CN116063467A - 抗h10亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体1f3及其在检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及抗H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体1F3及其在检测中的应用，是利用细胞工程、抗体工程技术，获得分泌抗血凝素蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，通过同品系的小鼠诱导腹水，制备抗血凝素蛋白的单克隆抗体1F3，鉴定为IgG1、κ型，再通过亲和纯化、免疫方法等技术实现对该抗体的应用。本发明的优点在于提供了一种抗H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体。制备方法简单易行，更为重要的是该方法制备的单克隆抗体可以有多种用途，如对临床和实验室的H10亚型禽流感样本进行定性诊断。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及抗H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体1F3及其在检测中的应用，是利用细胞工程、抗体工程技术，获得分泌抗血凝素蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，通过同品系的小鼠诱导腹水，制备抗血凝素蛋白的单克隆抗体1F3，鉴定为IgG1、κ型，再通过亲和纯化、免疫方法等技术实现对该抗体的应用。
背景技术
甲型流感病毒属于正粘病毒科，根据血凝素和神经氨酸酶糖蛋白的抗原特性，甲型流感病毒分为18种 HA和11种NA亚型。水禽被认为是甲型流感病毒的天然宿主，目前大多数甲型流感病毒亚型已在水禽中发现(比如家鸭)。值得注意的是，家鸭在感染低致病性禽流感病毒时通常不会出现严重的症状，但它们为禽流感病毒的重组提供了合适的环境。近年来，H10亚型禽流感病毒越来越多地从禽类中分离出来，例如 H10N1、H10N2、H10N3、H10N4、H10N5、H10N6、H10N7、H10N8和H10N9。
在鸡胚或MDCK细胞中分离病毒是目前公认的经典的流感病毒检测方法。近年来，分子检测方法也得到了极大发展，实时定量聚合酶链反应已被广泛用于流感病毒感染的实验室诊断。然而，这些方法对技术和实验室要求很高并且耗时。由于单克隆抗体技术的发展，基于单克隆抗体的检测方法也被广泛使用于病毒检测。因此，本发明旨在说明一株针对H10亚型禽流感病毒的特异性单克隆抗体，并将其与免疫荧光技术结合，可以对样本中H10亚型禽流感病毒进行检测。上述方法具有快速、灵敏、廉价的优势，这能促进更早更广泛的发现H10亚型禽流感病毒，控制疫情扩散。
综上所述，开发H10亚型禽流感病毒单克隆抗体，建立快速灵敏检测方法的对于病毒的防控具有重要的意义。基于以上背景，本项目选定H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白为靶抗原，采用融合杂交瘤技术建立稳定分泌抗血凝素蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系，并大量制备、纯化和鉴定这些单克隆抗体。该单克隆抗体的成功获得，为建立新型的H10亚型禽流感病毒诊断方法——基于免疫学技术的诊断奠定物质基础。同时对疾病发病机理、预后及疗效判定等方面的研究起到重要作用。
本发明用到杂交瘤细胞技术。该技术将免疫小鼠的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，以建立分泌均质抗体的杂交瘤细胞系，也称为单克隆抗体技术。该技术涉及到动物免疫、细胞培养、细胞融合、细胞克隆培养和免疫测定等一系列方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体，能识别H10亚型禽流感病毒。该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，命名为1F3，能特异性识别H10亚型禽流感病毒的血凝素蛋白。
抗H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体1F3的重链氨基酸序列如SEQ IDNo.2，轻链氨基酸序列如 SEQ ID No.4所示。
抗H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体1F3由杂交瘤细胞产生的；产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞是由免疫的BALB/C小鼠脾淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆、稳定传代后获得的杂交瘤细胞系1F3，能稳定分泌抗H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体1F3。
本发明的第二个目的提供抗H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备方法，通过以下步骤和技术方案实现：
(1)动物的免疫：选择6-8周龄BALB/C小鼠，以纯化的H10N3亚型禽流感病毒(A/Duck/Human/S11205/2012) 血凝素蛋白对小鼠进行免疫。
(2)小鼠骨髓瘤细胞的培养：培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并使之保持良好的生长状态用于细胞融合。
(3)细胞融合：采用聚乙二醇介导的细胞融合法。将步骤(1)中挑选出的小鼠处死，获取脾脏淋巴细胞。收集步骤(2)中的SP2/0细胞，将上述两种细胞混合离心，然后以聚乙二醇介导细胞融合，融合后的细胞适当稀释，接种至96孔培养板，适当条件培养。
(4)杂交瘤细胞的筛选：将上述培养物在次黄嘌呤-磷酸核糖转移酶选择性培养基中培养。在细胞集落长到大小合适时，吸取细胞培养上清液做抗体鉴定，筛选阳性克隆。
(5)杂交瘤细胞的克隆化：以有限稀释法克隆阳性的杂交瘤细胞，将稀释到一定密度的细胞接种至96 孔细胞培养板，使每孔只有一个细胞生长。形成细胞集落的孔取上清做酶联免疫吸附检测，筛选和鉴定阳性克隆。选择抗体效价最高的且呈单个克隆细胞生长的培养孔，再次进行有限稀释，连续进行4次以上的有限稀释，并连续传代20代以上，获得稳定高效表达抗H10亚型禽流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株,将克隆化后的杂交瘤细胞做抗体鉴定及理化性状分析。
(6)单克隆抗体腹水制备：选择8-10周BALB/C健康小鼠，每只腹部接种含5×106个阳性杂交瘤细胞 PBS缓冲液，接种细胞7-10天后小鼠腹部明显膨大，密切观察小鼠的健康状况腹部征象，待腹水尽可能多，并且小鼠濒临死亡之前，收集腹水离心，测定抗体效价，并纯化腹水中的单克隆抗体；
(7)单克隆抗体的纯化：使用蛋白G琼脂凝胶亲和纯化法纯化小鼠腹水中单克隆抗体
(8)本发明得到一个产生抗H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体杂交瘤系，即1F3，1F3杂交瘤细胞系经4次克隆化，持续培养六月余，分泌抗体稳定。该细胞株经液氮冻存，复苏后生长良好，抗体分泌未见衰退。酶联免疫吸附间接法实验测得1F3培养上清效价为1:64，腹水效价为1:2048。经单克隆抗体免疫球蛋白亚型分析显示该杂交瘤细胞产生的抗体类型为IgG1。
本发明提供产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，它是由免疫的BALB/C小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆、传代后获得的小鼠杂交瘤细胞系1F3，能稳定分泌抗H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体1F3。
本发明的另一个目的是提供该单克隆抗体1F3在含有H10亚型禽流感病毒的体液、尿囊液或其他环境样本中的检测，通过制备胶体金免疫层析试纸条和酶联免疫吸附法实现。
本发明的优点在于提供了一种抗H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体。制备方法简单易行，更为重要的是该方法制备的单克隆抗体可以有多种用途，如对临床和实验室的H10亚型禽流感样本进行定性诊断。
说明书附图
图1为单克隆抗体1F3的免疫球蛋白亚型分析。
图2为免疫荧光技术检测H10亚型禽流感病毒的特异性。
图3为单克隆抗体1F3的生物序列。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1.抗H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体的制备方法
(1)小鼠的免疫：首次免疫，将H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白与佐剂1:1体积混合均匀，总体积0.5 毫升。每只BALB/C小鼠0.1毫升(含H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白抗原100微克)，大腿内侧肌肉注射。第21天按同样方式加强免疫一次。第35天采微量尾血进行酶联免疫吸附实验测定，抗体滴度最高达到1:32000, 选择抗体滴度最高的小鼠尾静脉注射加强免疫一次，于3天后进行细胞融合。
(2)小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养传代：用10％牛血清的DMEM培养基对来自BALB/C小鼠的SP2/0骨髓瘤细胞株进行培养传代，在含5％二氧化碳的37℃孵箱中培养。融合前一天通常不传代以保证融合时细胞进入对数生长期。
(3)细胞融合：以BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，在融合前一天，接种BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞于96孔培养板，含20％牛血清的次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶培养基培养一天。取最后一次加强免疫3天的小鼠取脾，采用压力注水法分离脾脏淋巴细胞，离心洗涤细胞后用DMEM培养液重悬。收集SP2/0细胞，离心，洗涤后用DMEM培养液重悬，进行计数。将3×108个免疫小鼠脾淋巴细胞与3×107个小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合。两种细胞混合，离心弃上清，用手掌轻轻搓动离心管，使细胞块松动，用融合管缓慢加入37℃预温的聚乙二醇，其间轻轻振摇离心管，将细胞吸入融合管，静置90秒后将细胞吹入离心管，然后按先慢后快的原则，于第1分钟内加完1毫升DMEM培养基，于第2分钟内加完2毫升DMEM培养基，于第3分钟内加完7毫升DMEM培养基，以后1分钟内逐渐加入37℃预温的DMEM培养基40毫升。800转每分钟低速离心10 分钟。然后加入含有20％牛血清的次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶培养基，用玻璃滴管分别接种到加有饲养细胞的96孔培养板，一般每次融合的细胞铺2-4块板，在含5％二氧化碳的37℃孵箱中培养。
(4)杂交瘤细胞的筛选：96孔培养板5天后半量换液(含次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶)一次，10 天后改用含次黄嘌呤-磷酸核糖转移酶培养液。融合后的杂交瘤细胞在含次黄嘌呤-磷酸核糖转移酶的选择性培养液中大约持续培养两周。在细胞集落长到适当大小时(在10倍物镜下观察，细胞克隆大小以占满一个视野为宜)，吸取细胞培养上清液进行酶联免疫吸附实验，筛选阳性克隆。采用酶联免疫吸附实验间接法筛选阳性杂交瘤克隆。主要步骤：①0.01摩尔每升pH9.6碳酸盐缓冲液稀释H10亚型血凝素蛋白，然后分别于96 孔酶标板加入0.1毫升每孔，蛋白量为20纳克每孔，4℃过夜；②0.01摩尔每升pH7.4磷酸盐缓冲液(含吐温20)洗板5次；③用含有5％牛血清白蛋白0.01摩尔每升pH 7.4的磷酸盐缓冲液封闭2小时；④洗板3 次；⑤加入杂交瘤培养上清，0.1毫升每孔，同时设阳性对照(H10亚型蛋白免疫小鼠血清)、阴性对照(SP2/0 培养上清液)和空白对照，室温反应2小时；⑥洗板3次；⑦加1:10000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG，0.1毫升每孔，室温反应1小时；⑧洗板3次；⑨加入显色液室温避光反应5分钟；⑩2摩尔每升硫酸终止反应；450纳米测定其光密度值，以测定值除以阴性≥2.1为阳性。
(5)杂交瘤细胞的克隆化：杂交瘤细胞的克隆化培养按照有限稀释法进行，选择抗体检测阳性的杂交瘤孔细胞作适当增殖后，准确计数细胞。用完全DMEM培养基稀释成10个每毫升的细胞悬液接种到已有饲养细胞的96孔培养板中，每孔0.1毫升，10天后观察细胞生长情况，并检测上清液中抗体水平，选择抗体效价最高的且呈单个克隆细胞生长的培养孔，再次进行有限稀释，连续进行4次以上的有限稀释，并连续传代20代以上，获得稳定高效表达抗H10亚型禽流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
(6)单克隆抗体腹水制备：选择8-10周BALB/C健康小鼠，每只腹部接种含5×106个阳性杂交瘤细胞 PBS缓冲液，接种细胞7-10天后小鼠腹部明显膨大，密切观察小鼠的健康状况腹部征象，待腹水尽可能多时收集小鼠腹水。
(7)单克隆抗体的纯化：采用亲和纯化法(蛋白G琼脂凝胶)纯化腹水中单克隆抗体。①处理腹水：于4℃ 10000转每分钟将腹水离心15分钟，去除沉淀物，收集上清，将其与3-4倍体积的结合缓冲液混合，再于4℃ 10000转每分钟离心15分钟去除沉淀物。于4℃10000转每分钟离心15分钟去除沉淀物。②将预装有蛋白G 琼脂凝胶的亲和纯化柱用5倍柱床体积的结合缓冲液充分清洗。③将稀释的腹水上柱，控制流速8-10滴每分钟。④将已过柱的腹水重复上柱一次。⑤用5倍柱床体积的结合缓冲液充分洗涤纯化柱。⑥用洗脱缓冲液洗脱结合的单克隆抗体，控制流速8-10滴每分钟，收集洗脱液于预加有0.1毫升的磷酸钾缓冲液(PH7.9)的收集管中，每管收集0.5毫升含抗体的洗脱液。⑦于280纳米检测每管洗脱液的吸光度，并收集蛋白含量大于0.1毫克每毫升的洗脱液。⑧向超滤离心管内加入抗体洗脱液，于4℃10000转每分钟离心10-20分钟至抗体洗脱液终体积约为1毫升。加入并于0.1摩尔每升PH7.4的磷酸盐缓冲液10毫升，于8℃10000转每分钟离心10-20分钟，最后一次离心浓缩抗体至终体积约1毫升，吸取抗体浓缩液于收集管中。⑨将脱盐后的抗体溶液稀释后，于280纳米测蛋白含量。⑩将纯化的抗体分装于小管中，置于低温冰箱备用。
(8)单克隆抗体的亚型鉴定:采用Bio-Rad公司的小鼠单克隆抗体免疫球蛋白分型试剂盒分析。将纯化的单抗作适当稀释后进行检测，操作严格按试剂盒说明书进行。试验结果为1F3杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体为IgG1、κ型。
结果见附图1。
实施例2.用该单克隆抗体进行H10亚型禽流感病毒的定性检测
本发明制备的抗H10禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体可以用来定性检测H10亚型禽流感病毒，鉴定方法可以通过下述方法实现：
H10亚型禽流感病毒免疫荧光检测法：
(1)将MDCK细胞提前一天以每孔4×104个细胞的密度接种在48孔板中，待细胞长至70％，备用；
(2)取出铺好细胞的细胞板，弃去培养上清，用磷酸盐缓冲液洗一遍，备用；
(3)确定H10亚型禽流感病毒免疫荧光检测法检测H10亚型禽流感病毒的特异性：用磷酸盐缓冲液稀释病毒，包括H10N2(A/duck/Zhejiang/6D20/2013)、H10N3(A/chicken/Zhejiang/8615/2016)、H10N7 (A/chicken/Zhejiang/528189/2016)、H10N8(A/chicken/Zhejiang/102615/2016)、H1N2病毒 (A/duck/Zhejiang/D1/2013)、H2N8病毒(A/duck/Zhejiang/6D10/2013)、H3N2病毒 (A/duck/Zhejiang/4613/2013)、H4N6病毒(A/duck/Zhejiang/409/2013)、H5N1病毒 (A/goose/Zhejiang/97/2014)、H6N1病毒(A/chicken/Zhejiang/1664/2017)、H7N9病毒 (A/chicken/Zhejiang/ZJU01/2013)和H9N2病毒(A/chicken/Zhejiang/221/2016)稀释后的病毒液感染细胞(感染复数为0.5)，在含5％二氧化碳饱和37℃孵箱中培养2小时；
(4)取出细胞板，弃去病毒液，用磷酸盐缓冲液洗细胞2遍，再在每孔中加入200微升的病毒培养液，在含5％二氧化碳饱和37℃孵箱中培养16小时；
(5)取出细胞板，弃去培养上清，用磷酸盐缓冲液洗细胞1遍；
(6)在细胞板中每孔加入4％多聚甲醛固定细胞，室温下固定30分钟，用磷酸盐缓冲液洗3遍；
(7)用0.5％Triton-X100通透细胞，室温下通透30分钟，用磷酸盐缓冲液洗3遍；
(8)用含3％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液封闭，室温下封闭1小时，弃去牛血清白蛋白溶液；
(9)用磷酸盐缓冲液将单抗稀释至10微克每毫升，每孔加入200微升，在4℃下孵育过夜，用磷酸盐缓冲液洗3遍；
(10)用含1％牛血清白蛋白溶液稀释荧光二抗至5微克每毫升，每孔加入200微升，在37℃孵箱中避光孵育90分钟，用磷酸盐缓冲液洗3遍；
(11)用脱氧核糖核酸荧光染料(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)对细胞核进行染色，室温下避光孵育10分钟，用磷酸盐缓冲液洗3遍；
(12)在荧光显微镜下观察实验结果，观察到绿色荧光即为阳性。检测结果表明，基于本研究开发的抗 H10亚型禽流感病毒单克隆抗体1F3检测H10亚型禽流感病毒具有较好的特异性。
应理解，本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (7)
1.一种抗H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体1F3，抗体亚型为IgG1，κ型，能与H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白抗原特异结合。
2.根据权利要求1所述的抗H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体1F3，其特征在于：抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID No.2，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
3.根据权利要求1所述的抗H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体1F3，其特征在于：由杂交瘤细胞产生的；产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞是由免疫的BALB/C小鼠脾淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆、稳定传代后获得的杂交瘤细胞系1F3，能稳定分泌抗H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体1F3。
4.权利要求1所述的抗H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体1F3，其特征在于：该单克隆抗体通过的以下步骤获得：
(1)小鼠免疫：选择6-8周龄的BALB/C小鼠，通过纯化的H10亚型禽流感病毒的血凝素蛋白对小鼠进行免疫；每只小鼠以100微克的H10亚型血凝素蛋白1:1混合佐剂后大腿内侧肌肉注射免疫，第21天后按同样方式再免疫一次，共2次；第35天采微量小鼠尾血，测定小鼠抗体效价，选取免疫效价最高的小鼠，尾静脉注射加强免疫一次，于3天后进行细胞融合；
(2)小鼠骨髓瘤细胞的培养：在准备融合前的两周开始复苏骨髓瘤细胞SP2/0，培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并使其保持良好的生长状态用于杂交瘤细胞融合；
(3)细胞融合：采用聚乙二醇介导的细胞融合法；将步骤(1)中挑选出的小鼠处死，获取脾脏淋巴细胞；将脾脏淋巴细胞与骨髓瘤细胞SP2/0细胞混合离心，然后通过聚乙二醇介导细胞融合，融合后的细胞适当稀释，接种至培养板，适当条件培养；
(4)杂交瘤细胞的筛选：将上述培养物在含次黄嘌呤-磷酸核糖转移酶选择性培养基中培养；在细胞集落长到适当大小时，吸取培养上清液以酶联免疫吸附检测法做抗体鉴定，筛选阳性克隆；
(5)杂交瘤细胞的克隆化培养：以有限稀释法克隆阳性的杂交瘤细胞，将稀释到一定密度的细胞接种至96孔细胞培养板，使每孔只有一个细胞生长；形成细胞集落的孔取上清液做酶联免疫吸附检测，筛选和鉴定阳性克隆；选择抗体效价最高的且呈单个克隆细胞生长的培养孔，再次进行有限稀释，连续进行3次以上的单克隆有限稀释，并连续传代20代以上，获得稳定高效表达抗H10亚型禽流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
(6)单克隆抗体腹水制备：选择8-10周BALB/C健康小鼠，每只腹部接种含5×106个阳性杂交瘤细胞PBS缓冲液，接种细胞7-10天后小鼠腹部明显膨大，密切观察小鼠的健康状况腹部征象，待腹水尽可能多，并且小鼠濒临死亡之前，收集腹水离心，测定抗体效价，并纯化腹水中的单克隆抗体；
(7)单克隆抗体的纯化：使用蛋白G琼脂凝胶亲和纯化法纯化小鼠腹水中单克隆抗体。
5.权利要求1-3任一所述的抗H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体1F3在制备H10亚型禽流感病毒检测产品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述检测产品通过免疫荧光技术检测不同样本中H10亚型禽流感病毒。
7.一种H10亚型禽流感病毒检测试剂盒，包含检测抗H10亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体1F3的试剂。
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