CN101426917A - 重组单股反链病毒目病毒载体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组单股反链病毒目病毒(MV)载体，其包括旁邻为MV病毒基因的非编码区的外源基因。

Description

重组单股反链病毒目病毒载体

本发明涉及一种带有另外的转录单元的重组单股反链病毒目(Mononegaviral)病毒载体，该转录单元包括与上游的单股反链病毒目病毒基因起始(GS)序列和下游的单股反链病毒目重组病毒基因末端(GE)序列可操作连接的异源基因，以及涉及包括这种单股反链病毒目病毒载体的疫苗。

能在受感染宿主中复制的活病毒，诱导抗它们表达的抗原的强而且持久的免疫应答。它们有效地引起体液和细胞介导的免疫应答，而且刺激细胞因子和趋化因子通道。因此，活的，减毒病毒提供优于基于灭活或亚基免疫原的疫苗组合物的显著优点，这些疫苗组合物一般主要只刺激免疫系统的体液性抗体手臂(humoral arm)。

过去的十年，重组DNA技术已经使DNA与RNA病毒基因组的遗传工程领域都发生巨大变化。尤其是，引入外源基因到病毒的基因组中现在是可能的，以便新的载体病毒在宿主动物中复制以后，外源蛋白紧接着被表达，在宿主动物中发挥生物学作用。因而，重组载体病毒已经不仅开发用于控制和预防微生物引起的感染，而且用于设计靶治疗用于非微生物引起的疾病如恶性肿瘤和基因治疗中。

通过命名为“反向遗传学”的技术，完全来自克隆的cDNA的非节段性，负链RNA病毒(单股反链病毒目的病毒)的产生(其于1994年首次报道(Schnell et al.，EMBO J 13，4195-4203，1994))已经使利用单股反链病毒目(MV)的病毒作为载体成为可能。其后，描述利用MV目的许多病毒作为病毒载体，以表达来源于病原体的外源抗原的研究已经公开，其目的在于开发抗该病原体的疫苗。

单股反链病毒目划分成4个主要家族：副粘病毒科(paramyxoviridae)，弹状病毒科(Rhabdoviridae)，纤丝病毒科(Filoviridae)和玻那病毒科(Bornaviridae)。属于这些家族的病毒具有由单链，负(-)正义RNA分子表示的基因组，也即，该RNA基因组的极性与指定为正(+)正义的信使RNA(mRNA)的极性相反。主要的人与兽医学MV病毒的分类列于下表中：

表1：单股反链病毒目内病毒的分类

目前非常了解，而且多个作者综述了MV目的病毒的基因组结构和生活周期细节(Neumann et al.，J.Gen.Virology 83，2635-2662，2002；Whelan et al.，Curr.Top.Microbiol.Immunol.203，63-119，2004；Conzelmann，K.，Curr.Top.Microbiol.Immunol.203，1-41，2004)。尽管单股反链病毒目病毒具有不同的宿主和不同的形态学和生物学特性，但是它们具有许多共同的特征，如基因组结构和它们的一般复制和基因表达模式所必要的元件，这说明它们起源于一个共同的祖先。它们是包膜病毒，其在细胞的胞浆中复制，并产生没有剪接的mRNA。

单股反链病毒目病毒由两个主要的功能单元组成，核糖核蛋白(RNP)复合体和包膜。已经确定了上述所有家族的属的典型病毒的全部基因组序列。基因组大小为大约9.000个核苷酸到大约19.000个核苷酸，而且它们包含5到10个基因。MV病毒的基因组的结构和构造是很类似的，而且取决于它们特别的基因表达模式。所有的MV病毒基因组包括3个核心基因，其编码：核蛋白(N或NP)，磷蛋白(P)和依赖于RNA的RNA聚合酶(L)。病毒包膜由基质(M)蛋白和一种或多种跨膜糖蛋白(例如G，HN和F蛋白)组成，所述跨膜糖蛋白在病毒装配/出芽以及在细胞附着和/或病毒侵入中发挥作用。取决于属，通过在转录和病毒复制中显示某些特异性调节功能，或涉及病毒宿主反应的辅助蛋白(例如，C，V和NS蛋白)，来扩展蛋白库。MV病毒的基因顺序是高度保守的，在位于3’末端或其附近的核心基因N和P，而且在5’远端位置的大(L)基因。M，表面糖蛋白基因，以及其它的辅助基因，位于N，P与L基因之间。

在RNP复合物中，基因组或反基因组RNA用N蛋白紧密包裹，并与由L和P蛋白组成的依赖于RNA的RNA聚合酶相关。感染细胞以后，RNP复合物，而不是裸露的RNA基因组，用作两个不同的RNA合成功能的模板，也即亚基因组mRNA的转录和全长基因组RNA的复制。

所有串联排列的基因，通过所谓的“基因连接”结构隔开。基因连接包括一个保守的“基因末端”(GE)序列，一个非转录的“基因间隔区”(IGR)和一个保守的“基因起始”(GS)序列。这些序列对于基因转录而言都是足够的和必需的。转录期间，每个基因通过依赖于病毒RNA的RNA聚合酶连续转录成mRNA，该RNA聚合酶在第一个GS序列的基因组RNA的3′末端起始转录过程。在每个基因连接中，由于GE序列上的RNA聚合酶的脱离，转录被中断。在随后的GS序列上发生转录的重新起始，尽管以降低的效率。由于这种中断的过程，也称为“终止-起始”过程，转录减弱发生在每个基因连接中，结果MV病毒基因组中3’近端的基因比连续的下游基因转录得更多。MV病毒基因转录的模形式，其中每个基因是独立的顺反子或转录单位的部分，使这些病毒非常适于外源基因的插入和表达。MV病毒基因组中的每个转录单位包括下列元件：3’-GS-开放阅读框(ORF)-GE-5’。

在3’-和5’基因组末端，所有的MV病毒基因组具有短的非转录区，其分别称为“前导”(大约40-50nt)和“尾随”(大约20-600nt)。前导和尾随序列是必需的序列，其控制基因组RNA的复制，病毒衣壳化和包装。

反向遗传学技术和感染性MV病毒的拯救，已经使通过它的cDNA拷贝操作它的RNA基因组成为可能。合成病毒RNA所需的最小复制起始复合物，是RNP复合物。感染性MV病毒可以通过(反)基因组RNA，和来自(T7)RNA聚合酶驱动质粒的合适支持蛋白的细胞内共表达拯救。1994年Schnell等的初步报告，1994(上文)，根据原来的方案(或其轻微的改变)，已经实现了许多MV病毒种的可靠回收。

新城疫和禽流感是禽类的重要疾病，其可能在养禽业世界范围内引起严重的经济损失。新城疫病毒是MV目内的一种非节段的，负链RNA病毒。基因组，其长度为大约15kb，包含6个基因，其编码核蛋白(NP)，磷蛋白和V蛋白(P/V)，基质(M)蛋白，融合(F)蛋白，血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白和依赖于RNA的RNA聚合酶或大(L)蛋白。NDV基因以3′-NP-P-M-F-HN-L-5’的顺序连续排列，并被不同长度的基因间隔区隔开。所有的基因放在基因起始(GS)序列之前，其后面是非编码区，编码NDV蛋白的开放式阅读框，第二个非编码区和基因末端(GE)序列。NDV基因组的长度是6的倍数，其对于引入外源基因是必须考虑的。

禽流感(AI)是一种禽类疾病，其特征在于从轻微呼吸性迹象到高死亡率的严重疾病的。致病因子是属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的禽流感A病毒(AIV)。AIV包含编码10个蛋白的8个负极性的基因组RNA节段。根据表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(N)的抗原性，对AI病毒划分了亚型。迄今为止，16个血凝素(H 1-H 16)和9个神经氨酸酶(N 1-N 9)亚型是已知的。H和N的抗体在体液免疫应答中是重要的，并抑制感染或预防疾病。

禽流感和新城疫病毒，根据它们的毒性，可以划分成两个不同的致病型。由低致病的AIV(LPAI)或缓发型NDV引起的症状认为较少相关。相反，由高强毒病毒(NDV：中发型和速发型菌株)引起的高致病的禽流感(HPAI)和新城疫，是须申报的疾病。

尽管用缓发型NDV菌株进行抗NDV的常规疫苗接种，以保护小鸡抗高毒性的NDV菌株，但是在大多数国家不进行抗HPAI的疫苗接种，因为通过根除策略控制HPAI。但是，疫苗接种可用作一种策略，来最小化损失和降低发病率。疫苗诱导的免疫性是亚型特异性的，其指亚型H5疫苗可以保护免遭H5 AIV，但是不能保护免遭其它的H亚型。通常，流感病毒复制只限于肺，因为LPAI病毒的血凝素只能被类胰蛋白酶Clara裂解，类胰蛋白酶Clara是一种局限于肺的丝氨酸蛋白酶。至今，所有的HPAI病毒都是H5和H7亚型。这些HPAI病毒在H切割位点包含许多碱性氨基酸，因此它可以被普遍存在的弗林蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶样酶裂解成HA1和HA2亚基。这种病毒因此可以在其他的器官中生长。

H5和H7亚型疫苗可以为鸡和火鸡提供保护，免遭HPAI感染以后的临床征象和死亡。除了常规灭活的基于油的全AIV以外，载体病毒，亚基蛋白和DNA疫苗已经用实验方法显示有效用于抗AI的免疫接种。自用于各种病毒的反向遗传学出现以来，生产用作疫苗载体的重组病毒是一种重要的应用。已经构建了表达外源蛋白的各种重组负链RNA病毒。并且，AIV的血凝素被插入到各种载体病毒中如传染性喉气管炎病毒(ILTV)(Luschow et al.，Vaccine 19，4249-59，2001)，牛瘟病毒(Walsh et al.，J.Virol.74，10165-75，2000)和水泡性口膜炎病毒(VSV)(Roberts et al.，J.Virol.247，4704-11，1998)。

Rinderpestvirus也用作载体病毒，用于表达口蹄疫病毒VP1衣壳蛋白(Baron et al.，1999，J.of Gen.Virol.，vol.80，p.2031-2039)。

Tao等(1998，J.of Virol.，vol.72，p.2955-2961)描述了嵌合人副流感病毒(hPIV)3型的构建体，其中来自hPIV 1型的HN和F基因用于取代(而不是添加到)内源hPIV 3型HN和F基因。

NDV也用于表达AIV血凝素。流感A/WSN/33的血凝素基因被插入到NDV菌株Hitchner B1的P与M基因之间。这些重组体保护小鼠免受致命感染，尽管在小鼠中存在可检测的体重减轻，其在10天内完全恢复(Nakaya et al.J.Viro l.75，11868-73，2001)。具有用于外源基因的相同插入位点的另外的重组NDV，表达LPAI的H7，但是仅仅40％的接种鸡被保护免于速发型NDV和HPAI(Swayne et al.，AvianDis.47，1047-50，2003)。

然而这些出版物没有公开，内源MV基因的所谓非编码区对插入到MV载体基因组中的另外的外源基因的表达有任何有利作用。

本发明的一个目标是提供一种重组MV病毒载体，其显示由外源基因编码的蛋白的较高表达水平，该外源基因插入到载体病毒的基因组中，和/或显示比已知MV病毒载体增加的免疫原性。

本发明人已经发现，本发明的重组单股反链病毒目病毒可满足这个目标。因此，本发明提供了一种带有另外的转录单位的重组单股反链病毒目病毒载体，该转录单位包括与上游的单股反链病毒目病毒基因起始(GS)序列和下游的单股反链病毒目病毒基因末端(GE)序列可操作连接的外源基因，其特征在于单股反链病毒目病毒基因的3’非编码区和5’非编码区(基因组正义)，分别位于GS序列与外源基因的起始密码子之间，和外源基因的终止密码子与GE序列之间。

注意这里核酸链极性的表示，而且在本文余下部分中以基因组(-)正义提供，除了在mRNA与cDNA序列的情况中。

已经发现，包括插入到MV病毒基因组中的外源基因的转录单位中存在MV病毒基因的3’-与5’非编码区，对外源基因的转录和/或表达具有积极作用。图3中显示，对GS序列与禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因之间，和AIV HA基因与GE序列之间的MV病毒的非编码区进行工程操作，增加了由带有该AIV HA基因的MV病毒载体合成的HAmRNA的含量。也观察到了对蛋白表达水平的积极作用：在带有外源AIVHA基因的MV病毒载体的旁邻为非编码区的情况下，与利用AIV HA特异性抗血清，只显示强免疫学染色的MV病毒载体进行比较(图4)。因此，已经发现，虽然发明人不想受可能解释这些观察结果的任何理论或模型的束缚，但是位于外源基因旁邻的MV病毒非编码区的存在，对得到的MV病毒载体的表现具有积极作用。

外源基因是编码多肽或蛋白，而且天然不存在于受体MV病毒的基因组中的多核苷酸分子。

如上面已经详细描述的，MV病毒基因组结构的共同特征是它们的转录模形式，其中串联排列的转录单元被连续转录。在野生型MV病毒中，转录基因的旁邻为(i)它们的3’末端为GS序列和本领域命名为“非编码区”的核苷酸序列，和(ii)它们的5’末端为也命名为“非编码区”的核苷酸序列和GE序列。因此，如这里使用的，术语(3’或5’)“非编码区”指这样的核苷酸序列，其位于MV病毒的天然基因的上游(3’)或下游(5’)，并分别跨越GS序列与MV病毒基因的起始密码子(ATG)之间的区域，和MV病毒基因的终止密码子(TAA，TAG或TGA)与GE序列之间的区域。这里使用的非编码区来自于与载体病毒相同的病毒的基因(也即，非编码区与MV病毒载体是同源的)。

MV病毒的基因组结构的详细信息是本领域已知的，包括各种MV病毒基因的核苷酸序列，和它们的转录调控(GS与GE)序列，以及该基因旁邻的非编码序列。这种信息，例如，可获自国家生物技术信息中心(NCBI)，例如通过因特网上它们的网页；参见，表2和3)。

优选用于本发明的非编码序列来源于天然的MV病毒基因，但是天然非编码区中的一个或多个核苷酸的取代也认为在本发明的范围内。特别地，分别位于外源基因的起始/终止密码子紧接的上游或下游的核苷酸取代是期待的，而且该取代是由于引入人工限制性内切酶切割位点，其允许这些区域的遗传操作。

在本发明的一个优选的重组MV病毒载体中，非编码区是编码MV病毒包膜蛋白的基因，特别是M，G，F或HN蛋白，或RNP蛋白，尤其是N，P或L蛋白。

在本发明的一个尤其优选的重组MV病毒中，非编码区是编码F或HN蛋白的基因。

用于本发明的重组MV病毒载体的特定非编码区核苷酸序列示于表3中。

表2：单股反链病毒目病毒的基因组和载体信息

 

MV病毒	基因组信息NCB1登录号	重组病毒载体参考文献
			RV	NC_001542	Mebatsion et al.，PNAS 93，7310-14，1996
VSV	NC_001560	Kretzschmar et al.，J.Virol.71，5982-89，1997
			IHNV	NC_001652	-
SeV	NC_001552	Sakai et al.，FEBS Lett.456，221-6，1999
			hPIV 1	NC_003461	-
H PIV 3	NC_001796	Tao et al.，J.Virol.74，6448-58，2000
			bPIV 3	NC_002161	Tang et al.，Vaccine 23，1657-67，2005
麻疹病毒	NC_001498	Singh et al.，J.Virol.73，4823-28，1999
			牛瘟病毒	NC_006296	Walsh et al.，J.Gen.Virol.81，709-18，2000
CDV	NC_001921	Plattet et al.，Virus Res.101，147-53，2004
			SV 50	NC_006430	He et al.，Virology 237，249-60，1997
NDV	NC_002617	Zhao et al.，J.Gen.Virol.84，781-88，2003
			腮腺炎病毒	NC_002200	-
hPIV 2	NC_003443	-
			hRSV	NC_001781	Bukreyev et al.，PNAS 96，2367-72，1999
bRSV	NC_001989	Stope et al.，J.Virol.，75，9367-77，2001
			埃博拉病毒	NC_006432	-
马尔堡病毒	NC_001608	-

用于本发明中作为转录调控序列的GS和GE序列，优选为来源于MV病毒的天然基因的那些序列。相信在转录过程期间，尤其是在转录起始和mRNA 5’末端修饰，和在转录3’末端聚腺苷酸化和终止调控中，这些序列调节RNA聚合酶的活性。对于每种MV病毒，每个基因的开始由大约10个核苷酸的序列标记。虽然在一些MV病毒种中，每个基因的GS序列都是相同的，但是在其他的MV病毒种的基因组中，GS序列可以显示细微的差异。

由于它们在mRNA 3′末端聚A尾巴形成和转录终止中共同的功能，MV病毒中的GE序列享有共同的序列特征。典型的GE序列包括长度为4-8个核苷酸之间的U-序列。而且，紧接U-序列上游的C-残基是强烈保守的，而且其在富含A/U的核苷酸伸展序列之前。在不同的GE序列中，紧接U-序列上游的4个核苷酸由3′-AUUC-5′组成。

通过比较基因组模板中的核苷酸序列与mRNA末端中存在的核苷酸序列，已经鉴定了许多MV病毒基因的限定MV病毒基因的基因边界或基因连接的转录调控序列。而且许多研究已经确定了，有效的基因表达所需的GS和GE共有序列。GS和GE序列的一般特征和特定例子可来源于NCBI序列数据库中的信息(参见表2中的NCBI登录号)，而且Neumann等(J.Virol.83，2635-2662，2002)和Whelan等(Current Topics Microbiol.Immunol.203，63-119，2004)也对此进行了综述。

表3中列出了特别优选用于本发明的重组MV病毒载体中的GS与GE序列，尽管承认GS-，NCR-与GE序列之间的精确边界不是总能确定。NCBI数据库中公开了该序列信息(参见表2中的登录号)。NDV参考EMBL登录号Y18898，RV参考GenBank登录号M31046。

表3：不同的MV基因的基因连接序列信息(+正义)

 

病毒	GS	NCR(nt)GS与起始密码子之间	ORF	NCR(nt)终止密码子与GE之间	GE	IGR(GE与GS之间)
							RV	aacacccct	3	N	50	tgaaaaaaa	ct
	aacacccct	20	P	59	tgaaaaaaa	caggc
								aacaccact	6	M	171	tgaaaaaaa	ctatt
	aacatccct	18	G	459	agaaaaaaa	cattagatcagaagaacaactggc
								aacacttct	21	L	52	tgaaaaaaa
IHNV	ggcacttcagttg	100	NP	70	tagaaaaaaa	t
								ggcactatagtgc	25	P	32	agaaaaaaa	t
	ggcacgcaagtgt	41	M2	90	agacagaaaaaaa	t
								ggcacttttgtgc	39	G	28	agacagaaaaaaa	c
	ggcacatttgtgc	14	NV	-6	agatagaaaaaaa	t
								ggcacttttgtgc	64	L	41	agatacaaaaaaa
Sendai	agggtcaaag	54	NP	34	taagaaaaa	ctt

 

病毒
								agggtgaaag	93	P	74	taagaaaaa	ctt
	agggtgaaag	22	M	85	taagaaaaa	ctt
								agggataaag	43	F	61	taagaaaaa	ctt
	agggtgaaag	46	HN	95	taagaaaaa	ccc
								agggtgaatg	18	L	76	taagaaaaa
hPIV1	agggtaaag	54	N	31	aagtaagaaaaa	ctt
								agggtgaatg	93	P	71	aattaagaaaaa	ctt
	agggtcaaag	22	M	82	aaataagaaaaa	cgt
								agggacaaag	265	F	76	aagtaagaaaaa	ctt
	agggttaaag	46	HN	98	gaataagaaaaa	ctt
								agggttaatg	18	L	88	tagtaagaaaaa
bPIV3	aggattaaag	45	N	34	taagaaaaa	ctt
								aggattaatg	69	P	116	taagaaaaa	ctt
	aggatgaaag	22	M	51	aaacaaaaa	ctt
								aggatcaaag	101	F	26	tacaaaaaa	ctt
	aggaacaaag	63	HN	86	taataaaaaa	ctt
								aggagaaaag	12	L	62	taagaaaaa
hPIV3	aggattaaag	45	NP	34	taagaaaaa	ctt
								aggattaag	69	P	53	taagaaaaa	ctt
	aggattaaag	22	M	51	taatcaaaaa	ctt
								aggacaaaag	183	F	28	ttataaaaaa	ctt
	aggagtaaag	63	HN	81	tataaaaaa	ctt
								aggagcaaag	12	L	62	taataaaaa
Measlesvirus	aggattcaaag	42	N	49	ttataaaaaa	ctt
								aggaaccagg	50	P	62	ttataaaaaa	ctt
	aggagcaaag	22	M	417	taaacaaaa	ctt
								agggccaagg	574	F	128	taattaaaa	ctt
	agggtgcaag	10	H	74	ttaagaaaaa	cgt
								agggtccaag	12	L	59	ttaaagaaaa
Rinder-pest virus	aggattcaag	42	N	49	ttataaaaaa	ctt
								aggacccagg	49	P	62	ttataaaaaa	ctt
	aggagcaaag	22	M	408	taccaaacaaaa	ctt
								agggtcaaag	579	F	125	tataaacaaaaa	ctt
	aggatgcaag	10	H	98	ttataaaaaa	cgt
								agggtccaag	12	L	60	taaagaaaa
CDV	agggtcaatg	42	N	49	ttataaaaaa	ctt
								aggacccagg	49	P	62	ttataaaaaa	ctt
	aggacacaag	22	M	394	taattaatcaaaa	ctt
								agggtccagg	16	F	122	ttaaagaaaa	ctt
	agggctcagg	10	H	100	ttataaaaaaa	cta
								aggatccaag	12	L	53	tacgaaaaaaaa
SV5	aggtccggaacct	83	NP	92	tttaaagaaaaaaa	t
								aggcccggacgggt	47	P	54	ttttagaaaaaa	cgattaacgataaata
	agcccgaacact	20	M	193	ttcaaagaaaa	caatcatattaagac

 

						tatccta
								agcacgaacccat	15	F	25	tttttaagaaaaaaa	cgat
	aggaccgaacct	67	SH	64	ttttaaagaaaaaa	ta
								aggcccgaacact	54	HN	99	ttttaagaaaaa	ccaagagaacaat
	aggccagaatg	-3	L	22	Tttaagaaaaaa
							VSV	aacagtaatc	3	NP	42	tgaaaaaaa	ct
	aacagatatc	0	NS	-3	tgaaaaaaa	gt
								aacagatatc	31	M	98	tgaaaaaaa	ct
	aacagagatc	19	G	98	tgaaaaaaa	ct
								aacagcaatc	0	L	31	tgaaaaaaa
NDV	acgggtagaa	56	NP	200	ttagaaaaaa	gt
								acgggtagaa	73	P	169	ttaagaaaaaa	t
	acgggtagaa	24	M	102	ttagaaaaaa	c
								acgggtagaa	36	F	73	ttaagaaaaa	ctaccggttgtagatgaccaaaggacgatat
	acgggtagaa	81	HN	166	ttaagaaaaaa	tgtaagtggcaatgagatacaaggcaaaacagctcatggtaaataat
								acgggtagga	1	L	67	ttagaaaaaa

在本发明的一种优选的重组MV病毒载体中，GS-，GE序列与非编码区来源于相同的MV病毒基因。

用于制备重组MV病毒载体的方法(该载体带有包含外源基因的另外的转录单位)是本领域公知的。例如，表2涉及描述制备不同MV病毒种的这种重组载体病毒的文献。基本上，用于本发明的方法与现有技术中使用的方法相同，除了如上面所限定的，插入到MV病毒基因组中的外源基因的旁邻为合适的3’-与5’-非编码区外。

在本发明的一般方法中，通过插入一种分离的核酸分子(其包含(i)如上面所限定的，旁邻为3′-与5’-非编码区的外源基因和(ii)合适的转录调控序列)到MV病毒的基因组中来制备重组MV病毒载体，以便在得到的MV病毒载体中，外源基因之前和之后都是MV病毒基因连接，特别是包括GE-IGR-GS元件的基因组核苷酸序列片段。这种上游和下游元件的存在，不仅保证了插入的外源基因的合适转录，而且保证了位于插入的外源基因的上游和下游的同源MV病毒基因的合适转录。

更特别地，在该方法中，分离的核酸分子和MV病毒的基因组，以它们的cDNA形式(+正义)使用。这允许容易的操作和插入想要的核酸分子到病毒基因组中。

一般，基因组的不同部分可用于在两个基因之间插入外源基因，也即基因间隔区(IGR)，基因的3’或5’非编码区，以及基因组的3’启动子近端(N/NP基因之前)或5’远端(L基因之后)中。

外源基因可以有利地插入到N/NP基因之前，NP-P，P-M，M-G/F，G/F-HN，HN-L之间，和L基因之后。

最简单的方法是使用已经现有的限制性内切酶(RE)识别序列，在这些位点之一用酶进行切割并引入合适的转录盒。由于天然存在的限制性内切酶识别序列并不总是位于预定位置，通常可以通过定点突变或PCR诱变，把RE识别位点引入到基因组中。用于插入外源基因的适合的IGR的例子示于表3中。

待插入的转录盒的组成取决于插入的位点。例如，在转录盒被插入到IGR中的情况中，转录盒可以包含下列元件：3’RE识别位点-GS-非编码区-ORF(外源基因的)-非编码区-GE-RE识别位点5’。

做为选择，在引入转录盒到天然MV病毒基因的5′非编码区的情况中，转录盒可由以下物质组成：3′RE识别位点-GE-IGR-GS-非编码区-ORF(外源基因的)-非编码区-RE识别位点5’。

类似地，在引入转录盒到天然MV病毒基因的3′非编码区的情况中，转录盒可由以下物质组成：3’RE识别位点-非编码区-ORF(外源基因的)-非编码区-GE-IGR-GS-RE识别位点5’。

这种转录盒的制备和将其插入到MV病毒基因组中，只涉及常规的分子生物学技术，如表2中所列的参考文献中和本实施例中例示的。特别地，技术如定点突变和PCR诱变可用于该目的(Peeters et al.，1999，supra；Current Protocols in Molecular Biology，eds.：F.M.Ausubel et al.，Wiley N.Y.，1995 edition，pages 8.5.1.-8.5.9；Kunkel et al.，Methods in Enzymology Vol.154，376-382，1987)。

更特别地，本发明的重组MV病毒载体，可通过沿用已久的“反向遗传学”的方法制备，其能进行MV目的非节段，负链RNA病毒的遗传修饰(例如Conzelmann，K.K.的综述，Current Topics Microbiol.Immunol.203，1-41，2004；and Walpita et al.，FEMS Microbiol.Letters 244，9-18，2005)。

在该方法中，合适的细胞，在足以容许MV(反)基因组和支持蛋白转录和共表达，以及重组MV载体产生的条件下，通过包括含有编码MV病毒的全长基因组，或者，优选地，反基因组(+正义)的核苷酸序列的cDNA分子的载体，和一种或多种包括含有编码所需支持蛋白的核苷酸序列的cDNA分子的载体共转染。在该方法中，编码全长MV病毒(反)基因组的所述核酸分子，包括如上所述限定的另外的转录单位。

载体指复制子，如质粒，噬菌体或粘粒，另一个DNA节段可能附着到其上，以便引起附着的DNA节段在用该载体转染的细胞中复制，和它的转录和/或表达。

优选地，用于全长基因组转录的载体是质粒，其包括编码MV病毒的(反)基因组的cDNA序列，旁临为位于它的5′末端的T7聚合酶启动子，和位于它的3’末端的(肝炎DELTA)核酶序列，尽管也可以使用T3或SP6 RNA聚合酶启动子。

合适的支持蛋白的细胞内表达应用，优选由包括编码这些蛋白的cDNA序列的质粒，在合适的表达调控序列例如T7聚合酶启动子的调控下进行。

在用于制备本发明的重组MV病毒载体的一种特别优选的方法中，使用编码MV病毒的N(或NP)，P和L蛋白的表达质粒。

用于这种反向遗传学技术的转染支持质粒的量或比例，覆盖了一个较大的范围。用于支持质粒N:P:L的比例范围可以为大约20:10:1到1:1:2，而且每种病毒的有效转染方案是本领域已知的。

通过T7 RNA聚合酶启动子和核酶序列的共同作用，使基因组RNA的精确拷贝进入到转染的细胞中，而且该RNA接着被共转染表达质粒提供的病毒支持蛋白包装并复制。

由感染转染细胞的重组牛痘病毒，尤其是由牛痘病毒vTF7-3，提供T7聚合酶酶是优选地，可是其他的重组痘载体，如禽痘病毒，例如fpEFLT7pol，或其他的病毒载体也可用于T7 RNA聚合酶的表达。

来自牛痘病毒的拯救病毒的分离，可以通过简单的物理技术如过滤很容易地完成。对于仙台病毒或NDV的拯救，可通过在具胚的卵中接种转染细胞的上清液来完成。

在一个更加优选的实施方案中，细胞系用于转录和表达载体的转染，其组成型表达(T7)RNA聚合酶和/或一个或多个所需的支持蛋白。

例如，麻疹病毒的拯救可以在人胚肾细胞系，293-3-46中完成，其表达T7 RNA聚合酶和麻疹病毒支持蛋白N和P(Radecke et al.，EMBO J.14，5773-5784，1995)。可有利地用于本发明的另一个很有用的细胞系，是基于BSR的细胞，其表达T7 RNA聚合酶，也即BSR-T7/5细胞系(Buchholz et al.，J.Virol.73，251-259，1999)。

而且，Conzelmann，K.K.(上文)的综述和实施例1中，公开了这里用于制备本发明的MV病毒的关于反向遗传学技术的更详细的信息。

重组MV病毒载体稳定表达外源基因的能力，已经导致了用于预防和治疗应用的载体的发展。

在本发明的重组MV病毒载体中，外源基因可以根据特定的MV病毒载体种类和病毒载体的应用而改变。

外源基因可以编码(其他的)微生物病原体(例如病毒，细菌或寄生虫)的抗原，特别是外源基因编码能引起保护性免疫应答的病原体的抗原。

例如，可以插入到本发明的病毒载体中的异源基因序列包括，但不限于流感病毒糖蛋白基因，尤其是，禽流感病毒的H5和H7血凝素基因，来源于传染性囊病病毒(IBDV)的基因，特别地(IBDV)的VP2，来源于传染性支气管炎病毒(IBV)，猫白血病毒，犬瘟热病毒(caninedistemper virus)，马传染性贫血病毒，狂犬病病毒，埃利希氏体属生物体，特别是犬埃里希氏体(ehrlichia organism)，呼吸道合胞病毒，副流感病毒，人变性肿病毒(metapneumoviruses)和麻疹病毒的基因。

做为选择，外源基因可以编码多肽免疫调节剂，其能增强或调节对病毒感染的免疫应答，例如通过共表达细胞因子如白细胞介素(例如IL-2，IL-12，IFN-γ，TNF-α或GM-CSF)。

MV目包括能在人和动物，或在二者中复制的病毒(例如，狂犬病病毒和新城疫病毒)。因此，外源基因可以选自各种人和兽医学微生物病原体。

尽管所有的MV病毒都可用作本发明的病毒载体，在本发明的一个优选的实施方案中，重组MV病毒载体分别是弹状病毒科的病毒，优选狂犬病毒属或弹状病毒属的病毒，更优选狂犬病病毒或IHNV种。

在一个也优选的实施方案种，重组MV病毒是副粘病毒科，优选Respovirus属，特别是hPIV3或bPIV3种；Morbillivirus，特别是CDV种；Pneumovirus，特别是RSV种；和Avulavirus，特别是NDV种的病毒。

在本发明的一个特别优选的实施方案中，提供了一种重组MV病毒载体，其中病毒是新城疫病毒(NDV)。由于NDV能在人和动物中，特别是禽类，更特别地鸡中复制，本发明的重组NDV载体可包含编码病原体，特别是呼吸病原体的抗原的外源基因，或包含编码能在人或任何这些动物中引起合适的免疫应答的免疫调节剂的外源基因。

Peeters等(J.Virology 73，5001-5009，1999)，

等(J.Gen.Virol.80，2987-2995，1999)，以及Conzelmann，K.K.(上文)的综述中，已经公开了特别用于NDV的，NDV的遗传操作的反向遗传学方法。而且，已知NDV可用作载体用于外源基因的表达，例如，用于在用NDV载体感染的动物中引起免疫应答(Nakaya et al.，2001，上文)和Swayne et al.，Avian Dis.47，1047-50，2003)。

外源基因可以有利地引入到NDV基因组中的不同位置，一般如上面的MV病毒中所述的。特别地，在本发明的重组NDV载体中，外源基因(如合适的转录单位的部分)，可以插入到下列NDV基因之间：NP-P，P-M，M-F，F-HN，HN-L，而且位于3’近端-和5’远端的基因座(Zhaoet al.，2003，上文；Nakaya et al.，2001，上文)，优选位于3’近端，P-M，M-F和F-HN区，F-HN区是最优选的。

而且，在本发明的一种重组NDV载体中，外源基因旁邻的非编码区可以来源于所有天然存在的NDV基因，特别是来源于N，P，M，F或HN基因，HN基因是优选的。

在本发明的一个特定的实施方案中，提供了一种重组NDV载体，其中另外的转录单位位于F-HN基因之间，而且插入的外源基因的旁邻为NDV HN基因的非编码区。

更具体地，提供了一种NDV载体，其中3’-和5’NCR(和任选地GS和GE序列)，具有如SEQ ID No.1和2或3和4所示的核苷酸序列。

本发明的重组NDV载体，可有利地用于在禽类，特别是鸡中，诱导抗其他的病原体的免疫应答。因此，重组NDV载体，优选包括编码禽病原体，特别是流感病毒，马立克氏病病毒(MDV)，传染性喉气管炎病毒(ILTV)，传染性支气管炎病毒(IBV)，传染性囊病病毒(IBDV)，鸡贫血病毒(CAV)，reo病毒，禽逆转录病毒，家禽腺病毒，火鸡鼻气管炎病毒(TRTV)，大肠杆菌，Eimeria种，Cryptosporidia，支原体如M.Gallinarum，M.synoviae和M.meleagridis，Salmonella-，Campylobacter-，Ornithobacterium(ORT)或Pasteurella sp的保护性抗原的外源基因。

更优选地，重组NDV载体包括编码AIV，MDV，ILTV，IBV，TRTV，大肠杆菌，ORT或支原体的抗原的外源基因。

特别地，重组NDV载体突变体包括流感病毒，优选禽流感病毒(AIV)，更优选高致病性H5或H7 AIV的血凝素(HA)基因。

原则上，所有的(禽)流感株的HA基因都可用于本发明。本领域已经公开了许多HA基因的核苷酸序列，而且可以从核酸序列数据库，如GenBank或EMBL数据库重新得到。

如上所述，最近分离的，高致病性H5N2亚型AIV A/鸡/Italy/8/98的血凝素(HA)基因，可有利地用作本发明中的外源基因。在真核表达载体pcDNA3(Invitrogen)中逆转录，克隆该基因，并进行测序(Lüschow et al.，Vaccine，vol.19，p.4249-4259，2001，andGenBank Accession No.AJ305306)。使用产生人工的RE识别位点的特异性引物，该位点允许把HA基因插入到NDV基因组序列中，从获得的表达质粒pCD-HA5，通过扩增，可以获得HA基因。

在另一个实施方案中，如上所述，高致病性H7N1亚型AIV A/鸡/Italy/445/99的HA基因，可用作本发明的外源基因。HA基因进行逆转录，并通过PCR扩增。1711bp产物克隆到Sma I消化的载体pUC18(Amersham)中，并进行测序(Veits et al.，J.Gen.Virol.84.3343-3352，2003；和GenBank登录号AJ580353)。

在本发明的一个特别有利的重组MV病毒载体中，MV载体病毒是减毒的，那就是说，载体病毒对于靶动物是不致病的，或者与野生型病毒相比，显示毒性的大幅度削减。这里使用的许多MV病毒如病毒载体，具有如活的减毒疫苗如麻疹病毒和NDV一样的长安全记录，但是其他的病毒，如SeV和VSV认为对人是不致病的。此外，传统方法存在以获得和筛选减弱病毒，其显示有限的复制或传染潜能。这种技术包括在异源的基质中连续(冷)传代病毒，和化学诱变。

本发明的重组NDV载体可来源于任何常规的ND疫苗株。这种商业可获得的ND疫苗中存在的适合的NDV株的例子是：，LaSota，Hitchner B1，NDW，C2和AV4；

是优选的株。

本发明人还发现，本发明的重组MV病毒载体，能在动物中诱导保护性免疫应答。

因此，在本发明的另一个实施方案中，提供了抗微生物病原体的疫苗，其包括如上限定的活或灭活形式的重组MV病毒载体，和药学上可接受的载体或稀释剂。

本发明的疫苗可通过常规方法制备，如通常用于商业可获得的活和灭活MV病毒疫苗的那些方法。

简要地，用重组MV病毒载体接种敏感的基质并繁殖，直到病毒复制到想要的滴度，然后收获含有病毒的物质。接着，把收获的物质配制成具有免疫特性的药物制品。

能支持重组MV病毒载体复制的每种基质，都可用于本发明。作为基质，可使用来自于原核和真核来源的宿主细胞，取决于MV病毒。合适的宿主细胞可以是脊椎动物，例如，灵长类动物的细胞。适合的例子是：人细胞系HEK，WI-38，MRC-5或H-239，猿细胞系Vero，啮齿类动物细胞系CHO，BHK，犬细胞系MDCK或禽CEF或CEK细胞。

本发明的重组NDV载体可以在其上面繁殖的特别适合的基质是SPF具胚的卵。具胚的卵，可以用例如0.2ml NDV接种，其包括每个卵中含有至少10^2.0E ID₅₀的尿囊液。优选的，9到11天的具胚卵，用大约10^5.0 EID₅₀接种，并接着在37℃孵育2-4天。2-4天以后，优选可通过收集尿囊液，收获ND病毒产物。通过过滤器(100μm)过滤上清液之后，液体其后可以2500g离心10min。

本发明的疫苗包括与药学上可接受的载体或通常用于这种组合物的稀释剂一起的重组MV病毒载体。

可以悬浮液的形式或冷冻干燥的形式，制备和销售包含活病毒的疫苗。载体包括稳定剂，防腐剂和缓冲液。稀释剂包括水，含水的缓冲液和多元醇。

在本发明的另一个方面中，提供了包含灭活形式的重组MV病毒载体的疫苗。灭活疫苗的主要优点是它的安全，和可诱导的长期的高水平保护性抗体。

繁殖步骤以后收获的病毒灭活的目标是，消除病毒的繁殖。通常，这可通过公知的化学或物理方法完成。

如果需要，本发明的疫苗可包含佐剂。用于这种目的的适合的化合物和组合物的例子是氢氧化铝，磷酸铝或氧化铝，基于例如矿物油的水包油或油包水乳剂，如Bayol 

或Marcol 

或植物油如维生素E醋酸盐，和皂草苷。

本发明疫苗的给药可通过任何公知有效的形式进行，而且取决于MV病毒载体的类型。适合的给药模式包括，肠胃外，鼻内，口服和喷雾接种疫苗。

本发明的NDV载体疫苗，优选通过通常用于NDV疫苗接种的廉价集中使用技术来施用。对于NDV疫苗接种，这些技术包括饮用水和喷雾疫苗接种。

本发明的疫苗包括有效剂量的重组MV病毒载体作为活性组分，也即免疫MV病毒物质的量，其将在接种的禽类中诱导抗通过毒性微生物有机体的攻击的免疫性。免疫性这里定义为，疫苗接种以后，相较于未接种的组，在人或动物群体中，诱导抗致死率和临床症状的显著较高水平的保护。特别地，本发明的疫苗预防大部分接种的人或动物，以防疾病的临床症状和致死率的发生。

一般地，活疫苗可以10^2.0-10^8.0组织培养/胚胎感染剂量(TC/EID₅₀)的剂量施用，优选以10^4.0-10^7.0TC/EID₅₀的剂量范围。灭活疫苗可以包含10^4.0-10^9.0TC/EID₅₀的抗原同等物。

本发明还包括联合疫苗，其包括，除了本发明的重组MV病毒载体以外，能诱导保护以防另外的病原体的疫苗株。

实施例

实施例1：产生表达禽流感病毒HA基因(NDV/AIVH5)的重组MV病毒载体

-病毒和细胞

拯救的重组NDV和流感病毒分离物A/chicken/Italy/8/98，在无特异病原体的(SPF)10天龄具胚的鸡蛋中繁殖。使用速发型NDV株Herts 33/56和NDV Clone 30疫苗

稳定表达噬菌体T7 RNA聚合酶的BSR-T7/5细胞，用于从cDNA回收感染性NDV。

-编码包含AIV H5基因的NDV反基因组RNA的cDNA的构建

如这里用于确定NDV基因组中核苷酸的位置和NDV蛋白中的氨基酸残基的括弧中的计数，如等所述(J.Gen.Virol.80，2987-2995，1999，EMBL登录号Y18898)。质粒pf1NDV，其表达Clone 30的全长反基因组RNA(

 et al.，上文)，用于引AIV H5基因，该基因已经通过带有用于rNDV/AIVH5-A的人工MIuI限制性位点(PH5F1：5′-cta aac gcg taa aat gga gaa aatagt gc-3′(SEQ ID NO：5)和PH5R1：5′-tcg gac gcg ttt aaa tgcaaa ttc tgc act g-3′(SEQ ID NO：6)，MIuI位点有下划线)，和带有用于rNDV/AIVH5-B的NcoI或AfIII位点(PH5F2：5′-cct t cc atg gagaaa ata gtg ctt c-3′(SEQ ID NO：7)和PH5R2：5′-cct cct taa gta taa ttg act caa tta aat gca aat tct gca ctg caa tga tcc-3′(SEQ ID NO：8)，限制性位点有下划线)的特异性引物，从质粒pCD-HA5(Luschow et al.，上文)扩增。使用MIuI位点，如前面用于GFP插入所述的，将H5引入到Clone 30的反基因组中(图1A)(Engel-Herbert et al.，J.Virol.Methods 108，19-28，2003)。简要地，为了构建全长质粒pf1NDV/AIVH5-A，用包含人工MIuI位点(参见上面)的引物扩增H5 ORF，该位点用于将H5 ORF插入到最小基因盒的NDV的F和HN基因之间(图1A)。图1B提供了用于产生rNDV/AIVH5-B的包含AIV H5基因的全长质粒的构建。使用Quik

 II XL定点突变试剂盒(Stratagene)进行诱变反应。为此，使用包含Clone 30基因组的NotI/BsiWI-片段(4953-8852 n t)的pUC 18质粒(pUCNDVI)和以下引物：MP1(5-gac aac agt cct caacca tgg acc gcg ccg-3′)(SEQ ID NO：9)和MP2(5′-ctg gct agttga gtc aat tct taa gga gtt gga aag atg gc-3′)(SEQ ID NO：10)，用于突变A(图1B)，产生带有新建立的NcoI和AfIII位点(引物中的限制性位点有下划线)的质粒pUCNDV1a。用NcoI和AfIII消化以后，Clone 30的HN ORF被扩增的AIV H5 ORF取代。对于诱变B，为了在pUCNDVH5的L基因前面的基因间隔区中产生Sgf1-和SnaB1-位点，以得到pUCNDV/AIVH5-1b(图1B)，使用引物MP3(5′-caa aacagc tca tgg tac gta ata cgg gta gga cat gg-3′)(SEQ ID NO：11)和MP4(5′-gta agt ggc aat gcg atc gca ggc aaa aca gct cat gg-3′)(SEQ ID NO：12)。用MP3和MP5(5′-gaa aaa act acc ggc gat cgc tgacca aag gac gat ata cgg g-3′)(SEQ ID NO：13)进行诱变C，产生质粒pUCNDV1c，以获得Sgf1和SnaB1-位点，其用于将Clone 30 HN基因引入质粒pUCNDVH5_1b的L基因前面的基因间隔区中。最后，pf1NDV-1的Not1/BsiWI-片段被pUCNDVH5_1c的Not1/BsiWI-片段取代(图1B)。新产生的全长基因组的长度显示6的倍数(rNDV/AIVH5-A为16938nt，rNDV/AIVH5-B为17196 nt)。

-转染和病毒繁殖

转染实验，病毒繁殖和感染性病毒回收的确认，如前面所述的进行(

 et al.，上文；Engel-Herbert et al.，上文)。唯一的差异是，20μg的DNA(10μg包含质粒的全长基因组，6μg pCiteNP，2μg pCiteP和2μg pCiteL)总量用于转染。

-结果

AIV H5开放式阅读框插入到前面描述的质粒pf1NDV的F与HN基因之间( et al.，上文)。为此，通过带有MIuI限制性位点的引物，该位点用于将AIV H5 ORF插入到pf1NDVoligol的单个MIuI限制性位点中，从质粒pCD-HA5(Luschow et al.，上文)扩增AIV分离物A/chicken/Italy/8/98(H5N2)的AIV H5 ORF；(Engel-Herbert et al.，上文)产生质粒pf1NDV/AIVH5-A(图1A)。在这个构建体中，AIV H5 ORF的旁邻为人工基因起始(GS)与基因末端(GE)序列，其位于NDV的F与HN基因之间的基因间隔区中。为了构建全长质粒pf1NDV/AIVH5-B，质粒pUCNDV1a的HN ORF被扩增的H5ORF以NcoI/Af11I-片段取代(图1B)。在得到的质粒pUCNDVH5中，在H5基因下游的基因间隔区产生SgfI与SnaBI限制性位点，以产生质粒pUCNDVH5_1b(图1B)。产生的SgfI与SnaBI限制性位点，用于引入来自质粒pUCNDV1c的HN基因，其中HN基因的旁邻也为Sgf1与SnaBI限制性位点(图1B)。最后，得到的质粒pUCNDVH5_1c用于取代pf1NDV的Not1/BsW1-片段(图1B)。构建的pf1NDV/AIVH5-B不同于质粒pf 1NDV/AIVH5-A，因为NDV HN的非编码区又被插入到转录调控元件(GS，GE)与H5 ORF之间。

从用如前面描述的各个全长cDNA与支持质粒转染的BSR-T7/5细胞，回收NDV重组rNDV/AIVH5-A和rNDV/AIVH5-B(

et al.，上文；Engel-Herbert et al.，上文)。为了病毒回收，把转染上清液注入10天龄具胚的鸡蛋的尿囊腔中，并孵育5天。收获尿囊液，并通过血细胞凝集试验或间接免疫荧光(IF)，分析病毒的存在。包含病毒的尿囊液用于第二次继代，以用于进一步的病毒繁殖。通过逆转录-PCR和测序，证实插入的H5基因在rNDV/AIVH5-A与rNDV/AIVH5-B的病毒基因组中的存在(数据未显示)。图2A和2B显示了，NDV中HN ORF旁邻的区域的核苷酸序列，和NDV载体中H5 ORF的核苷酸序列。

实施例2：NDV/AIVH5载体的体外特性

-RNA分析

CEF细胞用NDV Clone 30，rNDV/AIVH5-A，rNDV/AIVH5-B和AIVA/chicken/Italy/8/98(H5N2)，以每细胞10的感染复数(MOI)感染，并于37℃孵育8h。制备感染和未感染细胞的总RNA，在变性琼脂糖凝胶中分离，并用放射性标记的cRNA杂交。质粒pCD-HA5和pCD-NDVHN，其分别包含AIV A/chicken/Italy/8/98(H5N2)H5和NDV Clone 30 HN的开放式阅读框，用于³²P标记的cRNA的体外转录(SP6/T7转录试剂盒，Roche)。

为了证实插入的AIV H5基因在rNDV/AIVH5-A和-B中的转录，用NDV/AIVH5重组体感染的初级鸡胚胎成纤维细胞的总RNA进行Northern印迹分析。NDV Clone 30和AIV A/chicken/Italy/8/98(H5N2)感染的细胞的RNA制品用作对照。对于rNDV/AIVH5-A以及rNDV/AIVH5-B，用基因特异性反义cRNA，检测插入的AIV H5基因的转录(图3)。可以观察到，AIV-H5B转录物延伸了大约81nt，而且比AIV-H5A转录物更丰富地存在。

-Western印迹分析

CEK细胞用NDV Clone 30，rNDV/AIVH5-A，rNDV/AIVH5-B和AIVA/chicken/Italy/8/98(H5N2)感染，并于37℃孵育20h。感染和未感染对照细胞的裂解物，通过SDS-PAGE进行分离(每道ca.10⁴细胞)，并转到硝酸纤维素滤膜上(

SD cell，Bio-Rad)。印迹用分别以1∶20000与1∶2500稀释的抗NDV的多克隆兔抗血清，或抗亚型H5的AIV的多克隆鸡抗血清，进行孵育。使用

West Pico化学发光基质(Pierce)，在X光胶片

 MP，Amersham)上，通过化学荧光，检测过氧化物酶缀合的种特异性第二抗体的结合。

在Western印迹分析中，只可在rNDV/AIVH5-B感染的细胞中检测到H5蛋白。AIV亚型H5-特异性抗血清检测到大约70与50kDa的两种显著的蛋白，和ca.25kDa的几乎不可见的蛋白，其在NDV Clone 30感染的细胞总没有发现(图4)。

-间接免疫荧光(IF)试验

为了间接IF试验，CEF细胞用NDV Clone 30，rNDV/AIVH5-A，rNDV/AIVH5-B和AIV A/chicken/Italy/8/98(H5N2)以低MOI感染20h。用甲醇和丙酮(1∶1)固定以后，细胞接着用分别以1∶3000与1∶100稀释的抗NDV的多克隆兔抗血清，或抗亚型H5的AIV的多克隆鸡抗血清进行孵育。用抗兔IgG的F(ab)₂片段和荧光素缀合的抗鸡IgG抗体孵育以后，通过常规的荧光显微术分析样本。

通过感染的CEF细胞的间接IF试验，检验H5表达。用NDV特异性抗血清孵育以后，在用NDV Clone 30，rNDV/AIVH5-A和rNDV/AIVH5-B感染的细胞中可检测到显著的荧光，而在用AIVA/chicken/Italy/8/98(H5N2)感染的细胞中和未感染的细胞中没有(图5，右面)。用AIV亚型H5特异性抗血清孵育，在AIV感染的细胞中显示显著的荧光。比较2种重组体，rNDV/AIVH5-B显示比rNDV/AIVH5-A更强的H5特异性荧光，这表明H5蛋白更高的表达水平(图5，左面)。

-免疫电子显微术

病毒粒子吸附到Formvar涂层的铜网7min。铜网用包含0.5％牛血清白蛋白的PBS洗涤4次，接着用NDV特异性的或AIV亚型H5特异性的抗血清孵育45min。用PB洗涤几次以后，铜网用A蛋白金(10nm，PAG10，Biocell International)或兔抗鸡金(10nm，RCHL 10，Biocell International)更进一步地孵育45min。用PB进行最后的洗涤以后，病毒粒子与磷钨酸(PTA，pH 7.2)进行显影，并用电子显微镜检验。

当检验NDV Clone 30或rNDV/AIVH5-A的病毒粒子时，仅用NDV特异性抗血清观察到了染色。相反，使用抗NDV抗血清，以及使用抗AIV的抗血清，观察到了rNDV/AIVH5-B染色，这证明rNDV/AIVH5-B的病毒粒子包含血凝素H5。沿着rNDV/AIVH5-B病毒粒子的表面，显著发现金颗粒，这表明血凝素锚定到病毒膜中。

实施例3：NDV/AIVH5载体的体内特性

-重组体rNDV/AIVH5-A与rNDV/AIVH5-B的保护的评价：

1天龄的鸡随机分派为两组，用10⁶EID₅₀的rNDV/AIVH5-A或用商业的NDV Clone 30疫苗(

Intervet，NL)通过喷雾进行眼鼻接种。在28天龄，以同样的方式进行第二次免疫接种。在第二次免疫接种后第12天，收集血液，通过HI试验确定NDV与AIVH5抗体的存在。第二次接种后2周，对免疫的组进行分类，每个组的一部分用10⁸EID₅₀的高致病性AIV分离物A/chicken/Italy/8/98(H5N2)进行眼鼻攻击。剩余的鸡用于评估疫苗抗速发型NDV的保护性功效。因此，这些鸡和另外的对照动物肌内注射接受10^5.3EID₅₀的NDV株Herts33/56。

免疫接种与攻击感染后，每天观察所有鸡的临床征象，观察10天，并分类为健康的(0)，生病的(1；下列征象之一：呼吸性征象，抑郁，腹泻，发绀，浮肿，神经紧张征象)，严重生病的(2；超过一种下列征象：呼吸性征象，抑郁，腹泻，发绀，浮肿，神经紧张征象)，或死亡(3)。计算临床评分，其代表每组中所有鸡这个时期的平均值。最后，攻击后3周，从所有幸存的动物获取血样，以评估抗AIV与NDV的抗体滴度。

在几乎相同的实验设计的单独的动物试验中，检验NDV重组体rNDV/AIVH5-B。唯一的差异是，在两组中都用10⁶EID₅₀的rNDV/AIVH5-B或NDV Clone 30疫苗进行眼鼻免疫接种，而不进行NDV攻击感染。

表4与图6中概括了这些实验的全部数据。接种后3周，通过HI试验，分析免疫鸡的血清，两种情况中都没有检测到HA特异性的血清抗体。第一次免疫接种以后，两组的所有动物都发展了高水平的NDV特异性抗体(平均HI滴度为2⁶-2⁷)，动物完全防止了速发型NDV感染，而所有的对照动物在4天内死亡，显示ND的典型征象。正如所料，AIV攻击感染在NDV Clone 30免疫的鸡中导致了严重的疾病，其死亡率为90％。rNDV/AIVH5-A免疫组的动物幸免于致死剂量的高致病性AIV，但是所有的鸡都显示不同的禽流感征象，其临床评分为0.64，这表明了显著的部分保护。然而，用rNDV/AIVH5-B免疫的鸡，用高致病性禽流感A病毒感染以后，完全防止了任何病征。

表4：rNDV/AIVH5-A与rNDV/AIVH5-B的动物试验概述

实施例4：旁邻为来自NDV F基因的ncr的NDV/AIV-H5载体的构建

使用基本上与上述相同的方法与材料(Enge l-Herbert et al.，上文)，制备了一种NDV载体构建体，其带有前面所述质粒pf1NDV的F与HN基因之间的H5AIV基因(

 et al.，上文)，但是现在H5插入物的旁邻为来自NDV F基因的非编码区。

简要地，使用的不同的步骤与材料是：

使带有NDVH5的1.6kb Not1-Pst1片段(pUCIRA)的pUC质粒突变，以产生MIuI限制性内切酶位点，其中使用诱变引物：pMPMLUIGRFHNF(5′-ggt tgt aga tga cca aag gac gcg tta cgg gta gaacgg taa gag agg-3′；SEQ ID NO：14)和pMPMLUIGRFHNR(5′-cct ctctta ccg ttc tac ccg taa cgc gtc ctt tgg tca tct aca acc-3′；SEQIDNO：15)(MIuI位点有下划线，GS序列以粗体)，得到质粒pUCIRAMLU。

两个低聚物退火：OFVOF：5′-agg acg cgt tac ggg tag aag attctg gat ccc ggt tgg cgc cct cca ggt gca gca cca tgg ag-3′(SEQID NO：16，MIuI位点有下划线)和OFVOR：5′-ctc cat ggt gct gcacct gga ggg cgc caa ccg gga tcc aga atc ttc tac ccgtaa cgc gtcct-3′(SEQ ID NO：17，MIuI位点有下划线)。然后，这些用MIuI与NcoI消化。

质粒pUCIRAMLU用MIuI与NcoI消化。

连接大约4.3kb的pUCIRAMLU的MIuI-NcoI片段与MIuI-NcoI消化的OFVOF/OFVOR寡杂合体。得到的质粒命名为PUCIRA2。

带有NDV的Not1-BsiWI片段与H5orf，而不是HNorf的pUC质粒(pUCAROK)，和pUCIRA2用NcoI与Sgf1消化，pUCAROK的Not1-NcoI片段被pUCIRA2的取代，产生质粒pUCAROK2。

进行HF-PCR(Roche)，来扩增插入的F基因后面的NDV F基因的ncr，使用引物：PNCRFHIF：5′-ata ctt aag ttc cct aat agt aatttg tgt-3′(SEQ ID NO：18，AfIII位点有下划线)，和PNCRFHIR：5′-cac gcgatcgca ttg cca ctg tac att ttt tct taa ctc tct gaactg aca gac tac c-3′(SEQ ID NO：19，Sgf1位点有下划线)，和质粒pUCAROA(pUC带有NDV的Not1-Spe1片段)。得到的～100bp片段连接到pGEMTeasy载体中，以提供pGEMFncrhi质粒。

pUCAROK2与pGEMFncrhi质粒用AfIII与Sgf1消化，以用来自pGEMFncrhi的F后面的HN ncr，取代质粒pUCAROK2的H5后面的HNncr。得到的质粒命名为pUCAROK4。

在最后的步骤中，NDVH5质粒的Not1-Sgf1片段被pUCAROK4的Not1-Sgf1片段取代，导致新的全长质粒E18C，其包括插入到NDV载体的F与HN之间的AIV H5基因(其旁邻为F-基因ncr′s)。

利用新的构建体转染实验，rec病毒繁殖与传染性病毒回收的确认如上所述进行。然后对病毒进行生物化学与生物学表征。

实施例5：其他的NDV载体构建体和rec病毒的产生：

利用类似的技术，使用不同的插入基因，和不同的插入位点，在NDV载体中进行其他的插入。

利用这里已经提供的细节，这些都在本领域熟练技术人员能力容易达到的范围内，因此它足以以表格形式提供这些：

表5：本发明的其他NDV载体构建体：

 

插入的基因	NDV插入区	NDV旁邻ncr区
			AIV H5	P-M	HN
AIV H5	M-F	HN
			AIV H7	F-HN	HN
AIV N1	F-HN	HN
			AIV H5	Before NP	HN

实施例6：产生表达EIAV包膜基因的重组狂犬病病毒载体

为了证明本发明的有利作用(使用MV基因非编码区以增强rec MV病毒粒子中外源蛋白的表达和/或呈递)扩展到副粘病毒科家族以外，狂犬病病毒-弹状病毒科的成员-用作载体来表达来源于不相关病毒马传染性贫血病毒(EIAV)的包膜蛋白。

在本实施例中，描述了包含EIAV包膜蛋白的rec狂犬病载体病毒的构建体，EIAV包膜蛋白被插入到狂犬病基因G与L之间，因此env基因的旁邻为来自于狂犬病G蛋白基因的ncr。

使用SAD-D29全长克隆(Mebatsion，2001，J.Virol.，vol.75，p.11496-11502)，其在这里称为ORA-D，在

 SK+噬菌粒中，制备狂犬病病毒的亚克隆。为了制备克隆载体，pSK载体首先用Sac1消化，用Klenow酶钝化，接着用HindIII消化，和～3kb片段的凝胶纯化。通过用Stul和HindIII消化ORA-D，纯化得到的1.3kb片段，和连接到制备的pSK载体中以产生质粒pNCR-b，来制备插入物。

pNCR-b质粒用BstXI和HindIII消化，纯化～4.0kb的片段，并用于与寡BSSNH+和BSSNH-(参见表6)连接，以产生包含最小的转录盒的质粒pSSNsc，与寡RABGNCR1-4(表6)连接以产生包含除了最小的转录单位外的非编码区的构建体GNCR-b(图7)。

通过从2052nt合成基因扩增，获得EIAV菌株Wyoming env基因，其已经最佳化密码子，除去RNA剪接位点(Cook，etal.2005，Vet.Micro.，vol.108，p.23-37)，并截短位于原始基因的3’编码区的134个氨基酸。

表6：rec狂犬病病毒构建期间使用的寡序列

 

寡-名称	SEQIDNO：	寡序列(5’->3’)
			BSSNH+	20	CTGGTGAAAAAAACTAACACCCCTGCTAGCA
BSSNH-	21	CGTTGACCACTTTTTTTGATTGTGGGGACGA-TCGTTCGA
			RABGNCRoligo1(*)	22	CTGGTGAAAAAAACTATTAACATCCCTCAAAA-GACTCAAGGATACGTACT
RABGNCRoligo2	23	GTATCCTTGAG TCTT TTGAGGGATGTTAATAG-TTTTTTTCACCAGTTGC
			RABGNCRoligo3	24	GGCCGTCCTTTCAACGATCCAAGTCCTGAAGA-TCACCTCCCCTTGGGGGA
RABGNCRoligo4	25	AGCTTCCCCCAAGGGGAGGTGATCTTCAGGAC-TTGGATCGTTGAAAG GACGG CCAGTAC
			EIAsynCDF	26	ATGGTGTCCATCGCCTTCTA
EIAsynCDstopR	27	TCAGTGTATGTTGTGTTGGGC

(*)从ORA-D变化的3nt原始的：GGAAAG GGACTGG，

到：GGATAC GTACTGG

扩增的env基因如下进行激酶处理，并插入到亚克隆中：使用引物组EIAsynCDF+EIAsynCDstopR，产生～2.0Kb扩增子，其被工程化以表示全部截短的EIAV包膜蛋白(参见表6)。扩增子插入到亚克隆GNCR-b中，其已经用SnaBI预先消化，并去磷酸化以产生重组质粒pGNCR-b：envG。～2.0Kb片段也插入到SSNsc亚克隆中，其已经用Nhe1预先消化，平末端化和去磷酸化以产生重组质粒pSSNsc：env。

每个重组构建体用Sph1并Hind111消化，并连接到SSNsc亚克隆中，其是Sph1/Hind111预先消化的，并用CIAP去磷酸化。返回到SSNsc亚克隆以后，通过用Sph1和MIuI消化，修饰的插入物返回到ORA-D主链，以产生重组狂犬病病毒RV-env和RV-envG(图8)。构建体的5’和3’末端，使用

终止子循环测序化学作用(AppliedBiosystems)，通过序列分析进行检验，并使用Applied Biosystems3100-Avant毛细管电泳测序仪分析。

已经描述了基于修饰的SAD狂犬病株ORA-D的全长cDNA克隆的构建体，和重组狂犬病病毒的产生(Schnell et al.，1994，EMBO J.，vol.13，p.4195-4203；Mebatsion，2001，上文)。如前面所述的，使用Mirus Trans-IT-LT1，把每个重组狂犬病病毒转染到BSR细胞中(Schnell，et al.，1994，上文)。转染后3天，收获细胞和上清液并传代。随后使用0.5的估计moi，只通过上清液传代。每个重组病毒传代最少5次，以证实稳定性。

用重组狂犬病感染的BSR细胞，在感染后～40小时被固定。使用FITC抗狂犬病单克隆球蛋白(FDI Diagnostics Inc.)，或使用抗EIAV多克隆马血清，通过直接免疫荧光分析这些细胞。在10倍系列稀释物中，还把产生狂犬病病毒的感染细胞的比例，与表达EIAV env的感染细胞进行比较，以监控病毒稳定性和重组抗原表达。

来自5次传代的重组狂犬病病毒，以0.01的moi，接种到装有新鲜BSR细胞的T-75烧瓶中。感染后24小时，培养基转换为无血清的。感染后72小时，收集上清液，并通过离心澄清(10,000xg)。病毒上清液通过蔗糖梯度纯化，以分析纯化的病毒粒子。

纯化的病毒粒子和总的感染细胞蛋白，与2 x Laemmli还原性样品缓冲液混合，并置于沸水中5-10分钟。溶于1 x SDS-PAGE工作缓冲液中的样品，点样到10％ Tris-HCL丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad)中。SDS-PAGE凝胶在20mA跑胶，直到染料前面靠近或位于凝胶的底部。通过于225mA印迹45分钟，把分离的蛋白转移到Immobilon-P(PVDF)膜(IPVH10100，Immobilon)上。印迹在封闭缓冲液(PBS-吐温20+1％干燥的脱脂乳)中在室温中孵育1小时，然后在PBS-吐温20中漂洗3次5分钟。使用针对狂犬病糖蛋白和核蛋白，分别在封闭缓冲液中稀释1:20000和1:2000的兔抗狂犬病多克隆血清，检测狂犬病的表达。

同时，使用在封闭缓冲液中稀释1:500的抗EIAV多克隆马血清，检测EIAV env表达。印迹在室温中孵育1小时，然后在PBS-Tween20漂洗3次5分钟。印迹置于HRP标记的缀合的山羊抗兔IgG(H+L)(KPL)，和HRP标记的缀合的山羊抗马IgG(H+L)(Bethyl Labs)中，每个在封闭缓冲液中稀释1:2000，并在室温中孵育1小时。印迹在PBS-Tween20中漂洗3 x 5分钟。印迹在TMB膜过氧化物酶基质(KPL)中孵育，直到完全发育，大约1-3分钟。印迹置于蒸馏水中以终止反应。

这种Western印迹实验的典型结果示于图9中，而且证明了表达EIAV包膜蛋白的重组狂犬病病毒的蛋白组成。

1道：宽范围的MW梯带(Bio-Rad)；

2道：ORA-D主链病毒；

3道：RV-env，包括EIAV-env基因，插入到狂犬病G与L基因之间，没有旁邻的ncr

4道：RV-envG，包括EIAV-env基因，旁邻为狂犬病病毒G蛋白的ncr区域。

在体外多次传代以后，两种重组狂犬病病毒产生相当的感染滴度，并稳定表达EIAV-env基因插入物。

然而，尽管使相当量的病毒粒子进行Western印迹，以常规方法构建的(因此没有旁邻的ncr′s)重组RV-env，只显示相应于EIAV-env蛋白的非常弱的条带；而重组病毒RV-envG，其具有插入的旁邻G蛋白非编码区的EIAV-env蛋白，以高得多的速率表达：图9，比较3-4道中env蛋白的条带。

由于RV-envG与RV-env的构建和插入另外是相同的，这是非编码区对促进高水平外源蛋白生产和免疫呈递具有积极作用的强烈证据。

序列表

<110>Intervet International BV

<120>重组mononegavirales病毒载体

<130>2006-007-FF

<150>US 60/783194

<151>2006-03-15

<160>27

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>133

<212>DNA

<213>新城疫病毒

<220>

<221>NDV_F基因末端

<222>(1)..(11)

<220>

<221>NDV_F-HN_基因间隔区

<222>(12)..(42)

<220>

<221>NDV_HN基因起始

<222>(43)..(52)

<220>

<221>NDV_HN基因_5’非编码区

<222>(53)..(133)

<400>1

<210>2

<211>177

<212>DNA

<213>新城疫病毒

<220>

<221>NDV_HN基因_3’_非编码区

<222>(1)..(166)

<220>

<221>NDV_HN基因末端

<222>(167)..(177)

<400>2

<210>3

<211>133

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>rec NDV插入构建体

<220>

<221>rNDV_F基因末端

<222>(1)..(11)

<220>

<221>rNDV_F-HN_基因间隔区

<222>(12)..(42)

<220>

<221>rNDV_HN基因起始

<222>(43)..(52)

<220>

<221>rNDV_HN基因_5’_非编码区

<222>(53)..(133)

<400>3

<210>4

<211>177

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>rec NDV插入构建体

<220>

<221>rNDV_HN基因_3’_非编码区

<222>(1)..(166)

<220>

<221>rNDV_HN基因末端

<222>(167)..(177)

<400>4

<210>5

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆引物 PH5F1

<400>5

<210>6

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆引物 PH5R1

<400>6

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆引物 PH5F2

<400>7

<210>8

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆引物 PH5R2

<400>8

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆引物 MP1

<400>9

<210>10

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆引物 MP2

<400>10

<210>11

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆引物 MP3

<400>11

<210>12

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆引物 MP4

<400>12

<210>13

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆引物 MP5

<400>13

<210>14

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>诱变引物 pMPMLUIGRFHNF

<400>14

<210>15

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>诱变引物 pMPMLUIGRFHNR

<400>15

<210>16

<211>65

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆寡聚物 OFVOF

<400>16

<210>17

<211>65

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆寡聚物 OFVOR

<400>17

<210>18

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆引物 PNCRFHIF

<400>18

<210>19

<211>58

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆引物 PNCRFHIR

<400>19

<210>20

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆引物 BSSNH+

<400>20

<210>21

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆引物 BSSNH-

<400>21

<210>22

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆引物 RABGNCRoligol

<400>22

<210>23

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆引物 RABGNCRoligo2

<400>23

<210>24

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆引物 RABGNCRoligo3

<400>24

<210>25

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆引物 RABGNCRoligo4

<400>25

<210>26

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆引物 EIAsynCDF

<400>26

<210>27

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆引物 EIAsynCDstopR

<400>27

Claims (23)

1.一种带有另外的转录单位的重组单股反链病毒目(Mononegavirales)病毒载体，该转录单位包含与上游的单股反链病毒目病毒基因起始(GS)序列和下游的单股反链病毒目病毒基因末端(GE)序列可操作连接的外源基因，其特征在于单股反链病毒目病毒基因的3’非编码区和5＇非编码区(基因组正义)，分别位于GS序列与外源基因的起始密码子之间和外源基因的终止密码子与GE序列之间。

2.权利要求1的重组单股反链病毒目病毒载体，其特征在于3’与5’非编码区是编码单股反链病毒目病毒的包膜蛋白的基因的，尤其是M，G，F或HN基因的。

3.权利要求1的重组单股反链病毒目病毒载体，其特征在于3’与5’非编码区是编码单股反链病毒目病毒的RNP蛋白的基因的。

4.权利要求1-3的重组单股反链病毒目病毒载体，其特征在于外源基因编码病原体的抗原。

5.权利要求1-3的重组单股反链病毒目病毒载体，其特征在于外源基因编码免疫-调节剂。

6.权利要求1-5的重组单股反链病毒目病毒载体，其特征在于单股反链病毒目病毒载体是弹状病毒科(Rhabdoviridae)的病毒。

7.权利要求6的重组单股反链病毒目病毒载体，其特征在于单股反链病毒目病毒载体是狂犬病病毒。

8.权利要求6的重组单股反链病毒目病毒载体，其特征在于单股反链病毒目病毒载体是传染性造血组织坏死病毒。

9.权利要求6-8的重组单股反链病毒目病毒载体，其特征在于3’与5＇非编码区是N，P，M或G基因的。

10.权利要求6-9的重组单股反链病毒目病毒载体，其特征在于另外的转录单位位于3’邻近的位置或P-M，M-G或G-L基因之间。

11.权利要求1-5的重组单股反链病毒目病毒载体，其特征在于单股反链病毒目病毒载体是副粘病毒科(paramyxoviridae)的病毒。

12.权利要求11的重组单股反链病毒目病毒载体，其特征在于单股反链病毒目病毒载体是新城疫病毒、犬瘟热病毒或(牛)副流感病毒。

13.权利要求11-12的重组单股反链病毒目病毒载体，其特征在于3’与5＇非编码区是NP、P、M、F或HN基因的。

14.权利要求11-13的重组单股反链病毒目病毒载体，其特征在于另外的转录单位位于3’邻近的位置或P-M、M-F、F-HN或HN-L基因之间。

15.权利要求11-14的重组单股反链病毒目病毒载体，其特征在于单股反链病毒目病毒载体是新城疫病毒。

16.权利要求15的重组单股反链病毒目病毒载体，其特征在于另外的转录单位位于F-HN基因之间。

17.权利要求15-16的重组单股反链病毒目病毒载体，其特征在于非编码区是HN基因的。

18.权利要求15-17的重组单股反链病毒目病毒载体，其特征在于外源基因编码禽病原体的抗原。

19.权利要求15-18的重组单股反链病毒目病毒载体，其特征在于外源基因编码流感病毒的血凝素(HA)，优选H5或H7血凝素。

20.权利要求1-19的重组单股反链病毒目病毒载体，其特征在于单股反链病毒目病毒载体是减毒病毒。

21.一种抗微生物病原体的疫苗，其特征在于它包含活的或灭活形式的权利要求1-20的重组单股反链病毒目病毒载体，和药学上可接受的载体或稀释剂。

22.权利要求21的疫苗，其特征在于它另外包含佐剂。

23.权利要求21-22的疫苗，其特征在于它包含另外的疫苗株。

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