CN108318683B - 一种快速诊断以色列急性麻痹病毒试纸及其应用 - Google Patents
一种快速诊断以色列急性麻痹病毒试纸及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种蜜蜂急性麻痹病毒抗体胶体金快速检测试剂条，包括支撑层，以及在所述支撑层上依次设置的加样垫、金标抗体释放垫、检测层和吸收层，所述金标抗体释放垫包埋有胶体金标记的以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白；所述检测层上设置有检测带和质控带，所述检测带固定有以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白，所述质控带固定有以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白抗体。本发明的试纸条特异性强，极大的降低了出现假阳性的概率，保证了试纸条特异性和灵敏度；安全性高，避免检测过程中复杂的病毒处理操作；操作简便快捷，本发明不需要专业的技术人员进行操作和专业仪器的辅助检测，检测结果直观易判定并且检测时间只需20min极为迅速。
Description
技术领域
本发明属于兽医生物技术领域，涉及一种快速检测抗体技术，尤其涉及蜜蜂以色列急性麻痹病毒抗体的检测试纸条，同时还涉及该试纸条的制备方法和应用方法。
背景技术
以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus)属于picornavirus目下的Dicistroviridae科的病毒成员。其中以色列急性麻痹病毒与蜜蜂多种疾病相关，主要引起蜜蜂爬蜂、颤抖、迷巢及失去飞翔能力。感染以色列急性麻痹病毒的蜜蜂将无法正常采集，导致蜜蜂免疫力下降，在遇到其它压力的共同作用下将引起蜂群大量损失甚至整群崩溃。因此，以色列急性麻痹病毒是一种严重威胁蜜蜂产业的病害。
自2007年美国最先报道以色列急性麻痹病毒是引起蜜蜂蜂群崩溃症的(CCD)的最主要原因以来，世界各地均报道了以色列急性麻痹病毒的感染与危害。同时，我们国家也报道了多个以色列急性麻痹病毒的毒株，并且在越冬蜂中的危害更为严重，直接影响第二年蜂群的发展。因此，开发建立一种可以对蜜蜂蜂群的以色列急性麻痹病毒抗体检测快速有效的方法是十分必要的。并且目前没有任何关于蜜蜂病毒的抗体检测法，已有的检测方法主要是PCR及环介导温等方法，这些方法存在一些较难克服的缺点，比如：PCR法需要若干个试剂、且检测步骤较为繁琐，检测所需的时间较长，检测过程中还需其它设备与仪器，并且对于在实地情况下的蜂农来说，对技术要求也是一个重要的难题，整体所需的花费也较高。因此迫切需要建立一种省时省力又可以迅速普及的检测方法。
免疫胶体金技术是20世纪80年代继荧光标记、放射性同位素标记和酶标记三大标记技术后发展起来的固相标记免疫测定技术，目前已广泛应用于临床诊断,尤其是在医学、兽医学临床检验中已广泛应用，具有费用低、灵敏度高、速度快、使用便捷、操作简单和易于普及等特点。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种以色列急性麻痹病毒(IAPV)抗体胶体金快速检测试纸条。
本发明提供的检测纸条，其包括支撑层，以及在所述支撑层上依次设置的加样垫、金标蛋白释放垫、检测层和吸收层，所述金标蛋白释放垫包埋有胶体金标记的以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白；所述检测层上设置有检测带和质控带，所述检测带固定有以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白，所述质控带固定有蜜蜂以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白抗体。所述以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白序列如序列表中序列1所示。
所述质控带固定有以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白多克隆抗体或者以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白单克隆抗体。
所述以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白是将序列表中序列1所示的核苷酸片段插入到表达载体中表达后纯化得到所述以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白；所述表达载体优选为pEASY载体。
具体的，所述以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白按照下述方法获得：根据以色列急性麻痹病毒的核衣壳蛋白VP2的核苷酸序列为基础，采用Primer 5.0软件设计了扩增引物，其上下游引物分别为：F：5’TGGCT CAGGA TACTT CAT 3′，R：5’AACAT CACAT CGCAG GT 3′，其扩增产物大小为260bp。然后根据已检测的以色列急性麻痹病毒阳性样品，采用RNA提取试剂盒Trizol提取总RNA，按反转录试剂盒步骤，采用M-MLV反转录酶合成cDNA。为了得到260bp大小的产物，将适量的GoTaq反应液，1uM的上、下游，1uL的cDNA，及无核酸酶的蒸馏水使其达到总体积为20uL。其PCR条件为，在95℃孵育预变性1min,其相应的循环参数为94℃下变性30s,55℃下退火30s，72℃下延伸1min，33个循环；随后在72℃下终延伸10min,于4℃下冷却。紧接着将PCR产物在1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，证实与目标大小一致。用DNA凝胶回收与纯化试剂盒对目的片段进行回收纯化。其主要步骤如下：用洁净的刀片切取含有目的基因片段的琼脂糖凝胶放入到1.5mL的离心管中，加入3倍体积的胶块融化液，使胶块完全融化。将融化的溶液移至吸附柱上，在12000转下离心2分钟，弃滤液重复上述步骤。最后用洗脱缓冲液将目标DNA洗脱，并收集于管中，-20℃保存。
产物的连接、转化与质粒鉴定。按照pEASY载体试剂盒说明书操作，将VP2基因与载体连接，16℃连接16小时，构建重组VP2质粒。将10uL连接产物加入感受态细胞管中，冰浴30分钟，42℃水浴热激90秒后，立即冰浴10分钟。将其加入到LB培养基中，于37℃、170转摇床下，摇1个小时，将其涂于平板中过夜。挑取单菌落后，采用PCR进行鉴定质粒。将接种的菌液加入1M IPTG于18℃下过夜诱导，取菌液沉淀并加入裂解缓冲液，经离心、搅拌、过滤洗脱等，采用GE镍柱纯化系统按相应参数进行纯化，进而得到纯化的蛋白VP2。
其中，所述的支撑层优选为聚乙烯纤维板，更优选为聚氯乙烯板(Polyvinylchlorid PVC板)
其中，所述的加样垫优选为中速定性滤纸。
其中，所述的金标抗原释放垫优选为玻璃纤维素膜，更优选为Rapid27(美国Whatman)的玻璃纤维素膜。
其中，所述的检测层优选为硝酸纤维素膜，更优选为FF85系列(美国Whatman)的硝酸纤维素膜。
其中，所述的吸收层优选为玻璃纤维，更优选为玻璃纤维CF4(美国Whatman)。
本发明还提供一种制备所述检测试纸条的方法，其包括如下步骤：
1)在检测层的不同位置上分别固定以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白以及以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白单克隆抗体，形成检测带和质控带；
2)制备金标抗体释放垫；
3)组装支撑层、加样垫、金标抗体释放垫、检测层和吸收层。
其中，制备金标抗体释放垫包括如下步骤：以1:100～3000的标记比例将待标记的以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白加入到pH7.0～10.0胶体金溶液中，按1:10～500的比例用含0.1～5％BSA的0.001～0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PB)稀释胶体金标记的以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白，将稀释后的胶体金标记的以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白液按60μL/cm2的速度喷于玻璃纤维素膜中，4℃低温真空干燥。
其中，将包被浓度为0.1～1mg/mL，优选为0.2～0.8mg/mL，更优选为0.5mg/mL的以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白按1μL/cm的速度喷于检测层上作为检测带，将包被浓度为0.1～5mg/mL，优选为0.5～2mg/mL，更优选为1mg/mL的以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白单克隆抗体按1μL/cm的速度喷于检测带下方的检测层上作为质控带，37℃下干燥30min，从而制备检测层。
与传统的PCR等方法相比，本方明的试纸条具有明显的优越性：特异性强，使用原核表达病毒结构蛋白，极大的降低了出现假阳性的概率，保证了试纸条特异性和灵敏度；安全性高，避免检测过程中病毒的操作；操作简便快捷，本发明不需要专业的技术人员进行操作和专业仪器的辅助检测，检测结果直观易判定并且检测时间只需10min极为迅速。
附图说明
图1为蜜蜂以色列急性麻痹病毒抗体胶体金快速检测试纸条的结构示意图；
图2是以色列急性麻痹病毒的核衣壳蛋白PCR电泳结果。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1、蜜蜂以色列急性麻痹病毒抗体胶体金快速检测试纸条的制备
如图1所示，本发明的蜜蜂以色列急性麻痹病毒抗体胶体金快速检测试纸条，包括支撑层，以及在所述支撑层上依次设置的加样垫、金标抗原释放垫、检测层和吸收层；
其中，所述金标抗原释放垫包埋有胶体金标记的以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白；所述检测层上设置有检测带和质控带，所述检测带固定有以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白，所述质控带固定有以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白抗体。
蜜蜂以色列急性麻痹病毒抗体胶体金快速检测试纸条按照下述方法制备：
一、以色列急性麻痹病毒核衣蛋白VP2的表达与纯化
1、VP2基因的扩增
本胶体金试纸条选择的表达蛋白为以色列急性麻痹病毒的核衣壳蛋白VP2，根据其对应的基因为设计相应的引物完成扩增。
根据以色列急性麻痹病毒的核衣壳蛋白VP2的核苷酸序列为基础，采用Primer5.0软件设计了扩增引物，其上下游引物分别为：F：5’TGGCT CAGGA TACTT CAT 3′，R：5’AACAT CACAT CGCAG GT 3′，其扩增产物大小为260bp。
然后根据已检测的以色列急性麻痹病毒阳性样品(采自北京市意大利蜜蜂阳性感染IAPV的个体)，采用RNA提取试剂盒Trizol提取总RNA，按反转录试剂盒步骤，采用M-MLV反转录酶合成cDNA。为了得到260bp大小的产物，将适量的GoTaq反应液，1uM的上、下游，1uL的cDNA，及无核酸酶的蒸馏水使其达到总体积为20uL。其PCR条件为，在95℃孵育预变性1min,其相应的循环参数为94℃下变性30s,55℃下退火30s，72℃下延伸1min，33个循环；随后在72℃下终延伸10min,于4℃下冷却。紧接着将PCR产物在1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，证实与目标大小一致。用DNA凝胶回收与纯化试剂盒对目的片段进行回收纯化。其主要步骤如下：用洁净的刀片切取含有目的基因片段的琼脂糖凝胶放入到1.5mL的离心管中，加入3倍体积的胶块融化液，使胶块完全融化。将融化的溶液移至吸附柱上，在12000转下离心2分钟，弃滤液重复上述步骤。最后用洗脱缓冲液将目标DNA洗脱，并收集于管中，-20℃保存。
2、PCR产物的连接、转化与鉴定。
将步骤1获得产物纯化的DNA连接pEASY载体，转化感受态大肠杆菌TG1,对转化菌进行蓝白斑筛选，挑选白斑，LB培养基培养并提取质粒,用PCR方法快速鉴定阳性克隆。阳性克隆质粒送上海生工生物公司测序。测序结果进一步验证了重组质粒的正确性。挑取过夜生长的菌落，利用碱裂解法提取质粒，用酶切法鉴定重组质粒，对阳性重组质粒进行进一步的PCR鉴定。PCR鉴定结果显示阳性，转化成功。
3、以色列急性麻痹病毒核衣蛋白VP2的表达和纯化
挑取鉴定为阳性的重组菌接种于LB培养基上，过夜后转入三角瓶进行37℃培养至OD600≈0.5时，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)终浓度为1.5mmol/L进行诱导表达，转入25℃培养6h。
取出培养物，将重组菌超声裂解后的上清与沉淀分别进行SDS-PAGE电泳分析，阴性对照为只转化载体的感受态细胞，考马斯亮蓝染色。电泳结果表明重组菌的裂解物沉淀和上清中均存在分子量约为30ku大小的条带，阴性对照中未见上述条带。
将诱导6h后的融合蛋白收获菌液，5000r/min离心10min，加入10mL结合缓冲液，弃去上清后用10mL的结合缓冲液重悬菌液，将样品置于冰浴中超声波裂解5s、间隔5s、超声至液体透明。然后10000r/min离心15min，去除细胞碎片，将上清液移入新管中。取上清液利用pEASY载体带有的His-tag选择性标签应用Nitrogen公司说明书采用GE镍柱纯化系统纯化蛋白。得到纯化的蛋白VP2。PCR电泳结果如图2所示。纯化的蛋白VP2经测序表明，该蛋白的序列如序列表中序列2所示。序列表中序列2的蛋白也可以通过人工合成获得。
二、以色列急性麻痹病毒核衣蛋白VP2抗体制备和效价检测
1、以色列急性麻痹病毒核衣蛋白VP2抗体制备
动物免疫：采用新西兰大白兔作为免疫动物，免疫浓度为1mg·ml－1以色列急性麻痹病毒核衣蛋白VP2。将新西兰兔子饲养数周后接种免疫，首次免疫用1ml完全弗氏佐剂乳化，加强免疫用1ml不完全弗氏佐剂乳化。每次免疫间隔3-4周，一共免疫5次，最后一次不加佐剂直接肌肉注射，最后一次免疫7-10d后采血检测，测定血清效价后，颈动脉放血，收集血清。
采用饱和硫酸胺盐法(SAS)和DEME纤维素离子交换层析法纯化抗血清，得到纯化的以色列急性麻痹病毒核衣蛋白VP2兔多克隆抗体。
2、抗体效价检测
1)包板：用包被缓冲液将抗原(步骤一中的步骤3所述纯化后的重组蛋白)稀释至1μg/ml，ELSIA板的96孔板中加50μl，(同时设置好实验组：确定有病毒感染的样本和阴性对照：没有病毒感染的样本，孔的数量设置应遵循抗体稀释梯度设计的需要，一般同一个抗体浓度下至少两个孔，另外再加两孔作为一抗空白对照)4℃过夜，次日，弃去孔内溶液，用1xTBST洗涤缓冲液(即：ELISA实验洗涤缓冲液)以每孔180μl洗1次，拍干。
2)封闭：每孔加60μl的5％BSA进行封闭，置37℃孵育1小时。之后弃封闭液。
3)加样：加一抗(作浓度梯度稀释)，50μl于上述已封闭的反应孔。同时设置好一抗空白对照(不加一抗加1％BSA)。置37℃孵育1小时，之后弃液，用1xTBST(即：ELISA实验洗涤缓冲液曲仲阳注)洗涤缓冲液以每孔180μl洗2次，拍干。
4)加酶标抗体：加稀释的羊抗鼠二抗-HRP(1:10000稀释，具体稀释倍数请根据厂家说明，用1％BSA(即：ELISA实验稀释液曲仲阳注)进行稀释)，以50μl/孔加入酶标板孔中，置37℃孵育45min，之后弃液，用1xTBST(即：ELISA实验洗涤缓冲液曲仲阳注)洗涤缓冲液以每孔180μl洗3次，拍干。
5)加底物液显色：于各反应孔中加入配制的TMB底物溶液100μl(A液与B液以1:1配制，现配现用)，置37℃反应5min。
6)终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸100μl(即ELISA实验终止液(2M H2SO4))，终止反应。
7)读板：将酶标板置于预热过的酶标仪中进行读数(测)，保存数据，进行分析。说明：450nm为主波长，测样本显色的吸光值(450nm为最大吸收锋)+试剂底色和孔板自身的吸光值等，600nm为副波长实际为585nm,一般用570或630nm,用于排除试剂底色和孔板自身的吸光值等干扰因素，最终样本显色的实验吸光值＝OD450－OD600。
结果表明，制备的抗体符合质控线的要求。
三、抗原工作浓度的确定
以步骤一中的步骤3所述纯化后的重组蛋白作为包被抗原(1μg/ml)，用包被液做l:200、l:300、l:400、1:600、1:800稀释，加入酶标板，100μL/孔，振动平板以使抗原分布均匀。将包被的酶标板用塑料膜封好，4℃过夜，弃去ELISA板中液体，加入洗涤液(PBST溶液)250μL/孔，室温下洗3min，用干净吸水纸在桌面上轻轻拍干，反复洗涤三次。用5％脱脂奶粉以PBST稀释作为封闭液，加入酶标板，100μL每孔。将包被的酶标板用塑料膜封好，37℃置2h。弃去ELISA板中液体，加入洗涤液(PBST溶液)250μL每孔，室温下洗3次每次3min。阳性血清为一抗，分别作l:50、1:80，1:100，1:150，1:200稀释，加入酶标板中，100μL/孔，同时设空白对照，37℃作用lh，洗涤三次，拍干。加入用5％脱脂奶粉1:8000稀释的HRP-兔抗鼠IgG，100uL每孔，37℃作用1h，洗涤三次，拍干。加底物溶液(TMB.H202)，100μL/孔，室温作用15min，加入终止液(2M H2S04溶液)50μL/孔，在酶标仪上读取OD值。以阳性血清孔的OD值接近1.0，P/N>2.0的抗原血清最大稀释度作为抗原及对照血清的最适工作浓度，其分别为1:600和1:80。
四、以色列急性麻痹病毒胶体金快速检测试纸条的制备
1、胶体金标记VP2蛋白的制备
以柠檬酸钠还原法制备金溶液：在50ml沸腾的0.04％氯金酸水溶液中加入2ml的1.5％柠檬酸三钠溶液，继续搅拌加热直至溶液呈稳定而透亮的红色。在透射电镜下观察胶体金溶液，发现胶体金颗粒其大小均一，无椭圆形或者其他不规则形状，说明已获得了稳定胶体金。
以0.1mol/L的K2CO3调节胶体金pH值在7～10之间，以1:1000～2000的标记比例将待标记的以色列急性麻痹病毒蛋白加入到调节好pH值的胶体金溶液中，静置10min后，加入20％聚乙二醇(PEG)10000至最终浓度为0.05％，4℃下2000r/min离心20min，除去未结合的胶体金颗粒，4℃下15000r/min离心40min后弃去上清获得胶体金标记好的VP2蛋白，用丙烯葡聚糖S-400层析柱分离纯化后4℃下短期保存。
2、以色列急性麻痹病毒抗体胶体金快速检测试纸条的制备
如图1所示，发明设计的试纸条基本结构为支撑层、加样层、检测层3与吸收层4。将各层按以下顺序粘贴：将检测层粘贴在支撑层上；将加样垫1粘在金标抗原释放垫2上组成加样层，由金标抗原释放垫连接在靠近检测层的检测线5一端，边缘附在检测层3上，定义为始端；把吸收层粘贴在检测层上靠近质控线6的一侧，定义为末端。
1)将GF/C滤纸、中速定性滤纸和GF-9型滤纸三种滤纸折叠成漏斗状置于10ml小烧杯中，把离心后的空白蜜蜂血淋巴1ml滴入滤纸中央，通过比较其各自的过滤速度及过滤后血淋巴的澄清度后发现，中速定性滤纸的过滤速度最快，且澄清度与其余两支相近。选择中速定性滤纸作为加样层的加样垫材料。
2)NC膜的三种备选材料为FF85(美国Whatman)、AE100(美国Whatman)和Vivid170(美国PALL)。经不断摸索后发现，FF85系列的流速适中满足本发明需求而被选用选定VP2蛋白三个包被浓度为0.2、0.5和0.8mg/mL，选定VP2蛋白多克隆抗体的三个包被浓度为0.5、1和2mg/mL。用喷膜机按1μL/cm的速度将两种蛋白喷于硝酸纤维素膜上，通过交叉试验，结果显示：VP2蛋白的包被浓度为0.5mg/ml、其多克隆抗体的包被浓度为1mg/ml时，在FF85上红色印记最明显。
3)将0.01mol/L PB(含1％BSA)稀释1:200倍的胶体金标记抗原分别滴加在Glass24(美国Whatman)、Glass33(美国Whatman)、Rapid27(美国Whatman)和Ahlstrom8964(芬兰Ahlstrom)四种释放垫备选材料上，37℃下烘干1h后，粘贴在标记好检测线和质控线的NC膜上，滴加100μL生理盐水在释放垫上比较其金标抗原的释放速度，结果发现使用Rapid27质控线在7min35sed时显色，其它的显色时间均大于8min，因此优选Rapid27作为释放垫的材料。
用0.01mol/L PB(含1％BSA)稀释1:100、1:200、1:300和1:400倍的胶体金标记抗原蛋白滴加在Rapid27，按60μL/cm2的体积均匀喷于金标垫上，37℃下烘干1h后，粘贴在标记好检测线和质控线的NC膜上，滴加100μL生理盐水在释放垫上比较其质控线的显色深浅。结果如下表1：
表1
| 浓度 | 1:100 | 1:200 | 1:300 | 1:400 |
| 显色 | + | ++ | +++ | ++ |
注：+的多少表示颜色的深浅程度。
上述最优条件制备得到以色列急性麻痹病毒抗体胶体金快速检测试纸条。
五、以色列急性麻痹病毒抗体胶体金快速检测试纸条的使用方法和原理
活蜂抓住，一只手捏住蜂体的两侧腹，另一只手用毛细血管插入蜂体腹部的第三至第四节，收集蜜蜂血淋巴约20ul，将其滴到检测试剂条上。加样垫1即吸取液体向上端移动，流经金标抗体释放垫2时使抗原标记胶体金探针复溶，并带动其向检测层3渗移。若标本中有待测特异抗体，其可与抗原标记胶体金探针结合，此复合物流至检测线5即被固相抗原所获，在膜上显出红色反应线条。过剩抗原标记胶体金探针继续前行，至质控线6与抗体结合，而显出红色质控线条。反之，阴性标本则无反应线条，而仅显示质控线条。
实例2、以色列急性麻痹病毒抗体胶体金快速检测试纸条的效果实验
1.敏感性测试
用实例1最优条件制备的以色列急性麻痹病毒抗体胶体金快速检测试纸条检测100只感染以色列急性麻痹病毒的蜜蜂，100只健康蜜蜂，活蜂抓住，一只手捏住蜂体的两侧腹，另一只手用毛细血管插入蜂体腹部的第三至第四节，收集蜜蜂血淋巴约20ul，将其滴到检测试剂条上。
同时，按照实施例1中VP2基因的扩增方法检测样品中是否含有以色列急性麻痹病毒。
结果本发明的试纸条检测与PCR检测结果一致。说明本发明的试纸的敏感性达到100％。
2.检测限测试
将以色列急性麻痹病毒扩繁，然后稀释，用本发明的试纸测试，结果表明能检测到病毒的最低浓度是1.2ug/ml。
3、特异性试验
通常情况下，以色列急性麻痹病毒与急性蜜蜂麻痹病毒(ABPV)、卡什米尔病毒(KBV)在基因组结构上非常相似，并且有时造蜂的症状也有些相似，不容易区分。
使用实施例1制备的试剂盒，检测600只健康蜜蜂、100份以色列急性麻痹病毒感染的蜜蜂、50份卡什米尔病毒(KBV)感染的蜜蜂。
特异性检测结果如下表(表1)显示，对600份健康猪血清的检测结果显示，特异性为99.7％，对卡什米尔病毒(KBV)检测结果均显示为阴性，检测的特异性为100％。
Claims (3)
1.一种蜜蜂以色列急性麻痹病毒抗体胶体金快速检测试纸条，包括支撑层，以及在所述支撑层上依次设置的加样垫、金标抗原释放垫、检测层和吸收层，其特征在于，所述金标抗原释放垫包埋有胶体金标记的以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白VP2；所述检测层上设置有检测带和质控带，所述检测带固定有以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白VP2，所述质控带固定有以色列急性麻痹病毒核衣蛋白VP2兔多克隆抗体；所述以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白VP2序列如序列表中序列2所示；所述以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白VP2是将序列表中序列1所示的核苷酸片段插入到pEASY载体中表达后纯化得到的；所述的支撑层为聚氯乙烯板；所述的加样垫为中速定性滤纸；所述的金标抗原释放垫为玻璃纤维素膜；所述的检测层为硝酸纤维素膜；所述的吸收层为玻璃纤维；
所述检测试纸条的制备方法，其包括如下步骤：
1)将包被浓度为0.1～1mg/mL的以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白VP2按2μL/cm的速度喷于检测层上作为检测带，将包被浓度为0.1～5mg/mL的以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白VP2兔多克隆抗体按1μL/cm的速度喷于检测带下方的检测层上作为质控带，37℃下干燥30min，从而制备检测层；
2)制备金标抗原释放垫：以1:100-3000的标记比例将待标记的以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白VP2加入到pH7.0～10.0胶体金溶液中，按1:10～500的比例用含0.1～5％BSA的0.001～0.1mol/L磷酸盐缓冲液稀释胶体金标记的以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白VP2，将稀释后的胶体金标记的以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白VP2液按100μL/cm2的速度喷于玻璃纤维素膜中，4℃低温真空干燥；
3)组装支撑层、加样垫、制备金标抗原释放垫、检测层和吸收层。
2.一种制备权利要求1所述检测试纸条的方法，其包括如下步骤：
1)将包被浓度为0.1～1mg/mL的以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白VP2按2μL/cm的速度喷于检测层上作为检测带，将包被浓度为0.1～5mg/mL的以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白VP2兔多克隆抗体按1μL/cm的速度喷于检测带下方的检测层上作为质控带，37℃下干燥30min，从而制备检测层；
2)制备金标抗原释放垫：以1:100-3000的标记比例将待标记的以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白VP2加入到pH7.0～10.0胶体金溶液中，按1:10～500的比例用含0.1～5％BSA的0.001～0.1mol/L磷酸盐缓冲液稀释胶体金标记的以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白VP2，将稀释后的胶体金标记的以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白VP2液按100μL/cm2的速度喷于玻璃纤维素膜中，4℃低温真空干燥；
3)组装支撑层、加样垫、制备金标抗原释放垫、检测层和吸收层。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白VP2的包被浓度为0.5mg/mL，以色列急性麻痹病毒核衣壳蛋白VP2兔多克隆抗体的包被浓度为1mg/mL。
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