CN114137206A - 用于检测伏马毒素的胶体金试纸条、试剂盒及检测方法 - Google Patents

用于检测伏马毒素的胶体金试纸条、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及检测制剂领域，具体讲，涉及一种用于检测伏马毒素的胶体金试纸条，试剂盒及检测方法。胶体金检测制剂包括胶体金试纸条和酶联反应孔，胶体金试纸条包括样品垫、NC膜、吸收垫，NC膜上设置有T线和C线；酶联反应孔中冻干保存有伏马毒素单克隆抗体标记的胶体金；T线处包被有伏马毒素完全抗原，用于竞争结合所述伏马毒素单克隆抗体标记的胶体金；T线由T线抗原划线液制备而成；C线处包被有羊抗小鼠抗体，用于捕获未结合的所述伏马毒素单克隆抗体标记的胶体金。本发明的伏马毒素胶体金试纸条，通过手持式读卡器在15min实现对伏马毒素Fb1的定量检测，具有线性范围宽、检测限低、灵敏度高的技术优势。

Description

用于检测伏马毒素的胶体金试纸条、试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及检测制剂领域，具体讲，涉及一种用于检测伏马毒素的胶体金试纸条，试剂盒及检测方法。
背景技术
伏马毒素是一种串珠镰刀菌真菌分泌的毒性很强的次生代谢物，主要污染玉米，是玉米中及其制品中最常见的霉菌毒素，目前发现的伏马毒素有11种，其中FB1污染范围最大，毒性最强，因此对于其的检测具有较为重要的意义。伏马毒素可导致马的白脑软化症和猪肺水肿，具有致癌性、肝毒性、肾毒性以及胚胎毒性。
检测伏马毒素的方法主要基于色谱法(高效液相色谱、高效液相色谱-串联质谱法、气相色谱-串联质谱法)和免疫学方法。基于色谱学的方法具有灵敏度高等优点，但是所需仪器昂贵、需要专业人员，不能够满足现场的快速检测需要。免疫层析技术是以试纸条为载体，利用抗原抗体特异性结合进行可视化检测的方法。通常针对小分子污染物的检测采用免疫竞争的原理，将含有分析物的提取液与胶体金标记的抗体进行孵育，之后添加到样品垫上，液体在毛细管作用下先后经过检测限(T线)和质控线(C线)，根据目标物浓度的不同在T线呈现不同的颜色。从而达到对目标物定性或定量检测的目的。由于免疫层析方法具有简单、快速、特异性强、灵敏度高等优点，被广泛用于食品中有毒有害小分子污染物的快速检测中。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的首要发明目的在于提供一种检测伏马毒素的胶体金试纸条。
本发明的第二发明目的在于提供检测伏马毒素的试剂盒。
本发明的第三发明目的在于提供检测伏马毒素的检测方法。
为了完成本发明的发明目的，采用的技术方案为：
本发明提出一种用于检测伏马毒素的胶体金检测制剂，所述胶体金检测制剂包括胶体金试纸条和酶联反应孔，所述胶体金试纸条包括样品垫、NC膜、吸收垫，所述NC膜上设置有T线和C线；其特征在于：
所述酶联反应孔中冻干保存有伏马毒素单克隆抗体标记的胶体金；伏马毒素单克隆抗体标记的胶体金中伏马毒素单克隆抗体的标记量为9～15μg/mL、优选为12μg/mL；
所述T线处包被有伏马毒素完全抗原，用于竞争结合所述伏马毒素单克隆抗体标记的胶体金；所述T线由T线抗原划线液制备而成，所述T线抗原划线液中伏马毒素完全抗原的浓度为1.2～1.8mg/mL；
所述C线处包被有羊抗小鼠抗体，用于捕获未结合的所述伏马毒素单克隆抗体标记的胶体金。
可选的，所述伏马毒素单克隆抗体标记的胶体金的制备方法：
S1、制备胶体金溶液；
S2、取OD值为1的胶体金溶液1mL，调整pH至8.5，加入9～15μg、优选为12μg/mL的伏马毒素单克隆抗体，混匀，封闭，离心，加入洗金缓冲液，复溶沉淀，离心，最后加入重悬上样液重悬；得到所述伏马毒素单克隆抗体标记的胶体金。
可选的，所述洗金缓冲液中含有质量百分比浓度为0.2～1％的BSA、质量百分比浓度为1～10％的蔗糖、质量百分比浓度为0.5～2％的吐温-20、10mM的Tris缓冲液；pH为9.0；
所述重悬上样液中含有质量百分比浓度为1～3％的BSA、质量百分比浓度为1～3％的蔗糖、质量百分比浓度为5～10％的果糖、质量百分比浓度为1～3％的PEG6000、质量百分比浓度为0.5～2％的Brij35、0.1M的PB溶液，pH为6.5。
可选的，在S1中，所述胶体金采用氯金酸：柠檬酸钠的质量比1：1.5～1.8制备得到；
优选的，所述胶体金采用氯金酸：柠檬酸钠的质量比1：1.7制备得到。
可选的，所述T线抗原划线液为含有体积比为5～20％甲醇的、浓度为50～100mM的PB缓冲液；
优选的，所述T线抗原划线液为含有体积比为10％甲醇的浓度为100mM的PB缓冲液；
更优选的，所述T线抗原划线液的pH值为6.5。
可选的，所述C线抗体划线液中含有0.1～0.3mg/mL的羊抗小鼠抗体，优选为0.3mg/mL；
更优选的，C线抗体划线液为含有0.1～0.3mg/mL羊抗小鼠抗体、质量百分比浓度为2.5％的蔗糖、50mM的PB溶液。
可选的，所述伏马毒素完全抗原采用伏马毒素半抗原采用EDC法与BSA偶联得到。
本发明提出一种用于检测伏马毒素的试剂盒，所述试剂盒中含有上述的胶体金检测制剂，所述试剂盒中还含有样本处理液、伏马毒素标准品和样品稀释液；
所述样本处理液为体积百分比浓度为80％甲醇水溶液；
所述样品稀释液为含有质量百分比浓度为0.5％的吐温-20的10mM的Tris溶液，pH为6.5。
本发明提出一种伏马毒素的检测方法，采用上述的试剂盒进行检测，至少包括以下步骤：
S1、对待测样本加入所述样本处理液，得混合物；
S2、将所述混合物离心，取上清用所述样品稀释液稀释，得到待测液；
S3、在酶联反应孔加入200μL待测液，35～38℃条件下孵育5～8min，将孵育得到的液体滴加于所述胶体金试纸条的样品垫上，或将所述胶体金试纸条插入所述酶联反应孔中，通过手持式读卡器测定显色值。
可选的，所述待测样本选自食用油或粮食作物制备的粉状物。
本发明至少具有以下有益的效果：
本发明的伏马毒素胶体金试纸条，通过手持式读卡器在15min实现对伏马毒素Fb1的定量检测，具有线性范围宽、检测限低、灵敏度高的技术优势。具体的，在食用油加标回收检测中；其检测伏马毒素的样品的线性范围为：27.85～891.44μg/kg，检出限为：15.62μg/kg；在玉米粉的加标回收检测中检测伏马毒素的线性范围为：0.588～7.913mg/kg，检出限为：0.363mg/kg，可以满足日常的检测需求。
附图说明
图1实施例1制备的胶体金的紫外光谱图；
图2实施例2制备的完全抗原的紫外光谱图；
图3实施例2制备的完全抗原的SDS-PAGE电泳图；
图4为实验例1中试纸条的显色效果图；
图5为实验例1中读卡器检测显色值的柱状对比图；
图6为不同抗原浓度的抗原划线液显色效果的柱状对比图；
图7为不同甲醇浓度的抗原划线液的显色效果图；
图8为不同甲醇浓度的抗原划线液的显色效果的柱状对比图；
图9为不同离子强度的抗原划线液的显色效果图；
图10为不同离子强度的显色效果的柱状对比图；
图11为不同pH的抗原划线液的显色效果图；
图12为不同pH的显色效果的柱状对比图；
图13为不同吐温-20浓度的抗原划线液的显色效果图；
图14为不同pH值的样品稀释液的显色效果图；
图15为检测玉米粉样品的工作曲线；
图16为检测玉米粉样品的线性范围曲线；
图17为检测食用油样品工作曲线图；
图18为检测食用油样品线性范围曲线。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提出一种用于检测伏马毒素的胶体金检测制剂，胶体金检测制剂包括胶体金试纸条和酶联反应孔，胶体金试纸条包括样品垫、NC膜、吸收垫，所述NC膜上设置有T线和C线；酶联反应孔中冻干保存有伏马毒素单克隆抗体标记的胶体金；伏马毒素单克隆抗体标记的胶体金中伏马毒素单克隆抗体的标记量为9～15μg/mL、优选为12μg/mL；如果伏马毒素单克隆抗体的标记量过大或者过小，都会引起显色效果不佳的现象。
T线处包被有伏马毒素完全抗原，用于竞争结合所述伏马毒素单克隆抗体标记的胶体金；T线由T线抗原划线液制备而成，T线抗原划线液中伏马毒素完全抗原的浓度为1.2～1.8mg/mL；如果伏马毒素完全抗原的标记量过大或者过小，都会引起显色效果不佳的现象。
C线处包被有羊抗小鼠抗体，用于捕获未结合的伏马毒素单克隆抗体标记的胶体金。
本发明实施例的用于检测伏马毒素的胶体金检测制剂可对伏马毒素Fb1的定量检测，具有线性范围宽、检测限低、灵敏度高的技术优势。
在本发明实施例的某一具体实施方式中，伏马毒素单克隆抗体标记的胶体金的制备方法：
S1、制备胶体金溶液；
S2、取OD值为1的胶体金溶液1mL，调整pH至8.5，加入9～15μg、优选为12μg/mL的伏马毒素单克隆抗体，混匀，封闭，离心，加入洗金缓冲液，复溶沉淀，离心，最后加入重悬上样液重悬；得到伏马毒素单克隆抗体标记的胶体金。
为本发明实施例的一种改进，洗金缓冲液用于制备金标抗体过程中重悬胶体金，洗金缓冲液中含有质量百分比浓度为0.2～1％的BSA、质量百分比浓度为1～10％的蔗糖、质量百分比浓度为0.5～2％的吐温-20、10mM的Tris缓冲液；优选的，含有质量百分比浓度为0.5％的BSA、质量百分比浓度为5％的蔗糖、质量百分比浓度为1％的吐温-20、10mM的Tris缓冲液；pH为9.0。
作为本发明实施例的一种改进，用于最后一次重悬金标抗体，含有质量百分比浓度为1～3％的BSA、质量百分比浓度为1～3％的蔗糖、质量百分比浓度为5～10％的果糖、质量百分比浓度为1～3％的PEG6000、质量百分比浓度为0.5～2％的Brij35、0.1M的PB溶液；优选的，含有质量百分比浓度为2％的BSA、质量百分比浓度为2％的蔗糖、质量百分比浓度为8％的果糖、质量百分比浓度为2％的PEG6000、质量百分比浓度为1％的Brij35、0.1M的PB溶液，pH为6.5。
作为本发明实施例的一种改进，在S1中，所述胶体金采用氯金酸：柠檬酸钠的质量比1：1.5～1.8制备得到；优选的，胶体金采用氯金酸：柠檬酸钠的质量比1：1.7制备得到。
作为本发明实施例的一种改进，T线抗原划线液为含有体积比为5～20％甲醇的、浓度为50～100mM的PB缓冲液；优选的，T线抗原划线液为含有体积比为10％甲醇的浓度为100mM的PB缓冲液；更优选的，所述T线抗原划线液的pH值为6.5。
根据筛选试验发现，如果甲醇的浓度过大或者过小，则影响显色效果；如果PB缓冲液的浓度过大或者过小，则影响显色效果；如果T线抗原划线液的pH值过大或者过小，则影响显色效果。
作为本发明实施例的一种改进，C线抗体划线液中含有0.1～0.3mg/mL的羊抗小鼠抗体，优选为0.3mg/mL；更优选的，C线抗体划线液为含有0.1～0.3mg/mL羊抗小鼠抗体、质量百分比浓度为2.5％的蔗糖、50mM的PB溶液。
作为本申请实施的一种改进，伏马毒素完全抗原采用伏马毒素半抗原采用EDC法与BSA偶联得到。
本发明实施例还提出一种用于检测伏马毒素的试剂盒，试剂盒中含有上述胶体金检测制剂，试剂盒中还含有样本处理液、伏马毒素标准品和样品稀释液；样本处理液为体积百分比浓度为80％甲醇水溶液；样品稀释液为含有质量百分比浓度为0.5％的吐温-20的10mM的Tris溶液，pH为6.5。
根据筛选试验发现，如果吐温-20的浓度过大，影响层析效果；如果pH过大或者过小，则影响显色效果。
本发明实施例还提出一种伏马毒素的检测方法，采用上述试剂盒进行检测，至少包括以下步骤：
S1、对待测样本加入样本处理液，得混合物；待测样本可选自食用油或粮食作物制备的粉状物；样本处理液为体积百分比浓度为80％甲醇水溶液；
S2、将混合物离心，取上清用样品稀释液稀释，上清和样品稀释液的体积比为1：5～10，优选1：6；样品稀释液为含有质量百分比浓度为0.5％的吐温-20的10mM的Tris溶液，pH为6.5得到待测液；
S3、在酶联反应孔加入200μL待测液，35～38℃条件下孵育5～8min，将孵育得到的液体滴加于所述胶体金试纸条的样品垫上，或将胶体金试纸条插入酶联反应孔中，通过手持式读卡器测定显色值。
主要实验试剂：FB1标准品，氯金酸、柠檬酸钠、碳酸钠购于天津渤化试剂，牛血清白蛋白、SDS购自索莱宝(北京)生物技术有限公司；FB1单克隆抗体购自天津浩泰生物技术有限公司；Sartorius-95硝化棉(NC)膜、样品垫、吸水纸、玻璃纤维和聚氯乙烯衬底均购自上海洁一生物科技有限公司。所有其他化学品均为分析级，来自中国上海国药化学试剂有限公司。采用Mill-Q纯化的超纯水(18.2MΩcm-1)制备相关溶液。
实施例1伏马毒素单克隆抗体-胶体金标记物的制备
(一)胶体金纳米颗粒的制备
采用油浴法制备胶体金，准确称取99mL超纯水倒入三角瓶中，放入圆柱形转子，将油温设置到180℃，待油温稳定后将三角瓶浸入油中，降低油浴温度至150℃，加入1mL1wt％氯金酸，打开搅拌，速度为600rpm左右，使氯金酸稀释均匀，待其保持微沸状态时，调节转速至2档。再快速加入1wt％柠檬酸钠1.7mL，待溶液变为紫色时继续保持15min加热，后关掉油浴加热装置，继续相同转速保持10min。完成后将三角瓶抬出到油面上方，继续保持低速搅拌，使其加速冷却，10min后将三角瓶取出使其自然冷却，胶体金倒入量筒中，超纯水定容至100mL。
结果可知，制备的胶体金外观呈深红色，澄清度较佳，通过紫外分光光度计鉴定，其最大吸光度为522nm，峰宽约50nm，如图1所示。
(二)伏马毒素单克隆抗体-胶体金标记物的制备
取1mL胶体金，加入0.1M碳酸钠20μL调整pH至8.5左右，加入12μg单抗，混匀30min，加入10wt％BSA 120μL，封闭15min，10000rpm离心15min，弃上清，加入洗金缓冲液1mL，复溶沉淀，继续8000rpm离心15min，重复2次，最后加入重悬上样液200μL抗体稳定液重悬。
洗金缓冲液的配方为：0.5wt％BSA+5wt％蔗糖+1wt％吐温-20+10mM Tris；pH为9.0；
重悬上样液的配方为：2wt％BSA+2wt％蔗糖+8wt％果糖+2wt％PEG6000+1wt％Brij35+0.1M PB，pH为6.5。
实施例2伏马毒素完全抗原的制备
采用EDC方法制备伏马毒素完全抗原，制备方法如下：
称取2mg FB1，2mg EDC、3mg BSA，分别用0.5mL、0.5mL、1mL的10mM PBS溶解为A溶液、B溶液、C溶液，磁力搅拌下首先将B溶液逐渐滴加到A溶液，反应5min使FB1得到充分活化，再将C溶液逐滴加入，4℃避光条件下磁力搅拌3h，反应产物透析3d，5000rpm离心5min取上清，偶联蛋白FB1-BSA制备完成。
同时用OVA替代EDC，采用上述方法进行制备，得到FB1-OVA。采用紫外分光光度计以及SDS-PAGE电泳对合成的完全抗原进行鉴定，实验结果如图2、图3所示。由图2可见，由于FB1无紫外特征峰，偶联物与载体蛋白对比不明显；由图3可知，电泳结果显示，偶联物与载体蛋白相比，条带均向上偏移，说明完全抗原制备成功。
实施例3
采用实施例1和实施例2制备得到的原料制备试纸条，具体方法为：
1、配制T线抗原划线液：含有1.5mg/mL的伏马毒素完全抗原(伏马毒素-BSA偶联物)、质量百分比浓度为0.5％的PEG20000的100mM的PB缓冲液，pH值为6.2；
2、配制C线抗体划线液：含有0.3mg/mL羊抗小鼠抗体，用PBS溶液稀释。pH值为7.4。
3、配制样品稀释液：含有质量百分比含量为0.05％PEG6000、质量百分比含量为5％蔗糖的浓度为20mM的PB溶液，pH为6.2。
4、取酶联反应孔，每孔加入实施例1制备的伏马毒素单克隆抗体-胶体金标记物，伏马毒素单克隆抗体-胶体金标记物与上样重悬液的体积比1：6，冷冻真空干燥后备用；上样重悬液的组成为含有质量百分比含量为0.05％PEG6000、质量百分比含量为5％蔗糖的浓度为20mM的PB溶液，pH为6.2。
5、将T线抗原划线液、C线抗体划线液分别划线包被到NC膜上，划线流量均为1μL/cm，T线与C线的距离5mm。将划好的NC膜放入烘箱37℃烘干4h，取出，取出粘贴在PVC底板上，粘贴样品垫、结合垫、NC膜、吸水垫。具体粘贴方法：首先粘贴NC膜，再将结合垫粘贴在NC膜下端，与NC膜重叠2mm，随即粘贴样品垫在结合垫下端，同样与NC膜重叠2mm；取吸水垫粘贴到NC膜上方，与NC膜重叠2mm，将上述的材料压紧后裁成3.5mm宽的试纸条，装入检测卡槽内备用。
试纸条的使用方法为：
S1、对待测样本加入伏马毒素标准品，然后加入样本处理液，得混合物；样本处理液为体积百分比浓度为80％甲醇水溶液；
S2、将混合物离心，取100μL上清，用样品稀释液稀释，上清和样品稀释液的体积比为1：5～10，优选1：6；得到待测液；
S3、在酶联反应孔加入待测液100μL，35～38℃条件下孵育5～8min，将孵育得到的液体滴加于胶体金试纸条的样品垫上，通过手持式读卡器测定显色值。
实验例1
取1mL胶体金，加入0.1M碳酸钠20μL调整pH至8.5左右，分别加入6μg、9μg、12μg、15μg的伏马毒素单克隆抗体，混匀30min，加入10％BSA 120μL，封闭15min，10000rpm离心15min，弃上清，加入洗金稳定液1mL，复溶沉淀，继续8000rpm离心15min，重复2次，最后加入200μL重悬上样液重悬，冻干，获得伏马毒素单克隆抗体标记的胶体金冻干粉A1～A4。
取伏马毒素单克隆抗体标记的胶体金冻干粉A1～A4，每种6份，其中3份分别加入阳性测试液(含50ng/mL的伏马毒素)200μL、3份分别加入阴性测试液(蒸馏水)200μL，溶解冻干粉，室温孵育5min后插入试纸，计时6min，取出后通过手持式读卡器检测显色值。
得到的实验结果如图4和图5所示。图4为试纸条的显色效果(200μL)，图5为读卡器检测显色值的柱状对比图。
如图4、图5所示，在随着抗体浓度的增加，T线上固定的胶体金含量逐渐增高，红色增强，同时在添加竞争小分子500ppb的FB1的试纸条中，固定在T线的金标抗体浓度相对较低，说明出现了较为明显的竞争反应。由结果可以看出用12μg抗体标记的胶体金，其不添加FB1与添加500ppb的FB1之间的差值最大，说明在此浓度的抗体标记具有较好的竞争以及显色效果。
实验例2 FB1试纸抗原划线浓度优化
将伏马毒素-牛血清白蛋白偶联物包被到T线上构成检测线，将羊抗小鼠抗体包被在C线上构成质控线。为了提高试纸条的灵敏度与稳定性，对T线抗原划线液中抗原的浓度进行优化。按照实施例3的方法制备试纸条，区别在于，区别在于改变抗原划线中抗原的浓度分别为0.9、1.2、1.5、1.8mg/mL。获得试纸条B1～B4。
取实施例1制备的胶体金冻干粉2份，其中1份加入阳性测试液(含50ng/mL的伏马毒素)200μL、1份加入阴性测试液(蒸馏水)200μL，溶解冻干粉，室温孵育5min后插入试纸条B1～B4；计时6min，取出后通过手持式读卡器检测显色值。实验结果如图6所示。图6为不同抗原浓度的抗原划线液显色效果的柱状对比图。
如图6所示，抗原划线浓度在1.2mg/mL～1.8mg/mL显色结果差异不大。综合成本考虑，后续实验先采用1.2mg/mL的抗原浓度进行后续实验。
实验例3 FB1试纸抗原划线液中甲醇浓度优化
为了提高抗原在NC膜上的偶联效率，可通过调整划线液中的甲醇浓度来调节抗原的静电吸附性能。
按照实施例3的方法进行制备，区别在于改变抗原划线中甲醇的浓度。调整抗原划线液中的甲醇为0％、5％、10％、15％、20％，获得试纸条C1～C5。
通过检测T线上的中金标抗体的显色程度，确定最佳甲醇浓度。取实施例1制备的胶体金冻干粉2份，其中1份加入阳性测试液(含50ng/mL的伏马毒素)200μL、1份加入阴性测试液(蒸馏水)200μL，溶解冻干粉，室温孵育5min后插入试纸条C1～C5，每种3支；计时6min，取出后通过手持式读卡器检测显色值。实验结果如图7和图8所示。
图7为不同甲醇浓度的抗原划线液的显色效果图，图8为不同甲醇浓度的抗原划线液的显色效果的柱状对比图。
由图7、图8可知，在甲醇浓度为10％的时候，金标抗体中未添加FB1与添加50ppb层析的试纸条中，其差值最大，因此后续实验采用10％的甲醇浓度用于抗原划线液。
实验例4 FB1试纸抗原划线液中离子强度优化
为了提高抗原在NC膜上的偶联效率，通过调整划线液中的离子强度来调节抗原的静电吸附性能。
按照实施例3的方法进行制备，区别在于改变抗原划线中的离子强度分别为25mM、50mM、75mM、100mM。获得试纸条D1～D5。
通过检测T线上的中金标抗体的显色程度，确定最佳离子强度。取实施例1制备的胶体金冻干粉2份，其中1份加入阳性测试液(含50ng/mL的伏马毒素)200μL、1份加入阴性测试液(蒸馏水)200μL，溶解冻干粉，室温孵育5min后插入试纸条D1～D5，每种3支；计时6min，取出后通过手持式读卡器检测显色值。实验结果如图9和图10所示。其中，图9为不同离子强度的抗原划线液的显色效果图，图10为不同离子强度的显色效果的柱状对比图。
由图9、图10可知，在离子强度为100mM的时候，金标抗体中未添加FB1与添加50ppb层析的试纸条中，其差值最大，因此后续实验采用100mM的PB缓冲液用于抗原划线液。
实验例5 FB1试纸抗原划线液中pH值优化
划线液pH值对于抗原的吸附能力的改变对于T线显色效果会产生一定的影响，为了提高显色效果，按照实施例3的方法进行制备，区别在于改变抗原划线中的pH值分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，获得试纸条E1～E6。
取实施例1制备的胶体金冻干粉2份，其中1份加入阳性测试液(含50ng/mL的伏马毒素)200μL、1份加入阴性测试液(蒸馏水)200μL，溶解冻干粉，室温孵育5min后插入试纸条E1～E6，每种3支；计时6min，取出后通过手持式读卡器检测显色值。实验结果如图11和图12所示。其中图11为不同pH的抗原划线液的显色效果图，图12为不同pH的显色效果的柱状对比图。由图11、图12可知，在pH为6.5的时候，金标抗体中未添加FB1与添加50ppb层析的试纸条中，其差值最大，因此后续实验采用pH为6.5的缓冲液用于抗原划线液。
实验例6样品稀释液成分配方优化
为了提高样品中伏马毒素的提取效率以及层析效果，样品稀释液成分中的吐温-20浓度以及pH的浓度进行优化。
按照实施例3的方法进行制备配制样品稀释液，区别在于改变样品稀释液中的吐温-20的添加量。调整吐温-20添加量从0.5％、1％、1.5％、2％。获得样品稀释液F1～F4。
取实施例1制备的胶体金冻干粉4份，分别加入样品稀释液F1～F4，溶解冻干粉，加入阳性测试液(含50ng/mL的伏马毒素)200μL，室温孵育5min后插入试纸条，每种6支；计时6min，取出后通过手持式读卡器检测显色值。
实验结果如图13所示。由图13可知，当吐温-20添加量为0.5％时，没有出现卡膜的情况，吐温-20浓度继续提高到2％时，样品垫预NC膜覆盖处出现了卡膜的情况，说明过高的吐温-20添加影响层析效果，故最适吐温-20添加量为0.5％。
按照实施例3的方法配制样品稀释液，区别在于调整样品稀释液的pH为6.5、7、7.5。获得样品稀释液F5～F7。实验结果如图14所示。图14为不同pH值的样品稀释液的显色效果图。
由图14可知，最佳显色效果样品稀释液pH 6.5组，没有出现卡膜的情况。
实验例7食用油、玉米粉加标标准曲线的建立
采用实施例3的试剂盒进行检测。
称量5g玉米粉，加入10mL 80％甲醇水溶液，加入不同浓度的伏马毒素标准品溶液，震荡5min，3500rpm离心5min，取上清100μL加入600μL样品稀释液稀释，取胶体金冻干粉，分别加入200μL样品液溶解冻干粉，室温孵育5min后插入试纸，计时6min，取出检测显色值。得到的实验结果如图15、16所示。
图15为检测玉米粉样品的工作曲线，图16为检测玉米粉样品的线性范围曲线。如图15、图16所示，检测伏马毒素的线性范围为：0.588～7.913mg/kg，检出限为：0.363mg/kg。
称取5g食用油，加入10mL 80％甲醇水溶液，加入不同浓度的伏马毒素标准品溶液，震荡5min，3500rpm离心5min，取上清100μL加入600μL样品稀释液稀释，取胶体金冻干粉，分别加入200μL样品液溶解冻干粉，室温孵育5min后插入试纸，计时6min，取出检测显色值。得到的实验结果如图17、18所示。其中，图17为检测食用油样品工作曲线图，图18为检测食用油样品线性范围。
如图17、图18所示，其检测伏马毒素的样品的线性范围为：27.85～891.44μg/kg，检出限为：15.62μg/kg。
本申请虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本申请构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本申请的保护范围应当以本申请权利要求所界定的范围为准。

Claims (10)

1.一种用于检测伏马毒素的胶体金检测制剂，所述胶体金检测制剂包括胶体金试纸条和酶联反应孔，所述胶体金试纸条包括样品垫、NC膜、吸收垫，所述NC膜上设置有T线和C线；其特征在于：
所述酶联反应孔中冻干保存有伏马毒素单克隆抗体标记的胶体金；所述伏马毒素单克隆抗体标记的胶体金中伏马毒素单克隆抗体的标记量为9～15μg/mL、优选为12μg/mL；
所述T线处包被有伏马毒素完全抗原，用于竞争结合所述伏马毒素单克隆抗体标记的胶体金；所述T线由T线抗原划线液制备而成，所述T线抗原划线液中伏马毒素完全抗原的浓度为1.2～1.8mg/mL；
所述C线处包被有羊抗小鼠抗体，用于捕获未结合的所述伏马毒素单克隆抗体标记的胶体金。
2.根据权利要求1所述的所述胶体金检测制剂，其特征在于，所述伏马毒素单克隆抗体标记的胶体金的制备方法：
S1、制备胶体金溶液；
S2、取OD值为1的胶体金溶液1mL，调整pH至8.5，加入9～15μg、优选为12μg/mL的伏马毒素单克隆抗体，混匀，封闭，离心，加入洗金缓冲液，复溶沉淀，离心，最后加入重悬上样液重悬；得到所述伏马毒素单克隆抗体标记的胶体金。
3.根据权利要求2所述的胶体金检测制剂，其特征在于：所述洗金缓冲液中含有质量百分比浓度为0.2～1％的BSA、质量百分比浓度为1～10％的蔗糖、质量百分比浓度为0.5～2％的吐温-20、10mM的Tris缓冲液；pH为9.0；
所述重悬上样液中含有质量百分比浓度为1～3％的BSA、质量百分比浓度为1～3％的蔗糖、质量百分比浓度为5～10％的果糖、质量百分比浓度为1～3％的PEG6000、质量百分比浓度为0.5～2％的Brij35、0.1M的PB溶液，pH为6.5。
4.根据权利要求2所述的胶体金检测制剂，其特征在于：在S1中，所述胶体金采用氯金酸：柠檬酸钠的质量比1：1.5～1.8制备得到；
优选的，所述胶体金采用氯金酸：柠檬酸钠的质量比1：1.7制备得到。
5.根据权利要求1所述的所述胶体金检测制剂，其特征在于，
所述T线抗原划线液为含有体积比为5～20％甲醇的、浓度为50～100mM的PB缓冲液；
优选的，所述T线抗原划线液为含有体积比为10％甲醇的浓度为100mM的PB缓冲液；
更优选的，所述T线抗原划线液的pH值为6.5。
6.根据权利要求1所述的所述胶体金检测制剂，其特征在于，
所述C线抗体划线液中含有0.1～0.3mg/mL的羊抗小鼠抗体，优选为0.3mg/mL；
更优选的，C线抗体划线液为含有0.1～0.3mg/mL羊抗小鼠抗体、质量百分比浓度为2.5％的蔗糖、50mM的PB溶液。
7.根据权利要求1所述的所述胶体金检测制剂，其特征在于，所述伏马毒素完全抗原采用伏马毒素半抗原采用EDC法与BSA偶联得到。
8.一种用于检测伏马毒素的试剂盒，所述试剂盒中含有如权利要求1～7任一项所述的胶体金检测制剂，其特征在于，所述试剂盒中还含有样本处理液、伏马毒素标准品和样品稀释液；
所述样本处理液为体积百分比浓度为80％甲醇水溶液；
所述样品稀释液为含有质量百分比浓度为0.5％的吐温-20的10mM的Tris溶液，pH为6.5。
9.一种伏马毒素的检测方法，其特征在于，采用权利要求8所述的试剂盒进行检测，至少包括以下步骤：
S1、对待测样本加入所述样本处理液，得混合物；
S2、将所述混合物离心，取上清用所述样品稀释液稀释，得到待测液；
S3、在酶联反应孔加入200μL待测液，35～38℃条件下孵育5～8min，将孵育得到的液体滴加于所述胶体金试纸条的样品垫上，或将所述胶体金试纸条插入所述酶联反应孔中，通过手持式读卡器测定显色值。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，
所述待测样本选自食用油或粮食作物制备的粉状物。
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Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101149380A (zh) * 2007-11-07 2008-03-26 湖南大学 一种用于检测血吸虫的硝酸纤维素膜及制备方法和应用
CN101661043A (zh) * 2009-09-27 2010-03-03 上海交通大学 用胶体金免疫层析试验检测伏马毒素的方法
CN102183634A (zh) * 2011-03-04 2011-09-14 河北省兽药监察所 快速检测四种硝基呋喃类药物的免疫纳米金试纸条
CN102520179A (zh) * 2011-12-07 2012-06-27 上海交通大学 定量检测伏马毒素b1的方法
CN106771213A (zh) * 2016-11-29 2017-05-31 百奥森（江苏）食品安全科技有限公司 一种伏马毒素检测方法
CN109374907A (zh) * 2018-10-10 2019-02-22 北京纳百生物科技有限公司 一种黏菌素胶体金检测试剂盒及其应用
CN111175511A (zh) * 2020-01-03 2020-05-19 华南农业大学 一种呕吐毒素荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用
CN113640522A (zh) * 2021-09-02 2021-11-12 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 用于检测t-2毒素的胶体金试纸条，试剂盒及检测方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101149380A (zh) * 2007-11-07 2008-03-26 湖南大学 一种用于检测血吸虫的硝酸纤维素膜及制备方法和应用
CN101661043A (zh) * 2009-09-27 2010-03-03 上海交通大学 用胶体金免疫层析试验检测伏马毒素的方法
CN102183634A (zh) * 2011-03-04 2011-09-14 河北省兽药监察所 快速检测四种硝基呋喃类药物的免疫纳米金试纸条
CN102520179A (zh) * 2011-12-07 2012-06-27 上海交通大学 定量检测伏马毒素b1的方法
CN106771213A (zh) * 2016-11-29 2017-05-31 百奥森（江苏）食品安全科技有限公司 一种伏马毒素检测方法
CN109374907A (zh) * 2018-10-10 2019-02-22 北京纳百生物科技有限公司 一种黏菌素胶体金检测试剂盒及其应用
CN111175511A (zh) * 2020-01-03 2020-05-19 华南农业大学 一种呕吐毒素荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用
CN113640522A (zh) * 2021-09-02 2021-11-12 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 用于检测t-2毒素的胶体金试纸条，试剂盒及检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
樊海新;李寒松;李复辉;马良友;朱平;吴金节;王希春;: "伏马菌素B_1胶体金免疫层析试纸条的研制" *

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