CN112159468A

CN112159468A - 一种具有中和活性的抗h1n1流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体zju-a1

Info

Publication number: CN112159468A
Application number: CN202011007331.XA
Authority: CN
Inventors: 吴海波; 吴南屏; 姚航平; 杨帆; 王莉彦
Original assignee: First Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine
Current assignee: First Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine
Priority date: 2020-09-23
Filing date: 2020-09-23
Publication date: 2021-01-01
Anticipated expiration: 2040-09-23
Also published as: CN112159468B

Abstract

本发明提供一种具有中和活性的抗H1N1流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU‑A1。该抗体能特异性识别H1N1流感病毒的血凝素蛋白，并通过中和作用发挥抗病毒效应。产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞是由经纯化的血凝素蛋白免疫的BALB/C小鼠脾淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆和传代流程筛选后获得，最终能稳定分泌抗体ZJU‑A1。抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID No.2，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。ZJU‑A1能有效结合、中和及治疗H1N1流感病毒，可与其他抗体或药物联合使用。

Description

一种具有中和活性的抗H1N1流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体 ZJU-A1

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及抗H1N1流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备及应用，是利用细胞工程、抗体工程技术，获得分泌抗血凝素蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，通过同品系的小鼠诱导腹水，制备抗血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU-A1，鉴定为IgG1、κ型，再通过亲和纯化、免疫等技术实现对该抗体的应用。

背景技术

1918年，因H1N1引发的“西班牙流感”席卷全球，造成数千万人患病死亡，是人类已知且有详实记录的最为严重的流感大流行，其感染率、致死率及在世界范围内传播的速度前所未有；2009年的“墨西哥流感”在北半球夏季出现传播迅速的反季节流行，造成大量人员死亡，世界卫生组织一度将流感大流行的警戒级别提高至6级，病原为变异后的新型甲型H1N1流感病毒；2018年初，我国冬季流感主要流行型别由B型Yamagata系悄然转变为甲型H1N1，且来势迅猛；至今，H1N1仍在世界范围内引起死亡病例的增加。其早期症状与普通流感相似，易被轻视，但病情可迅速进展，突然高热、肺炎，重者可以出现呼吸衰竭、多器官损伤，甚至死亡，病死率可达6％。

由于甲型H1N1流感病毒对M2离子通道阻滞剂金刚烷胺和金刚乙胺普遍耐药，目前主要使用神经氨酸酶抑制剂奥司他韦和扎那米韦等治疗。但临床研究发现药物暴露期间，流感病毒会出现耐药突变，导致对奥司他韦出现耐药，特别是在幼儿(小于5岁)、免疫功能低下者和接受预防性治疗方案的个体中。另外，在体外实验中也证实了基因突变会导致对奥司他韦、法匹拉韦产生抗性。

目前治疗性抗体药物研发已经成为生物技术药物领域的热点，使用治疗性抗体治疗H1N1感染具有良好前景。已有研究证明在疾病早期(发病后72小时内)给予含有中和性抗体的恢复期血浆对疾病转归具有极大的益处。但恢复期血浆有导致发热和过敏反应、输血相关的急性肺损伤等风险。而单克隆抗体具有特异性高、靶向性强、毒副作用低等优点，因此发展一种针对H1N1流感的中和性单克隆抗体迫在眉睫。

基于以上背景，本项目选定血凝素蛋白为靶抗原，采用融合杂交瘤技术建立稳定分泌抗血凝素蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系，并大量制备、纯化和鉴定这些单克隆抗体。该单克隆抗体的成功获得，为治疗新型H1N1流感病毒感染提供新思路。

本发明用到杂交瘤细胞技术。该技术将免疫小鼠的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以建立分泌均质抗体的杂交瘤细胞系，也称为单克隆抗体技术。该技术涉及到动物免疫、细胞培养、细胞融合、细胞克隆培养和免疫测定等一系列方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗H1N1流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体，能特异性识别H1N1流感病毒并发挥抗病毒效应。该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，命名为ZJU-A1。抗体的重链DNA序列如SEQ ID No.1、重链氨基酸序列如SEQ ID No.2；轻链DNA序列如SEQ ID No.3、轻链氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

SEQ ID No.1

Heavy chain:DNA sequence(417 bp)

Signal sequence-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

ATGGGATTCAGCAGGATCTTTCTCTTCCTCCTGTCAATAACTACAGGTGTCCACTCCCAGGCTTATCTACAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGTCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTTAGCAATTACAATATACACTGGATAAAGCAGACACCTGGACAGGGCCTGGAATGGATTGGATACATTTATCCTGGAAATGGTGGTGCTACCTACGATCAGAAGTTCAAGGTCAAGGCCACATTGACTGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACATTCATATCAGCAGCCTGTCATCTGAAGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGAGCCCTTTCCTTCGCCTACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA

SEQ ID No.2

Heavy chain:Amino acid sequence(139 aa)

Signal peptide-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

MGFSRIFLFLLSITTGVHSQAYLQQSGAELVRSGASVKMSCKASGYTFSNYNIHWIKQTPGQGLEWIGYIYPGNGGATYDQKFKVKATLTADTSSNTAYIHISSLSSEDSAVYFCARALSFAYWYFDVWGAGTTVTVSS

SEQ ID No.3

Light chain:DNA sequence(381 bp)

Signal sequence-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

ATGGAGTCACAGACTCAGGTCTTTGTATACATGTTGCTGTGGTTGTCTGGTGTTGATGGAGACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATTTGGGTTCTGATGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAAGCACTGATTTACTCGGCATCCTACCGGGACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTTTGTCACCAATATAACAACTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA

SEQ ID No.4

Light chain:Amino acid sequence(127 aa)

Signal peptide-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

MESQTQVFVYMLLWLSGVDGDIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNLGSDVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRDSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCHQYNNYPYTFGGGTKLEIK

所述单克隆抗体由杂交瘤细胞产生。产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞是由免疫的BALB/C小鼠脾淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆、传代和反复冻存、复苏后获得的杂交瘤细胞系ZJU-A1，能稳定分泌抗H1N1流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU-A1。

单克隆抗体ZJU-A1的制备方法，通过以下步骤和技术方案实现：

(1)动物的免疫：选择6周龄的BALB/C小鼠，以纯化的H1N1流感病毒血凝素蛋白对小鼠进行免疫。血凝素蛋白由H1N1流感病毒减毒株接种鸡胚，培养并收获病毒液，经甲醛灭活、纯化、裂解及再纯化等方法，以磷酸缓冲液稀释制备获得。

(2)小鼠骨髓瘤细胞的培养：培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并使之保持良好的生长状态，用于细胞融合。

(3)细胞融合：采用聚乙二醇融合法。以BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，在融合前一天，于96孔培养板中接种BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞，并用含20％牛血清的次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶培养基培养一天。将(1)中备好的小鼠处死，获取脾脏淋巴细胞。收集(2)中的SP2/0。将上述两种细胞混合离心，然后以聚乙二醇介导细胞融合。融合后的细胞适当稀释，接种至饲养细胞培养板，适当条件培养。

(4)杂交瘤细胞的筛选：将上述培养物在次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶选择性培养基中培养。在细胞集落长到大小合适时，吸取细胞培养上清液做抗体鉴定，筛选阳性克隆。

(5)杂交瘤细胞的克隆化：以有限稀释法克隆杂交瘤细胞，即将稀释到一定密度的细胞接种至96孔板，使每孔只有一个细胞生长。形成细胞集落的孔取培养上清液做酶联免疫吸附实验，鉴定阳性克隆。重复有限稀释若干次，直到杂交瘤细胞的阳性孔率达到100％。将克隆化后的杂交瘤细胞扩大培养做抗体鉴定及理化性状分析。

(6)单抗腹水的诱导：在接种杂交瘤细胞前一周，给每只BALB/C小鼠腹腔注射石蜡油0.5毫升，然后接种5×10⁶个阳性杂交瘤细胞每只，10天后收集腹水离心，测定抗体效价，并纯化单克隆抗体。

(7)单克隆抗体的纯化：利用Protein G亲和纯化法纯化腹水中的单克隆抗体。

(8)本发明得到一个产生抗H1N1流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体杂交瘤系，即ZJU-A1，ZJU-A1杂交瘤细胞系经4次克隆化，持续培养六月余，分泌抗体稳定。该细胞株经液氮冻存，复苏后生长良好，抗体分泌未见衰退。酶联免疫吸附实验法测得ZJU-A1培养上清效价为1:640，腹水效价分别为1:25600。经单克隆抗体免疫球蛋白亚型分析显示该杂交瘤细胞产生的抗体类型为IgG1。

本发明提供产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，它是由免疫的BALB/C小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆、传代和反复冻存、复苏后获得的小鼠杂交瘤细胞系ZJU-A1，能稳定分泌抗H1N1流感病毒HA蛋白的单克隆抗体ZJU-A1。

本发明的另一个目的是提供单克隆抗体ZJU-A1的用途及使用方法。

抗H1N1流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU-A1在制备用于中和H1N1流感病毒药物中的应用。

本发明单克隆抗体ZJU-A1能有效结合、中和H1N1流感病毒。本发明的优点在于ZJU-A1具备抗病毒效应，在细胞及动物体内均得到验证，将为抗H1N1流感病毒的预防与治疗提供新的参考方案。

说明书附图

图1为单克隆抗体ZJU-A1的免疫球蛋白亚型分析。

图2为单克隆抗体ZJU-A1的效价检测结果。

其中，阴性对照：小鼠IgG1无关抗体，为对照组；效价光密度值≥0.5即为单克隆抗体的有效浓度范围；每个稀释度含2个复孔。

图3为单克隆抗体ZJU-A1体外中和效应检测结果。

ZJU-A1针对H1N1流感病毒(A/Michigan/45/2015)的体外中和效应，每个稀释度含4个复孔。

图4为单克隆抗体ZJU-A1在小鼠体内的预防效果。

其中A：小鼠体重变化曲线；B：小鼠生存曲线。

图5为单克隆抗体ZJU-A1在小鼠体内的治疗效果。

其中A：小鼠体重变化曲线；B：小鼠生存曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

本发明选定H1N1流感病毒血凝素蛋白为靶抗原，采用融合杂交瘤技术建立稳定分泌抗血凝素蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系，并大量制备、纯化和鉴定这些单克隆抗体。该单克隆抗体的成功获得，不仅为建立新型的H1N1流感病毒诊断方法——基于免疫学技术的诊断奠定基础，而且也为抗H1N1流感病毒的治疗提供了新的方案。同时对疾病发病机理、诊断、预后及疗效判定等方面的研究起到重要作用。

实施例1.抗H1N1流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体的制备方法

(1)小鼠的免疫：首次免疫，将纯化的H1N1流感病毒血凝素全蛋白与佐剂按等体积混合均匀。每只BALB/C小鼠0.1毫升(含H1N1流感病毒血凝素蛋白30微克)大腿内侧肌肉注射。第21天按同样方式加强免疫一针。第35天采微量尾静脉血进行酶联免疫吸附实验测定，抗体滴度达到1:256000，随即尾静脉注射加强免疫一次，于3天后进行细胞融合。

(2)小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养：把来自BALB/C小鼠的SP2/0骨髓瘤细胞株以含10％牛血清DMEM培养基培养传代，在含5％二氧化碳、37℃孵箱中培养。融合前一天传代以保证融合时细胞进入对数生长期。

(3)细胞融合：以BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，在融合前一天，接种BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞于96孔培养板，含20％牛血清的次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶培养基培养一天。次日取脾脏，采用压力注水法分离脾细胞，离心洗涤细胞2次后用培养液重悬。收集小鼠SP2/0骨髓瘤细胞，离心，洗涤2次后用培养液重悬，作为待融合的SP2/0细胞。以1×10⁸个免疫小鼠脾淋巴细胞与2×10⁷个小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合，离心弃上清，轻弹管壁，混匀细胞。用37℃预温的0.9毫升聚乙二醇于90秒内逐滴加入细胞沉淀中，其间轻轻振摇离心管，静置1分钟。然后按先慢后快的原则，于第1分钟内加完1毫升无血清DMEM，于第2分钟内加完2毫升无血清DMEM，于第3分钟内加完7毫升无血清DMEM，以后1分钟内逐渐加入37℃预温的无血清DMEM培养基40毫升。1000转每分钟低速离心10分钟。然后加入20％牛血清次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶培养基，分别接种到加有饲养细胞的96孔培养板，一般每次融合的细胞铺2块板，置37℃、5％二氧化碳孵箱中培养。

(4)杂交瘤细胞的筛选：每隔4天半量换液一次，融合后的杂交瘤细胞在含次黄嘌呤-磷酸核糖转移酶的选择性培养液中大约持续培养两周。在细胞集落长到适当大小时，吸取培养液上清做酶联免疫吸附实验，筛选阳性克隆。采用酶联免疫吸附实验间接法筛选阳性杂交瘤克隆。主要步骤：①0.01摩尔每升pH9.6碳酸盐缓冲液稀释H7N9血凝素蛋白，浓度20纳克/孔，分别于96孔酶标板加入0.1毫升每孔包板，4℃过夜；②0.01摩尔每升pH7.4磷酸盐缓冲液吐温20洗板三次；③用2％牛血清白蛋白0.01摩尔每升pH 7.2的磷酸盐缓冲液室温封闭2小时；④同上洗板；⑤加入杂交瘤培养上清，0.1毫升每孔，同时设阳性对照(免疫小鼠的血清)、阴性对照(SP2/0培养上清液)和空白对照，室温反应2小时；⑥洗板；⑦加1:6000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG，0.1毫升每孔，室温反应1小时；⑧洗板；⑨加入底物室温避光反应5分钟；⑩2摩尔每升硫酸终止反应；450纳米测定其光密度值，以测定值除以阴性值≥2.1为阳性。

(5)杂交瘤细胞的克隆化：杂交瘤细胞的克隆化培养按有限稀释法进行，选择抗体检测阳性的杂交瘤孔细胞作适当稀释后，计数细胞。用次黄嘌呤-磷酸核糖转移酶培养基稀释成10个每毫升的细胞悬液，接种到已有饲养细胞的96孔培养板中，每孔0.1毫升，10天后观察细胞生长情况，并检测上清液中抗体水平，选择5个抗体滴度最高的单个克隆细胞生长的培养孔，作再次有限稀释。此方法可重复多次，直至单克隆孔抗体检测阳性率为100％。

(6)诱生腹水：在接种杂交瘤细胞前一周，给BALB/C小鼠腹腔注射石蜡油每只0.5毫升，然后每只接种5×10⁶个阳性杂交瘤细胞，10天后收集腹水测定抗体效价。

(7)单克隆抗体的纯化：采用亲和纯化法(Protein G交联的Sepharose)纯化腹水中单克隆抗体。①腹水用预冷的结合缓冲液稀释3倍后,于4℃10000转每分钟，离心15分钟去除沉淀物。②用10倍柱床体积的结合缓冲液充分流洗预装有Sepharose-Protein G的亲和纯化柱。③将稀释的腹水上柱，控制流速10滴每分钟。④将流穿的腹水重复上柱一次。⑤用20倍柱床体积的结合缓冲液充分洗涤，直至流穿液280纳米吸光值小于0.01。⑥用洗脱缓冲液洗脱结合的单克隆抗体，控制流速10滴每分钟，收集洗脱液于预加有0.1毫升的磷酸钾缓冲液(PH8.0，0.5摩尔每升)的收集管中，每管收集1毫升含抗体的洗脱液，共收集20管以上。⑦于280纳米检测每管洗脱液的吸光度，并收集吸光值大于0.2的洗脱液。⑧将收集的洗脱液置于透析卡中，并于0.1摩尔每升PH7.0的磷酸盐缓冲液中透析。每隔6小时换液一次，共透析24小时。⑨将透析后的抗体溶液稀释后，于280纳米测蛋白含量。⑩将纯化的抗体分装于小管中，置于低温冰箱备用。

(8)单克隆抗体的亚型鉴定:采用Bio-Rad公司小鼠单克隆抗体免疫球蛋白分型试剂盒分析。操作严格按试剂盒说明书进行。试验结果为ZJU-A1杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体ZJU-A1为IgG1、κ型。

结果见附图1。

ZJU-A1杂交瘤细胞系经4次克隆化，持续培养六月余，分泌抗体稳定。该细胞株经液氮冻存，复苏后生长良好，抗体分泌未见衰退。抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID No.2，(DNA序列如SEQ ID No.1)，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.4(DNA序列如SEQ ID No.3)所示。

实施例2.抗H1N1流感病毒HA蛋白的单克隆抗体ZJU-A1抗病毒效应

(1)微量中和实验：①H1N1流感病毒(A/Michigan/45/2015)进行TCID50(半数组织培养感染剂量)滴定；②MDCK细胞接种于96孔板，2×10⁴个每孔，37℃5％CO2孵箱培养一天；③用含0.2％胰酶的病毒培养液稀释病毒至100TCID50每50微升；④在96孔板中将10微克每毫升的单克隆抗体ZJU-A1用病毒培养液倍比稀释至不同浓度(1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:521)，每孔50微升；⑤在加有抗体的孔中加入50微升的100TCID50每50微升的病毒液，混匀，每一稀释度做4个复孔；倒数第二列做病毒回滴，病毒从100TCID50每100微升倍比稀释(1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128)，每孔100微升；最后一列做对照，4孔阴性细胞对照(病毒培养液，100微升每孔)和4孔阳性细胞对照(100TCID50每100微升病毒液，100微升每孔)，37℃孵育2小时；⑥取出96孔MDCK细胞板，磷酸盐缓冲液洗细胞1遍，将上述96孔中的液体转入细胞培养板中，37℃孵育2小时；⑦取出上述96孔细胞板，用PBS洗细胞2遍；每孔加入200微升病毒培养液，37℃孵育72小时；⑧取培养72小时后的96孔细胞板，每孔取培养上清液50微升，转至血凝板，再在血凝板中每孔加入50微升的1％鸡红细胞；⑨30分钟后观察结果，ZJU-A1对H1N1流感病毒均具有较好的体外中和效应。

结果见附图3

(2)小鼠预防实验：①H1N1流感病毒(A/Michigan/45/2015)小鼠半数致死量滴定；②小鼠分组：7周龄雌性BALB/C小鼠，每组5只，共4组，分别编号为第一组至第四组；③每只小鼠称重并记录；④第一至第三组小鼠分别通过腹腔注射0.1、1、10毫克每千克体重的单抗ZJU-A1，第六组注射10毫克每千克体重的鼠IgG1型无关抗体；⑤将H1N1流感病毒稀释至10倍半数致死量每50微升，所有小鼠在注射单抗或无关抗体24小时后，通过鼻内接种高致病性H1N1流感病毒，50微升每只；⑥每天观察并记录体重，单抗ZJU-A1在小鼠体内可以有效预防高致病性H1N1流感病毒的感染，在1毫克每千克体重的浓度下即可达到100％的保护效率。

结果见附图4。

(3)小鼠治疗实验：①小鼠分组：7周龄雌性BALB/C小鼠，每组5只，共4组，分别编号为第一组至第四组；②每只小鼠称重并记录；②将H1N1流感病毒稀释至10倍半数致死量每50微升，第一组至第四组中所有小鼠通过鼻内接种H1N1流感病，50微升每只；③感染6小时后，第一组通过腹腔注射10毫克每千克体重的单抗ZJU-A1，第四组腹腔注射10毫克每千克体重的鼠IgG1型无关抗体；④感染24小时后，第二组腹腔注射抗体10毫克每千克体重的单抗ZJU-A1；⑤感染72小时后，第三组腹腔注射抗体10毫克每千克体重的单抗ZJU-A1；⑥每天观察并记录体重，单抗ZJU-A1在小鼠体内可以有效治疗H1N1流感病毒的感染，并且治疗效果与治疗时间密切相关，在10毫克每千克体重的浓度下，在感染24小时后仍能达到100％的保护效率。

结果见附图5。

应理解，本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 浙江大学医学院附属第一医院

<120> 一种具有中和活性的抗H1N1流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体ZJU-A1

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 417

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggattca gcaggatctt tctcttcctc ctgtcaataa ctacaggtgt ccactcccag 60

gcttatctac agcagtctgg ggctgagctg gtgaggtctg gggcctcagt gaagatgtcc 120

tgcaaggctt ctggctacac atttagcaat tacaatatac actggataaa gcagacacct 180

ggacagggcc tggaatggat tggatacatt tatcctggaa atggtggtgc tacctacgat 240

cagaagttca aggtcaaggc cacattgact gcagacacat cctccaacac agcctacatt 300

catatcagca gcctgtcatc tgaagactct gcggtctatt tctgtgcaag agccctttcc 360

ttcgcctact ggtacttcga tgtctggggc gcagggacca cggtcaccgt ctcctca 417

<210> 2

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gly Phe Ser Arg Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Ile Thr Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg

20 25 30

Ser Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Ser Asn Tyr Asn Ile His Trp Ile Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Ala Thr Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Val Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn

85 90 95

Thr Ala Tyr Ile His Ile Ser Ser Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Ala Leu Ser Phe Ala Tyr Trp Tyr Phe Asp Val

115 120 125

Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

130 135

<210> 3

<211> 381

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggagtcac agactcaggt ctttgtatac atgttgctgt ggttgtctgg tgttgatgga 60

gacattgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 120

gtcacctgca aggccagtca gaatttgggt tctgatgtag cctggtatca acagaaacca 180

ggacaatctc ctaaagcact gatttactcg gcatcctacc gggacagtgg agtccctgat 240

cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct 300

gaagacttgg cagagtattt ttgtcaccaa tataacaact atccgtacac gttcggaggg 360

gggaccaagc tggaaataaa a 381

<210> 4

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Phe Val Tyr Met Leu Leu Trp Leu Ser

1 5 10 15

Gly Val Asp Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser

20 25 30

Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn

35 40 45

Leu Gly Ser Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

50 55 60

Lys Ala Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Asp Ser Gly Val Pro Asp

65 70 75 80

Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys His Gln Tyr Asn

100 105 110

Asn Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115 120 125

Claims

1.一种抗H1N1流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体ZJU-A1，该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，能与流感病毒血凝素蛋白抗原特异结合，抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID No.2，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.根据权利要求1所述的抗H1N1流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体ZJU-A1，其特征在于：所述单克隆抗体由杂交瘤细胞产生。

3.根据权利要求1所述的抗H1N1流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体ZJU-A1，其特征在于：产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞是由免疫的BALB/C小鼠脾淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆、传代和反复冻存、复苏后获得的杂交瘤细胞系ZJU-A1，能稳定分泌抗H1N1流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU-A1。

4.权利要求1所述的抗H1N1流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU-A1的制备方法，其特征在于该单克隆抗体通过的以下步骤获得：

(1)小鼠免疫：选择6周龄的BALB/C小鼠，以纯化的H1N1流感病毒血凝素蛋白对小鼠进行免疫；每只小鼠以30微克的抗原蛋白混合佐剂后大腿内侧肌肉注射免疫，第21天后再免疫一次，共2次；第3次加强免疫3天后用于融合；

(2)小鼠骨髓瘤细胞的培养：培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并使其保持良好的生长状态，用于杂交瘤细胞融合；

(3)细胞融合：采用聚乙二醇细胞融合法；以BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，在融合前一天，于96孔培养板中接种BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞，含20％牛血清的次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶培养基培养一天，将步骤(1)中备好的小鼠处死，收集脾脏淋巴细胞；收集步骤(2)中的SP2/0，将上述两种细胞混合离心，然后以聚乙二醇介导细胞融合，融合后的细胞适当稀释，接种至培养板，适当条件培养；

(4)杂交瘤细胞的筛选：将上述培养物在含次黄嘌呤-磷酸核糖转移酶选择性培养基中培养；在细胞集落长到大小合适时，吸取培养上清液以酶联免疫吸附检测法做抗体鉴定，筛选阳性克隆；

(5)杂交瘤细胞的克隆化培养：以有限稀释法克隆阳性的杂交瘤细胞，将稀释到一定密度的细胞接种至96孔细胞培养板，使每孔只有一个细胞生长；形成细胞集落的孔取上清做酶联免疫吸附检测，筛选和鉴定阳性克隆；可以重复有限稀释若干次，直到杂交瘤细胞的阳性孔率达到100％；将克隆化后的杂交瘤细胞扩大培养并做抗体理化性状分析和鉴定；

(6)小鼠腹水的诱生：在接种杂交瘤细胞前1周，给每只BALB/C小鼠腹腔注射石蜡油0.5毫升，然后接种生长良好的5×10⁶阳性杂交瘤细胞每只，10天后收集腹水离心，测定抗体效价，并纯化腹水中的单克隆抗体；

5.权利要求1或2所述的抗H1N1流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体ZJU-A1在制备用于中和H1N1流感病毒药物中的应用。