JP2001033445A - ウイルス抗原の調製法 - Google Patents
ウイルス抗原の調製法Info
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- JP2001033445A JP2001033445A JP11272673A JP27267399A JP2001033445A JP 2001033445 A JP2001033445 A JP 2001033445A JP 11272673 A JP11272673 A JP 11272673A JP 27267399 A JP27267399 A JP 27267399A JP 2001033445 A JP2001033445 A JP 2001033445A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 抗原活性を高めたウイルス抗原を得ることが
できるウイルス抗原の調製法を提供する。 【解決手段】 ウイルス抗原を界面活性剤、還元剤及び
タンパク質変性剤からなる群より選択される少なくとも
１種によって低分子化または変性処理する工程、並び
に、上記低分子化または変性処理されたウイルス抗原
に、酸化剤溶液で希釈又は透析する工程からなるウイル
ス抗原の調製法。
できるウイルス抗原の調製法を提供する。 【解決手段】 ウイルス抗原を界面活性剤、還元剤及び
タンパク質変性剤からなる群より選択される少なくとも
１種によって低分子化または変性処理する工程、並び
に、上記低分子化または変性処理されたウイルス抗原
に、酸化剤溶液で希釈又は透析する工程からなるウイル
ス抗原の調製法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗原活性を高めたウイ
ルス抗原を得ることができるウイルス抗原の調製法に関
する。
ルス抗原を得ることができるウイルス抗原の調製法に関
する。
【０００２】
【従来技術】近年、ウイルス感染症の多様化に伴い、ウ
イルス感染を検出することへの重要性が増加している。
そのようなウイルス検出法の一つとして、ウイルスに対
する特異抗体が体内に作られたか否かを測定することに
より感染の有無を調べる免疫診断法がある。
イルス感染を検出することへの重要性が増加している。
そのようなウイルス検出法の一つとして、ウイルスに対
する特異抗体が体内に作られたか否かを測定することに
より感染の有無を調べる免疫診断法がある。
【０００３】例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）で
は、感染時の患者血清中には、直径４２ｎｍのＤａｎｅ
粒子と呼ばれる二本鎖ＤＮＡウイルスの他に、直径２２
ｎｍの小型球状粒子や同じ外径で長さ５０〜７００ｎｍ
の管状粒子が存在することが知られている。これらＨＢ
Ｖには、ＨＢＶの外被（ｓｕｒｆａｃｅ）、芯（ｃｏｒ
ｅ）に対応する表面抗原（ＨＢｓ抗原）、核抗原（ＨＢ
ｃ抗原）等が存在する。
は、感染時の患者血清中には、直径４２ｎｍのＤａｎｅ
粒子と呼ばれる二本鎖ＤＮＡウイルスの他に、直径２２
ｎｍの小型球状粒子や同じ外径で長さ５０〜７００ｎｍ
の管状粒子が存在することが知られている。これらＨＢ
Ｖには、ＨＢＶの外被（ｓｕｒｆａｃｅ）、芯（ｃｏｒ
ｅ）に対応する表面抗原（ＨＢｓ抗原）、核抗原（ＨＢ
ｃ抗原）等が存在する。
【０００４】このような各抗原に対する抗体の検出は、
臨床診断上重要である。特に、ＨＢｓ抗体はＨＢＶに対
する感染防御抗体であるので、過去にＨＢＶの感染があ
り既に排除されている場合やＨＢＶワクチン接種後であ
る場合に血中にＨＢｓ抗体が検出される。従って、ＨＢ
ｓ抗体が陽性であることは、ＨＢＶに対して抵抗性があ
り、再感染のおそれがないことを示すものである。
臨床診断上重要である。特に、ＨＢｓ抗体はＨＢＶに対
する感染防御抗体であるので、過去にＨＢＶの感染があ
り既に排除されている場合やＨＢＶワクチン接種後であ
る場合に血中にＨＢｓ抗体が検出される。従って、ＨＢ
ｓ抗体が陽性であることは、ＨＢＶに対して抵抗性があ
り、再感染のおそれがないことを示すものである。
【０００５】そのようなＨＢｓ抗体を検出する方法にお
いては、ＨＢｓ抗原を酵素で標識したり、不溶性担体に
吸着・固定化したものを試薬として用いる。そのためＨ
Ｂｓ抗原の大量調製系が必要であるが、現在では、その
ようなＨＢｓ抗原は、ＨＢｓ抗原陽性であってＨＢＶが
検出されない患者の血清から抽出された小型球状粒子が
主に用いられているが、血清の供給量が限られている等
の問題点があった。
いては、ＨＢｓ抗原を酵素で標識したり、不溶性担体に
吸着・固定化したものを試薬として用いる。そのためＨ
Ｂｓ抗原の大量調製系が必要であるが、現在では、その
ようなＨＢｓ抗原は、ＨＢｓ抗原陽性であってＨＢＶが
検出されない患者の血清から抽出された小型球状粒子が
主に用いられているが、血清の供給量が限られている等
の問題点があった。
【０００６】近年、遺伝子組み換え技術の進展により、
タンパク質の生産が実用化されており、ＨＢｓ抗原にお
いても、遺伝子組み換え技術による抗原タンパク質の生
産が試みられている。しかしながら、大腸菌を宿主とし
た場合、低分子量タンパク質が生産されるものの、それ
らは集合せず粒子状とはならないため、抗原活性は極め
て弱いものであった（Ｐｕｍｐｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｇｅ
ｎｅ，３０，２０１（１９８４））。また、酵母を宿主
とした場合、細胞から抗原タンパクの分泌が起こらず精
製が困難である等の問題点があった（Ｍｉｙａｎｏｈａ
ｒａ，Ａ ｅｔａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．，８０，１（１９８３））。
タンパク質の生産が実用化されており、ＨＢｓ抗原にお
いても、遺伝子組み換え技術による抗原タンパク質の生
産が試みられている。しかしながら、大腸菌を宿主とし
た場合、低分子量タンパク質が生産されるものの、それ
らは集合せず粒子状とはならないため、抗原活性は極め
て弱いものであった（Ｐｕｍｐｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｇｅ
ｎｅ，３０，２０１（１９８４））。また、酵母を宿主
とした場合、細胞から抗原タンパクの分泌が起こらず精
製が困難である等の問題点があった（Ｍｉｙａｎｏｈａ
ｒａ，Ａ ｅｔａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．，８０，１（１９８３））。
【０００７】そのため、宿主として大腸菌や酵母ではな
く、ＣＨＯ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｌ細胞等の培養細胞を
用いる系が考案、検討され、抗原活性を高めた抗原タン
パク質の生産も報告されている（特開昭６３−２３０６
３９号公報）。しかしながら、このような培養細胞は、
大腸菌や酵母等に比較して格段に培養日数がかかり、操
作も習熟した技術を要するため煩雑なものであり、大量
生産には不適であるという問題点があった。従って、培
養日数が短く、培養操作も簡便である大腸菌や酵母を宿
主とするものであって、抗原活性の高いウイルス抗原を
生産する系の開発が望まれている。
く、ＣＨＯ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｌ細胞等の培養細胞を
用いる系が考案、検討され、抗原活性を高めた抗原タン
パク質の生産も報告されている（特開昭６３−２３０６
３９号公報）。しかしながら、このような培養細胞は、
大腸菌や酵母等に比較して格段に培養日数がかかり、操
作も習熟した技術を要するため煩雑なものであり、大量
生産には不適であるという問題点があった。従って、培
養日数が短く、培養操作も簡便である大腸菌や酵母を宿
主とするものであって、抗原活性の高いウイルス抗原を
生産する系の開発が望まれている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記現状に
鑑み、抗原活性を高めたウイルス抗原を得ることができ
るウイルス抗原の調製法を提供することを目的とする。
鑑み、抗原活性を高めたウイルス抗原を得ることができ
るウイルス抗原の調製法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、ウイルス抗原
を界面活性剤、還元剤及びタンパク質変性剤からなる群
より選択される少なくとも１種によって低分子化又は変
性処理する工程、並びに、上記低分子化又は変性処理さ
れたウイルス抗原に、酸化剤溶液で希釈又は透析する工
程からなるウイルス抗原の調製法である。
を界面活性剤、還元剤及びタンパク質変性剤からなる群
より選択される少なくとも１種によって低分子化又は変
性処理する工程、並びに、上記低分子化又は変性処理さ
れたウイルス抗原に、酸化剤溶液で希釈又は透析する工
程からなるウイルス抗原の調製法である。
【００１０】本発明は、遺伝子組み換え大腸菌等の細菌
や酵母等の菌体内で生産され特有の立体構造を有しない
ウイルス抗原タンパク質、又は、顆粒化し不溶化したウ
イルス抗原タンパク質を、界面活性剤、還元剤、タンパ
ク質変性剤からなる群より選択される少なくとも１種を
作用させて低分子化又は変性処理した後、これを酸化剤
を含む溶液で希釈又は透析することにより、抗原活性を
高めた粒子状抗原を調製するものである。
や酵母等の菌体内で生産され特有の立体構造を有しない
ウイルス抗原タンパク質、又は、顆粒化し不溶化したウ
イルス抗原タンパク質を、界面活性剤、還元剤、タンパ
ク質変性剤からなる群より選択される少なくとも１種を
作用させて低分子化又は変性処理した後、これを酸化剤
を含む溶液で希釈又は透析することにより、抗原活性を
高めた粒子状抗原を調製するものである。
【００１１】本発明のウイルス抗原の調製法はまた、陽
性患者血清等から抽出される天然型粒子状抗原タンパク
質を用いて低分子化又は変性処理した後に、これを酸化
剤を含む溶液で希釈又は透析することにより粒子状に再
構成させ処理前より活性を高くした抗原を調製すること
ができる。本発明のウイルス抗原の調製法はまた、ＣＨ
Ｏ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｌ細胞等の培養細胞等を宿主と
した遺伝子組み換えタンパク生産系に応用することも可
能である。
性患者血清等から抽出される天然型粒子状抗原タンパク
質を用いて低分子化又は変性処理した後に、これを酸化
剤を含む溶液で希釈又は透析することにより粒子状に再
構成させ処理前より活性を高くした抗原を調製すること
ができる。本発明のウイルス抗原の調製法はまた、ＣＨ
Ｏ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｌ細胞等の培養細胞等を宿主と
した遺伝子組み換えタンパク生産系に応用することも可
能である。
【００１２】本発明においては、培養日数が短い点及び
培養操作が簡便な点並びに大量に調製可能である点か
ら、大腸菌等の細菌及び酵母を宿主とした遺伝子組み換
え法により発現されたものが好ましい。例えば、大腸菌
を用いた系では、菌体内に生産されるタンパク質が顆粒
として形成され、これら顆粒化したタンパク質は不溶化
して抗原活性を示さない場合が多かった。顆粒形成がな
い場合でも、ウイルス抗原では抗原タンパク質が特有の
集合状態、即ち、球状粒子にならなければ、抗原活性を
示さない場合も多い。本発明では、これらの抗原タンパ
ク質を一旦低分子化又は変性処理し、再構成させて抗原
活性を高めることができる。
培養操作が簡便な点並びに大量に調製可能である点か
ら、大腸菌等の細菌及び酵母を宿主とした遺伝子組み換
え法により発現されたものが好ましい。例えば、大腸菌
を用いた系では、菌体内に生産されるタンパク質が顆粒
として形成され、これら顆粒化したタンパク質は不溶化
して抗原活性を示さない場合が多かった。顆粒形成がな
い場合でも、ウイルス抗原では抗原タンパク質が特有の
集合状態、即ち、球状粒子にならなければ、抗原活性を
示さない場合も多い。本発明では、これらの抗原タンパ
ク質を一旦低分子化又は変性処理し、再構成させて抗原
活性を高めることができる。
【００１３】上記ウイルス抗原としては特に限定され
ず、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓ抗
原）、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ抗原）、Ｃ型
肝炎ウイルス抗原（ＨＣＶ抗原）、エイズウイルス抗原
（ＨＩＶ抗原）等が挙げられる。
ず、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓ抗
原）、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃ抗原）、Ｃ型
肝炎ウイルス抗原（ＨＣＶ抗原）、エイズウイルス抗原
（ＨＩＶ抗原）等が挙げられる。
【００１４】本発明のウイルス抗原の調製法は、ウイル
ス抗原を界面活性剤、還元剤及びタンパク質変性剤から
なる群より選択される少なくとも１種によって低分子化
又は変性処理する工程を含むものである。本明細書にお
いて、低分子化又は変性処理するとは、界面活性剤、還
元剤及びタンパク質変性剤からなる群より選択される少
なくとも１種によって処理を行うことを意味する。
ス抗原を界面活性剤、還元剤及びタンパク質変性剤から
なる群より選択される少なくとも１種によって低分子化
又は変性処理する工程を含むものである。本明細書にお
いて、低分子化又は変性処理するとは、界面活性剤、還
元剤及びタンパク質変性剤からなる群より選択される少
なくとも１種によって処理を行うことを意味する。
【００１５】上記還元剤は、タンパク質のジスルフィド
（−ＳＳ−）結合を解離させるものであれば特に限定さ
れず、例えば、β−メルカプトエタノール、２−メルカ
プトエチルアミン、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジ
チオエリスルトール（ＤＴＥ）、水素化ホウ素ナトリウ
ム、モノチオリン酸等が挙げられる。使用する濃度は処
理するウイルス抗原の濃度によって異なるが、通常は溶
液中の濃度が０．０１〜２００ｍＭとなるように用い
る。
（−ＳＳ−）結合を解離させるものであれば特に限定さ
れず、例えば、β−メルカプトエタノール、２−メルカ
プトエチルアミン、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジ
チオエリスルトール（ＤＴＥ）、水素化ホウ素ナトリウ
ム、モノチオリン酸等が挙げられる。使用する濃度は処
理するウイルス抗原の濃度によって異なるが、通常は溶
液中の濃度が０．０１〜２００ｍＭとなるように用い
る。
【００１６】上記界面活性剤は、脂質を除去可能なもの
であれば特に限定されず、例えば、ドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）、ドデシルスルホン硫酸ナトリウム、コ
ール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、３−
［（コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１
−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、オクチルグルコ
シド（ＯＧ）、オクチルチオグルコシド、ノナノイル−
Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−９）、ポリオキシエ
チレンドデシルエーテル（Ｂｒｉｊｉ）、ポリオキシエ
チレンｉ−オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ）、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（Ｎ
ｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）、ポリオキシエチレン脂肪酸
エステル（Ｓｐａｎ）、ポリオキシエチレンソルビトー
ルエステル（Ｔｗｅｅｎ）等がある。用いる濃度は処理
するウイルス抗原濃度によって異なるが、０．０１〜２
０％の範囲が好ましい。
であれば特に限定されず、例えば、ドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）、ドデシルスルホン硫酸ナトリウム、コ
ール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、３−
［（コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１
−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、オクチルグルコ
シド（ＯＧ）、オクチルチオグルコシド、ノナノイル−
Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−９）、ポリオキシエ
チレンドデシルエーテル（Ｂｒｉｊｉ）、ポリオキシエ
チレンｉ−オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ）、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（Ｎ
ｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）、ポリオキシエチレン脂肪酸
エステル（Ｓｐａｎ）、ポリオキシエチレンソルビトー
ルエステル（Ｔｗｅｅｎ）等がある。用いる濃度は処理
するウイルス抗原濃度によって異なるが、０．０１〜２
０％の範囲が好ましい。
【００１７】上記タンパク質変性剤は、タンパク質の高
次構造をほぐしポリペプチド側鎖間の水素結合、疎水性
相互作用を解離するものであれば特に限定されず、例え
ば、グアニジン塩酸塩、尿素等がある。作用させる濃度
は処理するウイルス抗原濃度によって異なるが、０．１
〜８Ｍの範囲が好ましい。
次構造をほぐしポリペプチド側鎖間の水素結合、疎水性
相互作用を解離するものであれば特に限定されず、例え
ば、グアニジン塩酸塩、尿素等がある。作用させる濃度
は処理するウイルス抗原濃度によって異なるが、０．１
〜８Ｍの範囲が好ましい。
【００１８】上記還元剤、界面活性剤及びタンパク質変
性剤はそれぞれ単独で用いてもよく、又は混合して用い
てもよい。上記還元剤、界面活性剤及びタンパク質変性
剤からなる群より選択される少なくとも１種の処理剤を
溶解させる緩衝液としては特に限定されず、例えば、リ
ン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン系
緩衝液等の一般に用いられている緩衝液が挙げられる。
上記緩衝液のイオン強度は、ウイルス抗原について好適
な強度であれば特に限定されず、例えば、ＮａＣｌが
０．０５〜１Ｍとなるようにしたもの等が挙げられる。
上記緩衝液のｐＨについてもウイルス抗原について好適
な領域で行うが、ｐＨ４．５〜９．０が好ましい。
性剤はそれぞれ単独で用いてもよく、又は混合して用い
てもよい。上記還元剤、界面活性剤及びタンパク質変性
剤からなる群より選択される少なくとも１種の処理剤を
溶解させる緩衝液としては特に限定されず、例えば、リ
ン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン系
緩衝液等の一般に用いられている緩衝液が挙げられる。
上記緩衝液のイオン強度は、ウイルス抗原について好適
な強度であれば特に限定されず、例えば、ＮａＣｌが
０．０５〜１Ｍとなるようにしたもの等が挙げられる。
上記緩衝液のｐＨについてもウイルス抗原について好適
な領域で行うが、ｐＨ４．５〜９．０が好ましい。
【００１９】上記緩衝液に還元剤、界面活性剤及びタン
パク質変性剤からなる群より選択される少なくとも１種
の処理剤を適当量溶解させて、低分子化又は変性処理用
液として用いる。
パク質変性剤からなる群より選択される少なくとも１種
の処理剤を適当量溶解させて、低分子化又は変性処理用
液として用いる。
【００２０】上記ウイルス抗原の希釈液並びにそのイオ
ン強度及びｐＨとしては特に限定されず、例えば、上記
還元剤、界面活性剤及びタンパク質変性剤からなる群よ
り選択される少なくとも１種の処理剤を溶解させる緩衝
液で例示したもの等が挙げられる。上記ウイルス抗原の
希釈液にウイルス抗原を適量添加して使用する。ウイル
ス抗原のタンパク質濃度としては特に限定されず、例え
ば、０．００１〜１０ｍｇ／ｍＬが通常用いる濃度であ
る。
ン強度及びｐＨとしては特に限定されず、例えば、上記
還元剤、界面活性剤及びタンパク質変性剤からなる群よ
り選択される少なくとも１種の処理剤を溶解させる緩衝
液で例示したもの等が挙げられる。上記ウイルス抗原の
希釈液にウイルス抗原を適量添加して使用する。ウイル
ス抗原のタンパク質濃度としては特に限定されず、例え
ば、０．００１〜１０ｍｇ／ｍＬが通常用いる濃度であ
る。
【００２１】本発明の低分子化又は変性処理する工程に
おいては、ウイルス抗原希釈液と低分子化又は変性処理
用液を、上記還元剤、界面活性剤及びタンパク質変性剤
からなる群より選択される少なくとも１種の処理剤濃度
が上記の範囲となるように適当量混合し、４〜５０℃、
３０分〜４８時間程度インキュベーションすることによ
り、ウイルス抗原の低分子処理を行うことができる。必
要に応じて、攪拌操作や超音波処理を行ってもよい。
おいては、ウイルス抗原希釈液と低分子化又は変性処理
用液を、上記還元剤、界面活性剤及びタンパク質変性剤
からなる群より選択される少なくとも１種の処理剤濃度
が上記の範囲となるように適当量混合し、４〜５０℃、
３０分〜４８時間程度インキュベーションすることによ
り、ウイルス抗原の低分子処理を行うことができる。必
要に応じて、攪拌操作や超音波処理を行ってもよい。
【００２２】本発明のウイルス抗原の調製法において
は、上記低分子化又は変性処理されたウイルス抗原に、
酸化剤溶液で希釈又は透析する工程を含む。本発明にお
いては、上記低分子化又は変性処理したウイルス抗原を
酸化剤溶液で希釈又は透析することにより、ウイルス抗
原の抗原活性を高めることができる。
は、上記低分子化又は変性処理されたウイルス抗原に、
酸化剤溶液で希釈又は透析する工程を含む。本発明にお
いては、上記低分子化又は変性処理したウイルス抗原を
酸化剤溶液で希釈又は透析することにより、ウイルス抗
原の抗原活性を高めることができる。
【００２３】上記酸化剤としては、ｏ−ヨードソ安息香
酸、過酸化水素、四チオン酸ナトリウム、ヨウ化スルフ
ェニル、酸化型グルタチオン、酸化型グルタチオン及び
還元型グルタチオンの混合物、シスチン、シスチン及び
スステインの混合物等が挙げられる。上記酸化剤の濃度
は、用いたウイルス抗原の種類及び濃度並びに低分子化
又は変性処理で用いた還元剤の濃度に応じて用いるが、
通常０．１〜１０００ｍＭの範囲である。好ましくは、
１〜１００ｍＭである。
酸、過酸化水素、四チオン酸ナトリウム、ヨウ化スルフ
ェニル、酸化型グルタチオン、酸化型グルタチオン及び
還元型グルタチオンの混合物、シスチン、シスチン及び
スステインの混合物等が挙げられる。上記酸化剤の濃度
は、用いたウイルス抗原の種類及び濃度並びに低分子化
又は変性処理で用いた還元剤の濃度に応じて用いるが、
通常０．１〜１０００ｍＭの範囲である。好ましくは、
１〜１００ｍＭである。
【００２４】上記酸化剤溶液には、界面活性剤を混合し
て用いることが好ましい。上記界面活性剤としては特に
限定されず、例えば、上記低分子化又は変性処理に使用
する界面活性剤として例示したもの等が挙げられるが、
必ずしも低分子化又は変性反応で用いた界面活性剤と同
一のものを用いなくてもよい。上記界面活性剤の濃度
は、低分子化又は変性処理に用いた濃度の１／１〜１／
１００程度の濃度が好ましい。
て用いることが好ましい。上記界面活性剤としては特に
限定されず、例えば、上記低分子化又は変性処理に使用
する界面活性剤として例示したもの等が挙げられるが、
必ずしも低分子化又は変性反応で用いた界面活性剤と同
一のものを用いなくてもよい。上記界面活性剤の濃度
は、低分子化又は変性処理に用いた濃度の１／１〜１／
１００程度の濃度が好ましい。
【００２５】上記酸化剤溶液を調製するための緩衝液及
びそのｐＨとしては特に限定されず、例えば、上記還元
剤、界面活性剤及びタンパク質変性剤からなる群より選
択される少なくとも１種の処理剤を溶解させる緩衝液で
例示したもの等が挙げられる。上記溶解液のイオン強度
もウイルス抗原に好適なものであれば特に限定されず、
例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ2 、（ＮＨ4 ）2
ＳＯ4 等を０．０５〜１Ｍとなるようにしたものが好ま
しい。
びそのｐＨとしては特に限定されず、例えば、上記還元
剤、界面活性剤及びタンパク質変性剤からなる群より選
択される少なくとも１種の処理剤を溶解させる緩衝液で
例示したもの等が挙げられる。上記溶解液のイオン強度
もウイルス抗原に好適なものであれば特に限定されず、
例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ2 、（ＮＨ4 ）2
ＳＯ4 等を０．０５〜１Ｍとなるようにしたものが好ま
しい。
【００２６】上記酸化剤溶液で希釈又は透析する工程に
おいては、上記低分子化又は変性処理されたウイルス抗
原に、上記酸化剤溶液を添加しインキュベーションする
か、又は、上記酸化剤溶液で透析を行う。上記インキュ
ベーション又は透析の条件としては、例えば、４〜６０
℃中で３０分〜７２時間行うことができる。更に、長時
間インキュベーションしても差し支えない。
おいては、上記低分子化又は変性処理されたウイルス抗
原に、上記酸化剤溶液を添加しインキュベーションする
か、又は、上記酸化剤溶液で透析を行う。上記インキュ
ベーション又は透析の条件としては、例えば、４〜６０
℃中で３０分〜７２時間行うことができる。更に、長時
間インキュベーションしても差し支えない。
【００２７】上記低分子化又は変性処理されたウイルス
抗原液と酸化剤溶液の混合比率は１：１〜１：２００程
度が好ましく、より好ましくは、１：５〜１：１００で
ある。さらに上記粒子構成反応液中には、粒子をより構
成しやすくするために、粒子の外被となりうる脂質膜成
分を添加してもよい。脂質膜成分は脂質膜を形成できる
ものであれば特に限定されず、例えば、ホスファチジル
コリン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン、
ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタール
アミン、ホスファチジルイノシトールやカルジオライピ
ン、ホスファチジン酸、セレブロシド、リゾホスファチ
ジルコリン、リゾホスファチジルエタールアミンなどが
挙げられる。添加する方法は上記脂質膜成分をエタノー
ルなどの有機溶媒に溶解させて添加してもよく、あるい
は界面活性剤等の液に上記脂質膜成分を溶解させて添加
し粒子構成後、透析などで界面活性剤を除去してもよ
い。脂質膜成分の添加量は反応液中のウイルス抗原の蛋
白濃度（ｍｇ／ｍｌ）に対して０．００５〜５０倍程度
の濃度が適しており、０．０５〜２０倍程度の濃度が特
に適している。
抗原液と酸化剤溶液の混合比率は１：１〜１：２００程
度が好ましく、より好ましくは、１：５〜１：１００で
ある。さらに上記粒子構成反応液中には、粒子をより構
成しやすくするために、粒子の外被となりうる脂質膜成
分を添加してもよい。脂質膜成分は脂質膜を形成できる
ものであれば特に限定されず、例えば、ホスファチジル
コリン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン、
ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタール
アミン、ホスファチジルイノシトールやカルジオライピ
ン、ホスファチジン酸、セレブロシド、リゾホスファチ
ジルコリン、リゾホスファチジルエタールアミンなどが
挙げられる。添加する方法は上記脂質膜成分をエタノー
ルなどの有機溶媒に溶解させて添加してもよく、あるい
は界面活性剤等の液に上記脂質膜成分を溶解させて添加
し粒子構成後、透析などで界面活性剤を除去してもよ
い。脂質膜成分の添加量は反応液中のウイルス抗原の蛋
白濃度（ｍｇ／ｍｌ）に対して０．００５〜５０倍程度
の濃度が適しており、０．０５〜２０倍程度の濃度が特
に適している。
【００２８】本発明において調製されるウイルス粒子
は、免疫診断薬の抗原；ワクチン等として使用すること
ができる。上記免疫診断薬は、血清等の検体中のウイル
ス抗体の定量的測定等を行うことができ、抗原抗体反応
を利用した免疫測定法を利用することができる。上記免
疫測定法においては、（１）本発明により調製したウイ
ルス抗原を血球やラテックス等の不溶性担体に担持させ
た血球凝集法やラテックス凝集法、（２）本発明により
調製したウイルス抗原を酵素で標識した酵素標識抗原を
使用する酵素免疫測定法（ＥＩＡ）等が挙げられる。
は、免疫診断薬の抗原；ワクチン等として使用すること
ができる。上記免疫診断薬は、血清等の検体中のウイル
ス抗体の定量的測定等を行うことができ、抗原抗体反応
を利用した免疫測定法を利用することができる。上記免
疫測定法においては、（１）本発明により調製したウイ
ルス抗原を血球やラテックス等の不溶性担体に担持させ
た血球凝集法やラテックス凝集法、（２）本発明により
調製したウイルス抗原を酵素で標識した酵素標識抗原を
使用する酵素免疫測定法（ＥＩＡ）等が挙げられる。
【００２９】上記血球凝集法やラテックス凝集法におい
ては、本発明により調製したウイルス抗原をラテックス
や血球等に担持させ、これをウイルス抗体含有検体と混
合させる。抗原抗体反応の結果、ラテックスや血球が抗
体により架橋・凝集され、この凝集を検出することによ
り検体中のウイルス抗体を定量することができる。
ては、本発明により調製したウイルス抗原をラテックス
や血球等に担持させ、これをウイルス抗体含有検体と混
合させる。抗原抗体反応の結果、ラテックスや血球が抗
体により架橋・凝集され、この凝集を検出することによ
り検体中のウイルス抗体を定量することができる。
【００３０】上記酵素免疫測定法においては、例えば、
ワンステップサンドイッチ法の場合、本発明により調製
したウイルス抗原をビーズやマイクロタイタープレート
のウェル内壁等の不溶性担体に固定化する。これにウイ
ルス抗体含有検体及び酵素標識したウイルス抗原を加
え、固定化ウイルス抗原−ウイルス抗体−酵素標識ウイ
ルス抗原の免疫複合体を生成させる。洗浄操作後、酵素
基質を加え、酵素反応により生じる生産物を検出するこ
とにより、検体中のウイルス抗体を定量することができ
る。
ワンステップサンドイッチ法の場合、本発明により調製
したウイルス抗原をビーズやマイクロタイタープレート
のウェル内壁等の不溶性担体に固定化する。これにウイ
ルス抗体含有検体及び酵素標識したウイルス抗原を加
え、固定化ウイルス抗原−ウイルス抗体−酵素標識ウイ
ルス抗原の免疫複合体を生成させる。洗浄操作後、酵素
基質を加え、酵素反応により生じる生産物を検出するこ
とにより、検体中のウイルス抗体を定量することができ
る。
【００３１】
【実施例】以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。
【００３２】実施例１ 天然型ＨＢｓ抗原の低分子化又
は変性処理及び希釈（１） ＨＢｓ抗原は、ヒト陽性血清より精製した。精製法は、
塩化セシウム溶液及びショ糖密度勾配法によって小型球
状粒子抗原を回収し、更にゲル濾過法によって精製し
た。得られたＨＢｓ抗原を０．２ＭＮａＣｌ／５０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に３ｍｇ／ｍｌ
となるように溶解し、ＨＢｓ抗原液とした。
は変性処理及び希釈（１） ＨＢｓ抗原は、ヒト陽性血清より精製した。精製法は、
塩化セシウム溶液及びショ糖密度勾配法によって小型球
状粒子抗原を回収し、更にゲル濾過法によって精製し
た。得られたＨＢｓ抗原を０．２ＭＮａＣｌ／５０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に３ｍｇ／ｍｌ
となるように溶解し、ＨＢｓ抗原液とした。
【００３３】ＨＢｓ抗原を４Ｍ尿素／１ｍＭジチオスレ
イトール（ＤＴＴ）／０．５％オクチルグルコシド／５
０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で３５
℃で１時間インキュベーションし、低分子化処理及びポ
リペプチドの変性を行った。精製した天然型ＨＢｓ抗原
及び低分子化処理したＨＢｓ抗原を５０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７．０）／０．１％ＳＤＳを展開液
としてＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム（東ソー
社）によるゲル濾過を行った。クロマトグラムをそれぞ
れ、図１及び図２に示す。
イトール（ＤＴＴ）／０．５％オクチルグルコシド／５
０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で３５
℃で１時間インキュベーションし、低分子化処理及びポ
リペプチドの変性を行った。精製した天然型ＨＢｓ抗原
及び低分子化処理したＨＢｓ抗原を５０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７．０）／０．１％ＳＤＳを展開液
としてＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム（東ソー
社）によるゲル濾過を行った。クロマトグラムをそれぞ
れ、図１及び図２に示す。
【００３４】上記方法によって得られた低分子化処理し
たＨＢｓ抗原（１．５ｇ／ｍｌ）５μＬに、０．２５Ｍ
ＮａＣｌ、０．１％オクチルグルコシド／２．５ｍＭ四
チオン酸ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ７．８）を１９５μＬ添加混合し、３５℃で
３時間インキュベーションした。反応終了後、下記方法
に従ったＥＩＡによる抗原性評価、ゲル濾過による分子
量分布の測定を行った。ゲル濾過は５０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７．０）／０．１％ＳＤＳを展開液
として、ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬを用いて行っ
た。クロマトグラムを図３に示す。
たＨＢｓ抗原（１．５ｇ／ｍｌ）５μＬに、０．２５Ｍ
ＮａＣｌ、０．１％オクチルグルコシド／２．５ｍＭ四
チオン酸ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ７．８）を１９５μＬ添加混合し、３５℃で
３時間インキュベーションした。反応終了後、下記方法
に従ったＥＩＡによる抗原性評価、ゲル濾過による分子
量分布の測定を行った。ゲル濾過は５０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７．０）／０．１％ＳＤＳを展開液
として、ＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬを用いて行っ
た。クロマトグラムを図３に示す。
【００３５】評価方法：ＥＩＡによるＨＢｓ抗原の抗原
性評価 実施例１で得られたＨＢｓ抗原、低分子化ＨＢｓ抗原及
び希釈したＨＢｓ抗原をそれぞれ、０．１％ＳＤＳ／５
０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で、０．
１５μｇ／ｍＬにまで希釈した後、更に、０．１％ＳＤ
Ｓを含むヒト管理血清、Ｌ−コンセーラＮ「ニッスイ」
（日水製薬社）で０．０１５μｇ／ｍＬにまで希釈し、
ＨＢｓ抗原測定用ＥＩＡキット「エンザイグノストＨＢ
ｓＡｇｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ」（ヘキスト・ベーリング
イグアノスティック社）による抗原性評価を行った。結
果を表１に示した。
性評価 実施例１で得られたＨＢｓ抗原、低分子化ＨＢｓ抗原及
び希釈したＨＢｓ抗原をそれぞれ、０．１％ＳＤＳ／５
０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で、０．
１５μｇ／ｍＬにまで希釈した後、更に、０．１％ＳＤ
Ｓを含むヒト管理血清、Ｌ−コンセーラＮ「ニッスイ」
（日水製薬社）で０．０１５μｇ／ｍＬにまで希釈し、
ＨＢｓ抗原測定用ＥＩＡキット「エンザイグノストＨＢ
ｓＡｇｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ」（ヘキスト・ベーリング
イグアノスティック社）による抗原性評価を行った。結
果を表１に示した。
【００３６】実施例２ 組み換え大腸菌由来組み換え型
ＨＢｓ抗原の低分子化又は変性処理及び希釈（１） Ｂ型肝炎陽性患者（血清型：ａｄｗ）からクローニング
されたＨＢｓ抗原Ｓ領域遺伝子（Ｏｎｏ，Ｙ．ｅｔ ａ
ｌ．，１９８３，Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．
１１，１７４７；ＤＮＡ配列を配列表の配列番号１に示
した。）が導入された大腸菌を２ＸＹ．Ｔ．培地（酵母
エキス１０ｇ、バクトトリプトン２０ｇ、ＮａＣｌ５
ｇ、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．８）にて培
養後、ＯＤ６５０ｎｍが０．８から１．２に到達した時
点で、ＩＰＴＧを１ｍＭになるように添加し、更に１０
時間培養した。培養終了後、菌体を回収し、０．１ＭＮ
ａＣｌ／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
５）中で超音波破砕した。ＨＢｓ遺伝子発現産物（ｒＨ
Ｂｓ−ａｄｗ）は可溶性画分にも生産されていたが、沈
殿画分に多量に生産されていた。沈殿画分を０．１ＭＮ
ａＣｌ／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
５）で２回、遠心分離で洗浄後、５０ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．０）／４Ｍ尿素／１ｍＭＤＴＴ／
０．５％ＳＤＳに溶解し、３５℃で１時間処理した。遠
心分離によって上清を回収した。５０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）／４Ｍ尿素／１ｍＭＤＴＴを展開液とし
て、ＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷＸＬカラム（トーソー
社）によるゲル濾過によって組み換えＨＢｓ低分子を精
製した。精製ｒＨＢｓ−ａｄｗ低分子は、限外濾過によ
って１．５ｍｇ／ｍｌにまで濃縮した。得られたｒＨＢ
ｓ−ａｄｗ低分子の、展開液に５０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．０）／０．１％ＳＤＳを用いるＴＳ
ＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラムによるゲル濾過のク
ロマトグラムを図４に示す。
ＨＢｓ抗原の低分子化又は変性処理及び希釈（１） Ｂ型肝炎陽性患者（血清型：ａｄｗ）からクローニング
されたＨＢｓ抗原Ｓ領域遺伝子（Ｏｎｏ，Ｙ．ｅｔ ａ
ｌ．，１９８３，Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．
１１，１７４７；ＤＮＡ配列を配列表の配列番号１に示
した。）が導入された大腸菌を２ＸＹ．Ｔ．培地（酵母
エキス１０ｇ、バクトトリプトン２０ｇ、ＮａＣｌ５
ｇ、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．８）にて培
養後、ＯＤ６５０ｎｍが０．８から１．２に到達した時
点で、ＩＰＴＧを１ｍＭになるように添加し、更に１０
時間培養した。培養終了後、菌体を回収し、０．１ＭＮ
ａＣｌ／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
５）中で超音波破砕した。ＨＢｓ遺伝子発現産物（ｒＨ
Ｂｓ−ａｄｗ）は可溶性画分にも生産されていたが、沈
殿画分に多量に生産されていた。沈殿画分を０．１ＭＮ
ａＣｌ／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
５）で２回、遠心分離で洗浄後、５０ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．０）／４Ｍ尿素／１ｍＭＤＴＴ／
０．５％ＳＤＳに溶解し、３５℃で１時間処理した。遠
心分離によって上清を回収した。５０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）／４Ｍ尿素／１ｍＭＤＴＴを展開液とし
て、ＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷＸＬカラム（トーソー
社）によるゲル濾過によって組み換えＨＢｓ低分子を精
製した。精製ｒＨＢｓ−ａｄｗ低分子は、限外濾過によ
って１．５ｍｇ／ｍｌにまで濃縮した。得られたｒＨＢ
ｓ−ａｄｗ低分子の、展開液に５０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．０）／０．１％ＳＤＳを用いるＴＳ
ＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラムによるゲル濾過のク
ロマトグラムを図４に示す。
【００３７】低分子化処理したｒＨＢｓ−ａｄｗ５μＬ
（１．５ｇ／ｍＬ）を、０．２ＭＫＣｌ及び０．０５％
ＳＤＳ／２．５ｍＭ酸化型グルタチオンを含む０．１Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）１９５μＬに添
加混合し、３５℃で２時間インキュベーションしたこと
以外は、実施例１と同様に評価、ゲル濾過による分子量
分布の測定を行った。ゲル濾過クロマトグラムを図５に
示す。
（１．５ｇ／ｍＬ）を、０．２ＭＫＣｌ及び０．０５％
ＳＤＳ／２．５ｍＭ酸化型グルタチオンを含む０．１Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）１９５μＬに添
加混合し、３５℃で２時間インキュベーションしたこと
以外は、実施例１と同様に評価、ゲル濾過による分子量
分布の測定を行った。ゲル濾過クロマトグラムを図５に
示す。
【００３８】実施例３ 組み換え大腸菌由来組み換え型
ＨＢｓ抗原の低分子化又は変性処理及び希釈（２） Ｂ型肝炎陽性患者（血清型：ａｄｒ）からクローニング
されたＨＢｓ抗原Ｓ領域遺伝子（Ｌｏｎｃａｒｅｖｉ
ｃ，Ｉ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９０，１８，Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８，４９４０；ＤＮＡ配
列を配列表の配列番号３に示した。）が導入された大腸
菌を使用したこと以外は、実施例２と同様にして、ａｄ
ｒ型ＨＢｓ遺伝子発現産物（ｒＨＢｓ−ａｄｒ）の精製
を行い、沈殿画分を取得した。沈殿画分を０．１ＭＮａ
Ｃｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で２回、遠
心分離で洗浄後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
／４Ｍグアニジン酸塩酸塩／０．５ｍＭＤＴＴ／０．１
％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００に溶解し、３５℃で１時間処
理した。遠心分離によって上清を回収した。５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）／０．１％ＳＤＳを展開液と
して、ＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷＸＬカラムによるゲ
ル濾過によってｒＨＢｓ−ａｄｒ低分子を精製した。精
製ｒＨＢｓ−ａｄｒ低分子は、限外濾過によって１．５
ｍｇ／ｍｌにまで濃縮した。得られたｒＨＢｓ−ａｄｒ
低分子の、展開液に５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７．０）／０．１％ＳＤＳを用いるＴＳＫｇｅｌ
Ｇ４０００ＳＷＸＬカラムによるゲル濾過のクロマトグ
ラムを図６に示す。
ＨＢｓ抗原の低分子化又は変性処理及び希釈（２） Ｂ型肝炎陽性患者（血清型：ａｄｒ）からクローニング
されたＨＢｓ抗原Ｓ領域遺伝子（Ｌｏｎｃａｒｅｖｉ
ｃ，Ｉ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９０，１８，Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８，４９４０；ＤＮＡ配
列を配列表の配列番号３に示した。）が導入された大腸
菌を使用したこと以外は、実施例２と同様にして、ａｄ
ｒ型ＨＢｓ遺伝子発現産物（ｒＨＢｓ−ａｄｒ）の精製
を行い、沈殿画分を取得した。沈殿画分を０．１ＭＮａ
Ｃｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で２回、遠
心分離で洗浄後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
／４Ｍグアニジン酸塩酸塩／０．５ｍＭＤＴＴ／０．１
％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００に溶解し、３５℃で１時間処
理した。遠心分離によって上清を回収した。５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）／０．１％ＳＤＳを展開液と
して、ＴＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷＸＬカラムによるゲ
ル濾過によってｒＨＢｓ−ａｄｒ低分子を精製した。精
製ｒＨＢｓ−ａｄｒ低分子は、限外濾過によって１．５
ｍｇ／ｍｌにまで濃縮した。得られたｒＨＢｓ−ａｄｒ
低分子の、展開液に５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７．０）／０．１％ＳＤＳを用いるＴＳＫｇｅｌ
Ｇ４０００ＳＷＸＬカラムによるゲル濾過のクロマトグ
ラムを図６に示す。
【００３９】ｒＨＢｓ−ａｄｒ低分子５μＬ（１．５ｇ
／ｍＬ）を、０．１ＭＮａＣｌ及び０．１％ＭＥＧＡ−
９／１ｍＭシスチン＋システインを含む０．１Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）を１９５μＬに添加混
合し、３５℃で６時間インキュベーションした。反応終
了後に、１００００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離操作を
行い、上清を回収した。この上清液を用いて、実施例１
と同様にしてＥＩＡによる抗原性評価、ゲル濾過による
分子量分布の測定を行った。ゲル濾過クロマトグラムを
図７に示す。
／ｍＬ）を、０．１ＭＮａＣｌ及び０．１％ＭＥＧＡ−
９／１ｍＭシスチン＋システインを含む０．１Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）を１９５μＬに添加混
合し、３５℃で６時間インキュベーションした。反応終
了後に、１００００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離操作を
行い、上清を回収した。この上清液を用いて、実施例１
と同様にしてＥＩＡによる抗原性評価、ゲル濾過による
分子量分布の測定を行った。ゲル濾過クロマトグラムを
図７に示す。
【００４０】
【表１】
【００４１】実施例４ 配列表の配列番号５に示した、ａｄｒ型ＨＢｓ抗原をコ
ードする２本鎖合成遺伝子（６９７ｂｐ、アミノ酸配列
を配列番号６に示す）をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化
後、同様の制限酵素処理が施されたＴ７プロモーターを
保持する発現ベクターに導入し、合成ＨＢｓ遺伝子発現
ベクターｐＴＳＨＢｓを構築した。大腸菌ＢＬ２１（Ｄ
Ｅ３）株をｐＴＳＨＢｓで形質転換した後、アンピシリ
ン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレートにまき、３
７℃で一昼夜培養した。
ードする２本鎖合成遺伝子（６９７ｂｐ、アミノ酸配列
を配列番号６に示す）をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化
後、同様の制限酵素処理が施されたＴ７プロモーターを
保持する発現ベクターに導入し、合成ＨＢｓ遺伝子発現
ベクターｐＴＳＨＢｓを構築した。大腸菌ＢＬ２１（Ｄ
Ｅ３）株をｐＴＳＨＢｓで形質転換した後、アンピシリ
ン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレートにまき、３
７℃で一昼夜培養した。
【００４２】生育してきたコロニー１０個を、アンピシ
リン（１００μｇ／ｍｌ）を含む２ＸＬＢ液体培地に植
菌し、３５℃で培養した。培養液のＯＤ６５０が０．８
５に到達した時点で、１ｍＭＩＰＴＧを添加し、さらに
１０時間培養した。培養終了後、遠心分離によって菌体
を回収した。超音波処理によって菌体を破砕した後、遠
心分離によって沈殿画分と可溶性画分に分離した。各画
分におけるＨＢｓ蛋白質の発現をＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動によって確認した結果、２５ｋＤａ
のＨＢｓ蛋白質に相当するバンドが不溶性画分に大量に
存在することがわかった。
リン（１００μｇ／ｍｌ）を含む２ＸＬＢ液体培地に植
菌し、３５℃で培養した。培養液のＯＤ６５０が０．８
５に到達した時点で、１ｍＭＩＰＴＧを添加し、さらに
１０時間培養した。培養終了後、遠心分離によって菌体
を回収した。超音波処理によって菌体を破砕した後、遠
心分離によって沈殿画分と可溶性画分に分離した。各画
分におけるＨＢｓ蛋白質の発現をＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動によって確認した結果、２５ｋＤａ
のＨＢｓ蛋白質に相当するバンドが不溶性画分に大量に
存在することがわかった。
【００４３】不溶性画分を０．１５ＭＮａＣｌを含む５
０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で充分に洗浄
した後、これを４Ｍグアニジン塩酸塩／１ｍＭＤＴＴ／
５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．８）に溶解し、
３５℃で１時間可溶化処理した。これを処理液と同様の
展開液を用いるＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム
によるゲル濾過により精製した。精製されたフラクショ
ンを分画分子量５０００の限外濾過によって１０ｍｇ／
ｍｌにまで濃縮した。
０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で充分に洗浄
した後、これを４Ｍグアニジン塩酸塩／１ｍＭＤＴＴ／
５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．８）に溶解し、
３５℃で１時間可溶化処理した。これを処理液と同様の
展開液を用いるＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム
によるゲル濾過により精製した。精製されたフラクショ
ンを分画分子量５０００の限外濾過によって１０ｍｇ／
ｍｌにまで濃縮した。
【００４４】可溶化ＨＢｓ５μｌに０．２５ｍＭ酸化型
グルタチオン、２．５ｍＭ還元型グルタチオン、及び
０．０５ＭＫＣｌを含む０．１ＭＮａ−リン酸緩衝液
（ｐＨ７．８）を１９５μｌ添加混合し、３５℃で２時
間反応させた。反応終了後、ＴＳＫｇｅｌＧ４０００カ
ラムによるゲル濾過によって再生ＨＢｓ抗原を分析した
結果を、図８に示す。ＨＢｓ抗原は保持時間６．8 分の
ピークとして現れ、均一な粒子構造を形成していること
を示す。
グルタチオン、２．５ｍＭ還元型グルタチオン、及び
０．０５ＭＫＣｌを含む０．１ＭＮａ−リン酸緩衝液
（ｐＨ７．８）を１９５μｌ添加混合し、３５℃で２時
間反応させた。反応終了後、ＴＳＫｇｅｌＧ４０００カ
ラムによるゲル濾過によって再生ＨＢｓ抗原を分析した
結果を、図８に示す。ＨＢｓ抗原は保持時間６．8 分の
ピークとして現れ、均一な粒子構造を形成していること
を示す。
【００４５】回収された組み換え型ＨＢｓ抗原を０．１
５μｇ／ｍｌに５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）で希釈した後、さらにヒト管理血清Ｌ−コンセーラ
Ｎ「ニッスイ」（日水製薬）でさらに０．０１５μｇ／
ｍｌにまで希釈した。抗原希釈液の抗原性をＨＢｓ抗原
測定用ＥＩＡキット、エンザイグノストーＨＢｓＡｇｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌ（ヘキスト・ベーリングダイアグノ
スティック社製）によって評価した。結果を表２に示
す。本実施例のコントロールとして実施例１で調製され
た陽性患者由来小型球状粒子及び標準血清についても同
様の抗原性評価を行った。
５μｇ／ｍｌに５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）で希釈した後、さらにヒト管理血清Ｌ−コンセーラ
Ｎ「ニッスイ」（日水製薬）でさらに０．０１５μｇ／
ｍｌにまで希釈した。抗原希釈液の抗原性をＨＢｓ抗原
測定用ＥＩＡキット、エンザイグノストーＨＢｓＡｇｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌ（ヘキスト・ベーリングダイアグノ
スティック社製）によって評価した。結果を表２に示
す。本実施例のコントロールとして実施例１で調製され
た陽性患者由来小型球状粒子及び標準血清についても同
様の抗原性評価を行った。
【００４６】
【表２】
【００４７】実施例５ 配列表の配列番号７に示したＨＢｃ（Ｂ型肝炎コア抗
原）抗原をコードする２本鎖合成遺伝子（５６８ｂｐ、
アミノ酸配列を配列番号８に示す）をＮｄｅＩ及びＢａ
ｍＨＩで消化後、同様の制限酵素処理が施されたＴ７プ
ロモーターを保持する発現ベクターに導入し、合成ＨＢ
ｃ遺伝子発現ベクターｐＴＨＢｃを構築した。大腸菌Ｂ
Ｌ２１（ＤＥ３）株をｐＴＨＢｃで形質転換した後、ア
ンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレートに
まき、３７℃で一昼夜培養した。
原）抗原をコードする２本鎖合成遺伝子（５６８ｂｐ、
アミノ酸配列を配列番号８に示す）をＮｄｅＩ及びＢａ
ｍＨＩで消化後、同様の制限酵素処理が施されたＴ７プ
ロモーターを保持する発現ベクターに導入し、合成ＨＢ
ｃ遺伝子発現ベクターｐＴＨＢｃを構築した。大腸菌Ｂ
Ｌ２１（ＤＥ３）株をｐＴＨＢｃで形質転換した後、ア
ンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレートに
まき、３７℃で一昼夜培養した。
【００４８】生育してきたコロニー１０個を、アンピシ
リン（１００μｇ／ｍｌ）を含む２ＸＬＢ液体培地に植
菌し、３５℃で培養した。培養液のＯＤ６５０が０．８
５に到達した時点で、１ｍＭＩＰＴＧを添加し、さらに
１０時間培養した。培養終了後、遠心分離によって菌体
を回収した。超音波処理によって菌体を破砕した後、遠
心分離によって沈殿画分と可溶性画分に分離した。各画
分におけるＨＢｃ蛋白質の発現をＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動によって確認した結果、２１ｋＤａ
のＨＢｃ蛋白質に相当するバンドが不溶性画分に大量に
存在することがわかった。
リン（１００μｇ／ｍｌ）を含む２ＸＬＢ液体培地に植
菌し、３５℃で培養した。培養液のＯＤ６５０が０．８
５に到達した時点で、１ｍＭＩＰＴＧを添加し、さらに
１０時間培養した。培養終了後、遠心分離によって菌体
を回収した。超音波処理によって菌体を破砕した後、遠
心分離によって沈殿画分と可溶性画分に分離した。各画
分におけるＨＢｃ蛋白質の発現をＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動によって確認した結果、２１ｋＤａ
のＨＢｃ蛋白質に相当するバンドが不溶性画分に大量に
存在することがわかった。
【００４９】不溶性画分を０．１５ＭＮａＣｌを含む５
０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で充分に洗浄
した後、これを６Ｍグアニジン塩酸塩／１ｍＭＤＴＴ／
０．５％オクチルグルコシド／５０ｍＭＮａ−リン酸緩
衝液（ｐＨ７．８）に溶解し、３５℃で１時間可溶化処
理した。これを処理液と同様の展開液を用いるＴＳＫｇ
ｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラムによるゲル濾過により精
製した。精製されたフラクションを分画分子量５０００
の限外濾過によって５．０ｍｇ／ｍｌにまで濃縮した。
０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で充分に洗浄
した後、これを６Ｍグアニジン塩酸塩／１ｍＭＤＴＴ／
０．５％オクチルグルコシド／５０ｍＭＮａ−リン酸緩
衝液（ｐＨ７．８）に溶解し、３５℃で１時間可溶化処
理した。これを処理液と同様の展開液を用いるＴＳＫｇ
ｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラムによるゲル濾過により精
製した。精製されたフラクションを分画分子量５０００
の限外濾過によって５．０ｍｇ／ｍｌにまで濃縮した。
【００５０】可溶化ＨＢｃ５μｌに、０．２５ｍＭ酸化
型グルタチオン、２．５ｍＭ還元型グルタチオン、及び
０．０５ＭＫＣｌを含む０．１ＭＮａ−リン酸緩衝液
（ｐＨ７．８）を１９５μｌ添加混合し、３５℃で２時
間反応させた。反応終了後、ＴＳＫｇｅｌＧ４０００カ
ラムによるゲル濾過によって再生ＨＢｃ抗原を分析した
結果を、図９に示す。ＨＢｃ抗原は保持時間６．８分の
ピークとして現れ、均一な粒子構造を形成していること
を示す。０．２５ｍＭ酸化型グルタチオン、２．５ｍＭ
還元型グルタチオンを含まない０．１ＭＮａ−リン酸緩
衝液（ｐＨ７．８）を１９５μｌ添加混合した場合は沈
殿が生じた。
型グルタチオン、２．５ｍＭ還元型グルタチオン、及び
０．０５ＭＫＣｌを含む０．１ＭＮａ−リン酸緩衝液
（ｐＨ７．８）を１９５μｌ添加混合し、３５℃で２時
間反応させた。反応終了後、ＴＳＫｇｅｌＧ４０００カ
ラムによるゲル濾過によって再生ＨＢｃ抗原を分析した
結果を、図９に示す。ＨＢｃ抗原は保持時間６．８分の
ピークとして現れ、均一な粒子構造を形成していること
を示す。０．２５ｍＭ酸化型グルタチオン、２．５ｍＭ
還元型グルタチオンを含まない０．１ＭＮａ−リン酸緩
衝液（ｐＨ７．８）を１９５μｌ添加混合した場合は沈
殿が生じた。
【００５１】精製されたＨＢｃ粒子はＥＬＩＳＡによっ
て評価した。９６穴マイクロタータープレートに抗ＨＢ
ｃポリクローナル抗体（カルテット社製）をコートし、
次に牛血清アルブミンでコートした後、５０ｍＭＮａ−
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１０倍希釈した後、これ
に常法によってパーアキシダーゼ標識した抗ＨＢｃモノ
クローナル抗体（ケミコン社製）を作用させた。洗浄操
作後、これに発色基質としてＡＢＴＳ（アジノエチルベ
ンゾチアゾリンスルホン酸）を加え、発色させた後、４
０５ｎｍの吸収を測定した。結果を表３に示す。本実施
例のコントロールとして標準血清についても同様の抗原
性評価を行った。
て評価した。９６穴マイクロタータープレートに抗ＨＢ
ｃポリクローナル抗体（カルテット社製）をコートし、
次に牛血清アルブミンでコートした後、５０ｍＭＮａ−
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１０倍希釈した後、これ
に常法によってパーアキシダーゼ標識した抗ＨＢｃモノ
クローナル抗体（ケミコン社製）を作用させた。洗浄操
作後、これに発色基質としてＡＢＴＳ（アジノエチルベ
ンゾチアゾリンスルホン酸）を加え、発色させた後、４
０５ｎｍの吸収を測定した。結果を表３に示す。本実施
例のコントロールとして標準血清についても同様の抗原
性評価を行った。
【００５２】
【表３】
【００５３】実施例６ 配列表の配列番号９に示したＨＣＶｃ（Ｃ型肝炎コア抗
原）抗原をコードする２本鎖合成遺伝子（５９０ｂｐ、
アミノ酸配列を配列番号１０に示す）をＮｄｅＩ及びＢ
ａｍＨＩで消化後、同様の制限酵素処理が施されたＴ７
プロモーターを保持する発現ベクターに導入し、合成Ｈ
ＣＶｃ遺伝子発現ベクターｐＴＨＣＶｃを構築した。大
腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株をｐＴＨＣＶｃで形質転換し
た後、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプ
レートにまき、３７℃で一昼夜培養した。
原）抗原をコードする２本鎖合成遺伝子（５９０ｂｐ、
アミノ酸配列を配列番号１０に示す）をＮｄｅＩ及びＢ
ａｍＨＩで消化後、同様の制限酵素処理が施されたＴ７
プロモーターを保持する発現ベクターに導入し、合成Ｈ
ＣＶｃ遺伝子発現ベクターｐＴＨＣＶｃを構築した。大
腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株をｐＴＨＣＶｃで形質転換し
た後、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプ
レートにまき、３７℃で一昼夜培養した。
【００５４】生育してきたコロニー１０個を、アンピシ
リン（１００μｇ／ｍｌ）を含む２ＸＬＢ液体培地に植
菌し、３５℃で培養した。培養液のＯＤ６５０が０．８
５に到達した時点で、１ｍＭＩＰＴＧを添加し、さらに
１０時間培養した。培養終了後、遠心分離によって菌体
を回収した。超音波処理によって菌体を破砕した後、遠
心分離によって沈殿画分と可溶性画分に分離した。各画
分におけるＨＣＶｃ蛋白質の発現をＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動によって確認した結果、２１ｋＤ
ａのＨＣＶｃ蛋白質に相当するバンドが不溶性画分に大
量に存在することがわかった。
リン（１００μｇ／ｍｌ）を含む２ＸＬＢ液体培地に植
菌し、３５℃で培養した。培養液のＯＤ６５０が０．８
５に到達した時点で、１ｍＭＩＰＴＧを添加し、さらに
１０時間培養した。培養終了後、遠心分離によって菌体
を回収した。超音波処理によって菌体を破砕した後、遠
心分離によって沈殿画分と可溶性画分に分離した。各画
分におけるＨＣＶｃ蛋白質の発現をＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動によって確認した結果、２１ｋＤ
ａのＨＣＶｃ蛋白質に相当するバンドが不溶性画分に大
量に存在することがわかった。
【００５５】不溶性画分を０．１５ＭＮａＣｌを含む５
０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で充分に洗浄
した後、これを６Ｍグアニジン塩酸塩／１ｍＭＤＴＴ／
５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．８）に溶解し、
３５℃で１時間可溶化処理した。これを処理液と同様の
展開液を用いるＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム
によるゲル濾過により精製した。精製されたフラクショ
ンを分画分子量５０００の限外濾過によって１０ｍｇ／
ｍｌにまで濃縮した。
０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で充分に洗浄
した後、これを６Ｍグアニジン塩酸塩／１ｍＭＤＴＴ／
５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．８）に溶解し、
３５℃で１時間可溶化処理した。これを処理液と同様の
展開液を用いるＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラム
によるゲル濾過により精製した。精製されたフラクショ
ンを分画分子量５０００の限外濾過によって１０ｍｇ／
ｍｌにまで濃縮した。
【００５６】可溶化ＨＣＶｃ５μｌに、０．２５ｍＭ酸
化型グルタチオン、２．５ｍＭ還元型グルタチオン、及
び０．０５ＭＫＣｌを含む０．１ＭＮａ−リン酸緩衝液
（ｐＨ７．８）を１９５μｌ添加混合し、３５℃で２時
間反応させた。反応終了後、ＴＳＫｇｅｌＧ４０００カ
ラムによるゲル濾過によって再生ＨＣＶｃ抗原を分析し
た結果を、図１０に示す。ＨＣＶｃ抗原は保持時間６．
７分のピークとして現れ、均一な粒子構造を形成してい
ることを示す。０．２５ｍＭ酸化型グルタチオン、２．
５ｍＭ還元型グルタチオンを含まない０．１ＭＮａ−リ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．８）を１９５μｌ添加混合した場
合は沈殿が生じた。
化型グルタチオン、２．５ｍＭ還元型グルタチオン、及
び０．０５ＭＫＣｌを含む０．１ＭＮａ−リン酸緩衝液
（ｐＨ７．８）を１９５μｌ添加混合し、３５℃で２時
間反応させた。反応終了後、ＴＳＫｇｅｌＧ４０００カ
ラムによるゲル濾過によって再生ＨＣＶｃ抗原を分析し
た結果を、図１０に示す。ＨＣＶｃ抗原は保持時間６．
７分のピークとして現れ、均一な粒子構造を形成してい
ることを示す。０．２５ｍＭ酸化型グルタチオン、２．
５ｍＭ還元型グルタチオンを含まない０．１ＭＮａ−リ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．８）を１９５μｌ添加混合した場
合は沈殿が生じた。
【００５７】精製されたＨＣＶｃコア粒子を９６穴マイ
クロタイタープレートにコートした後、牛血清アルブミ
ンでブロッキングを施し、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液（１０ｍＭ
Ｎａ−リン酸緩衝液ｐＨ７．５／０．８％塩化ナトリウ
ム／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。次に
ＰＢＳ−Ｔ緩衝液で希釈したヒト陽性あるいは陰性血清
を加え反応させた。ＰＢＳ−Ｔ緩衝液で洗浄後、ペルオ
キシダーゼ標識ヒトＩｇＧ抗体（バイオジェネシス社
製）を作用させた。反応終了後、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液で４
回洗浄し、基質発色液（フェニルジアミン及び過酸化水
素を含む）を加え反応させた。４Ｎ硫酸添加によって反
応を止めた後、４９０ｎｍにおける吸収を測定した。結
果を表４に示す。本実施例のコントロールとして標準血
清についても同様の抗原性評価を行った。
クロタイタープレートにコートした後、牛血清アルブミ
ンでブロッキングを施し、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液（１０ｍＭ
Ｎａ−リン酸緩衝液ｐＨ７．５／０．８％塩化ナトリウ
ム／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。次に
ＰＢＳ−Ｔ緩衝液で希釈したヒト陽性あるいは陰性血清
を加え反応させた。ＰＢＳ−Ｔ緩衝液で洗浄後、ペルオ
キシダーゼ標識ヒトＩｇＧ抗体（バイオジェネシス社
製）を作用させた。反応終了後、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液で４
回洗浄し、基質発色液（フェニルジアミン及び過酸化水
素を含む）を加え反応させた。４Ｎ硫酸添加によって反
応を止めた後、４９０ｎｍにおける吸収を測定した。結
果を表４に示す。本実施例のコントロールとして標準血
清についても同様の抗原性評価を行った。
【００５８】
【表４】
【００５９】実施例７ 配列11に示したＨＣＶ−Ｅ１（Ｃ型肝炎ウィルス表面抗
原Ｅ１蛋白質）をコードする２本鎖合成遺伝子（５９１
ｂｐ、アミノ酸配列を配列番号12に示す）をＮｄｅＩ及
びＢａｍＨＩで消化後、同様の制限酵素処理が施された
Ｔ７プロモーターを保持する発現ベクターに導入し、合
成ＨＣＶ−Ｅ１遺伝子発現ベクターｐＴＨＣＶＥ１を構
築した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株をｐＴＨＣＶＥ１
で形質転換した後、カルベニシリン（１００μｇ／ｍ
ｌ）を含むＬＢプレートにまき、３７℃で一昼夜培養し
た。
原Ｅ１蛋白質）をコードする２本鎖合成遺伝子（５９１
ｂｐ、アミノ酸配列を配列番号12に示す）をＮｄｅＩ及
びＢａｍＨＩで消化後、同様の制限酵素処理が施された
Ｔ７プロモーターを保持する発現ベクターに導入し、合
成ＨＣＶ−Ｅ１遺伝子発現ベクターｐＴＨＣＶＥ１を構
築した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株をｐＴＨＣＶＥ１
で形質転換した後、カルベニシリン（１００μｇ／ｍ
ｌ）を含むＬＢプレートにまき、３７℃で一昼夜培養し
た。
【００６０】生育してきたコロニー１０個をカルベニシ
リン（１００μｇ／ｍｌ）を含む２ＸＬＢ液体培地に植
菌し、３５℃で培養した。培養液のＯＤ６００が０．４
から１．０に到達した時点で、１ｍＭＩＰＴＧを添加
し、さらに１０時間培養した。培養終了後、遠心分離に
よって菌体を回収後、超音波破砕した。遠心分離によっ
て沈殿画分と可溶性画分に分離した後、それぞれにおけ
るＨＣＶ−Ｅ１蛋白質（２１ｋＤａ）の存在をＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。そ
の結果、沈殿画分に存在することがわかった。
リン（１００μｇ／ｍｌ）を含む２ＸＬＢ液体培地に植
菌し、３５℃で培養した。培養液のＯＤ６００が０．４
から１．０に到達した時点で、１ｍＭＩＰＴＧを添加
し、さらに１０時間培養した。培養終了後、遠心分離に
よって菌体を回収後、超音波破砕した。遠心分離によっ
て沈殿画分と可溶性画分に分離した後、それぞれにおけ
るＨＣＶ−Ｅ１蛋白質（２１ｋＤａ）の存在をＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。そ
の結果、沈殿画分に存在することがわかった。
【００６１】沈殿画分を０．１５ＭＮａＣｌを含む５０
ｍＭ Ｋ−燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、こ
れを６Ｍグアニディウム塩酸塩／１ｍＭＤＴＴ／５０ｍ
ＭＫ−燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した。遠心分離
で不溶性成分を除去した後、同様の液を展開液としてＴ
ＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷＸＬによって分離した。ＨＣ
Ｖ−Ｅ１蛋白質の存在するフラクションを回収し、限外
ろ過によって５０ｍｇ／ｍｌにまで濃縮した。
ｍＭ Ｋ−燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、こ
れを６Ｍグアニディウム塩酸塩／１ｍＭＤＴＴ／５０ｍ
ＭＫ−燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した。遠心分離
で不溶性成分を除去した後、同様の液を展開液としてＴ
ＳＫｇｅｌＧ２０００ＳＷＸＬによって分離した。ＨＣ
Ｖ−Ｅ１蛋白質の存在するフラクションを回収し、限外
ろ過によって５０ｍｇ／ｍｌにまで濃縮した。
【００６２】得られたＨＣＶ−Ｅ１蛋白質溶液５μｌ
に、０．１％ＭＥＧＡ−９／１ｍＭシスチン＋システイ
ン、及び０．０５ＭＮａＣｌを含む０．１ＭＫ−燐酸緩
衝液（ｐＨ７．８）を１９５μｌ添加混合し、３５℃で
２時間反応させた。反応終了後、遠心分離を行った後、
上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析
した結果、ＨＣＶ−Ｅ１蛋白質が可溶性蛋白として存在
していることが判明した。本ＨＣＶ−Ｅ１蛋白質を含む
反応液を、ＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラムに
よって、分離した後、ＨＣＶ−Ｅ１蛋白質を含むフラク
ションをＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラムによる
ゲルろ過によって再生ＨＣＶ−Ｅ１蛋白質の分子量分布
を調べた。その結果、ＨＣＶ−Ｅ１蛋白質は図１１に示
すように保持時間６．７分のピークとして現れ、均一な
粒子構造を形成していると判断できた。
に、０．１％ＭＥＧＡ−９／１ｍＭシスチン＋システイ
ン、及び０．０５ＭＮａＣｌを含む０．１ＭＫ−燐酸緩
衝液（ｐＨ７．８）を１９５μｌ添加混合し、３５℃で
２時間反応させた。反応終了後、遠心分離を行った後、
上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析
した結果、ＨＣＶ−Ｅ１蛋白質が可溶性蛋白として存在
していることが判明した。本ＨＣＶ−Ｅ１蛋白質を含む
反応液を、ＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラムに
よって、分離した後、ＨＣＶ−Ｅ１蛋白質を含むフラク
ションをＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸＬカラムによる
ゲルろ過によって再生ＨＣＶ−Ｅ１蛋白質の分子量分布
を調べた。その結果、ＨＣＶ−Ｅ１蛋白質は図１１に示
すように保持時間６．７分のピークとして現れ、均一な
粒子構造を形成していると判断できた。
【００６３】ゲルろ過によって精製されたＨＣＶ−Ｅ１
粒子と実施例６で調製されたＨＣＶｃ粒子を蛋白質量で
等量づつ９６穴マイクロタイタープレートにコートした
後、牛血清アルブミンでブロッキングを施し、実施例６
と同一の方法でヒト陽性血清で抗原性の評価を行った。
結果を表５に示す。また、本評価のコントロールとして
実施例６で調製されたＨＣＶｃ粒子のみを含むサンプル
についても同様の評価を行った。
粒子と実施例６で調製されたＨＣＶｃ粒子を蛋白質量で
等量づつ９６穴マイクロタイタープレートにコートした
後、牛血清アルブミンでブロッキングを施し、実施例６
と同一の方法でヒト陽性血清で抗原性の評価を行った。
結果を表５に示す。また、本評価のコントロールとして
実施例６で調製されたＨＣＶｃ粒子のみを含むサンプル
についても同様の評価を行った。
【００６４】
【表５】
【００６５】実施例８ 配列表の配列番号13に示したＨＩＶコア抗原蛋白質ｐ２
４をコードする２本鎖合成遺伝子（７１５ｂｐ、アミノ
酸配列を配列番号14に示す）をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ
で消化後、同様の制限酵素処理が施されたＴ７プロモー
ターを保持する発現ベクターに導入し、合成ＨＩＶ遺伝
子発現ベクターｐＴＨＩＶを構築した。大腸菌ＢＬ２１
（ＤＥ３）株をｐＴＨＩＶで形質転換した後、アンピシ
リン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレートにまき、
３７℃で一昼夜培養した。
４をコードする２本鎖合成遺伝子（７１５ｂｐ、アミノ
酸配列を配列番号14に示す）をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ
で消化後、同様の制限酵素処理が施されたＴ７プロモー
ターを保持する発現ベクターに導入し、合成ＨＩＶ遺伝
子発現ベクターｐＴＨＩＶを構築した。大腸菌ＢＬ２１
（ＤＥ３）株をｐＴＨＩＶで形質転換した後、アンピシ
リン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレートにまき、
３７℃で一昼夜培養した。
【００６６】生育してきたコロニー１０個を、アンピシ
リン（１００μｇ／ｍｌ）を含む２ＸＬＢ液体培地に植
菌し、３７℃で培養した。培養液のＯＤ６００が０．８
５に到達した時点で、１ｍＭＩＰＴＧを添加し、さらに
１０時間培養した。培養終了後、遠心分離によって菌体
を回収した。超音波処理によって菌体を破砕した後、遠
心分離によって沈殿画分と可溶性画分に分離した。各画
分におけるＨＩＶコア抗原蛋白質ｐ２４の発現をＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認した結
果、２６ｋＤａのｐ２４蛋白質に相当するバンドが可溶
性画分に大量に存在することがわかった。
リン（１００μｇ／ｍｌ）を含む２ＸＬＢ液体培地に植
菌し、３７℃で培養した。培養液のＯＤ６００が０．８
５に到達した時点で、１ｍＭＩＰＴＧを添加し、さらに
１０時間培養した。培養終了後、遠心分離によって菌体
を回収した。超音波処理によって菌体を破砕した後、遠
心分離によって沈殿画分と可溶性画分に分離した。各画
分におけるＨＩＶコア抗原蛋白質ｐ２４の発現をＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認した結
果、２６ｋＤａのｐ２４蛋白質に相当するバンドが可溶
性画分に大量に存在することがわかった。
【００６７】可溶性画分を５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液
（ｐＨ７．８）／１ｍＭＤＴＴ／０．５％オクチルグル
コシドの展開液を用いるＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸ
Ｌカラムによるゲル濾過により精製した。精製されたフ
ラクションを分画分子量５０００の限外濾過によって
５．０ｍｇ／ｍｌにまで濃縮した。５μｌの可溶化ＨＩ
Ｖコア抗原蛋白質ｐ２４に、８Ｍグアニジン塩酸塩／１
ｍＭＤＴＴ／０．５％オクチルグルコシド／５０ｍＭＮ
ａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．８）５μｌを添加し、その
後、０．１％ＭＥＧＡ−９／１ｍＭシスチン＋システイ
ン、及び０．０５ＭＮａＣｌを含む０．１ＭＮａ−リン
酸緩衝液（ｐＨ７．８）を１９０μｌ添加混合し、３５
℃で２時間反応させた。
（ｐＨ７．８）／１ｍＭＤＴＴ／０．５％オクチルグル
コシドの展開液を用いるＴＳＫｇｅｌＧ４０００ＳＷＸ
Ｌカラムによるゲル濾過により精製した。精製されたフ
ラクションを分画分子量５０００の限外濾過によって
５．０ｍｇ／ｍｌにまで濃縮した。５μｌの可溶化ＨＩ
Ｖコア抗原蛋白質ｐ２４に、８Ｍグアニジン塩酸塩／１
ｍＭＤＴＴ／０．５％オクチルグルコシド／５０ｍＭＮ
ａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．８）５μｌを添加し、その
後、０．１％ＭＥＧＡ−９／１ｍＭシスチン＋システイ
ン、及び０．０５ＭＮａＣｌを含む０．１ＭＮａ−リン
酸緩衝液（ｐＨ７．８）を１９０μｌ添加混合し、３５
℃で２時間反応させた。
【００６８】回収された組み換え型ＨＩＶ抗原０．１５
μｇ／ｍｌを５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）で希釈した後、さらにヒト管理血清Ｌ−コンセーラ
Ｎ「ニッスイ」（日水製薬）でさらに０．０１５μｇ／
ｍｌにまで希釈した。抗原希釈液の抗原性をＨＩＶ抗原
・ＥＩＡキット、ＨＩＶ抗原・ＥＩＡII「アボット」
（ダイナボット（株）社製）によって評価した。また、
コントロールとして標準血清についても同様の抗原性評
価を行った。
μｇ／ｍｌを５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）で希釈した後、さらにヒト管理血清Ｌ−コンセーラ
Ｎ「ニッスイ」（日水製薬）でさらに０．０１５μｇ／
ｍｌにまで希釈した。抗原希釈液の抗原性をＨＩＶ抗原
・ＥＩＡキット、ＨＩＶ抗原・ＥＩＡII「アボット」
（ダイナボット（株）社製）によって評価した。また、
コントロールとして標準血清についても同様の抗原性評
価を行った。
【００６９】実施例９ （酸化剤反応系のみ） ５μｌの可溶化ＨＩＶコア抗原蛋白質ｐ２４に、添加す
る液を８Ｍグアニジン塩酸塩／１ｍＭＤＴＴ／０．５％
オクチルグルコシド／５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．８）のかわりに５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．８）とした以外は実施例８と同様の反応を行い、
抗原性を評価した。
る液を８Ｍグアニジン塩酸塩／１ｍＭＤＴＴ／０．５％
オクチルグルコシド／５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．８）のかわりに５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．８）とした以外は実施例８と同様の反応を行い、
抗原性を評価した。
【００７０】比較例１ （変性処理反応および酸化剤反
応を行わない系） ５μｌの可溶化ＨＩＶコア抗原蛋白質ｐ２４に、添加す
る液を８Ｍグアニジン塩酸塩／１ｍＭＤＴＴ／０．５％
オクチルグルコシド／５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．８）のかわりに５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．８）、０．１％ＭＥＧＡ−９／１ｍＭシスチン＋
システインを含む０．１ＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ
７．８）のかわりに０．１ＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ
７．８）とした以外は実施例８と同様の反応を行い、抗
原性を評価した。
応を行わない系） ５μｌの可溶化ＨＩＶコア抗原蛋白質ｐ２４に、添加す
る液を８Ｍグアニジン塩酸塩／１ｍＭＤＴＴ／０．５％
オクチルグルコシド／５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．８）のかわりに５０ｍＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．８）、０．１％ＭＥＧＡ−９／１ｍＭシスチン＋
システインを含む０．１ＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ
７．８）のかわりに０．１ＭＮａ−リン酸緩衝液（ｐＨ
７．８）とした以外は実施例８と同様の反応を行い、抗
原性を評価した。
【００７１】
【表６】
【００７２】表１〜６に示されるように、天然型ＨＢｓ
抗原、又は、不活性な組み換え型ＨＢｓ抗原、ＨＢｃ抗
原、ＨＣＶ抗原若しくはＨＩＶ抗原を、尿素、グアニジ
ウム塩酸塩等の変性剤の存在下で、ジチオスレイトール
等の還元剤やオクチルグルコシド等の界面活性剤を作用
させて低分子化または変性処理した後、酸化剤を含む溶
液で希釈又は透析することによって、より強い抗原活性
を得ることが可能であることが判明した。
抗原、又は、不活性な組み換え型ＨＢｓ抗原、ＨＢｃ抗
原、ＨＣＶ抗原若しくはＨＩＶ抗原を、尿素、グアニジ
ウム塩酸塩等の変性剤の存在下で、ジチオスレイトール
等の還元剤やオクチルグルコシド等の界面活性剤を作用
させて低分子化または変性処理した後、酸化剤を含む溶
液で希釈又は透析することによって、より強い抗原活性
を得ることが可能であることが判明した。
【００７３】
【発明の効果】本発明は、上述の構成よりなるので、抗
原活性を高めたウイルス抗原を得ることができ、それを
用いることにより免疫測定試薬の製造等に有用である。
また、本発明のウイルス抗原の調製法は、細菌又は酵母
を宿主とした遺伝子組み換え法により得られたウイルス
抗原に対して適用できるので、短い培養日数で簡便な操
作で大量のウイルス抗原を提供することが可能になる。
原活性を高めたウイルス抗原を得ることができ、それを
用いることにより免疫測定試薬の製造等に有用である。
また、本発明のウイルス抗原の調製法は、細菌又は酵母
を宿主とした遺伝子組み換え法により得られたウイルス
抗原に対して適用できるので、短い培養日数で簡便な操
作で大量のウイルス抗原を提供することが可能になる。
【００７４】
【配列表】 <110> 積水化学工業株式会社 SEKISUI CHEMICAL CO., LTD. <120> ウイルス抗原の調製法 <130> 99P02402 <150> JP P1998-377110 <151> 1998-12-28 <150> JP P1999-135948 <151> 1999-05-17 <160> 14 <210> 1 <211> 678 <212> DNA <213> Type B hepatitis virus <220> <221> CDS <222> 1..678 <400> 1 atg gag aac atc aca tca gga ttc cta gga ccc ctg ctc gtg tta cag 48 Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 gcg ggg ttt ttc ttg ttg aca aga atc ctc aca ata ccg cag agt cta 96 Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu 20 25 30 gac tcg tgg tgg act tct ctc aat ttt cta ggg gga tca ccc gtg tgt 144 Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys 35 40 45 ctt ggc caa aat tcg cag tcc cca acc tcc aat cac tca cca acc tcc 192 Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser 50 55 60 tgt cct cca att tgt cct ggt tat cgc tgg atg tgt ctg cgg cgt ttt 240 Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe 65 70 75 80 atc ata ttc ctc ttc atc ctg ctg cta tgc ctc atc ttc tta ttg gtt 288 Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val 85 90 95 ctt ctg gat tat caa ggt atg ttg ccc gtt tgt cct cta att cca gga 336 Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly 100 105 110 tca aca aca acc agt acg gga cca tgc aaa acc tgc acg act cct gct 384 Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala 115 120 125 caa ggc aac tct aag ttt ccc tca tgt tgc tgt aca aaa cct acg gat 432 Gln Gly Asn Ser Lys Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp 130 135 140 gga aat tgc acc tgt att ccc atc cca tcg tcc tgg gct ttc gca aaa 480 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys 145 150 155 160 tac cta tgg gag tgg gcc tca gtc cgt ttc tct tgg ctc agt tta cta 528 Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu 165 170 175 gtg cca ttt gtt cag tgg ttc gta ggg ctt tcc ccc act gtt tgg ctt 576 Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu 180 185 190 tca gct ata tgg atg atg tgg tat tgg ggg cca agt ctg tac agc atc 624 Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile 195 200 205 gtg agt ccc ttt ata ccg ctg tta cca att ttc ttt tgt ctc tgg gta 672 Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val 210 215 220 tac att 678 Tyr Ile 225 <210> 2 <211> 226 <212> PRT <213> Type B hepatitis virus <400> 2 Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu 20 25 30 Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys 35 40 45 Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser 50 55 60 Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe 65 70 75 80 Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val 85 90 95 Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly 100 105 110 Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala 115 120 125 Gln Gly Asn Ser Lys Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp 130 135 140 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys 145 150 155 160 Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu 165 170 175 Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu 180 185 190 Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile 195 200 205 Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val 210 215 220 Tyr Ile 225 <210> 3 <211> 681 <212> DNA <213> Type B hepatitis virus <220> <221> CDS <222> 1..678 <400> 3 atg gag aac aca aca tca gga ttc cta gga ccc ctg ctc gtg tta cag 48 Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 gcg ggg ttt ttc ttg ttg aca aga atc cta aca ata cca cag agt cta 96 Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu 20 25 30 gac tcg tgg tgg act tct ctc aat ttt cta ggg gga gca ccc acg tgt 144 Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys 35 40 45 cct ggc caa aat tcg cag tcc cca acc tcc aat cag tca cca acc tct 192 Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn Gln Ser Pro Thr Ser 50 55 60 tgt cct cca att tgt cct ggc tat cgc tgg atg tgt ctg cgg cgt ttt 240 Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe 65 70 75 80 atc ata ttc ctc ttc atc ctg ctg cta tgc ctc atc ttc ttg ttg gtt 288 Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val 85 90 95 ctt ctg gac tac caa ggt atg ttg ccc gtt tgt cct cta ctt cca gga 336 Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly 100 105 110 aca tca act acc agc acg gga cca tgc aag acc tgc acg att cct gct 384 Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala 115 120 125 caa gga acc tct atg ttt ccc tct tgt tgc tgt aca aaa cct tcg gac 432 Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp 130 135 140 gga aac tgc act tgt att ccc atc cca tca tcc tgg gct ttc gca aga 480 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg 145 150 155 160 ttc cta tgg gag ggg gcc tca gtc cgt ttc tcc tgg ctc agt tca cta 528 Phe Leu Trp Glu Gly Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Ser Leu 165 170 175 gtg cca ttt gtt cag tgg ttc gta ggg ctt tcc ccc act gtt tgg ctt 576 Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu 180 185 190 tca gtt ata tgg atg atg tgg tat tgg gga cca agt ctg tac aac atc 624 Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile 195 200 205 ttg agt ccc ttt tta cct cta tta cca att ttc ttt tgt ctt tgg gta 672 Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val 210 215 220 tac att taa 681 Tyr Ile 225 <210> 4 <211> 226 <212> PRT <213> Type B hepatitis virus <400> 4 Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu 20 25 30 Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys 35 40 45 Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn Gln Ser Pro Thr Ser 50 55 60 Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe 65 70 75 80 Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val 85 90 95 Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly 100 105 110 Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala 115 120 125 Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp 130 135 140 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg 145 150 155 160 Phe Leu Trp Glu Gly Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Ser Leu 165 170 175 Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu 180 185 190 Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile 195 200 205 Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val 210 215 220 Tyr Ile 225 <210> 5 <211> 697 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> CDS <222> (6)..(689) <220> <223> 配列表フリーテキスト ａｄｒ型ＨＢｓ抗原をコードする２本鎖合成遺伝子 <400> 5 ggcat atg gaa aac act act tct ggt ttc ctg ggt ccg ctg ctg gta ctg 50 Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu 1 5 10 15 cag gca ggt ttc ttc ctg ctg aca cgt atc ctc aca att cca cag tct 98 Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser 20 25 30 ctg gac tct tgg tgg act tct ctc aat ttt ctg ggt ggt gca ccg act 146 Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr 35 40 45 tgc cct ggc caa aat tct cag tcc cca acc tcc aat cac tct cca acc 194 Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr 50 55 60 tct tgc cct cca att tgc cct ggc tat cgc tgg atg tgc ctg cgt cgt 242 Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg 65 70 75 ttt atc att ttc ctc ttc atc ctg ctg ctg tgc ctc atc ttc ctg ctg 290 Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu 80 85 90 95 gtt ctt ctg gac tac caa ggt atg ctg cca gtt tgc cct ctg ctt cca 338 Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro 100 105 110 ggt aca tct acc acc agc act ggt cca tgc aag acc tgc act att cct 386 Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro 115 120 125 gct caa ggt acc tct atg ttt ccg tct tgc tgc tgc aca aaa cct tct 434 Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser 130 135 140 gac ggt aac tgc act tgc att ccg atc cca tct tcc tgg gct ttc gca 482 Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala 145 150 155 cgt ttc ctg tgg gag tgg gcc tct gtc cgt ttc tcc tgg ctc tct ctg 530 Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu 160 165 170 175 ctg gtg cca ttt gtt cag tgg ttc gta ggt ctg tct ccg act gtt tgg 578 Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp 180 185 190 ctg tct gtt att tgg atg atg tgg tat tgg ggt cca tct ctg tac aac 626 Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn 195 200 205 atc ctg tct ccg ttt ctg cct ctg ctg cca att ttc ttc tgc ctt tgg 674 Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp 210 215 220 gta tac att taa tag ggatccgg 697 Val Tyr Ile 225 <210> 6 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 6 Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu 20 25 30 Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys 35 40 45 Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser 50 55 60 Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe 65 70 75 80 Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val 85 90 95 Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly 100 105 110 Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala 115 120 125 Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp 130 135 140 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg 145 150 155 160 Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu 165 170 175 Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu 180 185 190 Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile 195 200 205 Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val 210 215 220 Tyr Ile 225 <210> 7 <211> 568 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> CDS <222> (6)..(560) <220> <223> 配列表フリーテキスト ＨＢｃ抗原をコードする２本鎖合成遺伝子 <400> 7 ggcat atg gac atc gac ccg tac aaa gaa ttc ggt gct tct gtt gaa ctg 50 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu 1 5 10 15 ctg tct ttt ctg cct tct gac ttc ttt cct tct att cgt gat ctc ctc 98 Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu 20 25 30 gac acc gcc tct gct ctg tat cgt gag gcc ctc gag tct ccg gaa cat 146 Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His 35 40 45 tgc tct cct cac cat aca gca ctc cgt caa gct atc ctg tgc tgg ggt 194 Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly 50 55 60 gag ctg atg aat ctg gcc acc tgg gtg ggt agc aat ctg gaa gac cca 242 Glu Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro 65 70 75 gca tcc agc gaa ctt gta gtc agc tat gtc aat gtt aat atg ggc ctg 290 Ala Ser Ser Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu 80 85 90 95 aaa atc cgt caa ctg ctg tgg ttt cac att tcc tgc ctt act ttt ggc 338 Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly 100 105 110 cgt gaa act gtt ctt gag tat ctg gtg tct ttt ggt gtg tgg att cgc 386 Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg 115 120 125 act cct ccg gct tac cgt cca cca aat gcc cct atc ctg tct aca ctt 434 Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu 130 135 140 ccg gaa act act gtt gtt cgt cgt cgt ggc cgt tcc cct cgt cgc cgt 482 Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg 145 150 155 act ccg tct cct cgc cgt cgt cgt tct caa tct ccg cgt cgc cgt cgc 530 Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg 160 165 170 175 tct caa tct cgt gaa tct caa tgc taa tag ggatccgg 568 Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 185 <210> 8 <211> 183 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 8 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Ser Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr 145 150 155 160 Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser 165 170 175 Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 <210> 9 <211> 592 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 配列表フリーテキスト ＨＣＶｃ抗原をコードする２本鎖合成遺伝子 <220> <221> CDS <222> (6)..(590) <400> 9 ggcat atg tct act aac ccg aaa ccg cag cgt aaa act aaa cgt aac act 50 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr 1 5 10 15 aac cgt cgc cca cag gac gtc aag ttc cct ggt ggt ggt cag atc gtt 98 Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val 20 25 30 ggt ggc gtt tac ctg ctt cca cgc cgt ggc cca cgt ctg ggt gtg cgt 146 Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg 35 40 45 gcg act cgt aag act tcc gag cgc tct caa cct cgt ggt cgt cgt caa 194 Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln 50 55 60 cct atc ccg aag gct cgt cgt cca gag ggt cgt gcc tgg gct cag cca 242 Pro Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro 65 70 75 ggt tac cct tgg cca ctc tat ggc aat gag ggc atg ggt tgg gca ggt 290 Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Met Gly Trp Ala Gly 80 85 90 95 tgg ctc ctg tct cca cgc ggt tcc cgt cct agc tgg ggt ccg act gac 338 Trp Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp 100 105 110 cca cgt cgt cgc tct cgt aac ctg ggt aag gtc atc gat acc ctc aca 386 Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr 115 120 125 tgc ggc ttc gcc gac ctc atg ggt tac att ccg ctc gtc ggt gcc cca 434 Cys Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro 130 135 140 ctg ggt ggt gct gcc cgt gcc ctg gcg cat ggc gtc cgt gtt ctg gaa 482 Leu Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu 145 150 155 gac ggc gtg aac tat gca aca ggt aat ctg cca ggt tgc tct ttc tct 530 Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser 160 165 170 175 atc ttc ctc ctg gct ctg ctg tcc tgc ctg acc atc cca gcc tcc gct 578 Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala 180 185 190 taa tag gga tcc gg 592 <210> 10 <211> 191 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 10 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn 1 5 10 15 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly 20 25 30 Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 45 Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro 50 55 60 Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro Gly 65 70 75 80 Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Met Gly Trp Ala Gly Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro 100 105 110 Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys 115 120 125 Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu 130 135 140 Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp 145 150 155 160 Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile 165 170 175 Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala 180 185 190 <210> 11 <211> 594 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> CDS <222> (4)..(582) <223> 配列表フリーテキスト ＨＣＶ−Ｅ１をコードする２本鎖合成遺伝子 <400> 11 cat atg tat gag gtg cgc aac gcg tcc ggg gtg tac cat gtc acg aac 48 Met Tyr Glu Val Arg Asn Ala Ser Gly Val Tyr His Val Thr Asn 1 5 10 15 gac tgc tct aac gca agc att gtg tat gag gca gcg gac atg atc atg 96 Asp Cys Ser Asn Ala Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met 20 25 30 cat acc ccc ggg tgt gtg ccc tgc gtt cgg gag gcc aat tcc tcc cgc 144 His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Ala Asn Ser Ser Arg 35 40 45 tgc tgg gta gcg ctc act ccc acg ctc gcg gcc agg aac tcc agc gtc 192 Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Ser Ser Val 50 55 60 cca act acg aca ata cga cgc cac gtc gat ttg ctc gtt ggg gcg gct 240 Pro Thr Thr Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala 65 70 75 gct ttc tgc tcc gct atg tac gtg ggg gat ctc tgc gga tct gtt ttc 288 Ala Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe 80 85 90 95 ctc gtc tcc cag ctg ttc acc ttc tcg cct cgc cgg cat gag acg gta 336 Leu Val Ser Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val 100 105 110 cag gac tgc aat tgt tca atc tat ccc ggc cac gta tca ggt cac cgc 384 Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Val Ser Gly His Arg 115 120 125 atg gct tgg gat atg atg atg aac tgg tca cct aca aca gcc cta gtg 432 Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val 130 135 140 gta tcg cag cta ctc cgg atc cca caa gct gtc atg gac atg gtg gcg 480 Val Ser Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Val Met Asp Met Val Ala 145 150 155 ggg gcc cac tgg gga gtc ctg gcg ggc ctt gcc tac tat tcc atg gtg 528 Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val 160 165 170 175 ggg aac tgg gct aag gtc ttg att gtg atg cta ctc ttt gcc ggc gtt 576 Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Ile Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val 180 185 190 gac ggg taataggaat tc 594 Asp Gly <210> 12 <211> 193 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 12 Met Tyr Glu Val Arg Asn Ala Ser Gly Val Tyr His Val Thr Asn Asp 1 5 10 15 Cys Ser Asn Ala Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met His 20 25 30 Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Ala Asn Ser Ser Arg Cys 35 40 45 Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Ser Ser Val Pro 50 55 60 Thr Thr Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala 65 70 75 80 Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu 85 90 95 Val Ser Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val Gln 100 105 110 Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Val Ser Gly His Arg Met 115 120 125 Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val 130 135 140 Ser Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Val Met Asp Met Val Ala Gly 145 150 155 160 Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly 165 170 175 Asn Trp Ala Lys Val Leu Ile Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp 180 185 190 Gly <210> 13 <211> 715 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> CDS <222> (6)..(701) <223> 配列表フリーテキスト ＨＩＶコア抗原蛋白質ｐ２４をコードする２本鎖合成遺伝子 <400> 13 ggcat atg ccg ata gtg cag aac tta cag ggg caa atg gta cat cag gcc 50 Met Pro Ile Val Gln Asn Leu Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala 1 5 10 15 atc tca cct aga act tta aat gca tgg gtt aaa gta ata gag gag aag 98 Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Ile Glu Glu Lys 20 25 30 gct ttc agc cca gaa gta ata ccc atg ttt tca gca tta tca gaa gga 146 Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly 35 40 45 gcc acc cca caa gat tta aac acc atg cta aac aca gtg ggg gga cat 194 Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His 50 55 60 cag gca gct atg cag atg tta aaa gag acc atc aat gag gaa gct gca 242 Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala 65 70 75 gaa tgg gat aga tta cat cca gcg cat gca ggg ccc aat gca cca ggc 290 Glu Trp Asp Arg Leu His Pro Ala His Ala Gly Pro Asn Ala Pro Gly 80 85 90 95 cag atg aga gaa cca agg gga agt gac ata gca gga act act agt acc 338 Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr 100 105 110 ctt cag gaa cag ata gga tgg atg aca agt aat cca cct gta cca gta 386 Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Ser Asn Pro Pro Val Pro Val 115 120 125 gga gaa atc tat aaa aga tgg ata atc ctg ggg tta aat aaa ata gta 434 Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val 130 135 140 aga atg tat agt cct gtc agc att ctg gac ata aga caa gga cca aag 482 Arg Met Tyr Ser Pro Val Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys 145 150 155 gaa ccc ttt aga gat tat gta gac cgg ttc tat aaa act cta aga gcc 530 Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala 160 165 170 175 gag caa gct tca cag gat gta aaa aat tgg atg aca gaa acc ttg ttg 578 Glu Gln Ala Ser Gln Asp Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu 180 185 190 gtc caa aat gca aac cca gat tgt aag act att tta aaa gca ttg gga 626 Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly 195 200 205 cca gca gct aca tta gaa gaa atg atg aca gca tgt cag gga gtg gga 674 Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly 210 215 220 gga ccc agc cat aag gca aga att ttg taatagggat ccgg 715 Gly Pro Ser His Lys Ala Arg Ile Leu 225 230 <210> 14 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 14 Met Pro Ile Val Gln Asn Leu Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala Ile 1 5 10 15 Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Ile Glu Glu Lys Ala 20 25 30 Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala 35 40 45 Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gln 50 55 60 Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala Glu 65 70 75 80 Trp Asp Arg Leu His Pro Ala His Ala Gly Pro Asn Ala Pro Gly Gln 85 90 95 Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu 100 105 110 Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Ser Asn Pro Pro Val Pro Val Gly 115 120 125 Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg 130 135 140 Met Tyr Ser Pro Val Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys Glu 145 150 155 160 Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu 165 170 175 Gln Ala Ser Gln Asp Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val 180 185 190 Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro 195 200 205 Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly 210 215 220 Pro Ser His Lys Ala Arg Ile Leu 225 230
【図１】実施例１における、天然型ＨＢｓ抗原（未処
理）のゲル濾過カラムクロマトグラフィーのチャートで
ある。縦軸は吸光度の強さ、横軸はカラムの保持時間を
示す単位である。
理）のゲル濾過カラムクロマトグラフィーのチャートで
ある。縦軸は吸光度の強さ、横軸はカラムの保持時間を
示す単位である。
【図２】実施例１における、低分子化処理した天然型Ｈ
Ｂｓ抗原のゲル濾過カラムクロマトグラフィーのチャー
トである。縦軸は吸光度の強さ、横軸はカラムの保持時
間を示す単位である。
Ｂｓ抗原のゲル濾過カラムクロマトグラフィーのチャー
トである。縦軸は吸光度の強さ、横軸はカラムの保持時
間を示す単位である。
【図３】実施例１における、低分子化処理後に酸化剤溶
液で希釈した天然型ＨＢｓ抗原のゲル濾過カラムクロマ
トグラフィーのチャートである。縦軸は吸光度の強さ、
横軸はカラムの保持時間を示す単位である。
液で希釈した天然型ＨＢｓ抗原のゲル濾過カラムクロマ
トグラフィーのチャートである。縦軸は吸光度の強さ、
横軸はカラムの保持時間を示す単位である。
【図４】実施例２における、低分子化処理した組み換え
型ａｄｗ型ＨＢｓ抗原のゲル濾過カラムクロマトグラフ
ィーのチャートである。縦軸は吸光度の強さ、横軸はカ
ラムの保持時間を示す単位である。
型ａｄｗ型ＨＢｓ抗原のゲル濾過カラムクロマトグラフ
ィーのチャートである。縦軸は吸光度の強さ、横軸はカ
ラムの保持時間を示す単位である。
【図５】実施例２における、低分子化処理後に酸化剤溶
液で希釈した組み換え型ａｄｗ型ＨＢｓ抗原のゲル濾過
カラムクロマトグラフィーのチャートである。縦軸は吸
光度の強さ、横軸はカラムの保持時間を示す単位であ
る。
液で希釈した組み換え型ａｄｗ型ＨＢｓ抗原のゲル濾過
カラムクロマトグラフィーのチャートである。縦軸は吸
光度の強さ、横軸はカラムの保持時間を示す単位であ
る。
【図６】実施例３における、低分子化処理した組み換え
型ａｄｒ型ＨＢｓ抗原のゲル濾過カラムクロマトグラフ
ィーのチャートである。縦軸は吸光度の強さ、横軸はカ
ラムの保持時間を示す単位である。
型ａｄｒ型ＨＢｓ抗原のゲル濾過カラムクロマトグラフ
ィーのチャートである。縦軸は吸光度の強さ、横軸はカ
ラムの保持時間を示す単位である。
【図７】実施例３における、低分子化処理後に酸化剤溶
液で希釈した組み換え型ａｄｒ型ＨＢｓ抗原のゲル濾過
カラムクロマトグラフィーのチャートである。縦軸は吸
光度の強さ、横軸はカラムの保持時間を示す単位であ
る。
液で希釈した組み換え型ａｄｒ型ＨＢｓ抗原のゲル濾過
カラムクロマトグラフィーのチャートである。縦軸は吸
光度の強さ、横軸はカラムの保持時間を示す単位であ
る。
【図８】実施例４における、低分子化処理後に酸化剤溶
液で希釈した組み換え型ａｄｒ型ＨＢｓ抗原のゲル濾過
カラムクロマトグラフィーのチャートである。縦軸は吸
光度の強さ、横軸はカラムの保持時間を示す単位であ
る。
液で希釈した組み換え型ａｄｒ型ＨＢｓ抗原のゲル濾過
カラムクロマトグラフィーのチャートである。縦軸は吸
光度の強さ、横軸はカラムの保持時間を示す単位であ
る。
【図９】実施例５における、低分子化処理後に酸化剤溶
液で希釈した組み換え型ＨＢｃ抗原のゲル濾過カラムク
ロマトグラフィーのチャートである。縦軸は吸光度の強
さ、横軸はカラムの保持時間を示す単位である。
液で希釈した組み換え型ＨＢｃ抗原のゲル濾過カラムク
ロマトグラフィーのチャートである。縦軸は吸光度の強
さ、横軸はカラムの保持時間を示す単位である。
【図10】実施例６における、低分子化処理後に酸化剤溶
液で希釈した組み換え型ＨＣＶｃ抗原のゲル濾過カラム
クロマトグラフィーのチャートである。縦軸は吸光度の
強さ、横軸はカラムの保持時間を示す単位である。
液で希釈した組み換え型ＨＣＶｃ抗原のゲル濾過カラム
クロマトグラフィーのチャートである。縦軸は吸光度の
強さ、横軸はカラムの保持時間を示す単位である。
【図11】実施例７における、低分子化処理後に酸化剤溶
液で希釈した組み換え型ＨＣＶ−Ｅ１蛋白質のゲル濾過
カラムクロマトグラフィーのチャートである。縦軸は吸
光度の強さ、横軸はカラムの保持時間を示す単位であ
る。
液で希釈した組み換え型ＨＣＶ−Ｅ１蛋白質のゲル濾過
カラムクロマトグラフィーのチャートである。縦軸は吸
光度の強さ、横軸はカラムの保持時間を示す単位であ
る。
Claims (4)
- 【請求項１】 ウイルス抗原を界面活性剤、還元剤及び
タンパク質変性剤からなる群より選択される少なくとも
１種によって低分子化または変性処理する工程、並び
に、前記低分子化または変性処理されたウイルス抗原
に、酸化剤溶液で希釈又は透析する工程からなることを
特徴とするウイルス抗原の調製法。 - 【請求項２】 ウイルス抗原は、細菌又は酵母を宿主と
した遺伝子組み換え法により発現されたものである請求
項１記載のウイルス抗原の調製法。 - 【請求項３】 ウイルス抗原は、Ｂ型肝炎ウイルス抗
原、Ｃ型肝炎ウイルス抗原又はエイズウイルス抗原であ
る請求項１又は２記載のウイルス抗原の調製法。 - 【請求項４】 請求項１、２、又は３記載のウイルス抗
原の調製法により得られたウイルス抗原。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11272673A JP2001033445A (ja) | 1998-12-28 | 1999-09-27 | ウイルス抗原の調製法 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP37711098 | 1998-12-28 | ||
| JP11-135948 | 1999-05-17 | ||
| JP13594899 | 1999-05-17 | ||
| JP10-377110 | 1999-05-17 | ||
| JP11272673A JP2001033445A (ja) | 1998-12-28 | 1999-09-27 | ウイルス抗原の調製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001033445A true JP2001033445A (ja) | 2001-02-09 |
Family
ID=27317185
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11272673A Pending JP2001033445A (ja) | 1998-12-28 | 1999-09-27 | ウイルス抗原の調製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001033445A (ja) |
-
1999
- 1999-09-27 JP JP11272673A patent/JP2001033445A/ja active Pending
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