CN117147740A - 测定血中游离孕激素的超滤-质谱法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于激素检测技术领域，涉及测定血中游离孕激素的超滤‑质谱法及试剂盒。针对血清样本中游离孕激素含量极低，如孕酮和17‑羟孕酮，现有技术中质谱法直接检测灵敏度不够的技术问题，本申请提供测定血中游离孕酮和游离17‑羟孕酮的超滤‑质谱法，采用超滤和液液萃取配合“复溶式”衍生化前处理，结合LC‑MS/MS技术，能快速简便准确的检测出血清中痕量的游离孕酮和游离17‑羟孕酮，定量下限达到0.25 pg/mL，检出限达0.10 pg/mL，远远低于人体正常浓度，满足临床要求。本申请还提供了测定血中游离孕激素的超滤‑质谱法试剂盒，包括样本前处理和检测过程中所需组分，便于储存、运输、使用，降低了检测时间，使得临床快速检测游离孕酮和游离17‑羟孕酮成为可能。

Description

测定血中游离孕激素的超滤-质谱法及试剂盒
技术领域
本发明属于激素检测技术领域，具体地，涉及测定血中游离孕激素的超滤-质谱法及试剂盒。
背景技术
孕激素是一种含有21个碳原子的类固醇激素，主要为孕酮，孕酮经羟基化后形成17-羟孕酮。孕酮具有很强的孕激素作用，在月经周期的维持、胚胎着床和妊娠的每个阶段都必不可少。在月经周期的黄体期，卵泡壁塌陷形成黄体，分泌的孕激素逐渐增加。若卵子未受精，孕激素在月经期降至卵泡期水平；若卵子成功受精，则黄体转为妊娠黄体，继续分泌孕激素，直至胎盘形成后，由胎盘继续分泌。孕激素主要通过与孕激素受体（Progesterone receptor, PR）结合发挥作用，人体内有两种典型的PR亚型，分别为PR-A和PR-B，PR-A主要与卵巢和子宫功能相关；PR-B则在哺乳动物发育中起关键作用。孕激素可对抗雌激素的内膜增殖作用，使子宫内膜腺体分泌营养物质以利于配子吸收营养和胚胎植入，间质退膜样变，有利于孕卵的着床和发育；抑制输卵管收缩及上皮纤毛生长，调节孕卵的运行；缩短子宫颈长度、促进子宫颈口闭合，子宫颈黏液分泌减少，性状变粘稠，不利于精子和微生物进入宫颈，避免多精致受精和感染；另外，孕激素还具有超强的免疫调节租用，使得母体在妊娠期间处于免疫耐受状态。因此，孕激素维持女性正常生理作用至关重要。
在人体血液中，孕激素绝大部分以结合态的形式存在，仅极少部分以游离型形式存在，而游离态激素可以通过细胞膜进入靶组织细胞，与细胞内的受体结合，发挥其生物学作用，是孕激素发生生理效应的真正活性部分，可以确切地反应人体真实的孕激素水平。因此，准确测定人体血清中游离孕酮和游离17-羟孕酮具有重要意义。中国发明专利申请公布号为CN110243977A，申请日为2019年09月17日，发明名称为检测血清中四种孕激素的方法，公开的方法用于检测17α-羟基孕烯醇酮、17α-羟基孕酮、孕酮和孕烯醇酮。包括以下步骤：向血清样品中加入含内标物的甲醇溶液，进行蛋白沉淀，离心、取上清，加入衍生化剂进行衍生化反应，冷却至室温后加入叔丁基甲醚，离心、取上清，得待测样品；对所述待测样品采用二维液相色谱串联四级杆质谱联用仪进行富集、分离和检测。该方法可以实现4种孕激素的同时检测，但是无法对于游离的孕激素进行测定。
发明内容
1、要解决的问题
针对血清样本中游离孕激素（孕酮和17-羟孕酮）含量极低，现有技术中质谱法直接检测灵敏度低的技术问题，本申请提供测定血中游离孕激素的超滤-质谱法，采用超滤和液液萃取配合“复溶式”衍生化前处理，结合超高效液相色谱-串联质谱技术，能快速简便准确的检测出血清中痕量的游离孕酮和游离17-羟孕酮。本申请还提供了测定血中游离孕激素的超滤-质谱法试剂盒，包括样本前处理中的含衍生化剂的复溶剂和检测过程中所有组分，便于储存、运输、使用，降低了检测时间，使得临床快速检测游离孕酮和游离17-羟孕酮成为可能。
2、技术方案
为达到上述目的，提供的技术方案为：
本发明的测定血中游离孕激素的超滤-质谱法，包括将样品前处理得到上清液，将所述上清液用高效液相色谱-串联质谱检测，得到浓度数据的步骤，所述前处理包括如下步骤：
用缓冲液将所述样品稀释，得到稀释样品；
将所述稀释样品超滤，得到超滤液；
用萃取剂将所述超滤液萃取，得到萃取液；
将所述萃取液氮吹，得到氮吹样品；
用含衍生化剂的复溶剂将所述氮吹样品进行复溶式衍生化反应，得到衍生化样品；
将所述衍生化样品离心，得到上清液。
进一步的，所述衍生化剂为吉拉德试剂；所述含衍生化剂的复溶剂中的溶剂为甲醇溶液；所述复溶式衍生化反应的条件为室温震荡5 min。
优选的，所述甲醇溶液为体积分数5~80%甲醇，最优选的为体积分数50%甲醇水溶液。
进一步的，所述缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸、磷酸、硼酸或碳酸中的一种；所述样品和缓冲液的体积比为1∶1~1∶5。
优选的，所述样品和缓冲液以1:3的比例稀释。
进一步的，所述超滤液和萃取剂的体积比为2∶3。
优选的，取100 μL活化液于超滤管中在37 ℃，2000 g条件下离心6 min，接着向超滤管中加入100 μL纯水在相同条件下离心6 min。取300 μL样品加入900 μL 缓冲液，涡旋震荡3 min。取1 mL稀释后的血清样品加入超滤管中，在37 ℃、2000 g离心1 h，取600 μL超滤液/校准品/质控品加入30 μL内标准品混合后，加入800 μL萃取液，涡旋离心后，取650 μL上层清液氮气吹干，加入100 μL复溶剂复溶，室温涡旋5 min，取10 μL直接进样。
进一步的，所述高效液相色谱-串联质谱检测的步骤中使用流动相；所述流动相包括流动相A和流动相B；所述流动相A为添加剂溶于纯水溶液中，所述流动相B为添加剂溶于有机试剂中；
所述添加剂为氟化铵溶液、甲酸铵、乙酸铵、甲酸、乙酸中的一种或几种；
所述有机试剂为甲醇、乙腈中的一种或几种。
进一步的，所述高效液相色谱的条件为：洗脱梯度：
进样器温度：8 ℃；柱温：50 ℃；运行时间：4.5 min。
进一步的，所述游离孕激素为游离孕酮和游离17-羟孕酮，质谱条件为：
当所述衍生化剂为吉拉德试剂T时，多反应监测参数为：
当所述衍生化剂为吉拉德试剂P时，多反应监测参数为：
扫描模式：多反应监测，正离子模式；毛细管电压：3 kV；脱溶剂温度：550 ℃；脱溶剂气：1000 L/hr；锥孔气：150 L/hr。
进一步的，所述试剂盒包括以下组分：校准品、质控品、内标准品、活化液、缓冲液、萃取剂、含衍生化剂的复溶剂、添加剂。
进一步的，所述萃取剂为甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、正己烷或二氯甲烷中的一种或几种；所述衍生化剂为吉拉德试剂。
优选的，所述吉拉德试剂为吉拉德试剂T或吉拉德试剂P。
进一步的，所述添加剂为氟化铵、甲酸铵、乙酸铵、甲酸、乙酸中的一种或几种；所述缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液或碳酸盐缓冲液中的一种或几种。
优选的，所述校准品和质控品为孕酮和17-羟孕酮。所述内标准品为孕酮-13C3和17-羟孕酮-13C3。所述活化液为0.1 mol/L的氢氧化钠溶液。
3、有益效果
采用本发明提供的技术方案，与已有的公知技术相比，具有如下有益效果：
（1）本发明的测定血中游离孕激素的超滤-质谱法，采用超滤和液液萃取配合“复溶式”衍生化前处理，结合超高效液相色谱-串联质谱技术，能快速简便准确的检测出血清中痕量的游离孕酮和游离17-羟孕酮，方法的特异性强，减少了分析过程中的干扰。运用超滤法能够快速的分离出游离孕酮和游离17-羟孕酮，再对超滤液进行液液萃取进行提取富集来提高了检测的灵敏度，随后，采用含衍生化剂的复溶剂进行“复溶式”衍生化以进一步提高灵敏度，使两个指标的定量下限降至0.25 pg/mL、检出限为0.1 pg/mL，远远低于人体正常游离孕酮和游离17-羟孕酮的浓度。
所述衍生化反应为“复溶式”衍生化是指：过程类似常规复溶操作，即加入含衍生化剂复溶剂复溶，室温涡旋5 min即完成衍生化，可直接检测，使样品处理步骤更为简单便捷，更易于操作。还避免了现有技术中免疫法的灵敏度和准确度都不足，特异性低的缺陷。
（2）本发明的测定血中游离孕激素的超滤-质谱法试剂盒，采用超滤法和液液萃取配合“复溶式”衍生化的方法对血清中游离孕酮和游离17-羟孕酮进行提取和富集，去除分析过程中的绝大多的基质干扰和杂质而降低了检测限的浓度。试剂盒中包括样本前处理和检测过程中所有组分，便于储存、运输、使用。能满足人体血清极低浓度游离孕酮和游离17-羟孕酮的检测需求，为临床提供更准确的临床结果和诊断价值。
附图说明
图1为本发明游离孕酮和游离17-羟孕酮检测方法的流程图；
图2为吉拉德试剂P衍生化后游离孕酮和游离17-羟孕酮及其同位素内标色谱图；
图3为吉拉德试剂T衍生化后游离孕酮和游离17-羟孕酮及其同位素内标色谱图。
具体实施方式
为进一步了解本发明的内容，结合实施例对本发明作详细描述。
实施例1
本实施例的测定血中游离孕激素的超滤-质谱法试剂盒，所述试剂盒包括以下组份：
表1 测定血中游离孕激素的超滤-质谱法试剂盒的组份
复溶剂（含衍生化剂）的溶剂为50%甲醇水溶液。
本实施例的试剂盒，采用超滤法和液液萃取配合“复溶式”衍生化的方法对血清中游离孕酮和游离17-羟孕酮进行提取和富集，去除分析过程中的绝大多的基质干扰和杂质而降低了检测限的浓度，使两个指标定量下限能降至0.25 pg/mL。使用前将添加剂溶于纯水中即得流动相A，添加剂溶于甲醇中即得流动相B，便于操作、储存和运输。
实施例2
本实施例的测定血中游离孕激素的超滤-质谱法试剂盒，基本同实施例1，不同的是，萃取剂为甲基叔丁基醚。
表2 测定血中游离孕激素的超滤-质谱法试剂盒的组份
实施例3
本实施例的测定血中游离孕激素的超滤-质谱法试剂盒，基本同实施例1，不同的是，萃取剂为二氯甲烷。
表3 测定血中游离孕激素的超滤-质谱法试剂盒的组份
实施例4
本实施例的测定血中游离孕激素的超滤-质谱法试剂盒，基本同实施例1，不同的是，萃取剂为正己烷。
表4 测定血中游离孕激素的超滤-质谱法试剂盒的组份
实施例1、2、3、4的萃取剂，均可以在样品超滤后，萃取出游离孕酮和游离17-羟孕酮，进一步衍生化后进行LC-MS/MS分析，通过比较孕酮和17-羟孕酮的峰面积，均可以满足检测要求，其中乙酸乙酯作为萃取剂时峰面积最大。
实施例5
本实施例的测定血中游离孕激素的超滤-质谱法试剂盒，基本同实施例1，不同的是，添加剂为甲酸铵。
表5 测定血中游离孕激素的超滤-质谱法试剂盒的组份
实施例6
本实施例的测定血中游离孕激素的超滤-质谱法试剂盒，基本同实施例1，不同的是，添加剂为氟化铵。
表6 测定血中游离孕激素的超滤-质谱法试剂盒的组份
实施例7
本实施例的测定血中游离孕激素的超滤-质谱法试剂盒，基本同实施例1，不同的是，添加剂为甲酸。
表7 测定血中游离孕激素的超滤-质谱法试剂盒的组份
实施例8
本实施例的测定血中游离孕激素的超滤-质谱法试剂盒，基本同实施例1，不同的是，添加剂为乙酸。
表8 测定血中游离孕激素的超滤-质谱法试剂盒的组份
通过实施例1、5、6、7、8的添加剂，优化其浓度，均可以在样品上清液进行LC-MS/MS分析，得到很好地峰形和分离效果，通过比较孕酮和17-羟孕酮的峰面积，均可以满足检测要求，其中乙酸铵作为添加剂的峰面积最大。
实施例9
本实施例的测定血中游离孕激素的超滤-质谱法试剂盒，基本同实施例1，不同的是，缓冲液为磷酸缓冲盐。
表9 测定血中游离孕激素的超滤-质谱法试剂盒的组份
实施例10
本实施例的测定血中游离孕激素的超滤-质谱法试剂盒，基本同实施例1，不同的是，缓冲液为硼酸缓冲盐。
表10 测定血中游离孕激素的超滤-质谱法试剂盒的组份
实施例11
本实施例的测定血中游离孕激素的超滤-质谱法试剂盒，基本同实施例1，不同的是，缓冲液为碳酸盐缓冲盐。
表11 测定血中游离孕激素的超滤-质谱法试剂盒的组份
通过实施例1、9、10、11的缓冲盐，优化其浓度，均可以在样品上清液进行LC-MS/MS分析，得到很好地峰形和分离效果，通过比较孕酮和17-羟孕酮的峰面积，均可以满足检测要求，其中4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液的峰面积最大更稳定。
实施例12
本实施例的测定血中游离孕激素的超滤-质谱法试剂盒，基本同实施例1，不同的是，衍生化剂为吉拉德试剂T。
表12 测定血中游离孕激素的超滤-质谱法试剂盒的组份
通过实施例1和12的复溶剂（含衍生化剂），优化其浓度，均可以在样品上清液进行LC-MS/MS分析，得到很好的峰形和分离效果，通过比较孕酮和17-羟孕酮的峰面积，均可以满足检测要求，其中吉拉德试剂P效果更佳。
实施例13
本实施例的测定血中游离孕激素的超滤-质谱法，包括如下步骤：
1. 实验材料
如实施例1~12所示，以实施例1的试剂盒为例，其余实施例2~12操作均相同。
1.1 主要仪器设备和耗材
LC-MS/MS：Waters UPLC-I Class超高效液相色谱和Xevo TQ-S质谱系统。
色谱柱，ACQUITY UPLC® BEH C18 (2.1 × 50 mm 1.7 μm)（Waters）。
漩涡混合器（美国SI Vortex Genie 2）。
台式高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）。
MD200系列氮气吹扫仪（杭州奥盛仪器有限公司）。
2. 流动相和其它溶液的配制
强洗溶液：90%甲醇溶液。
弱洗溶液：30%甲醇溶液。
流动相A：使用实施例1中试剂盒的添加剂的水溶液，浓度为0.5 mM。
流动相B：使用实施例1中试剂盒的添加剂的甲醇溶液，浓度为0.5 mM。
3. 样品的制备
取100 μL活化液于超滤管中在37℃，2000 g条件下离心6 min，接着向超滤管中加入100 μL纯水在相同条件下离心6 min。取300 μL血清样品加入900 μL 缓冲液，涡旋震荡3min。取1 mL稀释后的血清样品加入超滤管中，在37℃、2000 g离心1 h，取600 μL超滤液/校准品/质控品加入30 μL内标准品混合后，加入800 μL萃取液，涡旋离心后，取650 μL上层清液氮气吹干，加入100 μL复溶剂（含衍生化剂）复溶，室温涡旋5 min，取10 μL直接进样，具体如图1所示。
4. 仪器条件
4.1. 液相条件
本实验选用 ACQUITY UPLC® BEH C18 (2.1 × 50 mm 1.7 μm)（Waters）色谱柱，分别使用甲醇和乙腈作为有机相对梯度和不同pH和缓冲盐流动相体系进行比较研究，结果发现同时在甲醇和水中加入0.5 mM乙酸铵，能够得到很好的分离和保留且峰形良好，有较高灵敏度，本方法在超高效液相系统下分析时间可以缩短到4.5 min，能够快速、高效的分离出游离孕酮和游离17-羟孕酮，减少基线干扰并达到很好的定量分析效果。具体液相条件如下：
进样器温度：8 ℃。
柱温：50 ℃。
运行时间：4.5 min。
洗脱梯度：
4.2. 质谱条件
毛细管电压：3 kV；锥孔电压：30 V；脱溶剂温度：550 ℃；脱溶剂气：1000 L/hr；锥孔气：150 L/hr。
多反应监测参数表格：
注：17-OHP：17-羟孕酮；P：孕酮；#：定量通道。
5. 数据处理
分析物和内标的保留时间，色谱图采集和色谱图的积分和数据统计由Masslynx软件和Microsoft Office Excel 2013进行处理。校正曲线以1/x2为加权系，用峰面积比值（分析物/内标）对校正标样中分析物的浓度进行线性回归。
6. 方法验证
本方法在超滤后液液萃取配合“复溶式”衍生化的前处理条件下，在定量下限0.25pg/mL浓度样本中，S/N均大于10，色谱图见附图2，平行测定10个定量下限浓度的样品，检测结果如下详见表13和表14，定量下限的准确度（相对偏差）在±15%以内，精密度（变异系数CV）均在20%以内，结果符合要求；样品在0.25~500 pg/mL浓度范围内有良好的线性关系，相关系数r>0.998；该方法的精密度验证分别用低浓度女性血清样本和高浓度女性血清样本，经过超滤后通过测其本底的浓度来验证方法的精密度，要求CV%在15%以内，结果详见表15和表16，该方法的精密度符合要求；该方法的准确度通过加标回收试验来评估，通过分别向上述两种样本的超滤液中加入一定量低值和高值质控品，进行加标回收实验，来验证方法的准确度，要求加标回收率均在可接受范围（85~115%）内，该方法的准确度结果可以接受，结果详见表17和表18。
表13 17-羟孕酮定量下限的检测结果（n=10）
结论：17-羟孕酮的定量下限准确度（相对偏差）在±15 %以内，精密度（变异系数CV）在20%以内，均符合要求。
表14 孕酮定量下限的检测结果（n=10）
结论：孕酮的定量下限准确度（相对偏差）在±15 %以内，精密度（变异系数CV）在20%以内，均符合要求。
表15 17-羟孕酮低高浓度样品精密度（n=6）
结论：17-羟孕酮的变异系数CV在15 %以内，精密度符合要求。
表16 孕酮低高浓度样品精密度（n=6）
结论：孕酮的变异系数CV在15 %以内，精密度符合要求。
表17 17-羟孕酮低值和高值质控品的准确度测试（n=6）
结论，17-羟孕酮的加标回收率在85~115 %之内，变异系数在15%以内，结果符合要求。
表18 孕酮低值和高值质控品的准确度测试（n=6）
结论，孕酮的加标回收率在85~115 %之内，变异系数在15%以内，结果符合要求。
实施例14
本实施例的测定血中游离孕激素的超滤-质谱法，包括如下步骤：
1. 实验材料
如实施例1~12所示，以实施例12的试剂盒为例，其余方法和测试内容同实施例1，结果也类似。
采用吉拉德试剂T衍生后，测得的色谱图如图3所示。
所述衍生化剂为吉拉德试剂T时，多反应监测参数为：
综上所述，该方法分析方法运用超滤和液液萃取配合“复溶式”衍生化的前处理方法，能够快速的从血清中分离出游离孕酮和游离17-羟孕酮，并从超滤液中进一步的快速提取和富集，液液萃取提取方法简单，运用此方法进行富集比固相萃取的操作更为简单，且成本更低，更容易实现；此外“复溶式”衍生化使整个前处理过程同液液萃取方式，没有增加额外操作，但游离孕酮和17-羟孕酮的灵敏度得到的进一步提升。该方法的液相经过优化，在流动相中加入乙酸铵缓冲盐，对仪器响应能显著的提高，提高了灵敏度，使两个指标的定量下限能低至0.25 pg/mL，能完全满足临床样本的检测需求。
本申请建立了一种超高效液相色谱-串联质谱结合超滤法来检测血清中游离孕酮和游离17-羟孕酮的含量，能够快速实现血清中游离孕酮和游离17-羟孕酮的分离，在1 mL的上样量上只需要不到一小时就能收集超过600 μL的超滤液，超滤液的体积越多经过提取富集就越能提高检测的灵敏度。进一步本方法建立“复溶式”衍生化，使整个过程类似复溶过程，但灵敏度得到进一步提升，即在不增加操作步骤和操作时间的前提下进一步提升检测指标的灵敏度。在300 μL的血清样本用量上，就能将两个指标的定量下限（LLOQ）降低至0.25 pg/mL，检出限降至0.1 pg/mL，完全满足临床样本特别是女性血清样本中极低浓度的游离孕酮和游离17-羟孕酮检测需求。
对比例1
本对比例的测定血中游离孕激素的超滤-质谱法，其他条件基本同实施例13，不同的是，氮吹样品用不含衍生化剂的复溶剂（即50%甲醇水溶液）进行复溶。此外，质谱参数中的多反应监测参数不同，具体如下表。
采用非衍生前处理，多反应监测参数为：
① 本对比例1的样本前处理：样本超滤后，超滤液进行液液萃取，氮吹后，加入100μL复溶剂（50%甲醇水溶液），室温震荡5 min复溶，取10 μL进行LC-MS/MS检测。由于复溶液未进行衍生化反应，游离孕酮和游离17-羟孕酮的灵敏度未被进一步提升，测试结果：游离孕酮和游离17-羟孕酮的的定量下限（LLOQ）为15 pg/mL。
② 实施例13的样本前处理：样本超滤后，超滤液进行液液萃取，氮吹后，加入100μL复溶剂（含衍生化剂的50%甲醇水溶液），室温震荡5 min复溶，取10 μL进行LC-MS/MS检测。由于复溶液在复溶过程进行衍生化反应，游离孕酮和游离17-羟孕酮的灵敏度得到进一步提升，测试结果：游离孕酮和游离17-羟孕酮的定量下限（LLOQ）为0.25 pg/mL。
对比例1和实施例13的前处理步骤完全一致，仅复溶剂的组成成分有区别，具体的：对比例1中的复溶剂不含衍生化剂，因此，未对游离孕酮和游离17-羟孕酮进行衍生化而无法进一步提升检测灵敏度；实施例13的复溶剂含衍生化剂，与对比例1相比，在未增加额外步骤的前提下，即可使游离孕酮和游离17-羟孕酮的灵敏度提高60倍。
由于游离孕酮和游离17-羟孕酮在人体中含量极低，正常人体低水平游离孕酮约为1 pg/mL（正常参考范围下限），正常人低水平游离17-羟孕酮约为10 pg/mL（正常参考范围下限）。采用对比例1的方法，游离孕酮和游离17-羟孕酮的灵敏度太低，其LLOQ为15 pg/mL，无法检测低水平游离孕酮和游离17-羟孕酮，即在临床使用中，对比例1的方法无法检出低水平游离孕酮和游离17-羟孕酮，更无法检出游离孕酮和游离17-羟孕酮缺乏的患者（低于正常参考范围下限），极易造成误诊或漏诊。而本发明提供的测定血中游离孕激素的超滤-质谱法和试剂盒，游离孕酮和游离17-羟孕酮的灵敏度极高，其LLOQ为0.25 pg/mL，远远低于正常参考范围下限，可以准确测定人体游离孕酮和游离17-羟孕酮的含量。
以上所述实施例仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.测定血中游离孕激素的超滤-质谱法，包括将样品前处理得到上清液，将所述上清液用高效液相色谱-串联质谱检测，得到浓度数据的步骤，其特征在于：所述前处理包括如下步骤：
用缓冲液将所述样品稀释，得到稀释样品；
将所述稀释样品超滤，得到超滤液；
用萃取剂将所述超滤液萃取，得到萃取液；
将所述萃取液氮吹，得到氮吹样品；
用含衍生化剂的复溶剂将所述氮吹样品进行复溶式衍生化反应，得到衍生化样品；
将所述衍生化样品离心，得到上清液。
2.根据权利要求1所述的测定血中游离孕激素的超滤-质谱法，其特征在于：所述衍生化剂为吉拉德试剂；所述含衍生化剂的复溶剂中的溶剂为甲醇溶液；所述复溶式衍生化反应的条件为室温震荡5 min。
3.根据权利要求2所述的测定血中游离孕激素的超滤-质谱法，其特征在于：所述缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸、磷酸、硼酸或碳酸中的一种；所述样品和缓冲液的体积比为1∶1~1∶5。
4.根据权利要求1所述的测定血中游离孕激素的超滤-质谱法，其特征在于：所述超滤液和萃取剂的体积比为2∶3。
5.根据权利要求1-4任一项所述的测定血中游离孕激素的超滤-质谱法，其特征在于：所述高效液相色谱-串联质谱检测的步骤中使用流动相；所述流动相包括流动相A和流动相B；所述流动相A为添加剂溶于纯水溶液中，所述流动相B为添加剂溶于有机试剂中；
所述添加剂为氟化铵溶液、甲酸铵、乙酸铵、甲酸、乙酸中的一种或几种；
所述有机试剂为甲醇、乙腈中的一种或几种。
6.根据权利要求5所述的测定血中游离孕激素的超滤-质谱法，其特征在于：所述高效液相色谱的条件为：洗脱梯度：
进样器温度：8 ℃；柱温：50 ℃；运行时间：4.5 min。
7.根据权利要求5所述的测定血中游离孕激素的超滤-质谱法，其特征在于：所述游离孕激素为游离孕酮和游离17-羟孕酮，质谱条件为：
当所述衍生化剂为吉拉德试剂T时，多反应监测参数为：
当所述衍生化剂为吉拉德试剂P时，多反应监测参数为：
扫描模式：多反应监测，正离子模式；毛细管电压：3 kV；脱溶剂温度：550 ℃；脱溶剂气：1000 L/hr；锥孔气：150 L/hr。
8.测定血中游离孕激素的超滤-质谱法试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括以下组分：校准品、质控品、内标准品、活化液、缓冲液、萃取剂、含衍生化剂的复溶剂、添加剂。
9.根据权利要求8所述的测定血中游离孕激素的超滤-质谱法试剂盒，其特征在于：所述萃取剂为甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、正己烷或二氯甲烷中的一种或几种；所述衍生化剂为吉拉德试剂。
10.根据权利要求9所述的测定血中游离孕激素的超滤-质谱法试剂盒，其特征在于：所述添加剂为氟化铵、甲酸铵、乙酸铵、甲酸、乙酸中的一种或几种；所述缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液或碳酸盐缓冲液中的一种或几种。
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