CN104380106B - 用于生产抗体检测试剂的方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了以下内容：用于有效生产抗体检测试剂的方法，所述试剂特异的结合存在于液体样品中的不溶性抗原蛋白质；由所述生产方法生产的抗体检测试剂；和所述抗体的用途。在用于溶解抗原蛋白质的步骤中，通过利用阳离子化剂可以有效的溶解和回收抗原蛋白质；因此，当与常规方法相比时，可以有效的生产与载体中的多种抗原蛋白质分子结合的抗体检测试剂。

Description

用于生产抗体检测试剂的方法及其用途
技术领域
本发明涉及用于生产抗体检测试剂的方法。本发明还涉及由所述方法生产的抗体检测试剂及其用途。
背景技术
存在大量用于检测包含在液体样品中的抗体的方法，例如放射性免疫测定和酶联免疫吸附测定(ELISA)。ELISA是这样的方法，涉及：在微平板上固定特定的抗原；在连续稀释含有抗体的样品后，在微平板上实施抗原-抗体反应；使用酶标记的第二抗体检测结合的抗体。该方法需要使用独立的测定平板评估针对单个抗原的抗体测试。
作为用于解决该问题的方法，已关注了一种多元技术，该技术可以利用携带报告子荧光的微珠作为固定的载体，同时分析针对多种抗原的抗体。
在任何上述技术的应用中，必须以水溶性的形式制备这些多种抗原。在绝大部分情况下，通常使用可以以水溶性形式制备的天然结构的蛋白质或化学合成的多肽片段。
例如，专利文献1或2中描述了用于检测包含在癌症患者的血液中的抗体的方法。该方法涉及将抗原表位肽(包含若干个氨基酸的抗原肽)固定在珠子上；将珠子与对象的血液组分接触；并检测包含在对象的血液中的抗原表位肽-特异性抗体。然而，抗体所结合的表位部分根据HLA的类型而不同。因此，专利文献1或2中描述的方法的应用需要明确多种条件，如检验对象的HLA类型和鉴别适合对象的HLA类型的表位肽。
为了制备针对特定抗原蛋白质的抗体的检测试剂，待制备的试剂包含源自位于一类珠子表面上的一类抗原蛋白质的所有表位部分，并实施高度灵敏和稳定的检测。出于该目的，优选是获得具有水溶性和柔性结构的抗原。但是，绝大部分的变性蛋白质、溶解性差的蛋白质(例如，膜蛋白)或具有不稳定的物理特性的蛋白质都趋向于聚集。就此而言，在绝大部分情况下，通常使用能够表现出稳定的物理特性的部分肽。
利用这类部分肽需要合成多种重叠的肽用于覆盖所有的表位，并且还需要制备许多类型的珠子。此外，实践上难以提供无缝的表位肽。即使可以幸运的获得具有天然结构的全长抗原，具有内部包埋了疏水部分的高级结构的常规蛋白质并不总是暴露其表位而与抗体反应。
即使在使用溶解的蛋白质制备的抗体检测试剂中，包含在蛋白质中的巯基可以随时间形成二硫键，从而影响抗体检测。
例如，专利文献3描述了利用人丙肝病毒(HCV)的长链多肽，检测包含在对象的血清中的抗HCV抗体的方法。专利文献3陈述了随时间生成的蛋白质内或蛋白质间的二硫键降低了抗体检测的灵敏度。其中描述的解决该问题的方案是在检测前或检测的过程中使用还原剂解离蛋白质内或蛋白质间的二硫键，从而改善抗体检测的灵敏度。由于即使是溶解的蛋白质也可能随时间沉淀，用于解决该问题的方法是必需的。
已知TAPS-磺酸酯(甲烷硫代磺酸三甲基铵基丙基酯；在下文中称为TAPS)是使蛋白质溶解的化合物。TAPS可以结合蛋白质中的巯基，使蛋白质可逆的阳离子化(参见例如，非专利文献1和2)。
阳离子化蛋白表现出改善的水溶性。因为TAPS与蛋白质的结合是可逆的反应，已知在细胞摄入后，TAPS与蛋白质解离，从而由于重折叠的结果，使蛋白质能够执行其最初的功能。然而，迄今为止尚无尝试利用TAPS溶解来制备抗体检测试剂的方法。此外，一般已知抗体结合糖基化蛋白质。但是，之前没有报道显示抗体是否能够结合与人工合成的化合物，如TAPS结合的蛋白质。
引用列表
专利文献
专利文献1：日本专利号3960614(Immunodia Co.,Ltd.)
专利文献2：JP 2005-098877 A(Hitachi Software Engineering Co.,Ltd.)
专利文献3：日本专利号3225468(Dainabot Co.,Ltd.)
非专利文献
非专利文献1：M.Seno等人，Growth Factors,15,215-229(1998)
非专利文献2：M.Inoue等人，Biotechnol.Appl.Biochem.,28,207-213(1998)
发明概述
技术问题
本发明是在上述背景下产生的。本发明提供了用于有效生产检测存在于液体样品中的抗体的试剂的方法，所述抗体特异的结合溶解性差的抗原蛋白质。本发明还提供了由所述生产方法生产的抗体检测试剂及其用途。
要解决的问题
具体而言，本发明的目标是提供以下方面：
(1)用于生产包含抗原蛋白质和载体的抗体检测试剂的方法，方法包括以下步骤：通过阳离子化溶解抗原蛋白质；以及使得阳离子化的抗原蛋白质与载体结合。
(2)根据(1)的用于生产抗体检测试剂的方法，其中所述抗原蛋白质是全长蛋白质。
(3)根据(1)或(2)的用于生产抗体检测试剂的方法，其中所述抗原蛋白质是膜蛋白。
(4)根据(1)至(3)的任一项的用于生产抗体检测试剂的方法，其中所述抗原蛋白质是癌症抗原蛋白质。
(5)根据(1)至(4)的任一项的用于生产抗体检测试剂的方法，其中通过结合阳离子化剂与抗原蛋白质的巯基实施所述阳离子化。
(6)根据(5)的用于生产抗体检测试剂的方法，其中所述阳离子化剂选自任一种的硫代磺酸酯化合物、混合的二硫化物化合物、吡啶基硫化物阳离子化剂和烷基卤化物阳离子化剂，及其混合物。
(7)根据(6)的用于生产抗体检测试剂的方法，其中所述硫代磺酸酯化合物是由下列式所示的化合物：
[式1]
其中R1代表具有2至20个碳原子的线性亚烷基；R2代表具有1至3个碳原子的烷基；并且n代表1至3的任意整数。
(8)根据(7)的方法，其中所述化合物是TAPS-磺酸酯，其中R1是-(CH2)3-；R2是CH3-；且n是1。
(9)根据(7)的用于生产抗体检测试剂的方法，其中所述化合物是TAP3S-磺酸酯，其中R1是-(CH2)3-；R2是CH3-；且n是3。
(10)根据(6)的用于生产抗体检测试剂的方法，其中所述烷基卤化物阳离子化剂是TAP-Br。
(11)根据(1)至(10)的任一项的用于生产抗体检测试剂的方法，其中所述载体是磁珠。
(12)根据(1)至(11)的任一项的方法生产的抗体检测试剂。
(13)用于检测包含在样品中的抗原特异性抗体的方法，方法包括以下步骤：将根据(12)的抗体检测试剂与样品接触；向其加入与抗体结合的被标记的第二抗体以允许第二抗体与抗体结合；回收抗体检测试剂；以及检测与抗体结合的抗体检测试剂。
(14)根据(13)的方法，其中所述样品是分离的体液。
本发明人发现可以通过上述配置生产的意图来检测针对抗原蛋白质的抗体的抗体检测试剂，从而完成了本发明。
发明的有益效果
可以在溶解抗原蛋白质的步骤中使用阳离子化剂，从而有效的溶解和回收抗原蛋白质。因此，相比常规的方法，可以有效生产包含大量与载体结合的抗原蛋白质分子的抗体检测试剂。
此外，该抗体检测试剂比常规方法生产的试剂稳定得多，因此可以储藏很长时间。
在本发明的一个方面，使用溶解性差的抗原蛋白质作为抗体检测抗原。利用这类抗原蛋白质允许检测抗体，即使抗原蛋白质由于其HLA类型的不同而造成可以被抗体识别的表位部分不同。相比涉及在珠子上固定表位肽的方法，这消除了对产生根据对象的HLA类型的多种试剂的需求，并能够提供有效的生产方法。
此外，与抗原蛋白质中的巯基结合的阳离子化剂能够抑制时间依赖性的生成蛋白质内或蛋白质间的二硫键。预期这对于阻止抗体检测试剂通过蛋白质间二硫键随时间聚集是有效的。因此，相比传统方法，甚至当溶解性差的抗原蛋白质与载体结合时，或者甚至在室温或4℃或-20℃下长期储藏后，抗体检测试剂也可以维持其功能。
另一方面，这类与抗原蛋白质结合的人工合成的化合物可能会阻碍抗原蛋白质与抗体结合。然而，本发明人揭示了可以使用甚至与阳离子化剂结合的抗原蛋白质来检测抗体。
根据上述特征，可以利用本发明的生产方法，有效的生产抗体检测试剂。通过本发明的生产方法生产的抗体检测试剂能够检测存在于液体样品中的(针对抗原蛋白质的)抗体，并且例如不论癌症患者的HLA类型，能够检测血清样品中的癌症抗原蛋白质特异性的抗体。
特别是TAPS-磺酸酯或TAP-Br具有低的分子量。因此，该化合物可以使抑制蛋白质-抗体反应的位阻最小化，同时保持其高的溶解能力。该低分子量还有助于多种其分子与蛋白质的结合。其结果是可以使包含在蛋白质中的所有SH基阳离子化。这可以阻止珠子在长期的储藏过程中聚集。利用这些特征，使用TAPS-磺酸酯或TAP-Br的本发明的方法比常规方法更有效。
附图简介
图1是示意蛋白质阳离子化的示意图。
图2是显示用TAPS将WT-1阳离子化之后的SDS-PAGE分析结果的示意图。
图3是显示用TAPS将MAGE-A4阳离子化之后的SDS-PAGE分析结果的示意图。
图4是显示与TAPS-结合的WT-1的HPLC纯化结果的示意图。
图5是显示与TAPS-结合的MAGE-A4的HPLC纯化结果的示意图。
图6是显示在HPLC纯化与TAPS-结合的WT-1和MAGE-A4之后的SDS-PAGE分析结果的示意图。Min表示HPLC纯化的洗脱时间(图4或5)。例如，标注了“49min”的泳道描述了自49分钟的洗脱时间时收集1分钟的级分的迁移。
图7是显示制备的抗原蛋白质的SDS-PAGE分析结果的示意图。每个泳道装填2μg各抗原蛋白质。
图8是显示利用本发明的生产方法生产的抗体检测试剂，针对包含在癌症患者的血清中的6种类型的癌症抗原蛋白质的抗体检测结果的示意图。
图9是显示利用本发明的生产方法生产的抗体检测试剂，针对包含在癌症患者的血清中的3种类型的癌症抗原蛋白质的抗体检测结果的示意图。
图10是显示利用本发明的生产方法生产的抗体检测试剂，针对包含在癌症患者的血清中的3种类型的癌症抗原蛋白质的抗体检测结果的示意图。
图11是显示在与TAPS-结合的、与TAP3S-结合的、天然的和还原的溶菌酶上实施的反相HPLC(高效液相色谱)的结果的示意图。
图12是显示在4℃储藏5天、或37℃储藏10天或41天的与TAPS-结合的、与TAP3S-结合的、天然的和还原的MAGE-A4-固定化的珠子的悬浮液中包含的珠子聚集体的百分比示意图。
图13是显示对储藏了104天的与TAPS结合的MAGE-A4-固定化的珠子(泳道2)、与TAP3S结合的MAGE-A4-固定化的珠子(泳道3)、以及天然的MAGE-A4-固定化的珠子(泳道4)的储藏溶液实施的Western印迹的结果的示意图。泳道1描述了作为对照的100ng的MAGE-A4蛋白质迁移。
图14提供了图像，显示对结合在Bio-Plex COOH珠子、储藏了104天的与TAPS结合的MAGE-A4-固定化的珠子、储藏了104天的与TAP3S结合的MAGE-A4-固定化的珠子和储藏了104天的天然的MAGE-A4-固定化的珠子的表面上的蛋白质的检测。左图是通过共聚焦激光扫描荧光显微镜采集的图像。右图是在与之相同时间采集的微分干涉图(亮视野)。
实施方案描述
下文描述了本发明的实施方案。
首先，描述了用于生产本发明的抗体检测试剂的方法(下文中也被称为本发明的生产方法)。
本发明的生产方法是用于生产抗体检测试剂的方法，包括步骤：通过阳离子化溶解抗原蛋白质；和使得阳离子化的抗原蛋白质与载体结合。抗原蛋白质可以是溶解性差的蛋白质。
在本说明书中，术语“溶解性差”仅供示例蛋白质的特性，指溶解在液体中不形成均一混合溶液的特性，特别是不能或难以溶解在水中或生理学溶剂中的特性。本文所述的溶解性差的蛋白质类型可以定义为这样的溶解性差的蛋白质，当对水中、水和盐中、或水和不使蛋白质变性的生理学溶剂中的蛋白质15,100×g离心1小时后，大部分所述蛋白质实质上被回收入沉淀的级分。
本文所述的“蛋白质”包括肽、多肽等。蛋白质不限于在自然界中发现的天然存在的蛋白质，还涵盖了源自通过基因转移等转化的细胞的重组蛋白质，使用体外的无细胞蛋白质表达系统表达的蛋白质，和以合成的有机化学方式制备的合成蛋白质。可选的，可以向构成蛋白质的部分或全部氨基酸添加官能团，以这种方式使所述一个或多个氨基酸乙酰化、磷酸化或甲基化，或者可以用糖、蛋白质、脂类等修饰构成蛋白质的部分或全部氨基酸。
本文所述的“溶解性差的蛋白质”指即使通过在水中或在生理学溶剂中室温搅拌，也不能或难以溶解的蛋白质，并且其可以利用例如变性剂溶解，但由于用生理学溶剂取代变性剂而形成沉淀。即使当蛋白质实际上是可溶的情况下，当通过利用不同种的生物将其表达为重组蛋白质(例如，通过使用基因重组技术构建大肠杆菌中的表达系统)来将目标蛋白质以内含体的形式回收时，目标蛋白也可以表示为溶解性差的蛋白质。溶解性差的蛋白质的例子包括但不限于全长蛋白质、膜蛋白和癌症抗原蛋白质。
在本说明书中，术语“增溶”指将蛋白质保持其氨基酸序列的溶解在生理学溶剂中。术语“增溶”意指当用生理学溶剂取代后，离心含有用变性剂溶解的蛋白质的溶液时，回收到上清液中的蛋白质的量在离心后增加。
全长蛋白质不仅意指经验证存在于体内的天然蛋白质，还指由基因组序列预测的最大开放阅读框(ORF)编码的蛋白质。这类全长蛋白质的氨基酸序列可获得自，但不限于数据库，例如The ORFeome Collaboration(http://www.orfeomecollaboration.org/)或GeneCards(R)(http://www.genecards.org/)。
膜蛋白指具有跨膜结构的蛋白质。这类蛋白质存在于细胞膜、核被膜和其他胞内细胞器的表面。一种蛋白质分子含有在细胞内、或者与细胞外侧接触的亲水性部分，和包埋在细胞膜内的疏水性部分。出于该原因，当通过在大肠杆菌等中表达而获得时，这些膜蛋白很少在含水溶液中形成三维结构，而倾向于形成内含体。
癌症抗原蛋白质指在肿瘤中表达并诱导免疫应答的抗原蛋白质，或者可以作为肿瘤存在指标的抗原蛋白质。癌症抗原蛋白质的例子包括由于细胞的恶性转化而以升高的水平表达的蛋白质，和由于细胞的恶性转化导致具有一个或一些氨基酸突变的蛋白质。
本发明的生产方法的特征是使蛋白质阳离子化。更优选的，本发明的生产方法的特征是使溶解性差的蛋白质阳离子化。
蛋白质的阳离子化指向蛋白质添加过多的正电荷。由于电荷互斥，阳离子化的蛋白质表现出改善的水溶性。蛋白质阳离子化方法的例子包括使阳离子化剂与蛋白质结合。
“载体”指具有待被抗原蛋白质结合的固相表面的材料。其特定实例包括但不限于玻璃、尼龙膜、半导体晶片和微珠。
抗原蛋白质与载体的结合意指使用本领域已知的技术，将“抗原蛋白质”直接固定在载体的表面上。可选的，可以通过例如生物素-抗生物素蛋白键或者通过接头分子间接的固定抗原蛋白质至其上。
“样品”指含有通过本发明的抗体检测试剂待被检测的抗体(包括亚型，如IgG、IgA、IgM、IgD和IgE)及其活性片段(包括例如Fab和F(ab')2片段)的试样。
“体液”指可以从生物体收集的液体状态的样品。体液对应于外周血、骨髓液、脐带血、胸膜液、腹水、尿等。体液还对应于根据本领域技术人员普遍已知的方法处理这些体液所获得的样品(例如，通过外周血离心，从上清液获得的血浆或血清)。
“第二抗体”指识别通过本发明的抗体检测试剂待检测的抗体(包括亚型，如IgG、IgA、IgM、IgD和IgE)及其活性片段(包括例如Fab和F(ab')2片段)的抗体及其活性片段。“标记的第二抗体”指与标记结合的第二抗体，所述标记如放射性同位素、发光剂或荧光团。可选的，蛋白质如酶(例如荧光素酶或过氧化物酶)、生物素或绿色荧光蛋白(GFP)可以用作“标记”。在“标记”是源自蛋白质的情况下，可以以融合蛋白质的形式，按遗传工程的方式作为重组蛋白来制备“标记的第二抗体”
可用于本发明的生产方法中的阳离子化剂可以是能够通过二硫键向蛋白质添加正电荷的各种化合物中的任何(图1)。例如，可以使用硫代磺酸酯化合物、混合的二硫化物化合物、吡啶基二硫化物阳离子化剂或烷基卤化物阳离子化剂。
用于本发明的生产方法中的硫代磺酸酯化合物是由下文给出的[式2]所示的化合物。在该式中，X代表了具有阳离子的基团。可以使用具有由X所示阳离子的一个基团，或者可以使用由X所示基团的连接。在式中，R2代表了具有1至3个碳原子的低级烷基。具体而言，用于本发明的生产方法中的硫代磺酸酯化合物是在一个分子中具有一个或多个源自X的阳离子的硫代磺酸酯化合物。由X所示基团的例子包括季铵基。
[式2]
用于本发明的生产方法中的硫代磺酸酯化合物是由下文给出的[式3]所示的硫代磺酸酯化合物，其在一个分子中具有一个或多个源自季铵基的阳离子。
[式3]
其中R1代表具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子的线性或分支的亚烷基；R2代表具有1、2或3个碳原子的低级烷基；并且n代表1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的任意整数，更优选1、2和3的任意整数。
硫代磺酸酯化合物的特征的例子包括在图1所示的蛋白质阳离子化反应后，作为可解离基团R2形成的惰性可解离基团。
在一个分子中含有一个源自季铵基的阳离子的化合物的例子包括甲烷硫代磺酸三甲基铵基丙基酯(TAPS-磺酸酯；在下文中称为TAPS)。在一个分子中含有3个源自季铵基的阳离子的化合物的例子包括TAP3S-磺酸酯(在下文中称为TAP3S)。
TAPS指由下文给出的[式4]表示的化合物。TAPS在分子内具有强正电荷的季胺，通过半胱氨酸残基介导的与蛋白质的结合使蛋白质阳离子化。阳离子化的蛋白质表现出改善的溶解度，并含有稳定的受保护的SH基。可以参考例如Biotechnol.Appl.Biochem.(1998)28,207-213来合成TAPS，或者其可以Br盐的形式作为试剂购买(下文给出的[式5]所示)(分子量：292.26)(购自Wako Pure Chemical Industries,Ltd.,Katayama Chemical,Ltd.等)。
[式4]
[式5]
TAP3S指由下文给出的[式6]所示的分子量化合物。TAP3S在分子中具有3个带强正电荷的季胺，可以比TAPS更强的阳离子化蛋白质。可以参考例如国际公开号WO 2011/118731来合成TAP3S。
[式6]
用于本发明的生产方法中的混合的二硫化物化合物的例子包括下文给出的[式7]所示的胱胺。在胱胺的情况下，NH3 +是具有阳离子的基团。
[式7]
用于本发明的生产方法中的吡啶基硫化物阳离子化剂的例子包括下文给出的[式8]所示的化合物。X代表具有阳离子的基团。可以使用一个由X所示的具有阳离子的基团，或者可以使用由X所示的基团的连接。
[式8]
可用于本发明的生产方法中的阳离子化剂可以是能够通过S-烷基化作用向蛋白质添加正电荷的烷基卤化物阳离子化剂。例如，可以使用(3-溴丙基)三甲铵(TAP-Br)。TAP-Br与蛋白质中的SH基可逆的结合，从而改善其蛋白质溶解能力。TAP-Br(分子量：261.00)可以例如以Br盐的形式([式9]所示)作为试剂购买(例如购自Sigma-Aldrich Corp.)。
[式9]
多种阳离子化剂都可用于本发明的生产方法中。特别是TAPS-磺酸酯或TAP-Br，具有低分子量。因此，该化合物可以使抑制蛋白质-抗体反应的位阻最小化，同时保持其高的溶解能力。该低的分子量还有助于其多种分子与蛋白质的结合。其结果是，能够使包含蛋白质中的所有SH基阳离子化。这可以阻止珠子在长期储藏过程中聚集。
在下文中，制备抗原蛋白质的步骤和使用TAPS制备与TAPS结合的抗原蛋白质的步骤将作为获得阳离子化抗原蛋白质的一个例子来描述。
将抗原蛋白质的基因转移到大肠杆菌中，然后培养所述大肠杆菌。将培养的大肠杆菌均质化以回收抗原蛋白质。在这一回收中，抗原蛋白质可以是内含体的形式。
用变性剂溶解回收的内含体。所使用的变性剂的例子包括但不限于尿素、盐酸胍和表面活性剂。
用还原剂处理由此变性的抗原蛋白质以切开SS键。还原剂的例子包括但不限于二硫苏糖醇(DTT)和2-巯基乙醇(2ME)。
将TAPS添加到含有变性的抗原蛋白质的溶液中，并且将混合物放在室温下静置30分钟。添加的TAPS的量优选是TAPS的摩尔浓度为包含在抗原蛋白质和溶液中的巯基摩尔浓度的1至10倍，更优选1.1至1.2倍。
30分钟后，向含有与TAPS结合的抗原蛋白质的溶液中加入平均分子量为600的聚乙烯亚胺，终浓度为0.2％。然后，向其加入4倍所得到的溶液量的10％醋酸。离心含有与TAPS结合的抗原蛋白质的溶液，以回收上清液。
之后，纯化包含在上清液中的与TAPS结合的抗原蛋白质。在纯化中，可以使用例如透析或柱层析的方法。例如，将上清液转移到透析管中，用纯水或达0.5％醋酸在4℃透析以去除变性剂。在4℃至室温下，12,000rpm离心透析的液体15分钟以回收上清液。
通过这些步骤获得阳离子化的抗原蛋白质。
阳离子化的抗原蛋白质表现出高的水溶性，易于制备，且在弱酸性条件下(优选pH6或更低，更优选pH2-5)表现出非常高的稳定性。因此，阳离子化的抗原蛋白质可以将它的水溶性维持在这样的状态，其中使其全长蛋白质中的表位被无缝暴露。出于该原因，包含在一个抗原蛋白质中的所有表位都能被固定在一种类型的珠子上，从而有助于表位与抗体的反应。
之后，允许与TAPS结合的蛋白质与载体结合。
在一个方面，可以使用磁珠、非磁珠、小平板等作为载体。优选在常规的分析操作方面使用磁珠。在下文中，将描述使用珠子作为载体的情形。
将珠子悬浮在溶液中用于结合。在珠子已经被修饰以帮助珠子与蛋白质结合的情形中，珠子是直接与结合TAPS的蛋白质结合的。在缺少这类帮助珠子结合蛋白质的修饰的情况下，用材料(如脱脂奶)修饰珠子，所述材料在抗体检测过程中不抑制结合TAPS的蛋白质与抗体的反应。
混合结合TAPS的蛋白质的溶液与珠子的悬浮液。例如，2至16小时作为被激活进入与氨基反应的状态的珠子的混合时间是优选的。
回收珠子，然后悬浮在洗涤溶液中，离心洗涤。洗涤溶液的例子包括磷酸盐缓冲溶液。为了储藏，洗涤珠子，将珠子悬浮在缓冲液中用于储藏并且进行储藏。用于储藏的缓冲液的例子包括可获得自Bio-Rad Laboratories,Inc的储藏缓冲液。用于更稳定储藏的弱酸性(优选pH6或更低，更优选pH2至5)缓冲液维持了结合TAPS的蛋白质的溶解度。
可以通过这些步骤生产抗体检测试剂。
之后，一方面，详细的描述了使用通过本发明的生产方法生产的抗体检测试剂(下文称为本发明的试剂)的抗体检测方法。
本发明的试剂可以是包含阳离子化的溶解性差的抗原蛋白质和珠子的抗体检测试剂。
从对象获得假设含有抗体的样品。可以使用体液作为样品。可以使用外周血、骨髓液、脐带血、胸膜液、腹水、尿等作为体液。考虑到易于收集和对象的负担小，优选使用外周血。收集的样品量优选是不使对象产生沉重负担的量。可以使用真空血液收集管、血液收集袋等，利用全血收集方法收集外周血。对于血液收集，可以添加肝素等从而预防凝血。
通过离心从收集的血液收集血浆。可选的，可以利用单采血液成分术装置(apheresis apparatus)，在血液成分收集的过程中获得血浆。
此外，可以收集外周血，通过去除血细胞组分和凝血组分来获得血清，并将其用作样品。
为了检测抗体，需要时稀释血浆或血清。
混合本发明的试剂与血浆。混合时间优选是约2小时，例如，用于在室温下反应，或者在4℃下反应过夜。使用离心方法或磁性装置回收本发明的试剂，并洗涤。
可能顾虑阳离子化影响抗原-抗体反应。在此情况下，可以简单地测试所述影响，因为可以用还原剂(如二硫苏糖醇)处理来删除阳离子化。
为了检测抗体，允许第二抗体结合抗体。在例如人对象的情况下，与本发明试剂结合的抗体是人抗体。因此，使用被标记的抗人抗体作为用于标记的第二抗体。其实例包括生物素化的抗人IgG小鼠单克隆抗体。
使用流式细胞仪检测与第二抗体结合的珠子。检测中可以使用其中珠子本身被染色的Bio-Plex(Bio-Rad Laboratories,Inc.)。在此情况下，可以对装置同时应用多种类型的珠子。因而可以通过一次操作分析多种类型的抗体。这可以缩短分析时间。
还可以使用本发明的试剂从其他液体样品中检测抗体，方式与上述段落所述相同，除了将血浆变为液体样品如血清以外。
根据上述实施方案，分析包含在对象血液中的抗体可能实现了下列情形：
-通过分析对象的体内抗体，确定对象的变应原反应性。
-通过在治疗前后进行的抗体分析，发现与治疗效果或治疗后的进展相关的抗体。使用由此发现的抗体作为指标，决定治疗方案或预测或确定预后。
-对于免疫细胞疗法，在治疗中使用在患者血清中检测到的特定抗体的抗原，从而改善治疗效果。
-在放射疗法前后，分析抗体，从而预测据报道涉及免疫功能(如，伴随远隔效应)的治疗效果。
尽管可以通过利用表位肽的抗体检测试剂获得上述效果，但是本发明的试剂的优点在于可以使用蛋白质。这是因为在不受对象的HLA类型的限制下，使用蛋白质允许检测抗体。其结果是，甚至可以分析HLA类型，所述类型一般被视为次要的，因而在表位肽分析中不太被理解。
实施例1
在下文中，将参考实施例详细的描述本发明。但是，理所当然的，本发明并非意在用这些实施例通过任何方式进行限制。
<针对MAGE-A4和WT-1的大规模培养和制备方法的研究>
首先，制备用于抗体检测的每种抗原蛋白质。
用2种类型的质粒DNA各自转化大肠杆菌T7 Express，所述质粒是克隆到pET28b载体中的融合了His标签的MAGE-A4(SEQ ID NO：16和17，抗原蛋白质序列：SEQ ID NO：3和4)和融合了His标签的WT-1(SEQ ID NO：14和15，抗原蛋白质序列：SEQ ID NO：1和2)。挑取在平板上形成的若干个菌落，然后加入到10mL的LB/Kan25培养基中，振荡培养2小时。
之后，将少量培养物加入到400mL的TB培养基中，在37℃下进一步培养。当细菌细胞浓度达到OD600＝0.7至0.8时，向其加入IPTG至终浓度0.5mM。在37℃进一步培养细胞3小时。
使用超声仪，在40mL裂解缓冲液(20mMTris-HCl(pH8.0)，50mMNaCl，5mM MgSO4和0.2％Tween20)中分散细菌细胞，并将其进一步均质化1分钟x3组。
向含有细菌细胞匀浆的溶液中，加入1μL强核酸酶Benzonase(HC)，将混合物静置在室温下约15分钟。
对于WT-1，离心(8krpm，10-15min，室温)回收沉淀物(内含体)，同时去除上清液。向回收的沉淀物加入50至100mL的RO水，使用超声仪重悬沉淀物，将其离心回收(8krpm，10-15min，室温)。
对于MAGE-A4，离心(8krpm，10-15min，室温)回收上清液。
<通过变性的沉淀级分的可逆的阳离子化方法溶解WT-1>
将沉淀物溶解在5至10mL的6M胍和0.1M Tris-HCl(pH8)+1mM EDTA中。在脱气和氮气取代之后，向其加入30mM DTT(固体)，再在37℃下处理约1小时。
向含有WT-1的溶液中，加入70mM TAPS-磺酸酯，再在37℃下处理约30分钟。
向含有WT-1和TAPS-磺酸酯的溶液中，加入量为其1/10的醋酸和0.1％PEI600，然后在4℃用Milli-Q水充分透析混合物。在透析后，实施SDS-PAGE。结果显示在图2中。用sup指示的泳道描述了由此透析的溶液的迁移。用ppt指示的泳道描述了在透析后作为不溶性级分获得的样品的迁移。用“还原的”指示的泳道描述了通过向样品添加还原剂而与TAPS分开的蛋白质的迁移。用“非还原的”指示的泳道描述了在不向样品添加还原剂的条件下，与TAPS结合的蛋白质的迁移。图2显示的SDS-PAGE分析结果证实了WT-1成功的与TAPS结合并溶解。
<使用Co2+柱His标签纯化MAGE-A4>
用溶液A(20mMTris-HCl(pH8.0)，50mMNaCl和0.2％Tween20)平衡Co2+柱。然后，MAGE-A4的上清液吸附到树脂上。然后，用溶液A彻底洗涤树脂。之后，向其注射30mL溶液A+5mM咪唑。在添加4mL溶液A+200mM咪唑后，静置柱子5分钟，接着蛋白质洗脱。重复该操作5次，回收纯化的MAGE-A4。
<TAPS与MAGE-A4的结合>
将亲和纯化的MAGE-A4加入到茄形瓶中，然后使用冷冻干燥器脱水，并溶解在3mL的6M胍和0.1M Tris-HCl(pH8)。在脱气和氮气取代之后，向其加入30mMDTT(固体)，再在37℃下处理约1小时。向含有MAGE-A4的溶液中加入70mM TAPS-磺酸酯，再在37℃下处理约30分钟。
向含有MAGE-A4和TAPS-磺酸酯的溶液中，加入量为其1/10的醋酸和0.1％PEI600，然后在4℃用Milli-Q水充分透析混合物。在透析后，实施SDS-PAGE。结果显示在图3中。
<HPLC纯化>
使用逆相HPLC纯化与TAPS结合的MAGE-A4和WT-1。层析图显示在图4和5中。
在HPLC后，通过SDS-PAGE分析与TAPS结合的MAGE-A4和WT-1。结果显示在图6中。分析结果证实了可以通过逆相HPLC纯化与TAPS结合的蛋白质，制备高纯度的抗原蛋白质。在洗脱时间50分钟至51分钟(图6中的“50min”泳道)时，回收级分MAGE-A4，而在洗脱时间52分钟至53分钟(图6中的“52min”泳道)时，回收级分WT-1。这些级分用于后续步骤。
用与WT-1相同的方法制备与His-标签融合的NY-ESO-1(SEQ ID NO：18和19，抗原蛋白质序列：SEQ ID NO：5和6)、XAGE1b(SEQ ID NO：20和21，抗原蛋白质序列：SEQ ID NO：7和8)、gp100(SEQ ID NO：22和23，抗原蛋白质序列：SEQ ID NO：9和10)、存活蛋白-2B(SEQID NO：24和25，抗原蛋白质序列：SEQ ID NO：11和12)。通过SDS-PAGE分析制备的蛋白质。结果显示在图7中。
<结合Bio-Plex COOH珠子(由Bio-Rad Laboratories,Inc.生产)>
使用Bio-Plex胺偶联试剂盒(由Bio-Rad Laboratories,Inc.生产)，将抗原固定在6种类型的Bio-Plex COOH珠子上(1/10的量(1.25×106珠子))。使用的所有抗原都是通过TAPS结合(每种11μg)溶解的变性状态的抗原。
将每种溶解的蛋白质溶解在缓冲液中，静置在冰上。
用涡旋混合器振荡COOH珠子的容器30秒，用超声悬浮珠子30秒。
14,000×g离心COOH珠子悬浮液4分钟，去除上清液。
向回收的沉淀物加入100μL珠子洗涤缓冲液。用涡旋混合器振荡混合物10秒，并且用超声悬浮珠子10秒。14,000×g离心COOH珠子悬浮液4分钟以去除上清液。
向回收的沉淀物加入80μL珠子活化缓冲液。用涡旋混合器充分振荡混合物30秒，并且用超声悬浮珠子30秒。
向COOH珠子悬浮液中加入10％的50mg/mL EDAC，然后加入10μL的50mg/mL S-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)。用涡旋混合器振荡COOH珠子悬浮液30秒。
同时，珠子避光，在旋转温箱中振荡COOH珠子悬浮液20分钟。
向COOH珠子悬浮液中加入150μL的PBS，用涡旋混合器振荡混合物10秒。14,000×g离心COOH珠子悬浮液4分钟以去除上清液。再次重复该操作。
向回收的沉淀物中加入100μL的PBS。用涡旋混合器振荡混合物30秒，并且用超声悬浮珠子15秒。
将COOH珠子悬浮液与结合了TAPS的蛋白质悬浮液混合。通过添加PBS将混合物的总量调节为500μL。
同时，珠子避光，在旋转温箱中室温振荡COOH珠子悬浮液2小时。
14,000×g离心含有COOH珠子和结合了TAPS的蛋白质的悬浮液4分钟，去除上清液。
通过添加500μL的PBS，洗涤作为沉淀回收的COOH珠子(上面固定了结合了TAPS的蛋白质)。14,000×g离心COOH珠子悬浮液4分钟，去除上清液。
通过添加250μL封闭缓冲液，将作为沉淀回收的COOH珠子重新悬浮。用涡旋混合器振荡COOH珠子悬浮液15秒。
使用铝箔将COOH珠子避光，同时在旋转温箱中室温振荡COOH珠子悬浮液30分钟。
14,000×g离心COOH珠子悬浮液4分钟，去除上清液。
通过添加500μL储藏缓冲液，将作为沉淀物回收的COOH珠子重新悬浮。16,000×g离心COOH珠子悬浮液6分钟，去除上清液.
将因而获得的与TAPS结合的蛋白质-固定化的珠子悬浮在150μL储藏缓冲液中，并储藏。表1显示了对各种类型珠子的浓度。
[表1]
实施例2
<分析包含在癌症患者-1的血清中的抗体>
从两名癌症患者(供体1和供体2)收集血液，从中获得血清。
以相同的浓度混合6种类型的其上分别固定了抗原蛋白质(NY-ESO-1、WT-1、MAGE-A4、XAGE1b、gp100和存活蛋白-2B)的磁珠，并分散在96孔板(Bio-Rad Laboratories,Inc.,#171-025001)的孔中。向每个孔加入各个患者的血清。同时，使用铝箔避光，室温振荡平板1小时进行反应。用Wash Station(Bio-Rad Laboratories,Inc.)洗涤珠子。为了检测抗体，向每个孔加入生物素化的抗人IgG(H+L)(由Vector Laboratories,Inc.生产，BA-3000)作为第二抗体。同时，使用铝箔避光，室温振荡平板30分钟进行反应。用Wash Station(Bio-Rad Laboratories,Inc.)洗涤珠子。向每个孔加入用(R-)藻红蛋白(PE)标记的链霉亲和素(Vector Laboratories,Inc.)。同时，使用铝箔避光，室温振荡平板10分钟进行反应。用Wash Station(Bio-Rad Laboratories,Inc.)洗涤珠子，并用Bio-Plex(Bio-RadLaboratories,Inc.)分析。将使用的各患者的血清稀释400倍、1600倍和6400倍。
如图8所示，证实了源自供体1的样品响应NY-ESO-1。
该结果提示：供体1的血液含有识别NY-ESO-1的抗体；供体1中的癌症表达NY-ESO-1；和使用NY-ESO-1的肽疫苗或DC疫苗疗法可能对供体1有效。
作为该测试的结果，证实了源自供体2的样品响应XAGE1b.
该结果提示：供体2的血液含有识别XAGE1b的抗体；供体2中的癌症表达XAGE1b；和使用XAGE1b的肽疫苗或DC疫苗疗法可能对供体2有效。
实施例3
<分析包含在癌症患者-2的血清中的抗体>
在EP-DC疗法前后，从8名肾细胞癌患者(供体2至供体9)获得血清。
EP-DC疗法指这样的治疗方法，涉及：通过冻融方法等从癌症患者手术移除的肿瘤组织中制备裂解物；将裂解物电动上样给树突细胞；向患者施用所制备的树突细胞疫苗。
以相同的浓度混合6种类型分别固定了抗原蛋白质的磁珠，并分散在96孔板(Bio-Rad Laboratories,Inc.,#171-025001)的孔中。向每个孔加入各个患者的血清。同时，使用铝箔避光，室温振荡平板1小时进行反应。用Wash Station(Bio-Rad Laboratories,Inc.)洗涤珠子。为了检测抗体，向每个孔加入生物素化的抗人IgG(H+L)(由VectorLaboratories,Inc.生产，BA-3000)作为第二抗体。同时，使用铝箔避光，室温振荡平板30分钟进行反应。用Wash Station(Bio-Rad Laboratories,Inc.)洗涤珠子。向每个孔加入PE标记的链霉亲和素(Vector Laboratories,Inc.)。同时，使用铝箔避光，室温振荡平板10分钟进行反应。用Wash Station(Bio-Rad Laboratories,Inc.)洗涤珠子，并用Bio-Plex(Bio-Rad Laboratories,Inc.)测定装置分析。将使用的各患者的血清稀释400倍、1600倍和6400倍。
如图9所示，证实了供体6和供体8的血清响应MAGE-A4。因此，供体6和供体8的血液含有识别MAGE-A4的抗体，提示了患者供体6和供体8的体内肿瘤组织可能表达MAGE-A4。在此情况下，使用MAGE-A4的肽疫苗或DC疫苗疗法可能对这些患者是适合的。
如图10所示，证实了与治疗前相比，DC疫苗治疗后的供体3的血清更高的响应WT-1。因此，供体3的血液含有识别WT-1的抗体，提示了供体3的肿瘤组织可能表达WT-1。在此情况下，使用WT-1的肽疫苗或DC疫苗疗法可能对该患者是适合的。
实施例4
<评估阳离子化试剂保护SH基的能力>
使用鸡蛋白溶菌酶(SEQ ID NO：13；下文也被简单的称为溶菌酶；由Kewpie Corp.生产)作为样品，评估阳离子化试剂保护SH基的能力。
称量15mg溶菌酶至100mL梨形瓶中，溶解于2mL的6M盐酸胍，0.1M Tris-HCl(pH8.5)和2mM EDTA中。在对得到的溶液脱气和氮气取代后，向其中加入二硫苏糖醇(DTT)至终浓度30mM，在37℃恒温箱浴中反应混合物2小时。向获得的还原的溶菌酶，加入各种阳离子化试剂(TAPS-磺酸酯(由Katayama Chemical,Ltd.生产)或TAP3S-磺酸酯)至终浓度70mM，再在室温反应2小时。通过加入得到的溶液量的1/10量的醋酸，终止反应。然后，用Milli-Q水在4℃透析溶液1天，从而获得与TAPS-结合的溶菌酶和与TAP3S结合的溶菌酶。根据日本专利申请号2010-070804.描述的方法合成使用的TAP3S-磺酸酯。
将与TAPS结合的、与TAP3S结合的、天然的和还原的溶菌酶经过逆相HPLC(高效液相色谱)。天然的溶菌酶在1个分子中含有4个SS键，并具有一定程度的亲水性，因为它的疏水基团没有暴露。还原的溶菌酶是变性的蛋白质，其SS键被还原，并具有最高的疏水性(在水中的溶解度最低)。使用的柱子是COSMOSIL Protein-R(由NacalaiTesque,Inc.生产)。使用的溶剂是用0.1％盐酸稀释的乙腈，乙腈浓度设为1％至50％。
概括了逆相HPLC图表的结果显示在图11中。直线代表乙腈的浓度。靠近左侧的峰表示样品较低的疏水性(在水中较高的溶解度)。与TAP3S结合的溶菌酶比天然溶菌酶和还原型溶菌酶更加亲水，并被低浓度的乙腈溶剂洗脱。然而，TAP3S难以保护和阳离子化溶菌酶中的所有8个SH基，并且由于被SH基部分未被保护的不完善产物污染而表现出峰分散。相反，在与TAPS结合的溶菌酶中，所有8个SH基都被保护和阳离子化，展现出高的均质性。TAPS和TAP3S之间这一保护SH基的能力差异归因于它们分子的大小。在保护蛋白质分子上有些密集的SH基的情况下，大的TAP3S分子产生了待阳离子化的蛋白质分子上的位阻，导致痕量的残余SH基不能结合TAP3S；因此，之后的SH/SS交换反应进展缓慢。
实施例5
<评估珠子的储藏稳定性>
当以这样的状态制备和储藏抗体检测试剂时，所述状态是其中蛋白质的SH基未被完全保护，未被保护的残余SH基可能会形成SS键，导致蛋白质聚集或抗体检测试剂聚集。因此，通过下列方法验证抗体检测试剂的储藏稳定性。
根据实施例1描述的方法，制备与TAPS结合的、与TAP3S结合的或天然的MAGE-A4，制备上面固定了每种蛋白质的珠子。
将制备的珠子悬浮在储藏缓冲液中，在4℃或37℃的条件下储藏。在经过给定时间后，使用血细胞计数器测量悬浮液中的珠子中的珠子聚集体的丰度。如下计算结果中显示的珠子聚集体的百分比：各自涉及3个或更多个珠子的聚集体数量/珠子总数×100。
图12显示了在4℃储藏5天、或在37℃储藏10天或41天的各种悬浮液中包含的珠子聚集体的百分比。在4℃储藏的情况下，相比储藏的天然MAGE-A4-固定化的珠子，储藏的与TAPS结合的或与TAP3S结合的MAGE-A4-固定化的珠子中的珠子聚集体的百分比减少。在37℃储藏的情况下，相比储藏的天然MAGE-A4-固定化的珠子，储藏的与TAPS结合的MAGE-A4-固定化的珠子中的珠子聚集体的百分比减少。
之后，将珠子储藏溶液进行SDS-PAGE，从而证实了珠子聚集体的百分比这一减少不是由于固定化的抗原蛋白质从珠子上释放。
固定在珠子上的MAGE-A4是N-末端His标签的。因此，通过使用抗His标签抗体(OGHis，由Medical&Biological Laboratories Co.,Ltd.(MBL)生产)的Western印迹，检测MAGE-A4-固定化的珠子储藏溶液中释放的MAGE-A4蛋白质。
结果显示在图13中。使用储藏了104天的与TAPS结合的MAGE-A4-固定化的珠子、与TAP3S结合的MAGE-A4-固定化的珠子和天然的MAGE-A4-固定化的珠子的储藏溶液作为样品，所述样品分别在泳道2、3和4中迁移。在所有这些样品中检测到相同水平的游离蛋白质，证实了不存在阳离子化促进抗原蛋白质从珠子上释放的现象。
此外，检测到结合的蛋白质是与Bio-Plex COOH珠子，储藏了104天的与TAPS结合的MAGE-A4-固定化的珠子，储藏了104天的与TAP3S结合的MAGE-A4-固定化的珠子，以及储藏了104天的天然MAGE-A4-固定化的珠子结合的。
将PBS中稀释为200ng/mL的抗His标签的抗体(OGHis，由Medical&BiologicalLaboratories Co.,Ltd.(MBL)生产)与每种类型的珠子在室温混合30分钟。然后，用PBS洗涤珠子2次。然后，将PBS中稀释为200ng/mL的抗小鼠IgG-Alexa488(第二抗体；InvitrogenCorp.)与每种类型的珠子在室温混合30分钟。然后，用PBS洗涤珠子2次。在共聚焦激光扫描荧光显微镜下观察这些珠子(激发光：488nm，荧光滤片LP505)，可见在珠子的表面上存在His标签的MAGE-A4蛋白质。采集的图像显示在图14中。所有的图像都是用相同的检测灵敏度采集的。如图14所示，证实了MAGE-A4蛋白质与所有的珠子表面结合。
实施例5的结果证实，通过本发明公开的用于生产抗体检测试剂的方法所制备的珠子比用天然蛋白质制备的珠子更有效的抑制了聚集体的形成。还证实了这一抑制聚集体形成的抑制不是由于抗原蛋白质从珠子表面的释放。一般已知对于蛋白质-增溶能力，TAP3S比TAPS优秀。但是，与该增溶能力不同，显示了TAPS中，制备的珠子的聚集抑制效果更好。
实施例6
<使用TAP-Br的蛋白质阳离子化>
将如上所述亲和纯化的XAGE1b或NY-ESO-1添加到茄形瓶中，然后用冷冻干燥器脱水，并溶解在3mL的6M胍和0.1M Tris-HCl(pH8)中。在脱气和氮气取代后，向其中加入30mMDTT(固体)，再在37℃处理约1小时。向含有XAGE1b或NY-ESO-1的溶液中加入70mM TAP-Br，再在37℃处理约60分钟。
向含有XAGE1b或NY-ESO-1和TAP-Br的溶液中加入其量1/10的醋酸，然后，用Milli-Q水在4℃充分透析混合物。通过逆相HPLC纯化与TAP结合的XAGE1b或NY-ESO-1。
通过实施例1描述的方法，制备上面分别固定了与TAP结合的XAGE1b、与TAPS结合的XAGE1b、与TAP结合的NY-ESO-1和与TAPS结合的NY-ESO-1的珠子。经验证，与TAP结合的抗原蛋白质也成功的固定在珠子上，和与TAPS结合的抗原蛋白质一样。
本文引用的所有出版物和专利都通过引用全文整合到本文中。
工业实用性
如上所述，可以通过使用本发明的生产方法有效的生产包含抗原蛋白质的抗体检测试剂。通过本发明的生产方法生产的抗体检测试剂经验证是高度稳定的，也能够有效的检测液体样品中的抗体。本发明的试剂的应用可以提供不受对象的HLA类型局限的抗体分析测试。该测试将能够实施，例如从而确定涉及免疫的疾病的治疗方案，或者从而预测或确定对疾病的治疗效果。

Claims (7)

1.用于生产包含阳离子化抗原蛋白质和磁珠载体的抗体检测试剂的方法，方法包括以下步骤：通过阳离子化溶解抗原蛋白质；以及使得阳离子化的抗原蛋白质与磁珠载体结合，
其中通过结合阳离子化剂与抗原蛋白质的巯基实施所述阳离子化，并且所述阳离子化剂选自TAPS‐磺酸酯、TAP3S‐磺酸酯和TAP‐Br中的任一项。
2.根据权利要求1的用于生产抗体检测试剂的方法，其中所述抗原蛋白质是全长蛋白质。
3.根据权利要求1的用于生产抗体检测试剂的方法，其中所述抗原蛋白质是膜蛋白。
4.根据权利要求1的用于生产抗体检测试剂的方法，其中所述抗原蛋白质是癌症抗原蛋白质。
5.根据权利要求1至4的任一项的方法生产的抗体检测试剂。
6.用于检测包含在样品中的抗原特异性抗体的方法，方法包括以下步骤：将根据权利要求5的抗体检测试剂与样品接触；向其加入与抗体结合的被标记的第二抗体以允许第二抗体与抗体结合；回收抗体检测试剂；以及检测与抗体结合的抗体检测试剂。
7.根据权利要求6的方法，其中所述样品是分离的体液。
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