DE2827250A1 - Latexreagenz aus einem mit steroid- serumalbumin-konjugat sensibilisierten polymerlatex und verfahren zur herstellung dieses latexreagenz - Google Patents
Latexreagenz aus einem mit steroid- serumalbumin-konjugat sensibilisierten polymerlatex und verfahren zur herstellung dieses latexreagenzInfo
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Description
Es ist "bekannt, daß die Menge an Steroidhormonen und/oder
deren Metaboliten, die in menschlicher Körperflüssigkeit oder flüssigenAuSScheidungen Torliegt, in Zusammenhang mit dem
physiologischen und pathologischen Zustand des Menschen steht. Tie quantitative Analyse von Steroidhormonen und/oder deren
Metaboliten ist daher ein geeignetes Mittel für die Diagnose
und klinische Untersuchung.
Die Menge der in menschlichen Körperflüssigkeiten oder flüssigen Ausscheidungen vorhandenen Steroidhormone und Metaboliten von
Steroidhormonen ist jedoch im allgemeinen gering und die Veränderung der Menge der Steroidhormone und deren Metaboliten
aufgrund eines spezifischen physiologischen oder pathologischen Zustands ist' ebenfalls gering.
Infolgedessen erfordert die- quantitative Analyse von Steroidhormonen
und/oder deren Metaboliten außerordentlich hohe Genauigkeit»
Die jüngeren Entwicklungen von analytischen Vorrichtungen ermöglichen
es, eine außerordentlich genaue quantitative Analyse durchzuführen. Derartige Vorrichtungen und Instrumente sind
hoch entwickelt und die Einrichtung und Wartung dieser
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Instrumente ist im allgemeinen mit hohen Kosten verbunden. Außerdem
ist die Handhabung dieser Instrumente oder Vorrichtungen für nicht geübte Personen nicht leicht und häufig ist eine
mühsame und zeitraubende Vorbehandlung der zu analysierenden Proben erforderlich.
Is ist daher wesentlich, eine Methode zur Verfugung zu stellen,
welche den genauen und raschen quantitativen Nachweis von
Steroidhormonen und/oder deren Metaboliten ermöglicht, ohne daß eine spezielle Ausbildung und spezielle Instrumente erforderlich
sind.
Es ist bekannt, daß der quantitative Fachweis von Steroiden mit
Hilfe einer immunologischen Methode durchgeführt werden kann. Bei einer der typischen immunologischen Methoden werden die
Spezüxtät der Antigen-Antikörper-Reaktion und das sichtbare
Auftreten der Agglutinationsreaktion und der Agglutinations-Inhibierungs-Reaktion
ausgenutzt. So wird bei den typischen bekannten Verfahren im einzelnen die nachzuweisende Steroidart
an Protein gebunden, wobei ein Steroid-Protein-Konjugat gebildet
wird, dann wird ein Reagenz hergestellt,' welches mit diesem Konjugat sensibilisierte latexteilchen enthält, und
durch Injektion des Konjugats in ein Säugetier wird Anti3erum
hergestellt. Das so erhaltene Antiserum kann mit dem nachzuweisenden
Steroid reagieren und kann darüber hinaus mit dem Reagens reagieren. ¥enn daher eine bestimmte Menge einer Testprobe
aus menschlicher Körperflüssigkeit oder einer flüssigen Ausscheidung entnommen und mit einer bestimmten Menge dieses
Antiserums vermischt wird, so tritt eine Reaktion auf. Dann wird eine bestimmte Menge des Reagenz zu dem flüssigen Gemisch
aus der Testprobe und dem Antiserum gegeben. Wenn in diesem flüssigen Gemisch aus der Testprobe und dem Antiserum ein
Überschuß an Antiserum verblieben ist, tritt eine Antigen-Antikörper-Reaktion
zwischen dem verbliebenen Antiserum und
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dem Reagenz ein, die als Agglutinationsreaktion beobachtet
werden kanu. Wenn das Anti3erum mit dem in der Testprobe enthaltenen
Steroid gerade neutralisiert worden ist oder wenn eine überschüssige Menge an Steroid in dem flüssigen Gemisch verblieben
ist, tritt keine Antigen-Antikörper-Reaktion ein und dies kann als Agglutinations-Inhibierungs-Reaktion beobachtet
werden. Wenn daher eine Yerdünnungsserie der !Testproben mit
dem Antiserum, welches auf einen vorbestimmten liter eingestellt worden ist, und dem Reagenz geprüft wird, kann die
quantitative Bestimmung von Steroiden und/oder deren Metaboliten durchgeführt werden.
Ein solches bekanntes Verfahren wird in der offengelegten japanischen Patentanmeldung ITr. 51-112513 (Anmeldetag 25.3.1975,
Anmelder: Asahi Kasei Eogyo Kabushiki Kaisha, Offenlegungstag
5.Okt.1976) beschrieben. In dieser Veröffentlichung wird ein
Vergoren zur quantitativen immunologischen Bestimmung von
Dehydiroepiandrosteronsulfat (eines Zwischenprodukts der Biosynthese
eines G-esehlechtshormons) beschrieben; dieses bekannte
Verfahren enthält jedoch keine über den vorstehend beschriebenen
typischen Stand der Technik hinausgehende Merkmale. Wenn auch diese bekannten Verfahren wertvolle diagnostische
ITaehweismethoden darstellen, ist es doch hocherwünscht, die
Empfindlichkeit dieser immunologischen quantitativen Bestimmung zu erhöhen, um kleinere Änderungen der Steroidmenge nachweisen
zu können und um bei der üblichen Anwendung" zu einer erhöhten Genauigkeit des Nachweises zu führen.
Die menschliche Körperflüssigkeit oder flüssige Ausscheidungen enthalten jedoch gewöhnlich außer Steroiden zahlreiche andere
Arten von Verbindungen und die Hengenanteile dieser Verbindungen sind gewöhnlich weit höher als der Steroidgehalt. Einige
dieser Verbindungen, beispielsweise Proteine und Saccharide, beeinträchtigen die immunologische Bestimmung und es ist
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erforderlich, sie zu entfernen oder die au prüfende Körperflüssigkeit
oder flüssige Ausscheidung in einem solchen Ausmaß zu verdünnen, daß keine Störung verursacht wird. Die Entfernung
dieser störenden Verbindungen erfordert ein kompliziertes Verfahren und hei der klinischen Untersuchung, die Einfachheit
und rasche Durchführung erfordert, ist man gezwungen, die zu prüfende flüssigkeit zu verdünnen. Es wird daher erforderlich,
die Empfindlichkeit dieses immunologischen Uachwei3es zu erhöhen.
Auf die Einstellung der Empfindlichkeit "bezieht sich die offengelegte
japanische Patentanmeldung JIr. 50-123819 (Anmeldetag 14.März 1974» Anmelder: Seikoku Zoki Se.iyaku Kabushiki Kaisha,
Offenlegungstag 29.Sept. 1975).
In dieser zweiten Veröffentlichung zum Stand der Technik wird ein Terfahren zum immunologischen nachweis von Steroiden besehrieben,
die in menschlichen Körperflüssigkeiten oder flüssigen Ausscheidungen vorliegen. Bei diesem Verfahren wird ein
Antikörper, der aus einem Säugetier erhalten wird, welches mit einem Konjugat aus einem Steroid mit einem Antigen-Protein mit
freier Aminogruppe immunisiert ist, und sensiDillsierte Träger
oder Vehikel, welche mit dem Sterold^proteitt-XoA^Etgat*
mit einem von dem Antigen-Protein verschiedenen Protein sensibilisiertsimS» verwendet. Bei diesem zweiten bekannten
Verfahren kann die Einstellung der Empfindlichkeit durch Variieren der Menge des Steroid-Protein-Konjugats zur Sensibilisierung
der Latexteilchen in dem Reagenz und durch Variieren der Konzentration des Antiserums erreicht werden. Wenn auch die
in dieser zweiten Veröffentlichung gegebenen Erläuterungen nicht notwendigerweise klar sind, selbst wenn sie andeuten
können, daß eine geringere Menge des überschüssigen Antiserums sensibilisierte latexteilchen agglutinieren kann, wenn dieee
Latexteilchen mit einer geringeren Menge des Steroid-Protein-
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Konjugats sensibilisiert sind, kann dock dieser Versuch aus den
nachstehend beschriebenen Gründen zu keiner bedeutenden Verbesserung
der Empfindlichkeit führen. Ursprünglich haben Latexteilchen die Neigung, nicht spezifische Agglutination zu zeigen,
wenn ihnen kein geeigneter Stabilisator zugesetzt wird, und diese nicht spezifische Agglutination kann von einer spezifischen
Agglutination aufgrund einer Antigen-Antikörper-Reaktion
nicht unterschieden werden. Das zur Sensibilisierung von Latexteilchen verwendete Steroid-Protein-Konjugat kann als Stabilisierungsmittel
zur geeigneten Ausschaltung dieser nicht spezifischen Agglutination der Latexteilchen wirken. Die Einstellung
der Empfindlichkeit gemäß der zweiten Veröffentlichung ist daher in gewissem Maß begrenzt, wenn die nicht spezifische Agglutination
ausgeschaltet werden muß, und es kann daher nicht möglich sein, die Empfindlichkeit über diese Grenze hinaus zu erhöhen.
Ein '-"ersuch zur Überwindung dieser Begrenzungen besteht wahrscheinlich
in der Anwendung der Methode, die in der ausgelegten japanischen Patentanmeldung Ur. 49-11407 beschrieben wird
(Anmeldetag 29.Dez. 1970, Anmelder: Teikoku.Zoki Seiyaku
Kabusbiki Eaisha, Yeröffentlichungstag 16.Märζ 1974) und die
in der offengelegten japanischen Patentanmeldung 35Tr. 50-82230 . ·
(Anmeldetag 29.ϊΓον. 1973, Anmelder: Teikoku Zoki Seiyaku
Eabushiki Kaisha, Offenlegungstag 3.JuIi 1975) beschrieben ist.
In dieser dritten und vierten Yorveröffentlichung wird'angegeben, daß Latexteilchen stabilisiert werden können, indem man
diese latexteilchen immunologisch inertes Protein adsorbieren läßt, bevor oder nachdem die Latexteilchen mit Steroid-Protein-Konjjugat
oder Antikörper sensibilisiert werden beziehungsweise" sensibilisiert worden sind. Durch Kombination der vorstehend
beschriebenen zweiten Yorveröffentlichung und der dritten oder vierten Vorveröffentlichung scheint eine Möglichkeit zum Erzielen
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senaibilisierter latexteilchen mit erhöhter Empfindlichkeit zu
bestehen, wenn die Latexteilchen mit einer kleineren Menge an Steroid-Protein-Konjugat senaibiliaiert sind und mit einem
immunologisch inerten Protein atabiliaiert aind. Es -wurde jedoch
gefunden, daß diese Stabilisierung von Latexteilchen
durch inertes Protein die Neigung zeigt, die immunologisch spezifische Agglutination zu "beeinträchtigen.
In der offengelegten japanischen Patentanmeldung Kr. 48-49918 (Anmeldetag 26.Okt. 1972, Anmelder: American Cyanamid Gompany,
Offenlegungatag 14.JuIi 1973) wird eine Methode zur Herstellung
eines Antikörpers offenbart, der ausgezeichnete Spezifität gegen Progesteron hat und ea werden die Anwendbarkeit des Antikörpers
für den Radio-immun-assay und den Agglutinationstest
zur· Bestimmung der Konzentration von Progesteron in !Testproben
angegeben. Diese fünfte Veröffentlichung bezieht sich jedoch allgemein nicht auf die Verbesserung der Empfindlichkeit des
Nachweises von verschiedenen Steroidarten.
!Darüber hinaus wird in dieser fünften Veröffentlichung offensichtlich
festgestellt, daß das Steroid (Hydroxyproge3teron)-Protein-Eonjugat
15 bis 40 Moleküle des Steroids pro ein Molekül Protein enthält und dieses Konjugat wird nicht nur zur
Herstellung des Antikörpers, sondern auch zur Sensibilisierung von Latexteilchen angewendet. Auch in der zweiten vorstehend
erwähnten Veröffentlichung (JA-OS 50-123819) wird angegeben, daß Östriol-löoc-glucuronid-Eaninchenserumalbumin-lConjugat zur
Sensibilisierung von Xatexteilchen verwendet und das Bindungsverhältnis von Steroidglucuronid zu Protein liegt im Bereich
von 27 bis 30 Mol pro ein Mol des verwendeten Proteins.
Wie aus der vorstehenden Beschreibung .des Standes der Technik
ersichtlich ist, wurden bisher zur Sensibilisierung von latex-
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teilchen Steroid-Protein-Konjugate verwendet, in denen eine
relativ große Anzahl an Steroidmolekülen an ein Proteinmolekül gebunden ist (nachstehend wird die Anzahl der Steroidmoleküle,
die an ein Proteinmolekül gebunden sind, einfach als Steroid-Bindungszahl
bezeichnet).
Es ist ersichtlich, daß eine weitere Verbesserung der Empfindlichkeit
mit Hilfe der üblichen Methoden nicht zu erwarten ist.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die Empfindlichkeit
der genannten Uachweisinethoden für Steroide zu verbessern.
Erfindungsgemäß soll eine derartige Erhöhung der Empfindlichkeit durch eine geeignete "Verbesserung des Konjugats erreicht
werden.
Dabei wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß dann, wenn ein
Steroid-Serumalbumin-Konjugat in der ¥eise hergestellt wird,
daß die Steroid-Sindungszahl einen Wert innerhalb des Bereiches
von 0,5 bis 7,0 hat, und danach Latexteilchen mit diesem
Konjugat sensibilisiert werden, die so erhaltenen sensibilisierten
latexteilchen extrem hohe Empfindlichkeit besitzen,
und daß diese Verfahrensweise unabhängig von der Art des Steroids und des zu verwendenden Serumalbumins angewendet werden
kann. Soweit der Anmelderin bekannt ist, wurde bisher kein Hinweis auf eine Verminderung der Steroid-Bindungs zahl zur Err
höhung der Empfindlichkeit des Steroid-Hachweises gegeben.
Hauptgegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung
eines Latexpolymeren, das mit einem Steroid-Serumalbumin-Konjugat
sensibilisiert ist und erhöhte Empfindlichkeit für den Steroid-Nachweis zeigt, In welchem das zur Herstellung
des Konjugats eingesetztes Steroid an das Serumalbumin
in einem Verhältnis von 0,5 bis 7 Mol pro 1 Mol Serumalbumin
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gebunden ist.
Ferner ist es Gegenstand der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung
eines Latexreagenz zu schaffen, welches den nachweis
von Steroiden mit hoher Empfindlichkeit ermöglicht, trotz der Tatsache, daß die Latexteilchen nur mit Steroid-Serumalbumin--Konjugat
sensiMlisiert sind, ohne daß eine Stabilisation der
Latexteilchen mit immunologisch.inertem Protein erfolgt ist.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Polymerlatex, der mit Steroid-Serumalbumin-Konjugat
sen3iDilisiert ist und den Nachweis von Steroid mit
erhöhter Empfindlichkeit ermöglicht, wobei als Polymerlatex Latex von Styrol-Polymerem, Butadien-Polymerem oder Styrol-Butadien-Copolymerem
vorliegt.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist außerdem die Schaffung einer Methode zur Herstellung von mit Steroid-Serumalbumin-Konjugat
sensibilisiertem Polymerlatex mit erhöhter NachweisempfincPlchkeit
für Steroide, worin das Steroid zur Herstellung des Konjugats das nachzuweisende Steroid, ein Metabolit dieses
Steroids oder ein synthetisches Steroid mit ähnlicher Struktur sein kann und in welchem das zur Eonjugafbildung verwendete
SerumaXbumin aus der Gruppe Rinderserumalbumin, PferdeserumaTbumin,
Schafserumalbumin, Kaninchenserumalbumin.und mensch- ·
liches Serumalbumin ausgewählt ist.
Ein weiterer wesentlicher Gegenstand der Erfindung besteht
darin, ein Latexreagenz mit hoher Empfindlichkeit für den Steroid-Üachweis zu schaffen, in welchem die Latexteilchen
mit einem Steroid-Serumalbumin-Konjugat sensibilisiert sind,
das relativ kleine Steroid-Bindungszahl aufweist.
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Die erfindungsgemäßen Latexreagenzien zeigen sehr hohe Empfindlichkeit,
die etwa 0,2 bis 0,04 η Mol Steroid-Äquivalent/ml beträgt.
Die vorstehenden Gegenstände und Merkmale der Erfindung gehen aus der nachstehenden ausführlicheren Beschreibung hervor.
Zunächst werden allgemeine und grundlegende Merkmale der Erfindung
erläutert, wonach Einzelheiten diskutiert werden sollen.
Steroid
Allgemein können erfindungsgemäß die nachstehend erläuterten Steroide angewendet werden:
Pollikelhormon (Östrogen), Corpus luteum-Hormon (Progesteron),
männliche G-eschlechtshormone (zum Beispiel:
1'7-Ketosteroide),
Adrenocortitropes Hormon (beispielsweise
IT-Hydroxycorticosteroid) und
zahlreiche Steroide, welche als Metaboliten der vorstehend erwähnten Steroidhormone auftreten.
Wenn diese Steroide zur Ausbildung des Kbnjugats mit Serumalbumin verwendet werden, so liegen sie vorzugsweise in dem
Zustand vor, wie sie. in menschlicher Körperflüssigkeit oder flüssigen Ausscheidungen vorkommen, beispielsweise in Form des
Steroid-Glucuronid-Konjugats oder eines Steroid-Sulfat-Konjugats,
Es kann jedoch jede Art eines natürlichen oder synthetischen Steroids verwendet werden, sofern diesesausreichende immunologische
Kreuzreaktivität mit irgendeinem der spezifischen Steroidhormone oder deren Metaboliten, die in menschlicher'
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Körperflüssigkeit oder flüssigen Ausscheidungen nachgewiesen
v/erden sollen, aufweist und sofern es eine funktioneile Gruppe
■besitzt, mit der es an Serumalbumin chemisch gebunden werden
kann. So kann beispielsweise als synthetisches Steroid ein Steroid-hemisuccinat oder ein Steroid-(o-carbo:iymebhyl)-o3:im
eingesetzt werden.
]?ür die Zwecke der Erfindung kann jedes gereinigte Serumalbumin
■verwendet werden, insbesondere die handelsüblichen Serumalbuiaine,
beispielsweise
Rinderserumalbumin (ESA)
Pferde s erumalbumin (3SA)
Schaf3erumalbumin (SSA)
Kaninchenserumalbumin (USA)
menschliches Serumalbumin (HSA)
Die vorstehend zur Bezeichnung der verschiedenen Serumalbumine
in Klammern angegebenen Abkürzungen sollen nachstehend aus
Gründen der Vereinfachung verwendet werden.
Unter diesen Serum-Albuminen werden besonders BSA oder RSA
bevorzugt.
Folgende Latexteilchen sind handelsüblich und können vorteilhaft für die Zwecke der Erfindung angewendet werden:
Polys tyrolla tec-Tr» i lohon
Polybu tad ionlabe x-T'; 5.1 ch?*yi
Polybu tad ionlabe x-T'; 5.1 ch?*yi
Teilchen von Sfcyrol-Butadien-Copolymerlate.r
Ea iub wich big, daß die Latexteilchen Iceine reaktiven liebte
enthalten und daß üia im chemischen und im immunolofischen Sinn
inert sind. Besonders bevoraugt unter diesen latexteilchen
v/erden Polystyrollatex-Teilchen.
Die Korngröße dieser latexteilchen kann im Bereich von 0,05 u
bis 1,0 u und vorsusjsweise 0,2 u "bis 0,8 u liegen.
Die nachstehend "beschriebene i-Iethode ist bekannt und kann in
geeigneter I/eise für die Zwecke der Erfindung uur Herstellung
von S^eroid-SerußalDumin-Konjugat eingesetzt v/erden, welches
~ :r Ser:3iJili3ierung von Latexteilchen und sm? Hers te llung von
_.--i3ezrun oder Antikörpern verv/endet ^'/i
Carh odiimid-Methode
(Gross et al: Immunochemistry, YoI.5, S.55, 1968)
Säurechlorid-Methode
(Srlanger et al: Journal of Biological Chemistry,
Vol. 228, S. 713, 1957)
gemischte Säureanhydrid-Methode (dito), und Isocyanat-Methode
(Goodfriend et al: Canadian Journal of Biochemistry and Physiology, Vol. 36, S.1177, 1958)
Ein Beispiel für die Herstellung eines Steroid-Serumalbuinin-Konjugats
mit Hilfe der gemischten Säureanhydrid-rlethode wird
nachstehend geneigt.
"Ίΰ\η Hol .it-'iroi'l-^lucuronLd, iJteroid-herninn ■<■:Ln ifc oder ;5π??γοι:3.«
(ο-" jcboxyue t'h/ !) -orl..i pro --in "öl d-?H ;u -v.i^iul >
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2327250
albumins -wurden in Dimethylformamid gelöst. Zu dieser Lösung
"wurde die gleiche Molzahl, wie die des Steroids, an Tri-n-"butylamin
als Hilfsaktivator zugesetzt und eingerührt. Dann
wurde die gleiche Molzahl Isobutylchlorformiat, wie die des Steroids al3 weiterer Aktivator au der so erhaltenen I'Iisch-Iö3ung
gegeben und eingerührt. Die so erhaltene Hischlösung wurde als Flüssigkeit A bezeichnet.
Andererseits wurde Serumalbumin ϊώ entionisiertem Wasser gelöst,
der pH-Wert der Lösung mit η ITaOH auf pH 8,0 bis 10,0 eingestellt
und Dimethylformamid zugesetzt. Die so erhaltene Lösung wurde als Flüssigkeit B bezeichnet. Der Anteil an Dimethylformamid
in der Flüssigkeit B wurde so festgelegt, daß die Gesamtmenge an Dimethylformamid in Flüssigkeit A und Flüssigkeit
3 den gleichen Wert hattexvis die des entionisierten Wassers
1:2 Flüssigkeit B.
Dann wurde Flüssigkeit A während eines Zeitraums von eineinhalb
Stunden unter Rühren tropfenweise in die Flüssigkeit B gegeben und nach dem Einstellen des pH-¥erts mit η NaOH auf 8,0 bis
10,0 wurde die Mischflüssigkeit dreieinhalb Stunden gerührt, wobei das Steroid-Serumalbumin-Sonjugat synthetisiert wurde.
Die so erhaltene Mischflüssigkeit wurde gegen Wasser dialysiert und dann wurde Aceton in einem Mengenverhältnis von zwei Teilen
Aceton auf einen Teil der dialysierten Mischflüssigkeit zugesetzt und die Bestandteile wurden homogen vermischt, η HCl
wurde zu der Mischflüssigkeit gegeben, um das Konjugat auszufällen
und das ausgefällte Konjugat wurde durch Zentrifugieren
abgetrennt. Zu dem abgetrennten Niederschlag wurde eine geeignete Menge Wasser zugesetzt und η ITaOH wurde zugefügt, um
den pH-Wert auf 8 einzustellen. Die so erhaltene Lösung wurde einer Dialyse gegen Wasser unterworfen, um Aceton zu entfernen,
wobei das Konjugat erhalten wurde. Das "Verfahren sur Herstellung
des Konjugats erfolgte bei niederer Temperatur (etwa 6 0)
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Die Steroid-3indungszahl in dem Korgugat kann mit Hilfe "bekannter
Methoden "bestimmt werden, "beispielsweise durch Ultraviolettabsorption
oder mit Hilfe der Dinitrophenylierungs-Hethode
(2est l).
Eine Suspension von Latexteiloben wurde durch Waschen und/oder
Verdünnen von Latexteilchen mit einer geeigneten Pufferlösung (pH 7,2 "bis 8,6) hergestellt und das Steroid-Serumalbumin-Konjugat,
welches in einer geeigneten Konsentration hergestellt worden war, wurde zugesetzt und das gesamte Gemisch wurde
2 Stunden lang unter Rühren "bei 37°0 gehalten, um eine Suspension
von sensibilisierten Latexteilehen zu erhalten. Die Suspension wurde zentrifugiert und die Abscheidung wurde abgetrerrnt
und dann mit der Pufferlösung gewaschen. Das Zentrifugieren
und Waschen werden mehrere Male wiederholt und der so erhaltene Niederschlag wurde erneut in der Pufferlösung suspendier",
um eine Suspension von LatexteiIchan auszubilden, die
mit dem Sonjugat sexisibilisiert sind. Die Menge- des zur Sensibilisierung
der Latexteilchen verwendeten Konjugats kann auf einen Bereich begrenzt sein, innerhalb dessen Grenzen folgende
Erfordernisse erfüllt werden.
(1) die schließlich'erhältlichen sensibilisierten Latexteilchen zeigen keine nicht-spezifische
Agglutination aufgrund der speziellen Art der Latexteilchen.
(2) Eine spezifische Agglutination aufgrund der Antigen-Antikörper-Reaktion kann eintreten.
(3) Wenn Antikörper mit einer ausreichenden Menge von Steroid-Hapten neutralisiert werden und
danach die Suspension der sensibilisierten
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Latexteilchen zugesetzt "wird, so kann das gebildete
flüssige Gemisch eine homogene Suspension
bleiben, ohne daß eine Agglutination verursacht wird.
¥ie nachstehend erläutert werden 3oll, wird die Menge des sur
Sensibilisierung der Latexteilchen verwendeten Konjugats (nachstehend
als sensibilisierende Menge bezeichnet) in Abhängigkeit von der Größe der Latexteilchen und der Steroid-Bindungszahl in
dem zu verwendenden Konjugat variiert.
Latexteilchen mit verschiedenen Größen, von 0,234 u und 0,721 u,
wurden jeweils nach dein vorstehend beschriebenen Verfahren mit
einem Konjugat sensibilisiert, in welchem Östriol-16<*~glucuronid
in einem Verhältnis von 2,0 Molekülen pro ein Molekül RSA an
?,3A gebunden war. Die sensibilisierenden Mindestmengen in den
jeweiligen Latexteilchen, die zur Ausschaltung der nicht spezifischen Agglutination erforderlich waren, betrugen 72 mg beziehungsweise
18 mg pro 1 g der Latexteilchen. Im allgemeinen
neigen kleinere Teilchen dazu, daß sie größere sensibilisierende Mengen erfordern.
Latexteilchen einer Teilchengröße von 0,234· u wurden mit ÖstriollooC-glucuronid-Konjugat
mit einer Steroid-Bindungszahl von 15,1 sensibilisiert, wobei unterschiedliche sensibilisierende Mengen
verwendet wurden. Die sensibilisrerende Mindestmenge zur Ausschaltung
der nicht spezifischen Agglutination betrug 54 mg pro 1 g der Latexteilchen. Es ist darauf hinzuweisen, daß die
sen3ibili3ierende Mindestmenge in dem zuletzt beschriebenen Fall relativ klein im Vergleich mit dem vorher beschriebenen
Pail (72 mg/g) war, in welchem Latexteilchen mit dem Kongugat
mit einer Steroid-Bindungszahl von 2,0 sensibilisiert worden waren (Tabelle 1).
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Es ist außerdem darauf hinzuweisen, da3 die Sensioilisierung
von latexüeilchen durch Dialyse, ultrafiltration oder Kombination
irgendeiner dieser Methoden mit der vorstehend beschriebenen Methode durchgeführt werden kann. Darüber hinaus können
sensibilisierte latexteilchen gefriergetrocknet werden.
Antikörper können mit Hilfe üblicher Methoden hergestellt werden. So läßt sich beispielsweise Antiserum oder lassen sich daraus
abgetrennte Antikörper in der Weise herstellen, daß zuerst Steroid-Serumalbumin-Konjugat hergestellt wird, indem Steroid
in der gleichen !Form, wie es in menschlicher Xörperflüssigkeit
oder in flüssigen Abscheidungen vorkommt, oder Steroid mit irrrunologischer Sreuareaktivität mit diesem 1^serumalbumin umge-3e~zt
wird und danach das so erhaltene Konjugat in nicht oraler
?ΟΓ3 einem Säugetier verabreicht wird (sum Beispiel injiziert
wird), welches Fremdserum gegenüber dem Serum besitzt, das zur Herstellung des Konjugats zur Immunisierung des Säugetiers verwendet
wird. Von diesem Säugetier kann dann da3 Antiserum gewonnen
werden. Das so erhaltene Antiserum kann als solches als Antikörper verwendet werden. Natürlich können die Antikörper
auch aus dem Antiserum abgetrennt werden.
Es ist zu erwähnen, daß das nachzuweisende Steroid als Hapten mit den Antikörpern reagieren kann und daß auch das Konjugat
zur Sensibilisierung der Latexteilchen damit reagieren kann.
Zu diesem Zweck wird eine übliche Methode angewendet, mit der Ausnahme, daß das erfindungsgemäß hergestellte Latesreagenz
verwendet wird. Die geeignete ITachweis-Methode umfaßt die
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nachstellend beschriebenen zwei Verfahrensstufen:
(1) Eine festgelegte Menge menschlicher Körperflüssigkeit
oder einer, flüssigen Ausscheidung wird entnommen und entweder unverdünnt oder in geeigneter Verdünnung al3
Testprobe verwendet. Eine festgelegte Menge Antikörper wird zugesetzt und mit der Testprobe vermischt, um eine
Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen dem in der Testprobe vorhandenen Steroid und dem Antikörper hervorzurufen
(Neutralisation des Antikörpers).
(2) Eine 'bestimmte Menge der aus der Testprobe und dem
Antikörper erhaltenen Mischflüssigkeit wird auf einen Glas-Objektträger getropft und eine gegebene Menge des
Latexreagenz wird zugesetzt und mit einem langen schmalen Stab vermischt und die Mischflüssigkeit auf dem Objektträger
wird einige Minuten später beobachtet, um featzrastellen,
ob eine Agglutinationsreaktion aufgetreten ist oder nicht.
Wenn der Antikörper mit dem in der Testprobe enthaltenen Steroid nicht vollständig neutralisiert wird und infolgedessen
ein Überschuß an Antikörper1 in der ersten Verfahrensstufe zurückbleibt,
da.nn wird eine Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen dem Latexreagenz mit dem verbliebenen Antikörper verursacht
und in der zweiten Verfahrensstufe kann eine Agglutination beobachtet
werden.
Wenn der Antikörper mit dem in der Testprobe enthaltenen Steroid vollständig neutralisiert wird (einschließlich dea
Palis, in welchem eine überschüssige Menge an Steroid in der ersten Verfahrensstufe verbleibt), so tritt keine Antigen-Antikörper-Reaktion
ein und es wird keine Agglutination beobachtet, d.h., in der zweiten Verfahrensstufe kann eine Agglutinations-Inhibierungs-Reaktion
beobachtet werden.
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Es ist ersichtlich, daß die Konzentration der Testproben, des
Latexreagenz und des Antikörpers in Abhängigkeit von der angenommenen
oder der Bezugskonzentration an Steroidhormon und/ oder dessen Hetaboliten, die in der Testprobe nachzuweisen
sind, in geeigneter l'ieise eingestellt werden können. Die
Agglutinationsreaktion in der zweiten Verfaarenastufe ist
spätestens innerhalb von 5 Minuten beendet.
Fach Beschreibung der allgemeinen und grundlegenden Gesichtspunkte
für das Latexreagenz, das Verfahren zu seiner Herstellung und das Verfahren zum Nachweis von Steroiden unter Verwendung
des erfindungsgemäßen Latexreagenz wird die 3rfindung nacnstehend ausführlicher unter Bezugnahme auf als Beispiele
dienende Versuche und erfindungsgemäße Beispiele beschrieben.
Yersncb 1
1. Herstellung der Ausgangsmaterialien (1) Herstellung des Konjugats
Unter Verwendung von Östriol-löoc-glucuronid (Sigma Company)
und RSA (INC Pharmaceuticals Company) wurden in der nachstehend beschriebenen Weise neun verschiedene Arten von Konjugaten
hergestellt, die sich in ihrer Steroid.-Bindungszahl unterschieden:
Zehn Milligramm Östriol-löx-glucuronid wurden in 1 ml Dimethylformamid
(Wako Junyaku Kogyo Kabushiki Kaisha) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 5,1 ρίSri-n-butylamin (Tokyo Easei Kogyo
Kabushiki Kaisha) zugesetzt und eingerührt. Dann wurden 2,8 ul
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Isobutylchlorformiat (Aldrich Chemical Company) zugefügt und
eingerührt.
Die gleiche Menge der Flüssigkeit A wurde in 9 verschiedenen
Gefäßen hergestellt.
RSA wurde in den in Tabelle 3 gezeigten Mengenverhältnissen in entionisiertem Wasser gelöst, um RSA-lösungen verschiedener
Konsentrationen herzustellen. Durch Zugabe von η ITaOH zu den
jeweiligen lösungen wurde der pH-Wert auf 8,0 bis 10,0 eingestellt.
Zu diesen Lösungen wurden unterschiedliche Mengen an Dimethylformamid zugesetzt, wobei 9 verschiedene Arten der
Flüssigkeit B mit darin enthaltenen unterschiedlichen Anteilen an RSA hergestellt wurden. Die Menge an Dimethylformamid, die
in jeder der Flüssigkeiten B enthalten war, wurde so eingestellt,
daß die Gesamtmenge des Dimethylformamids in den
Flüssigkeiten A und B gleich der Menge des in Flüssigkeit 3 enthaltenen entionisierten Wassers war.
Jede der Flüssigkeiten A wurde während eines Zeitraums von eineinhalb Stunden unter Rühren tropfenweise zu jedex^ der
Flüssigkeiten B gegeben und durch Zugabe von η HaOH zu den jeweiligen lösungen wurde der pH-Wert auf 8,0 bis 10,0 eingestellt.
Jede dieser lösungen wurde weitere 3 Stunden lang gerührt, wobei 9 Arten von Östriol-löck-glucuronid-RSA-Xonjugat
erhalten wurden.
Jede dieser lösungen wurde einer Dialyse gegen entionisiertes Wasser unterworfen. Zu den dialysierten lösungen wurde Aceton
in einem Verhältnis von 2 Teilen Aceton pro 1 Teil der lösung
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gegeben und nach dem ausreichenden Rühren wurde jeweils 11 BIGl
zugesetzt, um das Konjugat aus auf allan. Das ausgefällte Eonjugat
in jeder der lösungen wurde durch 5-minütiges Zentrifugieren
bei 10 000 Upm abgetrennt.
Zu jedem abgetrennten Konjugat wurde entionisiertes wasser zugesetst
und nach der Einstellung de3 pH-Werts auf etwa 8 mit
η ITaOH v/urde jede der erhaltenen lösungen gegen entionisiertes
Wasser dialysiert, um Aceton zu entfernen. Auf diese Weise wurden 9 verschiedene Arten eines Konjugats mit unterschiedlichen
Steroid-Bindungszahlen erhalten (Tabelle 3, Proben ITr.
bis 9). Die Terfahrenssehritte zur Herstellung des Konjugats wurden bei niederer Temperatur (6°C) durchgeführt.
Die jeweiligen Steroid—Bindungszahlen in den Konjugaten sind
in -Tabelle 3 gezeigt. Die Messung der St er oid-Bindungs zahlen >;irä e.n späterer Stella beschrieben.
Die sensibilisierenden Mindestmengen für die Konjugate gemäß
Proben 1 bis 9 zur Ausschaltung der nicht spezifischen Agglutination der herstellbaren Konjugat-sensibilisierten
Latexteilchen wurden in folgender Weise bestimmt:
durch Auflösen von 5,0, 5,2, 5,4 beziehungsweise 5,δ rag der
Probe Mr. 1 (Konjugat) in Tabelle 3 in 4-0 ml einer 40 isM
Veronal-Pufferlösung, die 150 mM ITaGl enthielt, wurden 4 Arten
von Konjugatlösungen hergestellt. Zu den 4 Arten von Konjugatlösungen
wurde jeweils 1 ml einer 10 folgen Suspension der
Latexteilchen (Dow Chemical Go.) mit einer Seilchengröße von 0,234 u gegeben und das Gemisch wurde 2 Stunden bei 37 0 gehalten.
Die so erhaltenen Suspensionen von sensibili3ierten Latexteilchen wurden jeweils 20 Minuten lang bei 4 000 Upm
zentrifugiert, um die sensibilisierten Latexteilchen abzuscheiden.
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Die abgetrennten niederschlage wurden je in 20 ml der gleichen
Veronal-Pufferlösung suspendiert und unter den gleichen Bedingungen wie vorher zentrifugiert, um die sensibilisierten
Latexteilchen wieder abzutrennen. Die zuletzt genannte Verfahrensweise wurde noch einmal wiederholt und die so erhalte—
nen Abscheidungen wurden jeweils in 5 ml der gleichen Veronal-Pufferlösung
suspendiert, wobei 4 Arten von sensibilisierte
Latexteilchen enthaltenen Suspensionen mit unterschiedlichen 3ensibilisierenden Mengen erhalten wurden.
0,1 ml jeder der sensiMlisierten Latexteilchen-Suspensionen
wurden auf Objektträger getropft, wozu 0,1 ml des Antiserums zugesetzt und eingemischt wurde, das mit einem Überschuß an
Östriol-looL-glucuronid neutralisiert war. Einige Minuten später
w^rde das Vorliegen einer nicht spezifischen Agglutination in
den jeweiligen Mischtropfen beobachtet.
Die ni^at spezifische Agglutination wurde in den Tröpfchen für
die Suspensionen der mit Konjugat senslbilisierten Latexteilchen
beobachtet, in denen die sensibilisierende Menge 5*0 mg
beziehungsweise 5,2 mg der Probe Mr. 1 betrug, und sie wurde nicht für die Konjugat-sensibilisierten Latexteilchen-Suspensionen
beobachtet, die unter Verwendung von 5»4- mg beziehungsweise
5,6 mg der Probe Nr. 1 hergestellt wurden. Somit
wurde die sensibilisierende Mindestmenge der Probe Hr. 1 zu 5,4 mg pro 0,1 g der Latexteilchen bestimmt.
Entsprechende Versuche wurden für die Proben ITr. 2 bis 9 durchgeführt,
um die jeweilige sensibilisierende Mindestmenge zu bestimmen. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle
gezeigt.
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| Prot)e-Hr. | 1 | CM | 3 | 4 | VJI | 6 | 7 | 8 | 9 | |
| α ce α OC |
Bindungszahl für Östriol-lötf- glucuronid (pro 1 Molekül RSA) |
15,1 | 10,7 | 7,4 | 5,1 | 3,2 | 2,0 | 0,9 | 0,5 | 0,3 |
| α | sensütilisierende Mindestmenge (rag/0,1 g latex- teilehen; |
5,4 | 5,9 | 6,3 | 6,5 | 7,0 | 7,2 | 7,4 | 7,4 | 7,4 |
NJ OO NJ
Unter Verwendung der jeweiligen sensibilisierenden Hindestmengen
der Proben Nr. 1 "bis 9 wurden sensibilisierte Latexteilchen-Suspensionen
der Proben Er. 1 bis 9 hergestellt.
II, Messung der Steroid-Bindungszahl und
Steroid-Nachweisempfindlichkeit
(1) Messung der Steroid-Bindungszahl
Die Messung der Steroid-3indungszahl wurde mit Hilfe der
Methode nach Erlanger et al unter Anwendung der Ultraviolettabsorption (Journal of Biological Chemistry, YoI. 254, S.1090,
1959) und mit Hilfe der Methode nach Sanger unter Anwendung
der Dinitrophenylierung durchgeführt (Biochemical Journal,
YoI. 39, S. 507, 1945).
(i) Messung durch Ultraviolettabsorption
Östriol-loctr-glucuronid und RSA absorbieren in dem gleichen
Spektralbereich, d.h. mit einem Maximum bei 278 nm, und das Absorptionmaximum ihres Konjugats kann als Summe der Absorptionmaxima
der jeweiligen Komponenten gemessen werden. Demnach kann die von Östriol-löot-glucuronid in dem Eonjugat stammende Absorption
durch Subtraktion der Absorption von RSA von der des Konjugats erhalten werden. Durch Vergleich der so erhaltenen
Absorption, die sich von Östriol-löoc-glucuronid in dem Konjugat
ableitet, mit der Absorption einer Vielzahl bekannter Konzentrationen
von Östriol-lSoC-glucuronid wurde die Östrio 1-16ί>6-glucuronid-Bindungszahl
erhalten.
(ii) Messung durch Dinitrophenylierung
Lysinreste (Lys) in dem Konjugat und in dem zur Herateilung
des Konjugats verwendeten Serumalbumin wurden jeweils mit
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Dinitrofluorbenaol (Wako Junyaku Kogyo Kabushiki Kaisha) Dinitrophenyliert,
ma dinitrophenyliertes Konjugat und dinitrophenyliertes
Serumalbumin her3U3teilen« Dann wurden diese
Dinitrophenylierungsprodukte 24 Stunden lang bei 11O0G hydrolysiert,
um freies Dinitrophenyllysin zu erhalten. Auf diese
Weise wurden zwei verschiedene Lösungen mit einem Gehalt an Dinitrophenyllysin erhalten, deren eine aus dem Eonjugat und
deren andere von Serumalbumin stammte. Andererseits wurde als
Bezugssubstanζ handelsübliches Dinitrophenyllysin (Tokyo Kaeei
Eogyo Kabushiki Kaisha) verwendet und aus dieser Substanz
wurde eine Verdünnungsreihe von Lösungen hergestellt. Unter Verwendung der vorstehend erhaltenen beiden Arten an Dinitrophenyllysin
enthaltenden Lösungen und der Verdünnungsaerie von
Dinitrophenyllysin-Lösungen al3 Bezugssubstansen %vurde die
colorimetrische 3estianiung bei 390 nm durchgeführt und dann
■.Tirde die 8teroid-3indungszahl in dein Eonjugat aus den Vierten
der optischen Dichte berechnet.
(2) I-Iessung der Empfindlichkeit des Steroid-JTachweises
Im allgemeinen wurde die Empfindlichkeit des Steroid-Nachweises
in der T.feise gemessen, daß zuerst der Titer des ursprünglich
verwendeten Antikörpers mit Hilfe einer Bezugs-Steroidlösung bestimmt wurde und danach der 'Titer der Jeweiligen Proben Nr.
bis 9 in Bezug auf den Titer des ursprünglichen Antikörpers bestimmt wurde. Einzelheiten dieses Verfahrens werden nachstehend
erläutert.
(i) Bestimmung des Antikörper-Titers
Antiserum wurde aus Kaninchen erhalten, die nach einer geeigneten
üblichen Methode mit Östriol-lGoc-glucuronid-BSA-Konjugat
immunisiert worden waren, und da3 Antiserum wurde als
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ursprünglicher Antikörper verwendet. Dieser ursprüngliche Antikörper
wurde mit einer 40 mM Veronal-Pufferlösung, die 150 mM
ITaOl enthielt, in einer Verdünnungsserie verdünnt. Zu 0,05 ml des in Form einer Terdünnungsserie verdünnten Antikörpers wurde
0,05 ml einer lösung zugesetzt und gut eingerührt, die durch Auflösen von 0,1 η Mol Östriol-löß^-glucuronid pro 1 ml Pufferlösung
erhalten worden war. Je 0,1 ml der erhaltenen gerührten Mischlösungen wurde tropfenweise auf Objektträger gegeben und
zu jedem der Tropfen auf den Objektträgern wurde 0,1 al der Suspension von Latexteilchen zugesetzt, die mit Konjugat sensibilisiert
waren, das eine Östriol-16(XL-glueuronid-Bindungszahl
von 2,0 hatte, und das Gemisch wurde gut gerührt. Die Beobachtung nach 3 Minuten zeigt, daß eine Agglutinationsreaktion
in den Tröpfchen feststellbar war, die mit einer 200-fachen
oder geringeren Verdünnung des ursprünglichen Antikörpers erhalten v;orden waren.
| Verdünnung des Antikörpers |
x50 | xlOO | x200 | x300 | x400 |
| Agglutination | + | + | + | - | - |
Diese Werte zeigen, daß der ursprüngliche Antikörper bei einer Verdünnung auf das 200-fache mindestens 0,1 η Mol Östriol-16oC-glucuronid/ml
neutralisieren kann.
Der Titer dieses 200-fach verdünnten Antikörpers wurde somit
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zu 0,1 η Mol Östriol-lfoC-glucuronid-Aquivalent/riL bestimmt und
der Titer des ursprünglichen Antikörpers "betrug somit 20 η MoI
Gstriol-lorX-glucuronid-Äquivalente/ial.
(ii) Bestimmung de3 Titers des Late:a?eagenz
Der ursprüngliche Antikörper wurde mit Hilfe einer 40 stf'I Veronal-Pufferlösung
in einer Yerdünnungsserie verdünnt und je 0,1 ml
jeder der verdünnten Antikörper-Lösungen aus der Serie wurde auf Objektträger getropft. Zu diesen Tropfen wurden 0,1 ml
jeder der Proben Hr. 1 "bis 9 (Tabelle 1) zugesetzt und gut eingerührt
und die Ergebnisse wurden nach 3 Minuten beobachtet. Bezogen auf die maximale Verdünnung in den Tropfen, in denen
eine Agglutinationsreaktion beobachtet wurde, und auf den Titer des ursprünglichen Antikörpers, wurden die Titer der Latexreagens-Proben
berechnet. Es ist daher ersichtlich, daß ein lileizierer nummerischer Wert des Titers eine höhere Machweiseinpfindlichkeit
bedeutet.
Die östriol-lbrt-glucuronid-Bindungszahl und die Hachweisempfindlichkeit
für die Proben Hr. 1 bis 9 sind in Tabelle 3 gezeigt.
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| RSA (mg) |
l'aljelle | Herstellungsljedingungen | entionisiertes Wasser (ml) |
3 | Östriol-16oi- glucuronid- Birtdungszahl |
JDinitro- phenylierung- Metbode |
Haclrweis- empfindlich keit |
|
| Probe- Nr. α» ο co 00 |
56 | Östriol~16oc- glucuronid/RSA (Mol-Verhältnis) |
1,4 | Ultraviolett- absorptlon- Methode |
17,2 | Os tr i 0I-I60C.- glueuronid- Aquivalente des Antikörpers (η Mol/ml) |
||
| -*1 | 93 | 25,0 | 2,4 | 15,1 | 11,9 | 1,60 | ||
| O2 | 140 | 15,0 | 3,0 | 10,7 | 8,7 | |||
| ^3 | 200 | 10,0 | 5,1 | 7,4 | 6,2 | 0,13 cc | ||
| 4 | 311 | 7,0 | 8,0 | 5,1 | 3,6 | 0,09 ' | ||
| 5 | 466 | 4,5 | 12,0 | 3,2 | 2,4 | 0,05 | ||
| 6 | 932 | 3,0 | 24,0 | 2,0 | 1,5 | 0,04 | ||
| 7 | 1863 | 1,5 | 48,0 | 0,9 | 0,7 | 0,05 | ||
| 8 | 2795 . | 0,75 | 72,0 | 0,5 | 0,5 | 0,08 CO | ||
| 9 | 0,5 | 0,3 | 0,19 ^ cn O |
|||||
- 3ο -
Aus der vorstehenden Tabelle 3 ist ersichtlich, daß ein Zusammenhang
zwischen der Staroid-Bindungszahl und der Hachwei3-empfindlichkeit
bei den Proben Ur. 1 bis 9 besteht. D.h., die nachweisempfindlichkeit wird erhöht, wenn die Steroid-Bindungszahl
vermindert wird. Dia ITachweisempfindliehkeit erreicht jedoch
ein Maximum, wenn die Steroid-Bindungsaabl 2,0 beträgt
(bestimmt nach der Ultraviolettabsorptions—Methode) und danach
vermindert sich die nachweisempfindlichkeit mit verminderter
S t er ο id-Bin dungs sah1.
Es ist daher ersichtlich, daß mit Hilfe des eri'indungsgemäiSen
Verfahrens eine ausgezeichnete Empfindlichkeit von mehr al3 0,2 η Mol Östriol-lötf-glueuronid-Äquivalent/ml erreicht wird
und daß diese Empfindlichkeit merklich höher als die des üblichen Latexreagenz in dem Bereich von 2,5 η Mol Östriol-15
ix-gluaurcnid-lquivalant/ml ist.
Diese ausgezeichnete ITachweisempfindlichkeit ist erreichbar,
wenn die Steroid-Bindurigazahl in einen Bereich von etwa 0,5
bis 8,7 fällt, gemessen mit Hilfe der Ultraviolettabsorpfcions-Hethode
und der Dinitrophenylierungs-Hethode. Sine höhere
Empfindlichkeit von mehr als 0,1 η Hol Östriol-16-X-glucuronid-Äquivalent/ml
kann erreicht werden, wenn die Steroid-Bindungseinen Wert innerhalb des Bereiches von 0,7 bin 7,0 hat.
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Versuch 2
Der gleiche Versuch wie Versuch 1 wurde unhef Verwendung
von Latexteilchen durchgeführt, die mit Dehydroepiandrosteron-17-(o-carboxymethyl)-oxim-BSA
Konjugat sensibilisiert waren.
Unter Verwendung von Dehydroepiandrosteron (Sigma Company)
(nachstehend ale DHEA bezeichnet) und BSA (ICN Pharmaceuticals
Company), wurden 8 Arten von Konjugaten mit unterschiedlichen
Steroidbindungs2ahlen im Bereich von 0,5 bis 13,3 in folgender Weise hergestellt:
0,75 g DBDSA und 0,69 (o-carboxyme thy I) -hydroxy lamine-hy-'
drochlorid (Wako Junyaku Kogyo Kabushiki Kaisha) wurden
in 20 ml Äthylalkohol gelöst und 2 ml 6,4 m Natriumsuccinatlösung wurden zugesetzt, um die Lösung alkalisch
Ζ'Λ halfcea. Die gebildete Lösung wurde eine Stunde lang
gezrückzluSt, um die Reaktion zu beschleunigen, und dann
wurde Sa-CO-, zugesetzt. Die Menge des zugesetzten Na^CO3
wurde so gewählt, daß die Konzentration von Na-CO^ in der
gebildeten Lösung 5% betrug.
Nach dem Waschen der gebildeten Lösung mit Äther wurde die wässrige Schicht mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure
angesäuert und der gebildete Niederschlag wurde abgetrennt. Dieser Niederschlag wurde aus Äthanol umkristallisiert, wobei
0,6 g DHEA-17-(o-carboxymethyl)-oxim erhalten wurde
(nachstehend als DHEA-CMO bezeichnet.
Unter Verwendung von DHEA-CMO und BSA in den in Tabelle 4
gezeigten Molverhältnissen wurden 8 verschiedene Arten von Konjugaten (Proben Nr. 1 - Nr. 8) mit unterschiedlichen
Steroid-Bindungszahlen in gleicher Weise wie in Versuch 1 hergestellt. Die Steroid-Bindungszahl in den Proben Nr.1
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bis Nr. 8 wurde mit Hilfe der Dinitrophenylierungsmethode
gemessen. Dia dabei erhaltenen Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 4 gezeigt.
Die sensibilisierende Mindestmenge wurde für die Proben Nr.
1 bi3 Nr. 8 in gleicher Weise wie in Versuch 1 bestimmt.Die
Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 4 aufgeführt.
Unter Anwendung der sensibilisierenden Mindestmengen der Proben Nr. 1 bis Nr. 8 wurden 8 verschiedene Arten von
Latexreagentien hergestellt und die Steroid-Nachweisempfindlichkeit
wurde für diese Proben in folgender Weise gemessen:
Zu einem Milliliter einer lo%igen Suspension von Latexteilchen
(Dow Chemical Company) mit einer Teilchengröße von 0,721 f/m, wurden 4 ml von 20 mM Phosphorsäure-Pufferlösung
(pH 7,2), die 15Ο mM NaCl enthielt, zugesetzt. Nach dem ausreichenden
Rühren wurde die gebildete Lösung 2o Minuten lang mit 4.000 Upm zentrifugiert. Die erhaltene Abscheidung wurde
in 4 ml der gleichen Pufferlösung suspensiert. Die gebildete Suspension wurde wieder unter den vorstehend angegebenen Bedingungen
zentrifugiert und der Niederschlag wurde abgetrennt. Die gleiche Menge der so gewaschenen Latexteilchen
wurde in 8 Anteilen hergestellt.
Die sensibilisierenden Mindestmengen der entsprechenden
Konjugatproben Nr. 1 bis Nr. 8 gemäß Tabelle 4 wurden in
5 ml der Pufferlösung gelöst, wobei 8 Arten von Konjugat—
lösungen mit unterschiedlichen Steroid-Bindungszahlen hergestellt wurden und diese Lösungen wurden zu den 8 Anteilen
der so erhaltenen gewaschenen Latexteilchen gegeben. Nachdem die gebildeten Lösungen 2 Stunden lang bei 37 C stehengelassen
worden waren, wurden sie zweimal dem Zentrifugieren und Waschen mit der Pufferlösung unterworfen. Die
erhaltenen Niederschläge wurden jeweils in 5 ml der Pufferlösung suspensiert,wobei 8 Arten von DHEA-CMO-BSA-sensibi-
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- 33 ™ 2327250
lisierhen Latexteilchen-Suspensionen erhalten wurden
(Tabelle 4, Proben Nr. 1 bis LIr. 8).
Ferner wurde ein Antiserum aus mit DHEA-CMO-ESA-sensibilisierten
Kaninchen erhalten und dieses wurde als ursprünglicher Antikörper verwendet. Dieser ursprüngliche Antikörper
wurde mit 2o mM Phosphorsäure-Pufferlösung (pH 7,2),
dia 15o mM NaCl enthielt, in einer Vardünnungsserie verdünnt. Unter Verwendung von je 0,05 ml jeder Verdünnung
des Antikörpers wurden Gemische aus O,O5 ml jeder verdünnten
Lösung mit 0,05 ml einer Lösung, die durch Auflösen von 0,2 η Mol DHEA pro 1 ml der Pufferlösung
gebildet worden war, hergestellt, um den Antikörper zu neutralisieren. Auf Objektträger wurde ja 0,1 ml jeder
der entsprechenden neutralisierten Lösungen getropft und zu jedem dieser Tropfen wurde 0,1 ml einer Suspension von
Latexteilchen gegeben, die mit dem Konjugat mit einer DHEA-Bindungszahl
von 2,4 sensibilisiert worden waren, und gut eingerührt. Die maximale Verdünnung des Antikörpers, welche
dia Beobachtung einer Agglutination innerhalb von 3 Minuten ermeg-liehte, war 5o-fach. Der Titer des 5o-fach verdünnten
Antikörpers wurde somit zu 0,2 η Mol DHEA-Äquivalent/ml
bestimmt, so daß der Titer des ursprünglichen Antikörpers Io η Mol DHEA-Äquivalent/ml betrug.
Danach wurde mit dem ursprünglichen Antikörper mit Hilfe von 2o mM Phosphorsäure-Pufferlösung eine Verdünnungsreihe hergestellt und je 0,1 ml jeder der verdünnten Antikörperlösungen
wurde mit 0,1 ml der Latexreagenz-Proben Nr. 1 bis Nr. 8 auf Objektträgern vermischt und danach
wurde die maximale Verdünnung des Antikörper festgestellt, die zu einer Agglutination innerhalb von 3 Minuten führte.
Die jeweiligen Nachweisempfindlichkeiteη der Latexreagenz-Proben
Nr. 1 bis Nr. 8 wurden in gleicher Weise wie in Versuch 1 auf Basis der maximalen Verdünnung und des Titers
des ursprünglichen Antikörpers berechnet. Die berechneten Titer sind ebenfalls in Tabelle 4 gezeigt.
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CO O CO
CO
OD
| Probe ■ Hummer j I |
Herstellungs bedingungen |
DHEA-CMO/BSA (Molverhältnis} |
υιιι.Λ- U i.iiiJun<jH/,.i))l |
DHEA-CMO-ESA sensibilisie- rende Menge (mg/0, 1 g Latexteil- chen) |
ι Nackv;e xcempfind- lichkeit |
| 1 2 3 4 5 6 7 I Q ! |
BSA (mg) |
25,0 15,0 10,0 7,0 4,5 3,0 1.5 0,75 |
Dinitropheny- 1 ie rung s nie t bode |
1,2 1,3 1.3 1,5 1,7 1,7 1,8 1,8 ι |
Östriol-16 c<
- qlucuronid- Aquivalenl: aus Antikörpers (η Mol/rul) |
| 71,9 12o 18o 257 400 600 1200 I |
18,3 11,0 7.7 5,6 3,6 2,4 1,2 0,5 |
1,40 0,50 0, 15 ο, 10 0,07 0,05 ü,u5 0,08 |
Os»
C30 K)
N)
tn ο
2S27250
Aus Tabelle 4 ist ersichtlich, daß dia höchste Emprxndlichkeit erreicht wird, wenn die DHEA-CMO-Bindungs2ahl
innerhalb des Bereiches von 1,2 bis 2,4 liegt, und das eine Empfindlichkeit von mehr als 0,1 η Mol DHEA Ä'quivalsnt/ml
erzielt wird, wenn die DHEA-CMO-Bindungszahl
innerhalb des Bereiches von 0,5 bis 7,7 liegt.
Versuch 3
Unter Verwendung verschiedener Arten von Steroiden und Serumalbumin, die in den Versuchen 1 und 2 nicht verwendet
worden waren, wurden entsprachende Versuche nach der gleichen Verfahrensweise durchgeführt. Die Maximal-
und Mindestwerte der Steroid-Bindungszahl, bei denen eine Empfindlichkeit von mehr als 0,1 η Mol Steroid-Äquivalent/ml
erreichbar ist, sind in Tabelle 5 gezeigt.
| Konjugafc zur Sensibili- siemna von Latexteil |
Steroid-Bindungszahlen | Maximalwert |
| chen | I Mindestwert |
8,0 |
| Progesteron-11 hemisuccinat-RSA |
o,5 | 7,o |
| Hydrocortison-21 hemisuccinat-HSA |
o,5 | 7,5 |
| Aldosteron-3- (o-carboxy- methyl)-oxim-ESA |
o,5 | 8,6 |
| Testoseron-17 glucoronid-RSA |
o,5 | 7,3 |
| Pregnandiol-3- hemisuccinat-ESA |
o,5 |
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Aus den vorstehenden Angaben ist ersichtlich, daß unabhängig
von dem einzusetzenden Steroid und Serumalbumin
eine höhere Empfindlichkeit von mehr als O,2 η Mol Steroid-Äquivalent/ml
erreicht wird, wenn die Sfceroid-Bindungszahl in dem Konjugat innerhalb des Bereiches von
0,5 bis 7,0 liegt.
Versuch 4
Ein Vergleichsversuch zum Vergleich der Steroid-Nachweisempfindlichkeit
wurde zwischen dem erfindungsgemäß hergestellten Latexreagenz und dem mit Hilfe der üblichen Methode
hergestellten Latexreagenz in folgender Weise durchgeführt:
Das Latexreagenz wurde nach der üblichen Methode in gleicher Weise wie in Versuch 1 hergestellt, mit der Abänderung,
das 47 mg RSA (ICN Pharmaceuticals Company) und 1,O ml
entionisiertes Wasser verwendet wurden, wobei Östriol-16c£-
glucuronid-RSA-Konjugat erhalten wurde. Die Steroid-Bindursgszahl
in diesem Konjugat betrug entsprechend der in Versuch 1 erwähnten Ultraviolettabsorptionsmetfoode 2o.
Unter Verwendung verschiedener Mengen dieses Konjungates
wurden Latexteilchen in gleicher Weise wie in Versuch 1 sensibilisiert, und die erhalten unterschiedlich sensibilisierten
Latexreagenzien wurden in gleicher Weise wie in Versuch 1 dem Stabilitätstest für die nichtspezifische
Agglutination unterworfen. Die sensibilisierende Mindestmenge des Konjugats, die zum Ausschalten der nichtspezifischen
Agglutination erforderlich ist, wurde zu 5,0 mg pro 0,1 g Latexteilchen bestimmt.
Auf diese Weise wurde ein Vergleichslatexreagenz (Probe Nr. 10) hergestellt, indem Latexteilchen mit der sensibilisierenden
Mindestmenge dieses Konjugates sensibilisiert wurden.
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Außerdem wurden zusätzliche Vergleichs-Latexreagenzien (Proben Nr. 11 bis 14 in der Weise hergestellt, daß
Latexteilchen mit den sensibilisierenden Mindestmengen der Konjugate sensibilisiert wurden, die gegenüber dem
für Probe Nr. Io verwendeten unterschiedlich modifiziert waren. Im einzelnen wurde das Konjugat in der Weise
modifiziert, daß zu der gleichen Menge des in 4 Anteilen hergestellten Konjugats verschiedene Mengen einer wässrigen
Lösung von immunologisch inertem RSA gegenben wurden, so daß das resultierende Molverhältnis des Steroids zu
der Gesamtmenge an RSA in den modifizierten Konjugaten
auf einen Wert von 1, 2, 5 bzw. Io eingestellt wurde. Dann wurden für diese modifizierten Konjugate die sensibilisierenden
Maximal- bzw. Mindestmengen in gleicher Weise wie in den vorhergehenden Versuchen bestimmt. Unter Verwendung
der jeweiligen sensibilisierenden Mindestmengen dieser 4 Arten von modifizierten Konjugaten wurden Latexteilchen
sensibilisiert und die zusätzlichen Vergleichslatexreagenzien (Proben Nr. 11 bis 14) wurden hergestellt.
unter Verwendung der so erhaltenen 5 Arten von Vergleichs-Latexreagenzien
Nr. Io bis Nr. 14 und der Latexreagenz-Proben Nr. 6 und Nr. 9 gemäß Versuch 1 wurde ein Vergleichsversuch
zur Bestimmung der Steroid-Nachweisempfindlichkeit
in gleicher Weise wie in Versuch 1 durchgeführt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt.
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| Probe No. |
Mischungsverhält nis von inertem RSA und Probe Nr. Io (RSA: Probe No.lo) |
LM-er old ~ U J. uti u ng s zahl (pro 1 Mole kül Gesarnfc- RSA) |
Sensibili·" · siegende Menge (mg/0.1 g Latexteil chen) |
Nachweisempfin- lichkeit Östriol -löiC-glucuronid-/ Äquivalente des' Antikörpers (n Mol/ml) |
| 6* | 2,ο | 7,2 | o,o4 | |
| 9* | - | o, 3 | 7,4 | o, 19 |
| Io | 2o | 5,ο | 2,5 | |
| 11 | 1-: 1 | Io | 6,ο | 1,5 |
| 12 | 3 : 1 | 5 | 6,7 | l,o |
| 13 | 9 : 1 | 2 | 7,4 | o, 5 |
| 14 | 19 : 1 | 1 | 7,5 | o,8 |
(Anmerkung *. : Latexteilchen, sensibilisiert mit den erfindungsgemäßen Konjugaten)
N) tn O
Aus Tabelle 6 geht hervor, daß die Steroid-Nachwex3-empfindlichkeit
für Probe Nr. 6 das 62,5-fache der von Probe Nr. Io beträgt, und daß die Empfindlichkeit für
Probe Nr. 9 das 13-fache von der der Probe Nr. Io beträgt, obwohl die Probe Nr. 9 unter den erfindungsgemäßen
Proben die geringste Empfindlichkeit zeigt. Es ist somit deutlich, da1* die erfindungsgemäßen Latexreagenzien
eine extrem hohe Empfindlichkeit im Vergleich mit den üblichen Latexreagenzien besitzen, die
eine beträchliche große Steroid-Bindungszahl haben.
Betrachtet man die zusätzlichen Latexreagenz-Vergleichsproben Nr. 11 bis Nr. 14, so ist unter allen Proben die
Steroid-Nachweisempfindlichkeit für Probe Nr. 13 am höchsten, die Empfindlichkeit beträgt jedoch fast 1/12
der von Probe Nr. 6 und etwa 2/5 der von Probe Nr. 9. Obwohl außerdem diese Reagenzproben Nr. 11 bis Nr. 14
sehr kleine Steroid-Bindungszahlen haben, die vergleichbar
mit den Werten in den erfindungsgemäßen Reagenzproben
sind, können diese Reagenzproben Nr. 11 bis Nr. nicht notwendigerweise als übliche Reagenzien angesehen
werden, da bisher in der Literatur kein Hinweis existiert, der es lehren oder anregen könnte, die Steroid-Bindungszahl
auf einen derartigen Wert zu vermindern, um die Empfindlichkeit zu erhöhen. Es ist daher jedenfalls deutlich,
daß die Empfindlichkeit der Proben Nr.11 bis Nr. nicht vergleichbar mit den Empfindlichkeiten der erfindungsgemäßen
Proben ist.
Es ist somit ersichtlich, daß es erf xndugsgemäß' ermöglicht
wird, geringere Konzentrationen von Steroiden nachzuweisen, die nicht mit dem üblichen Latexreagenz
nachgewje sen werden können, oder daß wahlweise ermöglicht wird, die zu untersuchende Flüssigkeit zu verdünnen,
um Störungen durch vorliegende andere Substanzen auszuschalten,wenn die Flüssigkeit das Steroid in einer
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höheren Konzentration enthält. Anders ausgedrückt, er möglicht die Erfindung eine verläßlichere quantitavive
Bestimmung von Steroiden und ermöglicht darüberhinaus, genauere diagnostische Informationen zu geben.
Erfindungsgemäß wird darüberhinaus ein Latexreagenz mit
ausgezeichneter hoher Empfindlichkeit zugänglich und
der Steroidnachweis kann daher mit einer geringeren Menge an Antikörper oder Antiserum erreicht werden. Infolgedessen
werden Ersparnisse beim Verbrauch von Antikörper ermöglicht und im Hinblick darauf, daß die Herstellung
von Antikörper, oder Antiserum hohen Aufwand erfordert, ist daher das erfindungsgemäße Verfahren in
wirtschaftlicher Hinsicht äußerst vorteilhaft.
Nach der Beschreibung von beispielhaften Versuchen gemäß der Erfindung werden nachstehend einige Beispiele zum
besseren Verständnis der Erfindung beschrieben.
Flüssigkeit A wurde hergestellt, indem 5o mg Qstriol-16p<glucuronid
(Sigma Company) in Io ml Dimethylformamid (Wako Junyaku Kogyo Kabushiki Kaisha) gelöst wurden, wonach 26ul
Tri-n-butylamin (Tokyo Kasei Kabushiki Kaisha) und danach
14fiil Isobutylchlorformiat (Aldrich Chemical Company) zugegeben
wurden und das Gemisch gut gerührt wurde.
Andererseits wurden 2,33 g RSA (ICN Pharmaceuticals Company)
in 60 ml entionisiertem Wasser gelöst, dem 1,0 ml n NaOH zugesetzt worden war, und danach wurden 5o ml Dimethylformamid
zugesetzt. Auf diese Weise wurde Flüssigkeit B erhalten.
Zu dieser Flüssigkeit B wurde die vorher hergestellte
FlüssigkeitΆ tropfenweise zugefügt und das Gemisch wurde
eine Stunde gerührt. Dann wurde O,1 ml η NaOH zugefügt
und das Rühren wurde weitere dreieinhalb Stunden fortge-
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setzt. Nach der Dialyse der Lösung gegen entionisiertes
Wasser wurden zwei Teile Azeton pro ein Teil der Lösung zugesetzt und nach dem homogenen Vermischen wurde
1 η HCl zugefügt, um das synthetisiertes östriol-lS-
<3C-gluGuronid-RSA-Konjugat auszufällen- Die Abscheidung
wurde durch Zentrifugieren mit lo.ooo TJpm während 5
Minuten abgetrennt.
Zu dem abgetrennten Niederschlag wurde entionisiertes Wasser gegeben und der pH-Wert wurde mit η NaOH auf 8
eingestellt. Danach wurde die Lösung gegen entionisiertes Wasser dialysiert, um Azeton zu entfernen. Auf
diese Weise wurden 1,78 g des Konjugats erhalten (Ausbeute 75%). Diese Verfahrensschritte wurden bei niederer
Temperatur (6°C) durchgeführt. Die Steroid (Östriol~lfe(-glucuronid)-Bindungszahl
betrug nach der Messung mit Hilfe der Ultraviolettabsorptionsmethode 2,2 und
mit Hilfe der Dinitrophenylierungsmethode 1,9.
Dann wurden 76 mg des Konjugats in 4oo ml einer 4o mM
"eronal-Puffer-Losung gelöst, die 15o mM NaCl enthielt
und einen pH-Wert von 7,8 hatte. Zu der Lösung wurden Io ral einer Suspension (Konzentration lo%) von Polystyrollatex-Teilchen
(Teilchengröße 0,234iim) gegeben und das Gemisch wurde zwei Stunden lang bei 37 C gehalten, um
die Sensibilisierung durchzuführen. Die sensibilisierte Latexsuspension wurde mit 4,ooo Upm 2o Minuten lang zentrifugiert
und der erhaltene Niederschlag wurde in 2oo ml der genannten Pufferlösung suspensiert und danach
unter den vorstehend erwähnten Bedingungen zweimal zentrifugiert- Der so erhaltene Niederschlag wurde erneut
in 5o ml dieser Pufferlösung suspensiert und danach wurde Natriumazid zugefügt, so daß dessen Konzentration 0,1%
erreichte, wobei 5oml einer mit Östriol-l&^-glucuronid-RSA
sensibilisierten Latexteilchensuspension (Dichte 2%) erhalten wurde.
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original
Auf einem gläsernen Objektträger wurden 0,1 ml der so erhaltenen sensibilisierten Latextailchensuspension und
0,1 ml verdünnter Östriol-lö^^glucuronid-3SA-An tikörperlösung
vermischt, die in gleicher Weise, wie in Versuch 1, hergestellt und so verdünnt worden war, da!3 sie
einen Titer von 0,o4 η Mol Östriol~16t».-glucuronid-Ä"quivalent/ml
hatte. Die Agglutination wurde innerhalb von 1 bis 2 Minuten beobachtet- Wenn jedoch der Antikörper
so verdünnt war, daß er einen Titer entsprechend O,02 η
Mol Östriol-16o(-glucuronid-Äquivalent/ml hatte, wurde keine
Agglutination beobachtet und der Titer des in diesem Beispiel erhaltenen Latexreagenz wurde daher zu 0,04 η Mol
Östriol-16o<-glucuronid-Äquivalent/ml bestimmt.
DHSA-CMO wurde in gleicher Weise wie in Versuch 2 hergestellt.
Flüssigkeit A wurde hergestellt, indem 0,5 g DHBA-CMO in loo ml Dimethylformamid (Wako Junyaku Kogyo
Xabushiki Kaisha) gegeben wurde , wonach 0,33 ral Tri-nbutylainin
(Tokyo Kasei Kogyo Kabushiki Kaiaha) zugesetzt und außerdem 0,18 ml Isobutylchlorformiat (Aldrich Chemical
Company) zuge3etst wurde und das Gemisch gut gerührt
wurde.
Außerdem wurden 18,0 g BSA (Sigma Company) in 600 ml entionisiertes
Wasser gegeben, wozu 500 ml Dimethylformamid zugefügt wurde, so daß Flüssigkeit B erhalten wurde.
Zu dieser Flüssigkeit B wurde die vorstehend hergestellte Flüssigkeit A tropfenweise zugesetzt und nach 1 1/2 stündigem
Rühren wurde der pH-Wert des Gemisches mit η NaOH auf 9,0 eingestellt und das Rühren wurde dann weitere 3 1/2
Stunden durchgeführt. Die so erhaltene Lösung wurde gegen fließendes Wasser dialysiert, dann wurden zwei Teile Aceton
pro ein Teil der Lösung zugesetzt. Nach dem homogenen
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Vermischen wurde η HCl zu der Lösung gegeben, um das synthetisierte
Konjugat auszufällen, wonach die Lösung mit 5.000 Upm während 2o Minuten zentrifugiert wurde. Zu dem ijbgeschiedenen
Niederschlag wurde entionisiertes Wasser gegeben und nachdem der pH-Wert mit η NaOH auf etwa 8 eingestellt
worden war, wurde die Lösung gegen flief3endes Wasser dialysiert, um Aceton zu entfernen. Auf diese Weise wurden
13,0 g des DHEA-CMO-BSA-Konjugats in einer Ausbeute von etwa
7o% erhalten. Die Steroid (DHEA-CMO)-Bindungszahl dieses Konjugats,
bestimmt mit Hilfe der Dinitrophenylierungsmethode, betrug 4,1.
Dann wurden 68 mg des so erhaltenen Konjugats in loo ml
loo mM Glycinpufferlösung (mit einem Gehalt an 13o mM NaCl und 0,1% Natriumazid, pH 8,2) gelöst und zu dieser
Lösung wurden Io ml einer lo%igen Suspension von Polystyrollatexteilchen
(Dow Chemical Company) zugesetzt, wonach das Gemisch bei Raumtemperatur 5.Stunden lang zur Sensibilisierung
gegen diese Pufferlösung dialysiert wurde. Die so erhaltene sensibilisierte Latexsuspension wurde 2o Minuten lang mit
4.CCO Upm zentrifugiert und danach wurde der Niederschlag
in. 2OO ml dieser Pufferlösung suspendiert. Die erhaltene Suspension wurde dann noch zweimal unter den angegebenen
Bedingungen zentrifugiert und mit dieser Pufferlösung gewaschen. Schließlich wurde der erhaltene Niederschlag wieder
in 5o ml dieser Pufferlösung suspendiert, wobei 5o ml einer Suspension von mit DHEA-CMO-BSA' sensibilisierten Latexteilchen
einer Konzentration von 2% erhalten wurden.
Auf einem Objektträger wurde 0,o5 ml ο,Ι η Mol/ml DHEA mit
0,o5 ml des in gleicher Weise wie in Versuch 2 hergestellten verdünnten AntiTcörpers, der mit der angegebenen Pufferlösung
bis auf einen Titer von o, 1 η Mol DHEA-Äquivalent/ml verdünnt
worden war vermischtjdann wurde o,l ml der schließlich
erhaltenen sensibilisierten Latexteilchensuspension zugesetzt. Dabei wurde selbst nach Io Minuten keine Agglutination
beobachtet. Wenn o,l ml der sensibilisierten Latex-
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teilchensuspension zu dem Geraisch aus σ,o5 ml des ο, ο2 η
Mol/ml DHEA und o, o5 ml des verdünnten Antikörpers zugemischt wurde, so wurde innerhalb von 2- bis 3 Minuten
eine Agglutination beobachtet. Nach der gleichen Verfahrensweise wie in Versuch 1 wurde daher der Titer des
in diesem Beispiel erhaltenen Latexreagenz zu o,o5 η Mol DHEA-Äquivalent/ml bestimmt.
eine Agglutination beobachtet. Nach der gleichen Verfahrensweise wie in Versuch 1 wurde daher der Titer des
in diesem Beispiel erhaltenen Latexreagenz zu o,o5 η Mol DHEA-Äquivalent/ml bestimmt.
Flüssigkeit A wurde hergestellt, indem 1,1 g Testosteron-17-glucuronid
(Sigma Company) in 2oo ml Dimethylformamid
(Wako Junyaku Kogyo Kabushiki Kaisha) gelöst wurden, wonach
zu der so erhaltenen Lösung o,52 ml Tri-n-butylamin
(Tokyo Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha) und schließlich o,28
ml Isobutylchlorformiat . (Aldrich Chemical Company) nach und nach zugesetzt und gut eingerührt wurden.
Flüssigkeit B wurde durch Auflösen von 46,6 g RSA (Sigma Company) in 1,2 1 entionisiertem Wasser hergestellt und
nach dem Einstellen des pH-Wertes auf 9, ο mit η NaOH wurde
l,o iDiirBÖ^lformamid zugesetzt. In gleicher Weise wie in
Beispiel 2 wurden etwa 39,ο g Testosteron· -17-glucuronid-RSA-Xonjugat
(nachstehend auch als T-17-G-RSA bezeichnet) erhalten ( Ausbeute etwa 82%). Die Steroid (T-17-G) Bindungszahl
in diesem Konjugat betrug nach der Messung durch die Ultraviolettabsorptionsmethode 2,3 und nach der Messung
durch die Dinitrophenvlierungsmefchode 2,1.
Dann wurden 4oo ml 2o ttiM Phosphorsäurepufferlösung, die 15o mM
NaCl enthielt (pH 7,2) zu loo ml einer Suspension von Polystyrollatexteilchen
(Dow Chemical Company) einer Konzentration von lo% und mit einer Teilchengröße von o,721 ym gegeben
und die Suspension wurde dann 2o Minuten lang mit 4.ooo Upm zentrifugiert. Der so erhaltene Niederschlag wurde in
5oo ml der Pufferlösung suspendiert und die Suspensfan wurde dann unter den gleichen Bedingungen wie vorher zentrifugiert
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und der Niederschlag wurde abgetrennt. Dann wurden 5oo ml der angegebenen Pufferlösung, die 18o mg des vorher
erhaltenen Konjugats enthielt, zu dem abgetrennten Niederschlag gegeben. Nachdem die so erhaltene Suspension zwei Stunden lang bei 37°C gehalten worden war,
wurde die Suspension unter den vorstehend genannten Bedingungen zentrifugiert und das Waschen mit der Pufferlösung
und der Zentrifugationsvorgang wurden zweimal wiederholt. Der erhaltene Niederschlag wurde erneut in
5oo ml der Pufferlösung suspendiert und schlieSlich wurde
Nätriumazid bis zu einer Endkonzentration von 0,1% zugesetzt. Auf diese Weise wurden 5oo ml einer mit T-17-G-RSA
sensibilisierten Latexteilchensuspension einer Konzentration
von 2% erhalten.
In gleicher Weise wie in Versuch 1 wurde Antikörper gegen T-17·
G-RSA hergestellt, der dann mit der Pufferlösung bis zu einem Titer von o, o5 η Mol T-17-G-Äquivalent/ml verdünnt
wurde. Auf einem objektträger wurde o,1 ml dieses verdünnten
Antikörpers mit o,l ml der schließlich erhaltenen Latexteilchensuspension vermischt und eine Agglutination
wurde innerhalb von 1- bis 2 Minuten beobachtet. Wenn der Antikörper jedoch bis zu einem Titer von o,o2 η Mol T-17-G-Aquivalent/ml
verdünnt wurde, so wurde innerhalb von 5 Minuten keine Agglutination beobachtet. Das in diesem
Beispiel erhaltene Latexreagenz wurde somit als o,o5 η Mol T-17-G-Aquivalent/ml bewertet.
Flüssigkeit A wurde hergestellt, indem eine gewisse Molzahl Natriu,m-hydrocorfcison-21-hemisuccinat (Sigma Company)
mit der gleichen Molzahl konzentrierter Chlorwasserstoffsäure vermischt wurde und das Gemisch dann konzentriert und
mit Wasser gewaschen wurde. Das Konzentrieren und die Waschvorgänge wurden mehrere Male wiederholt, wonach vollständig
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getrocknet wurde. 0,5 g des so erhaltenen getrockneten
Materials wurde in 2GO ml Dimethylformamid (Wako Junyaku
Kogyo Kabushiki Kaisha) gelöst und dann wurden nach und
nach 0,26 ml Tri-n-butylamin (Tokyo Kasei Kogyo Kabushiki
Kaisha) und 0,14 Isobutylchlorformiat (Aldrich Chemical
Company) zugegeben und eingemischt.
Außerdem wurde Flüssigkeit B durch Auflösen von 17,6 g HSA (Miles Laboratories Inc.) in 6oo ml entionisiertem
Wasser, E .insteilen des pH-Wertes der Lösung auf 9,0 mit η NaOH und anschließende-Zugabe von 5oo ml Dimethylformamid
hergestellt. Danach wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 2 etwa 13,6 g Hydrocortison-21-hemisuccinat-HSA
(nachstehend als H-21-HS-HSA' bezeichnet) in einer Ausbeute von etwa 75% erhalten. Die Steroid (HC-21-HS)-Bindungszahl·
in diesem Konjugat, gemessen nach der Dinitrophenylierungsmethode,
betrug 3,0.
Dana wurden 2oo ml einer 4o mM Veronalpufferlösung, die
15o niM NaCL enthielt (pH 7,8) zu 5o ml einer Suspension
von Polystyrolatexteilchen (Dow Chemical Company) mit
einer Teilchengröße von 0,721 ^m und einer Konzentration
von lC/έ gegeben und die erhaltene Suspension wurde 20
Minuten Upm zentrifugiert. Der so abgetrennte Niederschlag wurde in 25o ml dieser. Pufferlösung suspendiert, danach
unter den gleichen Bedingungen wie vorher zentrifugiert und der Niederschlag isoliert. Danach wurden 25o ml der Pufferlösung,
die 88 mg des vorstehenden erhaltenen Konjugats
enthielt, zu dem schließlich gewonnen Niederschlag (Latexteilchen) gegeben, die so erhaltene Suspension wurde
2 Stunden bei 37 C gehalten und dann wurde die Suspension zentrifugiert, um den Niederschlag zu gewinnen. Der Niederschlag
wurde erneut in 25o ml der Pufferlösung suspendiert und unter den gleichen Bedingungen wie vorher zentrifugiert
und diese Verfahrensweise wurde nocheinmal wiederholt. Der so erhaltene Niederschlag wurde wieder in 25o ml der
genannten Pufferlösung suspendiert, dann wurde Natrium-
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' GRlGlMAL INSPECTED
282725Q
azid zugesetzt, so da3 dessen End.tconzentration auf etwa
0,1% eingestellt wurds. Auf diese Weise wurden 25o ml einer HC-21-HS-HSA-sensibilisierten Latexteilchensuspension
einer Konzentration von etwa 2% erhalten.
Danach wurde 0,05 ml ο,Ι η Mol Hydrocortison mit o,o5 ml
verdünntem Antikörper vermischt, der in gleicher Weise wie im Versuch 1 hergestellt worden war, und mit der
Pufferlösung bis zu einem Titer von ο,Ι η Mol HC-21-HS-Äquivalent/ml
verdünnt worden war, auf einem Objektträger vermischt, wonach o,l ml der vorher erhaltenen
sensibilisierten Latexteilchensuspension zugemischt wurde. Selbst nach Io Minuten wurde keine Agglutination
beobachtet. Wenn jedoch o,o5 ml o,o5 η Mol/ml Hydrocortison und o,o5 ml des verdünnten Antikörpers vermischt
und danach o,l ml der sensibilisierten Latexteilchensuspension auf einem Objektträger zugegeben wurde, so
wurde innerhalb von 2- bis 3 Minuten eine Agglutination beobachtet. Der Titer des Latexreagenz in diesem Beispiel
wurde zu o,o5 η Mol HC-21-HS-Äquivalent/ml bewertet.
INSPECTED
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Claims (1)
- PAT Γ N TA NWÄ V, IiSCHIFF ν. FÜNER STREHL. SCH Ü BEL-H OPF EBBKMSHAUS FINCKMAHIAHILFPLATZ 2 & 3, MÖNCHEN 9O fcO* ' fcVWPOSTADRESSE: POSTFACH 95 O1 6O, D-SOOO MÖNCHEN 95DEA-K 1986PROFESSIONAL REPRÄSENTATIVES AUSO BEFORE THE EUROPEAN PATENT OFFICEKARL UUDWIQ SCHIPFDIPU. CHEM. DR. ALEXANDER V. FÜNERDIPL. ING. PETER STREHLDIPL. CHEM. DR. URSULA SCHÜSEU-HOPFDIPL. ING. DIETER EBBINGHAUSDR. ING. DIETER FINCKTELEFON (Ο89) 4βαθΒ4·TELEX 5-23 565 AURO DTELEGRAMME AUROMARCPAT MÜNCHEN21.Juni 1978MORINAGA MILK INDUSTRY CO., LTD.Latexreagenz aus einem mit Steroid-Serumalbumin-Konjugat sensibilisierten Polymerlatex und Verfahren zur Herstellung dieses Latexreagenz.Patentansprüchel.JVerfahren zur Herstellung eines Latexreagenz für den immunologischen Nachweis von Steroiden in menschli·»· eher Körperflüssigkeit oder flüssigen Ausscheidungen, das Latexteilchenr enthält, die mit einem Steroid-Se~ rumalbumin-Konjugat sensibilisiert sind, dadurch gekennzeichnet, daß mana) durch Umsetzen eines Steroids mit einem Serumalbumin in einem Verhältnis im Bereich von O,5 Mol Steroid/Mol Serumalbumin bis 7,0 Mol Steroid/Mol Serumalbumin ein Steroid-Serumalbumin-Konjugat herstellt, und809881/1017b) immunologisch inerte Latexteilchen mit diesem Steroid-Serumalbumin-Konjugat sensibilisierfc.2,.Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeic hn e t, daß man zur Sens ibilis ie rung der Latexteilchen mit dem Konjugat eine solche Menge des Konjugats einsetzt, daß die unspezifische Agglutination durch die sensibilisierten Latexteilchenausgeschaltet wird, wobei man das Umsetzungsverhältnis zwischen Steroid und Serumalbumin bei der Herstellung des Konjugats und die Teilchengröße des verwendeten Latex berücksichtigt.3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Serumalbumin zur Herstellung des Konjugats Rinderserumalbumin, Pferdeserumalbumin, Schafserumalbumin, Kaninchenserumalbumin oder menschliches Serumalbumin verwendet.4. Verfahren zur Herstellung eines Latexreagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Latexteilchen Polystyrol-, Polybutadien- oder Styrol-Butadien-Copolymer-Latexteilchen verwendet.5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung des Konjugats ein Steroid verwendet, welches eine Antigen-Antikörper-Reaktion mit dem Antikörper eingeht, für den eine der Verbindungen: Östrogen und dessen Metabolite, Progesteron und dessen Metabolite, Androgen und dessen Metabolite und 17-Hydroxy-corticosteron und dessen Metabolite als Hapten wirkt.809881/10176. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid zur Herstellung des Konjugats Östrogen, Progesteron, Androgen,17-Hydroxycorticosteron oder deren Metabolite verwendet.7. Verfahren zur Herstellung eines Latexreagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchengröße des Latex im Bereich von o, 234 jO. Mbis 0,72IaM liegt und die Menge des zur Sensibilisierung dieser Latexteilchen verwendeten Konjugats im Bereich von 0,3aM/o,l g Latexteilchen mit 1,1 ju.M/0,1 g Latexteilchenfliegt.8. Latexreagenz, das zum immunologischen Nachweis von Steroiden in menschlicher Körperflüssigkeit oder flüssigen Ausscheidungen geeignet ist, welches mit einem Steroid-Serumalbumin-Konjugat sensibilisierte Latexteilchen enthält, dadurch gekennzeichnet, daß das Konjugat eine : Steroid-Bindungszahl im Bereich von 0,5 bis 7,0 Moleküle /1 MolekülSerumalbumin aufweist und daß die Latexteilchen mit einer solchen Menge des Konjugats sensibilisiert sind, daß die unspezifische Agglutination ausgeschaltet ist.und welches Agglutination durch die Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen dem Latexreagenz und den Antikörper verursacht, für den das nachzuweisende Steroid als Hapten wirkt.9. Latexreagenz nach Anspruch 8, dadurch gekennze ichn e t , daß es mit dem Konjugat in einer solchen sensibi— lisierenden Menge sensibilisiert ist, daß die unspezifische Agglutination ausgeschaltet ist, wobei diese Menge in Abhängigkeit von der Teilchengröße des verwendeten Latex und der Steroid-Bindungszahl in dem Konjugat festgelegt ist. .808881/1017
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Legal Events
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| 8128 | New person/name/address of the agent |
Representative=s name: VON FUENER, A., DIPL.-CHEM. DR.RER.NAT. EBBINGHAUS |
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| 8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
| D2 | Grant after examination | ||
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