JPS5819222B2 - ステロイド−血清アルブミン複合体感作ラテックス粒子の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はステロイド−血清アルブミン複合体（以下複合
体と略記する）を感作したラテックス粒子抗原とステロ
イド−・ブテン抗体とを用いてスライドグラス板上で凝
集または凝集阻止反応により微量ステロイドを検出する
方法に使用する複合体感作ラテツクス粒子の製造法に関
し、更に詳しくは血清アルブミンとステロイドとを従来
の複合体とは異なった特定の割合で化学的に結合せしめ
て複合体を調製し、該複合体を免疫化学的に不活性な蛋
白質で処理することなく、そのままラテックス粒子に感
作することを特徴とする複合体感作ラテツクス粒子の製
造法である。

本発明の目的は人の体液または排泄液中に存在する微量
ステロイドを免疫学的に高感度で検出するために適当し
た複合体感作ラテツクス粒子を提供することである。

近年、臨床化学分析の役割はますます重要性を有するよ
うになってきたが、それに伴って分析法の特異性を高め
ることは勿論、微量成分を検出する方法の必要性が増加
している。

微量成分を正確に定量するためには、特殊な分析機器の
発展並びに分析用試薬の開発等の貢献に依存するところ
が大きいが、一方ではこのような装置および複雑な操作
を使用しない迅速かつ簡便な、その上非常に特異性の高
い測定法が要求されている。

そして臨床検査においては、患者の病態および健康状態
の診断のために生体の体液または排液中の排泄物質の簡
便な検査が実施され、その効果を上げている。

このような観点から人の体液または排泄液中のステロイ
ドおよびその代謝産物の検出も注目されているが、ステ
ロイドの検出法の一つとしては、分析機器を使用しない
免疫化学的な抗原−抗体反応を応用した検査法があり、
特開昭５１−１１２５１３に開示されている。

しかしこの方法には次のような問題点がある。

すなわちこの方法は、テヒドロエピアンドロステロンサ
ルフエートをハプテンとして、蛋白質に化学結合させて
、該ステロイド−蛋白質複合体を合成し、ステロイドを
免疫化学的に検出するものであり、その検出の手段の一
つとして該ステロイド−蛋白質複合体をラテックス粒子
に感作して凝集または凝集阻止像を判定することが採用
されている。

従って、この方法は目的とするステロイドを免疫化学的
に検出することが主眼であり、その手段はラジオイムノ
アッセイ、ラテックス凝集試験管種々の方法を適用する
とともに、その種々の調製法自体も公知の方法と同様で
ある。

以上のことからこの方法の感作ラテツクス粒子を使用す
る検出手段においては、ステロイドの検出感度を高める
事を目的にした調製ではないので、検出感度は低く、微
量のステロイドの検出を目的とする場合には、この方法
は効果的ではない。

感作ラテツクス粒子を使用してステロイドを検出するた
めには、次のような問題点が改善されなければならない
。

人の体液または排泄液中にはステロイド以外の種々化合
物が存在しており、これらはステロイドよりはるかに多
く存在する場合の方が一般的である。

ラテックス粒子を用いてステロイドを検出するために、
特異性の高い免疫化学的方法を採用するとしても、これ
らステロイド以外の化合物の影響によりステロイドの検
出が出来ない場合も生ずる。

これらのステロイド以外の化合物の影響を少なくするに
は、これらを除去するか、あるいは十分希釈するかのい
ずれかの方法をとらなければならない。

しかし前者では、そのための煩雑な操作を必要とするの
で、簡便、迅速を目的とする臨床検査においては好まし
くな（、後者では十分に試料を希釈しても、なおかつス
テロイドが検出される方策、すなわちステロイドの検出
感度を高める方法を講する必要がある。

このための公知の手段としては、感作ラテツクス粒子調
製時の複合体の感作量および抗体の希釈度を調節するこ
とが知られている（特開昭５Ｏ−１２３８１９）。

抗体の希釈度を調節することは、感作ラテツクス粒子に
よるステロイドの検出感度を高める場合には、その希釈
度が出来るだけ高いものと凝集を起こす感作ラテツクス
粒子が必要であり、このことからステロイドの検出感度
を高めるには、抗体の希釈度を調節することとラテック
ス粒子の調製法、すなわちラテックス粒子調製時の複合
体の感作量を調節することとは、同一のものと考えるこ
とが出来る。

しかし次に述べる如く、感作ラテツクス粒子の調製にお
いて、複合体の感作量を調節してもステロイ、ドの検出
感度を高めるには不十分であるという欠点が存在する。

ラテックス粒子はそれ自身不安定で安定化剤の存在しな
い状態では、ラテックス粒子自身の非特異的な凝集が生
じ、抗原−抗体反応による特異的な凝集を検出すること
ができない。

このために感作ラテツクス粒子を調製するためには、蛋
白質自身のラテックス粒子安定化の性質を利用して抗原
として感作させる複合体をある一定量以上、ラテックス
粒子に感作させることが必要であるとともに、感作量が
増せば、ラテックス粒子は安定化を増し、感作量が多す
ぎると目的とする特異的な凝集は生じなくなる。

従って複合体の感作量は、ラテックス粒子の非特異的凝
集を起こさない最少量が検出感度の限界となり、これ以
上の検出感度を望む場合は、ラテックス粒子に感作する
複合体の量を変動させても達成出来るものではない。

さらに、ラテックス粒子の非特異的な凝集を抑え、ラテ
ックス粒子を安定化させるために免疫学的に不活性な蛋
白質をラテックス粒子に感作する蛋白質以外に添加する
ことも行なわれているが（特公昭４９−１１４０７、特
開昭５Ｏ−８２２３０）、ラテックス粒子に感作する複
合体の量を免疫学的に不活性な蛋白質で減することが出
来ても、この不活性な蛋白質によるラテックス粒子の安
定化作用が関与して抗原−抗体反応による凝集の検出感
度は低下を来たすことになる。

以上の事からこの方法ではラテックス粒子の非特異的凝
集を起こさない感作量で、検出される感度以上の感作ラ
テツクス粒子を調製することは不可能である。

特開昭４８−４９９１８においては、プロゲステロンの
免疫学的凝集法による検定方法が開示されている。

この方法においては、ラテックス粒子とプロゲステロン
−蛋白質複合体とをカップリング剤により、化学結合さ
せることを特徴としているが、化学結合させるグロゲス
テロンー蛋白質複合体は、公開公報の実施例４に具体的
に示されている通り、抗体産生用抗原と同一の１１α−
ヒドロキシプロゲステロンへミサクシネートー牛血清ア
ルブミンが使用され、この抗原として使用する複合体は
牛血清アルブミン１分子当りヒドロキシプロゲステロン
を約１５乃至４０分子持つものと記載されており、複合
体とラテックス粒子を化学結合する調製法においては、
複合体に結合しているステロイド数は抗原に使用するも
のと同一で、結合数が多い複合体を使用している。

また、前記特開昭５０−１２３８１９においても、感作
ラテツクス粒子の製造にエストリオール−１６α−グル
クロナイド−家兎血清アルブミンを用いているが、この
複合体の製造法は、公開公報の製造例１に示されている
如く、蛋白質１モル当り、エストリオール−１６α−グ
ルクロナイドが２７〜３０結合した複合体であり、ステ
ロイドの結合数は多いものである。

このように従来のラテックス粒子の製造においては、使
用する複合体の蛋白質１分子当りに結合するステロイド
の数が極めて多いものが使用され、複合体の感作量を変
えることにより、ラテックス粒子の調製が行なわれてい
た。

本発明者らはステロイドの検出感度を向上させるために
は、抗原としての複合体の量的な関係でなく、質的な関
係を改善しなければならないことに注目し、特にラテッ
クス粒子に感作する複合体について鋭意研究を行なった
。

その結果本発明者らはラテックス粒子に感作する複合体
のステロイドと血清アルブミンとの化学結合の比率があ
る特定の範囲すなわち血清アルブミン１分子当りステロ
イドが０．５〜７．０個の割合で化学的に結合せしめた
複合体をラテックス粒子に感作させた試薬を用いた場合
、スライドグラス板上での免疫化学的凝集または凝集阻
止反応が著しい感受性を有し、さらにステロイドおよび
血清アルブミンの種類に無関係にこの特定の範囲で感作
したラテックス粒子により凝集または凝集阻止反応が生
じることを見出し、人の体液または排泄液中に微量に存
在するステロイドを高感度で検出し得ることを見出した
。

本発明は、免疫学的にステロイドを検出するために使用
する公知のステロイド−血清アルブミン複合体感作ラテ
ツクス粒子の製造法において、血清アルブミン１分子当
り、０．５〜７個の割合で卵胞ホルモン、黄体ホルモン
、男性ホルモン、副腎皮質ホルモンおよびこれらの代謝
産物から選ばれる１種のステロイドを化学的に結合せし
めて、ステロイド−血清アルブミンを調製し、該複合体
を免疫化学的に不活性な蛋白質で処理することなく、そ
のままラテックス粒子に感作することを特徴とする免疫
学的に高感度でステロイドを検出し得るステロイド−血
清アルブミン複合体感作ラテツクス粒子の製造法である
。

次に本発明の方法について詳述する。

本発明の方法において複合体を調製するために使用する
ステロイドは卵胞ホルモンのエストロゲンおよびその代
謝産物、黄体ホルモンのプロゲステロンおよびその代謝
産物、男性ホルモン、すなわちアンドロゲン関連の１７
−ケドステロイドおよびその代謝産物、副腎皮質ホルモ
ンの１７−ヒドロキシコルチコステロイドおよびその代
謝産物等である。

これらのステロイドは血清アルブミンと複合体を調製す
る際、人の体液または排泄液中に見出される状態で用い
るのが望ましく、多くはステロイド・グルクロナイド抱
合体、またはステロイド・サルフェート抱合体であるが
、人の体液または排泄液中に見出されるステロイドと免
疫学的に十分な交叉反応性を有するステロイドおよび血
清アルブミンと化学的結合が可能な官能基を有する合成
ステロイド、例えばステロイド−ヘミサクシネート、ス
テロイド−（０−カルボキシメチル）−オキシム等も複
合体の調製に使用することが出来る。

本発明の方法において複合体の調製に使用する蛋白質は
、精製された市販の血清アルブミンであれば、牛血清ア
ルブミン（以下ＢＳＡと略記する）、馬血清アルブミン
（以下ＥＳＡと略記する）、羊血清アルブミン（以下Ｓ
ＳＡと略記する）、人血清アルブミン（以下Ｈ８Ａと略
記する）または家兎血清アルブミン（以下Ｒ８Ａ゛と略
記する）等いずれでもよいが、特にＢＳＡまたはＢＳＡ
が望ましい。

複合体は公知の方法、例えばカルボジイミド法（クロス
ら：イムノケミストリー、５巻、５５頁、１９６８年）
、酸塩化物法および混合酸無水物法（アーランジャーら
：ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、
２２８巻、７１３頁、１９５７年）、インシアナート法
（グツドフレンドら：カナディアン・ジャーナル・オブ
・バイオケミストリー・アンド・フイジオロジー、３６
巻、１１７７頁、１９５８年）等により調製される。

以下の本発明の詳細な説明においては１例として混合酸
無水物法により、血清アルブミン１分子当り０．５〜７
個の割合でステロイドが結合した複合体の調製法につい
て述べる。

なお、この方法における調製はすべて低温下（６℃）で
行なわれる。

血清アルブミンのモル比に換算して１．５〜１０倍量の
ステロイド−グルクロナイド、ステロイド−ヘミサクシ
ネートまたはステロイド−（０−力ルボキシメチル）オ
キシムをジメチルホルムアミドに溶解し、これに活性化
助剤として）ＩＪ−ｎ−ブチルアミンをステロイドと同
モル加え、次いで活性化剤としてインブチルクロロホル
メートをステロイドと同モル加え、攪拌して混合液Ａを
調製する。

−力説イオン水に血清アルブミンを溶解し１．１規定Ｎ
ａＯＨでｐＨを８．０〜１０．０に調整し、さらにジメ
チルホルムアミドを加え、混合液Ｂを調製する。

ただし、混合液Ｂに加えるジメチルホルムアミドの量と
混合液Ａのそれの量との合計が混合液Ｂの脱イオン水の
量と等量となるよう混合液Ｂに加えるジメチルホルムア
ミドの量を調整する。

この混合液Ｂに先に調製した混合液Ａを滴下し、１時間
半攪拌ののち１規定ＮａＯＨを加えてｐＨを８．０〜１
０．０に調製し、さらに３時間半攪拌を行ない、複合体
を合成する。

次いでこの反応液を水に対して透析し、反応液１容に対
し、アセトン２容を添加し、均一に混合し、１規定ＨＣ
Ｉを加えて、該複合体を析出させ、その後遠心する。

得られた沈澱物を水に対して透析してアセトンを除去し
複合体を得る。

調製された複合体のステロイド数は公知の方法、例えば
紫外部吸収法、ジニトロフェニル化法により測定される
（試験１参照）。

本発明の方法に使用するラテックス粒子は市販のポリス
レン、スチレン・ブタジェン共重合体等の反応基を有さ
ない化学的および血清学的に不活性なラテックス粒子で
特にポリスチレンラテックス粒子が望ましい。

また、ラテックス粒子の径の大きさは０．０５μから１
．０μで特に０．２μから０．８μのものが望ましい。

このようにして調製された複合体のラテックス粒子への
感作は次のようにして行なわれる。

ｐＨが７．２から８．６の間の緩衝液で洗浄あるいは希
釈したラテックス粒子懸濁液を適当濃度の複合体溶液と
混合し、攪拌しながら３１℃で２時間保持する。

その後遠心して沈澱物を分離し、この沈澱物を緩衝液で
洗浄し、次いで遠心、洗浄をくりかえして沈澱物を緩衝
液に再懸濁し、複合体感作ラテツクス粒子を得る。

ラテックス粒子の感作に使用する複合体の量は、最終的
に得られる感作ラテツクス粒子がラテックス粒子自身に
よる非特異的凝集２をおこさず、抗原−抗体反応による
特異的な凝集をおこし、さらに抗体を十分量のステロイ
ドバブチンで中和した後、感作ラテツクス粒子と混合し
ても凝集反応をおこさず、均一な懸濁状態を保持する範
囲に限定されるが、この量は使用するラテックス粒子の
大きさおよびステロイドと血清アルブミンとの結合の比
率の違いにより変動する。

例えばＲ８Ａｌ分子当り２．０個（紫外部吸収法により
測定）のエリトリオ−ルー１６α−グルクロナイド（以
下Ｅ３−１６α〜Ｇと略記する）を結合した複合体を０
．２３４μと０．７２１μのラテックス粒子に非特異的
凝集を起こさない最少量を感作した（試験１の（２）複
合体感作ラテツクス粒子の調製を参照）場合の複合体の
量は、それぞれ７２〜／２ラテックス粒子、および１８
ｍ９／７ラテツクス粒子で径の小さい方が複合体を多く
必要とし、１分子当り１５，１個のＥ３−１６α−Ｇを
結合した複合体を０．２３４μのラテックス粒子に感作
した場合の複合体の量は５４１ｒ１９／７ラテツクス粒
子でＲ８Ａｌ分子当り２．０個の７２ｒ１１９／７より
少ない（表１参照）。

感作ラテツクス粒子はこの外に透析、限外濾過および上
記の方法との併用により調製する事が可能であり、この
ように調製した感作ラテツクス粒子を凍結乾燥すること
も出来る。

ごのようにして調製された複合体感作ラテツクス粒子を
用い次のようにしてステロイドを検出する。

ステロイドを含有する人の体液または排泄液の一定量を
採取し、必要があれば希釈した試料と抗体の一定量とを
混合し、ステロイドと抗体とによるステロイドハプテン
−抗体中和反応を行ない、その後この混合液をスライド
グラス板上にとり、複合体感作ラテツクス粒子の懸濁液
の一定量とスライドグラス板上で細長い小さな棒で攪拌
し、数分後のスライドグラス板上の凝集または凝集阻止
反応すなわち試料中のステロイドで抗体が中和されない
場合、複合体感作ラテツクス粒子の添加で、残存の抗体
と抗原−抗体反応を起こし、凝集が観察され、試料中の
ステロイドで抗体が中和された場合、複合体感作ラテツ
クス粒子を添加しても抗体が中和されているために凝集
が観察されず、凝集阻止反応として検出される。

スライドグラス板上で凝集または凝集阻止を判定する際
に使用する感作ラテツクス粒子懸濁液の濃度は、薄すぎ
ても濃すぎても判定が不明確であり、濃度は０．５％か
ら３％特に１％から２％が望ましい。

凝集阻止反応の判定は人の体液または排泄液中のステロ
イドの存在が不足している場合、感作ラテツクス粒子と
抗体とによる凝集は遅くとも５分間で出現するので本発
明の方法によれば、通常２分間から５分間の検索で検査
を終了し得る。

次に本発明の方法において、複合体の血清アルブミンと
ステロイドとの結合の比率を血清アルブミン分子１モル
当りステロイドを０．５〜７個に限定した理由について
試験例を示して詳述する。

〔試験１〕 （１）試料の調製法 （１）複合体の調製 Ｅ３−１６α−Ｇ（シグマ社製）とＲ８Ａ（ＩＣＮファ
ーマシューテイカルズ社製）とを用い、Ｒ８Ａ分子１モ
ル当り０．３〜１５個のＥ３−１６α−Ｇが結合した９
種の複合体を次のように調製した。

なお、調製はすべて低温下（６℃）で行なった。

Ｅｓ １６ ａ Ｇ １０１ｎ９をジメチルホル
ムアミド（和光紬薬工業製）１ｗｔｌに溶解した溶液９
個を調製し、これらにｔｌＪ−ｎ−ブチルアミン（東京
化成工業製）５．１μｌを加え、次いでインブチルクロ
ロホルメート（アルドリッチケミカル社製）２．８μｌ
をそれぞれに加えて攪拌し混合液Ａを調製した。

一方、Ｒ８Ａおよび脱イオン水を表３に示した如く、秤
量して溶解し、ｐＨを１規定ＮａＯＨで８．０〜１０．
０に調整し、さらにジメチルホルムアミドを混合液Ａと
の合計量が脱イオン水と等量になるように加え、９種類
の混合液Ｂを調製した。

これらの混合液Ｂに先に調製した混合液Ａをそれぞれ滴
下し、１時間半攪拌し、後１規定ＮａＯＨでｐＨを８．
０〜１０．０に調整し、さらに３時間半攪拌を行ない、
Ｅ３−１６α−Ｇ−Ｒ８Ａ複合体を合成した。

次いでこの反応液を脱イオン水一対して透析し、晃応液
１容に対して、アセトン２容を添加し、十分混合し、後
１規定ＨＣＩ を加えて各複合体の沈澱を形成せしめ、
これを１０００Ｏｒ、ｐｏｍ、で５分間遠心した。

分離した沈澱物を脱イオン水に溶解し、脱イオン水に対
して透析してアセトンを除去し、９種類の複合体（試料
腐１〜９）を得た。

（２）複合体感作ラテツクス粒子の調製 前記（１）により調製した９種の複合体を用い次のよう
にして感作ラテツクス粒子を調製した。

複合体のラテックス粒子への感作量は感作後のラテック
ス粒子が非特異的な凝集を起こさない最少量で行なった
が、最少量を次のようにして求めた。

試料／１６．１の複合体５．０．５．２．５．４、およ
び５．６■をそれぞれ１５０ｍＭ ＮａＣ１を含む４０
７７１Ｍペロナール緩衝液（ｐＨ７，８） ４０ｒｆＬ
ｌに溶解し、１０％濃度の粒子径が０．２３４μのラテ
ックス粒子（ダウケミカル社製）１ｒｒＬｌを添加し、
３７℃で、２時間保持した。

その後この感作ラテツクス粒子懸濁液を４００Ｏｒ、ｐ
、ｍ、で２０分間遠心し、得られた沈澱物を該緩衝液２
０ｒｒＬｌに懸濁して同条件で遠心し、この操作を２回
行ない沈澱物を該緩衝液５ｒｒＬｌに懸濁して、それぞ
れの複合体感作ラテツクス粒子懸濁液を得た。

これらの懸濁液０．１ ｍｌと該緩衝液０．１ ｍｌと
をそれぞれスライドグラス板上で混合し、ラテックス粒
子の非特異的凝集を観察したところ、５．０ηおよび５
．２りの複合体感作ラテツクス粒子では、凝集が認めら
れ５．４ηおよび５．６゛ダの複合体感作ラテツクスで
は凝集が認められなかった。

このことから試料／１６．１の非特異的な凝集を起こさ
ない複合体の最少量は、５．４雫であり、この量を試料
屑１の複合体の最少感作量として、感作ラテツクス粒子
の調製を行なった。

同様にして、試料４６２〜９までの非特異的な凝集を起
こさない複合体の最少量を求め（表１参照）、これらの
最少量を用いて感作ラテツクス粒子の調製を行なった。

Ｒ３−１６α−Ｇの結合数および検出感度の測定法は次
の通りである。

川 測定方法 （１） Ｒ３−１６α−Ｇの結合数の測定（１）紫外
部吸収による測定 紫外部吸収によるＲ３−１６α−Ｇ結合 数の測定はアーランジャーらの方法（ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー、２３４巻、１０９０
頁、１９５９年；に従い次のように行なった。

Ｒ３−１６α−ＧおよびＲ８Ａの紫外部 吸収極太波長はともに２７８ｎ７７１にあり、複合体の
吸収極大はＲ３−１６α−Ｇと Ｒ８Ａの両者の合計した値でｍ１ｆｆｌされるので、こ
の吸収極大波−ｍモル吸光係数の算術計算によってＲ３
−１６α−Ｇの結合分子数を算出した。

すなわち複合体中のＲ３−１６α−Ｇ由来の吸光度は、
複合体の吸光度からＲ８Ａの吸光度を差し引くことによ
り求められ、Ｒ３−１６α−Ｇの１モル当りの吸光係数
から複合体中の結合Ｒ３− １６α−Ｇ数を求めた。

（ｉ：）ジニトロフェニル化法による測定ジニトロフェ
ニル化法によるＲ３− １６α−Ｇの結合数の算出方法は次の通りである。

複合体およびＲ８Ａをサンガーの方法（バイオケミカル
・ジャーナル、３９巻、５０７頁、１９４５年）により
複合体＝およびＲ３Ａ中のりジン残基をジニトロフルオ
ロベンゼン（和光紬薬工業製）を使用してジニトロフェ
ニル化し、１１０℃で ２４時間加水分解し、ジニトロフェニルリジンを遊離せ
しめ、標準物質として市販のジニトロフェニルリジン（
東京化成工業製）を使用して０．Ｄ、 ３９０ ｎ ｍ
で比色定量し、その値から複合体に結合しているステロ
イド数を算出した。

（２）検出感度の測定法 表１０感作量の感作ラテツクス粒子を用い、抗体の力価
を次のように測定し、本抗体の力価からＲ３Ａ分子１モ
ル当りのＲ３−１６α−Ｇ結合数とＲ３−１６α−Ｇ検
出感度との関係を試験した。

抗体の希釈倍率の池］定は次のように行なった。

家兎にＲ３−１６α−Ｇ−ＢＳＡ複合体を注射し、免疫
して得た抗血清を抗体原液とした。

この抗体原液を１５０ｍＭＮａＣ１を含む４０ｍＭベロ
ナール緩衝液（ｐＨ７，８）で希釈し、その０．０５Ｗ
Ｌｌと０．１ ｎ ｍｏｌｅ ／ｍｌのＲ３−１６α−
Ｇ溶液０．０５ ｒｕｌとを混合し、スライドグラス板
上にとり、Ｒ３−１６α−Ｇの結合数が２．０個の複合
体感作ラテツクス粒子懸濁液０．１ ｍｌとスライドグ
ラス板上で混合攪拌し３分以内に凝集が検出される最大
希釈倍率を求めた。

その結果は表２の通りである。この抗体は２００倍希釈
において少なくとも０．１ ｎ ｍｍｏｌｅ Ｒ３−１
６ａ −Ｇ等量／ｍｌの力価であり、本抗体の原液の力
価は２０ｎｍｏｌｅ Ｅ３−１６ａ −〇等量／ｒｆＬ
ｌと計算される。

次いで本抗体を４０ｍＭベロナール緩衝液で希釈し、そ
の０．１ ｍｌと各結合数の複合体感作ラテックス粒子
懸１濁液ｏ、１ｒＩＬｌとをスライドグラス板上で混合
攪拌し、３分以内に凝集の観察される最大希釈倍率を測
定し、その倍率から前記と同様に力価を算出し、検出芯
。

度とした。

なおこの方法においてはこの検出感度の測定から感作ラ
テツクス粒子が凝集をおこすのに要した抗体の希釈倍率
が高い程すなわち抗体量が少ない和検出感度が高℃・こ
とが明らかである。

各試料のＥ３−１６α−Ｇの結合数および抗体による検
出感度は表３に示す通りであった。

表３の結果からＥ３−１６α−Ｇ−Ｒ８Ａ感作ラテック
ス粒子と抗体との免疫凝集反応は、感作ラテツクス粒子
の調製に使用した複合体中のＲ３Ａｌ分子当りの鉤。

−１６α−Ｇの結合数と凝集の観察される抗体の検出感
度との間に相関性が認められ、結合Ｅ３−１６α−Ｇが
多くても少なくても検出感度は低下し、結合数２．０付
近で最大の検出感度を示した。

従来の感作ラテツクス粒子の調製法による検出感度は、
０．５ ｍｍｏｌｅ Ｅ３−１６α−Ｇ等量／ｍｌより
低く（表６参照）、微量のＥ３−１６α−Ｇを検出する
には抗体の検出感度が０．５ ｎｍｏｌｅ Ｅ３ −１
６ ａ −Ｇ等量／ｒｎｌより高く、少なくとも０．２
ｎｍｏｌｅ Ｅ３−１６α−Ｇ等量／ｒｆｌｌより高い
ことが望ましい。

この検出感度より高い検出感度の感作ラテツクス粒子の
複合体の結合Ｅ３−１６α−Ｇ数は紫外部吸収法および
ジニトロフェニル化法の両者から少なくとも０．５〜７
．４であり特に抗体量が０．１ ｎｍｏｌｅ Ｅ３−１
５α−Ｇ等量／廐より高い検出感度で凝集をおこす０．
７〜５．１の結合数の感作ラテツクス粒子が好ましい。

試験１で使用した複合体以外の複合体を感作したラテッ
クス粒子について試験１と同様の試験を行なった例を示
し、複合体の血清アルブミンの種類およびステロイドの
種類に関係なく、本発明においては血清アルブミン１分
子当りのステロイド結合数が０．５〜７個でなければな
らないことを示す。

〔試験２〕 デヒドロエピアンドロステロン（シグマ社製。

以下ＤＨＥＡと略記する）とＢＳＡ（ＩＣＮファーマシ
ューライカルズ社製）とを用い、Ｂ５Ａｌ分子当り０．
５〜１８．３個のＤＨＥＡが結合した８種の複合体を次
のようにして調製した。

ＤＨＥＡｏ、７５７および（０−カルボキシメチル）ヒ
ドロキシルアミン塩酸塩（相光紬薬工業製）０．６９ｆ
をエチルアルコール２０ｗＬｌに溶解し、６．４Ｍ酢酸
ソーダ溶液２ｒＩＬｌを加えてアルカリ性に保つ。

この混合液を１時間還流しＮａ２ＣＯ３を５％になるよ
うに添加して、エーテルで洗浄後、水層を濃塩酸で酸性
にして沈殿を得る。

その後エタノールから再結晶し、ＤＨＥＡ−１７−（ｏ
−カルボキシメチル）オキシム（以下ＤＨＥＡ、−ＣＭ
Ｏと略記する）約０．６ｆＩを得た。

ＤＨＥｔ−ＣＭＯとＢＳＡとを用いて試験１と同様の方
法で複合体を調製し、ジニトロフェニル化法によりＤＨ
ＥＡ数を測定した。

このように調製した８種の複合体を用い、次のようにし
て感作ラテツクス粒子を調製した。

複合体のラテックスｉ子への感作量は試験１と同様の方
法による感作後のラテックス粒子が非特異的凝集をおこ
さない最少量とした（表４参照）。

１０％濃度の粒子径が０．７２１μのラテックス粒子（
ダウケミカル社製）１ｒＩｌｌに１５０ｍＭ ＮａＣ
１を含む２０ｒＩＬＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，２） ４
ｒｎｌを加えた試料を８検体用意し４０００ｒ、ｐｌｍ
、で２０分間遠心し、得られた沈殿物を５ｒｒＬｌの該
緩衝液に懸濁して同条件で遠心した。

分離した沈殿物に表４に示す各複合体の最少感作量を含
んだ緩衝液５ｒＩＬｌを添加して３７℃で２時間保持し
た。

その後遠心および緩衝液による洗浄を２回くり返し、Ｄ
ＨＥＡ−ＣＭＯ−ＢＳＡ感作ラテックス粒子懸濁液５ｒ
ＩＬｌを得た。

これらの感作ラテツクス粒子を用い、抗体の最大希釈倍
率を試験１と同様に測定し、ＤＳＡ１モル当りに結合す
るＤＨＥＡ数とＤＨＥＡ検出感度との関係を試験した。

抗体の最大希釈倍率の測定法は次のようにして行なった
。

家兎にＤＨＥＡ−ＣＭＯ−ＥＳＡを注射し、免疫して得
た抗血清を抗体原液とした。

この抗体原液と１５０ｍＭ ＮａＣ１を含む２０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，２）で希釈し、その０．０５ｍ１
と０．２ｎ ｍｏｌｅ／ｒｎｌのＤＨＥＡ溶液０．０５
ｒｕｌとを混合し、スライドグラス板上にとり、ＤＨ
ＥＡの結合数が２．４の複合体感作ラテツクス粒子懸濁
液０．１ ｍｌとスライドグラス板上で混合攪拌し３分
以内に凝集が検出される最大希釈倍率を試験１と同様に
求めたところ最大希釈倍率は５０倍であった。

この抗体は５０倍希釈において少なくとも０．２ ｎ
ｍｏｌｅＤＨＥＡ等量／ｒｕｌの力価であり本抗体原液
σ力価は１０ ｎ ｍｏｌｅ ＤＨＥＡ等量／ｒｕｌと
算出された。

次いで本抗体を２０ｍＭＪン酸緩衝液で希釈し、その０
．１ ｒｕｌと各結合数の複合体感作ラテツクス粒子懸
濁液０．１ ｒｕｌとをスライドグラス板上で混合攪拌
し、３分以内に凝集の観察される最大希釈倍率を測定し
、その倍率から前記試験２と同様の方法で検出感度と測
定した。

ＤＨＥＡの結合数および検出感度の測定結果を表４に示
す。

表４の結果からＤＨＥＡ−ＣＭＯ−ＢＳＡ感作ラテック
ス粒子と抗体との免疫凝集反応は、ＤＨＥＡ−ＣＭＯの
結合数が１，２〜２．４付近で検出感度が最大になり検
出感度が０．２ ｎ ｍｏｌｅ Ｄ ＨＥ Ａ等量／ｒ
ｕｌより高いＤＨＥＡの結合数は０．５〜７．７である
ことが判明した。

〔試験３〕 さらに本発明者らは試験１および２で用いた以外のステ
ロイドおよび血清アルブミンを使用して試験１または２
と同様の方法でラテックス粒子を調製し０．２ ｎ ｍ
ｏｌｅステロイド等量／ｒｎｌの抗体力価より高い検出
感度で凝集をおこす各種ステロイドの血清アルブミン１
分子当りのステロイド結合数を試験１と同様の方法で測
定し、その結果をまとめて表５に示す。

表５の結果から複合体を構成するステロイド、血清アル
ブミンが試験１および２と異なっていても０．２ ｎ
ｍｏｌｅステロイド等量／ｒｕｌの抗体力価より高い検
出感度を示す複合体のステロイド結合数はほぼ０．５〜
７．０の範囲に存在することが判明した。

従って本発明の方法によれば、どのようなステロイドと
血清アルブミンとの組合せにおいても血清アルブミン１
分子当り０．５〜７．０個の割合でステロイドが結合し
ている複合体でラテックス粒子を感作することによって
ステロイドの検出感度の高い感作ラテツクス粒子を製造
しうる。

本発明の方法により製造される複合体感作ラテツクス粒
子の効果をステロイド検出感度について従来法により製
造されたそのステロイド検出感度と比較した試験例を示
せば次の通りである。

〔試験４〕 従来のステロイド結合数の多い複合体および該複合体に
よる感作ラテツクス粒子を次の如く調製した。

Ｒ８Ａ（ＩＣＮファーマシューテイカルズ社製）４７〜
に脱イオン水ｔｏｒｎｌを添加した以外すべて試験１の
方法と同様め方法でＥ３二１６α−Ｇ−Ｒ８Ａの複合体
を調製し、Ｅ３−１６α−ＧがＲ８Ａ分子１モル当り２
０個（歳験１の紫外部吸収法により測定）結合した複合
体を得、試験１と同様の方法で感作ラテツクス粒子を調
製した（試料１０）。

尚、この感作ラテツクス粒子が非特異的な凝集を起こさ
ない最少量を試験１と同様の方法で求めたとこ８５．ｏ
ｍｙ７ｏ、１ｙラテックス粒子であった。

更に、どのステロイド結合数の多い複合体の一定濃度の
水溶液に免疫学的に不活性なＲ８Ａの一定濃度の水溶液
を加え、ステロイドが結合したＲ８Ａと結合していない
Ｒ８Ａとの合計のＲ８Ａ１分子当りに結合するステロイ
ド数が１〜１０個の４種の混合物を調製した。

そしてこれらの混合物を用いて試験１と同様の方法で感
作ラテツクス粒子を調製した（試料／１６１１〜１４）
。

尚、感作ラテックス粒子が非特異的な凝集を起こさない
該混合物の最少量を試験１と同様の方法で求め（表６参
照）、この最少量を用いて感作ラテツクス粒子の調製を
行なった。

これらの感作ラテツクス粒子と試験１において調製した
試料Ａ６および％９の感作ラテツクス粒子との検出感度
を試験１と同様の方法に従って試験した。

その結果を表６に示す。

表６から本発明の方法により製造した試料／１６６の複
合体感作ラテツクス粒子とＥ３−１６α−Ｇ結合数の多
い試料／１６．１０の感作ラテツクス粒子の検出感度を
比較すると前者の方が後者より約６２．５倍検出感度が
高く、不発−〇方法により製造した複合体感作ラテツク
スの中で検出感度の最も低い試料層９と試料／１６．１
０とを比較しても、前者が後者の約１３倍も検出感度が
高く、本発明の方法により製造した感作ラテツクス粒子
の検出感度は、従来のＥ３−１６α−Ｇ結合数の多い複
合体を使用して調製した感作ラテツクス粒子より高いこ
とが明らかである。

さらに試料ＡＩＯを免疫学的に不活性なＲ８Ａと混合し
て総Ｒ８Ａ１分子当りのＥ３−１６α−Ｇ数を減少せし
めた混合物で調製した感作ラテツクス粒子では、試料層
４３において、検出感度が最大であったが、この検出感
度は試料／１６６の約１／１２、試料／１６９の約２１
５と低く、従来のＥ３−１６α−Ｇ結合数の多い複合体
を卑疫学的に不活性なＲ８Ａと混合して、総Ｒ８Ａ分子
１モル当りのＥ３−１６α−Ｇ数を減じても、本発明に
より製造した複合体感作ラテツクス粒子の検出感度より
劣っていることが明らかである。

以上のことから、本発明により製造した複合体感体ラテ
ックス粒子を使用することにより、人の体液または排泄
液中に存在するステロイドの含有量が低〈従来の感作ラ
テツクス粒子では検出できない場合にも、ステロイドの
検出が可能となり、またステロイド含量の高い試料に対
しては、十分に希釈を行なうことにより、試料中に存在
する他の物質の影響を除くことができるため信頼性の高
い分析結果が得られ、より正確な診断資料を提供するこ
とが出来る。

さらに本発明の方法によれば、検出感度の高い複合体感
作ラテツクス粒子が得られるので、少ない抗体量で測定
することが出来、従来に比べて同量の抗体で多くの測定
用試料を調製することが出来、製造経費の上からも大き
な利点となる。

実施例 Ｉ Ｅ３−１６α−Ｇ（シグマ社製）５０〜をジメチルホル
ムアミド（相光紬薬社製）１０ｒＩｌｌに溶解し、これ
にトリーｎ−ブチルアミン（東京化成社製）２６μｌを
加え、次いでインブチルクロロホルメート（アルドリッ
チ・ケミカル社製）１４μｌを加えて攪拌し混合液Ａを
調製した。

一方、脱イオン水６０−に１規定ＮａＯＨ１，０ｒｕｌ
を添加した溶液にＲ８Ａ（ＩＣＮファーマシューテイカ
ルズ社製）２．３３ｆを溶解し、さらにジメチルホルム
アミド５０ｒＩＬｌを加えた混合液Ｂを調製した。

この混合液Ｂに先に調製した混合液Ａを滴下し、県時間
半攪拌し、のち１規定ＮａＯＨ１，ＯｗＬｌを加えてさ
らに３時間半攪拌を行ないＢ３−１６α−Ｇ−Ｒ８Ａ複
合体を合成した。

次いでこの反応液を脱イオン水に対して透析し、反応液
１容に対しアセトン２容を添加し、均一に混合し、１規
定ＨＣＩを加えて該複合体を析出させ１００００ｒ、ｐ
ｏｍ。

で５分間遠心した。

分離した沈澱物を脱イオン水に溶解し、脱イオン水に対
して透析してアセトンを除去し複合体約１．７８ｆ（収
率約７５％）を得た。

以上の操作はすべて低温下（６℃）において行なった。

本複合体のＲ８Ａｌ分子当りに結合しているＢ３−１６
α−Ｇ数を前記ジニトロフェニル化法および紫外部吸収
法で測定した結果それぞれ２．２および１．９であった
。

次いでこの複合体７６〜を４０ｍＭペロナール緩衝液（
１５０ｍＭＮａｃｌ を含有、ｐＨ７，８）４００ｍ
ｌに溶解し、これに１０％濃度の粒子径０、２３．４μ
のポリスチレンラテックス粒子（ダウケミカル社製）を
１０１Ｌｌ添加し、３７℃で２時間保持して感作を行ん
った。

その後感作ラテツクス粒子懸濁液を４００Ｏｒ、ｐｏｍ
、、２０分間遠ｔｖシ、得られた沈殿物を上記緩衝液２
００ｍ１に懸濁して同条件で遠心しこの操作を２回行な
い得られた沈殿物を５０−の上記緩衝液に懸濁し最終濃
度が０．１％になるように窒化ソーダを加えて調製し、
約２％濃度のＢ２−１６α−Ｇ−Ｒ８Ａ感作ラテックス
粒子懸濁液約５０ｍ１を得た。

このようにして得た感作ラテツクス粒子懸濁液０、１
ｍｌと試験１と同様の方法で得たＢ３−１６α−Ｇ−Ｂ
ＳＡ抗体を０．０４ ｎｍｏｌｅ Ｂ３−１６ ａ 。

−Ｇ等量／膨の力価に希釈した抗体０．１ ｒｒｔｌと
をスライドグラス板上で混合したとき、１〜２分間で凝
集が観察され、０．０２ ｎｍｏｌｅ Ｂ３−１６ａ
−Ｇ等量／ｍｌの力価に希釈した抗体０．１ ｍｌと混
合しても５分後に凝集が観察されずこの感作ラテツク７
ス粒子の検出感度は０．０４ ｎｍｏｌｅ Ｂ３−１６
ａ−Ｇ等量／ｍｌであった。

実施例 ２ 試験２と同様の方法で得たＤＨＥＡ−ＣＭＯｏ、５１を
ジメチルホルムアミド（和光紬薬社製）１００ｍｌに溶
解し、これにトリーｎ−ブチルアミン（東京化成社製）
０．３３１１１１を加え、次いでインブチルクロロホル
メート（アルドリッチ・ケミカル社製）０．１８ｍＡ！
を加えて攪拌し、混合液Ａを調製した。

一方、脱イオン水６０．ｏ＠１ＫＢＳＡ（シグマ社製）
１８．ｏｆを溶解し、１規定ＮａＯＨでｐＨを９．０に
調整しさらにジメチルホルムアミド５００） ｍｌを加
えて混合液Ｂを調製した。

この混合液Ｂに先に調製した混合液Ａを滴下し、１時間
半攪拌し、のち１規定ＮａＯＨを加えてｐＨを９．０に
調製し、さらに３時間半攪拌を行ないＤＨＥＡ−ＣＭＯ
−ＢＳＡ複合体を合成した。

次いでこの反応液を流水に対して透析し、反応液１容に
対し、アセトン２容を添加し、均一に混合し、■規定Ｈ
ＣＩを加えて、複合体を析出させ５０００ ｒ、ｐ、ｍ
、で２゜分遠心した。

分離した沈殿物を脱イオン水に溶解し、流水に対して透
析してアセトンを除去し複合１体約１３．０ｆｆ（収率
約７０％）を得た。

この複合体のＢ５Ａｌ分子当りに結合しているＤＨＥＡ
数を前記ジニトロフェニル化法で測定した結果、４．１
であった。

次いでこの複合体６８〜を１００ｍＭグリシン緩衝液（
１３０ｍＭＮａｃｌおよび０．１％窒窒化ソータ金含有
ｐＨ８，２） １００ｍｌに溶解し、これに１０％濃度
の粒子径０．２３４μのポリスチレンラテックス粒子（
ダウケミカル社製）１０１ｒＬｌを添加し、室温で５日
間該緩衝液に対して透析して感作を行なった。

その後感作ラテツクス粒子懸濁液を４０００ｒ、ｐｏｍ
、２０分間遠心し、得られた沈殿物を該緩衝液２ｏｏ１
１１１に懸濁し、同条件で遠心して洗浄をさらに２回行
ない最終的に沈殿物を５０ｍ１の該緩衝液に懸濁し、約
２％濃度のＤＨＥＡ、−ＣＭＯ−ＢＳＡ感作ラテックス
粒子懸濁液約５０ＷＬｌを得た。

０．１ ｎ ｍｏｌｅ／ ｍ１ＤＨＥＡ０．０５ｍ１と
試験２と同様の方法により調製し、該緩衝液で０．１
ｎｍｏｌｅＤＨＥＡ等量／ｍｌの力価に希釈した抗体０
．０５ｍ１とを混合し、スライドグラス板上にとり、本
感作ラテツクス粒子懸濁液０．１ ｍｌをスライドグラ
ス板上で混合しても１０分後でも、凝集は観察されず、
０．０２ｎｍｏｌｅ ／ｍｌ Ｄ ＨＥ Ａ ０．０５
ｍｌと上記抗体０．０５ｍ１とを混合しスライドグラ
ス板上にとり本感作ラテツクス粒子懸濁液０．１ ｍｌ
とスライドグラス板上で混合すると２〜３分間で凝集が
観察された。

試験ｌと同様の方法で測定した結果、検出感度は０．０
５ ｎ ｍｏｌｅＤＨＥＡ等量／ｍ７！であった。

実施例 ３ ソジウム・テトラステロン−１７−グルクロナイド（シ
グマ社製）１．１ｆをジメチルホルムアミド（和光紬薬
社製）２００１ｒｌｌに溶解し、これにトリーｎ−ブチ
ルアミン（東京化成社製）０．５２１ｒＬｌを加え、次
いでインブチルクロロホルメート（アルドリッチ・ケミ
カル社製）０．２５ｍ１を加えて攪拌し、混合液Ａを調
製した。

一方、脱イオン水１．２７ＫＲ８Ａ（シグマ社製）４６
．６Ｓ’を溶解して１規定ＮａＯＨでｐＨを９．０に調
整し、さらにジメチルホルムアミド１．０ 、ｌを加え
た混合液Ｂを調・製した。

以下実施例２と同様に行ないテストステロン−１７−グ
ルクロナイド−Ｒ８Ａ（以下Ｔ−１７−Ｇ−Ｒ８Ａと略
記する）約３９．Ｏｆ（収率約８２％）を得た。

この複合体のＲ８Ａ１分子当りに結合しているＴ−１７
−Ｇの数をジニトロフェニル化法および紫外部吸収法で
測定した結果それぞれ２．３および２．１であった。

１０％濃度の粒子径の０．７２１μのポリスチレンラテ
ックス粒子（ダウケミカル社製）１００ＷＬｌに１５
ｍＭＮａｃ ｌ を含む２０ ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，２） ４００ｍｌを加えて４０００ｒ、ｐ、ｍ。

２０分間遠心して得られた沈殿物を５００ｍ１の該緩衝
液に懸濁し、同条件で遠心して沈殿物を得た。

この沈殿物に１８０１ｎ９の複合体を含有する５００ｍ
１の該緩衝液を加えて懸濁し、３７℃で２時間保持し、
のち同条件で遠心して洗浄し、さらに２回行ない、得ら
れた沈殿物を５００ｍ１の該緩衝液に懸濁し、最終濃度
が０．１％になるように窒化ソーダを加えて約２％濃度
のＴ−１７−Ｇ−Ｒ８Ａ感作ラテックス粒子懸濁液５０
０ｍ１を得た。

試験１と同様の方法で調製し、該緩衝液で □０．０５
ｎｍｏｌｅ Ｔ−１７−Ｇ等量／ｍ＃）力価に希釈し
て、抗体０．１ ｍｌと前記感作ラテツクス粒子懸濁液
ｏ、 １ｍｌとをスライドグラフ板上で混合すると１〜
２分間で凝集が観察され、０．０２ ｎｍｏｌｅ Ｔ−
１７−Ｇ等量／ｒｒＬｌの力価に希釈した抗体０．１
ｍｌと混合しても５分間で凝集が観察されず本感作ラテ
ツクス粒子の検出感度は０．０５ ｎｍｏｌｅ Ｔ −
１７−Ｇ等量／ｍｌであった。

実施例 ４ ソジウム・ハイドロコーチシン−２１−ヘミサクシネー
ト（シグマ社製）０．５ｙをジメチルホルムアミド（和
光紬薬社製）１００ｍに溶解し、これにトリーｎ−ブチ
ルアミン（東京化成社製）０．２６ｗＬｌを加え、次い
でイソブチルクロロホルメート（アルドリッチ・ケミカ
ル社製）０．１４７ｄを加えて攪拌し、混合液Ａを調製
した。

一方、脱イオン水６００ｍＡ’ＫＨ８Ａ（マイルズラボ
ラトリー社製）１７．６ｆを溶解し、１規定ＮａＯＨで
ｐＨを９．０に調製し、さらにジメチルホルムアミド５
００ｍＡ！を加えて混合液Ｂを調製した。

以下実施例２と同様の方法によりハイドロコーチシン−
２１−ヘミサクシネート−Ｈ８Ａ（以下ＨＣ−２１−Ｈ
８−Ｈ８Ａと略記する）約１３．６ＳＦ（収率約７５％
）を得た。

この複合体のＨ８Ａｌ分子当りに結合しているＨＣ−２
１−Ｈ８数をジニトロフェニル化法で測定した結果３．
０であった。

１０％濃度の粒子径０．７２１のポリスチレンラテック
ス粒子（ダウケミカル社製）５０ｒｒＬｌに１５０ ｍ
Ｍ ＮａＣ１を含む４０７７１Ｍペロナール緩衝液（
ｐＨ７，８）２００ｍ７を加えて４０００ｒ、ｐｏｍ、
で２０分間遠心し、得られた沈殿物を２５０ｍ７の該緩
衝液に懸濁し、同条件で遠心して沈殿物を得た。

この沈殿物に８ＳＦ１ｇの複合体を含有する２５０ｒｒ
Ｌｌの該緩衝液を加えて懸濁し、３７℃で２時間保持し
、のち同条件で遠心して洗浄をし、さらに２回行ない、
得られた沈殿物を２５０ｍ１の該緩衝液に懸濁し、最終
濃度が０．１％になるように窒化ソーダを加えて約２％
濃度のＨＣ−２１−Ｈ８−Ｈ８Ａ感作ラテックス粒子懸
濁液２５０ｍ／を得た。

０、１ ｎ ｍｏｌｅハイドロコーチシン０．０５＋７
２１と、試験１と同様の方法で調製し、該緩衝液で０．
１ｈ ｍｏｌｅ ＨＣ−２１−Ｈ３等量／ｒｕｌの力価
に希釈した抗体０．０５ ＴＩＬｌとを混合し、スライ
ドグラス板上にとり、本感作ラテツクス粒子懸濁液０．
１ｒＩＬｌとスライドグラス板上で混合しても１０分後
でも凝集は観察されなかったが、０．０５ ｎ ｍｏｌ
ｅ ７ｍｌハイドロコーチシン０．０５ｒ／Ｌｌと上記
抗体０．０５７１１とを混合し、スライドグラス板上に
とり、前記感作ラテックス粒子懸濁液０．１ ｍｌとス
ライドグラス板上で混合すると２〜３分間で凝集が観察
され、この感作ラテツクス粒子の検出感度は０．０５ｎ
ｍｏｌｅ ＨＣ−２１−Ｈ８等量／ｍｌであった。

実施例 ５ 実施例１と同様の方法で調製したニス） ＩＪオール−
１６α−グルクロナイド−Ｒ８Ａ複合体４９〜を、１０
０ ｍＭグリシン緩衝液（１３０ｍＭＮａＣ１及び０．
１％窒素ソーダを含む。

ｐＨ８，２）５０Ｗｌｌに溶解し、この溶液に、スチレ
ン−ブタジェン共重合ラテックス粒子（粒径０．３６４
μｍ０ダウケミ力ル社製）を２％の濃度で前記緩衝液に
懸濁した液５０ｍＡ’を加え、４５℃で１時間保持して
感作した。

その後この溶液を４０００ ｒ、ｐｏｍ。で２０分間遠
心し、得られた沈殿を５０ｍの前記緩衝液に懸濁し、エ
ストリオール１６α−グルクロナイド−Ｒ８Ａ−感作ラ
テツクス粒子の２％懸濁液を得た。

試験ｌと同様の方法により測定したこの感作ラテツクス
の検出感度は、０．０４ｎｍｏｌｅエストリオールー１
６α−グルクロナイド等量／ｍｌであった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 免疫化学的なステロイドの検出に使用するステロイ
   ド−血清アルブミン複合体で感作したラテックス粒子の
   製造法において１．血清アルブミン１分子当り０．５〜
   ７個（ジニトロフェニル化法により測定）の割合で卵胞
   ホルモン、黄体ホルモン、男性ホルモン、副腎皮質ホル
   モンおよびこれらの代謝産物から選ばれる１種のステロ
   イドを化学的に結合せしめてステロイド−血清アルブミ
   ン複合体を調製し、該複合体をそのままラテックス粒子
   に感作することを特徴とする免疫化学的に高感度でステ
   ロイドを検出し得るステロイド−血清アルブミン複合体
   感作ラテックス粒子の製造法。