JP6371222B2 - インフルエンザの受動免疫用抗体 - Google Patents

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関連出願
本出願は、２０１１年１２月５日に出願された米国特許出願第６１／５６７，０４６号の利益を享受するものであり、その全体は参照により本明細書に組み入れられる。

本発明は、インフルエンザに対する受動免疫の分野に関する。より具体的には、インフルエンザヘマグルチニンＡのＨＡ０成熟切断部位のコンセンサス配列の近傍に結合する特異的抗体に関し、ヒト細胞によって分泌される抗体を含む。

インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質（ＨＡ）は、インフルエンザ株間で非常に不均一な球状ヘッドドメイン、及び、細胞への侵入に必要な融合部位を含むストーク領域を有する。ＨＡはウイルスエンベロープ上に三量体として存在する。ヘマグルチニンタンパク質の非切断形態（ＨＡ０）は、トリプシンによってＨＡ１部分とＨＡ２部分に切断されることにより活性化され、これにより融合部位が病原性を発揮できるようになる。これら２つの切断部分は、ジスルフィド結合により連結を維持しているが、宿主細胞エンドソーム区画の低ｐＨ環境下でコンホメーション変化を起こし、それによりウイルスと宿主細胞膜との融合をもたらす。

切断部位は、インフルエンザＡ型とインフルエンザＢ型の両方、及び、インフルエンザＡ型とＢ型の様々な株に共通するコンセンサス配列を含む。非切断ヘマグルチニンタンパク質三量体（ＨＡ０）は不活性型と呼ばれるのに対し、ヘマグルチニンタンパク質がＨＡ１部分とＨＡ２部分に切断されると活性型と呼ばれる。

Ｂｉａｎｃｈｉ， Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． （２００５） ７９：７３８０−７３８８には、この切断部位のコンセンサス配列に基づく「ユニバーサル」インフルエンザＢ型ワクチンが記載されている。同文献には、この部位を含むペプチドは、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜タンパク質複合体と結合させると、マウスにおいて抗体を産生させることができたことが記載されいてる。また、コンセンサス配列に結合するモノクローナル抗体も記載されている。さらに、抗血清の受動伝達がマウスにおいて成功したことが観察されている。他の従来技術のワクチン、例えば、ＷＯ２００４／０８０４０３に記載されたインフルエンザのＭ２及び／又はＨＡタンパク質由来のペプチドを含むワクチンは、効力が弱いか、又は株を超えた効果がない抗体しか誘導できなかった。

従来技術における、ＨＡストーク領域に結合する抗体としては、Ｃｒｕｃｅｌｌ社によって開発され、Ｔｈｒｏｓｂｙ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ （２００８） ３：ｅ３９４２； Ｅｋｉｅｒｔ， Ｄ． Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （２０１１） ３３３：８４３−８５０； 及びＳｕｉ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （２００９） １６：２６５−２７３に記載された、ＣＲ６２６１及びＣＲ８０２０が挙げられる。また、Ｇｒａｎｄｅａ， Ａ． Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ＵＳＡ （２０１０） １０７：１２６５８−１２６６３に記載されているように、保存されたＭ２Ｅ抗原に対するモノクローナル抗体も開発されている。Ｍ２Ｅは感染した細胞の表面上にあり、アマンタジン及びリマンタジンの標的でもある。当該抗生物質に対する薬剤耐性が発生していることから、本標的が必須の機能を果たしていないと考えられている。

他の抗体は、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａのグループから公開されている（Ｃｏｒｔｉ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （２０１１） ３３３：８５０−８５６）。当該抗体はインフルエンザＡ型のグループ１とグループ２の両方の株に結合し、中和するが、以下の実施例において示すように、その有効性は本明細書に記載された抗体ほど高いものではない。また、Ｄｒｅｙｆｕｓ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （２０１２） ３３７：１３４３−１３４８に記載された、インフルエンザＡ型及びＢ型の両方に対して免疫反応性であるモノクローナル抗体は、以下に記載する抗体よりも効果が低い。

ＰＣＴ出願公開公報ＷＯ２０１１／１６００８３（参照により本明細書に組み入れられる）には、ヒト細胞に由来し、かつ受動ワクチンに有用である、モノクローナル抗体が記載されている。該抗体は、グループ１に属するインフルエンザウイルスのクレードＨ１に対して高い結合親和性を示し、また、該抗体の一部は、同じグループ１のＨ９に対して、及び／又は、グループ２のＨ７に対して、及び／又は、グループ１のＨ２に対して、高い親和性を示す。これらの抗体のいくつかは不活性型の三量体にのみ結合することから、コンセンサス切断領域に結合すると考えられるが、その他の抗体はすでに切断されている活性型ヘマグルチニンタンパク質に結合することができる。

他のクレードに結合し、増強された親和性を示す抗体は、依然として必要とされている。

本発明は、インフルエンザＡ型のグループ１とグループ２のいずれか一方又は両方に典型的な三量体に、増強された親和性で結合するモノクローナル抗体を提供する。このような抗体は、例えば従来同定されなかったインフルエンザ株又は現在利用可能な季節性ワクチンでは防御されない株によって、パンデミックが発生した場合に、受動免疫を与えることが可能である。抗体の少なくとも一部が多くの株に結合することは、必須部位を標的としていることを示しており、よって、そのような抗体はこれまで遭遇していない株にも結合する可能性がある。また、このような抗体は、ワクチン接種により十分な防御応答を獲得できない対象、又は、免疫系が弱いため高リスクにさらされている対象（例えば、乳幼児、高齢者、移植患者、癌又はＨＩＶの化学療法治療患者）における、感染の改善又は予防に有用である。

したがって、一態様では、本発明は、タイプ標本として、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１３、Ｈ１６を含むグループ１、又は、Ｈ３及びＨ７を含むグループ２のインフルエンザＡ型ウイルスと広く交差反応性であるか、グループを超えた反応性を示す、結合部分、特にはモノクローナル抗体又はその免疫反応性断片に関する。以下で説明する抗体のいくつかは、ＨＡ０タンパク質に含まれるエピトープに特異的に結合し、かつＨＡの天然の三量体のみならずその活性型をも認識する。

特に重要であるのは、特異的に結合するウイルスのクレードの範囲を広げることが可能な、二重特異性抗体及びその断片である。

当技術分野で十分理解されているとおり、フィブロネクチン、トランスフェリン又はリポカリンに基づいた結合剤を含む、非免疫グロブリンベースのタンパク質は、抗体と同様のエピトープ認識特性を備えることがあることから、これらもまた、好適な実施形態を提供することができる。アプタマー等の核酸ベースの成分もこうした結合特性を備える。

他の態様では、本発明は、既にウイルスに曝露され、又は感染している対象におけるウイルス感染を受動的に抑制するための、本発明の結合成分の使用方法に関する。また、本発明は、抗体又は断片を産生させるための組換え物質及び方法に関する。

インフルエンザウイルスの重要なクレードのグループへの本技術分野公知の分類を示す。 ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、ＭＡＢ５７９のいずれもグループ２を代表するＨ７及びＨ３の様々な株への結合の結果を示す。 ２つのリードモノクローナル抗体、ＭＡＢ５３（グループ１）及びＭＡＢ５７９（グループ２）が、それぞれのグループに亘るクレードを超えてサブｎＭレベルの親和性を有することを示す。 ＭＡＢ４８６及びＭＡＢ５７９の中和活性の対比である。図４Ａに示すとおり、ＭＡＢ４８６及びウサギ免疫からのポリクローナル調製物は、トリプシン非存在下でのみＨ１Ｎ１の中和効果を示す。対照的に、図４Ｂは、ＭＡＢ５７９がトリプシン存在下及び非存在下のいずれにおいても有効であることを示す。 ＭＡＢ５７９及びＭＡＢ５３の可変領域を含む二重特異性抗体を示す図である。 ＭＡＢ５３、ＭＡＢ５７９、これらの混合物、及び、図５に示す二重特異性抗体のｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示す。

本発明は、抗体及びその断片を含む、有用な結合成分を提供する。また、本発明は、そのような抗体を分泌する細胞を同定するための効果的な手段を提供し、これにより関連するコード配列を取得して保存することが可能となり、また、当該抗体をその後容易に組換え生産することができる。

本発明の抗体又は類似の結合成分は、予防と治療の両方に用いることができる。したがって、本発明の抗体又は類似の結合成分は、ウイルスによる攻撃から対象を保護することに用いることもできるし、既にインフルエンザに曝されているか又は感染している対象を治療するために使用することもできる。最終的に関心の高い対象はヒトであり、ヒトに使用する場合には、従来の天然型の抗体又はその免疫反応性断片である、ヒト型又はヒト化型結合成分が好ましい。しかし、実験動物を用いた研究で使用する場合には、ＣＤＲ領域によって決定づけられる適切な結合特性を有する抗体が、非ヒト特性を保持してもよい。以下の実施例に記載された実験はマウスで行われているが、当該実験で用いた抗体はヒトの可変領域及び定常領域を含む。

本発明の抗体を含む結合成分により、治療及び予防される対象は、ヒトの他、インフルエンザによる感染を受けやすい対象が含まれる。したがって、様々な哺乳動物、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、及び他の哺乳動物（ウマ、ペットなど）に対して、これらの結合成分は、予防的及び治療的に使用することができる。また、インフルエンザはトリ種に感染することが知られており、これらに対しても本発明の抗体を含有する組成物は有益である。

予防及び治療のための使用方法は一般的であり、通常よく知られている。抗体又は他の結合成分は、典型的には注射により投与されるが、経口ワクチンも効果的であると考えられている。投与量レベル及び投与時期は容易に最適化することができ、当業者の技能の範囲内にある。

有用な抗体を分泌するヒト細胞は、特に米国特許第７，４１３，８６８号（その内容は参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている、ＣｅｌｌＳｐｏｔ（商標）法を使用して、同定することができる。概説すると、本方法は、粒状標識による標識化と顕微鏡観察の利点を活かしたハイスループットアッセイにより、ヒト対象（又は他の対象）から得られた個々の細胞をスクリーニングすることができる。例示的な一実施形態では、１個の細胞が分泌した抗体を表面に吸着又は結合させ、次いで、各々区別可能な粒状標識と結合させた所望の抗原で前記表面を処理することにより、たった１個の細胞でさえもその分泌する抗体について分析することができる。よって、細胞のフットプリントを顕微鏡を用いて同定することができる。本技術を用いることにより、無数の細胞を所望の抗体分泌についてスクリーニングすることができ、かつ、本明細書に記載されるような株を超えたインフルエンザ受動免疫に望ましい抗体等の稀な抗体でさえも回収可能である。ヒト対象は少なくともいくつかのインフルエンザ株に対する既存の抗体を有し、本発明の方法で得られる抗体は保存された配列に結合するため、これらの抗体は、ヒト集団が経験したことのある株と同様に、新しい株に対処する目的にも合致する。

適切な抗体を取得する方法は、ＣｅｌｌＳｐｏｔ（商標）技術に限定されず、また、ヒト対象に限定されない。適切な抗体を産生する細胞は種々の手段によって同定することができ、また、該細胞はマウス又は他の齧歯類などの実験動物の細胞であってよい。抗体をコードする核酸配列を単離して、非ヒト細胞により産生されるキメラ型及びヒト化型の抗体を含む様々な型の抗体を産生させることができる。さらに、組換えにより産生される抗体又は断片は、単鎖抗体又はそれらのＦａｂもしくはＦａｂ２領域を含む。ヒト抗体はまた、ヒト免疫系を有するＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）などの宿主を用いて取得することができる。適切な結合特性についてスクリーニングするための抗体を産生させる手段は、当技術分野で周知である。

同様に、望ましい結合パターンを有するアプタマーを構築する手段もまた、当技術分野で知られている。

上述したように、抗体又は他の結合成分は、ヘマグルチニンタンパク質の活性型、不活性型、又はその両方に結合してもよい。該タンパク質の切断部位は株を超えて比較的保存されていることから、場合によっては、エピトープは前記切断部位であることが有利であるが、好ましくは、結合成分は三量体と活性型の両方に結合する。

インフルエンザＡ型とインフルエンザＢ型の様々な株の切断部位が知られている。例えば、前掲のＢｉａｎｃｈｉらによる論文は、表１に、いくつかの株の切断部位周辺の配列を示している。

表に示されるように、切断部位の上流のアルギニン残基から始まる形で厳密なコンセンサスが存在する。したがって、本発明の試験ペプチドに含まれる好ましいコンセンサス配列は、配列ＲＧＩ／Ｌ／ＦＦＧＡＩＡＧＦＬＥ（配列番号５７）を有する。なお、試験ペプチドではこの配列の一部のみを使用してもよい。

上述のとおり、所望の抗体を分泌する細胞の同定後は、それらをコードするヌクレオチド配列を取得すること、及び所望の抗体を組換えにより大規模で生産することは容易である。また、これにより例えば、単鎖抗体又はその可変領域のみとして産生させるために、抗体を操作することも可能である。

取得された核酸は、後の組換え産生のために物理的に保存及び回収することができ、かつ／又は、抗体のコード配列に関する配列情報を解読し、保存することで、後に適切な核酸を合成することができる。コード配列情報、及び、公知の組換え生産方法と共に迅速な合成やクローニング技術が利用可能となることで、パンデミック又は他の緊急時に必要な抗体を迅速に生産することができる。

参考までに、重鎖と軽鎖の両方のヒト定常領域の配列は既に開示されており、本明細書の配列番号１〜３に記載されている。前掲のＷＯ２０１１／１６００８３においては、可変領域のアミノ酸配列及びヌクレオチドコード配列が決定された種々のモノクローナル抗体が回収されており、当該抗体は種々のインフルエンザ株のＨＡタンパク質に様々な程度の親和性で結合する。特に関心の高い抗体の軽鎖と重鎖の両方の可変領域の構造を、本明細書の配列番号２２〜２５として示す。当該抗体は、ＭＡＢ８及びＭＡＢ５３を含む。ＭＡＢ５３及びＭＡＢ８は特定の親和性でＨ１と結合し；さらに、ＭＡＢ５３はＨ５、Ｈ７及びＨ９と強く結合する。ＭＡＢ８は、Ｈ７及びＨ２とも結合する。これらの抗体はいずれもＨ３と強く結合しないが、ＭＡＢ５７９は本明細書に記載されるようにＨ３と結合する。Ｈ７及びＨ３は特に魅力的な標的である。

より詳細には、これらのＭＡＢの各々は、適度な又は高い親和性で、少なくとも３つの異なるクレードに結合する。ＨＡ０タンパク質に対するＥＬＩＳＡアッセイで示されたとおり、ＭＡＢ５３はＨ１、Ｈ９及びＨ７クレード由来のＨＡ０に結合し、ＭＡＢ８はＨ１、Ｈ７クレード由来のＨＡ０に結合し、Ｈ３にはあまり強く結合しない。親和性はナノモル範囲内である。全てのグループ１クレード由来のＨＡの天然三量体に対する反応性は、ＨＥＫ２９３細胞で発現させたＨＡを使用し、フローサイトメトリーで測定した抗体結合により評価した。

これらの結果については、代替アッセイ系であるＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）バイオセンサーと呼ばれるバイオレベル干渉法ベースの結合アッセイを用いて確認した。このより正確なアッセイで測定された親和性は以下の通りである：
ＭＡＢ５３／Ｈ１＝６０ｐＭ，Ｈ５＝６ｎＭ，Ｈ７＝７０ｐＭ，Ｈ９＝３０ｐＭ；
ＭＡＢ８／Ｈ１＝９ｎＭ，Ｈ３＝１６ｎＭ，Ｈ５＝０．２ｎＭ。

本願で同定された追加の特異的抗体ＭＡＢ３８３、ＭＡＢ４８６、ＭＡＢ５７９、ＭＡＢ６９９、ＭＡＢ７００、ＭＡＢ７０８、ＭＡＢ７１０、ＭＡＢ７１１及びＭＡＢ７２３の重鎖可変領域及び軽鎖のアミノ酸配列を、配列番号４〜２１に示す。これらの抗体は、インフルエンザ株の追加のクレードとより強い親和性で結合する。例えば、ＭＡＢ５７９はＨ３とＨ７の両方に高い親和性で結合する。したがって、これらの抗体はインフルエンザの予防及び治療に有用な抗体のレパートリーを増やす。

２つの別個の抗体由来の抗原特異的ドメインを組み込んだ単一の抗体様分子（二重特異性抗体）を作製するための複数の技術が存在する。よって、それぞれグループ１とグループ２に対して広範な反応性を示す個別の抗体のＦａｂドメインを用いて、非常に広範な株への反応性を示す単一の抗体を構築することができる。適切な技術は、Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ社（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）、Ｍｉｃｒｏｍｅｔ社（Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）及びＭｅｒｒｉｍａｃ社（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）によって開示されている（例えば、Ｏｒｃｕｔｔ ＫＤ， Ａｃｋｅｒｍａｎ ＭＥ， Ｃｉｅｓｌｅｗｉｃｚ Ｍ， Ｑｕｉｒｏｚ Ｅ， Ｓｌｕｓａｒｃｚｙｋ ＡＬ， Ｆｒａｎｇｉｏｎｉ ＪＶ， Ｗｉｔｔｒｕｐ ＫＤ． Ａ ｍｏｄｕｌａｒ ＩｇＧ−ｓｃＦｖ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏｐｏｌｏｇｙ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ． （２０１０）２３：２２１−２２８； Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｊ， Ｌｕｇｏｖｓｋｏｙ Ａ． Ｒａｔｉｏｎａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｐａｔｈｗａｙｓ． ＭＡｂｓ． （２０１１） １：３（３）； Ｂａｅｕｅｒｌｅ ＰＡ， Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ Ｃ． Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． （２００９） ６９：４９４１−４９４４参照）。

したがって、二重特異性抗体を構築して、ヘマグルチニンタンパク質の複数のタイプに結合する抗体又は他の結合成分を提供することは特に有用である。特に有用な組み合わせは、ＭＡＢ５３（Ｈ１、Ｈ５、Ｈ９）とＭＡＢ５７９（Ｈ３、Ｈ７）の結合特異性を組み合わせることである。

本発明の抗体は全て、上述の新規抗体の結合特異性の少なくとも１つを含む。このような新規抗体は、前掲のＷＯ２０１１／１６００８３に記載された抗体、並びに本明細書に開示された新たなグループ抗体の他のメンバーを含む様々な他の抗体と組み合わせることができる。そのような結合特異性の可能な組み合わせは、全て本発明の範囲内に含まれる。

ＭＡＢ５３はＨＡ０と高い親和性で結合するが、ＨＡ１とは結合しないことから、相補的なＨＡ２断片に結合すると考えられ、その結合が確認された。ＭＡＢ５３は、ウェスタンブロット試験ではＨＡ０に結合しないため、ドミナントエピトープは少なくとも一部が立体構造的であると考えられる。ＭＡＢ８及びＭＡＢ５３は、Ｈ１クレードのＨＡ０タンパク質への結合において互いに競合することから、同じか又は近傍のエピトープに結合することが見出された。

上記ＷＯ２０１１／１６００８３において既に開示されたものを含めて、本明細書に開示する抗体の全ては、ＨＡトランスフェクト細胞の表面に発現した天然のＨＡ三量体と結合する。このような結合は、Ｅｍｏｒｙ大学のＳ． Ｇａｌｌｏｗａｙ及びＤ． Ｓｔｅｉｎｈａｕｅｒによって提供された、ＨＡをコードするプラスミドを用いて検証した。すなわち、本発明の種々のモノクローナル抗体によって認識されるクレードの細胞表面に提示される三量体は、これらのモノクローナル抗体によって認識される。

ＭＡＢ５３とＭＡＢ８は、ｐＨを６に下げるとＭＡＢ８がＨＡ０タンパク質から離れるのに対し、ＭＡＢ５３は離れないという点で相違することが示された。この相違は、それが中和能の予測となり得るため、重要である。ＭＤＣＫ標的細胞のプラーク減少アッセイを利用した、Ｈ１Ｎ１ウイルス感染中和能試験において、ＭＡＢ５３は、１〜５μｇ／ｍｌという低用量で、Ｈ１Ｎ１、Ｈ７Ｎ３、Ｈ５Ｎ１及びＨ９Ｎ２による感染を中和した。しかし、ＭＡＢ８はこれらの株による感染を中和しない。よって、一次スクリーニングの間は結合したモノクローナル抗体又は断片をｐＨ６で洗浄し、抗体−ウイルス複合体がエンドソーム区画を経由して細胞に侵入しても結合を維持せず、そのためウイルスを中和する能力が低下していると予想される抗体をＨＡ０モノクロ−ナル抗体から取り除くことによって、中和する系統を優先的に選択することができる。例えば、ＣｅｌｌＳｐｏｔ法では、ＨＡ０を固相支持体（蛍光ビーズ）に結合させて、ＭＡＢ又はＭＡＢの混合物と結合させ、その後ｐＨ６で洗浄することができる。

また、ＭＡＢ５３の段階的用量で前処理したマウスは、そのような投与がなければ致死的となる力価のＨ１Ｎ１及びＨ５Ｎ１ウイルスによる感染に対し、１００％の防御率で生き残ることが示された。この効力はＣｒｕｃｅｌｌ社によって記載された先行技術の抗体に匹敵するが、該抗体はグループ２の株に対して活性を示さない。Ｔｈｒｏｓｂｙ， Ｍ．， （前掲） ３：ｅ３９４２参照。Ｃｒｕｃｅｌｌ社の抗体は、ヒトＩｇＭ＋メモリーＢ細胞から回収された、Ｈ５Ｎ１及びＨ１Ｎ１に対して交差防御性である、ヘテロサブタイプの中和モノクローナル抗体である。ＭＡＢ５３も１０ｍｇ／ｋｇで完全な防御を与え；２ｍｇ／ｋｇで９０％が生存、かつ、０．４ｍｇ／ｋｇで５０％生存であった。Ｈ１Ｎ１による感染に代えてＨ５Ｎ１による感染を用いた場合、ＭＡＢ５３について、１０ｍｇ／ｋｇでは８０％の生存率が得られ；２ｍｇ／ｋｇでは６０％の生存率、そして０．４ｍｇ／ｋｇでは５０％の生存率が得られた。

ＭＡＢ５３、及び、同じ条件下で同じエピトープに結合する抗体、すなわち、ｐＨを６に下げたとき結合を維持する抗体は、流行病及びパンデミックから集団を防御するのに適し、かつ、免疫系が低下した患者の季節性インフルエンザに対する予防的又は治療的使用に適した、受動ワクチンとして有効である。ＭＡＢ５３のエピトープ結合領域と、本発明の抗体の高親和性結合エピトープとの組み合わせは、二重特異性抗体を構築する上で特に有用である。例えば、これは明らかに、ＭＡＢ５７９の結合領域が抗体に含まれている場合、同抗体におけるＨ７、Ｈ３及びＨ１との効果的な結合を可能にする。表２は、ＭＡＢ５７９によって示される、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質の種々の株に対するＩＣ５０を示す。

これらの値は、ＭＤＣＫ単層マイクロ中和試験により得た。また、種々の株に対するＭＡＢ５７９の親和性のグラフを図２に示した。示したとおり、Ｈ３及びＨ７とは強固に結合するが、Ｈ１については無視できるほどの結合親和性しか見られない。よって、ＭＡＢ５７９の結合領域を、Ｈ１への高い結合を示すＭＡＢの結合領域と組み合わせることが、特に有利である。結果としてこの場合、グループ１とグループ２の両方が対象となる。本発明の一実施形態は、ＭＡＢ５３が結合するエピトープと、ＭＡＢ５７９が結合するエピトープの両方に結合する二重特異性抗体を含む。

二重特異性抗体それ自体に加えて、本発明は、ウイルス感染を中和するための構築物における重鎖のみの使用を想定している；このような抗体も二重特異性であり得る。特異性は主に重鎖可変領域によって付与され、場合によっては、重鎖単独でもワクチンの活性成分として成功を収めていることが、本技術分野において理解されている。あるいは、適切な特異性を有する重鎖は、親和性又はウイルス中和能を向上させるために、様々な形態の軽鎖と結合させることができる。

本明細書に記載された抗体の重鎖のＣＤＲ３領域は延長されて、複数のチロシン残基を含有することが特に注意が必要である。これらのチロシン残基は翻訳後にスルホン化され得る。したがって、本発明の一部は、ＭＡＢ５７９、ＭＡＢ６９９、ＭＡＢ７００、ＭＡＢ７０８、ＭＡＢ７１０、ＭＡＢ７１１又はＭＡＢ７２３の重鎖のＣＤＲ３領域を含むワクチンに関し、前記領域にある１個以上のチロシン残基はスルホン化されていてもよい。これらの領域は、スルホン化の有無に関係なく、受動ワクチンとして単独で使用することもできる。ＣＤＲ３領域のスルホン化は、Ｍｏｎｉｇａｔｔｉ， Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ （２００２） １８：７６９−７７０に記載されるスルホン化の基準と一致している。その他の、重鎖のＣＤＲ３領域を単独でウイルス感染の中和に使用して成功した例は、Ｐｅｊｃｈａｌ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ （２０１０） １０７：１１４８３−１１４８８及びＬｉｕ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． （２０１１） ８５：８４６７−８４７６に記載されている。

本明細書で使用する用語「抗体」は、時々「断片」が重複して記載されていても、伝統的な抗体の免疫反応性断片が含まれる。したがって、抗体としては、Ｆａｂ断片、実質的に可変領域のみを含むＦｖ単鎖抗体、二重特異性抗体、及び依然として免疫特異性を保持しているそれらの種々の断片化された形態、並びに、より伝統的な天然に存在する抗体の可変領域の活性に近似するアミノ酸配列又は修飾アミノ酸配列（すなわち、擬似ペプチド）を含むことによって、「天然の」抗体の活性を模倣する一般のタンパク質が挙げられる。

抗体の構造
これらは以下の順序で提示される：
１． ヒトＩｇＧ１重鎖の定常領域、ヒト定常κ及びヒト定常λのアミノ酸配列；
２． ＭＡＢ ３８３、４８６、５７９、６９９、７００、７０８、７１０、７１１及び７２３の重鎖及び軽鎖の可変領域の重鎖及び軽鎖アミノ酸配列（ＭＡＢ ５７９、６９９、７００、７０８、７１０、７１１及び７２３のＣＤＲ領域は下線で示す）；
３． ＷＯ２０１１／１６００８３に記載された、ＭＡＢ８及びＭＡＢ５３の重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列（ＷＯ２０１１／１６００８３に示される軽鎖配列は定常領域を含んでいるが、これは削除される）；
４． ヒトＩｇＧ１重鎖の定常領域、ヒト定常κ及びヒト定常λをコードするヌクレオチド配列；
５． ＭＡＢ ３８３、４８６、５７９、６９９、７００、７０８、７１０、７１１及び７２３の重鎖及び軽鎖の可変領域の、重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
６． ＭＡＢ８及びＭＡＢ５３の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。

示したＣＤＲ領域に関して、ＣＤＲを同定するための２つ以上の手法が存在することに留意すべきである。最も頻繁に使用されているのは、Ｗｕ， Ｔ． Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． （１９７０） １３２：２１１−２５０に最初に記載されたＫａｂａｔ法である。Ｋａｂａｔ法は、ＣＤＲに関連づけられる特定の位置を同定する上で、広く採用されている方法である。他の方法であるＣｈｏｔｈｉａナンバリング方式は、若干異なる結果を与える。この方法は、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． （１９９７） ２７３：９２７−９４８に記載されている。どの方法を用いるかによって、わずかに異なるＣＤＲの結果が得られる。例えば、ＭＡＢ５３において、Ｋａｂａｔ法に従った重鎖ＣＤＲはＫＹＡＩＮであるが、Ｃｈｏｔｈｉａ法ではＧＧＩＩＲＫＹＡＩＮとなる。重鎖ＣＤＲ２領域では、Ｎ末端にＧが追加され、かつ、ＣＤＲ３領域では、Ｎ末端にＡＲが追加される。軽鎖では、ＣＤＲは両方法で同一である。

これらの両方法について、いくつかの反論が様々な研究者から指摘されている；したがって、本明細書及び特許請求の範囲で指定するＣＤＲ領域はやや異なり得ることが理解される。得られる可変領域がその結合能力を保持する限り、ＣＤＲ領域の正確な位置は重要ではなく、特許請求の範囲で指定するこれらの領域は、一般に認められた任意のシステムによって同定されたＣＤＲを含むものとみなされるべきである。

以下の実施例は例示のために提供されるものであり、本発明を限定するものではない。

実施例１
ＭＡＢ５３及びＭＡＢ５７９の親和性
ＭＡＢ５３の親和性は、上述のＰＣＴ公開公報で報告されている。この抗体はクレードＨ５、Ｈ７、Ｈ１及びＨ９からのＨＡに強く結合し、Ｈ２及びＨ３に対する親和性は低い。ＭＡＢ５７９は、Ｈ７及びＨ３に関して高い親和性でＨＡに結合する。図３Ａ及び３Ｂは、各抗体についての標準ＦｏｒｔｅＢｉｏ（商標）アッセイを用いた典型的な結果を示す。

実施例２
ＭＡＢ４８６及びＭＡＢ５７９による感染の中和
ＭＡＢ４８６及び５７９は、感染初期にトリプシンの存在下又は非存在下で、ＭＤＣＫ細胞単層のＨ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２（Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／２００９）による感染並びにプラーク形成を阻害するかについて試験した。ＭＡＢ４８６及びｐＡｂ ｘＣＰ（切断部位のコンセンサス配列に対するウサギポリクローナル抗体）は、図４Ａに示すようにトリプシンの非存在下でのみＨ１Ｎ１（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９）を中和し、ウイルスが最初にトリプシンで活性化された場合には感染及びプラーク形成を阻害することができない。このことは、インタクトな融合ペプチド上（すなわち、プロテアーゼ感受性の）エピトープを含む融合領域に対する抗体が、ウイルス感染を防御する上で効果的ではないことを示している。図４Ｂに示すように、ＭＡＢ５７９はトリプシンの存在下及び非存在下のいずれにおいても感染を阻害する。

感染を中和するＭＡＢ５３の能力は以前に報告されている。しかし、Ｃｒｕｃｅｌｌ社のモノクローナル抗体ＣＲ６２６１と対比した、ｉｎ ｖｉｔｒｏの中和活性の親和性及びＥＣ５０の比較を下記の表１２に示す。

ＥＣ５０の値は上記のように得られた。

実施例３
エピトープの決定
ＭＡＢ５３及びＭＡＢ５７９の結合部位をマッピングするために、Ｐｅｐｓｃａｎ ＣＬＩＰＳ（商標）技術を使用した。様々な長さを有し、かつ、天然の構造を模倣するために様々な長さのコネクターを両端に有する、約６，０００のユニークなペプチドをＨ１及びＨ３のために合成した。ＭＡＢ５３及びＭＡＢ５７９によるストーク領域への結合は、競合物質として球状ヘッド又はストークに対するウサギ血清を用いて、ストーク領域由来のペプチドへの直接結合によって確認した。上述したように、ＭＡＢ４８６はグループ１とグループ２の両方に結合するが、ＨＡ０がジスルフィド結合で連結したＨＡ１とＨＡ２にプロテアーゼ切断される前の前活性化状態においてのみ結合する。クレードを超えた結合のためのエピトープは、天然の三量体ＨＡ０の２つの単量体にわたる不連続なエピトープであると結論づけられた。

実施例４
ｉｎ ｖｉｖｏ効力（ＭＡＢ５３）及び薬物動態（ＭＡＢ５３及びＭＡＢ５７９）
これらの実験で使用した株は以下のとおりである：
Ｈ１Ｎ１： Ａ／ＣＡ／０４／０９；
Ｈ５Ｎ１： Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４／ＨＰＡＩ；
Ｈ３Ｎ２： Ａ／Ｐｅｒｔｈ／１６／０９；
Ｈ７Ｎ３： Ａ／Ｒｅｄ Ｋｎｏｔ／ＮＪ／１５２３４７０／０６。

予防を試験するために、−１日目にＭＡＢ５３を１０ｍｇ／ｋｇの単回腹腔内投与でマウスに与え、続いて０日目にＬＤ５０の１０倍のウイルス用量を鼻腔内に投与した。１〜１．５ｍｇ／ｋｇのＥＣ５０を示すことが報告されている（Ｋｏｕｄｓｔａａｌ， Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． （２００９） ２００：１８７０−１８７３）Ｃｒｕｃｅｌｌ社の抗体ＣＲ６２６１と比較して、ＭＡＢ５３は、０．４ｍｇ／ｋｇのＥＣ５０を示し、効力が高いことが判明した。

治療有効性を試験するために、ほとんどの株については＋３日目に、Ｈ７Ｎ３については＋１日目に、ＭＡＢを１０ｍｇ／ｋｇの単回腹腔内投与で与えた。ＭＡＢ５３はＨ１Ｎ１及びＨ５Ｎ１に対して十分に有効である一方、全ての対照マウスは１０日目までに死亡した。ＭＡＢ５７９はＨ３Ｎ２及びＨ７Ｎ３に対して基本的に十分に有効である一方、全ての対照マウスは１０日目以前に死亡した。

また、体重減少を測定したところ、処置マウスにおいて体重減少は２０％より悪くなることはなかった。

タミフル（Ｔａｍｉｆｌｕ（登録商標））（リン酸オセルタミビル）による治療と比較するために、マウス（１群１０匹）を麻酔し、ウイルス（Ｈ１Ｎ１ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｃａ／０４／０９）をＬＤ５０用量の１０倍量で鼻腔内感染させた。ＭＡＢ５３（又は対照のアイソタイプ適合ヒトＩｇＧ）を感染後＋１日目に腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。タミフル（登録商標）は、感染後＋１日目から開始して４日間、１日２回強制経口投与した。死亡率及び罹患率（体重減少により評価）のいずれについても、ＭＡＢ５３コホートと比較して、タミフル（登録商標）コホートがはるかに重症であった。

対照では、マウスの全てが感染後８日までに死亡した。タミフル（登録商標）治療群では、２匹を除いた全てのマウスが感染後８日目より前に死亡した；これら２匹のマウスは少なくとも１４日目まで生き残った。ＭＡＢ５３治療群では、１０匹のうち８匹のマウスが８日目を過ぎて１４日目まで生き残った。

体重減少に関しては、対照群は８日後には、初期体重の７０％にまで体重が減少した。ＭＡＢ５３治療マウスでは、体重減少は４日目に増加に転じ、１４日目までに初期体重を超えた。タミフル（登録商標）治療マウスでは、体重減少は６日目に増加に転じたが、１４日目までに初期体重の９２％までしか戻らなかった。

また、ＭＡＢ５３及びＭＡＢ５７９について薬物動態をマウスで調べた。これらは、ヒトにおける３〜４週の半減期に該当する、約７〜１４日の半減期をマウスで示す。これは、ＩｇＧ１ κ ＭＡＢに典型的な半減期に相当する。二重特異性抗体ＭＡＢ５７９／５３Ｂｉ（実施例５参照）は同様の半減期を示す。

実施例５
ＭＡＢ５７９／５３Ｂｉの構築
ＭＡＢ５７９／５３Ｂｉの構築は、図５に示すように、ＭＡＢ５７９の定常領域にＭＡＢ５３のｓｃＦｖ部分を結合することにより行った。このような二重特異性抗体の構築は当技術分野でよく知られている（Ｍａｒｖｉｎ， Ｊ． Ｓ．， Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ （２００５） ２６：６４９−６５８）。よって、ＭＡＢ５７９／５３Ｂｉは、インタクトなＦｃ領域と共に、この分子の両端に二価結合を提供する。表１３は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（商標）による測定により、前記二重特異性抗体が独立した抗体の親和性（ｎＭ）を保持していることを示している。本二重特異性抗体はさらに、それを構成する個々の抗体の中和能力を保持しており、Ｈ１Ｎ１に対して３．５μｇ／ｍｌ；Ｈ５Ｎ１に対して６．０μｇ／ｍｌ；及び、Ｈ３Ｎ２に対して２．２μｇ／ｍｌのＥＣ５０を有する。

実施例６
ＭＡＢ５７９／５３Ｂｉのｉｎ ｖｉｖｏ効力
ｉｎ ｖｉｖｏ効力を、実施例４において一般的に記載したとおり測定し、その結果を図６Ａ〜６Ｅに示す。

図６Ａ及び６Ｃに示すように、マウスを、０日目にＡ／Ｃａ／０４／０９（Ｈ１Ｎ１）（インフルエンザグループ１を代表する）に感染させ、２日目に１０ｍｇ／ｍｌのＭＡＢ５３単独、１０ｍｇ／ｍｌのＭＡＢ５７９単独、又は、ＭＡＢ５３とＭＡＢ５７９の混合物（図６Ａ）か二重特異性抗体（図６Ｃ）のいずれかをＩＰ注射により処置した（図６Ｃは体重減少曲線も示す）。対照には２０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧを投与した。ＭＡＢの混合物はそれぞれ１０ｍｇ／ｋｇで投与し、二重特異性抗体は１０ｍｇ／ｋｇで投与した。図６Ａに示すように、ＭＡＢ５３単独、及び、ＭＡＢ５３とＭＡＢ５７９との混合物は防御的であったが、ＭＡＢ５７９投与群及び対照群では、１０日後に生存無しとなった。図６Ｃに示すように、二重特異性抗体は混合物と同程度に効果的であった。

図６Ｂ及び６Ｄに示すように、グループ２を代表するＰｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ ２／８２（Ｈ２Ｎ３）に感染させたマウスについて類似のプロトコルを用いることにより同様の結果が得られた（図６Ｄは体重減少曲線をも示す）。図６Ｂに示すように、混合物はＭＡＢ５７９と同様にこのウイルスに対して有効であったが、ＭＡＢ５３単独投与群及び対照群は１０日後に死亡した。図６Ｄは、二重特異性抗体が混合物と同程度に効果的であることを示している。

図６Ｅは、類似のプロトコルを用いて、グループ１及びグループ２を代表するＨ１Ｎ１とＨ２Ｎ３の両方を同じマウスに感染させた場合の感染治療結果を示す。それぞれ３ｍｇ／ｋｇずつのＭＡＢ５７９とＭＡＢ５３との組み合わせは完全に防御的であり、それぞれ１ｍｇ／ｋｇずつではマウスの８０％を防御した。このことは、重感染が自然界で発生しており、それがパンデミックを引き起こす可能性がある組換えウイルスをもたらすことから、非常に重要である。

Claims (10)

1. インフルエンザＡウイルスクレードＨ３及びＨ７による感染を中和する、
   モノクローナル抗体、又はその免疫反応性断片であって、
   該抗体は、（ｉ）配列ＡＹＴＩＨのＣＤＲ１、及び、配列ＷＩＮＡＧＮＧＨＴＫＹＳＱＲＦＫＧＲのＣＤＲ２、及び、配列ＧＰＥＴＹＹＹＤＫＴＮＷＬＮＳＨＰＤＥＹＦＱＨのＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに、（ｉｉ）配列ＲＡＳＱＴＩＮＮＹＬＡのＣＤＲ１、及び、配列ＫＡＳＳＬＥＳのＣＤＲ２、及び、配列ＱＥＹＮＮＤＳＰＬＴのＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を有する抗体。
2. 二重特異性である、請求項１に記載の抗体又は断片。
3. 配列ＫＹＡＩＮのＣＤＲ１、及び
   配列ＧＩＩＡＩＦＮＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧのＣＤＲ２、及び
   配列ＧＭＮＹＹＳＤＹＦＤＹのＣＤＲ３（ＭＡＢ５３）
   を含む重鎖可変領域、並びに、
   配列ＲＡＳＱＳＶＲＳＮＮＬＡのＣＤＲ１、及び
   配列ＧＡＳＳＲＡＴのＣＤＲ２、及び
   配列ＱＱＹＧＳＳＰＡＬＴのＣＤＲ３（ＭＡＢ５３）
   を含む軽鎖可変領域をさらに含む、請求項２に記載の抗体又は断片。
4. 配列ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＡＹＴＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＷＩＮＡＧＮＧＨＴＫＹＳＱＲＦＫＧＲＶＴＩＴＲＤＴＳＡＲＴＴＹＭＥＬＲＳＬＴＳＥＤＴＡＬＹＦＣＡＲＧＰＥＴＹＹＹＤＫＴＮＷＬＮＳＨＰＤＥＹＦＱＨＷＧＨＧＴＱＶＴＶＳＳを含む重鎖を含み、かつ、配列ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＴＩＮＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＫＡＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＥＹＮＮＤＳＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫを含む軽鎖を含む（ＭＡＢ５７９）、請求項１又は請求項３に記載の抗体又は断片。
5. 二重特異性抗体又は断片であり、以下の配列：
   ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＲＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＶＳＧＧＩＩＲＫＹＡＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＡＩＦＮＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＬＹＹＣＡＲＧＭＮＹＹＳＤＹＦＤＹＷＧＱＧＳＬＶＴＶＳＰ（ＭＡＢ５３）を含む第二の重鎖をさらに含み、かつ、
   配列ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＲＳＮＮＬＡＷＹＱＨＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＦＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＡＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（ＭＡＢ５３）を含む軽鎖も含む、請求項４に記載の抗体又は断片。
6. 請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の抗体又は断片を含有する薬学的組成物。
7. 対象におけるインフルエンザ感染の治療方法又は予防方法に使用するための、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の抗体又は断片。
8. 発現のための制御配列に機能的に連結された、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の抗体又は断片の重鎖及び／又は軽鎖可変領域をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む、組換え発現系。
9. 請求項８に記載の発現系を含むように改変された、組換え宿主細胞。
10. 請求項９に記載の細胞を、前記ヌクレオチド配列が発現される条件下で培養することを含んでなる、インフルエンザウイルスと免疫反応性のモノクローナル抗体又は断片の産生方法。