SE445149B - Latexreagens, som innehaller latexpartiklar sensibiliserade med ett steroid-serumalbuminkonjugat, for immunkemisk bestemning av steroid i mensklig kroppsvetska, samt forfarande for framstellning av reagenset - Google Patents

Description

in 15 20 25 "än 35 ¿antiserumet '7806961-4 Kflpersonal och kräver ofta besvärlig och tidskrävande förbe- handling av de prov, som skall analyseras.

Det är därför av stor betydelse att erhålla ett sitt för noggrann-och snabb kvantitativ bestämning av steroid- _hormoner och/eller metaboliter därav utan krav på speciell dtbildning och särskilda instrument.

Det är känt att kvantitativ _bestämning av steroider kan ske med immunologiska metoder. En typisk sådan metod utnyttjar specificiteten hos antigen-antikroppsreaktíonen - och synligheten av agglutinerings- och agglutineringsínhibe- I ett typiskt känt förfarande binder man sådana steroider, som skall bestämmas, vid protein till ett ringsreaktionen. steroid-proteinkonjugat, framställer sedan ett reagens av med konjugatet sensibiliserade latexpartiklar och framitålldr antiserum genom att konjugatet insprutas i ett däggdjur. Dit :sålunda erhållna antiserumet kan reagera med den steroid, lol skall bestämmas, och kan också reagera med reagenset} Om en given mängd av ett prov av mänsklig kroppsvätska eller ut- söndrad vätska uppsamlas'och blandas med en given mängd av antiserumet, inträffar en reaktion däremellan. Sedan sättas en given mängd av reagenset till blandningen av provet och antiserumet. Om ett överskott av antiserum finns i bland- ningen av provet och antiserumet, kan en antigen-antikropps-' reaktion mellan kvarvarande antiserum och reagenset observeras såsom agglutinationsreaktion, och om antiserumet precis neutraliseras med steroiden i provet eller det finns överskott av steroid i vätskeblandningen, äger ingen antigen-antikropps- reaktion rum, och detta kan iakttagas som en inhibering av agglutinationen. Om seriellt utspädh.prov undersökes med inställt på en bestämd titer och reagenset, kan'W kvantitativ analys på steroider och/eller metaboliter därav genomföras. A l I Ett gjorda japanska patentansökan 51-112513. Denna avser ett sådant känt förfarande anges i den offentlig- förfarande för immunologisk kvantitativ analys pá dehydro- epiandrosteronsulfat (som är en mellanprodukt i biosyntesen av ett könshormon), men denna skrift anger ingenting nytt ut- över vad som ovan anges som teknikens ståndpunkt. Ehuru dessa kända förfaranden avser användbara diagnosmetoder, är det 10 15 20 25 30 35 3 7806961-4 synnerligen önskvärt att öka känsligheten av denna"immünólo- giska kvantitativa analys, enär man skulle kunna upptäcka mindre variationer i mängden steroid och få ökad noggrann- het vid konventionell användning.

Mänskliga kroppsvätskor och utsöndrade vätskor inne- håller många slags föreningar vid sidan om steroider, och halterna av dessa föreningar är vanligen mycket större än steroidhalten. Vissa av dessa föreningar, t ex proteiner och sackarider, påverkar den immunologiska analysen, och det är nödvändigt att avlägsna dem eller späda den vätska, som skall undersökas, så mycket att ingen påverkan uppträder.

Avlägsnandet av de påverkande föreningarna kräver ett kompli- cerat förfarande, och vid kliniska undersökningar, som kräver enkelhet och snabbhet, är det nödvändigt att späda vätska, som skall undersökas. Detta gör det önskvärt att öka den immuno- logiska analysens känslighet.

, Inställning av känsligheten anges i den offentlig- gjorda japanska patentansökan 50-123819. Denna skrift avser ett förfarande för immunologisk analys av steroider i mänsklig -kroppsvätska eller utsöndrad vätska, vid vilket man använder en antikropp erhållen från ett däggdjur, som har immuniserats med en steroid konjugerad med antigent protein med fri amino- grupp, och en bärare sensibiliserad med steroiden konjugerad med ett protein av annan beskaffenhet än det antigena proteinet.

I detta förfarande kan känsligheten regleras genom variation av mängden steroid-proteinkonjugat för aktivering av latex- partiklarna i reagenset och genom variation av antiserum- koncentrationen. Beskrivningen i sistnämnda patentansökan är icke fdllt klar, men synes antyda, att mindre mängder av överskottsantiserum kan agglutinera sensibiliserade latex- partiklar, om dessa är sensibiliserade med en mindre mängd av steroidproteinkonjugatet. På så sätt man dock icke avse- värt förbättra känsligheten, såsom förklaras nedan. Latex- partiklarna har från början benägenhet att visa en ospecifik agglutinering,om icke ett lämpligt Sïæfilififlflßdel tillsättes, och denna ospecifika agglutinering kan icke skiljas från specifik agglutinering som följd av en antigen~antikropps- reaktion. Det för sensibilisering av latexpartiklarna använda steroid-proteinkonjugatet kan verka som stabilisermedel för 10 15 20 25 30 35 78Ü6961”4 u eliminering av denna ospecifika agglutinering av själva latexpartiklarna. Det i.nyssnämnda ansökan angivna sättet att inställa känsligheten är därför begränsat till en viss grad, där ospecifik agglutinering kan elimineras, och det är icke möjligt_att öka känsligheten utöver denna gräns.

Ett sätt att eliminera denna begränsning anges i japanska patentskriften H9~11407 och i den offentliggjorde japanska patentansökan 50-82230. I dessa skrifter anges, att man kan stabilisera latexpartiklarna genom att låta dem absorbera immunologiskt inert protein före eller efter sensibiliseringen-med steroid-proteinkonjugat eller antikropp.

En kombination av de kända metoderna erbjuder möjlighet att erhålla sensibiliserade latexpartiklar med ökad känslighet genom att latexpartiklarna sensibilíseras med en mindre mängd steroid-proteinkonjugat och stabiliseras med immunologiskt inert protein. Det har emellertid visat sig, att stabilise- ringen av latexpartiklarna med det inerta proteinet kan pá- verka den immunologiskt specifika agglutineringen.

Den offentliggjorda japanska patentansökan H8-ß9918 avser ett förfarande för framställning av antikropp, som har en utomordentlig specificitet mot progesteron, och användning av denna antikropp för radioimmunoanalys och agglutinerings- test för bestämning av progesteronhalten i prov. Denna skrift anger emellertid inte att känsligheten för bestämning av steroider förbättras. Denna-skrift synes vidare ange, att konjugatet av steroiden (hydroxyprogesteron) och proteinet har 15 - H0 molekyler steroid per molekyl protein och att detta konjugat användes icke enbart för framställning av antikroppïntan även för sensibilisering av latexpartiklar.

Likaså användes enligt den japanska patnetansökan 50-123819 ett konjugat av estríol-16a-glukuronid och kaninserumalbumin för sensíbilisering av latexpartiklar. Förhållandet mellan steroidglukuronníoch protein anges vara 27 ~ 30 mol per mol protein.

Av ovanstående framgår, att steroid-proteinkonjugat, vari ett relativt stort antal steroidmolekyler är bundna -per molekyl.protein, har använts för sensibilisering av latexpartiklar vid kända förfaranden (nedan benämnas antalet steroidmolekyler, som är bundna vid en proteinmolekyl, steroid- bindningstal). 10 15 20 25 30 35 H0 1aos9e1Å4 ß Uppfinningen avser även ett latexreagens med hög känslighet för steroidbestämning, i vilket latexpartiklar är sensibiliserade med ett steroid-serumalbuminkonjugat med ett relativt litet steroidbindningstal.

Såsom steroider för genomförande av uppfinningen kan man använda exempelvis follikelhormoner (estrogen), gul- kroppshormoner (progesteron), manliga könshormoner (t ex 17- ketosteroider), adrenokortikalhormoner (t ex 17-hydroxikorti- kosteroider) samt en mångfald metaboliter av dessa steroid- hormoner.

För framställning av konjugat med serumalbumin an- vänds dessa steroider företrädesvis i de tillstånd, vari de finns i mänskliga kroppsvätskor eller utsöndrade vätskor, t ex såsom steroid-glukuronidkonjugat eller steroidsulfatkonjugat.

Emellertid kan alla naturliga och syntetiska steroider användas, förutsatt att de har tillräcklig immunologisk kors- reaktivitet med det specifika steroidhormon eller den meta- bolit därav, som skall bestämmas i kroppsvätska eller utsöndrad vätska, och att de har en funktionell grupp, medelst vilken de kan kemiskt bindas vid serumalbumin. Exempelvis kan steroid- hemisuccinat eller steroid(o-karboximetyl)oxím användas som syntetisk steroid.

Som serumalbumin kan man använda alla raffinerade serumalbuminer, som är kommersiellt tillgängliga, exempelvis nötserumalbumin (NSA), hästserumalbumin (HSA), fårserumalbumin (FSA), kaninserumalbumin (KSA) och människoserumalbumin (MSA).

Särskilt NSA och KSA är lämpliga.

I Som latexpartiklar kan man enligt uppfinningen lämp- ligen använda partiklar av polystyrenlatex, polybutadien- latex eller styren-butadien-sampolymerlatex. Det är viktigt att latexpartiklarna icke har reaktiva radikaler och att de är inerta i kemiskt och immunologiskt avseende. Polystyrenlatex- partiklar är särskilt lämpliga. Partikelstorleken kan vara 0,05 - 1,0 pm, företrädesvis 0,2 - 0,8 um.

För framställning av steroid-serumalbuminkonjugat, som användes för sensibilisering av latexpartiklar och för erhållande av antiserum eller antikroppar, kan man tillämpa exempelvis karbodiimidförfarandet (Gross et al, Immunochemistry, 5, sid. 55 (1968)), syrakloridförfarandet(Erlanger et al, Journal of Biological Chemistry, 228, sid. 713 (1957)), 10 5 in 1ses9s¶=4 Uppfinningen utgår från tanken] att ytterligare för- bättring av känsligheten icke kan ernås med konventionella metoder, varför uppfinningen syftar till att förbättra själva konjngatet. Det har visat sig, att om man framställer ett steroid-serumalbuminkonjugat på så sätt att steroidbindnings- talet ligger vid 0,5 - 7,0 och sensibilišerar;latexpartiklar med ett sådant konjugat, de sålunda erhållna sensibiliserade latexpartišlarna visar extremt hög känslighet, och detta Oßeroende av_den använda arten av steroïd och sernmalbumin. afiittillsånarñdet iåkê'varit¿käntå att~man genon att sänka šfezfoiaplggšgiígšëfälefi-k-an, åka känsi-ighèæenr vidjfásffëfoiábël i šfiämningi N'“«">då5 Hïfar., ." ¿¿ ”J' _. wird 1 i '" fl ai; fšreliêäande uprfinnins avser etttfdrtarandefför" 'ffram$tëllninà^avdenimed.steroidësernnalbuminkonfinàatïsensifew 15 Éäiliserad lateípölymer¿med ökad känslighet för bestämning 1; än ~3U èïs »mol per mol serumalbuminff“":ïi äv_steráid§ívid vilket steroiden för framställninåfäv konju- gatet binds vid serumalbuminet i ett förhållande av:fi;5 - 7 ¥"«fvÜppfinningeniavser*vidare?Éttâ¥%rfäšaÉdelÉ%% ÉÉáfi4 ställning av ett latekreagens, som lämpar sig föägfieštämning av -steroícr mec- trots arf “1atexpar-'cikd1afnä~ " -šndast är7senšíbïEišerade*nëd'sterbidsernnalbuminkonjhäatet ïutan*stabiliseríng>av~latexpartiklarna med ímmunologiskt inert ._1l._ 1....'J PfQ-tgin_l.f;i-flf,..g.st.ri. <- =f:»..l ...rf-npsfinsifigzanfavšëæffvadæëßfétæïafasfafäadëf-*ffffa-'aïèåfiil 'štällñínëïaV~ed1fiedfšteroidkseruñalbhfiinkónfingat:sensibiliserad ffsififsegfämnftnngalaavïeæërøia med ökad känslighet; voi-an v-ilgëf' i ïlatex§olyneren"väïjès bland styrenpolvmerer; tutadienfiolymerer *oëhïstyren-butadiensampolymerer. uppšífifn-ingen avta; även* ett faffårahaè~ får* frame-f I 'sæaïilfnïihg av en 'med sfmía-serummiuminkbnjugaf¶ Sdéfišfíbilni-nnd *i 'sër¿a= -Iantiexfioiymer-t med öka-a känslighet fàftddbesfämn_iíígn_ av *sffesaiaèf , f1v1a vilket dsfëæëiaëfi *fär fràfišfänfnififg- av* kantin: i * " gatet¿ntgöres5àv den steroíd; som skall påvisas, en meta- bolit däràvfellerzen syntetisk steroíd med likartad struktur, Den seruma1Buminet~för framställning av konjugatet ntgöres* av nötserumàlbumin, hästserunalbumin; fårserumalbumin, kanin- šëfumaibuminafelïer-fmännískøsëfumalbumifiif ~ a *a f* 10 15 20 25 30 35 7 78006961-4 blandanhydridförfarandet (do.) eller isocyanatförfarandet (Goodfriend et al, Canadian Journal of Biochemistry and Physiology, 36, sid. 1177 (1958)).

Ett exempel på framställning av steroid-serumalbumin- konjugat med blandanhydridmetoden anges nedan. 10 mol steroidglukuronid, steroidhemisuccínat eller steroid(o-karboximetyl)oxim per mol använt serumalbumin löses i dimetylformamid. Till denna lösning sättes tri-n- butylamin som hjälpaktivator i samma molära mängd som steroiden varpå blandningen omrörs. Sedan försätts den erhållna blandning- en med isobutylkloroformiat som aktivator i samma molära mängd som steroiden, och blandningen omrörs. Den erhållna blandade lösningen benämns vätska A. I Serumalbumin löses i dejoniserat vatten, lösningens pH inställs på 8,0 - 10,0 med 1N NaOH, och dimetylformamid tillsätts. Den erhållna lösningen benämns vätska B. Mängden dimetylformamid i vätska B bestäms så, att den totala mängden dimetylformamid i vätskorna A och B blir densamma som mängden dejoniserat vatten i vätska B.

Sedan sätts vätska A droppvis till vätska B under 1,5 timme med omröring, och sedan blandningens pH inställts på 8,0 - 10,0 med 1N NaOH, omrörs blandningen under 3,5 timme, varvid steroid-serumalbuminkonjugatet bildas. Den erhållna blandningen dialyseras mot vatten, varpå aceton tillsättes i ett förhållande av 2 delar aceton per del dialyserad blandning och blandas homogent. Efter tillsats av 1N saltsyra till blandningen för fällning av konjugatet, avskiljs det utfällda konjugatet genom centrifugering. En lämplig mängd vatten sättes till den avskilda fällningen, och 1N Na0H tillsätts för in- ställning av pH på 8. Den erhållna lösningen underkastas dialys mot vatten för avlägsnande av aceton, varvid konjugatet tas . upp. Framställningen av konjugatet genomförs under låg temperatur (omkring 6°C).

Steroidbindningstalet i konjugatet kan bestämmas på känt sätt, t ex genom ultraviolettabsorption eller dinitro- fenylering.

Sensibiliseringen av latexpartiklarna kan ske på följande sätt. 10 15 20, 25 30 35 7ane961-4¿~ 8 En suspension av latexpartiklar framställs genom tvättning och/eller spädning av latexpartiklar med en lämp- lig buffertlösning (pH 7,2 - 8,6). Det framställda steroid- serumalbuminkonjugatet i lämplig koncentration sättes där- till och hålls vid 37°C under 2 timmar med omröring, varvid man får en suspension av sensibiliserade latexpartiklar. Sus- pensionen centrifugeras, och fällningen frånskiljs och tvättas sedan med buffertlösning. Centrifugeringen och tvättningen upprepas flera gånger, och den erhållna fällning- en omsuspenderas i buffertlösningen, så att man får en sus- pension av sensibiliserade latexpartiklar. Den mängd konjugah som användes för sensibilisering av latexpartiklarna, kan väljas inom ett område, där följande villkor är uppfyllda. 1. De slutligen erhållna sensibiliserade latexpartik- larna visar ingen ospecifik agglutinering till följd av latex? partiklarnas egen beskaffenhet. ' 2. Specifik agglutinering till följd av reaktion mellan antikropp och antigen kan inträffa. 3. När en antikropp neutraliseras med en tillräcklig mängd steroidhapten och suspensionen av sensibiliserade latex- partiklar tillsätts, förblir den erhållna blandningen en homogen suspension utan agglutinering Såsom beskrivs närmare nedan, varieras den mängd kon- jugat, som användes för sensibilisering av latexpartiklarna (nedan kallad sensibiliseringsmängd), beroende på latexpar- tiklarnas storlek och det använda konjugatets steroidbindnings tal.

Latexpartiklar med olika storlekar, 0,23R och 0,721 um, sensibiliserades med ett konjugat, vari estriol-16a-glukuronid. var bundet till KSA i ett förhållande av 2,0 mol per mol KSA, med ovan angivna förfarande. De minimala sensibiliserings~ mängderna för latexpartiklarna för eliminering av ospecifik agglutinering var 72 respekive 18 mg per gram latexpartiklar.

I allmänhet kräver mindre partiklar större sensibiliserings- mängder.

Latexpartiklar med en storlek av 0,234 pm sensibili- serades med estriol-16a-glukuronídkonjugat med steroidbind- ningstalet 15,1 underlanvändning av~olika sensibiliserings- mängder. Den minimala sensibiliseringsmängden för eliminering 10 15 20 25 30 35 9 1aos9s1--4 av ospecifik agglutinering var 54 mg per gram latexpartiklar.

Det är att märka, att den minimala sensibiliseringsmängden i sistnämnda fall var relativt liten jämförd med det förra fallet (72 mg/g), där latexpartiklarna sensibiliserades med ett konjugat med steroidbindningstalet 2,0 (se tabell I).

Det är även att märka, att sensibiliseringen av latexpartiklarna kan ske genom dialys, ultrafiltrering eller en kombination av dem med ovannämnda förfarande. Likaså kan sensibiliserade latexpartiklar frystorkas.

'Antikropp kan framställas med konventionella metoder.

Exempelvis kan man erhålla antiserum eller därur avskild antikropp på så sätt, att man först framställer ett steroid- serumalbuminkonjugat genom att omsätta serumalbumin med en steroid i det tillstånd, vari den finns i mänsklig kropps- vätska eller utsöndrad vätska, eller steroid med immuno=~ logisk korsreaktivitet däremot, och sedan inför det erhållna konjugatet på icke oral väg (t ex genom injektion) i ett däggdjur, vars serum är främmande från det vid konjugatets framställning använda serumet, för immunisering av djuret, varifrån antiserum sedan kan utvinnas. Det sålunda erhållna antiserumet kan användas som ursprunglig antikropp. Givetvis kan man isolera antikroppen från antiserumet.

Det är att märka, att den för bestämning avsedda steroiden kan reagera som hapten med antikroppen och att konjugatet för sensibilisering av latexpartiklarna också kan reagera därmed.

Bestämningen av steroiden sker på konventionellt sätt bortsett från att man använder ett latexreagens, som fram- ställts enligt föreliggande uppfinningen. Förfarandet inne- fattar följande steg. 1. En given mängd mänsklig kroppsvätska eller ut- söndrad vätska, outspädd eller utspädd på lämpligt sätt, uttas såsom prov, och en given mängd antikropp tillsätts och blandas med provet, så att en antigen-antikroppsreaktion erhålles mellan den steroiden, som utgör haptenen i provet, och antikroppen (neutralisation av antikroppen). 2. En given mängd av blandningen av provet och anti- kroppen droppas på en glasplatta, och en given mängd laten- reagens tillsättes och blandas med en liten stav, varpå lö 15 20 25 30 35 H0 7ane961-4i ” blandningen pâ glasplattan studeras nâgra minuter senare för bestämning av huruvida agglutinering har skett eller ej.

Om antikroppen icke har blivit helt neutraliserad med steroiden i provet och följaktligen ett överskott av anti- kropp finns kvar efter det första steget, uppträder en antigen- antikroppsreaktion mellan latexreagenset och kvarvarande antikropp och agglutinering kan iakttas i det andra steget.

Om antikroppen är helt neutraliserad med steroiden i provet (inklusive det fall, där ett steroidöverskott återstår från ldet första steget), uppkommer ingen antigen-antikroppsreaktion och kan ingen agglutinering observeras, d v s inhibering av 'agglutinationen kan iakttas i det andra steget.

Det är givet, att koncentrationen av proverna, latex- reagenset och antikroppen kan väljas beroende på den för- väntade koncentrationen av steroidhormon och/eller dess meta- bolit, som skall bestämmas i provet. Agglutineringsreaktionen i det andra steget kan avslutas inom loppet av högst 5 minuter.

Uppfinningen beskrivs närmare i samband med ett antal exemplifierande försök och utföringsexempel.

Försök 1 I. Framställning av material 1. Framställning av konjugat Med användning av estriol-16u-glukuronid och KSA fram- ställdes nio olika konjugat med olika steroidbindningstal.

Framställning av vätska A 10 mg estriol-l6u-glukuronid löstes i 1 ml dimetyl- formamid. Till denna lösning sattes 5,1 ul tri-n-butylamin, och blandningen omrördes. Sedan tillsattes 2,8 ul isobutyl- kloroformiat, och blandningen omrördes. Samma mängd vätska A framställdes i nio behållare.

Pramställning av vätska B Kaninserumalbumin löstes i avjoniserat vatten, såsom anges i tabell III, för beredning av KSA-lösningar med olika koncentrationer. Genom tillsats av 1N natriumhydroxid till lösningarna inställdes pH på 8,0 - 10,0. Till dessa lösningar sattes olika mängder dimetylfurmamid och framställdes nio slags vätska B med olika mängder KSA. Mängden dimetylformamid i varje vätska B inställdes så, att den totala mängden dimetyl- formamid i vätskorna A och B var lika med mängden avjoniserat vatten i vätska B. 10 15 20 25 30 35 11 708069614- Framställning av konjugat Varje vätska A sattes droppvís till varje vätska B under 1,5 timme under omröring. Genom tillsats av 1N NaOH till lösningarna inställdes pH på 8,0 - 10,0, och varje lösning omrördes ytterligare 3 timmar. Nio olika lösningar av estriol-1Bm-glukuronid-KSA-konjugat erhölls. Varje lösning underkastades dialys mot avjoniserat vattenl Till de dia: lyserade lösningarna sattes aceton i ett förhållande av 2 delar aceton på 1 del lösning och sedan blandningen om- rörts tillräckligt, tillsattes 1N saltsyra för fällning av konjugatet. Det fällda konjugatet i varje lösning avskildes genom centrifugering under 5 minuter vid 10 000 r/min. Till varje avskilt konjugat sattes avjoníserat vatten, och efter inställning av pH på omkring 8 med 1N Na0H dialyserades varje lösning mot avjoniserat vatten för bortskaffande av acetonen. Sålunda erhölls nio olika konjugat med olika steroidbindningstal (tabell III, prov 1 ~ 9). Framställning- en av konjugat skedde vid låg temperatur (GOC).

Konjugatens steroidbindningstal anges i tabell III.

Mätningen av steroidbindningstalet beskrives nedan. framställning av konjugatlatexpartiklar De minimala sensibiliseringsmängderna för konjugaterna i prov 1 - 9 för eliminering av ospecifik agglutination av konjugatlatexpartiklarna bestämdes på följande sätt.

Genom upplösning av 5,0, 5,2, 5,M och 5,6 mg av prov 1 (konjugat) enligt tabell III i H0 ml H0 mM veronalbuffert- lösning innehållande 150 mM NaCl erhölls fyra olika konju- gatlösningar. Till var och en av dessa fyra konjugatlösning- ar sattes 1 ml 10-procentig suspension av latexpartiklar med en partikelstorlek av 0,23H um, och blandningarna hölls vid 37°C under 2 timmar. De erhållna suspensionerna av sensibiliserade latexpartiklar centrifugerades vid H 000 r/min under 20 min för utfällning av de sensibiliserade latex- partíklarna. De avskilda fällningarna suspenderades i 20 ml vardera av samma veronalbuffertlösning och centrifugerades under samma betingelser som ovan för separering av de sensi- biliserade latexpartiklarna. Sistnämnda steg upprepades, och de sålunda erhållna fällningarna omsuspenderades i 5 ml av samma veronalbuffertlösning, så att fyra suspensioner av 10 15 20 25 30 35 1snsn9s1-4s 12 sensibiliserade latexpartiklar med olika sensibiliserings- mängder erhölls.

På objektglas droppades 0,1 ml av varje suspension och blandades med 0,1 ml av antiserum, som neutraliserats med ett överskott av estriol-16a-glukuronid. Flera minuter senare observerades dropparna för fastställande av närvaro eller_frånvaro av ospecifik agglutinering.

Ospecifik agglutinering kunde iakttas i dropparna för de suspensioner av konjugatsensibiliserade latexpartiklar, som hade sensibiliseringsmängden 5,0 och 5,2 mg av prov 1, men kunde icke iakttas vid användning av 5,H och 5,6 mg av prov 1. Den minimala sensibiliseringsmängden av prov 1 kundre sålunda bestämmas till 5,U mg per 0,1 g latexpartiklan En liknande undersökning genomfördes med prov 2 - 9 för bestämning av respektive minimala sensibiliserings- mängder. Reusltaten anges i tabell I.

Under användning av den minimala sensibiliserings- mängden av prov 1 - 9 framställdes suspensioner av sensi- biliserade aktiverade latexpartiklar.

II. Mätning av steroidbindningstal och steroidbestäm- ningskänslighet 1. §Ée§9idbindningstal Steroidbindningstalet mättes enligt Erlanger et al under användning av ultraviolettabsorption (Journal of Biological Chemistry, 234, 1090 (1959)) och enligt Sanger under användning av dinitrofenylering (Biochemical Journal, 39, 507 (19H5)). (a) Mätning genom ultraviolettabsorption N Estriol-16u-glukuronid och KSA absorberar inom samma spektralomräde, d v s med ett maximum vid 278 nm, och absorptionsmaximum för deras konjugat kan mätas såsom summan av absorptíonsmaxima för respektive komponenter.

Följaktligen kan absorbansen från estriol~16u-glukuronid i konjugatet erhållas genom att absorbansen för RSA subtraheras från konjugatets absorbans. Genom att jämföra den sålunda erhållna absorbansen för estriol-16a-glukuroniden i konju- gatet med absorbansen för olika kända koncentrationer av estriol-lßa-glukuronid kan man bestämma estriol-16u-glu- kuronidens bindningstal. 10 15 20 25 30 35 13 78069614 (b) Mätning genom dinitrofenylering Lysinradikaler i konjutatet och i det serumalbumin, som användes för framställning av konjugatet, dinitrofenyl- erades med dinitrofluorobensen för bildning av dinitrofeny- lerat konjugat och dinitrofenylerat serumalbumin. Därpå hydrolyserades dessa produkter vid 110°C under 24 timmar för bildning av fri dinitrofenyllysin. Sålunda erhölls två slags lösningar innehållande dinitrofenyllysin, den ena från konjugatet och den andra från serumalbuminet. Kommer- siellt tillgänglig dinitrofenyllysin användes som referens- material, och seriellt spädda lösningar därav framställdes.

De två olika dinitrofenyllysinhaltiga lösningarna och de seriellt spådde refercnslösningarna undersöktes kolori- metriskt vid 390 nm, varpå konjugatets steroidbildningstal be- räknades ur värdena för den optiska tätheten. 2.Mätning av steroidkänslighet Steroidkänsligheten mättes genom att först den ursprungliga antíkroppens titer bestämdes med en referens- steroidlösning och därpå provens 1 - 9 titer bestämdes mot den ursprungliga antikroppens titer, såsom beskrives nedan. (a) Bestämning av antikroppens titer Antiserum erhölls från kaniner, som immuniserats med estriol-1ßa-glukuronid-KSA-konjugat med en lämplig kon- ventionell metod, och antiserumet användes som ursprunglig antikropp. Denna ursprungliga antikropp späddes seriellt med H0 mM veronalbuffertlösning innehållande 150 mM NaCl.

Till 0,05 ml seriellt utspädd antikropp sattes 0,05 ml av en lösning, som framställts genom upplösning av 0,1 nmol estríolslßa-glukuronid i 1 ml buffertlösning, och blandning- en omrördes väl. Droppvis anbringades 0,1 ml av respektive blandade lösningar på objektglas, där de försattes med 0,1 ml suspension av konjugataktiverade latexpartiklar med ett estriol-16a-glukuronidbindningstal av 2,0 och omrördes väl.

Observation efter 3 minuter visade, att agglutinering kunde påvisas i dropparna med en utspädning av 200 gånger eller därunder av den ursprungliga antikroppen (tabell II). Detta betyder att den ursprungliga antikroppen vid spädning 200 gånger kan neutralisera åtminstone 0,1 nmol estriol-16u- glukuronid per milliliter. 10 15 20 25 30 35 1sos961-4i 1” Sålunda bestämdes titern för denna 200 gånger spädda antikropp till 0,1 nmol estriol-16u-glukuronidekvi- valent per milliliter och titern för den ursprungliga anti- kroppen till 20 nmol estriol-16a-glukuronidekvivalent per milliliter. (b) Bestämning av latexreagensets titer Den ursprungliga antikroppen späddes seriellt med H0 mM veronalbuffertlösning, och 1,0 ml av varje seriellt utspädd lösning droppades på objektglas. Till dessa droppar sattes 0,1 ml vardera av prov 1 - 9 (tabell I) och omrördes väl och resultaten observerades efter 3 minuter. På grund- val av den maximala utspädning av dropparna, vid vilken agglutinering kunde iakttagas, och den ursprungliga anti- kroppens titer beräknades latexreagensprovens titer. Det är att märka att ett lägre värde på titern betyder högre känslighet.

Provens 1 - 9 estriollñu-glukuronidbindningstal och känslighet anges i tabell III.

Av tabell III framgår, att det finns ett samband mellan provens 1 - 9 steroidbindningstal och känslighet, d v s den sistnämnda ökar när bindningstalet sjunker.

Känsligheten är emellertid maximal, när steroidbindnings- talet är 2,0 (enligt ultraviolettabsorptionsförfarandet), varpå känsligheten minskar när bindningstalet sjunker.

Det är sålunda klart, att man enligt uppfinningen när en utomordentlig känslighet av 0,2 nmol estriol-16a- glukuronidekvivalent per milliliter, och denna är avsevärt högre än hos ett konventionellt latexreagens, där den ligger vid 2,5 nmol estriol-16a-glukuronidekvivalent per milli- liter.

Denna utomordentliga känslighet erhålls när steroid- bindningstalet ligger vid omkring 0,5 - 8,7, mätt genom både ultraviolettabsorptions- och dinitrofenyleringsför- farandet. En högre känslighet av 0,1 nmol estriol-16a- glukuronidekvivalent per milliliter kan uppnås när steroid- bindningstalet ligger inom området 0,7 - 7,0.

Försök 2 Ett försök av samma typ som försök 1 genomfördes med latexpartiklar, som sensibiliserats med dehydroepiundroS~ 10 15 _20 25 30 35 si 7eos9s1-4 teron-17-(0-karboximetyl)oxim-KSA-konjugat.

Under användning av dehydroepiandrosteron (DHEA) och KSA framställdes åtta konjugat med olika steroidbindningstal inom området 0,5 - 18,3 på följande sätt: 0,75 g DHEA och 0,69 g (o-karboximetyl)hydroxylamin- hydroklorid löstes i 20 ml etylalkohol. Lösningen försattes med 2 ml 6,HM natriumsuccinatlösning för att förbli alkalisk.

Den erhållna lösningen återloppskokades under en timme för att påskynda reaktionen, varpå natriumkarbonat tillsattes.

Den tillsatta mängden gav den erhållna lösningen en halt av 5 % natriumkarbonat.

Efter tvättning av den erhållna lösningen med eter sur- gjordes dess vattenskikt med koncentrerad saltsyra, och den erhållna fällningen frånskildes. Denna fällning omkristalli- serades ur etanol, och 0,6 g DHEA-17-(o-karboximetyl)oxim (DHEA-CMO) erhölls.

Under användning av denna DHEA-CMO och KSA i de i tabell IV angivna molförhållanden framställdes åtta konjugat (prov 1 - 8) med olika steroidbindningstal på samma sätt som i försök 1. Provens steroidbindningstal mättes med denitro- fenyleringsförfarandet. Resultaten anges i tabell IV.

Den minimala sensibiliseringsmängden bestämdes för prov 1 - 8 på samma sätt som i försök 1. Resultaten anges i tabell IV.

Under användning av den minimala sensibiliseringsmängden av prov 1 - 8 framställdes åtta latexreagens. Dessas steroid- känslighet mättes på följande sätt.

Till 1 ml 10-procentig suspension av latexpartiklar med en partikelstorlek av 0,721 um sattes U ml 20 mM fosfor- syrabuffertlösning (pH 7,2) innehållande 150 mM NaCl. Efter tillräcklig omröring centrifugerades den erhållna lösningen vid H 000 r/min under 20 minuter. Den erhållna fällningen sus- penderades i 5 ml av samma buffertlösning. Den erhållna sus- pensionen centrifugerades på nytt enligt ovan så att fällningen separerades. Samma mängd sålunda tvättade latexpartiklar fram- ställdes i åtta poster.

Minimala sensibiliseringsmängden av respektive kon- jugatprov 1 - 8 enligt tabell IV löstes i 5 ml av buffert- lösningen för framställning av åtta konjugatlösningar med olika 10 150 20 25 30 35 »1aoe9s1-4 “ steroidbindningstal, och dessa lösningar sattes till de åtta posterna av tvättade latexpartiklar. Sedan de erhållna lös- ningarna hållits vid 37°C under 2 timmar, centrifugerades de och tvättades med buffertlösningen två gånger, De erhållna fällningarna omsuspenderades i 5 ml av buffertlösningen och gav åtta suspensioner av DHEA-CMO-KSA-sensibiliserade latex- partiklar (tabell IV, prov 1 - 8). ' Antiserum erhölls från kaniner, som immuniserats med DHEA-CMO-ESA, och detta användes som ursprunglig antikropp, vilken seríellt späddes med 20 mM fosforsyrabuffertlösning (pH 7,2) innehållande 150 mM NaCl. 0,05 ml av varje utspädd antikropp blandades med 0,05 ml av en lösning, som framställts genom upplösning av 0,2 nmol DHEA i 1 ml buffertlösning för neutralisering av antikroppen däri. På objektglas droppades 0,1 ml av varje neutraliserad lösning, och till varje droppe sattes 0,1 ml suspension av de latexpartiklar, som sensibili- serats med konjugatet med DHEA-bindningstalet 2,4, varpå bland- ningen omrördes väl. Den maximala spädning av antikroppen, som gav agglutinering inom 3 minuter, var 50 gånger. Därför bestämdes títern för den 50 gånger spädda antikroppen till 0,2 nmol DHEA-ekvivalent per milliliter och den ursprungliga .antikroppens titer till 10 nmol DHEA-ekvivalent per milliliter.

Därpå späddes den ursprungliga antikroppen seríellt med 20 mM fosforsyrabuffertlösning, och 0,1 ml utspädd anti- kropp blandades med 0,1 ml av varje latexreagensprov 1 - 8 på objektglas, varpå den maximala utspädning av antikroppen, som gav agglutinering inom 3 minuter, bestämdes. Latexreagens- provens 1 - 8 steroidkänslighet beräknades såsom i försök 1 på grundval av den maximala utspädningen och titern för den ursprungliga antikroppen. De beräknade titrerna anges i tabell IV.

Av tabell IV framgår, att den högsta känsligheten upp- nås när DHEA-CMO-bindningstalet ligger vid 1,2 - 2,H, och att en känslighet över 0,2 nmol DHBA-ekvivalent per milliliter uppnås, när DHEA-CMO-bindningstalet är 0,5 - 7,7.

Försök 3 Under användning av olika slags steroider och serum- albuminer, vilka icke användes i försök 1 och 2, genomfördes liknande försök. De största och minsta värden av steroidbind- 10 15 20 30 35 1"/ íflaowew ningstalet, vid vilka högre känsligheter än 0,2 nmol steroid- ekvivalent per milliliter kan uppnås, anges i tabell V.

Av tabellen framgår, att oberoende av vilken steroid och vilket serumalbumin som används, högre känslighet än 0,2 nmol steroidekvivalent per milliliter erhålles när steroid- bindningstalet i konjugatet ligger vid 0,5 - 7,0.

Försök 4 ' Försök för jämförelse av steroidkänsligheten hos före- liggande latexreagens och hos konventionellt latexreagens genomfördes på följande sätt.

Konventionellt latexreagens framställdes på samma sätt som i försök 1 med undantag för att H7 mg KSA och 1,0 ml dejoniserat vatten användes, varvid estriol-16a~glukuronid-KSA- konjugat erhölls. Steroidbindningstalet för detta konjugat var 20, bestämt genom ultraviolettabsorption, såsom beskrives i försök 1. Under användning av olika mängder av detta konjugat sensibiliserades latexpartiklar på samma sätt som i försök 1, och de erhållna olika sensibiliserade latexreagensen under- kastades stabilitetsprovning avseende ospecifik agglutinering, såsom i försök 1. Den minimala sensibiliseringsmängden av kon- jugatet för eliminering av ospecifik agglutinering bestämdes .till 5,0 mg per 0,1 g latexpartiklar.

Sålunda framställdes ett jämförelselatexreagens (prov 10) genom sensibilisering av latexpartiklar med den minimala sensibilíserade mängden av konjugatet.

Vidare framställdes ytterligare jämförelse/latexreagens (prov 11 - 1%) på så sätt, att latexpartiklar sensibiliserades _ med de minimala mängderna av konjugaten, vilka hade modifierats på annat sätt än vid prov 10. Närmare bestämt modifierades konjugatet på så sätt, att till samma mängd av konjugatet, vilket framställts i fyra poster, sattes olika mängder av en vattenlösning av immunologiskt ínert KSA, så att det erhållna molförhâllandet mellan steroid och totalt KSA i de modifierade konjugaten blev 1, 2, 5 och 10, och för dessa modifierade kon- jugat bestämdes de maximala sensibiliserande mängderna såsom i tidigare försök. Sedan sensibiliserades latexpartiklar med respektive minimala sensibiliseringsmängder av de fyra modi- fierade konjugaten och framställdes de angivna ytterligare jäm- förelselatexreagensen (prov 11 - 1H). 10 15 20 25 30 35 7soe9e1-4 1” Under användning av de sålunda erhållna fem olika jäm- förelselatexreagensproven 10 - 14 och av latexreagensproven 6 och 9 i försök 1 bestämdes steroidkänsligheten på samma sätt som i försök 1. Resultaten anges i tabell VI.

Av tabell VI framgår, att provets 6 steroidkänslighet är 62,5 gånger så stor som provets 10 och att provets 9 känslig- het är 13 gånger så stor som provets 10, trots att prov 9 har lägsta känsligheten bland proven enligt föreliggande uppfin- ning. Det är därför klart, att föreliggande latexreagens har mycket högre känslighet än konventionella latexreagens, som har avsevärt högre~steroidbindningstal.

Beträffande jämförelselatexreagensproven 11 - 1H är att märka, att steroidkänsligheten är högst för prov 13, men känsligheten är endast 1/12 av provets 6 känslighet och om- kring 2/5 av provets 9 känslighet. Ehuru dessa reagensprov 11 - 14 har synnerligen låga steroidbindningstal, jämförbara med dem hos föreliggande reagensprov, behöver dessa reagens- prov 11 - 14 icke nödvändigtvis anses vara konventionella reagens, enär det icke är känt att man kan minska steroid- bindningstalet till en sådan nivå för att öka känsligheten.

Det är dock klart, att känsligheten hos proven 11 - ih icke är .jämförbar med känsligheten hos reagens enligt uppfinningen.

Föreliggande uppfinning gör det sålunda möjligt att be- stämma steroider i lägre koncentrationer, vilka icke kan på- visas med konventionellt latexreagens, eller att utspäda ett prov för att eliminera störningar från samtidigt närvarande substanser, när vätskan innehåller steroid i högre koncentra- tioner. Med andra ord möjliggör föreliggande uppfinning en mera tillförlitlig kvantitativ analys på steroid och även en mera noggrann diagnostisk information.

Vidare ger uppfinningen latexreagens med utomordent- ligt hög känslighet, så att steroider kan bestämmas med mindre mängd antikropp eller antiserum. Man kan sålunda minska anti- kroppsförbrukningen, vilket gör föreliggande uppfinning mycket fördelaktig med hänsyn till de höga kostnaderna för framställ- ning av antikropp eller antiserum.

Uppfinningen belyses av några utföringsexempel.

Exempel 1 Vätska A framställdes genom upplösning av 50 mg 10 15 20 25 30 35 i” 1806961-4 estriol-lßq-glukuronid i 10 ml dimetylformamid, varpå 26 ul tri-n-butylamin och sedan 1H pl isobutylkloroformiat tillsattes.

Blandningen omrördes väl. 2,33 g KSA löstes i 60 ml dejoniserat vatten försatt med 1,0 ml 1N Na0H, varpå 50 ml dimetylformamid tillsattes för framställning av vätska B.

Till denna vätska B sattes vätska A droppvis, och bland- ningen omrördes under 1 timme, varpå 0,1 ml 1N NaOH tillsattes och blandningen omrördes ytterligare 3,5 timmar. Efter dialys av lösningen mot dejoniserat vatten tillsattes 2 delar aceton per del lösning, och sedan blandningen omrörts homogent till- sattes 1N saltsyra för utfällning av det syntetiserade estriol- 16u- lukuronid-KSA-konjugatet. Fällningen avskildes genom centrifugering vid 10 000 r/min under 5 minuter.

Till den avskilda fällningen sattes avjoniserat vatten, och pH inställdes på 8 med 1N Na0H, varpå blandningen underkastades dialys mot dejoniserat vatten för avlägsnande av aceton. Sålunda erhölls 1,78 g konjugat (utbyte 75 %). Dessa steg genomfördes vid låg temperatur (SOC). Steroidbindningstalet, mätt genom ultraviolettabsorption och dinitrofenylering, var 2,2 1,9.

Sedan löstes 76 mg konjugat i 400 ml H0 mM veronal- buffertlösning (innehållande 150 mM NaCl, pH 7,8), 10 ml suspension (10 % koncentration) av polystyrenlatexpartiklar resp. (partiklestorlek 0,23% pm) tillsattes, och blandningen hölls vid 3700 under 2 timmar för sensibilisering. Den sensibili- serade latexsuspensionen centrifugerades vid H 000 r/min under 20 min, och den erhållna fällningen suspenderades i 200 ml buffertlösning och centrifugerades 2 gånger under samma betingelser. Den erhållna fällningen suspenderades ånyo i 50 ml buffertlösning, varpå natriumazid tillsattes till en koncentration av 0,1 %, varigenom 50 ml suspension av estriol- 0 16a~glukuronid-KSA-sensibiliserade latexpartiklar (2 6 täthet) erhölls.

Vid blandning på ett objektglas av 0,1 ml av den så- lunda erhållna suspensionen av sensibiliserade latexpartiklar med 0,1 ml utspädd lösning av estriol-16u-glukuronid-KSA- antikropp, vilken framställts såsom i försök 1 och utspätts till nn biter på 0,0H nmol estriol-1En-glukuronidekvlvalcnt per 10 15 20 25 30 35 .7aoe9s1-4 2” milliliter, iakttogs agglutinering inom loppet av 1 - 2 minuter. Då antikroppen utspäddes till en titer av 0,02 nmol estriol-16a-glukuronidekvivalent per milliliter, kunde emeller- tid ingen agglutinering iakttas, och titern för latexreagenset i detta exempel bestämdes till 0,0ß nmol estriol-1&rglkuro- nidekvivalent per milliliter.

Exempel 2 DHEA-CMO framställdes på samma sätt som i försök 2.

Vätska A framställdes genom att 0,5 g DHEA-CMO sattes till 100 ml dimetylformamid, följd av 0,33 ml tri-n-butylamin och 0,18 ml isobutylkloroformiat, varpå blandningen omrördes väl. 18,0 g NSA sattes till 600 ml dejoniserat vatten och ytter- ligare 500 ml dimetylformamid, så att vätska B erhölls.

Till vätska B sattes den tidigare framställda vätskan A droppvis, och efter 1,5 timmars omröring inställdes pH på 9,0 med 1N Na0H, varpå omröringen fortsattes under 3,5 timmar. Den erhållna lösningen dialyserades mot rinnande vatten, varpå 2 delar aceton tillsattes per del lösning. Efter om- röring till homogent tillstånd försattes lösningen med 1N saltsyra för utfällning av det syntetiserade konjugatet, var- på-lösningen centrifugerades vid 5 000 r/min under 20 minuter. _Till den avskilda fällningen sattes dejoniserat vatten, och sedan pH inställts på omkring 8 med 1N Na0H dialyserades lös- ningen mot rinnande vatten för avskiljning av aceton, varvid 13,0 g DHEA-CMO-NSA-konjugat_erhölls (utbyte omkring 70 %).

Steroidbindningstalet för detta konjugat mätt genom dinitro- fenylering var H,1.

Sedan löstes 68 mg av det sålunda erhållna konjugatet i 100 m1 160 mn giycinbufferriösning (innehållande :Lao mn Naci och 0,1 % natriumazid, pH 8,2), och till denna lösning sattes 10 ml 10-procentig suspension av polystyrenlatexpartiklar, varpå blandningen dialyserades mot buffertlösningen vid rums- temperatur under 5 dagar för sensibilisering. Den erhållna suspensíonen av sensibiliserad latex centrifugerades vid 4 000 r/min under 20 minuter. Sedan fällningen suspenderats i 230 ml av buffertlösningen centrifugerades suspensionen och tvättades med buffertlösningen två gånger under samma betingel- ser. Genom omsuspendering av den erhållna fällningen i 50 ml buffertlösning erhölls slutligen 50 ml 2-procentig suspension av DHEA-CMO-BSA-sensibilíserade latexpartiklar. 10 15 20 25 30 Ü 78Ü6961'4 Vid blandning på ett objektglas av 0,05 ml 0,1 nmol/ml DHEA med 0,05 ml utspädd antikropp, vilken framställts såsom i försök 2 och utspätts med buffertlösningen till en titer av 0,1 nmol/ml DHEA-ekvivalent, och tillsats av 0,1 ml av den erhållna suspensionen av sensibiliserade latexpartiklar kunde ingen agglutinering iakttas ens efter 10 minuter. Dä 0,1 ml av suspensionen av sensibiliserade latexpartiklar sattes till en blandning av 0,05 ml 0,02 nmol/ml DHEA och 0,05 ml utspädd antikropp kunde agglutinering iakttas inom 2 - 3 minuter. På liknande sätt som i försök 1 bestämdes titern för föreliggande latexreagens till 0,05 nmol/ml DHEA-ekvivalent.

Exempel 3 Vätska A framställdes genom att 1,1 g testosteron-17- glukuronid löstes i 200 ml dimetylformamid och den erhållna lösningen försattes successivt med 0,52 ml tri-n-butylamin och 0,28 ml isobutylkloroformiat samt omrördes väl.

För framställning av vätska B löstes 46,6 g KSA i 1,2 l dejoniserat vatten. Sedan pH ínställts på 9,0 med 1N Na0H, tillsattes 1,0 l dimetylformamid. Liksom i exempel 2 erhölls omkring 39,0 g testosteron-17-glukuronid-KSA (nedan benämnt T-17-G-RSA) (utbyte omkring 82 %). Steroidbindningstalet för .detta konjugat, genom ultraviolettabsorption och dinitrofenyl- ering, var 2,3 resp. 2,1.

Sedan sattes H00 ml 20 mM fosforsyrabuffertlösning inne- hållande 150 mM NaCl (pH 7,2) till 100 ml 10-procentig suspen- sion av polystyrenlatexpartiklar med en partikelstorlek av 0,721 um, varpå suspensionen centrifugerades vid H 000 r/min under 20 minuter. Den erhållna fällningen suspenderades i 500 ml av buffertlösningen, varpå suspensionen centrifugerades under ovannämnda betingelser, så att fällningen separerades.

Sedan sattes 500 ml av buffertlösningen innehållande 180 mg av det tidigare erhållna konjugatet till den separerade fällning- en. Sedan den erhållna suspensionen hållits vid 37°C under 2 timmar, centrifugerades den under samma betingelser och tvättades med buffertlösningen, varpå centrifugeringen upp- repades två gånger. Den erhållna fällningen omsuspenderades i 500 ml buffertlösning, och slutligen tillsattes natriumazid till en koncentration på 0,1 %. Sålunda erhölls 500 ml 2- procentig suspension av T-17-G-RSA-sensibiliserade latexpartiklar. 10 15 20 25 30 35 40 22 73Û6961'4 På liknande sätt som i försök 1 framställdes T-17-G- RSA-antikropp och späddes sedan med buffertlösningen till en titer av 0,05 nmol/ml T-17-G-ekvivalent. Pâ ett objektglas blandades 0,1 ml av denna utspädda antikropp med 0,1 ml av den erhållna latexpartikelsuspensionen, och agglutinering kunde iakttas inom 1 - 2 minuter. Då antikroppen späddes till en titer av 0,02 nmol/ml T~17-G-ekvivalent, kunde emellertid ingen agglutinering iakttas under 5 minuter. Föreliggande latex- reagens bedömdes sålunda ha 0,05 nmol/ml T-17-G-ekvivalent.

Exempel B Vätska A framställdes genom blandning av natriumhydro- kortison-21-hemisuccinat med koncentrerad saltsyra i molför- hållandet 1:1, varpå blandningen koncentrerades och tvättades med vatten, och dessa koncentrerings- och tvättsteg upprepades flera gånger, varpå blandningen torkades helt. 0,5 g av det sålunda erhållna torkade materialet löstes i 100 ml dimetyl- formamid, varpå lösningen försattes i följd med 0,26 ml tri-n- butylamin och 0,14 ml isobutylkloroformiat.

Under tiden framställdes vätska B genom upplösning av 17,6 g HSA i 600 ml dejoniserat vatten, inställning av pH på 9,0 med 1N NaOH och slutligen tillsats av 500 ml dimetyl- .formamid. Sedan erhölls på liknande sätt som i exempel 2 om- kring 13,6 g hydrokortison-21-hemisuccinat-HSA (nedan benämnt HC-21-HS-HSA) (utbyte omkring 75 %). Steroidbindningstalet för detta konjugat mätt genom dinitrofenylering var 3,0. 200 ml 40 mM veronalbuffertlösning innehållande 150 mM NaCl (pH 7,8) sattes till 50 ml av en 10-procentig suspension av polystyrenlatexpartiklar med en partikelstorlek på 0,721 um.

Den erhållna suspensionen centrifugerades vid 4 000 r/min under 20 minuter. Den separerade fällningen suspenderades i 250 ml av buffertlösningen och centrifugerades sedan under samma be- tingelser, varpå fällningen uppsamladcs. Sedan sattes 250 ml av buffertlösningen innehållande 88 mg av det tidigare erhållna konjugatet till den uppsamlade fällningen (latexpartiklar), varpå den erhållna suspensionen hölls vid 3700 under 2 timmar och därpå centrifugerades för uppsamling av fällningen. Fällning- en omsuspenderades i 250 ml buffertlösning och centrifugerades under angivna betingelser, och dessa steg upprepades ännu en gång. Den erhållna fällningen omsuspenderades i 250 ml buffert- lösning, varpå natríumazíd tillsattes till en koncentration av 10 15 20 25 30 2"* 7806961-4 omkring 0,1 %. Sålunda erhölls 250 ml av omkring 2-procentig suspension av HC-21-HS-HSA-sensibiliserade latexpartiklar.

Sedan blandades 0,05 ml 0,1 nmol/ml hydrokortison med 0,05 ml antikropp, vilken framställts såsom i försök 1 och utspätts med buffertlösningen till en titer av 0,1 nmol/ml HC-21-HS-ekvivalent, på ett objektglas, varpå 0,1 ml av den tidigare erhållna suspensionen av sensibiliserade latexpartiklar inblandades. Ingen agglutinering kunde iakttas ens efter 10 minuter. När 0,05 ml 0,05 nmol/mol hydrokortison och 0,05 ml utspädd antikropp blandades och sedan 0,1 ml suspensionen av sensibiliserade latexpartiklar tillsattes på ett objektglas, kunde emellertid agglutinering iakttas inom 2 - 8 minuter.

Titern för föreliggande latexreagens bestämdes till 0,05 nmol/ml HC-21-HS-ekvivalent.

Tabell II Utspädning av antikropp x50 x100 x200 x300 x400 Agglutinering + + + - - Tabell V Konjugat för Steroidbindningstal sensibilisering minimum maximum ~Progesteron-11- hemisuccínat-KSA 0,5 8,0 Hydrokortison-21- hemisuccinat~MSA 0,5 7,0 Aldosteron-3-(o-karboxi- metyl)-oxim~HSA 0,5 7,5 Testosteron-17-glukuronid- KSA 0,5 8,6 Pregnandiol-3-hemi- succinat~HSA 0,5 7,3 2H 7806961-4 mfi“Q n n Q,~> w Q m Q m,= m@>~. m wo.o. >“@ m,Q O.w: mß.Q mwmfi w m@.o m.fl mao Q“:N m.fl Nwm ß iøno :.N .O“N Q.~fl @.m mm: Q mQ“Q wnm ~.m O.w m.: fiflm w n n mO.@ N w fl“m fl.m @.> Gow I mfi.O >@w =.> @.m oßofi Qïfi m n mm o m fifl > ofi :.N oflwfl mm N Qwnfi ~.>fl finmfi :,fi oflmw mm fi HE\Hoë: HE w nüfløoüäxflfim wcflàwflædwm |PPwfi0«> :wPPm> |8mw|fl0fln#mm .öwfilfloflfivwm uoàvfldfln nmfivflb vmfimmflcowwn wwflmfiflmflfiwmaoz onm Pwnwflflwcmx Hmvwmcflcwcfln . lwflnofisxøflw |öwfl|Hoflhvwm Qmmfiwwmflvmnmwcflcflfiwvwëmfim HHH aflmnmß znß raw :nn w.> o.ß man m.m mflm :.m Ahmflxflvämmxwvwfl M fl.o hmm mëv Uwflmëmwßwnmm _ lflflflßflmflwm Hmâflcfiâ m.Q m“@ m.o o.~ wnm fl“m =.> >.Qfi fl.mfi ^ . fiæxmaoä fimmv flmvwwflfiüvcflß _ |wH=on:x:Hm.a@fi|Hofln~wm m m ß w m 1 m N fl >Ohm H Hflmnmß 7 8fl69L6 1-4 2 .fimwcflncfimmmä vmflacm pmwflwcox flwë wvmsmwflfifinflmøwm nmflxflvhmmxwvmq « w Q m ß fl flumfi rfi m _ Q 1 . ß N fl u m m fl O“fl >.@ m flum NH mflfl @.@ OH Hufi fifi m.N cam Om | Ofl m«.@ j.> m,@ 1 fim :@“@ ~“> @.~ | fiw H.E\HOEG >O..Hn.H PGÜHMN/.wx/vfiw |Uflcofiflx5Hw 1 xwvmfi Amwz ofl >onm nömfl|HoflnPww m flflo ämm mä Umamä vflmvov aæxmfloš ßwmv zoo pwsmflflmcwz |mwcflpwwflH«ßflmcww flmpmwaflqucfinnflopwpw wwnwflfiwnnwmwwaflcucmfim H> Hfiwnmw wO“o æfifl m.@ m>.@ QQIN w m@,O w.fl Nfifl wßfi oowfl ß moflo ßafl :,~ Q.m cow @ ßøno >.fl @.m m“: 00: m @fi.@ mad w,w ø“> ßmw 1 @fl.@ m.fl >.> @“@« owfl m Om.Q m.fi Q.«fl oßmfl Qwfl N Djhfi ~.fl m.mfl @,m~ mnfiß fi He\Hos: w > on@ PGwam>w>Mw A Cflhmfi Emm Luficofisxøfiw xwvmfi Åwflfifi m mvawfifiwnnmmfioz |amfl|H0fi9umw w fißo mmm mä vwcmå . .vv H P mmz wmßwflflwcmx lmwcflhwmflflwnfiwßwm |mwGflcUsflfl| >H HHQQWB

Claims (2)

10 15 20 25 30 35 7806961-4 26 PATENTKRAV

1. Förfarande för framställning av ett latexreagens, som innehåller latexpartiklar sensibiliserade med ett steroidserum- albuminkonjugat och lämpar sig för immunokemisk bestämning av steroid i mänsklig kroppsvätska eller utsöndrad vätska, k ä n n e t e c k n a t av att man framställer ett steroid- serumalbuminkonjugat genom att omsätta en steroid med ett serum- albumin i ett förhållande mellan 0,5 och 7 mol steroid per mol serumalbumin och framställer sensibiliserade latexpartiklar genom att sensibilisera immunologiskt inerta latexpartiklar med det erhållna steroid-serumalbuminkonjugatet. 2. Förfarande enligt patentkravet 1, k ä n n e - t e c k n a t av att sensibiliseringen av latexpartiklarna med konjugatet utförs med en mängd konjugat, som icke framkallar en på de sensibiliserade latexpartiklarna själva beroende ospe- cifik agglutinering. 3. Förfarande enligt patentkravet 1 eller 2, k ä n n e - t e c k n a t av att serumalbuminet utgörs av nötserumalbumin, hästserumalbumin, fårserumalbumin, kaninserumalbumin eller människoserumalbumin. 4. Förfarande enligt något av patentkraven 1 - 3, k ä n n e t e c k n a t av att latexpartiklarna utgörs av poly- styren-, polybutadien- eller styren-butadiensampolymerlatex- partiklar. _ 5. Förfarande enligt något av patentkraven 1 - 4, k ä n n e t e c k n a t av att den för framställning av konju- gatet använda steroiden kan framkalla en antigen-antikropps- reaktion med en antikropp, för vilken estrogen och dess metaboliter, progesteron och dess metaboliter, androgen och dess metaboliter samt 17-hydroxikortikosteron och dessmetaboli- ter kan verka som hapten. 6. Förfarande enligt patentkravet 5, k ä n n e ~ t e c k n a t av att den-för framställning av konjugatet an- vända steroiden är estrogen, progesteron, androgen eller 17- hydroxikortikosteron eller en metabolit därav. 7. Förfarande enligt något av patentkraven 1 - 6, k ä n n e t e c k n a t av att latexens partikelstorlek ligger inom omrâdet 0,234 - 0,721 um och att mängden för sensibilise- ring av latexpartiklarna använt konjugat är inom omrâdet 10 15 20 h) LW 78069-61-4 i 27 0,3 - 1,1 umol per gram latexpartiklar. 8. Latexreagens, som innehåller latexpartiklar sensibili- serade med ett steroid-serumalbuminkonjugat och lämpar sig för immunokemisk bestämning av steroid i mänsklig kroppsvätska eller utsöndrad vätska, k ä n n e t e c k n a t av att kon- jugatet har ett steroidbindningstal inom omrâdet 0,5 - 7 mol- ekyler per molekyl serumalbumin, att latexens partikelstorlek ligger inom området 0,234 - 0,721 um och att mängden för sensi- bilisering av latexpartiklarna använt konjugat är inom området 0,3 - 1,1 umol per gram latexpartiklar. 9. Latexreagens enligt patentkravet 8, t e c k n a t av att serumalbumindelen av steroid-serumalbunán- konjugatet utgörs av nötserumalbumin, hästserumalbumin, fâr- serumalbumin, kaninserumalbumin eller människoserumalbumin. k ä n n e- k ä n n e - 10. Latexreagens enligt patentkravet 8 eller 9, t e c k n a t av att latexpartiklarna utgörs av polystyren-, polybutadien- eller styren-butadiensampolymerlatexpartiklar. 11. Latexreagens enligt något av patentkraven 8 - 10, k ä n n e t e c k n a t av att steroiddelen i steroid-serum- albuminkonjugatet är en steroid, som kan framkalla en antigen- antikroppsreaktion med en antikropp, för vilken estrogen och dess metaboliter, progesteron och dess metaboliter, androgen och dess metaboliter samt 17-hydroxikortikosteron och dess metaboliter kan verka som hapten.

2. Latexreaqens enligt patentkravet 11, k ä n n e - t e c k n a t av att steroiden är estrogen, progesteron, andro- gen eller 17-hydroxikortikosteron eller en metabolit därav.