hemagglutinin (hereinafter referred to as” HA ) refers to the envelope glycoprotein of influenza virus. HA mediates influenza virus adsorption and penetration into host cells. There are 17 subtypes reported so far.
  • H1 subtype includes H1N1, H1N2, H1N3, H1N4, H1N5, H1N6, H1N7, H1N8, H1N9, and H1N10.
  • H2 subtype in the present invention includes H2N1, H2N2, H2N3, H2N4, H2N5, H2N6, H2N7, H2N8, H2N9, and H2N10.
  • H5 subtype in the present invention includes H5N1, H5N2, H5N3, H5N4, H5N5, H5N6, H5N7, H5N8, H5N9, and H5N10.
  • H9 subtype in the present invention includes H9N1, H9N2, H9N3, H9N4, H9N5, H9N6, H9N7, H9N8, H9N9, and H9N10.
  • H3 subtype includes H3N1, H3N2, H3N3, H3N4, H3N5, H3N6, H3N7, H3N8, H3N9, and H3N10.
  • H7 subtype in the present invention includes H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N5, H7N6, H7N7, H7N8, H7N9, and H7N10.
  • the "antibody” may comprise an antibody that binds to or neutralizes the influenza virus.
  • an “antibody mixture” may comprise two or more different anti-influenza virus antibodies.
  • the anti-influenza virus antibody or two or more different anti-influenza virus antibody mixtures may comprise an antibody that binds to influenza A virus.
  • the anti-influenza virus antibody or two or more different anti-influenza virus antibody mixtures may comprise an antibody that binds to the hemagglutinin (HA) protein of influenza A virus.
  • an anti-influenza virus antibody or a mixture of two or more different anti-influenza virus antibodies is directed to the stem region or epitope thereof of the influenza A virus hemagglutinin (HA) protein. It may include an antibody that binds.
  • the epitope of the antibody comprises i) positions 18, 25, 27, 32, 33, 38, 40, 54, 55, 278, 291, 292, 310, 311, 312, and Any one or more amino acid residues selected from the group consisting of 318; And ii) positions 18, 19, 20, 21, 38, 39, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 52, 53, 56, 57, 58, 60, and 99 of the HA2 polypeptide. It can include any one or more amino acid residues.
  • the epitope comprises amino acid residues at position 318 of the HA1 polypeptide and comprises amino acid residues at positions 41, 42, 45, 48, 49, 52, and 53 of the HA2 polypeptide. Can be.
  • the epitope may comprise amino acid residues at positions 18, 38, 40, 291, 292 and 31 of the HA1 polypeptide.
  • the epitope may comprise amino acid residues at positions 18, 19, 20, 21, 41, 42, 45, 48, 49, 52 and 53 of the HA2 polypeptide.
  • the epitope comprises amino acid residues at positions 18, 38, 40, 291, 292 and 318 of the HA1 polypeptide, and positions 18, 19, 20, 21, 41, 42, 45, 48, 49, 52 and 53 of the HA2 polypeptide. And amino acid residues of.
  • the epitope may comprise amino acid residues at positions 278 and 318 of the HA1 polypeptide.
  • the epitope may comprise positions 38, 39, 41, 42, 45, 48, 49, 52, and 53 amino acid residues of the HA2 polypeptide.
  • the epitope comprises amino acid residues at the position of the HA1 polypeptide and / or HA2 polypeptide of the HA first monomer and comprises positions 25, 32 and 33 amino acid residues of the HA1 polypeptide of the second monomer adjacent to the first monomer. It may further comprise.
  • the epitope comprises amino acid residues at positions 278 and 318 of the HA1 polypeptide and comprises amino acids residues 38, 39, 41, 42, 45, 48, 49, 52, and 53 amino acid residues of the HA2 polypeptide. It may include.
  • the epitope may comprise amino acid residues at the positions of the HA1 polypeptide and HA2 polypeptide of the HA first monomer and may further comprise positions 25, 32, and 33 amino acid residues of the HA1 polypeptide of the second monomer adjacent to the first monomer. have.
  • the epitope comprises amino acid residues at positions 278 and 318 of the HA1 polypeptide and positions 38, 39, 41, 42, 45, 48, 49, 52, 53, 58 and 99 of the HA2 polypeptide. And amino acid residues of.
  • the epitope comprises amino acid residues at the positions of the HA1 polypeptide and HA2 polypeptide of the HA first monomer, and further comprises positions 25, 27, 32, and 33 amino acid residues of the HA1 polypeptide of the second monomer adjacent to the first monomer. can do.
  • the epitope comprises amino acid residues at positions 54, 55, 278, 291 and 318 of the HA1 polypeptide and positions 19, 20, 21, 38, 39, 41, 42, 45 of the HA2 polypeptide , 46, 48, 49, 52, 53, 56, 57, and 60 amino acid residues.
  • the epitope comprises amino acid residues at the positions of the HA1 polypeptide and HA2 polypeptide of the HA first monomer, and positions 25, 32, 33, 310, 311, and HA1 polypeptide of the HA second monomer adjacent to the HA first monomer; May further comprise 312 amino acid residues.
  • the anti-influenza virus antibodies will comprise polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, recombinant antibodies, single chain antibodies, hybrid antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies, or fragments thereof. Can be.
  • the anti-influenza virus antibody may comprise a human antibody. In another embodiment of the invention, the anti-influenza virus antibody may be included in the IgG class of the antibody.
  • the anti-influenza virus antibody comprises: i) a light chain variable region comprising a CDR1 region of SEQ ID NO: 1, a CDR2 region of SEQ ID NO: 2, and a CDR3 region of SEQ ID NO: 3, and a CDR1 region of SEQ ID NO: 4,
  • An antibody comprising a heavy chain variable region comprising a CDR2 region of SEQ ID NO: 5 and a CDR3 region region of SEQ ID NO: 6; ii) a light chain variable region comprising the CDR1 region of SEQ ID NO: 7, the CDR2 region of SEQ ID NO: 8, and the CDR3 region of SEQ ID NO: 9 and the CDR1 region of SEQ ID NO: 10, the CDR2 region of SEQ ID NO: 11, and the CDR3 of SEQ ID NO: 12
  • An antibody comprising a heavy chain variable region comprising a region; iii) a light chain variable region comprising the CDR1 region of SEQ ID NO: 13, the CDR2 region
  • the anti-influenza virus antibody comprises i) a light chain variable region having at least 95% sequence identity to the light chain variable region of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 43 and 95% to a heavy chain variable region of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 44 An antibody comprising a heavy chain variable region having the above sequence identity; ii) an antibody comprising a light chain variable region having at least 95% sequence identity to the light chain variable region of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 45 and a heavy chain variable region having at least 95% sequence identity to the heavy chain variable region of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 46; iii) an antibody comprising a light chain variable region having at least 95% sequence identity to the light chain variable region of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 47 and a heavy chain variable region having at least 95% sequence identity to the heavy chain variable region of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 48; iv) an antibody comprising a light chain variable region having at least 95% sequence identity
  • the anti-influenza virus antibody comprises i) a light chain having at least 95% sequence identity to the light chain of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 57 and a heavy chain having at least 95% sequence identity to the heavy chain of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 58
  • An antibody comprising a; ii) an antibody comprising a light chain having at least 95% sequence identity to the light chain of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 59 and a heavy chain having at least 95% sequence identity to the heavy chain of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 60; iii) an antibody comprising a light chain having at least 95% sequence identity to the light chain of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 61 and a heavy chain having at least 95% sequence identity to the heavy chain of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 62; iv) an antibody comprising a light chain having at least 95% sequence identity to the light chain of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 57
  • two or more different anti-influenza virus antibody mixtures comprise i) a light chain variable region and sequence comprising a CDR1 region of SEQ ID NO: 1, a CDR2 region of SEQ ID NO: 2, and a CDR3 region of SEQ ID NO: 3
  • An antibody comprising a heavy chain variable region comprising a CDR1 region of SEQ ID NO: 4, a CDR2 region of SEQ ID NO: 5, and a CDR3 region of SEQ ID NO: 6;
  • It may include an antibody comprising a heavy chain variable region comprising a CDR3 region.
  • two or more different anti-influenza virus antibody mixtures comprise i) a light chain variable region having at least 95% sequence identity to the light chain variable region of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 43 and a polypeptide sequence of SEQ ID NO: 44 An antibody comprising a heavy chain variable region having at least 95% sequence identity to the heavy chain variable region; And ii) a light chain variable region having at least 95% sequence identity to the light chain variable region of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 45 and a heavy chain variable region having at least 95% sequence identity to the heavy chain variable region of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 46; It may include.
  • the two or more different anti-influenza virus antibody mixtures comprise i) 95% of the light chain having at least 95% sequence identity to the light chain of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 57 and 95% of the heavy chain of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 58 An antibody comprising a heavy chain having the above sequence identity; And ii) a light chain having at least 95% sequence identity to the light chain of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 59 and a heavy chain having at least 95% sequence identity to the heavy chain of the polypeptide sequence of SEQ ID NO: 60.
  • the mixing ratio of two different antibodies when two or more different anti-influenza virus antibody mixtures are mixtures of two different antibodies, the mixing ratio of two different antibodies may be 9: 1 to 1: 9. In another embodiment of the present invention, the mixing ratio may be 4: 1 to 1: 4. In another embodiment of the present invention, the mixing ratio may be 1: 1. When the mixing ratio is within this range, the stability of the liquid pharmaceutical formulation can be excellently shown. The mixing ratio can be freely adjusted within a range that does not substantially adversely affect the stability of the stable liquid pharmaceutical formulation according to the present invention.
  • the concentration of the anti-influenza virus antibody or two or more different anti-influenza virus antibody mixtures may be between 5 and 200 mg / mL. In another embodiment of the present invention, the concentration may be 10 to 150 mg / mL. In another embodiment of the invention, the concentration may be 20 to 100 mg / mL. If the concentration is in this range, it can exhibit excellent long-term stability. The concentration can be freely adjusted within a range that does not substantially adversely affect the stability of the stable liquid pharmaceutical formulation according to the present invention.
  • the "surfactant” is a polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester (for example, polysorbate), polyoxyethylene alkyl ether (for example, Brij), alkylphenyl polyoxyethylene ether ( For example, Triton-X, polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymers (e.g., Poloxamer, Pluronic), sodium dodecyl sulfate (SDS), etc.
  • polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester for example, polysorbate
  • polyoxyethylene alkyl ether for example, Brij
  • alkylphenyl polyoxyethylene ether alkylphenyl polyoxyethylene ether
  • Triton-X polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymers
  • Poloxamer Poloxamer, Pluronic
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the surfactant may comprise polysorbate, poloxamer, or mixtures thereof. In another embodiment of the invention, the surfactant may comprise polysorbate 20, polysorbate 40, polysorbate 60, polysorbate 80, or a mixture of two or more thereof. In another embodiment of the invention, the surfactant may comprise polysorbate 80.
  • the concentration of the surfactant may be 0.001 to 10% (w / v). In another embodiment of the present invention, the concentration may be 0.01 to 1.0% (w / v). In another embodiment of the present invention, the concentration may be 0.05 to 0.5% (w / v). If the concentration is within this range, the stability of the liquid pharmaceutical formulation can be well represented. The concentration can be freely adjusted within a range that does not substantially adversely affect the stability of the stable liquid pharmaceutical formulation according to the present invention.
  • “sugar” may include monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, polysaccharides, or a mixture of two or more thereof.
  • monosaccharides include, but are not limited to, glucose, fructose, galactose, and the like.
  • disaccharides include but are not limited to sucrose, lactose, maltose, trehalose and the like.
  • oligosaccharides include, but are not limited to, fructooligosaccharides, galactooligosaccharides, met oligosaccharides, and the like.
  • polysaccharides include, but are not limited to, starch, glycogen, cellulose, chitin, pectin, and the like.
  • the "derivatives of sugars” may include sugar alcohols, sugar acids, or mixtures thereof.
  • sugar alcohols include glycerol, erythritol, tracerol, arabitol, xyitol, ribitol, mannitol, sorbitol, galactitol, pushtol, iditol, inositol, bolitol, isomalt, maltitol, lactitol, maltotriitol , Maltotetriitol, polyglycitol, and the like, but are not limited thereto.
  • sugar acids include, but are not limited to, aldonic acid (such as glyceric acid), uloxonic acid (such as neuramic acid), uronic acid (such as glucuronic acid), and aldar acid (such as tartaric acid).
  • aldonic acid such as glyceric acid
  • uloxonic acid such as neuramic acid
  • uronic acid such as glucuronic acid
  • aldar acid such as tartaric acid
  • the sugars comprise monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, polysaccharides, or mixtures of two or more thereof
  • the derivatives of sugars may comprise sugar alcohols, sugar acids, or mixtures thereof.
  • the sugar or derivatives of sugar may comprise sorbitol, mannitol, trehalose, sucrose, or a mixture of two or more thereof.
  • the concentration of sugar or derivative of sugar may be 0.01 to 30% (w / v). In another embodiment of the present invention, the concentration may be 0.1 to 15% (w / v). In another embodiment of the present invention, the concentration may be 1.0 to 10% (w / v). If the concentration is within this range, the stability of the liquid pharmaceutical formulation can be well represented. The concentration can be freely adjusted within a range that does not substantially adversely affect the stability of the stable liquid pharmaceutical formulation according to the present invention.
  • amino acid may include free amino acids, amino acid salts, or mixtures thereof.
  • the free amino acid means a free amino acid that does not have a peptide bond between amino acids or an ester bond between amino acids and other molecules.
  • amino acids include, but are not limited to, aspartic acid, histidine, lysine, arginine, and the like.
  • amino acid salts include, but are not limited to, aspartate, histidine salt, lysine salt, arginine salt, and the like.
  • the amino acids may comprise aspartic acid, histidine, lysine, arginine, or salts thereof.
  • the amino acid may comprise histidine, histidine salt, or mixtures thereof.
  • the amino acid may comprise a mixture of histidine and histidine-HCl.
  • the amino acids may comprise amino acids, amino acid salts, or mixtures thereof.
  • the amino acid may be a buffer.
  • the "buffer” refers to a neutralizing material that minimizes the change in pH caused by acid or alkali, and means a material that maintains a specific range of pH even without a pH adjuster.
  • the concentration of amino acid may be 0.1 to 40 mM. In another embodiment of the invention, the concentration may be 1 to 20 mM. In another embodiment of the invention, the concentration may be 5 to 15 mM. If the concentration is within this range, the stability of the liquid pharmaceutical formulation can be well represented. The concentration can be freely adjusted within a range that does not substantially adversely affect the stability of the stable liquid pharmaceutical formulation according to the present invention.
  • the pH of the stable liquid pharmaceutical formulation in the present invention may be 5.5 to 6.5. If the pH is within this range, it can exhibit excellent long-term stability. pH can be adjusted with buffers or amino acids. In other words, when a small amount of buffer or amino acid is included, the pH may be expressed in the above range without a separate pH adjuster.
  • the pH may be adjusted with an additional pH adjuster.
  • pH adjusting agents include, but are not limited to, acids or bases (eg, sodium hydroxide).
  • Stable liquid pharmaceutical formulations of the present invention may further comprise additives known in the art within a range that does not substantially affect the activity of the antibody, the stability of the formulation.
  • the additive may include additional buffers, diluents, solubilizers, pH adjusters, sedatives, other inorganic or organic salts, antioxidants, aqueous carriers, or mixtures thereof, and the like. It is not. In another embodiment of the present invention, it may further comprise an aqueous carrier, antioxidant, or a mixture of two or more thereof.
  • Aqueous carriers are pharmaceutically acceptable (safe and nontoxic to human administration) and may include carriers useful for the preparation of liquid pharmaceutical formulations.
  • stable in the “stable” liquid pharmaceutical formulation of the present invention means that the antibody according to the present invention substantially retains its physical stability and / or chemical stability and / or biological activity during the manufacturing process and / or during storage / storage. I mean. Various analytical techniques for measuring the stability of antibodies are readily available in the art.
  • physical stability can be assessed by methods known in the art, which can include measuring sample apparent attenuation of light (absorption or optical density), and the like. This light attenuation measurement is related to the turbidity of the formulation. In addition, high molecular weight component content, low molecular weight component content, intact protein amount, insoluble foreign matter particle number, etc. may be measured with respect to physical stability.
  • chemical stability may be evaluated by a method known in the art, and the method may include an evaluation for detecting and quantifying a chemically changed form of an antibody, and the like.
  • charge variants eg, generated as a result of deamidation or oxidation
  • ion exchange chromatography can be measured for chemical stability.
  • the charge variant measurement using the ion exchange chromatography can be measured through an acidic or basic peak or the like.
  • storage stability means that the antibody substantially retains its biological activity even during transport, for example, under altered climatic conditions, elevated temperature and atmospheric humidity environments, shear stress working environments, and the like.
  • the storage stability can be measured through various assays for measuring the biological activity of the corpus luteum in a long-term elevated temperature and atmospheric humidity environment.
  • biological activity can be evaluated by methods known in the art, and the method may include measuring antigen binding affinity through Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA).
  • ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
  • the liquid pharmaceutical formulation may be stable for a long time.
  • stable liquid pharmaceutical formulation means a liquid pharmaceutical formulation that satisfies one or more of the following.
  • Liquid pharmaceutical preparations having a temperature of 40 ⁇ 2 ° C., a relative humidity of 75 ⁇ 5%, and a correlated clearness after 6 weeks of storage in closed conditions;
  • Liquid pharmaceutical preparations which maintain a correlated transparent degree after storage for 12 months at temperature 5 ⁇ 3 ° C., ambient humidity, and closed conditions;
  • Liquid pharmaceutical formulations having a pH measurement of 6.0 ⁇ 0.5 after 12 months storage at a temperature of 5 ⁇ 3 ° C., ambient humidity, and closed conditions;
  • Liquid pharmaceutical preparations in which the microorganisms of the medium do not grow in the isolator after 12 months storage at a temperature of 5 ⁇ 3 ° C., ambient humidity, and closed conditions;
  • the concentration of a single antibody measured by HIC-HPLC after storage for 6 weeks at a temperature of 5 ⁇ 3 ° C., ambient humidity, and confined conditions is 50 ⁇ 5.0 mg / mL, or each concentration of a single antibody constituting the antibody mixture
  • Single antibodies that have a concentration of 50 ⁇ 5.0 mg / mL, as measured by HIC-HPLC after storage for 6 weeks at a temperature of 25 ⁇ 2 ° C., a relative humidity of 60 ⁇ 5%, and confined conditions; Liquid pharmaceutical formulations wherein each concentration of is 25 ⁇ 2.5 mg / mL and the concentration of the antibody mixture is 50 ⁇ 5.0 mg / mL;
  • Single antibodies that have a concentration of 50 ⁇ 5.0 mg / mL, as measured by HIC-HPLC, after storage for 6 weeks at 40 ⁇ 2 ° C., relative humidity 75 ⁇ 5%, and confined conditions; Liquid pharmaceutical formulations wherein each concentration of 25 ⁇ 2.5 mg / mL and the concentration of the antibody mixture is 50 ⁇ 5.0 mg / mL;
  • the concentration of a single antibody measured by HIC-HPLC after storage for 12 months at a temperature of 5 ⁇ 3 ° C., ambient humidity, and confined conditions of 50 ⁇ 5.0 mg / mL, or each concentration of a single antibody constituting the antibody mixture A liquid pharmaceutical formulation having a 25 ⁇ 2.5 mg / mL and a concentration of the antibody mixture of 50 ⁇ 5.0 mg / mL;
  • Intact immunoglobulin G content (Intact IgG% )
  • Liquid pharmaceutical preparations having a content of intact immunoglobulin G (Intact IgG%) of 90.0 to 100% as measured by non-reducing CE-SDS after storage for 12 months at a temperature of 5 ⁇ 3 ° C., ambient humidity, and closed conditions;
  • Liquid pharmaceutical formulations having an intact light and heavy chain content (Intact HC + LC%) of 95.0 to 100% as measured by reduced CE-SDS after storage for 12 months at a temperature of 5 ⁇ 3 ° C., ambient humidity, and closed conditions ;
  • Liquid pharmaceutical preparations having a temperature of 40 ⁇ 2 ° C., a relative humidity of 75 ⁇ 5%, and an antibody monomer content of 95.0 to 100% as determined by SEC-HPLC after storage for 6 weeks in closed conditions;
  • Liquid pharmaceutical preparations having a content of 95.0-100% of the antibody monomer as determined by SEC-HPLC after storage for 12 months at a temperature of 5 ⁇ 3 ° C., ambient humidity, and closed conditions;
  • Liquid pharmaceutical formulations having a HA binding affinity of 70-130% as measured by Cellular Enzyme-Linked Immunosorbent assay (CELISA) or ELISA after storage for 6 weeks at a temperature of 5 ⁇ 3 ° C., ambient humidity, and closed conditions;
  • CELISA Cellular Enzyme-Linked Immunosorbent assay
  • CELISA Cellular Enzyme-Linked Immunosorbent assay
  • CELISA Cellular Enzyme-Linked Immunosorbent assay
  • Liquid pharmaceutical preparations having a HA binding affinity of 70-130% as measured by Cellular Enzyme-Linked Immunosorbent assay (CELISA) or ELISA after storage for 12 months at a temperature of 5 ⁇ 3 ° C., ambient humidity, and closed conditions;
  • CELISA Cellular Enzyme-Linked Immunosorbent assay
  • the process for preparing a stable liquid pharmaceutical formulation of the present invention can be prepared using known methods, and is not limited to any particular method.
  • the preparation method comprises the steps of i) preparing a mixed solution in which amino acids are added to a solution containing a sugar or a derivative of sugar; ii) exchanging a buffer between the mixed solution of step i) and a solution comprising the antibody to prepare a mixed solution comprising the antibody; And iii) adding a solution comprising a surfactant to the mixed solution comprising the antibody of step ii).
  • the "buffer” is a solution containing a buffer, means a solution that minimizes the change in pH caused by acid or alkali.
  • a method for preparing a stable liquid pharmaceutical formulation comprising a mixture of two different anti-influenza virus antibodies is prepared by mixing each antibody with a stable liquid pharmaceutical formulation with the above-described method.
  • a stable liquid pharmaceutical formulation may be prepared by the above method.
  • the manufacturing method may not include a freeze drying process at the time of manufacture or may include a freeze drying process.
  • the manufacturing method when the manufacturing method does not include a freeze drying process, the manufacturing method may further include preparing a liquid pharmaceutical formulation and immediately placing the liquid pharmaceutical preparation in a closed container after treatment such as sterilization.
  • the preparation method when the preparation method comprises a freeze drying process, the preparation method further comprises preparing a liquid pharmaceutical preparation and freeze drying, or preparing and freeze drying the liquid pharmaceutical preparation of the invention.
  • the preparation method After storage / storage, replenishment or replacement of components removed or modified by lyophilization and / or storage / storage may be included.
  • freeze-drying only the components excluding components that can be removed or modified by freeze drying and / or storage / storage in the liquid pharmaceutical formulation of the present invention or after freeze-drying and storing / storing only those components It may include the step of adding the components that were excluded.
  • Stable liquid pharmaceutical formulations of the invention may be for the diagnosis, prevention, or treatment of influenza virus infection.
  • the stable liquid pharmaceutical formulation of the invention may be for the diagnosis, prevention, or treatment of a disease resulting from influenza bias infection.
  • diseases caused by influenza virus infection include, but are not limited to, pneumonia, otitis media and the like.
  • the stable liquid pharmaceutical formulation may be for intravenous, intramuscular, intradermal, subcutaneous, intraperitoneal, topical, or a combination thereof.
  • the stable liquid pharmaceutical formulation may be for one or several administrations.
  • the concentration of the other components including the antibody in the liquid pharmaceutical formulation is as described above, the total volume of the liquid pharmaceutical formulation may be 0.1 to 100 mL.
  • the dosage and timing of administration of the liquid pharmaceutical formulation of the present invention may vary depending on the type of disease, the severity and course of the disease, the health and treatment of the patient, and the judgment of the treating physician, and the specific dosage and It is not limited to the timing of administration.
  • the present invention provides an anti-influenza virus antibody or a mixture of two or more different anti-influenza virus antibodies; (B) surfactants; (C) sugars or derivatives of sugars; And (D) administering to the patient a stable liquid pharmaceutical formulation comprising an amino acid.
  • the prophylactic or therapeutic method may be administered with a therapeutic agent known to those skilled in the art.
  • the method of preventing or treating may further comprise administering an anti-viral drug.
  • the anti-viral drug may be an anti-influenza virus monoclonal antibody, an anti-influenza virus polyclonal antibody, a DNA polymerase inhibitor, an siRNA agent or a therapeutic vaccine, but is not limited thereto. no.
  • the present invention provides an anti-influenza virus antibody or a mixture of two or more different anti-influenza virus antibodies; (B) surfactants; (C) sugars or derivatives of sugars; And (D) preparing a stable liquid pharmaceutical formulation comprising an amino acid.
  • the present invention provides an anti-influenza virus antibody or a mixture of two or more different anti-influenza virus antibodies; (B) surfactants; (C) sugars or derivatives of sugars; And (D) a stable liquid pharmaceutical formulation comprising an amino acid; And a container for receiving the stable liquid pharmaceutical formulation in an airtight state.
  • the container may be formed from a material such as glass, polymer (plastic), metal, but is not limited thereto.
  • the container is a bottle, vial, syringe, or tube, but is not limited thereto.
  • the container may be a glass or polymer vial, or a glass or polymer prefilled syringe.
  • the inside of the container may not be coated with silicone oil. If silicone oil is coated, the stability may be reduced.
  • the container may be a container for single administration or for several administrations.
  • the kit may further comprise instructions for providing a method of use, storage, or both of the stable liquid pharmaceutical formulation.
  • the method of use may include a method for diagnosing, preventing, or treating an influenza virus infection, and may include a route of administration, a dose, and a timing of administration.
  • the kit may include other tools required from a commercial and user standpoint.
  • the other tool may include a needle, a syringe, and the like.
  • the kit may further comprise a pharmaceutically acceptable excipient, wherein the pharmaceutically acceptable excipient may be combined with an active molecule such as an antibody to prepare an acceptable or convenient dosage form.
  • an active molecule such as an antibody
  • Pharmaceutically acceptable excipients are excipients which are nontoxic to recipients at the dosages and concentrations employed and are compatible with the other ingredients of the composition comprising the monoclonal antibody.
  • the following method was used as a method for measuring physical stability, chemical stability, and biological activity of the liquid pharmaceutical formulation used in the following experimental example.
  • Physical stability, chemical stability and biological activity according to the following measurement methods may include measurement errors depending on the measurement environment and conditions.
  • HIC-HPLC Hydrophilicity Chromatography
  • Clarity of the solution was determined using the appearance of the stored formulation.
  • the pH of the solution was measured using a pH-meter.
  • the degree of growth of the microorganisms in the solution was measured in the isolator.
  • Intact immunoglobulin G content ((Intact IgG%)) was determined using either Microchip-based capillary electrophoretic sodium dodecyl sulfate (CE-SDS) or non-reducing CE-SDS. .
  • the intact heavy and light chain contents (Intact HC + LC%) were measured using capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfate (CE-SDS).
  • Influenza virus HA binding affinity (%) was measured by Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) or Cellular Enzyme-Linked ImmunoSorbent assay (CELISA).
  • the content of the antibody monomer (post-peak;%) was measured using size exclusion HPLC.
  • Examples 1 to 9 and Comparative Examples 1 to 21 were prepared by applying the candidate liquid pharmaceutical formulation components to the antibody mixture mixed with 1.
  • buffers for optimal buffering capacity prepare buffers for optimal buffering capacity, add sugars, sugar alcohols, or sodium chloride, and add anti-influenza viruses to the solution containing the buffers and sugars, sugar alcohols, or sodium chloride.
  • Candidate liquid pharmaceutical formulations were prepared by adding an antibody or a mixture of two or more different anti-influenza virus antibodies and adding a surfactant to reach a target concentration.
  • Examples 1-9 and in comparison 1-21 were stored at 5 ⁇ 3 ° C./ambient relative humidity, 25 ⁇ 2 ° C./60 ⁇ 5% relative humidity, 40 ⁇ 2 ° C./75 ⁇ 5% relative humidity. Stability was measured after 2 weeks, 4 weeks, and 6 weeks at the respective temperatures and humidity.
  • Comparative Example 4 containing acetic acid buffer, pH 4.0, 140 mM sodium chloride at 40 ⁇ 2 °C / 75 ⁇ 5% relative humidity showed a level that can not be analyzed by gelatinization after 4 weeks (IS: Inaccessible State).
  • Examples 1, 4, and 7 and Comparative Examples 1, 7, 10, 13, 16, and 19 at all temperature conditions had no particles observed visually for 6 weeks, but Comparative Examples 1 and 4 including sodium chloride.
  • 10, and 16 show a light milky or milky appearance, whereas Examples 1, 4, and 7, including sorbitol, and Comparative Examples 7, 13, and 19 showed apparently clear results.
  • Examples 1, 4, and 7 and Comparative Example 1 comprising histidine buffer were Comparative Example 16 comprising phosphate buffer. And 19 showed greater than 95% purity while Comparative Examples 7 and 10 with acetic acid buffer showed less than 95% purity.
  • the histidine buffer or the phosphate buffer was included in the high temperature condition than the acetic acid buffer, the intact immunoglobulin G content was maintained at 95% or more, and thus it was stable to degradation.
  • Deterioration means a modification of the inherent structural properties of the protein at a temperature higher than body temperature (corresponding to 40 ⁇ 2 ° C. of the present invention) in the human body.
  • Example 1 5 ⁇ 3 °C / ambient relative humidity 98.42 98.57 98.35 98.00 25 ⁇ 2 °C / 60 ⁇ 5% relative humidity 98.42 98.61 98.47 97.90 40 ⁇ 2 °C / 75 ⁇ 5% Relative Humidity 98.42 98.32 96.54 96.40
  • Example 4 5 ⁇ 3 °C / ambient relative humidity 98.44 98.69 98.35 98.48 25 ⁇ 2 °C / 60 ⁇ 5% relative humidity 98.44 98.53 98.47 97.80 40 ⁇ 2 °C / 75 ⁇ 5% Relative Humidity 98.44 98.26 96.62 96.42
  • Example 7 5 ⁇ 3 °C / ambient relative humidity 98.46 98.59 98.39 98.33 25 ⁇ 2 °C / 60 ⁇ 5% relative
  • the content of antibody monomers was determined using SEC-HPLC for Examples 1, 4, and 7 and Comparative Examples 1, 7, 10, 13, 16, and 19.
  • Examples 1, 4, and 7 comprising histidine buffer, pH 6.0, 5% sorbitol, had a purity of at least 95%. While Comparative Examples 1, 7, 10, 13, 16, and 19, including acetic acid buffer or phosphate buffer, showed less than 95% purity. In addition, Comparative Example 7 including the acetic acid buffer of pH 4.0 has a relatively high proportion of fragments appearing behind the main peak on the chromatogram, Comparative Examples 16 and 17 containing the phosphate buffer on the chromatogram It was confirmed that the ratio of aggregates appearing in front of the main peak was relatively high (data not shown).
  • Example 1 5 ⁇ 3 °C / ambient relative humidity 99.17 99.12 99.23 99.10 25 ⁇ 2 °C / 60 ⁇ 5% relative humidity 99.17 99.08 99.23 98.80 40 ⁇ 2 °C / 75 ⁇ 5% Relative Humidity 99.17 96.91 96.12 95.69
  • Example 4 5 ⁇ 3 °C / ambient relative humidity 99.20 99.15 99.23 99.12 25 ⁇ 2 °C / 60 ⁇ 5% relative humidity 99.20 99.11 99.05 98.91 40 ⁇ 2 °C / 75 ⁇ 5% Relative Humidity 99.20 96.96 96.33 95.83
  • Example 7 5 ⁇ 3 °C / ambient relative humidity 99.20 99.17 99.27 99.17 25 ⁇ 2 °C / 60 ⁇ 5% relative humidity 99.20 99.11 99.08 98.92 40 ⁇ 2 °C
  • Antibody binding affinity was measured using ELISA and CELISA for Examples 1, 4, and 7 and Comparative Examples 1, 7, 10, 13, 16, and 19.
  • H1N1 and H3 (H3N2) subtypes were used to measure the binding ability of antibody 1 and antibody 2 by CELISA, and antibody 1 and HA to H5 (H5N1) subtypes.
  • the binding capacity of the antibody mixture of antibody 2 was measured by ELISA.
  • Example 1 the concentration of the antibody mixture was 150 mg / mL, and as a result of performing external appearance analysis, antibody concentration measurement, and the like, it was confirmed that the data was stable.
  • Example 1 the concentration of the polysorbate 80 was 0.01% and 1.0%, and the results of the external analysis, the antibody concentration measurement, and the like were confirmed to be stable (data not shown).
  • Example 1 the concentrations of sorbitol were 0.1% and 15%, and the results of the external analysis, antibody concentration measurement, and the like were confirmed to be stable (data not shown).
  • Example 1 the concentrations of histidine were set to 1 mM and 20 mM, and the results of the external analysis, the antibody concentration measurement, and the like were confirmed to be stable (data not shown).
  • surfactants serve to prevent surface adsorption or aggregation of antibodies.
  • the surfactant which is a polymer, may have a tendency to decrease gradually as the surfactant itself decomposes as the storage period becomes longer. Therefore, considering the rate at which the surfactant decomposes, it is necessary to use a high concentration in order for the surfactant to maintain its function for a long time as an inhibitor of surface adsorption and aggregation of the antibody. Accordingly, it was determined that the optimal condition was to include the highest content of 0.1% of the candidate liquid pharmaceutical formulations (data not shown).
  • Example 1 including histidine 10 mM, pH 6.0, 5% sorbitol, and 0.1% polysorbate 80.
  • Example 1 The stable liquid pharmaceutical formulation components of Example 1 were applied to antibodies 3 to 7 and mixtures thereof, in the same manner as in Experiment 2, 5 ⁇ 3 ° C./ambient relative humidity, 25 ⁇ 2 ° C./60 ⁇ 5% Relative humidity, stored at 40 ⁇ 2 °C / 75 ⁇ 5% relative humidity. After 2 weeks, 4 weeks, and 6 weeks at each temperature and humidity, the stability was confirmed that the stability of the single antibody and the antibody mixture was maintained in the same manner as in Example 1 for all the single antibodies and the antibody mixture (data not shown). ).
  • Example 1 50 mL of the stable liquid pharmaceutical formulation of Example 1 prepared by the method of Experimental Example 1 were stored in a sealed container at 5 ⁇ 3 ° C./ambient relative humidity. Stability was measured at this temperature and humidity for up to 12 months.
  • Example 1 In order to confirm the long-term stability of Example 1, appearance analysis, pH measurement, sterility test, antibody concentration measurement, determination of the content of intact immunoglobulin G using non-reducing CE-SDS, intact heavy and light chains using reduced CE-SDS The content measurement, the content measurement of the antibody monomer, and the binding affinity (H5N1 ELISA, H1N1 CELISA, and H3N2 CELISA) were performed and the results are shown in Tables 5 to 14.
  • Example 1 was found to be stable because the degree of vascular transparency was maintained after 12 months at 5 ⁇ 3 °C without any change in appearance.
  • Example 1 was found to be stable since the pH was kept constant after 12 months at 5 ⁇ 3 °C.
  • Example 1 was found to be stable because the sterile state was maintained after 12 months at 5 ⁇ 3 °C.
  • Example 1 was found to be stable because it was kept constant without changing the antibody concentration after 12 months at 5 ⁇ 3 °C.
  • Example 1 was found to be stable since the content of intact immunoglobulin G was maintained more than 97% after 12 months at 5 ⁇ 3 °C.
  • Example 1 was found to be stable since the content of intact heavy and light chains was maintained at a high content of 98% or more after 12 months at 5 ⁇ 3 °C.
  • Example 1 was found to be stable because after 12 months at 5 ⁇ 3 °C the content of the antibody monomer was maintained at a high content of more than 98%.
  • H5N1 ELISA, H1N1 CELISA, and H3N2 CELISA measurement results are shown in Tables 12 to 13 as follows.
  • Influenza A Virus HA (H5N1) Binding Affinity division 5 ⁇ 3 °C, 0 months later 5 ⁇ 3 °C, 3 months later 5 ⁇ 3 °C, 6 months later 5 ⁇ 3 °C, 9 months later 5 ⁇ 3 °C, 12 months later
  • H5N1 Influenza A Virus HA
  • Example 1 is stable because the H5N1 subtype binding affinity of influenza A virus HA is between 70-130% after 12 months at 5 ⁇ 3 °C.
  • Influenza A virus HA (H1N1) binding affinity (%) division 5 ⁇ 3 °C, 0 months later 5 ⁇ 3 °C, 3 months later 5 ⁇ 3 °C, 6 months later 5 ⁇ 3 °C, 9 months later 5 ⁇ 3 °C, 12 months later
  • H1N1 binding affinity
  • Example 1 was found to be stable because the H1N1 subtype binding affinity of influenza A virus HA after 12 months at 5 ⁇ 3 °C is between 70-130%.
  • Influenza A virus HA H3N2
  • binding affinity % division 5 ⁇ 3 °C, 0 months later 5 ⁇ 3 °C, 3 months later 5 ⁇ 3 °C, 6 months later 5 ⁇ 3 °C, 9 months later 5 ⁇ 3 °C, 12 months later
  • Example 1 was found to be stable since 12 months at 5 ⁇ 3 °C H3N2 subtype binding affinity of influenza A virus HA is between 70-130%.

Abstract

본 발명은 항-인플루엔자 바이러스 항체의 안정한 액체 약제학적 제제에 관한 것으로보다 상세하게는 (A) 항-인플루엔자 바이러스 항체 또는 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체 혼합물; (B) 계면활성제; (C) 당 또는 당의 유도체; 및 (D) 아미노산을 포함하는 안정한 액체 약제학적 제제에 관한 것이다. 본 발명의 항-인플루엔자 바이러스 항체의 안정한 액체 약제학적 제제는 저온(5 ℃), 상온(25 ℃), 및 고온(40 ℃) 보관 안정성과 장기간(12개월) 보관 안정성이 우수하며, 정맥내, 근육내, 피내, 피하내, 복막내 국소, 또는 이의 조합된 투여가 가능하다.

Description

항-인플루엔자 바이러스 항체의 안정한 액체 약제학적 제제
본 발명은 항-인플루엔자 바이러스 항체의 안정한 액체 약제학적 제제에 관한 것이다.
인플루엔자(influenza)는 인플루엔자 바이러스 감염에 의한 호흡기 질환으로 매년 겨울철에 유행을 일으키며, 특히 노인이나 소아들이 취약한 것으로 알려져 있다. 인플루엔자 바이러스는 A, B, C형으로 구분되며 그 중 A형과 B형이 사람이나 동물에게 전염된다. 인플루엔자 A 바이러스는 바이러스 표면에 존재하는 항원인 HA(Hemagglutinin)와 NA(Neuraminidase) subtype에 따라 더욱 세분화할 수 있으며(H1N1, H3N2 등), 인플루엔자 B 바이러스는 subtype에 따라 세분화되어 있지는 않다. 현재까지 알려진 A형 인플루엔자 바이러스의 HA 17종류, NA 10종류의 조합을 통해 여러 가지 서브타입을 가진 바이러스의 발생이 가능하다.
인플루엔자 바이러스의 유전자는 여러 개의 절편으로 구성되어 있는데, 단일 숙주에 두 개 이상의 다른 인플루엔자가 동시에 감염될 경우, 유전자의 재배열을 통하여 새로운 아형의 인플루엔자 바이러스가 발생될 수 있으며, 이러한 항원 대변이(Antigenic shift)는 예측이 불가능하기 때문에 현재의 백신으로는 방어가 힘들다. 따라서 이런 신종 인플루엔자에 대한 대응을 위하여 치료의 폭이 보다 넓은 인플루엔자 바이러스 치료제가 절실한 상황이다.
신규한 인플루엔자 바이러스 치료제로서, 한국특허출원 제10-2011-0020061호와 한국특허출원 제10-2012-0107512호의 개시된 항체는 주요한 계통발생 그룹1(H1, H2, H5, 및 H9)과 계통발생 그룹2(H3, H7)에 대한 중화 효과를 나타내었다. 또한 한국특허출원 제10-2014-0036601호는 상기 한국특허출원에서 개시된 2 종류 이상의 항체를 혼합한 조성물을 통해 계통발생 그룹 1 및 그룹 2에 속한 인플루엔자 바이러스에 대한 예방 및 치료 효과를 확인하였다.
상기의 치료 및 예방 효과가 우수한 항-인플루엔자 바이러스 항체가 예방 및 치료용 액체 약제학적 제제로 사용되기 위해서는 항체가 저온(5 ℃), 상온(25 ℃), 및 고온(40 ℃)에서 안정성을 가지면서, 항체의 응집 및 분해가 최소화된 안정한 제제(Formulation)의 개발이 필수적이다.
항체는 통상적인 유기 및 무기 약물에 비해 크고 복잡하기 때문에, 항체 조성물은 특별한 문제들을 지니고 있다. 항체 안정성은 이온 강도, pH, 온도, 동결/해동의 반복 주기, 항체 농도, 및 전단 응력과 같은 인자들에 의해 영향을 받을 수 있다. 활성 항체는 변성, 응집 (용해성 및 불용성 응집물의 형성), 침전, 및 흡착을 포함하는 물리적 불안정성과 라세미화, 베타-제거 또는 이황화 교환, 가수분해, 탈아미드화, 및 산화를 포함하는 화학적 불안정성에 의하여 손실이 발생할 수 있다. 상기 물리적 및 화학적 불안정성은 저하된 생물학적 활성, 증가된 독성, 및/또는 증가된 면역원성을 갖는 항체 부산물 또는 유도체의 형성을 잠재적으로 초래할 수 있다.
종래 기술에 항체의 안정한 액체 약제학적 제제의 개발에 사용될 수 있는 다양한 부형제 들이 제시되고 있지만, 항체마다 항체 고유의 물리화학적인 성질을 가지기 때문에, 제제 개발 시에 특정 항체가 가지는 특정 불안정성 문제들 극복하기 위한 부형제의 종류 및 양을 예측하는 것은 실질적으로 불가능하다. 또한, 특정 항체를 조성물 내에서 화학적으로 그리고 생물학적으로 안정하게 유지시키는, 항체 농도, pH, 및/또는 다른 부형제의 농도와 같은 최적 조건을 발견하는 것은 어려우며 많은 시간과 노력이 필요하다.
더욱이 2 이상의 서로 다른 항체 혼합물을 제제화하기 위한 적합한 부형제 및 최적의 조건을 발견하는 것 및 그 안정성을 증명하는 것은 각각의 항체의 안정성에 대하여 입증해야 하는 것은 물론, 혼합한 조성물의 안정성을 입증해야 하기 때문에 단일 항체를 제제화하는 것에 비해 몇 배의 어려움이 있다.
현재, 항-인플루엔자 바이러스 항체의 안정한 액체 약제학적 제제를 개시하는 선행기술은 존재하지 않는다.
따라서, 상기 항-인플루엔자 바이러스 항체를 포함하는 안정한 액체 약제학적 제제에 대한 필요성 및 보다 다양한 인플루엔자 바이러스 아형에 대한 진단, 예방, 또는 치료 효과를 제공하기 위하여, 항-인플루엔자 단일 항체 또는 서로 다른 두 가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체를 장기간 저장하여도 안정한 조성물에 대한 필요성이 존재하였다.
이에 상기의 문제점들을 해결하고자, 본 발명자들은 인플루엔자 바이러스 예방 또는 치료 효과가 확인된 항체 또는 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체 혼합물의 저온(5 ℃), 상온(25 ℃), 및 고온(40 ℃)에서 안정성과 장기간보관 안정성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 항-인플루엔자 바이러스 항체 또는 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체 혼합물을 포함하는 안정한 액체 약제학적 제제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 항-인플루엔자 바이러스 항체 또는 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체 혼합물을 포함하면서 저온(5 ℃), 상온(25 ℃), 및 고온(40 ℃) 보관 안정성과 장기간(12개월) 보관 안정성이 우수한 액체 약제학적 제제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 정맥내, 근육내, 피내, 피하내, 복막내, 국소, 또는 이의 조합된 투여가 가능한 항-인플루엔자 바이러스 항체 또는 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체 혼합물의 안정한 액체 약제학적 제제를 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하고자, 본 발명은 (A) 항-인플루엔자 바이러스 항체 또는 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체 혼합물; (B) 계면활성제; (C) 당 또는 당의 유도체; 및 (D) 아미노산을 포함하는 안정한 액체 약제학적 제제를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, (A) 항-인플루엔자 바이러스 항체 또는 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체 혼합물은 인플루엔자 Ａ 바이러스의 헤마글루티닌(HA) 단백질 내의 에피토프에 결합하는 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 항체는 인플루엔자 Ａ 바이러스의 헤마글루티닌(HA) 단백질의 줄기 영역(stem region) 내 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 항체의 에피토프는 i) HA1 폴리펩티드의 위치 18, 25, 27, 32, 33, 38, 40, 54, 55, 278, 291, 292, 310, 311, 312, 및 318 로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 잔기(residue); 및 ii) HA2 폴리펩티드의 위치 18, 19, 20, 21, 38, 39, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 52, 53, 56, 57, 58, 60, 및 99로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 잔기(residue)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 에피토프는 HA1 폴리펩티드의 위치 318의 아미노산 잔기를 포함하고, HA2 폴리펩티드의 위치 41, 42, 45, 48, 49, 52, 및 53의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 에피토프는 HA1 폴리펩티드의 위치 18, 38, 40, 291, 292, 및 318의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 또한, 상기 에피토프는 HA2 폴리펩티드의 위치 18, 19, 20, 21, 41, 42, 45, 48, 49, 52, 및 53의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 상기 에피토프는 HA1 폴리펩티드의 위치 18, 38, 40, 291, 292, 및 318의 아미노산 잔기를 포함하고, HA2 폴리펩티드의 위치 18, 19, 20, 21, 41, 42, 45, 48, 49, 52, 및 53의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 에피토프는 HA1 폴리펩티드의 위치 278 및 318의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 상기 에피토프는 HA2 폴리펩티드의 위치 38, 39, 41, 42, 45, 48, 49, 52, 및 53 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 상기 에피토프는 HA 제1 단량체(monomer)의 상기 HA1 폴리펩티드 및/또는 HA2 폴리펩티드의 위치의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 제1 단량체에 인접한 제2 단량체의 HA1 폴리펩티드의 위치 25, 32, 및 33 아미노산 잔기를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 에피토프는 HA1 폴리펩티드의 위치 278 및 318의 아미노산 잔기를 포함하고, HA2 폴리펩티드의 위치 38, 39, 41, 42, 45, 48, 49, 52, 및 53 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 상기 에피토프는 HA 제1 단량체의 상기 HA1 폴리펩티드 및 HA2폴리펩티드의 위치의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 제1 단량체에 인접한 제2 단량체의 HA1 폴리펩티드의 위치 25, 32, 및 33 아미노산 잔기를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 에피토프는 HA1 폴리펩티드의 위치 278 및 318의 아미노산 잔기를 포함하고, HA2 폴리펩티드의 위치 38, 39, 41, 42, 45, 48, 49, 52, 53, 58, 및 99의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 상기 에피토프는 HA 제1 단량체의 상기 HA1 폴리펩티드 및 HA2 폴리펩티드의 위치의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 제1 단량체에 인접한 제2 단량체의 HA1 폴리펩티드의 위치 25, 27, 32, 및 33 아미노산 잔기를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 에피토프는 HA1 폴리펩티드의 위치 54, 55, 278, 291 및 318의 아미노산 잔기를 포함하고, HA2 폴리펩티드의 위치 19, 20, 21, 38, 39, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 52, 53, 56, 57, 및 60의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 상기 에피토프는 HA 제1단량체의 상기 HA1 폴리펩티드 및 HA2 폴리펩티드의 위치의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 HA 제1단량체에 인접한 HA 제2 단량체의 HA1 폴리펩티드의 위치 25, 32, 33, 310, 311, 및 312의 아미노산 잔기를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서 (A) 항-인플루엔자 바이러스 항체는 i) 서열번호 1의 CDR1 영역, 서열번호 2의 CDR2 영역, 및 서열번호 3의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 4의 CDR1 영역, 서열번호 5의 CDR2 영역, 및 서열번호 6의 CDR3 영역영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체; ii) 서열번호 7의 CDR1 영역, 서열번호 8의 CDR2 영역, 및 서열번호 9의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 10의 CDR1 영역, 서열번호 11의 CDR2 영역, 및 서열번호 12의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체; iii) 서열번호 13의 CDR1 영역, 서열번호 14의 CDR2 영역, 및 서열번호 15의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 16의 CDR1 영역, 서열번호 17의 CDR2 영역, 및 서열번호 18의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체; iv) 서열번호 19의 CDR1 영역, 서열번호 20의 CDR2 영역, 및 서열번호 21의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 22의 CDR1 영역, 서열번호 23의 CDR2 영역, 및 서열번호 24의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체; v) 서열번호 25의 CDR1 영역, 서열번호 26의 CDR2 영역, 및 서열번호 27의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 28의 CDR1 영역, 서열번호 29의 CDR2 영역, 및 서열번호 30의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체; vi) 서열번호 31의 CDR1 영역, 서열번호 32의 CDR2 영역, 및 서열번호 33의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 34의 CDR1 영역, 서열번호 35의 CDR2 영역, 및 서열번호 36의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체; 및vii) 서열번호 37의 CDR1 영역, 서열번호 38의 CDR2 영역, 및 서열번호 39의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 40의 CDR1 영역, 서열번호 41의 CDR2 영역, 및 서열번호 42의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서 (A) 항-인플루엔자 바이러스 항체는 i) 서열번호 43의 폴리펩티드 서열의 경쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 44의 폴리펩티드 서열의 중쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체; ii) 서열번호 45의 폴리펩티드 서열의 경쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 46의 폴리펩티드 서열의 중쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체; iii) 서열번호 47의 폴리펩티드 서열의 경쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 48의 폴리펩티드 서열의 중쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체; iv) 서열번호 49의 폴리펩티드 서열의 경쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 50의 폴리펩티드 서열의 중쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체; v) 서열번호 51의 폴리펩티드 서열의 경쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 52의 폴리펩티드 서열의 중쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체; vi) 서열번호 53의 폴리펩티드 서열의 경쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 54의 폴리펩티드 서열의 중쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체; 및 vii) 서열번호 55의 폴리펩티드 서열의 경쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 56의 폴리펩티드 서열의 중쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서 (A) 항-인플루엔자 바이러스 항체는i) 서열번호 57의 폴리펩티드 서열의 경쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 및 서열번호 58의 폴리펩티드 서열의 중쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하는 항체; ii) 서열번호 59의 폴리펩티드 서열의 경쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 및 서열번호 60의 폴리펩티드 서열의 중쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하는 항체; iii) 서열번호 61의 폴리펩티드 서열의 경쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 및 서열번호 62의 폴리펩티드 서열의 중쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하는 항체; iv) 서열번호 63의 폴리펩티드 서열의 경쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 및 서열번호 64의 폴리펩티드 서열의 중쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하는 항체; v) 서열번호 65의 폴리펩티드 서열의 경쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 및 서열번호 66의 폴리펩티드 서열의 중쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하는 항체; vi) 서열번호 67의 폴리펩티드 서열의 경쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 및 서열번호 68의 폴리펩티드 서열의 중쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하는 항체; 및 vii) 서열번호 69의 폴리펩티드 서열의 경쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 및 서열번호 70의 폴리펩티드 서열의 중쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하는 항체 로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서 (A) 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체 혼합물은i) 서열번호 1의 CDR1 영역, 서열번호 2의 CDR2 영역, 및 서열번호 3의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 4의 CDR1 영역, 서열번호 5의 CDR2 영역, 및 서열번호 6의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체; 및 ii) 서열번호 7의 CDR1 영역, 서열번호 8의 CDR2 영역, 및 서열번호 9의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 10의 CDR1 영역, 서열번호 11의 CDR2 영역, 및 서열번호 12의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서 (A) 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체 혼합물은 i) 서열번호 43의 폴리펩티드 서열의 경쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 44의 폴리펩티드 서열의 중쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체; 및 ii) 서열번호 45의 폴리펩티드 서열의 경쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 46의 폴리펩티드 서열의 중쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서 (A) 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체 혼합물은 i) 서열번호 57의 폴리펩티드 서열의 경쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 및 서열번호 58의 폴리펩티드 서열의 중쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하는 항체; 및 ii) 서열번호 59의 폴리펩티드 서열의 경쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 및 서열번호 60의 폴리펩티드 서열의 중쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하는 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서 (A) 항-인플루엔자 바이러스 항체는 제넨텍 사의 MHAA4549A 항체; 메디이뮨 사의 MEDI8852 항체; 크루셀 사의 CR6261 항체, CR8020 항체, CR9114항체, CR8033 항체, CR8071 항체; 다나-파버 암 연구소의 F10 항체; 비스테라 사의 VIS410 항체; 테라클론 사이언시스 사의 TCN-032 항체; 및/또는 스위스 바이오의학연구소(IRB)의 FI6 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서 (A) 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체 혼합물이 서로 다른 2가지 항체의 혼합물일 때, 서로 다른 2 가지 항체들의 혼합비가 9:1 내지 1:9일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, (A) 항-인플루엔자 바이러스 항체 또는 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체 혼합물의 농도는 10 내지 150 mg/mL일 수 있다.
본 발명의 일 구현예어서, (B) 계면활성제는 폴리소르베이트, 폴록사머, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예서, (B) 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80, 또는 이들 중 2 이상의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, (B) 계면활성제는 폴리소르베이트 80을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현에서, (B) 계면활성제의 농도는 0.01 내지 1.0 %(w/v)일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, (C) 당은 단당류, 이당류, 올리고당, 다당류, 또는 이들 중 2 이상의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, (C) 당의 유도체는 당 알코올, 당 산, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, (C) 당은 단당류, 이당류, 올리고당, 다당류, 또는 이들 중 2 이상의 혼합물을 포함하고, (C) 당의 유도체는 당 알코올, 당 산, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, (C) 당 또는 당의 유도체는 소르비톨, 만니톨, 트레할로스, 수크로오스, 또는 이들 중 2 이상의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, (C) 당 또는 당의 유도체의 농도는 0.1 내지 15 %(w/v)일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, (D) 아미노산은 유리 아미노산, 아미노산염, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, (D) 아미노산은 아스파르트산, 히스티딘, 리신, 아르기닌, 또는 이들의 염을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, (D) 아미노산은 히스티딘, 히스티딘염, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, (D) 아미노산의 농도는 1 내지 20 mM일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, pH가 5.5 내지 6.5일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 40±2 ℃에서 6주간 보관한 후 측정한 항체 모노머 순도가 95% 이상일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 5±3 ℃/주변 상대 습도조건에서 3개월 이상 보관한 후 측정한 항체 모노머 순도가 95 % 이상일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 5±3 ℃/주변 상대 습도조건에서 6개월 이상 보관한 후 측정한 항체 모노머 순도가 95 % 이상일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 안정한 액체 약제학적 제제는 정맥내, 근육내, 피내, 피하내, 복막내, 국소, 또는 이의 조합된 투여용일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 프리-필드 시린지(pre-filled syringe)는 상기 안정한 액체 약제학적 제제가 충진된다.
본 발명의 일 구현예에서, 자동 주사기(auto-injector)는 상기 프리-필드 시린지가 그 내부에 포함된다.
본 발명의 일 구현예에서, 키트는 상기 안정한 액체 약제학적 제제 및 용기를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 안정한 액체 약제학적 제제는 인플루엔자 바이러스 예방, 진단 또는 치료용일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 안정한 액체 약제학적 제제를 제조하는 방법일 수 있다.
본 발명에 따른 항-인플루엔자 바이러스 항체의 안정한 액체 약제학적 제제는 저온(5 ℃), 상온(25 ℃), 및 고온(40 ℃) 보관 안정성과 장기간(12개월) 보관 안정성이 우수하며, 정맥내, 근육내, 피내, 피하내, 복막내 국소, 또는 이의 조합된 투여가 가능하다.
[안정한 액체 약제학적 제제]
본 발명에 따른 안정한 액체 약제학적 제제는 (A) 항-인플루엔자 바이러스 항체 또는 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체 혼합물; (B) 계면활성제; (C) 당 또는 당의 유도체; 및 (D) 아미노산을 포함할 수 있다.
(A) 항-인플루엔자 바이러스 항체 또는 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체 혼합물
본 발명에서 “항체”는 그의 가장 넓은 의미로 사용되고 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 재조합 항체, 단일쇄 항체, 하이브리드 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 또는 이들의 단편을 포함할 수 있다. 기타 변화된 구조를 갖는 자연 발생 항체, 예를 들어 카멜리드 항체도 이 정의에 포함된다. 온전한(intact) 항체는 2개의 중쇄(Heavy Chain) 및 2개의 경쇄(Light Chain)가 디설파이드 결합에 의해 서로 연결되어 있는 4개의 폴리펩타이드쇄로 이루어진 면역글로불린 분자를 가리킨다. 항체의 단편은 특히 Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dAb, Fd, 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 단일-쇄 항체(scFv), 2가(bivalent) 단일-쇄 항체, 단일-쇄 파지 항체, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 폴리펩티드로의 특정 항원에 결합하기에 충분한 이뮤노글로브린의 하나 이상의 단편을 함유하는 폴리펩티드 등을 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변영역 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변영역 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인(CL)으로 이루어진다. 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역은, 골격 영역(FR)으로 불리는 보다 보존된 영역과 함께 배치된, 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 초가변성 영역으로 더욱 세분될 수 있다. 각각의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어지고, 이들은 아미노 말단에서 카복시 말단까지 하기의 순서로 배열되어 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
본 발명에서 가변영역의 CDR은 Kabat 등에 의해 고안된 시스템에 따라 통상적인 방법으로 결정되었다(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th), National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 본 발명에 사용된 CDR 넘버링은 Kabat 방법을 사용했지만, 이외에 IMGT 방법, Chothia 방법, AbM 방법 등 다른 방법에 따라 결정된 CDR을 포함하는 항체도 본 발명에 포함된다.
본 발명에서 항체는 항체의 기능적 변이체를 포함한다. 항체의 기능적 변이체 들이 인플루엔자 바이러스에 특이적으로 결합하기 위해 본 발명의 항체와 경쟁할 수 있다면, 본 발명의 항체의 기능적 변이체로 간주된다. 기능적 변이체는 1차 구조적 서열이 실질적으로 유사한 유도체를 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 기능적 변이체는 선택적으로 부모 항체의 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 삽입, 결실, 또는 그들의 조합을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 항체일 수 있다. 더욱이 기능적 변이체는 아미노 말단 또는 카르복시 말단 중 하나 또는 모두에서 아미노산 서열의 절단체(truncated form)를 포함할 수 있다. 본 발명의 기능적 변이체는 본 발명의 부모 항체와 비교하여 동일하거나 다르거나, 더 높거나 낮은 결합 친화력을 가질 수 있지만, 여전히 인플루엔자 바이러스에 결합할 수 있다. 본 발명의 범위에 속하는 기능적 변이체는 본 명세서의 개시된 항체와 약 50 ~ 99 %, 약 60 ~ 99 %, 약 80 ~ 99 %, 약 90 ~ 99 %, 약 95 ~ 99 %, 또는 약 97 ~ 99 % 아미노산 서열 동질성을 가질 수 있다. 비교될 아미노산 서열을 최적으로 배열하고 유사하거나 또는 동일한 아미노산 잔기를 정의하기 위해 컴퓨터 알고리즘 중 당업자에게 알려진 Gap 또는 Bestfit 등을 사용할 수 있다. 기능적 변이체는 부모 항체 또는 그것의 일부를 PCR 방법, 올리고머 뉴클레오티드를 이용한 돌연변이 생성 및 부분 돌연변이 생성을 포함하는 공지의 일반 분자생물학적 방법에 의해 변화시키거나 유기합성 방법으로 얻을 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 “항체의 종류"는 그의 중쇄에 의해 소유된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형으로 분류될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 항체의 5개의 주요 종류, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 존재하며, 이들 중 다수는 하위부류(아이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다.
본 발명에서 "에피토프"는 에피토프는 항원을 표적화하는 항체에 의해 결합되는 상기 항원의 영역이며, 상기 항체와 직접 접촉하는 특정한 아미노산들을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어 에피토프는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐기와 같은 분자의 화학 활성 표면 그룹을 포함할 수 있으며, 특정한 3차원 구조 특징 및/또는 특정한 전하 특징일 수 있다.
본 발명에서 "인플루엔자 A 바이러스(influenza A virus)"는 오르쏘믹소바이러스 (Orthomyxoviridae)에 속하는 외피 보유 바이러스(enveloped virus)로 8개의 분절로 된 음성-극성 및 단일 가닥(Negative-sense, single-strand)의RNA(ribonucleic acid)를 유전체로 가지고, A, B, 및 C 그룹으로 분류되며, 주요 표면 단백질인HA(hemaggutinin)와 NA(neuraminidase)에 따라 다시 여러 서브타입(subtype)으로 나뉜다. 현재까지 17종의 HA와 10종의 NA가 알려져 있다.
본 발명에서 "헤마글루티닌(hemagglutinin, 이하 "HA"라 칭함)"은 인플루엔자 바이러스의 외피(envelope) 당단백질을 나타낸다. HA는 인플루엔자 바이러스가 숙주 세포에 흡착하여 침투하는 것을 매개한다. 현재까지 17 종류의 서브타입이 보고되어 있다.
본 발명에서 "H1 서브타입"에는 H1N1, H1N2, H1N3, H1N4, H1N5, H1N6, H1N7, H1N8, H1N9, 및 H1N10이 포함된다.
본 발명에서 "H2 서브타입"에는 H2N1, H2N2, H2N3, H2N4, H2N5, H2N6, H2N7, H2N8, H2N9, 및 H2N10 이 포함된다.
본 발명에서 "H5 서브타입"에는 H5N1, H5N2, H5N3, H5N4, H5N5, H5N6, H5N7, H5N8, H5N9, 및 H5N10 이 포함된다.
본 발명에서 "H9 서브타입"에는 H9N1, H9N2, H9N3, H9N4, H9N5, H9N6, H9N7, H9N8, H9N9, 및 H9N10 이 포함된다.
본 발명에서 "H3 서브타입"에는 H3N1, H3N2, H3N3, H3N4, H3N5, H3N6, H3N7, H3N8, H3N9, 및 H3N10 이 포함된다.
본 발명에서 "H7 서브타입"에는 H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N5, H7N6, H7N7, H7N8, H7N9, 및 H7N10 이 포함된다.
본 발명의 일 구현예에서, "항체"는 인플루엔자 바이러스에 결합 또는 인플루엔자 바이러스를 중화 시키는 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, "항체 혼합물"는 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 항-인플루엔자 바이러스 항체 또는 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체 혼합물은 인플루엔자 Ａ 바이러스에 결합하는 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예에서, 항-인플루엔자 바이러스 항체 또는 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체 혼합물은 인플루엔자 Ａ 바이러스의 헤마글루티닌(HA) 단백질에 결합하는 항체를 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 일 구현예에서, 항-인플루엔자 바이러스 항체 또는 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체 혼합물은 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌(HA) 단백질의 줄기 영역(stem region) 또는 이의 에피토프에 결합하는 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 항체의 에피토프는 i) HA1 폴리펩티드의 위치 18, 25, 27, 32, 33, 38, 40, 54, 55, 278, 291, 292, 310, 311, 312, 및 318 로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 잔기(residue); 및 ii) HA2 폴리펩티드의 위치 18, 19, 20, 21, 38, 39, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 52, 53, 56, 57, 58, 60, 및 99로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 잔기(residue)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 에피토프는 HA1 폴리펩티드의 위치 318의 아미노산 잔기(residue)를 포함하고, HA2 폴리펩티드의 위치 41, 42, 45, 48, 49, 52, 및 53의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 에피토프는 HA1 폴리펩티드의 위치 18, 38, 40, 291, 292 및 31의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 또한, 상기 에피토프는 HA2 폴리펩티드의 위치 18, 19, 20, 21, 41, 42, 45, 48, 49, 52 및 53의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 상기 에피토프는 HA1 폴리펩티드의 위치 18, 38, 40, 291, 292 및 318의 아미노산 잔기를 포함하고, HA2 폴리펩티드의 위치 18, 19, 20, 21, 41, 42, 45, 48, 49, 52 및 53의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 에피토프는 HA1 폴리펩티드의 위치 278 및 318의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 상기 에피토프는 HA2 폴리펩티드의 위치 38, 39, 41, 42, 45, 48, 49, 52, 및 53 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 상기 에피토프는 HA 제1 단량체(monomer)의 상기 HA1 폴리펩티드 및/또는 HA2 폴리펩티드의 위치의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 제1 단량체에 인접한 제2 단량체의 HA1 폴리펩티드의 위치 25, 32 및 33 아미노산 잔기를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 에피토프는 HA1 폴리펩티드의 위치 278 및 318의 아미노산 잔기를 포함하고, HA2 폴리펩티드의 위치 38, 39, 41, 42, 45, 48, 49, 52, 및 53 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 상기 에피토프는 HA 제1 단량체의 상기 HA1 폴리펩티드 및 HA2폴리펩티드의 위치의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 제1 단량체에 인접한 제2 단량체의 HA1 폴리펩티드의 위치 25, 32 및 33 아미노산 잔기를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 에피토프는 HA1 폴리펩티드의 위치 278 및 318의 아미노산 잔기를 포함하고, HA2 폴리펩티드의 위치 38, 39, 41, 42, 45, 48, 49, 52, 53, 58 및 99의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 상기 에피토프는 HA 제1 단량체의 상기 HA1 폴리펩티드 및 HA2 폴리펩티드의 위치의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 제1 단량체에 인접한 제2 단량체의 HA1 폴리펩티드의 위치 25, 27, 32 및 33 아미노산 잔기를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 에피토프는 HA1 폴리펩티드의 위치 54, 55, 278, 291 및 318의 아미노산 잔기를 포함하고, HA2 폴리펩티드의 위치 19, 20, 21, 38, 39, 41, 42, 45, 46, 48, 49, 52, 53, 56, 57 및 60의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 상기 에피토프는 HA 제1단량체의 상기 HA1 폴리펩티드 및 HA2 폴리펩티드의 위치의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 HA 제1단량체에 인접한 HA 제2 단량체의 HA1 폴리펩티드의 위치 25, 32, 33, 310, 311, 및 312의 아미노산 잔기를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 항-인플루엔자 바이러스 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 재조합 항체, 단일쇄 항체, 하이브리드 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 또는 이들의 단편을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예에서, 항-인플루엔자 바이러스 항체는 인간 항체를 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 일 구현예에서, 항-인플루엔자 바이러스 항체는 항체의 IgG 분류에 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서 항-인플루엔자 바이러스 항체는 i) 서열번호 1의 CDR1 영역, 서열번호 2의 CDR2 영역, 및 서열번호 3의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 4의 CDR1 영역, 서열번호 5의 CDR2 영역, 및 서열번호 6의 CDR3 영역영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체; ii) 서열번호 7의 CDR1 영역, 서열번호 8의 CDR2 영역, 및 서열번호 9의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 10의 CDR1 영역, 서열번호 11의 CDR2 영역, 및 서열번호 12의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체; iii) 서열번호 13의 CDR1 영역, 서열번호 14의 CDR2 영역, 및 서열번호 15의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 16의 CDR1 영역, 서열번호 17의 CDR2 영역, 및 서열번호 18의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체; iv) 서열번호 19의 CDR1 영역, 서열번호 20의 CDR2 영역, 및 서열번호 21의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 22의 CDR1 영역, 서열번호 23의 CDR2 영역, 및 서열번호 24의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체; v) 서열번호 25의 CDR1 영역, 서열번호 26의 CDR2 영역, 및 서열번호 27의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 28의 CDR1 영역, 서열번호 29의 CDR2 영역, 및 서열번호 30의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체; vi) 서열번호 31의 CDR1 영역, 서열번호 32의 CDR2 영역, 및 서열번호 33의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 34의 CDR1 영역, 서열번호 35의 CDR2 영역, 및 서열번호 36의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체; 및vii) 서열번호 37의 CDR1 영역, 서열번호 38의 CDR2 영역, 및 서열번호 39의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 40의 CDR1 영역, 서열번호 41의 CDR2 영역, 및 서열번호 42의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서 항-인플루엔자 바이러스 항체는 i) 서열번호 43의 폴리펩티드 서열의 경쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 44의 폴리펩티드 서열의 중쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체; ii) 서열번호 45의 폴리펩티드 서열의 경쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 46의 폴리펩티드 서열의 중쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체; iii) 서열번호 47의 폴리펩티드 서열의 경쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 48의 폴리펩티드 서열의 중쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체; iv) 서열번호 49의 폴리펩티드 서열의 경쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 50의 폴리펩티드 서열의 중쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체; v) 서열번호 51의 폴리펩티드 서열의 경쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 52의 폴리펩티드 서열의 중쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체; vi) 서열번호 53의 폴리펩티드 서열의 경쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 54의 폴리펩티드 서열의 중쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체; 및 vii) 서열번호 55의 폴리펩티드 서열의 경쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 56의 폴리펩티드 서열의 중쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서 항-인플루엔자 바이러스 항체는i) 서열번호 57의 폴리펩티드 서열의 경쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 및 서열번호 58의 폴리펩티드 서열의 중쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하는 항체; ii) 서열번호 59의 폴리펩티드 서열의 경쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 및 서열번호 60의 폴리펩티드 서열의 중쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하는 항체; iii) 서열번호 61의 폴리펩티드 서열의 경쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 및 서열번호 62의 폴리펩티드 서열의 중쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하는 항체; iv) 서열번호 63의 폴리펩티드 서열의 경쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 및 서열번호 64의 폴리펩티드 서열의 중쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하는 항체; v) 서열번호 65의 폴리펩티드 서열의 경쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 및 서열번호 66의 폴리펩티드 서열의 중쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하는 항체; vi) 서열번호 67의 폴리펩티드 서열의 경쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 및 서열번호 68의 폴리펩티드 서열의 중쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하는 항체; 및 vii) 서열번호 69의 폴리펩티드 서열의 경쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 및 서열번호 70의 폴리펩티드 서열의 중쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하는 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체 혼합물은i) 서열번호 1의 CDR1 영역, 서열번호 2의 CDR2 영역, 및 서열번호 3의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 4의 CDR1 영역, 서열번호 5의 CDR2 영역, 및 서열번호 6의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체; 및 ii) 서열번호 7의 CDR1 영역, 서열번호 8의 CDR2 영역, 및 서열번호 9의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 10의 CDR1 영역, 서열번호 11의 CDR2 영역, 및 서열번호 12의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체 혼합물은 i) 서열번호 43의 폴리펩티드 서열의 경쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 44의 폴리펩티드 서열의 중쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체; 및 ii) 서열번호 45의 폴리펩티드 서열의 경쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 46의 폴리펩티드 서열의 중쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체 혼합물은 i) 서열번호 57의 폴리펩티드 서열의 경쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 및 서열번호 58의 폴리펩티드 서열의 중쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하는 항체; 및 ii) 서열번호 59의 폴리펩티드 서열의 경쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 및 서열번호 60의 폴리펩티드 서열의 중쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하는 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체 혼합물이 서로 다른 2가지 항체의 혼합물일 때, 서로 다른 2 가지 항체들의 혼합비가 9:1 내지 1:9일 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 혼합비가 4:1 내지 1:4일 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 혼합비가 1:1일 수 있다. 상기 혼합비가 이 범위 내인 경우, 액체 약제학적 제제의 안정성을 우수하게 나타낼 수 있다. 상기 혼합비는 본 발명에 따른 안정한 액체 약제학적 제제의 안정성에 악영향을 실질적으로 미치지 않는 범위 내에서 자유롭게 조절할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 항-인플루엔자 바이러스 항체 또는 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체 혼합물의 농도는 5 내지 200 mg/mL일 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 농도가 10 내지 150 mg/mL일 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 농도가 20 내지 100 mg/mL일 수 있다. 상기 농도가 이 범위 내인 경우, 장기간 안정성을 우수하게 나타낼 수 있다. 상기 농도는 본 발명에 따른 안정한 액체 약제학적 제제의 안정성에 악영향을 실질적으로 미치지 않는 범위 내에서 자유롭게 조절할 수 있다.
(B) 계면활성제
본 발명에서 “계면활성제”는 폴리옥시에틸렌소르비탄지방산에스테르 (예를 들면, 폴리소르베이트(Polysorbate)), 폴리옥시에틸렌알킬에테르 (예들 들면, 브리지(Brij)), 알킬페닐폴리옥시에틸렌에테르 (예를 들면, 트리톤-X(Triton-X)), 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 코폴리머 (예를 들면, 폴록사머(Poloxamer), 플루로닉(Pluronic)), 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 등이 있으며 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트, 폴록사머, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 일 구현예서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80, 또는 이들 중 2 이상의 혼합물을 포함할 수 있다. 발명의 다른 일 구현예에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현에서, 계면활성제의 농도는 0.001 내지 10 %(w/v) 일 수 있다. 본 발명의 다른 일 구현예에서, 상기 농도는0.01 내지 1.0 %(w/v)일 수 있다. 본 발명의 또 다른 일 구현예에서, 상기 농도는0.05 내지 0.5 %(w/v)일 수 있다. 상기 농도가 이 범위 내인 경우, 액체 약제학적 제제의 안정성을 우수하게 나타낼 수 있다. 상기 농도는 본 발명에 따른 안정한 액체 약제학적 제제의 안정성에 악영향을 실질적으로 미치지 않는 범위 내에서 자유롭게 조절할 수 있다.
(C) 당 또는 당의 유도체
본 발명에서 “당”은 단당류, 이당류, 올리고당, 다당류, 또는 이들 중 2 이상의 혼합물을 포함할 수 있다. 단당류의 예로는 글루코스, 프룩토스, 갈락토스 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 이당류의 예로는 수크로오스, 락토스, 말토스, 트레할로스 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 올리고당의 예로는 프룩토올리고당, 갈락토올릭고당, 만난올리고당 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 다당류의 예로는 전분, 글리코겐, 셀룰로스, 키틴, 펙틴 등이 있으며 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 “당의 유도체”는 당 알코올, 당 산, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 당 알코올의 예로는 글리세롤, 에리스리톨, 트레이톨, 아라비톨, 자이리톨, 리비톨, 만니톨, 소르비톨, 갈락티톨, 푸시톨, 이디톨, 이노시톨, 볼레미톨, 아이소말트, 말티톨, 락티톨, 말토트리이톨, 말토테트라이톨, 폴리글리시톨 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 당 산의 예로는 알돈산(글리세르산 등), 울로손산(뉴라민산 등), 우론산(글루쿠론산 등), 알다르산(타르타르산 등) 등이 있으며 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 당은 단당류, 이당류, 올리고당, 다당류, 또는 이들 중 2 이상의 혼합물을 포함하고, 당의 유도체는 당 알코올, 당 산, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 당 또는 당의 유도체는 소르비톨, 만니톨, 트레할로스, 수크로오스, 또는 이들 중 2 이상의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 당 또는 당의 유도체의 농도는 0.01 내지 30 %(w/v) 일 수 있다. 본 발명의 다른 일 구현예에서, 상기 농도는 0.1 내지 15 %(w/v)일 수 있다. 본 발명의 또 다른 일 구현예에서, 상기 농도는1.0 내지 10 %(w/v)일 수 있다. 상기 농도가 이 범위 내인 경우, 액체 약제학적 제제의 안정성을 우수하게 나타낼 수 있다. 상기 농도는 본 발명에 따른 안정한 액체 약제학적 제제의 안정성에 악영향을 실질적으로 미치지 않는 범위 내에서 자유롭게 조절할 수 있다.
(D) 아미노산
본 발명에서 “아미노산”은 유리 아미노산, 아미노산염, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 상기 유리 아미노산(free amino acid)은 아미노산 간의 펩타이드 결합 또는 아미노산과 다른 분자와의 사이에서 에스터르(ester)결합 등을 하지 않는 유리상태의 아미노산을 의미한다. 아미노산의 예로서는 아스파르트산, 히스티딘, 리신, 아르기닌 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 아미노산염의 예로서는 아스파르트산염, 히스티딘염, 리신염, 아르기닌염 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 아미노산은 아스파르트산, 히스티딘, 리신, 아르기닌, 또는 이들의 염을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 일 구현예에서, 아미노산은 히스티딘, 히스티딘염, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에서, 아미노산은 히스티딘 및 히스티딘-HCl의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 아미노산은 아미노산, 아미노산염, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에서, 상기 아미노산은 완충제일 수 있다.
상기 “완충제”는 산이나 알칼리에 의한 pH의 변화를 최소화시키는 중화성 물질을 의미하며 pH 조절제 없이도 특정 범위의 pH를 유지시키는 물질을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에서, 아미노산의 농도는 0.1 내지 40 mM 일 수 있다. 본 발명의 다른 일 구현예에서, 상기 농도는 1 내지 20 mM 일 수 있다. 본 발명의 또 다른 일 구현예에서, 상기 농도는 5 내지 15 mM 일 수 있다. 상기 농도가 이 범위 내인 경우, 액체 약제학적 제제의 안정성을 우수하게 나타낼 수 있다. 상기 농도는 본 발명에 따른 안정한 액체 약제학적 제제의 안정성에 악영향을 실질적으로 미치지 않는 범위 내에서 자유롭게 조절할 수 있다.
(E) pH
본 발명에서 안정한 액체 약제학적 제제의 pH는 5.5 내지 6.5일 수 있다. pH가 이 범위 내에 있는 경우, 장기간 안정성을 우수하게 나타낼 수 있다. pH는 완충제 또는 아미노산을 이용하여 조절할 수 있다. 다시 말해서, 완충제 또는 아미노산을 소량으로 포함하는 경우 별도의 pH 조절제 없이도 상기 범위의 pH를 나타낼 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예어서, 상기 pH는 추가적인 pH 조절제로 조절할 수 있다. pH 조절제는 산 또는 염기(예를 들면, 수산화나트륨) 등이 있으며 이에 제한되지 않는다.
(F) 기타 성분
본 발명의 안정한 액체 약제학적 제제는 항체의 활성, 제제의 안정성에 악영향을 실질적으로 미치지 않는 범위 내에서 당해 기술분야에서 공지된 첨가제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예에서, 상기 첨가제는 추가 완충제, 희석제, 용해제, pH 조절제, 진정제, 다른 무기 또는 유기 염, 산화방지제, 수성 담체, 또는 이들의 혼합물 등을 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 또 다른 일 구현예에서, 수성 담체, 산화방지제, 또는 이들 중 2 이상의 혼합물을 더 포함할 수 있다. 수성 담체는 제약상 허용되고(인간에게 투여시 안전하고 무독성이고), 액체 약제학적 제제의 제조에 유용한 담체를 포함할 수 있다.
(G) “안정한” 액체 약제학적 제제
본 발명의 "안정한" 액체 약제학적 제제에서 용어 “안정한”은 본 발명에 따른 항체가 제조 공정 동안 및/또는 보관/저장 시에 이의 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 실질적으로 보유하는 것을 의미한다. 항체의 안정성을 측정하는 다양한 분석학적 기술은 당해 기술분야에서 용이하게 이용할 수 있다.
본 발명에서 “물리적 안정성”은 당해 기술분야에 공지된 방법으로 평가할 수 있으며, 이러한 방법은 광(흡광 또는 광학 밀도)의 샘플 겉보기 감쇠 측정 등을 포함할 수 있다. 이러한 광 감쇠 측정은 제제의 탁도와 관련된다. 또한, 물리적 안정성에 대해 고분자량 성분 함량, 저분자량 성분 함량, 온전한 단백질량, 불용성 이물 입자 수 등을 측정할 수 있다.
본 발명에서 “화학적 안정성”은, 당해 기술분야에 공지된 방법으로 평가할 수 있으며, 이러한 방법은 화학적으로 변화된 형태의 항체를 검출하고 정량화하는 평가 등을 포함할 수 있다. 또한 화학적 안정성에 대해 이온 교환 크로마토그래피을 이용한 전하 변형체(예를 들면, 탈아미드화 또는 산화의 결과로서 발생) 등을 측정할 수 있다. 상기 이온 교환 크로마토그래피를 이용한 전하 변형체 측정은 산성 또는 염기성 피크 등을 통해 측정할 수 있다.
본 발명에서 “저장 안정성”은 예를 들어 운반 중, 변경된 기후 조건, 상승된 온도 및 대기 습도 환경, 전단 응력이 작용 환경 등의 경우에도 항체가 생물학적 활성을 실질적으로 보유하는 것을 의미한다. 상기 저장 안정성은 장기간 상승된 온도 및 대기 습도 환경 등에서 황체의 생물학적 활성을 측정하는 다양한 분석법을 통해 측정할 수 있다.
본 발명에서 “생물학적 활성”은 당해 기술분야에 공지된 방법으로 평가할 수 있으며, 이러한 방법은 ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)를 통해 항원 결합 친화도를 측정 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 액체 약제학적 제제는 장기간 동안 안정할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 용어 “안정한” 액체 약제학적 제제는 다음 중 하나 이상을 만족하는 액체 약제학적 제제를 의미한다.
외관 분석
- 온도 40±2 ℃, 상대습도 75±5 %, 및 밀폐 조건에서 6주 동안 보관한 후 유관상 투명한 정도가 유지되는 액체 약제학적 제제;
- 온도 5±3 ℃, 주변 습도, 및 밀폐 조건에서 12개월 보관 후 유관상 투명한 정도가 유지되는 액체 약제학적 제제;
pH
- 온도 5±3 ℃, 주변 습도, 및 밀폐 조건에서 12개월 보관 후 pH측정 결과 6.0±0.5를 만족하는 액체 약제학적 제제;
무균 상태
- 온도 5±3 ℃, 주변 습도, 및 밀폐 조건에서 12개월 보관 후 아이솔레이터 (Isolaotor) 내에서 배지의 미생물이 자라지 않는 액체 약제학적 제제;
항체 농도
- 온도 5±3 ℃, 주변 습도, 및 밀폐 조건에서 6주 동안 보관한 후 HIC-HPLC로 측정한 단일 항체의 농도가 50±5.0 mg/mL 이거나, 항체 혼합물을 구성하는 단일 항체의 각각의 농도가 25±2.5 mg/mL 이고 항체 혼합물의 농도가 50±5.0 mg/mL인 액체 약제학적 제제;
- 온도 25±2 ℃, 상대습도 60±5 %, 및 밀폐 조건에서 6주 동안 보관한 후 HIC-HPLC로 측정한 단일 항체의 농도가 50±5.0 mg/mL 이거나, 항체 혼합물을 구성하는 단일 항체의 각각의 농도가 25±2.5 mg/mL 이고 항체 혼합물의 농도가 50±5.0 mg/mL 인 액체 약제학적 제제;
- 온도 40±2 ℃, 상대습도 75±5 %, 및 밀폐 조건에서 6주 동안 보관한 후 HIC-HPLC로 측정한 단일 항체의 농도가 50±5.0 mg/mL 이거나, 항체 혼합물을 구성하는 단일 항체의 각각의 농도가 25±2.5 mg/mL이고 항체 혼합물의 농도가 50±5.0 mg/mL인 액체 약제학적 제제;
- 온도 5±3 ℃, 주변 습도, 및 밀폐 조건에서 12개월 동안 보관한 후 HIC-HPLC로 측정한 단일 항체의 농도가 50±5.0 mg/mL 이거나, 항체 혼합물을 구성하는 단일 항체의 각각의 농도가 25±2.5 mg/mL 이고 항체 혼합물의 농도가 50±5.0 mg/mL인 액체 약제학적 제제;
온전한 면역글로불린 G의 함량(Intact IgG% )
- 온도 40±2 ℃, 상대습도 75±5 % 및 밀폐 조건에서 6주 동안 보관한 후 Chip-based CE-SDS로 측정한 온전한 면역글로불린 G의 함량(Intact IgG %)이 95.0 내지 100 %인 액체 약제학적 제제;
- 온도 5±3 ℃, 주변 습도, 및 밀폐 조건에서 12개월 동안 보관한 후 비환원 CE-SDS로 측정한 온전한 면역글로불린 G의 함량(Intact IgG %)이 90.0 내지 100 %인 액체 약제학적 제제;
온전한 중쇄 및 경쇄의 함량 (Intact HC+ LC% )
- 온도 5±3 ℃, 주변 습도, 및 밀폐 조건에서 12개월 동안 보관한 후 환원 CE-SDS로 측정한 온전한 경쇄 및 중쇄의 함량(Intact HC+LC %)이 95.0 내지 100 %인 액체 약제학적 제제;
항체 모노머의 함량
- 온도 40±2 ℃, 상대습도 75±5 %, 및 밀폐 조건에서 6주 동안 보관한 후 SEC-HPLC로 측정한 항체 모노머의 함량이 95.0 내지 100 %인 액체 약제학적 제제;
- 온도 5±3 ℃, 주변 습도, 및 밀폐 조건에서 12개월 동안 보관한 후 SEC-HPLC로 측정한 항체 모노머의 함량이 95.0 내지 100 %인 액체 약제학적 제제;
인플루엔자 A 바이러스 HA결합 친화도
- 온도 5±3 ℃, 주변 습도, 및 밀폐 조건에서 6주 동안 보관한 후 CELISA(Cellular Enzyme-Linked Immunosorbent assay) 또는 ELISA로 측정한 HA결합 친화도가 70 내지 130%인 액체 약제학적 제제;
- 온도 25±2 ℃, 상대습도 60±5%, 및 밀폐 조건에서 6주 동안 보관한 후 CELISA(Cellular Enzyme-Linked Immunosorbent assay) 또는 ELISA로 측정한 HA결합 친화도가 70 내지 130 %인 액체 약제학적 제제;
- 온도 40±2 ℃, 상대습도 75±5%, 및 밀폐 조건에서 6주 동안 보관한 후 CELISA(Cellular Enzyme-Linked Immunosorbent assay) 또는 ELISA로 측정한 HA결합 친화도가 70 내지 130%인 액체 약제학적 제제
- 온도 5±3 ℃, 주변 습도, 및 밀폐 조건에서 12개월 동안 보관한 후 CELISA(Cellular Enzyme-Linked Immunosorbent assay) 또는 ELISA로 측정한 HA결합 친화도가 70 내지 130 %인 액체 약제학적 제제;
[안정한 액체 약제학적 제제의 제조방법]
본 발명의 안정한 액체 약제학적 제제의 제조방법은 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있으며, 특정 방법으로 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 제조방법은 i) 당 또는 당의 유도체를 포함하는 용액에 아미노산을 첨가한 혼합 용액을 제조하는 단계; ii) i) 단계의 혼합 용액과 항체 포함하는 용액 간의 완충액을 교환하여 항체를 포함하는 혼합 용액을 제조하는 단계; 및 iii) ii) 단계의 항체를 포함하는 혼합 용액에 계면활성제 포함하는 용액을 첨가하는 단계를 포함하는 안정한 액체 약제학적 제제를 제조하는 방법일 수 있다.
상기 “완충액”은 완충제를 포함하는 용액으로서, 산이나 알칼리에 의한 pH의 변화를 최소화시키는 용액을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에서, 서로 다른 2개의 항-인플루엔자 바이러스 항체의 혼합물을 포함하는 안정한 액체 약제학적 제제의 제조방법은 각각의 항체를 상기 제조방법으로 안정한 액체 약제학적 제제를 제조한 뒤 이를 혼합하거나 항체 혼합물을 제조한 뒤 상기 제조방법으로 안정한 액체 약제학적 제제를 제조할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 제조방법은 제조시 동결 건조 공정을 포함하지 않을 수 있거나 동결 건조 공정을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예에서, 제조방법이 동결 건조 공정을 포함하지 않은 경우, 상기 제조방법은 추가적으로 액체 약제학적 제제를 제조하고 멸균 등의 처리 후 바로 밀폐 용기에 담는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예에서, 제조방법이 동결 건조 공정을 포함하는 경우, 상기 제조방법은 추가적으로 액체 약제학적 제제를 제조하고 동결 건조한 후, 또는 본 발명의 액체 약제학적 제제를 제조하고 동결 건조하고 보관/저장한 후, 동결 건조 및/또는 보관/저장에 의해 제거되었거나 변형된 성분을 보충하거나 교체하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 액체 약제학적 제제 중에서 동결 건조 및/또는 보관/저장에 의해 제거되거나 변형될 수 있는 성분들이 제외된 성분들만을 동결 건조한 후, 또는 그 성분들만을 동결 건조하고 보관/저장한 후, 상기 제외되었던 성분들을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.
[안정한 액체 약제학적 제제의 용도]
본 발명의 안정한 액체 약제학적 제제는 인플루엔자 바이러스 감염의 진단, 예방, 또는 치료용일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 안정한 액체 약제학적 제제는 인플루엔자 바이어스 감염에 유래된 질환의 진단, 예방, 또는 치료용일 수 있다. 본 발명의 다른 일 구현예에서, 인플루엔자 바이러스 감염에 유래된 질환은 폐렴, 중이염 등이 있으며 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 안정한 액체 약제학적 제제는 정맥내, 근육내, 피내, 피하내, 복막내, 국소, 또는 이의 조합된 투여용일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 안정한 액체 약제학적 제제는 1회 또는 수회 투여용일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 액체 약제학적 제제 내의 항체를 비롯한 다른 성분들의 농도는 상술한 바와 같으며, 액체 약제학적 제제의 전체 부피는 0.1 내지 100 mL일 수 있다.
본 발명의 액체 약제학적 제제의 투여량 및 투여시기는 질병의 종류, 질병의 중증도 및 경과상태, 환자의 건강 및 치료에 대한 반응, 및 치료하는 의사의 판단에 따라 달라질 수 있으며, 특정 투여량 및 투여시기로 제한되지 않는다.
[진단, 예방, 또는 치료방법]
본 발명은 (A) 항-인플루엔자 바이러스 항체 또는 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체 혼합물; (B) 계면활성제; (C) 당 또는 당의 유도체; 및 (D) 아미노산을 포함하는 안정한 액체 약제학적 제제를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 인플루엔자 바이러스 진단, 예방, 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 예방 또는 치료 방법은 당업자에게 알려진 치료제를 함께 투여할 수 있다. 본 발명의 다른 일 구현예에서, 상기 예방 또는 치료 방법은, 항-바이러스 약물을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에서, 상기 항-바이러스 약물은 항-인플루엔자 바이러스 단일클론 항체, 항-인플루엔자 바이러스 다클론 항체, DNA 폴리머라제 저해제, siRNA 제제 또는 치료 백신일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
[안정화 방법]
본 발명은 (A) 항-인플루엔자 바이러스 항체 또는 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체 혼합물; (B) 계면활성제; (C) 당 또는 당의 유도체; 및 (D) 아미노산을 포함하는 안정한 액체 약제학적 제제를 제조하는 것을 포함하는 항체를 액체 약제학적 제제 내에서 안정화하는 방법을 제공한다.
[ 키트 ]
본 발명은 (A) 항-인플루엔자 바이러스 항체 또는 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체 혼합물; (B) 계면활성제; (C) 당 또는 당의 유도체; 및 (D) 아미노산을 포함하는 안정한 액체 약제학적 제제; 및 상기 안정한 액체 약제학적 제제를 밀폐된 상태로 수용하는 용기를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 용기는 유리, 폴리머(플라스틱), 금속 등의 물질로부터 형성될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 용기는 병, 바이알, 주사기, 또는 튜브이며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 용기는 유리 또는 폴리머 바이알, 또는 유리 또는 폴리머 프리필드시린지일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 용기의 내부에 실리콘 오일이 코팅되어 있지 않을 수 있다. 실리콘 오일이 코팅되어 있는 경우 안정성이 저하될 수 있다. 상기 용기는 1회 투여용 또는 수회 투여용 용기일 수 있다.
상기 바이알, 카트리지, 프리-필드 시린지, 자동 주사기 등의 구체적인 제품형태와 상기 안정한 액체 약제학적 제제를 상기 바이알, 카트리지, 프리-필드 시린지, 자동 주사기 등에 충진하는 방법은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 용이하게 입수하거나 실시할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,861,335호, 제6,331,174호 등은 프리-필드 시린지의 구체적인 제품형태 및 충진방법을 개시한다. 예를 들어, 미국 특허 제5,085,642호, 제5,681,291호 등은 자동 주사기의 구체적인 제품형태 및 조립방법을 개시한다. 상기 바이알, 카트리지, 프리-필드 시린지, 자동 주사기 등으로서 상용화된 제품을 그대로 이용하거나, 상기 안정한 액체 약제학적 제제의 물성, 투여부위, 투여량 등을 고려하여 별도로 주문 제작한 제품을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 키트는 상기 안정한 액체 약제학적 제제의 사용방법, 보관방법, 또는 이들 모두를 제공하는 지시사항을 더 포함할 수 있다. 상기 사용방법은 인플루엔자 바이러스 감염의 진단, 예방, 또는 치료 방법을 포함하고, 투여경로, 투여량 및 투여시기를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 키트는 상업적 및 사용자 관점에서 필요한 기타 도구를 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 일 구현예에서, 상기 기타 도구는 바늘, 주사기 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 키트는 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 추가적으로 포함할 수 있으며, 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 용인 가능한 또는 편리한 제형 (dosage form)을 제조하기 위한 항체와 같은 활성 분자와 조합되는 불활성 물질을 의미한다. 약제학적으로 허용가능한 부형제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 모노클로날 항체를 포함하는 조성물의 다른 성분과 양립할 수 있는 부형제이다.
이하 본 발명을 실시예에 따라 상세히 설명한다. 그러나, 하기의 실시예들은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 인용된 문헌 및 본 출원인이 기출원한 한국특허출원 제10-2011-0020061호, 한국특허출원 제10-2012-0107512호, 및 한국특허출원 제10-2014-0036601호는 본 발명의 명세서에 참조로서 통합된다.
실시예
아래 실험예에서 사용한 항-인플루엔자 바이러스 항체의 동정, 클로닝, 제조 및 특징화는 한국특허출원 제10-2011-0020061호, 한국특허출원 제10-2012-0107512호에 상세히 기술되어 있으며, 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체 혼합물은 한국특허출원 제10-2014-003660호 에 상세히 기술되어 있다.
아래 실험예에서 항-인플루엔자 바이러스 항체로 한국특허출원 제10-2011-0020061호의 실시예 4에서 최종 선별한 11개의 항체 중 3종과 한국특허출원 제10-2012-0107512호 의 실시예4에서 최종 선별한 6개의 항체 중 4종 (이하 "항체 1", "항체 2", “항체 3”, “항체 4”, “항체 5”, “항체 6”, 또는 “항체 7”이 라 칭함)을 사용하였으며, 항체 혼합물은 상기 7종의 항체를 2 이상 포함하는 항체 혼합물을 사용하였다.
아래 실험예에서 사용된 액체 약제학적 제제의 물리적 안정성, 화학적 안정성 및 생물학적 활성의 측정방법으로서 다음과 같은 방법을 사용하였다.
하기 측정방법에 따른 물리적 안정성, 화학적 안정성 및 생물학적 활성은 측정 환경 및 조건에 따른 측정 오차를 포함할 수 있다.
- 항체 농도
HIC-HPLC (Hydrophobic Interaction Chromatography)를 이용하여 단일 항체와 항체 혼합물의 농도(mg/mL)를 측정하였다.
- 외관 분석
저장된 제제의 외관을 이용하여 용액의 투명도(Clarity)를 측정하였다.
- pH 측정
pH-측정기를 이용하여 용액의 pH를 측정하였다.
- 무균 시험
아이솔레이터(Isolator) 내에서 용액의 미생물의 자라나는 정도를 측정하였다.
- 온전한 면역글로불린 G의 함량(Intact IgG%)
마이크로칩-기반 모세관 전기이동 나트륨 도데실 설페이트(Chip-based Capillary Electrophoresis-Sodium Dodecyl Sulfate; CE-SDS) 또는 비환원 CE-SDS를 이용하여 온전한 면역글로불린 G의 함량((Intact IgG%)을 측정하였다.
- 온전한 중쇄 및 경쇄의 함량(Intact HC+LC%)
환원 모세관 전기이동 나트륨 도데실 설페이트(Capillary Electrophoresis-Sodium Dodecyl Sulfate; CE-SDS)를 이용하여 온전한 중쇄 및 경쇄의 함량(Intact HC+LC%)을 측정하였다.
- 인플루엔자 바이러스 결합 친화도
효소결합면역흡착 분석법(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay; ELISA) 또는 세포효소결합면역흡착 분석법(Cellular Enzyme-Linked ImmunoSorbent assay; CELISA) 으로 인플루엔자 바이러스 HA 결합 친화도(%)를 측정하였다.
- 항체 모노머의 함량
크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(Size Exclusion HPLC)를 이용하여 항체 모노머의 함량(post-peak; %)을 측정하였다.
실험예 1. 실시예 1 내지 9 및 비교예 1 내지 21의 제조
항-인플루엔자 바이러스 항체 또는 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체 혼합물의 최적화된 액체 약제학적 제제 선별을 위하여, 대표적으로 단일 항체로서 항체 1또는 항체 2를 항체 혼합물로서 항체 1 및 항체 2를 1:1로 혼합한 항체 혼합물을 대상으로 후보 액체 약제학적 제제 구성 성분을 적용하여 하기와 같은 방법으로 실시예 1 내지 9 및 비교예 1 내지 21을 제조하였다.
각 완충제를 이용하여 최적의 완충능력을 보이는 pH에 맞게 완충액을 제조한 뒤 당, 당 알코올, 또는 염화나트룸을 첨가하고, 완충제와 당, 당 알코올, 또는 염화나트륨이 포함된 용액에 항-인플루엔자 바이러스 항체 또는 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체 혼합물을 첨가하고, 계면활성제를 목표 농도에 도달하도록 첨가하여 후보 액체 약제학적 제제를 제조하였다.
후보 액체 약제학적 제제의 각 성분에 대한 구체적인 함량은 하기 표 1에서와 같으며, 전체 용량은 4 mL 이다.
실시예 1 내지 9 및 비교예 1 내지 21
구분 완충제 pH 당, 당 알코올, 또는 염화나트륨 계면활성제(w/v) 항체 농도 (mg/mL)
항체 1 항체 2
실시예 1 히스티딘 10 mM 6.0 소르비톨 5 %(w/v) 폴리소르베이트 80 0.10 % 25 25
실시예 2 히스티딘 10 mM 6.0 소르비톨 5 %(w/v) 폴리소르베이트 80 0.10 % 50 -
실시예 3 히스티딘 10 mM 6.0 소르비톨 5 %(w/v) 폴리소르베이트 80 0.10 % - 50
실시예 4 히스티딘 10 mM 6.0 소르비톨 5 %(w/v) 폴리소르베이트 80 0.05 % 25 25
실시예 5 히스티딘 10 mM 6.0 소르비톨 5 %(w/v) 폴리소르베이트 80 0.05 % 50 -
실시예 6 히스티딘 10 mM 6.0 소르비톨 5 %(w/v) 폴리소르베이트 80 0.05 % - 50
실시예 7 히스티딘 10 mM 6.0 소르비톨 5 %(w/v) 폴리소르베이트 80 0.02 % 25 25
실시예 8 히스티딘 10 mM 6.0 소르비톨 5 %(w/v) 폴리소르베이트 80 0.02 % 50 -
실시예 9 히스티딘 10 mM 6.0 소르비톨 5 %(w/v) 폴리소르베이트 80 0.02 % - 50
비교예 1 히스티딘 10 mM 6.0 염화나트륨 140 mM 폴리소르베이트 80 0.05 % 25 25
비교예 2 히스티딘 10 mM 6.0 염화나트륨 140 mM 폴리소르베이트 80 0.05 % 50 -
비교예 3 히스티딘 10 mM 6.0 염화나트륨 140 mM 폴리소르베이트 80 0.05 % - 50
비교예 4 아세트산나트륨 10 mM 4.0 염화나트륨 140 mM 폴리소르베이트 80 0.05 % 25 25
비교예 5 아세트산나트륨 10 mM 4.0 염화나트륨 140 mM 폴리소르베이트 80 0.05 % 50 -
비교예 6 아세트산나트륨 10 mM 4.0 염화나트륨 140 mM 폴리소르베이트 80 0.05 % - 50
비교예 7 아세트산나트륨 10 mM 4.0 소르비톨 5 %(w/v) 폴리소르베이트 80 0.05 % 25 25
비교예 8 아세트산나트륨 10 mM 4.0 소르비톨 5 %(w/v) 폴리소르베이트 80 0.05 % 50 -
비교예 9 아세트산나트륨 10 mM 4.0 소르비톨 5 %(w/v) 폴리소르베이트 80 0.05 % - 50
비교예 10 아세트산나트륨 10 mM 5.0 염화나트륨 140 mM 폴리소르베이트 80 0.05 % 25 25
비교예 11 아세트산나트륨 10 mM 5.0 염화나트륨 140 mM 폴리소르베이트 80 0.05 % 50 -
비교예 12 아세트산나트륨 10 mM 5.0 염화나트륨140 mM 폴리소르베이트 80 0.05 % - 50
비교예 13 아세트산나트륨 10 mM 5.0 소르비톨 5 %(w/v) 폴리소르베이트 80 0.05 % 25 25
비교예 14 아세트산나트륨 10 mM 5.0 소르비톨 5 %(w/v) 폴리소르베이트 80 0.05 % 50 -
비교예 15 아세트산나트륨 10 mM 5.0 소르비톨 5 %(w/v) 폴리소르베이트 80 0.05 % - 50
비교예 16 인산나트륨 10 mM 6.0 염화나트륨 140 mM 폴리소르베이트 80 0.05 % 25 25
비교예 17 인산나트륨 10 mM 6.0 염화나트륨 140 mM 폴리소르베이트 80 0.05 % 50 -
비교예 18 인산나트륨 10 mM 6.0 염화나트륨 140 mM 폴리소르베이트 80 0.05 % - 50
비교예 19 인산나트륨 10 mM 6.0 소르비톨 5 %(w/v) 폴리소르베이트 80 0.05 % 25 25
비교예 20 인산나트륨 10 mM 6.0 소르비톨 5 %(w/v) 폴리소르베이트 80 0.05 % 50 -
비교예 21 인산나트륨 10 mM 6.0 소르비톨 5 %(w/v) 폴리소르베이트 80 0.05 % - 50
실험예 2. 실시예 1 내지 9 및 비교예 1 내지 21의 안정성 비교
실시예 1 내지 9 및 비교에 1 내지 21을 5±3 ℃/주변 상대 습도, 25±2 ℃/60±5 % 상대습도, 40±2 ℃/75±5 % 상대습도에서 보관하였다. 상기 각 온도 및 습도에서 2주 후, 4주 후, 6주 후 안정성을 측정하였다.
실시예 1 내지 9 및 비교예 1 내지 21의 안정성을 비교하기 위하여, 외관 분석, 항체 농도 측정, 온전한 면역글로블린 G의 함량 측정, 항체 모노머의 함량 측정, 및 결합 친화도(ELISA 및 CELISA) 측정을 수행하였다.
단일 항체인 항체 1 또는 항체 2를 포함한 실시예 및 비교예와 항체 1 및 항체 2의 항체 혼합물에 대한 실시예와 비교예의 경향성이 동일하여, 대표적으로 항체 혼합물에 대한 실시예 1, 4, 및 7과 비교예 1, 4, 7, 10, 13, 16, 및 19를 대상으로 안정성 측정한 결과를 명세서에 기재하였다.
(1) 외관 분석
실시예 1, 4, 및 7및 비교예 1, 4, 7, 10, 13, 16, 및 19에 대해 육안으로 관찰되는 입자 및 투명도를 판단하는 외관 분석을 수행하여, 전혀 탁하지 않은 경우를 투명으로, 유관상 입자가 보이지 않으나 탁한 경우를 연한 유백색으로, 유관상 입자가 보이지 않으나 매우 탁한 경우를 유백색으로, 젤라틴과 같은 형상을 나타내는 경우를 불투명으로 표시하였다.
하기 표 2에서 나타난 바와 같이, 40±2 ℃/75±5 % 상대습도에서 아세트산 완충제, pH 4.0, 140mM 염화나트륨을 포함한 비교예 4는 4주가 경과한 뒤 젤라틴화가 진행되어 분석이 불가능한 수준을 보여주었다(IS: Inaccessible State). 모든 온도조건에서 실시예 1, 4, 및 7및 비교예 1, 7, 10, 13, 16, 및, 19는 6주 동안 육안으로 관찰되는 입자는 존재하지 않았지만, 염화나트륨을 포함한 비교예 1, 4, 10, 및 16은 외관상 연한 유백색 또는 유백색을 나타나는 데 반해, 소르비톨을 포함한 실시예 1, 4, 및 7및 비교예 7, 13, 및 19는 외관상 투명한 결과를 보여주었다.
따라서, 모든 온도조건에서 염화나트륨보다 소르비톨을 포함하는 경우가 유관상 투명 정도가 유지되었다.
이후 실험에서는 젤라틴화가 진행된 비교예 4를 제외한 실시예 1, 4, 및 7과 비교예 1, 7, 10, 13, 16, 및 19에 대해서만 분석을 진행하였다.
구분 온도 0주 2주 후 4주 후 6주 후
실시예 1 5±3 ℃ / 주변 상대 습도 투명 투명 투명 투명
25±2 ℃ / 60±5 % 상대 습도 투명 투명 투명 투명
40±2 ℃ / 75±5 % 상대 습도 투명 투명 투명 투명
실시예 4 5±3 ℃ / 주변 상대 습도 투명 투명 투명 투명
25±2 ℃ / 60±5 % 상대 습도 투명 투명 투명 투명
40±2 ℃ / 75±5 % 상대 습도 투명 투명 투명 투명
실시예 7 5±3 ℃ / 주변 상대 습도 투명 투명 투명 투명
25±2 ℃ / 60±5 % 상대 습도 투명 투명 투명 투명
40±2 ℃ / 75±5 % 상대 습도 투명 투명 투명 투명
비교예 1 5±3 ℃ / 주변 상대 습도 연한 유백색 연한 유백색 연한 유백색 연한 유백색
25±2 ℃ / 60±5 % 상대 습도 연한 유백색 연한 유백색 연한 유백색 연한 유백색
40±2 ℃ / 75±5 % 상대 습도 연한 유백색 연한 유백색 연한 유백색 연한 유백색
비교예 4 5±3 ℃ / 주변 상대 습도 연한 유백색 연한 유백색 연한 유백색 연한 유백색
25±2 ℃ / 60±5 % 상대 습도 연한 유백색 연한 유백색 연한 유백색 연한 유백색
40±2 ℃ / 75±5 % 상대 습도 연한 유백색 유백색 불투명 불투명
비교예 7 5±3 ℃ / 주변 상대 습도 투명 투명 투명 투명
25±2 ℃ / 60±5 % 상대 습도 투명 투명 투명 투명
40±2 ℃ / 75±5 % 상대 습도 투명 투명 투명 투명
비교예 10 5±3 ℃ / 주변 상대 습도 연한 유백색 연한 유백색 연한 유백색 연한 유백색
25±2 ℃ / 60±5 % 상대 습도 연한 유백색 연한 유백색 연한 유백색 연한 유백색
40±2 ℃ / 75±5 % 상대 습도 연한 유백색 연한 유백색 연한 유백색 연한 유백색
비교예 13 5±3 ℃ / 주변 상대 습도 투명 투명 투명 투명
25±2 ℃ / 60±5 % 상대 습도 투명 투명 투명 투명
40±2 ℃ / 75±5 % 상대 습도 투명 투명 투명 투명
비교예 16 5±3 ℃ / 주변 상대 습도 연한 유백색 연한 유백색 연한 유백색 연한 유백색
25±2 ℃ / 60±5 % 상대 습도 연한 유백색 연한 유백색 연한 유백색 연한 유백색
40±2 ℃ / 75±5 % 상대 습도 연한 유백색 연한 유백색 연한 유백색 연한 유백색
비교예 19 5±3 ℃ / 주변 상대 습도 투명 투명 투명 투명
25±2 ℃ / 60±5 % 상대 습도 투명 투명 투명 투명
40±2 ℃ / 75±5 % 상대 습도 투명 투명 투명 투명
(2) 항체 농도
실시예 1, 4, 및 7 및 비교예 1, 7, 10, 13, 16, 및 19에 대해 HIC-HPLC (Hydrophobic Interaction Chromatography)를 이용하여 항체 혼합물 내의 항체 1 및 항체 2의 각각의 농도를 측정하였다.
그 결과 모든 온도조건에서 변화 없다는 것을 알 수 있었다(데이터는 나타내지 않음).
(3) 온전한 면역글로블린 G의 함량(%)
실시예 1, 4, 및 7 및 비교예 1, 7, 10, 13, 16, 및 19에 대해 Chip-based CE-SDS 분석 장비인 Labchip GXII를 이용하여 온전한 면역글로블린 G의 함량을 측정하였다.
하기 표 3에서 나타난 바와 같이, 40±2 ℃/75±5 % 상대습도에서 6주 후, 히스티딘 완충제를 포함하는 실시예 1, 4, 및 7및 비교예 1은 인산 완충제를 포함하는 비교예 16 및 19는 95 % 이상의 순도를 보여주는 반면에 아세트산 완충제를 포함하는 비교예 7 및 10은 95 % 미만의 순도를 보여주었다.
따라서, 높은 온도조건에서 아세트산 완충제보다 히스티딘 완충제 또는 인산 완충제를 포함하는 경우가 CE-SDS 측정 결과 95 % 이상 온전한 면역글로블린 G의 함량이 유지되었으므로 열화에 안정하다는 것을 알 수 있었다. 열화란 인체에 체온 보다 높은 온도(본 발명의 40±2 ℃에 해당함)에서 단백질의 고유한 구조적 특성이 변형된 것을 의미한다.
구분 온도 0주 2주 후 4주 후 6주 후
실시예 1 5±3 ℃ / 주변 상대 습도 98.42 98.57 98.35 98.00
25±2 ℃ / 60±5 % 상대 습도 98.42 98.61 98.47 97.90
40±2 ℃ / 75±5 % 상대 습도 98.42 98.32 96.54 96.40
실시예 4 5±3 ℃ / 주변 상대 습도 98.44 98.69 98.35 98.48
25±2 ℃ / 60±5 % 상대 습도 98.44 98.53 98.47 97.80
40±2 ℃ / 75±5 % 상대 습도 98.44 98.26 96.62 96.42
실시예 7 5±3 ℃ / 주변 상대 습도 98.46 98.59 98.39 98.33
25±2 ℃ / 60±5 % 상대 습도 98.46 98.58 98.51 98.03
40±2 ℃ / 75±5 % 상대 습도 98.46 98.28 96.69 96.34
비교예 1 5±3 ℃ / 주변 상대 습도 98.38 98.67 98.35 98.61
25±2℃ / 60±5 % 상대 습도 98.38 98.61 98.47 97.81
40±2℃ / 75±5 % 상대 습도 98.38 98.22 96.35 96.28
비교예 7 5±3 ℃ / 주변 상대 습도 98.47 98.55 98.32 98.51
25±2 ℃ / 60±5 % 상대 습도 98.47 98.54 98.44 97.47
40±2 ℃ / 75±5 % 상대 습도 98.47 98.16 95.58　 94.52　
비교예 10 5±3 ℃ / 주변 상대 습도 98.36 98.65 98.31 98.34
25±2 ℃ / 60±5 % 상대 습도 98.36 98.45 98.43 97.17
40±2 ℃ / 75±5 % 상대 습도 98.36 97.85 93.49 91.95
비교예 13 5±3 ℃ / 주변 상대 습도 98.43 98.68 98.31 98.47
25±2 ℃ / 60±5 % 상대 습도 98.43 98.47 98.43 97.73
40±2 ℃ / 75±5 % 상대 습도 98.43 98.18 96.19 95.07
비교예 16 5±3 ℃ / 주변 상대 습도 98.48 98.56 98.33 97.98
25±2 ℃ / 60±5 % 상대 습도 98.48 98.64 98.45 97.17
40±2 ℃ / 75±5 % 상대 습도 98.48 98.20 95.61 96.26
비교예 19 5±3 ℃ / 주변 상대 습도 98.46 98.62 98.38 98.27
25±2 ℃ / 60±5 % 상대 습도 98.46 98.59 98.50 97.70
40±2 ℃ / 75±5 % 상대 습도 98.46 98.21 96.40 95.77
(4) 항체 모노머의 함량 (%)
실시예 1, 4, 및 7 및 비교예 1, 7, 10, 13, 16, 및 19에 대해 SEC-HPLC를 이용하여 항체 모노머의 함량을 측정하였다.
하기 표 4에서 나타난 바와 같이, 40±2 ℃/75±5 % 상대습도에서 6주 후, 히스티딘 완충제, pH 6.0, 5 % 소르비톨을 포함하는 실시예 1, 4, 및 7은 95% 이상의 순도를 보여주는 반면에 아세트산 완충제 또는 인산 완충제를 포함하는 비교예 1, 7, 10, 13, 16, 및 19는 95 % 미만의 순도를 보여주었다. 또한 상대적으로 pH 4.0의 아세트산 완충제를 포함하는 비교예 7은 크로마토그램 상에서 메인피크 뒤쪽에 나타나는 분해산물 (Fragments)의 비율이 상대적으로 높았으며, 인산 완충제를 포함하는 비교예 16 및 17는 크로마토그램 상에서 메인피크 앞쪽에 나타나는 응집체 (Aggregate)의 비율이 상대적으로 높았음을 확인할 수 있었다 (데이터는 나타내지 않음).
따라서, 높은 온도조건에서 아세트산 완충제 또는 인산 완충제보다 히스티딘 완충제를 포함하는 경우가 SEC-HPLC 측정 결과 95 % 이상 항체 모노머의 함량이 유지되었으므로 열화에 안정하다는 것을 알 수 있었다. 또한 염화나트륨을 포함하는 비교예 1, 10, 및 16은 소르비톨을 포함하는 실시예 1, 4, 및 7 및 비교예 1, 7, 13, 및 19보다 낮은 모노머 함량을 보여주는 것으로 보아 염화나트륨이 소르비톨보다 열화에 안정하다는 것을 알 수 있었다.
구분 온도 0주 2주 후 4주 후 6주 후
실시예 1 5±3 ℃ / 주변 상대 습도 99.17 99.12 99.23 99.10
25±2 ℃ / 60±5 % 상대 습도 99.17 99.08 99.23 98.80
40±2 ℃ / 75±5 % 상대 습도 99.17 96.91 96.12 95.69
실시예 4 5±3 ℃ / 주변 상대 습도 99.20 99.15 99.23 99.12
25±2 ℃ / 60±5 % 상대 습도 99.20 99.11 99.05 98.91
40±2 ℃ / 75±5 % 상대 습도 99.20 96.96 96.33 95.83
실시예 7 5±3 ℃ / 주변 상대 습도 99.20 99.17 99.27 99.17
25±2 ℃ / 60±5 % 상대 습도 99.20 99.11 99.08 98.92
40±2 ℃ / 75±5 % 상대 습도 99.20 97.17 96.05 95.78
비교예 1 5±3 ℃ / 주변 상대 습도 99.13 99.04 99.14 98.99
25±2 ℃ / 60±5 % 상대 습도 99.13 98.98 98.80 98.62
40±2 ℃ / 75±5 % 상대 습도 99.13 96.62 95.28 94.67
비교예 7 5±3 ℃ / 주변 상대 습도 99.41 99.35 99.43 99.33
25±2 ℃ / 60±5 % 상대 습도 99.41 99.32 99.31 99.16
40±2 ℃ / 75±5 % 상대 습도 99.41 97.21 95.46 94.73
비교예 10 5±3 ℃ / 주변 상대 습도 99.17 99.15 99.22 99.04
25±2 ℃ / 60±5 % 상대 습도 99.17 98.96 98.77 98.58
40±2 ℃ / 75±5 % 상대 습도 99.17 96.03 93.59 91.46
비교예 13 5±3 ℃ / 주변 상대 습도 99.34 99.39 99.41 99.29
25±2 ℃ / 60±5 % 상대 습도 99.34 99.28 99.27 99.04
40±2 ℃ / 75±5 % 상대 습도 99.34 97.11 96.13 95.57
비교예 16 5±3 ℃ / 주변 상대 습도 98.78 98.79 98.85 98.77
25±2 ℃ / 60±5 % 상대 습도 98.78 98.60 98.43 98.29
40±2 ℃ / 75±5 % 상대 습도 98.78 96.08 94.77 94.20
비교예 19 5±3 ℃ / 주변 상대 습도 98.92 98.91 99.01 98.83
25±2 ℃ / 60±5 % 상대 습도 98.92 98.86 98.72 98.50
40±2 ℃ / 75±5 % 상대 습도 98.92 96.51 95.41 94.71
(5) 결합 친화도 측정
실시예 1, 4, 및 7및 비교예 1, 7, 10, 13, 16, 및 19에 대해 ELISA 및 CELISA를 이용하여 항체 결합 친화도를 측정하였다.
H1(H1N1), H3(H3N2) 서브타입의 HA를 발현하는 CHO 세포주를 이용하여 각각 항체 1과 항체 2의 결합능력을 CELISA를 통해 측정하였고, H5(H5N1) 서브타입의 HA에 대한 항체 1과 항체 2의 항체 혼합물의 결합능력을 ELISA를 통해 측정하였다.
그 결과 모든 온도조건에서 HA결합 친화도가 70 내지 130 %인 것을 알 수 있었다(데이터는 나타내지 않음).
실험예 3. 제형 구성 성분 종류 및 농도에 대한 추가 실험
(1) 항체
상기 실험예 2의 실시예 1, 4, 및 7에서 확인된 바와 같이, 항체 1과 항체 2를 모두 포함한 항체 혼합물 제형이 안정하다는 것을 확인하였다. 상기 실험예 2의 항체 농도 측정, 온전한 면역글로블린 G의 함량 측정, 항체 모노머의 함량 측정, 및 결합 친화도(ELISA 및 CELISA) 측정에서 항체 1 과 항체 2 각각에 대하여 안정성을 확인하였다. 이를 통하여 단일 항체인 항체 1과 항체 2도 항체 혼합물과 안정성 경향이 동일함을 확인하였다.
또한 추가적으로 실시예 1에서 항체 혼합물의 농도를 150 mg/mL로 하여 외관 분석, 항체 농도 측정 등을 수행한 결과 안정함을 확인하였다(데이터 나타내지 않음).
(2) 계면활성제 　
상기 실험예 2의 실시예 1, 4, 및 7에서 확인된 바와 같이, 계면활성제를 포함하는 경우 안정한다는 것을 확인하였다. 다른 계면활성제를 포함하는 경우에도 안정한지를 확인하기 위해 추가적으로 실시예 1, 4, 및 7의 제형에서 계면활성제를 폴리소르베이트 20 또는 풀록사머 188을 치환하여 6주 후 외관을 분석한 결과에서도 제형은 모두 안정하였다(데이터는 나타내지 않음).
또한 추가적으로 실시예 1에서 폴리소르베이트 80의 농도를 0.01 % 및 1.0 %로 하여 외관 분석, 항체 농도 측정 등을 수행한 결과 안정함을 확인하였다(데이터 나타내지 않음).
(3) 당 또는 당의 유도체
상기 실험예 2의 실시예 1, 4, 및 7에서 확인된 바와 같이, 당 또는 당의 유도체를 포함하는 경우 안정하다는 것을 확인하였다. 다른 당 또는 당의 유도체를 포함하는 경우에도 안정한지를 확인하기 위해 추가적으로 실시예 1, 4, 및 7의 제형에서 소르비톨을 만니톨, 트레할로스, 또는 수크로오스를 치환하여 6주 후 외관을 분석한 결과에서도 제형은 모두 안정하였다(데이터는 나타내지 않음).
또한 추가적으로 실시예 1에서 소르비톨의 농도를 0.1% 및 15 %로 하여 외관 분석, 항체 농도 측정 등을 수행한 결과 안정함을 확인하였다(데이터 나타내지 않음).
(4) 아미노산
상기 실험예 2의 실시예 1, 4, 및 7에서 확인된 바와 같이, 아미노산을 포함하는 경우 안정하다는 것을 확인하였다. 다른 아미노산 또는 아미노산염을 포함하는 경우에도 안정한지를 확인하기 위해 추가적으로 실시예 1, 4 및 7의 제형에 아스파르트산, 리신, 또는 아르기닌을 첨가하여 6주 후 외관을 분석한 결과에서도 제형은 모두 안정하였다. 또한 실시예 1, 4, 및 7의 제형에서 히스티딘을 히스티딘-염산염으로 치환하여 6주 후 외관을 분석한 결과에서도 제형은 안정하였다(데이터는 나타내지 않음).
또한 추가적으로 실시예 1에서 히스티딘의 농도를 1 mM 및 20 mM로 하여 외관 분석, 항체 농도 측정 등을 수행한 결과 안정함을 확인하였다(데이터 나타내지 않음).
실험예 4. 안정한 액체 약제학적 제제의 결정
(1) 실험예 2 및 3의 분석
외관 분석 비교 결과, 소르비톨을 포함하는 경우가 염화나트륨을　포함하는 경우보다 안정함을 알 수 있었다. 온전한（Intact）항체의　함량 비교 결과, 히스티딘　완충제 또는　인산　완충제를 포함하는 경우가　아세트산　완충제를 포함하는 경우보다　열화에　대해서　더　안정함을 알 수 있었다. 모노머 함량 비교 결과　히스티딘　완충제를　포함하는　제형이　아세트산 완충제 또는 인산　완충제를　포함하는 경우보다，열화에　대해서　더　안정함을 알 수 있었다. 모든 분석 시험에서 계면활성제인 폴리소르베이트 80의 농도에 따른 제형 안정성 변화가 없음을 알 수 있었다.
(2) 소결
외관 분석뿐만 아니라 실험예 2의 항체 농도 측정, 온전한 면역글로블린 G의 함량 측정, 항체 모노머의 함량 측정, 및 결합 친화도(ELISA 및 CELISA) 측정에서 모두 안정함이 확인된 실시예 1, 4, 및 7 이 항-인플루엔자 항체에 대하여, 단일 항체 또는 서로 다른 2 이상의 항체 혼합물에 있어서 히스티딘 완충제와 소르비톨을 포함하는 경우가 안정한 액체 약제학적 제제임을 확인하였다.
액체 약제학적 제제 내에서 계면활성제는 표면 흡착 또는 항체의 응집을 막아주는 역할을 한다. 하지만 일반적으로 고분자인 계면활성제는 저장 기간이 길어짐에 따라 계면활성제 자체가 분해되어 조금씩 함량이 감소하는 경향을 가질 수 있다. 따라서 계면활성제가 분해되는 속도를 고려하였을 때 계면활성제가 표면 흡착 및 항체의 응집 저해제로서 그 기능을 장기간 유지하기 위해서 높은 농도를 사용하는 것이 필요하다. 이에 따라 후보 액체 약제학적 제제 중 가장 함량이 높은 0.1%를 포함하는 것이 최적의 조건이라 판단하였다(데이터는 나타내지 않음).
따라서, 히스티딘　10 mM,　pH 6.0, 5 % 소르비톨，0.1 % 폴리소르베이트　80을 포함하는 실시예 １을 대상으로 장기 안정성 실험을 진행하였다.
실험예 5. 안정한 액체 약제학적 제제의 다른 항-인플루엔자 단일 항체 및 항체 혼합물에 적용
상기 실시예 1의 안정한 액체 약제학적 제제 구성 성분을 항체 3 내지 7 및 이들의 혼합물에 적용하여, 상기 실험예 2와 동일하게 5±3 ℃/주변 상대 습도, 25±2 ℃/60±5 % 상대습도, 40±2 ℃/75±5 % 상대습도에서 보관하였다. 상기 각 온도 및 습도에서 2주 후, 4주 후, 6주 후 안정성 확인할 결과 모든 단일 항체 및 항체 혼합물에 대해 실시예 1과 마찬가지로 단일 항체 및 항체 혼합물의 안정성이 유지됨을 확인하였다(데이터는 나타내지 않음).
실험예 6: 실시예 1의　장기간　안정성　평가
실시예 1의 장기간　안정성　평가를 ICH(International Conference on Harmonisation)에서 제공한 가이드라인(Guideline Q5C Quality of Biotechnological Products: Stability Testing of Biotechnological 또는 Biological Products and ICH Guideline Q1A (R2): Stability Testing of New Drug Substances and Drug Products)에　따라　실시하였다．　
상기 실험예 1의 방법으로 제조한 실시예 1의 안정한 액체 약제학적 제제 50 mL를 5±3 ℃/주변 상대 습도에서 밀폐 용기에 보관하였다. 상기 온도 및 습도에서 12개월까지 안정성을 측정하였다.
실시예 1 의 장기간 안정성을 확인하기 위하여, 외관 분석, pH 측정, 무균 시험, 항체 농도 측정, 비환원 CE-SDS를 이용한 온전한 면역글로블린 G의 함량 측정, 환원 CE-SDS를 이용한 온전한 중쇄 및 경쇄의 함량 측정, 항체 모노머의 함량 측정, 및 결합 친화도(H5N1 ELISA, H1N1 CELISA, 및 H3N2 CELISA) 측정을 수행하였으며 그 결과를 표 5 내지14로 나타내었다.
(1) 외관 분석
구분 5±3 ℃, 0개월 후 5±3 ℃, 3개월 후 5±3 ℃, 6개월 후 5±3 ℃, 9개월 후 5±3 ℃, 12개월 후
실시예 1 투명 투명 투명 투명 투명
상기 표 5에서 나타난 바와 같이, 실시예 1은 5±3 ℃에서 12 개월 후 외관상의 변화 없이 유관상 투명 정도가 유지되었으므로 안정하다는 것을 알 수 있었다.
(2) pH 측정
구분 5±3 ℃, 0개월 후 5±3 ℃, 3개월 후 5±3 ℃, 6개월 후 5±3 ℃, 9개월 후 5±3 ℃, 12개월 후
실시예 1 6.1 6.1 6.1 6.1 6.1
상기 표 6에서 나타난 바와 같이, 실시예 1은 5±3 ℃에서 12 개월 후 pH는 변화 없이 일정하게 유지되었으므로 안정하다는 것을 알 수 있었다.
(3) 무균 시험
구분 5±3 ℃, 0개월 후 5±3 ℃, 3개월 후 5±3 ℃, 6개월 후 5±3 ℃, 9개월 후 5±3 ℃, 12개월 후
실시예 1 세균이 자라지 않음 분석하지 않음 세균이 자라지 않음 세균이 자라지 않음 세균이 자라지 않음
상기 표 7에서 나타난 바와 같이, 실시예 1은 5±3 ℃에서 12 개월 후 무균 상태가 유지되었으므로 안정하다는 것을 알 수 있었다.
(4) 항체 농도 (mg/mL)
구분 5±3 ℃, 0개월 후 5±3 ℃, 3개월 후 5±3 ℃, 6개월 후 5±3 ℃, 9개월 후 5±3 ℃, 12개월 후
실시예 1 항체 1 (mg/mL) 24.0 23.5 24.4 23.5 23.8
항체 2 (mg/mL) 25.1 25.2 25.8 24.7 25.1
항체 1 + 항체 2 (mg/mL) 49.0 48.7 50.2 48.2 48.9
상기 표 8에서 나타난 바와 같이, 실시예 1은 5±3 ℃에서 12 개월 후 항체 농도의 변화 없이 일정하게 유지되었으므로 안정하다는 것을 알 수 있었다.
(5) 온전한 면역글로블린 G의 함량(Intact IgG %)
구분 5±3 ℃, 0개월 후 5±3 ℃, 3개월 후 5±3 ℃, 6개월 후 5±3 ℃, 9개월 후 5±3 ℃, 12개월 후
실시예 1 94.6 96.7 97.4 97.1 97.1
상기 표 9에서 나타난 바와 같이, 실시예 1은 5±3 ℃에서 12 개월 후 온전한 면역글로블린 G의 함량이 97 % 이상 높은 함량이 유지되었으므로 안정하다는 것을 알 수 있었다.
(6) 온전한 중쇄 및 경쇄의 함량(Intact HC+LC %)
구분 5±3 ℃, 0개월 후 5±3 ℃, 3개월 후 5±3 ℃, 6개월 후 5±3 ℃, 9개월 후 5±3 ℃, 12개월 후
실시예 1 98.6 98.5 98.5 98.4 98.7
상기 표 10에서 나타난 바와 같이, 실시예 1은 5±3 ℃에서 12 개월 후 온전한 중쇄 및 경쇄의 함량이 98 % 이상 높은 함량이 유지되었으므로 안정하다는 것을 알 수 있었다.
(7) 항체 모노머의 함량(%)
구분 5±3 ℃, 0개월 후 5±3 ℃, 3개월 후 5±3 ℃, 6개월 후 5±3 ℃, 9개월 후 5±3 ℃, 12개월 후
실시예 1 99.3 99.0 99.0 98.9 98.8
상기 표 11에서 나타난 바와 같이, 실시예 1은 5±3 ℃에서 12 개월 후 항체 모노머의 함량이 98 % 이상 높은 함량이 유지되었으므로 안정하다는 것을 알 수 있었다.
(8) 결합 친화도(%)
H5N1 ELISA, H1N1 CELISA, 및 H3N2 CELISA 측정 결과를 하기와 같이 표 12 내지 표 13으로 나타내었다.
인플루엔자 A 바이러스 HA (H5N1) 결합 친화도
구분 5±3 ℃, 0개월 후 5±3 ℃, 3개월 후 5±3 ℃, 6개월 후 5±3 ℃, 9개월 후 5±3 ℃, 12개월 후
실시예 1 95 106 99 105 106
상기 표 12에서 나타난 바와 같이, 보면 실시예 1은 5±3 ℃에서 12 개월 후 인플루엔자 A 바이러스 HA의 H5N1 서브타입 결합 친화도가 70-130 % 사이이므로 안정하다는 것을 알 수 있었다.
인플루엔자 A 바이러스 HA (H1N1) 결합 친화도(%)
구분 5±3 ℃, 0개월 후 5±3 ℃, 3개월 후 5±3 ℃, 6개월 후 5±3 ℃, 9개월 후 5±3 ℃, 12개월 후
실시예 1 97 107 113 103 98
상기 표 13에서 나타난 바와 같이, 실시예 1은 5±3 ℃에서 12 개월 후 인플루엔자 A 바이러스 HA의 H1N1 서브타입 결합 친화도가 70-130 % 사이이므로 안정하다는 것을 알 수 있었다.
인플루엔자 A 바이러스 HA (H3N2) 결합 친화도(%)
구분 5±3 ℃, 0개월 후 5±3 ℃, 3개월 후 5±3 ℃, 6개월 후 5±3 ℃, 9개월 후 5±3 ℃, 12개월 후
실시예 1 101 115 100 98 106
상기 표 14에서 나타난 바와 같이, 실시예 1은 5±3 ℃에서 12 개월 후 인플루엔자 A 바이러스 HA의 H3N2 서브타입 결합 친화도가 70-130 % 사이이므로 안정하다는 것을 알 수 있었다.
상기 안정성 확인 결과를 바탕으로, 24개월 후 장기간 안정성 데이터를 확보할 예정이다.

Claims (30)

  1. (A) 항-인플루엔자 바이러스 항체 또는 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체 혼합물;
    (B) 계면활성제;
    (C) 당 또는 당의 유도체; 및
    (D) 아미노산을 포함하는, 안정한 액체 약제학적 제제.
  2. 제 1항에 있어서,
    (A) 항-인플루엔자 바이러스 항체는
    HA1 폴리펩티드의 위치 318의 아미노산 잔기를 포함하고,
    HA2 폴리펩티드의 위치 41, 42, 45, 48, 49, 52, 및 53의 아미노산 잔기를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스의 해마글루티닌(HA) 단백질 내 에피토프에 결합하는 항체인, 안정한 액체 약제학적 제제.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    (A) 항-인플루엔자 바이러스 항체는
    i) 서열번호 1의 CDR1 영역, 서열번호 2의 CDR2 영역, 및 서열번호 3의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 4의 CDR1 영역, 서열번호 5의 CDR2 영역, 및 서열번호 6의 CDR3 영역영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
    ii) 서열번호 7의 CDR1 영역, 서열번호 8의 CDR2 영역, 및 서열번호 9의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 10의 CDR1 영역, 서열번호 11의 CDR2 영역, 및 서열번호 12의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
    iii) 서열번호 13의 CDR1 영역, 서열번호 14의 CDR2 영역, 및 서열번호 15의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 16의 CDR1 영역, 서열번호 17의 CDR2 영역, 및 서열번호 18의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
    iv) 서열번호 19의 CDR1 영역, 서열번호 20의 CDR2 영역, 및 서열번호 21의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 22의 CDR1 영역, 서열번호 23의 CDR2 영역, 및 서열번호 24의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
    v) 서열번호 25의 CDR1 영역, 서열번호 26의 CDR2 영역, 및 서열번호 27의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역; 및 서열번호 28의 CDR1 영역, 서열번호 29의 CDR2 영역, 및 서열번호 30의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
    vi) 서열번호 31의 CDR1 영역, 서열번호 32의 CDR2 영역, 및 서열번호 33의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 34의 CDR1 영역, 서열번호 35의 CDR2 영역, 및 서열번호 36의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체; 및
    vii) 서열번호 37의 CDR1 영역, 서열번호 38의 CDR2 영역, 및 서열번호 39의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 40의 CDR1 영역, 서열번호 41의 CDR2 영역, 및 서열번호 42의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체
    로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 항체를 포함하는, 안정한 액체 약제학적 제제.
  4. 제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    (A) 항-인플루엔자 바이러스 항체는
    i) 서열번호 43의 폴리펩티드 서열의 경쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 44의 폴리펩티드 서열의 중쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
    ii) 서열번호 45의 폴리펩티드 서열의 경쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 46의 폴리펩티드 서열의 중쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
    iii) 서열번호 47의 폴리펩티드 서열의 경쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 48의 폴리펩티드 서열의 중쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
    iv) 서열번호 49의 폴리펩티드 서열의 경쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 50의 폴리펩티드 서열의 중쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
    v) 서열번호 51의 폴리펩티드 서열의 경쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 52의 폴리펩티드 서열의 중쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체;
    vi) 서열번호 53의 폴리펩티드 서열의 경쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 54의 폴리펩티드 서열의 중쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체; 및
    vii) 서열번호 55의 폴리펩티드 서열의 경쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 56의 폴리펩티드 서열의 중쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체
    로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 항체를 포함하는, 안정한 액체 약제학적 제제.
  5. 제 1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    (A) 항-인플루엔자 바이러스 항체는
    i) 서열번호 57의 폴리펩티드 서열의 경쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 및 서열번호 58의 폴리펩티드 서열의 중쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하는 항체;
    ii) 서열번호 59의 폴리펩티드 서열의 경쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 및 서열번호 60의 폴리펩티드 서열의 중쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하는 항체;
    iii) 서열번호 61의 폴리펩티드 서열의 경쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 및 서열번호 62의 폴리펩티드 서열의 중쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하는 항체;
    iv) 서열번호 63의 폴리펩티드 서열의 경쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 및 서열번호 64의 폴리펩티드 서열의 중쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하는 항체;
    v) 서열번호 65의 폴리펩티드 서열의 경쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 및 서열번호 66의 폴리펩티드 서열의 중쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하는 항체;
    vi) 서열번호 67의 폴리펩티드 서열의 경쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 및 서열번호 68의 폴리펩티드 서열의 중쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하는 항체; 및
    vii) 서열번호 69의 폴리펩티드 서열의 경쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 및 서열번호 70의 폴리펩티드 서열의 중쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하는 항체;
    로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 항체를 포함하는, 안정한 액체 약제학적 제제.
  6. 제 1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    (A) 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체 혼합물은
    i) 서열번호 1의 CDR1 영역, 서열번호 2의 CDR2 영역, 및 서열번호 3의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 4의 CDR1 영역, 서열번호 5의 CDR2 영역, 및 서열번호 6의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체; 및
    ii) 서열번호 7의 CDR1 영역, 서열번호 8의 CDR2 영역, 및 서열번호 9의 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변영역 및 서열번호 10의 CDR1 영역, 서열번호 11의 CDR2 영역, 및 서열번호 12의 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체를
    포함하는, 안정한 액체 약제학적 제제.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    (A) 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체 혼합물은
    i) 서열번호 43의 폴리펩티드 서열의 경쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 44의 폴리펩티드 서열의 중쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체; 및
    ii) 서열번호 45의 폴리펩티드 서열의 경쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변영역 및 서열번호 46의 폴리펩티드 서열의 중쇄 가변영역에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체를
    포함하는, 안정한 액체 약제학적 제제.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
    (A) 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체 혼합물은
    i) 서열번호 57의 폴리펩티드 서열의 경쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 및 서열번호 58의 폴리펩티드 서열의 중쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하는 항체; 및
    ii) 서열번호 59의 폴리펩티드 서열의 경쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 및 서열번호 60의 폴리펩티드 서열의 중쇄에 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하는 항체를
    포함하는, 안정한 액체 약제학적 제제.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
    (A) 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체 혼합물이 서로 다른 2가지 항체의 혼합물일 때, 서로 다른 2 가지 항체들의 비가 9:1 내지 1:9인, 안정한 액체 약제학적 제제.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
    (A) 항-인플루엔자 바이러스 항체 또는 서로 다른 2가지 이상의 항-인플루엔자 바이러스 항체 혼합물의 농도는 10 내지 150 mg/mL인, 안정한 액체 약제학적 제제.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서,
    (B) 계면활성제는 폴리소르베이트, 폴록사머, 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 안정한 액체 약제학적 제제.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서,
    (B) 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 80, 또는 이들 중 2 이상의 혼합물을 포함하는, 안정한 액체 약제학적 제제.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,
    (B) 계면활성제는 폴리소르베이트 80을 포함하는, 안정한 액체 약제학적 제제.
  14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,
    (B) 계면활성제의 농도는 0.01 내지 1.0 %(w/v)인, 안정한 액체 약제학적 제제.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서,
    (C) 당은 단당류, 이당류, 올리고당, 다당류, 또는 이들 중 2 이상의 혼합물을 포함하고, (C) 당의 유도체는 당 알코올, 당 산, 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 안정한 액체 약제학적 제제.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서,
    (C) 당 또는 이의 유도체는 소르비톨, 만니톨, 트레할로스, 수크로오스, 또는 이들 중 2 이상의 혼합물을 포함하는, 안정한 액체 약제학적 제제.
  17. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서,
    (C) 당 또는 이의 유도체의 농도는 0.1 내지 15 %(w/v)인, 안정한 액체 약제학적 제제.
  18. 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서,
    (D) 아미노산은 유리 아미노산, 아미노산염, 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 안정한 액체 약제학적 제제.
  19. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서,
    (D) 아미노산은 아스파르트산, 히스티딘, 리신, 아르기닌, 또는 이들의 염을 포함하는, 안정한 액체 약제학적 제제.
  20. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서,
    (D) 아미노산은 히스티딘, 히스티딘염, 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 안정한 액체 약제학적 제제.
  21. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서,
    (D) 아미노산의 농도는 1 내지 20 mM인, 안정한 액체 약제학적 제제.
  22. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서,
    pH가 5.5 내지 6.5인, 안정한 액체 약제학적 제제.
  23. 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서,
    40±2℃에서 6주간 보관한 후 측정한 항체 모노머 순도가 95% 이상인, 안정한 액체 약제학적 제제.
  24. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서,
    5±3℃에서 12개월 보관한 후 측정한 항체 모노머 순도가 95% 이상인, 안정한 액체 약제학적 제제.
  25. 제 1항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서,
    정맥내, 근육내, 피내, 피하내, 복막내, 국소, 또는 이의 조합된 투여용인, 안정한 액체 약제학적 제제.
  26. 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 기재된 안정한 액체 약제학적 제제가 충진된 프리-필드 시린지(pre-filled syringe).
  27. 제 26항에 기재된 프리-필드 시린지가 그 내부에 포함된 자동주사기(auto-injector).
  28. 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항의 안정한 액체 약제학적 제제 및 용기를 포함하는 키트.
  29. 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항의 안정한 액체 약제학적 제제를 이용하여 질병을 예방, 진단 또는 치료하는 방법.
  30. 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항의 안정한 액체 약제학적 제제를 제조하는 방법.
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