WO1996006355A1

WO1996006355A1 - Reactif pour le dosage d'un anticorps dirige contre un antigene reduit et procede de dosage

Info

Publication number: WO1996006355A1
Application number: PCT/JP1995/001634
Authority: WO
Inventors: Yuzo Inoue; Toshinori Takei; Susumu Tokita
Original assignee: Dainabot Co., Ltd.
Priority date: 1994-08-19
Filing date: 1995-08-17
Publication date: 1996-02-29
Also published as: JPH0862219A

Description

明細害通元型抗原に対する抗体ァッセィ試薬及びそれを使用した測定方法産業上の利用分野

本発明は、試料中の C型肝炎ウィルス（HCV) 抗原と免疫学的に反応性の抗体の存在を同定するためのアツセィ、特に該抗原中に存在するシスティン残基を還元型ある、は還元型誘導体に変換ある、は保持し、特異的に該還元型抗原またはその還元型抗原誘導体と特異的に反応性の抗体を検出することに関する。 HC Vゲノムの NS 3領域、特に 33 C 抗原のシスティン残基が還元型あるいは還元型誘導体に変換されているかあるいはその還元型に保持されているものは、 C型肝炎ウィルス（H CV) に曝された個体の体液中の抗体検出試薬として有用である。特に、本発明は C型肝炎ウィルス（HCV) に対する抗体を高い感度で測定すると共により正確に測定するための測定用試薬に関する。背景技術

急性ウィルス肝炎は、これまで A型肝炎ウィルス（HAV) 、 B型肝炎ウィルス（HBV) などのウィルスにより引き起こされていることが見出されてきているが、これら HAVや HBV、サイトメガロウィルス、ェブスタイン—バールウィルスに対する抗体が検出されない急性肝炎が臨床的に見出され、これを非 A非 B型肝炎（NANBH) と呼ぶことが提案された。 HBVに対しては優れた試験法の開発が成功していることから、現在では輸血後肝炎の大部分が非 A非 B型肝炎であるという状況になつており、この意味でも非 A非 B型肝炎の有効な試験法の開発が求められた。このような中にあって、慢性非 A非 B型肝炎感染チンパンジーの血液から遗伝子組換え法によりクローニングされた非 A非 B型肝炎の因子は C型肝炎ウィルス（HCV) と名付けられた（欧州特許公開第 3 1 8 2 1 6号〔EP— A— 0 3 1 8 2 1 6〕、同第 3 8 8 2 3 2号〔EP— A - 0 3 8 8 2 3 2〕）。

こうして C型肝炎ウィルス（HCV) による感染を診断する方法としては、 1 9 8 8年に米国カイロン社より C 1 0 0— 3抗原を使用した H CV抗体測定系が開発された。この C 1 0 0 - 3と呼ばれる抗原は、そのァミノ末端にヒ卜スーパーォキサイドディスムターゼ（SOD) に由来する 1 5 4個のァミノ酸残基、 E c oR I制限酵素部位を含む合成 D N Aアダプターの発現で導かれる 5個のァミノ酸残基、クローン化された HCVゲノム由来の cDNAフラグメン卜の発現で導かれる 3 6 3個のァミノ酸残基及び MS 2クローニングベクター DN Aから導かれる 5 個のカルボキシ末端にある 5個のアミノ酸残基を含むものであると報告されている。

1 9 9 1年には、 HCVゲノム上の構造領域であるコア領域および C 1 0 0— 3抗原とは重複しない NS 3領域にコ一ドされる 3 3 C抗原の使用により更に感度および検出率の優れた H C V抗体測定系が開発された。さらに NS 4領域にコードされる抗原の使用も図られている。これら HCV抗体の測定法としては、赤血球やラテックス粒子を抗原担持担体として用いる凝集法、ビーズ、チューブ、あるいはプレートを抗原固相化担体として用いるィムノメトリック法等が用いられている。

しかし、抗原を担体上へ固相化する工程中あるいは調製された試薬の保存中に抗原の活性が反応溶液中で急激に低下し、抗原抗体反応が十分に進行できないために測定感度が十分に上がらない、更には抗原の活性が経時的に変化するために感度の再現性が悪化する等の問題があった。本発明者等は先にこの HCV抗体測定系における感度不良の問題は、 H CV抗原、特に HCVゲノム上の NS 3領域にコードされているタンパク質に含まれているシスティンが自然酸化を受け、ジスルフィド結合等になることに起因するとの知見に基づき H C V測定系に還元剤、特にチオール保護剤を添加することにより、その HCV抗体測定系の感度の低下の問題を防止でき、さらにその還元剤処理は該測定系に悪影響を与えないものであることを確かめた。こうして検体中の HCV抗体を免疫学的方法により測定するための試薬において、該 H C V抗原またはそれと実質的に同等の作用を有するぺプチド含有試薬に還元剤を含有せしめること、あるいは担体に固相化した HCV抗原またはそれと実質的に同等の作用を有するぺプチドを通元剤で処理した試薬を提供した。

こうした試薬を用いてさらに研究を進めるなかで、 HCV陽性検体中には HCVゲノム上の NS 3領域にコードされているタンパク質に含まれているシスティンの酸化型に対する抗体よりもその還元型に対する抗体の方が C型肝炎ウィルス（HCV) に曝された個体の体液中でははるかに高い力価で存在を示すことを見出した。

したがって、 H C V陽性検体を検出するには安定して H C Vゲノム上の NS 3領域にコードされているタンパク質のうち還元型システィン残基を含有するタンパク質部分に対する抗体（以下、単に「抗還元型 HC V抗体」という。）を検知する系を利用するのが有用である。しかしながら、これまでは上記したようにべプチド含有試薬に還元剤を含有せしめると力、、担体に固相化した H C V抗原を一旦通元剤で処理するなどのことしかなされておらず、確実に抗還元型 HCV抗体のみを検知する系は他には知られていなかった。また、一旦通元型のシスティン残基を含有するタンパク質部分が測定の途中などで酸化型に変化してしまうという問題を解決できなかった。発明の開示

本発明者等は、より確実に HCV陽性検体を検出するためには、安定して少なくとも該抗還元型 HCV抗体を検出できる測定系であれば、非常に有用との考えのもと鋭意研究した結果、 HCVゲノム上の NS 3領域にコードされているタンパク質，特に 33 C抗原のうちのシスティン残基を該抗還元型 H C V抗体とのみ反応できるようにすればよいことを見出し、本発明を完成したものである。即ち、本発明は、検体中の HC V抗体を免疫学的方法により測定するための抗原またはそれと実質的に同等の作用を有するぺプチド含有試薬において、該 HCVゲノム上の N S 3領域にコードされているタンパク質抗原（以下、単に「NS 3抗原」という。）またはそれと実質的に同等の作用を有するペプチド（以下、単に「NS 3抗原関連ペプチド」という。）中に存在するシスティン残基を、該 NS 3抗原または NS 3抗原関連べプチドに存在する還元型システィン残基を含有するタンパク質抗原部分に免疫学的かつ特異的に反応性の抗体（以下、単に「抗通元型 HCV抗体」という。）と免疫学的かつ特異的に反応性の残基に変換または保持されていることを特徴とする試薬及びその製造法に関する。

なお、 N S 3抗原及び N S 3抗原関連べプチドを含めて、 N S 3関連抗原と略称する。該抗通元型 HCV抗体は、 HCV陽性検体において抗酸化型 H C V抗体よりもはるかに高い力価で存在することが見出され、この抗通元型 H C V抗体に特異的に反応する抗原を試薬として用いることにより、測定系の感度を高めたり、測定結果の信頼性を高めることができる。ここで抗酸化型 HCV抗体とは NS 3抗原に対して酸化状態においても反応性の抗体を指す。図面の簡単な説明

図 1は、ボトル中の不活性ガスの影饗を示す。 H eはへリゥム含有の場合、 C 0 n t . は対照試験を示す。

図 2は、各 H C V抗原感作赤血球と H C V抗体陽性血清における検出感度との関係を示す。縦軸は Numb e rを示す。

図 3は、各 H C V抗原感作赤血球と H C V抗体陽性血清における検出感度との関係を示す。縦軸は Numb e rを示す。

図 4は、図 2及び図 3の結果の相関関係を示す。

図 5は、図 2及び図 3の結果の相関関係を示す。発明の詳細な説明

NS 3関連抗原中に存在するシスティン残基は、以下（1) 〜（5) からなる群から選ばれた処理を施すことにより、該抗還元型 H C V抗体と免疫学的かつ特異的に反応性の残基に変換するかまたはそのような残基を保持しているようにされることができると考えられる力要は該 N S 3関連抗原が該抗通元型 H C V抗体と免疫学的かつ特異的に反応性のものに変換される力、、あるいは該抗還元型 H C V抗体と免疫学的かつ特異的な反応性の保持されているものであればよい。

(1) S 3関連抗原をその中に存在するシスティン残基が還元型となるよう還元剤で処理し、得られた遝元型 NS 3関連抗原を乾燥状態、不活性ガス中あるいは脱酸素剤存在下で保持する、

(2) NS 3関連抗原中に存在するシスティン残基のチオール基を、チオール基保護または修飾試薬、例えばョードアセトアミド、ョード酢酸、 _p—クロロマーキユリ安息香酸、ヨウ化メチル、あるいは水銀、鉄、鉛などの金属などで修飾する、

(3) NS 3関連抗原中に存在するシスティン残基を、遺伝子組換え技術、例えば特定部位変異誘発法などにより修飾し、変異体リコビナント

NS 3抗原または NS 3抗原関連べプチドを製造する、

(4) NS 3関連抗原をその中に存在するシスティン残基が還元型となるよう通元剤で処理し、次に通元剤除去後得られた通元型の該 NS 3関連抗原を酸化防止剤の存在下使用直前まで保持する、

(5) NS 3関連抗原の中に存在するジスルフィド結合（― S— S—）を開裂させて、チオール基を形成できる酵素、例えばジスルフィド · レダクターゼなどで処理する、及び

(6) NS 3関連抗原の中に存在するシスティン残基に基質親和性をもつもので NS 3抗原または NS 3抗原関連べプチドを処理する。

本発明で用いる抗原としては、システィン残基を有するものであり、特には通元型システィン残基を有するものである。

特表平 2 - 5 0 0 8 8 0号公報、欧州特許公開第 3 1 8 2 1 6号！: E P— A- 0 3 1 8 2 1 6〕、同第 3 8 8 2 3 2号〔EP— A— 0 3 8 8 2 3 2〕には、 C型肝炎ウィルス（HCV) のゲノムのクローニングにより得られた DN A配列をもつクローンが開示されており、その開示された配列を利用して得られ、システィン残基を有するものは、本発明で用いる抗原の一つとして考えられる。

上記文献には、 C 1 0 0— 3クローンにより発現される C 1 0 0 -3 抗原の記載があり、この C 1 0 0— 3と呼ばれる抗原は、そのアミノ末端にヒトスーパーォキサイドデイスムターゼ（SOD) に由来する 1 5 4個のアミノ酸残基、 E c 0 R I制限酵素部位を含む合成 DN Aァダプタ一の発現で導かれる 5個のアミノ酸残基、クローン化された HCVゲノム由来の c DNAフラグメン卜の発現で導かれる 3 6 3個のァミノ酸残基及び MS 2クローニングベクター DNAから導かれる 5個のカルボキシ末端にある 5個のアミノ酸残基を含むと報告されている。 HCV配列の第 1番目〜第 1 5 0番目のアミノ酸残基を含むものは H C V—コア ( C o r e ) 抗原として知られている。 H C V配列の第 1 1 9 2番目〜第 1 4 5 7番目のアミノ酸残基を含むものは、 N S 3領域からのポリべプチドでクローン 3 3により発現され、 3 3 C抗原として知られている c 11〇¥配列の第1 6 7 6番目〜第 1 9 3 1番目のアミノ酸残基（2 5 6 個のアミノ酸残基からなる）を含むものは、 N S 4領域からのポリぺプチドである。

本発明で用いる抗原としては、 N S 3領域からのポリペプチドが挙げられ、特に、 3 3 C抗原またはそれと実質的に同様な活性を持つものが挙げられる。ここで抗原の活性とは、特異的な抗原抗体反応をなすことができるものをいい、特に検体中の特異抗体と免疫学的方法で反応する特異抗原の活性を指すもので、抗還元型 H C V抗体と反応しうるものである。本発明で用いる抗原は、このような性状を持つものであれば、遗伝子工学的手法によつて作製された発現産物たる組換え抗原、あるいは合成ペプチドであるものも格別の制限無く用いることが出来る。本発明で用いられる遺伝子工学的手法によって作製された発現産物たる組換え抗原、すなわち遺伝子組換え法で産生された抗原は、例えば遺伝子組換え技術を適用し、天然 H C Vなどのウイルスなどからクローニングにより得られた D N A配列あるいは既に知られた H C Vなどのゲノム配列から、酵素などを用いたり、化学合成により得られた D N A配列を、微生物あるいは動物、植物、昆虫及びそれらの培養細胞などで発現させて得られたリコビナント抗原である。このリコピナン卜抗原としては、例えば、 H C Vなどのゲノムの別々の抗原領域を発現させた組換え蛋白質（リコビナント蛋白質）の少なくとも 1種であることができる。本発明で用いられる遺伝子組換え法で産生された抗原としては、好ましくは触合蛋白質として得られるものである。特に、本発明の上記（3 ) の処理方法では、変異体リコビナント N S 3抗原または N S 3抗原関連べプチド (変異体リコビナント NS 3関連抗原）を合成するには、例えば、特定部位変異誘発法（アル、ウー（R. Wu) 及びエル、グロスマン（L. G r o s sman) 編、メソーズ 'イン 'ェンザィモロジ一（Me t h o d s i n En z ymo l o gyリ、 Vo l. 1 54、ァカデミツク *プレス、ニュー 'ヨーク (Ac a d em i c P r e s s、 New ) , 1 987年、セクション I V、第 329 1頁以降、例えば、第 32 9頁、第 350頁、第 367頁、第 382頁など）などの方法に従って行うことができる。該システィン残基は、例えば、欠失などの除去を施したり、あるいは他のアミノ酸で置換したり、さらには近傍配列を除去したり、他の配列で置換するなどの処理ができる。これらの決定は実験によりなすことができる。該システィン残基は、中性のアミノ酸、例えば、グリシン、ノくリン、ァラニン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フエ二ルァラニン、ヒスチジン、トリブトファン、セリン、スレオニン、メチォニンなどに置き換えることが挙げられる。

さらに好ましくはこのリコビナント抗原は CKS、 SOD、 S—ガラクトシダーゼ、グルタチオン S—トランスフェラーゼ、プロテイン A の I gG結合領域、マルトース結合蛋白質、あるいはそれらの関連蛋白質の触合蛋白質として得られるものであることができる。例えば、宿主細胞として大腸菌を用いて C K S融合蛋白質発現系の遺伝子産物として得られるもの、特には CKSの全 24 8個のァミノ酸配列のうち最初の 239個のアミノ酸配列をもつものとの融合蛋白質、及び宿主細胞として酵母を用いて S 0 D融合蛋白質発現系の遺伝子産物として得られるものが挙げられる。 CKS融合蛋白質発現系によるものとしては、例えば、特開平 4— 253998公報ゃ特開平 4一 28 1 792公報に記載のものが挙げられ、さらには例えば PHCV— 23リコビナント抗原、 pH CV_ 2 9リコビナント抗原、 pHCV— 3 1 リコビナント抗原、 pH CV— 3 4リコビナント抗原、 pHCV— 4 5リコビナント抗原、 pH CV— 4 8 リコビナント抗原、 pHCV— 4 9 リコビナント抗原、 pH CV— 5 0リコビナント抗原、 pHCV— 5 1 リコビナント抗原、 pH CV— 5 7リコビナント抗原、 pHCV— 5 8リコビナント抗原、 pH CV- 1 0 1 リコピナント抗原、 p H C V— 1 0 2 リコピナント抗原、 p H C V— 1 0 3リコピナント抗原、 p H C V— 1 0 4リコビナント抗原、 p H C V— 1 0 5 リコピナント抗原、 p H C V— 1 0 7 リコピナント抗原、あるいはそれらをべプチダーゼや化学的開裂試薬で処理などし、プロセッシングして得られたペプチド、例えば CKS遗伝子由来べプチド部分の切断してあるものなどが挙げられる。融合部位は、例えば臭化シアン、ヒドロキシルァミン、ギ酸、酢酸一ピリジン溶液、 2— （2 —二トロフエニルスルフエ二ル）一 3—ブロモインドールース力トールなどの化学的な処理で切断しうるようなものか、トリプシン、リシルェンドプロテアーゼ、 Xa因子、トロンビン、ヒト血漿カリクレインなどの酵素で切断しうるようなものとされていることができる。

こうして得られた形質転換体は、その大腸菌、酵母などの細胞を、ガラスビーズ、アルミナビーズなどを備えていてもよいホモジュナイザー、ワーリングブレンダー、フレンチプレス、超音波破砕機などの機械的方法、リゾチームなどの酵素による方法、凍結融解や浸透圧による物理的方法あるいはドデシル硫酸ナトリウム（SDS) 、トウィーン（Twe e n :商品名）、トライトン X (T r i t on X :商品名）などの界面活性剤、アセトン、ブタノールなどの有機溶媒、 EDTAなどのキレ一ト化剤などを用いる化学的方法などにより破砕することができる。細胞を破碎する際、懸濁液中にプロテアーゼ阻害剤などを添加しておくこともできる。超音波処理は、例えば、懸濁溶液試料を 1 0〜6 0 kHz の音波（超音波）を出すことのできる超音波振動子に適用することにより細胞を破壊することのできる装置にかけて行うことができ、そのような装置としては棒状の超音波振動子を試料に浸す型のものや、超音波振動子を取り付けた力ップ状の容器に試料をいれ処理する型のものや、連続処理が可能なように循環式にされた型のもの、さらにはビーズなどと共に試料を処理できるようにしたもの等が挙げられる。こういつた超音波破砕装置は、大岳製作所（株）、セントラル科学貿易（株）、セィコ一電子工業（株）などから市販されている。超音波処理は、細胞を破砕するに十分な時間処理することにより行われ、使用試料の量や使用出力に応じて適宜適当に選ぶことができ、通常約 1分間から約 2時間の範囲で選ぶことができる。得られた抗原含有形質転換体細胞液は、例えば硫酸アンモニゥムなどの蛋白質沈殿剤などを用いての塩析、エタノールなどの有機溶媒による沈殿法、界面活性剤などを用いての抽出、透析、密度勾配遠心などの遠心分離法、限外濂過法、イオン交換樹脂、イオン交換セルロース、イオン交換セフアデックス、アルミナ、ハイド口キシァパタイトなどによる吸着、カラムクロマトグラフィー、電気泳動法、デキストランゲル、ポリアクリルァミドゲル、ポリエチレングリコールジメタクリル酸ゲル、ァガロースゲル、多？ L質シリカガラス、分子ふるい法、モノクローナル抗体などを利用したァフィ二ティクロマトグラフィ一によりさらに分離、精製されることができ、使用に適したものに加工できる。これらの処理は、任意に適した方法を選び組み合わせてよい。これらの処理にあたっては、通元状態でその処理を行うことができ、例えば還元剤を含有する媒質を使用したり、酸素との接触を排除し得るように不活性ガス雰囲気中で処理をしたり、脱酸素剤共存下ある、は脱酸素剤のある雰囲気中で処理を行うことができる。通元剤としては、例えばジチオスレィトール、ジチォエリスリトール、チォグリコール酸、シ P T/JP95/01 3

1 1 スティン、グルタチオン、 2—メルカプトエタノール、 2—メルカプトェチルアミンおよびこれらの混合物から成る群より選ばれた少なくとも一つであるものにより処理されていることができる。この処理においては、特に、ジチオスレィトール、グルタチオン、 2—メルカプトエタノール等が好ましい。

本発明で用いる抗原は、上記抗遝元型 H C V抗体と実質的に免疫学的に特異的に反応しうる性状を持つものであれば、遺伝子工学的手法によつて作製された発現産物たる組換え抗原、あるいは合成べプチドであるものも格別の制限無く用いることが出来る。本発明においては、たとえ分子中にシスティンのチオール基またはそれに由来するジスルフィド結合を有していてもそれらが該抗原の活性に影響を与えうる基でない場合は、本発明での処理をなす対象抗原としてそれを意図はしない。

本発明で用いられる測定対象試料検体としては、全血、血清、血漿、などの生物由来材料をあげることができるが、これらに限定されるものではない。

本発明では、不溶性担体などの担体に、上記の（1 ) 〜（6 ) からなる群から選ばれた処理を施して得られた N S 3関連抗原を感作し、こうして得られた感作担体を用いて、検体中の特異抗体を免疫学的に測定するために使用する試薬が製造される。上記（1 ) の方法に従えば、例えば担体にその通元型の抗原を感作した後、凍結乾燥させるか、又は得られた感作担体を実質的に通元剤非存在のもとで不活性ガス雰囲気の下、適当な緩衝液に分散させることにより達成することが出来る。こうして得られた試薬は不活性ガス雰囲気下その使用直前まで保存される。このようにして得られた試薬は、測定時においても通元剤非存在のもとでその測定を行うことが出来る。不活性ガスとしては、窒素ガス、アルゴンガス、ヘリウムガス、炭酸ガス、それらの任意の混合ガスなどが挙げられる。担体にその還元型の抗原を感作する前に、必要に応じ、抗原は例えばジチオスレィトール、ジチォエリスリトール、チォグリコール酸、システィン、グルタチオン、 2—メルカプトエタノール、 2—メルカプ卜ェチルアミンおよびこれらの混合物から成る群より選ばれた少なくとも一つであるものにより処理されていることができる。この処理においては、特に、ジチオスレィトール、グルタチオン、 2—メルカブトエタノール等が好ましい。本発明においては、上記感作処理、凍結乾燥処理、保存及び測定操作のいずれかあるいはそのすベての処理にわたって脱酸素剤共存下または脱酸素剤のある雰囲気中で行うことができる。脱酸素剤としては、無機系の鉄粉末、アルカリ金属あるいはアルカリ土金属の亜硫酸水素塩、亜硫酸塩、チォ硫酸塩、ピロ亜硫酸塩など、有機系のァスコルビン酸、ハイドロキノン、カテコールなどが挙げられる。脱酸素剤としては、市販のエージレス（商品名）として入手できるものが挙げられる。ここで脱酸素剤としては、上記通元剤、さらにはチオール保護剤とは異なる。ここで用いることが出来る不溶性担体としては、不溶性担体として広く知られたものが挙げられ、例えば合成樹脂、ニトロセル口一ス等の天然ある、は合成の高分子等から作られたものの他、ラテツクス粒子等ある、は赤血球等が挙げられる。

上記（2 ) の方法に従えば、例えば抗原をチオール基修飾試薬で処理し、次に修飾抗原を感作した後、適当な緩衝液に分散させることにより達成することが出来る。チオール基修飾試薬としては、ョード齚酸、ョ一ドアセトアミド、プロモ齚酸などのハロゲノ酢酸またはそのアミド、 2—ブロモプロピオン酸など、 N—ェチルマレイミド、 p—クロロマーキユリ安息香酸、ヨウ化メチル、あるいは水銀、鉄、鉛などの金属、テトラチオン酸カリウム、テトラチオン酸ナトリウム、メチルメタンスルホネート、 2—ヒドロキシェチルジスルフイド、 S—ァセチルメルカブトコハク酸無水物、 N， N' —0—フヱニレンジマレイミド、グルタチオン、ジチォピリジンまたはその N—ォキサイド体などが挙げられる。上記（4 ) の方法に従えば、例えば担体にその抗原を感作した後、得られた感作担体を酸化防止剤（通元剤ゃチオール保護剤を除く）を含有する雰囲気下、適当な緩衝液に分散させることにより達成することが出来る。また、本発明は、上記（1 ) 〜（6 ) からなる群から選ばれた処理を施して得られた N S 3関連抗原を不溶性担体に固相化することによつて得られた固相化抗原を用いて、ェンザィムィムノアッセィ（E I A) 、ラジオィムノアッセィ（R I A) 、あるいはフルォロイムノアッセィ（ F I A) 等の方法により検体中の特異抗体を免疫学的に測定するために使用する試薬が製造される。

不溶性担体に H C V抗原を固相化した後、得られた抗原結合固相を前記の（1 ) 〜（6 ) からなる群から選ばれた処理を施し、次に緩衝液に浸清し、達成することが出来る。本発明において試料中の抗原と免疫学的に反応性の抗体を測定するにあたっては、抗原抗体反応にあずかる抗原は、必要に応じて、固定担体に固定しておき、この固定担体を、分析対象としての抗体等を含有する試料と接触させ、こうして固定担体に固定された抗原と、分析試料中の抗体等とを特異的に結合反応せしめ、この特異的に結合した分析対象物を検知することによりおこなうことができる。ここで用いることが出来る不溶性又は固体の担体としては、固相化用担体として広く知られたものが挙げられ、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、スチレン一ブタジエン共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、テフロン、ポリアセタール、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、スチレン一メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、ァクロレイン一エチレングリコールジメタクリレート共重合体等のポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエポキシ樹脂など合成樹脂、寒天、ァガロース、架橋ァガロース、架橋アルギン酸、架橋グァガム、紙、セルロース、ニトロセルロース、カルボキシルセルロースなどのセルロースエステルあるいは混合セルロースエステル、デキストラン、ゼラチン、キチン、コラーゲン、綿など、重合アミノ酸、多糖等の天然あるいは合成の修飾ある L、は非修飾の重合炭水化物、重合炭化水素などの高分子、それらの架橋誘導体など、ガラス、例えば活性化ガラス、シリカゲル、アルミナ、カオリン、タルク、シリカ—アルミナ、セラミック、カーボン、硫酸バリゥム、硫酸マグネシゥ厶などから選ばれたものであり、粒子、微粒子、膜、ビーズ、チューブ、プレート、マイクロプレート、マイクロタイター ·ゥエル、マイクロチューブ、ストリップ等の形状のものがある。さらには赤血球、ラテックス粒子、乳剤などが挙げられる。

本発明において試料中の抗原と免疫学的に反応性の抗体を測定するにあたっては、ラジオィムノアツセィ、酵素免疫測定法、螢光免疫測定法、化学又は生物発光免疫測定法、及び凝集反応免疫測定法などの方法によることができる。また化学発光免疫測定法は自動化された測定ができ好ましい方法でもある。ラジオィムノアツセィ、酵素免疫測定法、化学又は生物発光あるいは螢光免疫測定法などでは、 ^{1 2 5} I、 ³ Hなどの放射性物質、西洋わさびペルォキシダーゼ、；8— D—ガラクトシダーゼ、ァルカリフォスファターゼなどの酵素、フルォレツセインなどの螢光色素、ァクリジニゥムエステル類などの化学発光色素、金コロイド、セレンコロイドあるいは有色ラテックス粒子などの有色物質、発光又は発色物質などで標識された抗原などが試薬として用いられ、分析試料中の抗体、複合体等と特異的に結合反応せしめられ、その放射活性、酵素活性、ィ匕学発光あるいは色の有無などを測定して、試料中の抗体等が存在していたか否かを判別することができる。本発明においては、例えば、検知用試薬として、 4ーヒドロキシフヱニル酢酸、 1 , 2—フエ二レンジアミン、テトラメチルベンジジンなどと西洋ヮサビ 'ペルォキシダーゼ、ゥンベ、）フエリルガラクトシド、ニトロフエ二ルガラクトシドなどと一 D —ガラクトシダーゼ、ゥンベリフヱリルホスフヱート、ニトロフエ二ルホスフェート、 N A D Pなどとアルカリフォスファターゼ、ダルコ一ス— 6—リン酸'デヒドロゲナーゼなどの酵素試薬、放射性物質試薬、フルォレツセィンィソチオシァネー卜、テトラメチルローダミンイソチオシァネート、ァクリジニゥムエステル類、発光ランタニドなどを用いている螢光試薬、発光試薬、化学発光試薬、金コロイド、銀コロイド、セレンコロイドなどのコロイド標識試薬、磁性体試薬、ピオチン標識抗ピオチン抗体などのハブテン標識抗ハプテン抗体検出系試薬などを用いることができる。

本発明においては、特に化学発光標識法、例えばァクリジニゥムエステル類あるいは螢光標識法、例えば発光ランタニドなどで標識された試薬を用いる螢光あるいは化学発光免疫測定法は自動化された測定ができ好ましい方法である。特にァクリジニゥムエステル類で標識された試薬を用いる化学発光免疫測定法は自動化された測定ができ好ましい。ァクリジニゥムエステル類としては、例えば特開昭 6 2 - 3 9 5 9 8号公報、特開昭 6 2— 6 1 9 6 9号公報、特開昭 6 3— 5 7 5 7 2号公報、特開昭 6 3— 1 0 1 3 6 8号公報、特開昭 6 3— 1 1 2 5 6 4号公報、特開平 1 — 2 6 1 4 6 1号公報、英国特許明細書第 1 , 4 6 1 , 8 7 7号、米国特許明細書第 3， 5 3 9 , 5 7 4号などに記載の N—アルキル又はァリールァクリジニゥムー 9一力ルボン酸エステルなどが挙げられる。特に、特開昭 6 3— 1 1 2 5 6 4号公報、米国特許明細書第 3， 5 3 9， 5 7 4号などに記載の 1 0 —アルキル' N—アルキル又はァリール—スルホニルー N—アルキル又はァリールスルホニルァクリジニゥムー 9一カルボキサミド、 N—メチルァクリジニゥムー 9一力ルボン酸エステルなどは代表的な化学発光檫識として挙げられる。ァクリジニゥム標識の場合、測定前に発光開始試薬処理、例えば過酸化水素、例えば約 0 . 0 1 %〜約 0 . 1 %の過酸化水素水溶液、及び水酸化ナトリウム、例えば約 0 . 0 5 〜約0 . 5 Nの水酸化ナトリウム水溶液で処理しながら、ルミノメーターなどを用いて測定を行うことができる。発光ランタ二ドとしては、例えば欧州特許公開出願第 0 0 6 8 8 7 5号、米国特許明細書第 4 , 3 7 4 , 1 2 0号、米国特許明細書第 4， 2 8 3， 3 8 2号、米国特許明細書第 4 , 2 5 9， 3 1 3号、米国特許明細害第 4 , 3 5 2 , 7 5 1号、米国特許明細書第 4， 4 3 2 , 9 0 7号、欧州特許公開出願第 0 1 0 3 5 5 8号などに記載のアミノカルボン酸基を持つ発光ランタ二ドをキレート化できるものなどが挙げられる。また測定前にレーザー光などによる励起処理をして測定を容易にすることもできる。

勿論、標識剤は上記のものに限定されること無く、測定に使用される機器、場所などを考慮し、適宜当該分野で使用することが知られているものの中から目的に応じ選択して用いることができる。

凝集反応を利用した測定法では、抗原を粒子状担体、例えば、赤血球、ポリスチレン粒子、ラテックス粒子などに結合させたいわゆる感作粒子抗原などの粒子状抗原と、それに対する抗体とが特異的に結合反応して観察できるような凝集塊をつくる反応を利用する。例えば、試料中の抗体を検知するため、上記したような粒子状抗原を試料と混合して反応させ、例えば、水性媒質の中で抗原抗体反応により生じた凝集反応が観察されるか否かにより、試料中に測定対象の抗体が存在しているか否かが判別される。この凝集反応を用いた測定法にあっては、一定量の抗原に対し、一定の希釈列にある既知濃度あるいは量の抗体を加え、反応の結果得られる溶液の凝集反応の程度を希釈倍数の逆数で表して評価されることがなされる。逆に一定量の抗体に対し、一定の希釈列にある既知濃度あるいは量の抗原を加え、反応の結果得られる溶液の凝集反応の程度を希釈倍数の逆数で表して評価されることもなされるし、更に抗体に対する抗体、すなわち二次抗体を用いて間接的な凝集反応を観察することもなされる。受身凝集反応免疫測定法は、本発明に従い、例えば、 H C Vに対する抗体などの測定に用いられ、優れた作用効果が得られる。固体担体、粒子状担体ある L、は標識などと抗原とを結合あるいは吸着させるには、当該分野で汎用されている方法を用いることができ、例えばィオン相互作用、疎水相互作用、共有結合などの物理的吸着や化学的結合により行うことができる。化学的な結合剤としては、通常の当業者に知られたものの中から選択することができる力《、例えば、グルタルアルデヒド、 1—ェチルー 3— （3 —ジメチルァミノプロピル）カルポジイミド、 N， N' — 0—フエ二レンジマレイミド、 N—スクシンィミジル 3 - ( 2 —ピリジルジチォ）プロピオネート、 N—スクシンィミジル S—ァセチルメルカプトアセテート、 N—スクシンィミジル 4一（N 一マレイミドメチル）シクロへキサン一 1 一カルボキシレート、 N—スクシンイミジル 6—マレイミドへキサノエ一ト、 N—スクシンィミジノレ 4ーョードアセチルァミノべンゾエート、 N—スクシンィミジル 3— （p—ヒドロキシフエニル）プロピオンネート、 N—スクシンィミジル m—マレイミドベンゾエート、 N—スクシンィミジル 4—マレィミドブチレ一ト、 N—スクシンィミジル（p—マレイミドフェニル ) ァセテ一ト、 N—スクシンィミジル 4— ( p—マレイミドフエニル ) プチレートなどが挙げられ、さらに 6—マレイミドカプロン酸、 2— ブロモ酢酸、. 2—ョード醉酸、コハク酸等の活性エステル、トリアジンの活性エステル、スルホン酸エステル誘導体等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明の測定系においては、界面活性剤、緩衝剤、希釈液又は希釈剤、ブロッキング剤、キレート化剤、保存剤などを用いることができる。界面活性剤としては、陰イオン型界面活性剤、陽イオン型界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン型界面活性剤のうちから選んで用いることが出来る。陰イオン型界面活性剤としては、炭素数 1 2〜1 8の高級脂肪酸のアルカリ金属塩あるいはアルカリ土類金属塩、炭素数 1 2〜1 8の高級脂肪酸のトリエタノールァミンなどの有機塩基塩、炭素数 1 2〜 1 8 の高級脂肪酸又は高級アルコ一ルの硫酸ェステル、ァルキルスルホン酸塩、アルキルァリールスルホン酸塩などが挙げられる。陽イオン型界面活性剤としては、アルキル基、ァリール基、複素環基などを有する第四級アンモニゥム化合物などが挙げられる。アルカリ金属としては、ナトリウム、カリウム、リチウムなど、アルカリ土類金属としては、カルシゥム、マグネシウムなどが挙げられる。

両性界面活性剤としては、ポリアミノモノカルボン酸、炭素数 1 2〜

1 8の高級アルキルアミノ酸、ラウリルジメチルベタインなどのアミノ酸の N—トリアルキル置換体などが挙げられる。非イオン型界面活性剤としては、モノステアリン酸グリセリンなどの炭素数 1 2〜 1 8の高級脂肪酸の多価アルコールエステル、高級脂肪酸のボリオキシェチレンェステル、高級脂肪酸のソルビタンエステル、高級脂肪酸とポリオキシェチレン及びソルビタンエーテルとのエステル、ポリォキシエチレンラウリルアルコールなどの高級アルコールとポリオキンエチレンとのエーテル、ポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとのエーテルなどが挙げられる。緩衝剤、希釈液又は希釈剤としては、水、リン酸緩銜液、トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン（T r i s ) 緩衝液、例えば生理食塩水などの塩化ナトリウム液、 N— （2—ヒドロキシェチル）ピぺラジン一 N，一（2—エタンスルホン酸）（HEPES) 液、ピペラジン一 N， N，一ビス（2—エタンスルホン酸）（P I BES) 液、 3— (シァノへキシルァミノ）一 1—プロパンスルホン酸（CAPS) 液、 3 - (モルホリノ）プロパンスルホン酸（MOPS) 液、 N, Ν' ービス（2—ヒドロキシェチル）一 2—アミノエタンスルホン酸（B E S) 液、 Ν—トリス（ヒドロキシメチル）メチルー 2—アミノエタンスルホン酸（TE S) 液、 Ν— （2—ァセトアミド）一 2—アミノエタンスルホン酸（ACES) 液、アミノ酸液などが挙げられる。これらは単独で用いることができるし、任意に二種以上を配合しても用いることができる。キレート化剤としては、エチレンジァミンテトラ酢酸（EDTA) 、エチレングリコール一ビス（jg—アミノエチルエーテル）一 N, N, N' ， Ν' —テトラ酢酸（EGTA) などが挙げられる。これらキレート化剤は、約 0. 0 ImM〜約 2 OmMの範囲で用いることができる。保存剤としては、例えばナトリウムアジド、ェチルパラベンなどが挙げられる。その他、本発明の測定系には、各種動物の血清、例えば牛血清、牛血清アルブンミン（BSA) 、牛胎児血清（FCS) 、ャギ血清、卵白アルブンミン、ゼラチン、各種乳蛋白質、例えばスキムミルク、カゼイン、カゼイン分解物、ホェ一蛋白質など、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどからなる群から選ばれたものを添加することができる。これらは、約 0. 0 1 %vZv〜約 50 %ν/νの範囲で添加することができる。

本発明においては、リンパ球破砕物、例えばヒト Τーリンパ球抽出液、大腸菌抽出液、酵母抽出液、マウス細胞培養液抽出液などの細胞抽出物を添加することもできるこれらのものは、約 0. 00 1%νΖν〜約 20 %ν/νの範囲で添加することもできる。実施例

次に実施例を示して、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこの具体例により限定されるものでなく、その思想に従うかぎり各種の形態で実施できることは理解されるべきである。

実施例 1

固定化用ヒト赤血球をリン酸緩衝液（ P H 7 · 4 ) で 3回洗浄後、 p H 5. 7の酢酸緩銜液に 1容量％となるように懸濁し、遗伝子組換え技術により産生された精製 HCV 3 3 C抗原を最終濃度が、

1となるように添加し、室温で 1時間撹拌した後に、リン酸緩衝液（p H 7. 4) で 3回洗浄し、 7. 5%のサッカロース及び 3 OmMのグルタチオン（GSH) を含有するリン酸緩銜液（pH7. 4) 中で凍結乾燥して、 3 3 C抗原感作赤血球を調製した。

得られた 3 3 C抗原感作赤血球をトリス塩酸緩衝液（pH 7. 8) の入ったボトルに、 1容量％となるように注入し、懸濁させた。 3 3 C抗原感作赤血球懸濁液が入った該ボトルを酸素'濃度の約 2倍量及び 2 0倍量の脱酸素剤エージレス（商品名、三菱ガス化学社製）と共に非開放空間に保存した。対照として 3 3 C抗原感作赤血球懸濁液の入ったボトルを脱酸素剤不存在下開放空間に放置したものを用いた。こうして調製された 3 3 C抗原感作赤血球懸濁液を用い、 0〜 9日間その液を 2 5てに静置した後、感度比較を行った。感度の比較は、 3 3 C抗体陽性ヒト血清を、同抗体陰性である血清により予め段階希釈したものを感度管理用血清として使用した。マイクロタイター ·プレートの各ゥエルに、リン酸緩衝液（PH7. 4) 2 5 1、及び各濃度の感度管理用血清 2 5 // 1 を分注し、さらに感作赤血球を 2 5 ; 1分注し、ミキサーで 3 0秒間擾拌し、室温で 1時間放置した後、結果を目視により判定した。

結果は表 1に示す。表 1 脫酸茶剤の感度に及ぼす影響

開始 2 曰 S 5 曰 7 曰 9 曰巨 m m. 0 X2 X≥20 0 X2 X≥20 0 X2 X 20 0 X2 X≥20 パ A 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 ネ

ル B 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 検

体 c 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2.5 3 3

m 2 + 2 + 2+ 2 + 2 + 2 + 2 + 2 + 2+ 2 + 2 + 2 + 2 + i

対照 3 3 C抗原感作赤血球液を用いた場合、 5日目には Aパネル及び Bパネル血清検体で感度の消失が認められたが，脱酸素剤付加群ではいずれのパネル血清検体でも感度に変化は認められ無かった。実施例 2

3 3 C抗原感作赤血球保存用ボトル内にヘリウムガスを封入しておき、さらにトリス塩酸緩衝液（pH 7. 8) を入れておく。実施例 1と同様にして得られた凍結乾燥 3 3 C抗原感作赤血球を用い、該ボトルに、 1 容量％となるように該 H C V抗原感作赤血球をシリンジを使用して注入し、 3 3 C抗原感作赤血球を懸濁した。対照として何らヘリウムガスなどの不活性ガスの加えてないボトル中のトリス塩酸緩衝液に懸濁した 3 3 C抗原感作赤血球液を用いた。こうして調製された 3 3 C抗原感作赤血球懸濁液を用い、 0〜9日間その液を 2 5°Cに静置した後、実施例 1 と同様にして感度比較を行つた。

結果は図 1に示す。ヘリウムガス封入ボトルでの 3 3 C抗原感作赤血球液の場合には、 1 6日後でも十分に感度を保持できていた力 <、空気中で保存された 3 3 C抗原感作血球液の場合 5日目で感度がなくなり、 2 日目で実質上その使用に問題なものとなっていた。実施例 3

実施例 1と同様にして調製された凍結乾燥 3 3 C抗原感作赤血球を用い、トリス塩酸緩衝液（PH7. 8) を含有するボトル中で 4容量％となるようにその 3 3 C抗原感作赤血球を懸濁した後、凍結乾燥した。こうして調製された 3 3 C抗原感作赤血球を（1) 1 %牛血清アルブミン（BSA) 、 6%牛胎児血清（FCS) 含有 1 1 OmMトリス塩酸緩衝液（pH 7. 8) に再懸濁した後、室温で 1時間置いたもの、（2) (1) と同様に再懸濁後、室温で空気雰囲気に曝したまま 4日間匱いたもの及び（3) (2) と同様 4日間空気雰囲気中に放置した後、 30m Mグルタチオン含有 1 1 OmMトリス塩酸緩衝液（pH7. 8) で処理した 33 C抗原感作赤血球を室温で 1時間置いたものそれぞれを用い試験した。検体としては、 5， NC— r e g i 0 n— RT— PCR法 HC V RNA陽性を示した血清及び陰性を示した血清を用いた。血清は実施例 1に準じて HCV抗体陰性である血清により予め段階希釈し、感度管理用血清として使用し、測定を行った。

結果は表 2に示す。 P C R法陽性及び陰性血清検体共に、（ 1 ) 再懸濁後 1時間血球で測定されうる還元型抗原に対する抗体のタイター（t i t e r) のほう力、（2) 再懸濁後 4日間置かれた血球で測定されうる酸化型抗原に対する抗体のタイターより高かった。さらに、酸化型抗原をグルタチオン溶液で還元処理すると（1) と同様の抗原の反応性が再現されることが観察された。

表 2 HCV 33Ct¾ に * ^る抗体のタイター

検体 PCR離性検体検体 PCR法陰職体番号酸ィ再 ¾7^5J 番号

33 CiJt 33 Cin 33 CinM 33 CfiM 33 CiJtl 33 C

( 1 ) (2) (3) (1) (2) (3)

49 6 < 3 6 46 6 < 3 6

40 7 3 7 58 13 9 13

54 7 3 7 48 1 3 < 3 13

53 7 4 7 7 15 9 14

51 7 < 3 7 62 15 10 15

39 g 5 7 57 16 10 16

29 8 < 3 8 9 > l 4 7 > 14

26 9 7 9 13 > i 6 7 > 16

15 1 l 5 11 10 > l 6 10 > l 6

34 1 l 5 10 11 > 16 10 > 16

55 1 i 5 1 l 34 > l 6 1 o > l 6

56 1 l < 3 11 6 > 16 1 1 > 16

50 12 7 11 17 > 16 1 1 > 16

52 13 7 13 12 > 16 12 > 16

20 15 8 15 13 > 16 12 >16

38 > 14 8 >14 5 > 16 13 > 16

28 > 14 9 >14 14 > 16 14 > 16

41 >14 10 >14 15 >16 14 > 16

25 >16 14 >16 38 > 16 14 > 16

14 > 16 15 >16 8 > 16 15 > 16 実施例 4

HCV抗原のコア抗原、 C 1 0 0抗原及び 3 3 C抗原を実施例 1と同様にして感作して各 H C V抗原感作赤血球を調製した。同様に H C V抗原としてコア抗原、 C 1 0 0抗原及び 3 3 C抗原の混合物を用い HCV PHA抗原感作赤血球を調製した。 HCV 3 3 C抗原感作赤血球中のシスティン残基は十分に通元型であることが認められていた。この各 HCV抗原感作赤血球を用い、実施例 1に準じて感度比較を行った。結果は図 2及び図 3に示す。図 2 (a) は、 HCV PHA抗原感作赤血球での結果を示し、図 2 (b) は、 HCV 3 3 C抗原感作赤血球での結果を示し、図 3 (c) は、 HCV コア抗原抗原感作赤血球での結果を示し、図 3 (d) は、 HCV C 1 0 0抗原感作赤血球での結果を示す。 HCV PHA抗原感作赤血球での結果と HC V 3 3 C抗原感作赤血球での結果とはその分布がよく一致し、還元型 3 3 C抗原が H C V抗体測定試薬として非常に有用であることが証明された。実施例 5

実施例 1と同様にして得られた 3 3 C抗原感作赤血球を 7. 5%のサッ力ロース及び 1 OmMのジチオスレィトール（DDT) を含有するリン酸緩衝液（PH7. 4) 中で凍結乾燥して、 3 3 C抗原感作赤血球を調製した。得られた 3 3 C抗原感作赤血球を用い、実施例 1に準じて感度比較を行った。実施例 1と同様な結果が得られる。実施例 6

1 Z4インチのポリスチレン ' ビーズを 7. 5 %のサッカロースを含有するリン酸緩衝液（P H 7. 4) 中に入れ、実施例 1で使用した遗伝子組換え技術により産生された精製 HCV 3 3 C抗原を最終濃度が、 1 0 g/ 1となるように添加し、 3 7°Cで 1時間静置した。次にリン酸緩銜液（PH7. 4) で 3回洗浄後、 7. 5%のサッカロース及び 2 0 mMの 2—メルカブトエタノール（2— ME) を含有するリン酸緩衝液（PH7. 4) 中に浸演し、ついで乾燥処理し、 3 3 C抗原固相化ビーズを得た。対照固相化ビーズとして、 2— MEを含まない 7. 5 % のサッカロース含有リン酸緩銜液（pH7. 4) 中に浸演し、ついで乾燥処理して得られた 3 3 C抗原固相化ビーズを用いた。

保存 3 3 C抗原固相化ビーズ 1個を、反応用緩衝液としてトリス塩酸緩衝液（pH 7. 8 ) 2 0 0 ^ 1を入れた反応試験管に入れ、各濃度の感度管理用血清 1 0 jcz 1を添加し、 3 7 °Cで 1時間反応させた。反応終了後、生理食塩水で 3回洗浄し、ペルォキシダーゼ檫識抗ヒトイムノグロブリン G抗体 2 0 0 // 1を添加し、 3 7°Cで 3 0分間反応させた。反応終了後、生理食塩水で 3回洗浄し、オルトエチレンジァミン及び過酸化水素を含む基質溶液を 1 m 1加え、室温で 3 0分間反応させた後、 1 N硫酸溶液 1 m 1を添加し、反応停止後 4 9 0 nmの吸光度を測定することにより判定した。 2— ME処理ビーズは、感度が傻れていた。実施例 7

7. 5 %のサッカロース及び 4 OmMのグルタチオン（GSH) を含有するリン酸緩衝液（PH7. 4) 中に浸漬し、ついで乾燥処理する以外は、実施例 6と同様に処理し、 3 3 C抗原固相化ビーズを調製した。得られた 3 3 C抗原固相化ビーズを用い、実施例 6と同様にして感度比較を行った。実施例 6と同様な結果が得られる。

Claims

請求の範囲

1. 検体中の H C V抗体を免疫学的方法により測定するための抗原またはそれと実質的に同等の作用を有するぺプチド含有試薬において、抗原として HCVゲノム上の NS 3領域にコードされているタンパク質抗原またはそれと実質的に同等の作用を有するぺプチドを少なくとも用い、該抗原が還元型 N S 3関連抗原の形態を実質上保有するように変換または保持されていることを特徴とする試薬。

2. 該抗原中にはシスティン残基が存在し、該システィン残基は、以下

(1) 還元型 NS 3関連抗原を乾燥状態、不活性ガス中あるいは脱酸素剤存在下で保持する、

(2) 還元型 NS 3関連抗原中に存在するシスティン残基のチオール基を、チオール基保護または修飾試薬、例えばョードアセトアミド、ョード酢酸、 P—クロロマーキユリ安息香酸、ヨウ化メチル、あるいは水銀、鉄、鉛などの金属などで修飾する、

(3) 遝元型 NS 3関連抗原中に存在するシスティン残基を、遺伝子組換え技術、例えば特定部位変異誘発法などにより修飾し、変異体リコビナント NS 3関連抗原として製造する、

(4) 還元型 NS 3関連抗原を酸化防止剤の存在下使用直前まで保持する、

(5) ジスルフィド結合（一 S— S— ) を開裂させて、チオール基を形成できる酵素、例えばジスルフィド' レダクターゼなどで NS 3関連抗原を処理する、または

(6) NS 3関連抗原を存在するシスティン残基に基質親和性をもつもので処理する

のいずれかの処理をなすことにより、該抗通元型 H C V抗体と免疫学的かつ特異的に反応性の残基に変換するかまたはそのような残基を保持しているようにされることを特徴とする請求項 1記載の試薬。

3 . 抗原はその製造、分離及び又は精製処理において実質的に通元状態あるいは酸素非存在下にそれらの処理がなされたものである請求項 1又は 2記載の試薬。

4 . N S 3領域にコードされているタンパク質抗原が 3 3 Cである請求項 1〜 3のいずれか一記載の試薬。

5 . 抗原またはそれと実質的に同等の作用を有するぺプチドを用いた検体中の H C V抗体の免疫学的測定方法において、抗原として H C Vゲノム上の N S 3領域にコードされているタンパク質抗原またはそれと実質的に同等の作用を有するぺプチドを少なくとも使用し、該抗原中に存在するシスティン残基を、抗通元型 H C V抗体と免疫学的かつ特異的に反応性である残基に変換または保持しておくことを特徴とする検体中の H C V抗体の測定方法。

6 . 該抗原中に存在するシスティン残基を、以下

( 1 ) 還元型 N S 3関連抗原を乾燥状態、不活性ガス中あるいは脱酸素剤存在下で保持する、

( 2 ) 還元型 N S 3関連抗原中に存在するシスティン残基のチオール基を、チオール基保護または修飾試薬、例えばョードアセトアミド、ョード酢酸、 P—クロロマーキユリ安息香酸、ヨウ化メチル、あるいは水銀、鉄、鉛などの金属などで修飾する、

( 3 ) ¾元型 N S 3関連抗原中に存在するシスティン残基を、遺伝子組換え技術、例えば特定部位変異誘発法などにより修飾し、変異体リコビナント N S 3関連抗原として製造する、 (4) 還元型 NS 3関連抗原を酸化防止剤の存在下使用直前まで保持する、

の、ずれかをなすことにより、該抗還元型 H C V抗体と免疫学的かつ特異的に反応性の残基に変換するかまたはそのような残基を保持しているようにすることを特徴とする請求項 5記載の検体中の H C V抗体の測定方法。

7. 抗原はその製造、分離及び/又は精製処理において実質的に通元状態あるいは酸素非存在下にそれらの処理がなされたものである請求項

5又は 6記載の検体中の H C V抗体の測定方法。

8. NS 3領域にコードされているタンパク質抗原が 33 Cである請求項 5〜 7のいずれか一記載の検体中の H C V抗体の測定方法。

抗体の測定法。

9. 該抗原試薬を乾燥状態、脱酸素剤又は不活性ガス中で保存、又は測定のため使用するものである請求項 5記載の検体中の H C V抗体の測定方法。