DK151400B

DK151400B - Latexreagens sensitiveret med steroid-serumalbumin-konjugat og fremgangsmaade til fremstilling af latexreagenset

Info

Publication number: DK151400B
Application number: DK277178AA
Authority: DK
Inventors: Katsuhiro Ogasa; Morio Kuboyama; Minoru Saito; Tsutomu Kudo; Yoshitsugu Harada; Akio Kawashiri; Eiji Takahashi
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date: 1977-06-21
Filing date: 1978-06-20
Publication date: 1987-11-30
Also published as: FR2395507A1; US4226847A; NL7806681A; GB2001992A; AU522306B2; JPS5819222B2; DK277178A; DE2827250C2; AU3694578A; SE7806961L; JPS548715A; DK151400C; SE445149B; GB2001992B; FR2395507B1; SU1213975A3; CA1107196A; DE2827250A1

Description

i 151400

Det er kendt, at mængden af steroidhormoner og/eller metaboliter deraf indeholdt i human legemsvæske eller udskilt væske, korrelerer med fysiologiske og patologiske tilstande af mennesker. Derfor er kvantitativ analyse 5 af steroidhormoner og/eller metaboliter deraf nyttig til diagnose og klinisk undersøgelse.

Imidlertid er mængden af steroidhormoner og metaboliter deraf indeholdt i human legemsvæske og udskilt væske normalt lille, og variationer i mængden af steroidhormoner 10 og metaboliter deraf som følge af en specifik fysiologisk eller patologisk tilstand er også lille.

Følgelig kræver kvantitativ analyse af steroidhormoner og/eller metaboliter deraf den yderste nøjagtighed.

Den nyeste udvikling i analytiske instrumenter gør 15 det muligt at udføre yderst nøjagtige kvantitative analy ser. Spdanne instrumenter er højt udviklede, og installation og vedligeholdelse af sådanne instrumenter kræver normalt store omkostninger. Endvidere er håndteringen af sådanne instrumenter ikke nem for ikke-faguddannede og kræver ofte 20 besværlig og tidrøvende forudgående behandling af de prøver, som skal undersøges.

Derfor er det af betydning at tilvejebringe midler, som muliggør akkurat og hurtig kvantitativ detektering af steroidhormoner og/eller metaboliter deraf uden noget 25 behov for særlig træning og specielle instrumenter.

Det er kendt, at kvantitativ detektering af steroider kan gøres ved immunologiske metoder. En af de typiske immunologiske metoder gør brug af specificiteten af en antigen-antistof-reaktion og synligheden af agglutination og agglu-30 tinationsinhiberingsreaktionen deraf. Specielt bindes i en typisk kendt metode en bestemt slags steroid, som skal de-tekteres, til protein for at give et steroid-protein-konju-gat, og derpå fremstilles et reagens med latexpartikler, som sensitiseres med konjugatet, og der fremstilles anti-35 serum, idet konjugatet injiceres i et pattedyr. Det således opnåede antiserum kan reagere med det steroid, som skal detekteres, og kan også reagere med reagenset. Hvis der- 2 151408 ' for en given mængde af en prøve af human legemsvæske eller udskilt væske samles og blandes med en given mængde af det nævnte antiserum, sker der en reaktion mellem steroid og antiserum. Derpå sættes en given mængde af reagenset til 5 blandingen af prøven og antiserumet. Hvis der er overskud af antiserum i blandingen af prøven og antiserumet, kan antigen-antistof-reaktionen mellem det resterende antiserum og reagenset iagttages som en agglutinationsreaktion, og hvis antiserumet netop neutraliseres med steroidet inde-10 holdt i prøven, eller en overskudsmængde af steroid forbli ver i væskeblandingen, sker der ikke antigen-antistof-reak-tion, og dette kan iagttages som en agglutinationsinhibe-ringsreaktion. Hvis derfor serievis fortyndede prøver undersøges med antiserumet, som er indstillet med en forud be-15 stemt styrke, og reagenset, kan der foretages kvantitativ bestemmelse af steroider og/eller metaboliter deraf.

En kendt metode er åbenbaret i japansk tilgængelig patentansøgning nr. 51-112513 (indleveringsdato: 25 MAR 1975). Denne kendte teknik refererer til immunologisk kvan-20 titativ bestemmelse af dehydroepiandrosteron-sulfat (som er et mellemprodukt i biosyntesen af et kønshormon), men denne kendte teknik føjer intet nyt til den nævnte typiske kendte teknik. Skønt den kendte teknik tilvejebringer brugbare diagnostiske undersøgelsesmetoder, har man ønsket at 25 forøge følsomheden af sådanne kvantitative immunologiske prøver, da dette gør det muligt at detektere mindre variationer i steroidmængden.

Imidlertid indeholder human legemsvæske eller udskilt væske normalt mange slags forbindelser foruden steroider, 30 og indholdet af disse forbindelser er normalt meget større end steroidindholdet. Nogle af disse forbindelser, f.eks. proteiner og saccharider, påvirker immunologiske prøver, og det er nødvendigt at fjerne dem eller fortynde legemsvæsken eller den udskilte væske, som skal undersøges, i en 35 udstrækning, hvor der ikke længere sker nogen påvirkning.

Fjernelse af de forstyrrende forbindelser nødvendiggør komplicerede processer, og i den kliniske undersøgelse, som kræver enkelhed og hurtighed, er det nødvendigt at 3 151400 fortynde den væske, som skal undersøges. Dette gør det nødvendigt at forøge følsomheden af en sådan immunologisk prøve.

Justering af følsomheden er anført i det japanske 5 offentliggørelsesskrift 50-123819 (indleveret 14 MAR 1974).

Dette andet eksempel på kendt teknik åbenbarer en metode til immunologisk undersøgelse af steroider indeholdt i human legemsvæske eller udskilt væske, ved hvilken metode der benyttes et antistof, der fås fra et pattedyr, 10 der er immuniseret med steroid konjugeret med antigenisk preotein med fri aminogruppe, og sensitiverede bærere, hvor bærerne er sensitiveret med steroid konjugeret med protein, som er forskellig fra det nævnte antigeniske protein. I dette andet tilfælde af den kendte teknik kan ju-15 stering af følsomheden opnås ved variation af mængden af steroidproteinkonjugat til sensitivering af latexpartikler i reagenset og ved variation af koncentrationen af antiserum. Skønt beskrivelsen i det andet tilfælde af den kendte teknik ikke nødvendigvis er klar, skønt beskrivelsen anty-20 der, at følsomheden er stor, idet små mængder af overskydende antiserum kan agglutinere sensitiverede latexpartikler, når latexpartiklerne er sensitiveret med små mængder af steroidproteinkonjugatet, giver dette løsningsforslag muligvis ikke nogen væsentlig forbedring af følsomheden 25 af den nedenfor anførte grunde. Oprindeligt har latexpartikler en tilbøjelighed til at vise ikke-specifik agglutination, når et passende stabiliseringsmiddel ikke tilsættes, og denne ikke-specifikke agglutination kan ikke skelnes fra specifik agglutination som følge af antigen-antistof-30 reaktion. Det steroidproteinkonjugat, der benyttes til sensitivering af latexpartikler, kan virke som et stabiliseringsmiddel til eliminering af denne ikke-specifikke agglutination af selve latexpartiklerne. Følgelig er indstillingen af følsomheden i overensstemmelse med det andet 35 eksempel på den kendte teknik begrænset til, at en vis mængde konjugat skal anvendes, for at ikke-specifik agglutination kan elimineres, og det er ikke muligt at forøge følsomheden ud over denne begrænsning.

4 151400

Et forsøg på at overvinde denne begrænsning består i anvendelsen af den teknik, som fremgår af japansk patentskrift nr. 49-11407 (indleveringsdato 29 DEC 1970, publikation 16 MAR 1974) og 50-82230 (indleveringsdato 29 NOV 5 1973, fremlagt 03 JUL 1975). I dette tredie og fjerde til fælde af kendt teknik åbenbares det, at latexpartiker kan stabiliseres ved, at man får latexpartikler til at absorbere immunologisk indifferent protein, før eller efter at latexpartiklerne sensitiveres med steroidproteinkonjugat 10 eller antistof. Ved kombination af det andet samt det tredie eller fjerde tilfælde af den kendte teknik er der en mulighed for at opnå sensitiverede latexpartikler med øget følsomhed med latexpartikler, som er sensitiveret med små mængder af steroidproteinkonjugat og stabiliseret med im-15 munologisk indifferent protein. Det har imidlertid vist sig, at denne stabilisering af latexpartikler med indifferent protein er tilbøjelig til at påvirke immunologisk specifik agglutination.

Japansk patentskrift nr. 48-49918 (indleveringsdato 20 26 OKT 1972, fremlagt 14 JUL 1973) åbenbarer en metode til fremstilling af antistof, som har udmærket specificitet over for progesteron og anvendelighed af antistoffet til radioimmunoanalyse og agglutinationsprøve til bestemmelse af koncentrationen af progesteron i stofprøver.

25 Imidlertid refererer dette femte tilfælde af kendt teknik ikke generelt til forbedringer i følsomheden af detekteringen af andre steroider.

Endvidere angives det øjensynligt i dette femte tilfælde af den kendte teknik, at steroidproteinkonjugatet, 30 hvor steroidet er hydroxyprogesteron, har 15-40 molekyler steroid for hvert molekyle protein, og et sådant konjugat benyttes ikke blot til fremstilling af antistof, men også til sensitivering af latexpartikler. Ligeledes benyttes der i det andet tilfælde af den kendte teknik (japansk 35 patentskrift nr. 50-123819) estriol-16o(-glucuronid-kanin- serumalbumin-konjugat til sensitivering af latexpartikler, og bindingsforholdet mellem steroidglucuronid og protein ligger i området 27-30 mol for hvert benyttet mol protein.

5 151400

Som det vil ses af ovenstående, er steroidprotein-konjugat, hvor et forholdsvis stort antal steroidmolekyler er bundet for hvert molekyle protein, blevet benyttet til sensitivering af latexpartikler i den kendte teknik (i det følgende betegnes antallet af molekyler steroid 5 bundet til et molekyle protein simpelt hen proteinbindings tal ).

I forbindelse med den foreliggende opfindelse har man forestillet sig, at yderligere forbedring i følsomheden ikke kan forventes ad konventionel vej, og man har koncen-10 treret sig om forbedring af selve konjugatet. Som et resul tat heraf har det vist sig, at når steroid-serumalbumin-konjugat fremstilles, så at steoridbindingstallet falder i området 0,5-7,0, og latexpartiklerne derpå sensitiveres med et sådant konjugat, så udviser de således opnåede sensiti-15 verede latexpartikler yderst høj følsomhed, og dette gælder uanset arten af benyttet steroid og serumalbumin. Så vidt vides, findes der intet litteratursted, som refererer til en nedgang i steroidbindingstallet ledsaget af en stigning i følsomheden af steroiddetekteringen.

20 Gennem den foreliggende opfindelse anvises der derfor en fremgangsmåde til fremstilling af en latexpolymer, som er sensitiveret med steroid-serumalbumin-konjugat med forøget steroiddetekteringsfølsomhed, hvor steroidet til fremstilling af konjugatet er bundet til serumalbumin i for-25 holdet 0,5-7 mol for hvert mol serumalbumin som angivet i krav 1.

Der anvises en metode til fremstilling af et latexrea-gens, som kan detektere steroid med høj følsomhed til trods for, at latexpartiklerne kun er sensitiveret med ste-30 roid serumalbumin-konjugat uden stabilisering af latexpar tiklerne med immunologisk indifferent protein.

Der anvises en fremgangsmåde til fremstilling af en latexpolymer sensitiveret med steroid-serumalbumin-konjugat til detektering af steroid med øget følsomhed, hvor latex-35 polymeren er styrenpolymer, butadienpolymer eller styren-butadien-copolymer.

6 151400

Der anvises endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af en latexpolymer, som er sensitiveret med steroid-serumalbumin-konjugat med forøget steroiddetekteringsføl-somhed, hvor steroidet til fremstilling af konjugatet væl-5 ges blandt steroidet, som skal detekteres, metaboliter deraf og syntetiske steroider med lignende struktur, og serumalbumin til fremstilling af konjugat vælges blandt okseserumalbumin, hesteserumalbumin, fåreserumalbumin, kaninserumalbumin og humant serumalbumin.

10 Gennem den foreliggende opfindelse anvises der et latexreagens med høj følsomhed for steroiddetektering, hvor latexpartiklerne sensitiveres med steroid-serumalbumin-kon-jugat med forholdsvis lavt steroidbindingstal som angivet i krav 7-8.

15 Opfindelsen skal forklares nærmere gennem det følgende.

Først skal de generelle og grundlæggende aspekter for opfindelsen beskrives, hvorpå følger en nærmere diskussion. Steroid,

Generelt er steroidet, som kan benyttes, følgende: 20 Follikulært hormon (estrogen), corpus-luteum-hormon (progesteron), mandligt kønshormon (f.eks. 17-ketosteroid), adrenocorticalt hormon (f.eks. 17-hydroxycorticoste-roid) eller steroid, som kan være en varietet af me-25 taboliter af ovennævnte steroidhormoner.

Når disse steroider benyttes til fremstilling af konjugat med serumalbumin, benyttes de fortrinsvis i den tilstand, hvori de findes i human legemsvæske eller udskilt fluidum, f.eks. i tilstanden af steroid-glucuronid-konju-30 gat eller steroid-sulfat-konjugat. Imidlertid kan enhver slags naturligt eller syntetisk steroid benyttes, når blot de har tilstrækkelig immunologisk krydsreaktivitet med ethvert af specifikke steroidhormoner eller metaboliter deraf, som skal detekteres i human legemsvæske eller ud-35 skilt væske, og forsåvidt de har en funktionel gruppe, hvorved de kan bindes kemisk til serumalbumin. F.eks. kan steroidhemisuccinat eller steroid-(o-carboxymethyl)-oxim benyttes som syntetisk steroid.

7 151400

Serumalbumin

Ethvert raffineret serumalbumin, som fås i handelen, kan benyttes, f.eks.: okseserumalbumin (BSA) 5 hesteserumalbumin (ESA) fåreserumalbumin (SSA) kaninserumalbumin (RSA) humant serumalbumin (HSA)

Koderne i parenteser er initialerne for de respektive 10 slags serumalbumin.

Især okseserumalbumin og kaninserumalbumin foretrækkes. Latexpartikler

Polystyrenlatexpartikler, polybutadienlatexpartikler og 15 styren-butadien-copolymerlatexpartikler.

Det er vigtigt, at latexpartiklerne ikke har reaktionsdygtige radikaler, og de må være indifferente i kemisk og immunologisk forstand. Polystyrenlatexpartikler foretrækkes især.

20 Partikelstørrelsesordenen kan være 0,05 ji - 1,0 ji, fortrinsvis 0,2 - 0,8

Fremstilling af konjuqat Følgende metoder er kendt og kan bekvemt benyttes i forbindelse med den foreliggende opfindelse til fremstil-25 ling af steroid-serumalbumin-konjugat, som benyttes til sensitivering af latexpartiklerne og til opnåelse af antiserum eller antistof:

Carbodiimidmetode (jf. Gross m.fl.:

Immunochemistry, bd. 5, side 55, 1968), 30 Syrechloridmetode (jf. Erlanger m.fl.:

Journal of Biological Chemistry, bd. 228, side 713, 1957),

Metode med blandet anhydrid (do.) og Isocyanatmetode (Goodfriendm.fi.: Canadian 35 Journal of Biochemistry and Physiology, bd. 36, side 1177, 1958).

Et eksempel på fremstilling af steroid-serumalbumin-konjugat ved metoden med blandede syreanhydrider er vist 8 151400 i det følgende: 10 mol steroid-glucuronid, steroidhemisuccinat eller steroid-(o-carboxymethyl)-oxim for hvert mol benyttet serumalbumin opløses i dimethylformamid. Til denne opløs-5 ning sættes det samme antal mol af tri-n-butylamin som af steroidet som en hjælpeaktivator, og der omrøres. Derpå sættes det samme antal mol af isobutylchlorformiat som af steroid yderligere som en aktivator til den således opnåede blandede opløsning, og der omrøres. Den således opnåede 10 opløsning betegnes væske A.

Serumalbumin opløses i afmineraliseret vand, og man indstiller dets pH-værdi på 8,0-10,0 med 1 N NaOH, og der tilsættes dimethylformamid. Den således opnåede opløsning betegnes væske B. Mængden af dimethylformamid i væske B 15 vælges, så at den totale mængde af dimethylformamid i væske A og B er den samme som mængden af det afmineraliserede vand i væske B.

Derpå sættes væske A dråbevis til væske B i løbet af 1 time 30 minutter under omrøring, og derefter indstilles 20 pH-værdien på 8,0-10,0 med 1 N NaOH, og den blandede væske omrøres i 3 timer 30 minutter, hvorved steroid-serumalbu-min-konjugat syntetiseres. Den således opnåede blandede væske dialyseres mod vand, og der tilsættes acetone i en mængde på 2 dele acetone for hver del af den dialyserede 25 blandede væske, og disse homogeniseres. Der sættes 1 N HCl til den blandede væske til udfældning af konjugatet, og det udfældede konjugat separeres ved centrifugering. En passende mængde vand sættes til den separerede udfældning, og der tilsættes 1 N NaOH til indstilling af pH-værdien 30 på 8. Den således opnåede opløsning underkastes dialyse mod vand til fjernelse af acetone, og konjugatet optages derved. Processen til fremstilling af konjugat udføres ved lav temperatur, ca. 6°C.

Steroidbindingstallet i konjugatet kan bestemmes 35 efter kendte metoder, f.eks. ultraviolet absorption og ved dinitrophenylering (se prøve 1).

9 151400

Sensitivering af latexpartikler

En suspension af latexpartikler kan fremstilles ved vaskning og/eller fortynding af latexpartikler med en passende stødpudeopløsning (pH-værdi 7,2-8,6), og steroid-5 serumalbumin-konjugatet, som blev fremstillet i en passen de koncentration, tilsættes og holdes ved 37°C i 2 timer under omrøring til opnåelse af en suspension af sensitive-rede latexpartikler. Suspensionen centrifugeres, og bundfaldet skilles fra og vaskes derpå med stødpudeopløsning.

10 Centrifugering og vaskning gentages flere gange, og det således opnåede bundfald gensuspenderes i stødpudeopløsningen til opnåelse af en suspension af latexpartiker, som er sensitiveret med konjugatet. Mængden af konjugat, som benyttes til sensitivering af latexpartiklerne, kan be-15 grænses til et område, hvor følgende betingelser er opfyldt: (1) Eventuelt opnåelige sensitiverede latexpartikler viser ikke ikke -specifik agglutination som følge af karakteren af selve latexpartiklerne.

(2) Specifik agglutination som følge af antigen-anti- 20 stofreaktion kan forekomme.

Når antistoffet er neutraliseret med en tilstrækkelig mængde steroidhapten, og når derpå suspensionen af de sensitiverede latexpartikler tilsættes, kan den fremkomne blandede væske opretholde en homogen suspension uden at 25 forårsage nogen agglutination.

Som det skal nævnes nedenfor, varierer den mængde konjugat, som skal benyttes til sensitivering af latexpartiklerne (i det følgende betegnet sensitiveringsmængden) afhængende af størrelsen af latexpartiklerne og steroidbin-30 dingstallet i det konjugat, som skal benyttes.

Latexpartikler med forskellig størrelse, 0,234 γ og 0,721 γ sensitiveres henholdsvis med et konjugat, hvori estriol-16 o(-glncoronid er bundet med kaninserumalbumin i forholdet 2,0 molekyler for hvert molekyle kaninserumalbu-35 min i overensstemmelse med den ovenfor nævnte fremgangsmåde.

De minimale sensitiveringsmaengder i de respektive latexpartikler til eliminering af ikke-specifik agglutination 10 151400 > er 72 mg og 18 mg for hvert g latexpartikler, Normalt er mindre partikler tilbøjelige til at kræve større sensitiveringsmængder. Latex-partikler med partikelstørrelser på 0,234 μ sensitiveres med estriol--16a-glucuronid-konjugat med steroidbindingstal på 15,1 under anven-> delse af forskellige sensitiveringsmængder. Den minimale sensitive-ringsmængde til eliminering af ikke-specifik agglutination er 54 mg for hvert g latexpartikler. Det skal bemærkes, at den minimale sensitiveringsmængde i det sidste tilfælde er forholdsvis lille i sammenligning med mængden i det første tilfælde (72 mg/g), hvor la-) texpartikleme sensitiveres med konjugatet med steroidbindingstal på 2,0 (se tabel l).

Det skal også nævnes, at sensitiveringen af latexpartikler kan udføres ved dialyse, ultrafiltrering eller kombination deraf med ovenstående metode. Også sensitiverede latexpartikler kan fry-5 setørres.

Fremstilling af antistof.

Antistof kan fremstilles ved konventionelle metoder, f.eks.kan antiserum eller antistof fraskilt derfra opnås på en sådan måde, at der først fremstilles steroid-serumalbumin-konjugat ved omsætning af 0 steroid i den tilstand, som netop findes i human legemsvæske eller udskilt væske eller steroid med immunologisk krydsreaktivitet dermed til serumalbumin, og derpå doseres, f.eks. indsprøjtes det således opnåede konjugat ad ikke-oral vej på et pattedyr, som har et fremmed serum i forhold til det serum, som benyttes til frem-5 stilling af konjugatet til immunisering af det pattedyr, hvorfra antiserumet er taget. Det således opnåede antiserum kan benyttes som originalt antistof. Antistof kan naturligvis også separeres fra anfiserumet.

Det skal bemærkes, at det steroid, som skal detekteres, kan 0 reagere som et hapten med antistoffet, og konjugatet til sensitivering af latexpartiklerne kan også reagere dermed.

Steroiddetektering.

Der benyttes en konventionel metode, blot at man benytter det ifølge den foreliggende opfindelse fremstillede latexreagens.

[5 Detekteringsmetoden omfatter følgende to processer: 11 151400 (1) En given mængde af human legemsvæske eller udskilt væske, enten ufortyndet eller passende fortyndet, udtages som forsøgsprøve, og en given mængde antistof tilsættes og blandes med prøven til bevirkning af antigen-antistof-reaktion mellem steroidet, som 5 er haptenet indeholdt i prøven, og antistoffet (neutralisation af antistof).

(2) En given mængde af den blandede væske af prøven og antistoffet anbringes på et objektglas, og en given mængde af latex-reagenset tilsættes og blandes med en lang smal stav, og den blan- 10 dede væske på glaspladen iagttages nogle minutter senere til bestemmelse af, om der er sket en agglutinationsreaktion eller ej.

Dette vil sige, at hvis antistoffet ikke er helt neutraliseret med steroidet indeholdt i prøven, og hvis følgelig en overskydende mængde af antistoffet resterer i den første proces, så for-15 årsages der en antigen-antistof-reaktion mellem latexreagenset med resterende antistof, og agglutination kan iagttages i den anden proces. I det tilfælde, at antistoffet neutraliseres helt med det i prøven indeholdte steroid (indbefattet det tilfælde, hvor en overskudsmængde af steroid forbliver i den første proces) forårsages der 20 ikke nogen antigen-antistof-reaktion, og agglutination kan ikke iagttages, hvilket vil sige, at en agglutinationsinhiberingsreak-tion kan iagttages i den anden proces.

Det vil forstås, at koncentrationen af prøverne, latex-reagenset og antistoffet kan bestemmes på rette måde afhængende af 25 den anticiperede koncentration eller referencekoncentrationen af steroidhormon og/eller dets metabolit, som skal undersøges i prøven. Agglutinationsreaktionen i den anden proces kan bestemmes i løbet af 5 minutter.

Efter at have beskrevet de generelle og grundlæggende aspek-30 ter for latexreagenset, metoder til fremstilling deraf og til detektering af steroid under anvendelse af det omhandlede latexrea-gens, skal man nu i nærmere enkeltheder beskrive eksemplificerende forsøg.

Prøve 1.

35 I, Materialefremstilling, l) Konjugatfremstilling.

12 151400

Under anvendelse af estriol-16a-glucuronid (Sigma Company) og Isaninserumalbumin (INC Pharmaceuticals Company) fremstilles ni slags konjugat, som er forskellige i steroidbindingstal, som følger: 5 Fremstilling af væske A, 10 mg estriol-16a-glucuronid opløses i 1 ml dimethylform-amid♦ Til denne opløsning sættes 5*1 μΐ tri-n-butylamin, og der omrøres, Derpå tilsættes der 2,8 μΐ isobutylchlorformiat, og der omrøres , 10 Den samme mængde af væske A præpareres i ni beholdere.

Fremstilling af væske B.

Kaninserumalbumin opløses i afmineraliseret vand som vist i tabel 3 til opnåelse af kaninserumalbuminopløsningen med forskellige koncentrationer. Ved tilsætning af 1 N NaOH til de respek-15 tive opløsninger indstilles pH-værdien på 8,0-10,0, Til disse opløsninger sættes forskellige mængder af dimethylformamid, 'og ni slags væske B, hvori der indeholdes forskellige mængder af kaninserumalbumin, præpareres. Mængden af dimethylformamid indeholdt i hver af væskerne B indstilles, så at den totale mængde af dimethyl-20 formamid indeholdt i væske A og B svarer til mængden af afmineraliseret vand indeholdt i væske B.

Fremstilling af kon.iugat.

Hver af væskerne A sættes dråbevis til hver væske B i løbet af 1 time 30 minutter under omrøring, og ved tilsætning af 1 I 25 HaOH til de respektive opløsninger indstilles pH-værdien på 8,0-10,0, og hver af disse opløsninger emrøres yderligere i 3 timer, og der fås 9 slags estriol-16a-glucuronidkaninserumalbumin-kon;jugatopløs-ninger.

Hver af disse opløsninger underkastes dialyse mod afmine-30 raliseret vand. Til de dialyserede opløsninger sættes der respektive acetone i forholdet 2 dele acetone for hver del opløsning,

og efter tilstrækkelig omrøring tilsættes respektive 1 H HC1 til fældning af konjugatet. Det fældede konjugat i hver af opløsningerne separeres ved centrifugering i 5 minutter ved 10,000 omdrej-35 ninger pr, minut. Til hvert separeret konjugat sættes afmineraliseret vand, og efter indstilling af dets pH-værdi til ca, 8 med 1 H

13 151400

NaOH dialyseres hver af disse opløsninger mod afmineralise-ret vand til fjernelse af acetone. Således fås der 9 slags konjugat med forskellige steroidbindingstal (se tabel 3, prøver 1-9). Processerne til fremstilling af konjugatet udføres ved lav temperatur (6°C).

5 De respektive steroidbindingstal i konjugaterne er vist i tabel 3. Måling af steroidbindingstallet skal beskrives senere.

Fremstilling af konjugatlatexpartikler

De minimale sensitiverende mængder med hensyn til kon-10 jugaterne af prøverne nr. 1-9 til eliminering af ikke-speci- fik agglutination af de opnåelige konjugatlatexpartikler bestemmes som følger:

Ved opløsning af 5,0 mg, 5,2 mg, 5,4 mg og 5,6 mg af prøve nr. 1 (konjugat) i tabel 3 respektive i 40 ml 40 mM 15 vernonalstødpudeopløsning indeholdende 150 mM NaCl frem stilles 4 slags konjugatopløsninger. Til de 4 slags konju-gatopløsninger sættes 1 ml 10%'s suspension af latexpar-tikler med en partikelstørrelse på 0,234 μ, og disse holdes ved 37°C i 2 timer. De således opnåede sensitiverede latex-20 partikelsuspensioner underkastes centrifugering ved 4000 omdrejninger pr. minut i 20 minutter til bundfældning af de sensitiverede latexpartikler. De separerede bundfald suspenderes i 20 ml af samme veronalstødpude og centrifugeres under de samme ovennævnte betingelser til separering 25 af sensitiverede latexpartikler. Denne sidstnævnte proces gentages, og de således opnåede bundfald resuspenderes i 5 ml af samme veronalstødpude, og der fås 4 slags sensitiverede latexpartikelsuspensioner med forskellige sensiti-veringskvantiteter.

30 På objektglas dryppes 0,1 ml af hver af de sensitive rede latexpartikelsuspensioner, hvortil der sættes 0,1 ml antiserum, som neutraliseres med en overskudsvæske af estri-ol-16c\-glucuronid, og der blandes. Nogle minutter senere iagttages en eventuel tilstedeværelse af ikke-specifik 35 agglutination i de respektive blandede dråber.

Ikke-specifik agglutination iagttages i dråberne for de konjugatsensitiverede latexpartikelsuspensioner med sensitiverings- 14 151400 for dem, som er fremstillet under anvendelse af 5,4 mg og 5,6 mg af prøve nr. 1. Således bestemmes den minimale sensitiveringskvan-titet for prøve nr. 1 til 5,4 mg pr. 0,1 g latexpartikler, lignende prøver udføres med hensyn til prøverne nr. 2-9 5 til bestemmelse af de respektive minimale sensitiveringskvantiteter. Resultaterne er vist i tabel 1.

Tabel 1.

Prøve nr, 1 1_ 2__ J5_ _4_ _5_ _6_ J7_ J_ _ 0 estriol- 16a-glucu-ronidbindingstal 15,1 10,7 7,4 5,1 3,2 2,0 0,9 0,5 0,3 (pr. molekyle kaninse rumalbumin) 5 minimumsen- sitiverings-kvantitet (mg/0,1 g 5,4 5,9 6,3 6,5 7,0 7,2 7,4 7,4 7,4 latexpartikler)

Under anvendelse af de respektive minimumsensitiverings-0 kvantiteter af prøverne nr, 1-9 fremstilles der sensitiverede latex- partikelsuspensioner af prøverne nr. 1-9.

II. Måling af steroidbindingstal og steroiddetekteringssensitivitet.

1). Steroidbindingstalletsmåling.

Måling af steroidbindingstallet udføres ved metoden ifølge 5 Erlanger m.fl. under anvendelse af U.T,absorption (Journal of Biological Chemistry, bd. 234, side 1090, 1959) og ved Sanger's metode under anvendelse af dinitrophenylering (Biochemical Journal, bd. 39, side 507, 1945).

I) Måling ved U.T.absorption.

0 Estriol-16a-glucuronid og kaninserumalbumin absorberer i samme spektralområde, dvs. med et maksimum ved 278 nin., og absorptionsmaksimum for konjugatet deraf kan måles som summen af absorptionsmaksima af de respektive komponenter. Følgelig kan absorban-sen afledt af estriol-16a-glucuronid i konjugatet fås ved subtrak-5 tion af absorptionsevnen af kaninserumalbumin fra absorptionsevnen af konjugatet. Ted sammenligning af den således opnåede absorptionsevne afledt af estriol-16a-glucuronidet i konjugatet med absorptionsevnerne af en række kendte koncentrationer af estriol-16a-glucoronid fås estriol-16a-glucuronidets bindingstal.

15 151400 II) Måling ved dinitrophenylering.

Lysinradikaler (Lys) i konjugatet og i serumalbuminet, der benyttes til fremstilling af konjugatet, dinitrophenyleres hver især med dinitrofluorbenzen til fremstilling af dinitrophenyleret konju-5 gat og dinitrophenyleret serumalbumin. Derpå hydrolyseres disse dinitrophenylerede produkter hver især ved 110°C i 24 timer for frit dinitrophenyllysin. Således fås der 2 slags opløsninger indeholdende dinitrophenyllysin, den ene afledt af konjugatet og den anden afledt af serumalbumin. På den anden side fås kommercielt 10 dinitrophenyllysin som et referencestof, og serievis fortyndede opløsninger deraf fremstilles. Under anvendelse af de ovennævnte 2 slags dinitrophenyllysin indeholdende opløsninger og serievis fortyndede referencedinitrophenyllysinopløsninger underkastes disse kolorimetrisk bestemmelse ved 390 nm, og derpå beregnes steroidbin-15 dingstallet i konjugatet ud fra værdierne af den optiske tæthed deraf.

2) Måling af steroiddetekteringsfølsomhed.

Normalt måles steroiddetekteringsfølsomhed på en sådan måde, at man først bestemmer titeren af det oprindelige antistof med 20 referencesteroidopløsning, og derpå bestemmes titeren af de respektive prøver nr. 1-9 under reference til titeren af det oprindelige antistof. Enkelthederne fremgår af det følgende.

I) Bestemmelse af titer af antistof.

Antiserum fås fra kaniner som immuniseres med estriol-16a-25 -glucuronid-okseserumslbumin-konjugat ved en passende konventionel metode, og antiserumet benyttes som et oprindeligt antistof. Dette oprindelige antistof fortyndes serievis med 40 ml veronal stødpudeopløsning indeholdende 150 mM NaCl. Til 0,05 ml af det serievis fortyndede antistof sættes 0,05 ml af en opløsning fremstillet ved 30 opløsning af 0,1 n mol estriol-16a-glucuronid pr, 1 ml af stødpudeopløsningen, respektive, og der omrøres go<dt. Idet man dråbevis tager 0,1 ml af de respektive omrørte blandede opløsninger på ot^ekt-glas,tilsættes der 0,1 ml af den konjugatsensitiverede latexparti-kelsuspension med estriol-16a-glucuronidbindingstal på 2,0 til hver 35 af dråberne på objektglassene, og de omrøres godt. Iagttagelse efter 3 minutters forløb viser, at en agglutinationsreaktion er de-tekterbar i dråberne med 200 gange eller mindre fortynding af det oprindelige antistof.

16 151400 tabel 2.

Fortynding af antistof 50 x 100 x 200 x 500 x 400 x

Agglutination + + +

Dette betyder, at det oprindelige antistof ved fortynding 5 200 gange kan neutralisere mindst 0,1 n mol estriol-16a-glueuronid pr. ml.

Således bestemmes titeren af dette 200 gange >fortyndede antistof som 0,1 n mol estriol-16^ _ glucuronidækvivalent pr. ml, og titeren af det oprindelige antistof som 20 n mol estriol-16 10 glucuronidækvivalent pr. ml.

II) Bestemmelse af titer af latexreagens.

Det oprindelige antistof fortyndes serievis med 40 mM vero-nalstødpudeopløsning, og 1,0 ml af hvert serievis fortyndet antistof dryppes på objektglas. Til disse dråber sættes 0,1 ml af hver 15 af prøverne nr. 1 til 9 (se tabel 1), og der omrøres godt, og resultaterne iagttages efter 3 minutters forløb. På basis af den maksimale fortynding i de dråber, hvori agglutinationsreaktion iagttages, og titeren af det oprindelige antistof beregnes titeren af latexreagensprøverne. Det vil derfor forstås, at lavere numeriske 20 værdier af titeren betyder højere detektionsfølsomhed.

Estriol-16a-glucuronidbindingstallet og detektionsfølsomhe-den for de respektive prøver nr. 1-9 er vist i tabel 3.

17 151400 li I 8 -d ω κω ·η -μ β -d η β β Η

Od ΙΟ Φ<Μ ε _ _ •Η Λ Η hrl OK1K1^in<rin(0^ μ ε ο d φ μ η νο m η ο ο ο ο ο η χ ο ·Η Ο ί> W Ο - ·> - - - - ·* - - Φ Κ> β d ·Η Η ε Η Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο Ο μ η -μ η > -μ ω s to β β ό •μ φ ι æ cc^

I I

I O <D

O β Η I Φ CMO'«NCMVO<l-inlNLr\ β μ !>> CO Ό - ·- - ·> ·> *> » ·> ·>

β Ή β hO O NHOOvOIOCMHOO

0 β Φ βμ Η Η β ·Η β ·Η Φ Η Η τ3 ft β ε 50Φ ι μ 8 ω ι κω ω μ w Η β Φ β 1 ·Η Η Ο Η *d ο ·Η ο β ·η μ •Η Η (¾ Φ β μ cti β τί HN-iHCMOCJvioro 'ϋ ^ Ο Ο ► •ν*****·**'·*·'*

to ·η μ to μ Lnot>tnrocMOOO

• Φ β Η β ο Η Η ro d cd ε Η φ μ

cti I

Εη ·η ό Η β cti to β > ^

Φ H<|-<f-OHOOOOO

β μ ε ---------

•ΗΦ ^riNIAIAtOWstCOW

β ε β Η W <f Ν φ «Η Φ ω φ ω Η Φ ω β c •Η Cil μ I g m φ 8\ 3 μ κω *d η ΙΓ to η ·η y οοοοιποιηΝ-ιο

Cj I r.»·.*'*'*'*'*'***'

oho d ininotN-iroHOO

Η Ο β (R CvJ Η H

μ ·η d 3 φ β o 75 β μ d §

Cti to H

p. Φ 50 8 β I I -H^-n β ε ε <!^ τΐ d 3cq b£ to ro o O H co οι ro lo.

β βμβ 6 to cn <f ο η κο rovo σν β (BHw η cm ro <r σν οο in

X W Cti H CM

Φ K* ·

$ β HCMrO-Cj-lOVOINCDOV

β β 18 151400

Af denne tabel 3 vil det ses, at der er korrelation mellem steroidbindingstallet og detektionsfølsomheden af prøverne nr. 1-9. Dette vil sige, at detektionsfølsomheden forøges, når steroidbindingstallet formindskes. Imidlertid 5 når detektionsfølsomheden sit maksimum, når steroidbin dingstallet er 2,0 (ved U.V. absorptionsmetode), og derefter aftager detektionsfølsomheden, når steroidbindingstallet formindskes.

Derfor vil det forstås, at der i overensstemmelse 10 med opfindelsen opnås udmærket følsomhed på 0,2 n mol estri- ol-16o<-glucuronidækvivalent pr. ml, og dette er bemærkelsesværdigt højere end for det konventionelle latexreagens i området 2,5 n mol estriol-16 -glucuronidækvivalent pr. ml.

15 Denne udmærkede detektionsfølsomhed er opnåelig, når steroidbindingstallet falder i området 0,5-8,7 målt ved både U.V. absorptionsmetoden og dinitrophenyleringsmetoden.

Høj følsomhed over 0,1 n mol estriol-166(-glucuronidækvi-valent pr. ml kan opnås, når steroidbindingstallet falder 20 inden for området 0,7-7,0.

Prøve 2

Der udføres en lignende prøve som i prøve 1 med hensyn til latexpartikler sensitiveret med dehydroepiandro-steron-17-(o-carboxymethy1)-oxim-okseserumalbumin-konjugat.

25 Under anvendelse af dehydroepiandrosteron (DHEA) og okseserumalbumin (BSA) fremstilles 8 slags konjugat med forskelligt steroidbindingstal i området 0,5-18,3 som følger:

Opløsning af 0,75 g DHEA og 0,69 g (o-carboxymethyl)-30 hydroxylamin-hydrochlorid i 20 ml ethylalkohol.

I 20 ml ethylalkohol opløses 0,75 g DHEA og 0,69 g (o-carboxymethyl)-hydroxylamin-hydrochlorid og 2 ml 6,4 M natriumsuccinatopløsning tilsættes til opretholdelse af alkalisk reaktion. Den fremkomne opløsning tilbagesvales 35 i 1 time til fremme af reaktionen, og derpå tilsættes ^2*303, så at koncentrationen af lS^CO^ i den fremkomne opløsning andrager 5%.

19 151400· 1

Vaskning af den fremkomne opløsning med ether foretages, og derefter syrnes dens vandige lag med koncentreret saltsyre, og den fremkomne udfældning skilles fra.

Denne udfældning omkrystalliseres af ethanol, og der fås 5 0,6 DHEA-17-(o-carboxymethyl)-oxim, som i det følgende skal betegnes DHEA-CMO.

Under anvendelse af denne DHEA-CMO og okseserumalbu-min (BSA) i de i tabel 4 viste molforhold fremstilles der 8 slags konjugat (prøve nr. 1-8) med forskellige steroid-.0 bindingstal på lignende måde som i prøve 1. Steroidbindings tallene i prøverne nr. 1-8 måles ved denitrophenylerings-metoden. Resultaterne er også vist i tabel 4.

Minimumsensitiveringskvantiteten bestemmes med hensyn til prøverne nr. 1-8 på samme måde som i prøve 1. Resulta-5 terne er også vist i tabel 4.

Under anvendelse af minimumsensitiveringskvantiteten for prøverne nr. 1-8 fremstilles der 8 slags latexreagenser, og steroiddetekteringssensitiviteten måles med hensyn til disse prøver som følger: !0 Til 1 ml 10%'s suspension af latexpartikler med en partikelstørrelse på 0,721 ji sættes 4 ml 20 mM phosphor-stødpudeopløsning (pH-værdi 7,2) indeholdende 150 mM NaCl.

Efter tilstrækkelig omrøring centrifugeres den fremkomne suspension ved 4000 omdrejninger pr. minut i 20 minutter.

*5 Det opnåede bundfald suspenderes i 5 ml af samme stødpude opløsning. Den fremkomne suspension centrifugeres igen under samme betingelser som ovenfor, og bundfaldet separeres. Den samme mængde af sådanne vaskede latexpartikler præpareres i 8 hold.

30 Minimumsensitiveringskvantiteterne for de respektive konjugatprøver nr. 1-8 i tabel 4 opløses i 5 ml af stødpudeopløsningen til fremstilling af 8 slags konjugatopløs-ninger med forskellige steroidbindingstal, og disse respektive opløsninger sættes til de 8 hold af de nævnte 35 vaskede latexpartikler. Efter at de fremkomne suspensioner er blevet holdt ved 37°C i 2 timer, underkastes de hver især centrifugering og vaskning med stødpudeopløsningen 2 gange. De fremkomne bundfald resuspenderes hver især i 20 151400 5 ml af stødpudeopløsningen, og der fås 8 slags DHEA-CMO-BSA-sensitiverede latexpartikelsuspensioner (tabel 4, prøverne nr. 1-8).

I mellemtiden fås antiserum fra kaniner, der er immuniseret med DHEA-CMO-ESA, og dette benyttes som antistof.

5 Antistoffet fortyndes serievis med 20 mM phosphorsyrestød- pudeopløsning (pH-værdi 7,2) indeholdende 150 mM NaCl.

Idet man tager 0,05 ml af hvert af de fortyndede antistoffer, blandes de henholdsvis med 0,05 ml af en opløsning fremstillet ved opløsning af 0,2 n mol DHEA pr. ml af en 10 opløsning fremstillet ved opløsning af 0,2 n mol DHEA pr.

ml af stødpudeopløsningen til neutralisation af antistoffet deri. På objektglas dryppes 0,1 ml af de respektive neutraliserede opløsninger, og til hver af disse dråber sættes 0,1 ml suspension af latexpartikler sensitiveret med konju-15 gatet med DHEA-bindingstallet 2,4, og der omrøres godt.

Maksimal fortynding af antistof, som muliggør detektering af agglutination i løbet af 3 minutter, er 50-dobbelt.

Derfor bestemmes titeren af 50 gange fortyndet antistof som 0,2 n mol DHEA-ækvivalent/ml, og titeren af oprinde-20 ligt antistof bestemmes som 10 n mol DHEA-ækvivalent/ml.

Derpå fortyndes det oprindelige antistof serievis med 20 mM phosphorsyrestødpudeopløsning, og 0,1 ml af hvert fortyndet antistof blandes med 0,1 ml af latexreagensprøverne nr. 1-8 på objektglas og den maksimale fortynding af 25 antistof, som giver agglutination i løbet af 3 minutter, vurderes. De respektive detektionsfølsomheder af latexrea-gensprøverne nr. 1-8 bestemmes på lignende måde som i prøve 1 på basis af maksimumfortyndingen og titeren af det oprindelige antistof. De beregnede titere er også vist i 30 tabel 4.

21 151400 Η

tS I

<H « «

CQ Wfl-P ΰ ΓΊ H c rH

0 i d o *H S ooinot>inir\co

•H Η Ο Η O -^inHHOOOO

P Ό O d CO P H - - *> - « * ~ * js; φ ·Η d £ M O H o o o o o o o <D £ d ο -Η ·Η 6

P £3 P d > P

(DO MH^h β C

Ό CQ <D bQJB CO '-i CQ Φ

bO H

C C

CQ -Η ·Η

M ^ -P

I φ bo d ojrornint^isooco O t> OCJ ♦‘•'Λ****'*’

S ·Η Η & HHHHHHHH

O -P Φ - X IHO O 0) C cq bo 'v.-p w d d bo co x φ æ s h p oi g w •

rH

Φ I

p CQ

(0 H b0 eh cd d raid tOOisvovoo-cMirs

ill o ID

d d H <D COHC^infOCMrHO

1 Ή ρ >^τ) H H

<U Ό ·Η d o w d d cdp Εβ Ή Ηβφ flfl -d ft s <u c CO xi

ffl H

\ O CP

i o p ooooiftoint'- CQSIh ddo ο • mmoc'-<i-cPHo

Ο β) I <H CO Η H

•H CQ <J H

PH (¾ o (0 <D K s

d b£ P "-P

co d ft-H 83P d Φ ftp Λ ^ σ>

<! bO

CQ g HOOISOOOO

rpw o-cNjoomoooo rH H C\l <J" CD CM <j"

H CM

Φ i> · sd -H CM fOHt ΙΛ CD C^00 d c ft 22 151400

Af tabel 4 vil det ses, at den højeste følsomhed fås, når DHEA-CMO-bindingstallet falder i området 1,2-2,4, og en følsomhed på 0,2 n mol DHEA-ækvivalent/ml fås, når DHEA-CMO-bindingstallet falder i området 0,5-7,7.

5 Prøve 5.

Under anvendelse af forskellige slags steroider og serum-albuminer, som ikke er benyttet i prøve 1 og 2, udføres lignende prøver. Maksimum- og minimumværdierne for steroidbindingstal, med hvilke der kan opnås en følsomhed På 0,2 n mol steroidækvi-10 valent/ml, er vist i tabel 5.

Tabel 5.

Jconjugat til sensiti- ateroldbindlngstal- vering af latexpartik- minimum maksimum 15 ler_ _ _ progesteron-ll-hemisue- cinat-ESA 0,5 8,0 hydrocortison-21-hemi- succinat-HSA 0,5 7,0 20 aldosteron-3-(o-carb- oxymethyl)-oxim-ESA 0,5 7,5 testosteron-17-gluco- ronid -ESA 0,5 8,5 pregnand i ol-3-hemi- 25 succinat-ESA 0,5 7,3

Af ovenstående kan det ses, at uanset det benyttede steroid og serumalbumin fås der en følsomhed på 0,2 n mol steroid-ækvivalent/ml, når steroidbindingstallet i konjugatet falder i området 0,5-7,0.

30 Prøve 4.

Sammenligningsforsøg for steroiddetekteringsfølsomhed mellem latexreagenset fremstillet ifølge opfindelsen og det efter konventionel metode fremstillede udføres som følger: latexreagens fremstilles ved den konventionelle metode på 35 samme måde som i prøve 1, blot at 47 mg kaninserumalbumin (ESA) og 1,0 ml afmineraliseret vand benyttes, og der fås estriol-16cr-glucu-ronid-ESA-konjugat. Steroidbindingstallet i dette konjugat er 20 ved ultraviolet ahsorption som angivet i prøve 1. Under anvendelse af forskellige mængder af dette konjugat sensitiveres latexpartik-40 ler på samme måde som i prøve 1, og der fås indbyrdes forskelligt sensitiverede latexreagenser, som underkastes stabilitetsforsøg 151400 1 23 for ikke-specifik agglutination på samme måde som i prøve 1, Den minimale sensitiveringskvantitet for konjugatet til eliminering af ikke-specifik agglutination bestemmes til 5,0 mg pr. 0,1 g la-texpartikler.

> Således fremstilles et sammenligningslatexreagens (prøve .....

nr. 10) ved sensitivering af latexpartikler med minimumsensitive-ringsmængden af konjugatet.

Yderligere fremstilles der sammenligningslatexreagenser (prøve nr. 11-14) på en sådan måde, at latexpartiklerne sensitive-) res med minimumslængderne af konjugaterne, som er modificeret forskelligt fra det, som benyttes til prøve nr. 10. Nærmere betegnet modificeres konjugatet på en sådan måde, at der til den samme mængde af konjugatet fremstillet i 4 hold sættes forskellige mængder af vandig opløsning af immunologisk indifferent RSA, så at det fremkom-5 ne molforhold mellem steroidet og det totale RSA i det modificerede konjugat bliver 1,2,5 og 10, og derpå med hensyn til disse modificerede konjugater bestemmes de maksimale sensitiveringsmængder på lignende måde som i den foregående prøve. Ved derpå at benytte de respektive minimale sensitiveringsmængder for 4 slags modificeret kon-3 jugat sensitiveres latexpartiklerne, og det yderligere sammenlig-ningslatexreagens (prøver nr. 11-14) fremstilles.

Under anvendelse af de således opnåede 5 slags sammenlig-ningslatexreagensprøver nr. 10-14 og latexreagensprøverne nr. 6 og 9 i prøve 1 udføres en sammenligningsprøve for steroiddetektions-5 følsomhed på samme måde som i prøve 1. Resultaterne er vist i tabel 6, 24 151400

Ti Φ I Λ β ε ο θ3·Ρ «Η β Η faO Φ S I Η · «Η β «ΰ β rave > ^ <} <τ> φ βΗ·Η η oh in in ο m co « ο I > «Η S ·>·> »·>·>»* ιΡ ΠΗΛΟ \ ΟΟ (Μ Η Η Ο Ο Φ •ρ ο æ -μ η τ* ^ ·η τι ω ο β φ β η ·η ε ·η Ρ+>β+> 'Η Φ W Ο β β ft

Ti Φ β Φ ^ ο φ &0 »'-s Η

β IS

φ φ «Η Τί Η ·Η β Λ Φ ·Η -Ρ β ·Ρ $ Φ faO β +3 > cd cm -ί ο ο is <l· in φ •Ρ Η ft ·>·. Λ ·* ·* ·* ·“ bp -ΡΦ - £F s s m Φ ιο Ν IS β •P Τ Ο Φ ·η> • ω fao \-ρ β VD β β faced Ο φ s επ λ Η ιο S ^ _

φ TJ

rQ g φ ε 6-1 +5 I ρ ω ^ β fao <ή φ β Φ CO > •Η Η Cd Τ) >> +3 β ,¾ -Ρ Ή •Η Φ Η Ο m Μ rQ ι—I Φ » ·. β -d ο+3 <μο οοιηηΐΗ φ •Η ε ο CM Η Μ ° +> , β · β Φ Η β «Η Φ •Ρ Φ ft Φ Η ω +> w .it! *Η -Ρ β χΐ Φ Η-Ρ ft Ο β Μ ini ο Φ β β Φ ο +3 Ο Φ > Φ Η φ 'Η <Η 13 > 1-3 Μ·*Η β IS * ΗΗιΗΗ faO-Η ft β β β τ) ft β II I ........

•Ρ β faoo ·* Τ) ·Ρ Ο Η ·· Η |C| ΟΙ σι * β <! Η

Φ β< 1 W

Η Ο W β cd bp ,Ω «Η Cd β ' β *π φ β > . s s β * æ ^ ε ^ Ρ VOCTi Ο Η CM m <l· Φ

ρ, Η Η Η Η Η CQ

25 151400

Af tabel 6 vil det ses, at steroiddetekteringsfølsomheden for prøve nr. 6 er 62,5 gange værdien for prøve nr. 10, og at følsomheden af prøve nr. 9 er 13 gange følsomheden i prøve nr. 10, skønt prøve nr. 9 har den laveste følsomhed blandt prøverne ifølge 5 den foreliggende opfindelse. Det er derfor klart, at latexreagen-serne ifølge opfindelsen har yderst høj følsomhed sammenlignet med konventionelle latexreagenser, som har store steroidbindingstal.

Hvad angår de yderligere sammenligningslatexreagensprøver nr. 11-14, er steroiddetekteringsfølsomheden af prøve nr. 13 den 10 højeste iblandt dem, men følsomheden er omtrent 1/12 af følsomheden i prøve nr. 6, og ca, 2/5 af følsomheden for prøve nr. 9. Skønt endvidere disse reagensprøver nr. 11-14 har små steroidbindingstal i sammenligning med dem ifølge opfindelsens reagensprøver, betragtes disse reagensprøver nr. 11-14 ikke nødvendigvis som konventio-15 nelle reagenser, da der ikke foreligger nogen reference, så vidt vides, som anviser eller antyder en nedsættelse af steroidbindings-tallet til et sådant niveau til forøgelse af følsomheden. I alle tilfælde vil det være klart, at følsomhedeme af prøverne nr. 11-14 ikke kan sammenlignes med værdien i prøverne ifølge opfindelsen, 20 Derfor vil det forstås, at den foreliggende opfindelse mu liggør detektering af mindre koncentrationer af steroid, som ikke kan detekteres med det gængse latexreagens eller alternativt at fortynde en væske, som skal undersøges, til eliminering af uheldig indvirkning af koeksisterende stoffer, når væsken indeholder steroid 25 i højere koncentration. Den foreliggende opfindelse gør det med andre ord muligt at udføre mere pålidelige kvantitative analyser af steroider og muliggør også tilvejebringelsen af mere nøjagtige d iagnose opløsninger.

Endvidere kan den foreliggende opfindelse tilvejebringe et 30 latexreagens med udmærket høj følsomhed, og derfor kan steroiddetektering opnås med en mindre mængde af antistof eller antiserum. Følgelig er det muligt at nedsætte forbruget af antistof, og i betragtning af, at fremstillingen af antistof eller antiserum medfører meget høje omkostninger, er den foreliggende opfindelse for-35 delagtig i økonomisk henseende.

Nedenstående eksempler illustrerer opfindelsen.

26 151400

Eksempel 1 Væske A fremstilles ved opløsning af 50 mg estriol-16^-glucuronid i 10 ml dimethylformamid, og der tilsættes 26 pi tri-n-butylamin og derpå 14 jil isobutylchlorformiat, 5 og der omrøres godt.

2,33 g RSA opløses i 60 ml afmineraliseret vand, og der tildættes 1,0 ml 1 N NaOH, og derefter tilsættes der 50 ml dimethylformamid, hvorved man får væske B.

Til denne væske B sættes den tidligere fremstillede 10 væske A dråbevis, og der omrøres i 1 time, hvorpå der til sættes 0,1 ml 1 N NaOH, og der omrøres yderligere i 3 timer 30 minutter. Efter dialyse af opløsningen mod afmineraliseret vand sættes der 2 dele acetone til hver opløsning, og efter ensartet omrøring tilsættes der 1 N HCl til ud-15 fældning af syntetiseret striol-16<X-glucuronid-RSA-konju- gat. Bundfaldet fraskilles ved centrifugering ved 10.000 omdrejninger pr. minut i 5 minutter.

Til det fraskilte bundflad sættes afmineraliseret vand, og pH-værdien indstilles til 8 med 1 N NaOH, hvorpå man 20 underkaster dialyse mod afmineraliseret vand til fjernelse af acetone. Således fås der 1,78 g af konjugatet (udbytte 75%). Disse processer udføres ved lav temperatur (6°C).

Steroidbindingstallet (estriol-16e( -glucuronid) målt ved U.V. absorptionsmetoden og dinitrophenyleringsmetoden er 25 henholdsvis 2,2 og 1,9.

Derpå opløses 76 mg konjugat i 400 ml 40 mM veronal-stødpudeopløsning (indeholdende 150 mM NaCl, pH-værdi 7,8), og der tilsættes yderligere 10 ml polystyrenlatexpartikler (partikelstørreIse 0,234 p) i suspension (10%'s koncentra-30 tion), og de holdes ved 37°C i 2 timer til opnåelse af sensitivering. Den sensitiverede latexsuspension underkastes centrifugering ved 4000 omdrejninger pr. minut i 20 minutter, og det fremkomne bundfald suspenderes i 200 ml af stødpudeopløsningen og underkastes derpå centrifugering 35 under de samme betingelser som ovenfor 2 9an.ge. Det således opnåede bundfald gensuspenderes i 50 ml af stødpudeopløsningen, og der tilsættes derpå natriumazid, så at den fremkomne koncentration deraf er 0,1%, så at der fås 50 ml estri- 27 151400 ol-16 cC-glucuronid-RSA-sensitiveret latexpartikelsuspension (2% tæthed).

Ved blanding på et objektglas af 0,1 ml af den således opnåede sensitiverede latexpartikelsuspension og 0,1 ml 5 fortyndet anti-estriol-16<K -glucuronid-BSA-antistofopløs- ning, som fremstilles på samme måde som i prøve 1 og fortyndet til en titer på 0,04 n mol estriol-iecK -glucuronid-ækvivalent/ml, iagttager man agglutination i løbet af 1-2 minutter. Når imidlertid antistoffet fortyndes til at have en 10 titer på 0,02 n mol estriol-16^-glucuronidækvivalent/ml, iagttages der ingen agglutination, og titeren af latex-reagenset fremstillet i dette eksempel bestemmes til 0,04 n mol estriol-16ø(-glucuronidækvivalent/ml.

Eksempel 2 15 DHEA-CMO fremstilles på samme måde som i prøve 2.

Væske A fremstilles ved tilsætning af 0,5 g DHEA-CMO til 100 ml dimethylformamid, og derpå tilsættes der yderligere 0,33 ml tri-n-butylamin og 0,18 ml isobutylchlorformiat, og der omrøres godt.

20 Der tilsættes 18,0 g BSA til 600 ml afmineraliseret vand, og yderligere 500 ml dimethylformamid tilsættes, og der fås væske B.

Til denne væske B sættes den i forvejen fremstillede væske A dråbevis, og efter omrøring i 1 time 30 minutter 25 indstilles dens pH-værdi på 9,0 med 1 N NaOH, og der omrø res i yderligere 3 timer 30 minutter. Den således opnåede opløsning dialyseres mod strømmende vand, hvorpå der tilsættes 2 dele acetone for hver del opløsning. Efter homogen omrøring sættes der 1 N HC1 til opløsningen til udfæld-30 ning af det syntetiserede konjugat, og derpå underkastes opløsningen centrifugering ved 5000 omdrejninger pr. minut i 20 minutter. Til det fraskilte bundfald sættes der afmineraliseret vand, og efter indstilling af pH-værdien på ca. 8 med 1 N NaOH dialyseres opløsningen mod strømmende 35 vand til fjernelse af acetone, og der fås 13,0 g DHEA-CMO- BSA-konjugat (udbytte ca. 70%). Steroidbindingstallet (DHEA-CMO) for dette konjugat målt ved dinitrophenyleringsmetoden er 4,1.

28 151400

Derpå opløses 68 mg af det således opnåede konjugat i 100 ml 100 mM glycinstødpudeopløsning (indeholdende 130 mM NaCl og 0,1% natriumazid, pH-værdi 8,2), og til denne opløsning sættes der 10 ml 10%'s suspension af poly-5 styrenlatexpartikler, og derpå dialyseres blandingen mod stødpudeopløsningen ved stuetemperatur i 5 dage med henblik på sensitivering- Den således opnåede sensitiverede latexsuspension underkastes centrifugering ved 4000 omdrejninger pr. minut i 20 minutter, og efter at bundfaldet 10 er suspenderet i 200 ml af stødpudeopløsningen, underkastes suspensionen centrifugering og vaskning med stødpudeopløsningen under de samme betingelser 2 gange. Endelig fås der ved gensuspendering af det opnåede bundfald i 50 ml af stødpudeopløsningen 50 ml 20%'s DHEA-CMO-BSA-sensitiveret 15 latexpartikelsuspension.

Ved blanding på et objektglas af 0,05 ml 0,1 n mol/ml DHEA med 0,05 ml fortyndet antistof, som er fremstillet på lignende måde som i prøve 2 og fortyndet med stødpudeopløsningen til en titer på 0,1 n mol DHEA-ækvivalent/mi og derpå tilsætning af 0,1 ml 20 af den derefter opnåede sensitiverede latexpartikelsuspension iagttages der ingen agglutination, selv efter 10 minutters forløb. Når 0,1 ml af den sensitiverede latexpartikelsuspension sættes til blandingen af 0,05 ml 0,02 n mol/ml DHEA og 0,05 ml af det fortyndede antistof, iagttages agglutination i løbet af 2-5 minutter. Gen-25 nem en lignende fremgangsmåde som i prøve 1 bestemmes titeren af det i dette eksempel opnåede latexreagens til 0,05 n mol DHEA-ækvivalent/ml.

Eksempel 5.

30 Væske A fremstilles ved opløsning af 1,1 g testosteron-17- -glucuronid i 200 ml dimethylformamid, og til den således opnåede opløsning sættes successive 0,52 ml tri-n-butylamin og derpå 0,28 ml isobutylchlorformiat, og der omrøres godt.

Væske B fremstilles ved opløsning af 46,6 g ESA i 1,2 liter 35 afmineraliseret vand, og efter indstilling af dets pH-værdi til 9»0 med 1 H NaOH tilsættes der 1,0 liter dimethylformamid. På lignende måde som i eksempel 2 fås 39»0 g testestoron-17-glucuronid-ESA (i 29 151400 det følgende betegnet T-17-G-RSA) (udbytte ca. 82%). Steroidbindingstallet (T-17-G) i dette konjugat.målt ved U.V. absorptionsmetoden og dinitrophenyleringsmetoden er henholdsvis 2,3 og 2,1.

5 Derpå tilsættes 400 ml 20 mM phosphorsyrestødpude- opløsning indeholdende 150 mM NaCl (pH-værdi 7,2) til 100 ml 10%'s suspension af polystyrenlatexpartikler med en partikelstørrelse på 0,721 ji, og derpå underkastes suspensionen centrifugering ved 4000 omdrejninger pr. minut.

X0 Det således opnåede bundfald suspenderes i 500 ml af stød pudeopløsningen, hvorpå man centrifugerer suspensionen under samme betingelser som ovenfor, og bundfaldet skilles fra. Tilsætning af 500 ml af stødpudeopløsningen indeholdende 180 mg af det ovenfor opnåede konjugat til det fra-15 skilte bundfald foretages. Efter at den således opnåede suspension er blevet holdt ved' 37°C i 2 timer, underkastes suspensionen centrifugering under de samme betingelser, og derpå foretager man vaskning med stødpudeopløsningen og centrifugering 2 gange. Det opnåede bundfald gensuspende-20 res i 500 ml stødpudeopløsning, og endelig tilsættes der natriumazid, så at koncentrationen deraf bliver 0,1%. Således fås 500 ml 2%'s T-17-G-RSA-sensitiveret latexpartikel-suspension.

På lignende måde som i prøve 1 fremstilles anti-T-17-G-RSA-25 -antistof, og derpå fortyndes det med stødpudeopløsningen, hvorved der fås en titer på 0,05 n mol T-17-G-ækvivalent/ml. På et objektglas blandes 0,1 ml af dette fortyndede antistof med 0,1 ml af den opnåede latexpartikelsuspension, og agglutination iagttages i løbet af 1-2 minutter. Når imidlertid antistoffet fortyndes til at give 30 en titer på 0,02 n mol T-17-G-ækvivalent/ml, iagttages der ingen agglutination i løbet af 5 minutter* Derpå bestemmes latexreagenset, som fås i dette eksempel, til 0,05 n mol T-17-G-ækvivalent/ml.

Eksempel 4.

Væske A fremstilles ved tilsætning af et vist mol natrium-35 hydrocortison-21-hemisuccinat gied samme mol koncentreret saltsyre, og derpå inddamper man og vasker med vand, og disse inddampninger 30 151400 og vaskninger gentages flere gange og efterfølges af en fuldstændig tørring, og 0,5 g af det således opnåede tørrede materiale opløses i 100 ml dimethylformamid, og under omrøring tilsætter man 0,26 ml tri-n-butylamin og 0,14 ml 5 isobutylchlorformiat.

I mellemtiden fremstilles væske B ved opløsning af 17,6 g HSA i 600 ml afmineraliseret vand, og man indstiller pH-værdien på 9,0 med 1 N NaOH, og endelig tilsætter man 500 ml dimethylformamid. Derefter fås der på lignende 10 måde som i eksempel 2 ca. 13,6 g hydrocortison-21-hemisuc- cinat-HSA (i det følgende betegnet HC-21-HS-HSA)(udbytte ca. 75%). Steroidbindingstallet (HC-21-HS) i dette konju-gat målt ved dinitrophenyleringsmetoden er 3,0.

Derpå sættes der 200 ml 40 mM veronalstødpudeopløs-15 ning indeholdende 150 mM NaCl (pH-værdi 7,8) til 50 ml 10%'s suspension af polystyrenlatexpartikler med en partikelstørrelse på 0,721 ^i, og den således opnåede suspension centrifugeres ved 4000 omdrejninger pr. minut i 20 minutter. Det således opnåede bundfald suspenderes i 250 ml 20 stødpudeopløsning og .centrifugeres derpå under de samme be tingelser som ovenfor, og man samler bundfaldet. Derpå sættes der 250 ml stødpudeopløsning indeholdende 88 mg af det ovenfor fremstillede konjugat til bundfaldet (latex-partikler), den opnåede suspension holdes på 37°C i 2 ti-25 mer, og derpå centrifugeres til samling af bundfaldet.

Bundfaldet gensuspenderes i 250 ml af stødpudeopløsningen og centrifugeres under de samme betingelser som ovenfor, og disse fremgangsmåder gentages. Det således opnåede bundfald gensuspenderes i 250 ml af stødpudeopløsningen, 30 og der tilsættes natriumazid, så at koncentrationen deraf bliver ca. 0,1%. Således fås der 250 ml ca. 2%'s HC-21-HS-HSA-sensitiveret latexpartikelsuspension.

Derpå blandes 0,05 ml 0,1 n mol hydrocortison med 0,05 ml fortyndet antistof, som er fremstillet på lignende 35 måde som i prøve 1, og fortyndes med stødpudeopløsningen til en titer på 0,1 n mol HC-21-HS-ækvivalenter/ml på et objektglas, og derpå blandes 0,1 ml af den ovenfor fremstillede sensitiverede latexpartikelsuspension dermed.

151400 31

Der iagttages ingen agglutination efter 10 minutters forløb. Når imidlertid 0,05 ml af 0,05 n mol/ml hydrocortison og 0,05 ml af det fortyndede antistof blandes, og når der derpå tilsættes 0,1 ml af den sensitiverede latexpartikel-5 suspension på et objektglas, iagttages agglutination i løbet af 2-3 minutter. Titeren for latexreagenset i dette eksempel bestemmes til 0,05 n mol HC-21-HS-ækvivalent/ml.

Claims

151400

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et latexrea-gens til immunologisk påvisning af steroider i human legemsvæske, hvor man ved omsætning af et steroid med et serumalbumin fremstiller et steroid-serumalbumin-konjugat 5 og sensitiverer immunologisk indifferente latexpartikler med dette steroid-seriimalbumin- konjugat, kendetegnet ved, at man gennemfører omsætningen i et forhold i området fra 0,5 mol steroid/mol serumalbumin til 7,0 mol steroid/mol serumalbumin.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man til sensitivering af latexpartiklerne med kon-jugatet under hensyntagen til omsætningsforholdet mellem steroid og serumalbumin ved fremstillingen af konjugatet og til partikelstørrelsen af den benyttede latex benytter 15 en sådan mængde af konjugatet, at en uspecifik agglutina tion ved hjælp af de sensibiliserede latexpartikler udelukkes .

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1-2, kendetegnet ved, at man som serumalbumin til fremstilling af 20 konjugatet benytter okseserumalbumin, hesteserumalbumin, fåreserumalbumin, kaninserumalbumin eller humant serumalbumin.

4. Fremgangsmåde til fremstilling af et latexrea-gens ifølge krav 1-3, kendetegnet ved, at man 25 som latexpartikler benytter polystyren-, polybutadien el ler styren-butadien-copolymer-latexpartikler.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1-4, kendetegnet ved, at man til fremstilling af konjugatet benytter et steroid fra gruppen estrogen og dettes metaboliter, 30 progesteron og dettes, metaboliter, androgen og dettes metaboliter og 17-hydroxy-corcicosteron og dettes metaboliter.

6. Fremgangsmåde til fremstilling af et latexaggre-gat ifølge krav 1-5, kendetegnet ved, at par- 35 tikelstørrelsen af latexen ligger i området 0,234 ji - 0,721 ji, og at mængden af det til sensitivering af disse latexpartik- 151400 ler benyttede konjugat ligger i området fra 0,3 ^iM/lg til 1,1 jiM/lg latexpartikler.

7. Latexreagens til immunologisk påvisning af steroider i human legemsvæske, som indeholder latexpartikler, 5 som er sensitiveret med et steroid-serumalbumin-konjugat, kendetegnet ved, at konjugatet har et steroidbindingstal i området fra 0,5 til 7,0 molekyle/1 molekyle serumalbumin.

8. Latexreagens ifølge krav 7, kendetegnet 10 ved, at latexpartiklerne sensitiveres med konjugatet under hensyn til partikelstørrelsen af den benyttede latex og til steroidbindingstallet i konjugatet i en sådan mængde, at en uspecifik agglutination udelukkes.