KR101583457B1 - 다중 당단백질의 발현량 및 당질변이의 측정을 통한 간암의 예측방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생체 시료 내에 포함된 당단백질인 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin)의 발현량 및 당질변이(aberrant glycosylation)를 이용하는 간암의 예측방법에 관한 것으로, 상세하게는 상기 다중 바이오마커에 대하여 간암 특이적인 당질변이인 푸코실화와 당단백질의 발현량 변화를 측정하여 간암을 예측하는 방법에 관한 것이다. 상기 푸코실화는 발현량을 기반으로 정규화하고 상기 3종의 당단백질에 대한 가중치를 각각 다르게 적용하여 간암의 특이적인 푸코실화-인덱스를 확립하였다. 즉 본 발명의 간암의 예측방법은 생체시료로부터 분석된 상기 인덱스 값으로부터 간암의 여부를 예측하는 것이며, 종래의 AFP 또는 AFP-L3보다 민감도 및 특이도가 우수하여 예측의 정확도가 높은 간암의 예측방법이다.
Description
본 발명은 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(alpha 2-macroglobulin)의 발현량과 비정상적인 당질화(aberrant glycosylation)를 측정하는 간암의 예측 방법에 관한 것이다.
간암은 국내뿐만 아니라 중국, 일본 등에서 호발하는 암종이며, 예후가 좋지 않아 재발 및 사망률이 매우 높은 암종이다. 간암의 특징은 다른 암종과는 달리 효과적인 항암제가 개발되어 있지 않아 적절한 내과적 항암치료가 거의 힘든 상황이고, 외과적 근치술(간절제, 간이식)과 국소적 치료법인 간동맥화학색전술(Transarterial chemoembolization : TACE), 고주파열 치료 (Radiofrequency ablation : RFA) 등에 의존하고 있다(Hepatology 2008;48:S20-S37).
이와 같은 간암을 진단하는 마커로 AFP(alpha-feto protein)가 이 쓰이고 있지만, 민감성과 특이성이 충분하지 않아 더 나은 진단 마커의 개발이 요구되고 있으며, AFP 이외의 진단마커를 개발하려는 연구 결과, 현재 AFP, DCP(Des-γ carboxyprothrombin), α-L-Fucosidase, Glypican-3, SCCA(Squamous cell carcinoma antigen), GP73(golgi protein 73), HGF(Hepatocyte growth factor), TGF-beta 1(Transforming growth factor-beta 1), VEGF(Vascular endothelial cell growth factor) 등이 발굴되어 임상에서 테스트 되고 있다(Gomaa et al., World J Gastro. 15:1301, 2009). 간암을 진단하는 방법으로는, 혈액 내 단백질 마커를 측정하는 방법 이외에 초음파검사(ultrasound), 전산화단층촬영(CT), 자기공명촬영(MRI) 및 간동맥조영촬영(Angiography) 등의 영상 진단 방법이 있으며, 초음파 검사의 경우, 간암 발생을 알아보는 일차 영상검사 방법으로 많이 이용되고 있는데, 간암의 크기에 따라 민감도에 많은 영향을 받는다. 5cm 이상의 큰 간암 조직의 경우, 75% 이상의 민감도를 보이는 반면, 1cm 미만의 작은 간암의 경우, 약 42%의 민감도를 보인다(Gomaa et al., World J Gastro., 15:1301, 2009). 전산화단층촬영(CT)의 경우, 간암의 진단 효과가 좋은 검사법으로 2cm 이상의 간암의 경우, 거의 100%, 1~2cm의 경우 93%, 1cm 이하의 간암도 60% 가까운 민감도(sensitivity)로 진단할 수 있다(Gomaa et al., World J Gastro., 15:1301, 2009). 하지만 검사 비용이 비교적 비싸므로 일상적인 검진(스크리닝) 검사로 사용하기에는 부담이 되는 검사법이다.
간암의 경우 진단 당시의 종양의 크기가 예후와 관련이 깊은데, 간암 환자의 생존율을 높이는 데 중요한 일은 종양을 조기에 발견하는 것이며, 간암은 우리나라에서 비교적 높은 빈도로 발병하는 질병이므로 일정 연령 이상에서 스크리닝을 통해 조기에 발견하는 것이 간암 관련 사회적 비용을 줄이는 데 중요하다. 그러므로 높은 민감도 및 특이도로 간암을 진단할 수 있는 바이오마커의 발굴이 절실히 요구되고 있으나, 아직까지는 바이오마커 단백질의 발현량의 변화에 따른 간암의 예측방법이 주로 알려져 있는 실정이다.
하지만, 간암의 발생과 진행과정에서 생체분자들의 양적, 질적 변화가 수반된다. 그 중에서 대표적인 질적 변화가 당단백질의 당질변이(aberrant glycosylation)로 N-형이나 O-형 당단백질의 구성요소에 부가적인 당이 결합하거나 반대로 당질의 감소를 통해 다양한 당단백질의 변화가 나타난다고 보고된 바 있다 (Torben et al., Electrophoresis 20, 362-371, 2000).
지금까지 당단백질의 당질변이가 어떻게 암의 발생 및 진행을 유도하는지에 대한 많은 연구들이 수행되었다. 대표적인 예가 당전이효소인 N-아세틸글루코사민 전이효소 V(N-acetylglucosaminyltransferase V; GnT-V)에 의한 당질변이로, N-형 당단백질의 코아 만노스에 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)이 부가되어 만노스-β1,6-GlcNAc 가지가 형성된다. 형성된 가지는 매트립테이즈(matriptase)의 안정화를 통해 암의 전이에 관여하기도 하며(Ihara et al., J. Biol. Chem. 277, 16960-16967, 2002), TIMP-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1)의 젤라티네이즈 (gelatinase) 저해능력을 떨어뜨려 암의 침윤 및 전이 능력을 향상시키기도 한다 (Kim et al., Mol. Cell. Proteome. 7, 1-14, 2008). 또 잘 알려진 다른 예는 시알릴 루이스(sialyl Lewis) 구조이다. 상기 구조는 주로 N-형이나 O-형 당단백질의 당쇄말단에 형성되며, 글루코사민, 퓨코스, 갈락토스, 시알산으로 이루어진다. 이 시알릴 루이스 구조는 혈관에 놓인 암이 전이를 이루는 과정에서 혈관벽에서 발현되는 E-셀렉틴(selectin)의 타겟이 되어 암의 진행에 관여한다(Takada et al., Cancer Res. 53, 354-361, 1993). 실제 암세포의 표면에서 E-셀렉틴의 리간드가 되는 시알릴 루이스 구조의 발현이 유방암에서 림프절 전이와 관련이 있다는 최근의 보고 (Wei et al., Int. J. Surg. Pathol. 18, 193-200, 2010)를 비롯하여 다수의 암에서 E-셀렉틴과 암의 관련성이 보고되고 있다. 이외에도 다양한 당질변이가 암에서 관찰된다는 보고가 있어 특정 당단백질의 당질 변화를 추적함으로써 암의 예측, 진단을 가능케 하는 바이오마커의 개발 가능성이 제시되고 있다.
대표적인 사례를 알파태아단백질(α-fetoprotein; AFP)에서 찾아볼 수 있다. AFP는 태아에서 높은 발현을 보이나 성인이 되는 과정에서 발현이 정지되어 정상의 성인에서는 통상 발견되지 않는다. 그런데 간암환자에게서 그 양이 높게 발현되어 혈액 중에서 AFP가 20㎍/㎖ 이상으로 검출될 경우, 간암의 존재를 예측하는 인자로 사용될 수 있음이 검증되어 현재 FDA의 승인을 받은 간암 바이오마커로 활용되고 있다. 하지만, 문제는 AFP를 통한 간암의 예측에 한계가 있다는 점이다. 암 환자를 예측하는 지표인 민감도(sensitivity)가 50% 수준이며 특히, 간암 환자가 아닌 정상인을 구분하는 특이성(specificity)도 60% 내외여서 사회경제학적 비용을 높인다는 한계가 있다. 그런데 당단백질인 AFP의 N-형 당쇄에 퓨코스(fucose)가 결합된 형태인 AFP는 간암 예측에서 AFP보다 높은 특이성을 나타내며, 작은 간암조직도 예측할 수 있는 높은 민감도를 보인다는 점에서 AFP보다 우수한 간암 바이오마커로 인식되어 (Hirai et al., J. Chromatogr. 604, 91-94, 1992; Zhou et al., World J. Gastroenterol. 12, 1175-1182, 2006) 또 다른 간암 바이오마커로 승인을 받게 되었다. AFP 외에도 현재 FDA의 승인을 받은 대부분의 암 바이오마커는 당단백질이며, CA125나 CA19-9과 같이 당단백질의 당질변화나 당질변화 그 자체가 암 바이오마커로 활용되는 예가 다수 존재한다 (Ludwig et al., Nat. Rev. Cancer 5, 845-856, 2005).
암의 효과적인 치료는 얼마나 빠른 시기에 암을 진단하였느냐에 절대적으로 의존하기 때문에 암의 조기진단과 감시를 가능케 하는 암 바이오마커의 필요성과 진단시장 규모는 매우 크다고 할 수 있다. 하지만, 특정 생체물질이 바이오마커로 활용되기 위해서는 일정한 개발단계를 거쳐 바이오마커로서 가져야 할 요건들이 입증되어야 한다. 바이오마커 개발과정은 대략 두 가지 단계를 포함하는데, 이는 비교적 소수의 시료수로부터 질병과의 연관성을 보이는 후보군을 도출해내는 발굴단계(discovery phase)와 후보군들을 검증해서 높은 민감도(sensitivity)와 특이도 (specificity)를 보이는, 임상적으로 또한 경제적으로 유용한 바이오마커를 선별하는 검증단계(validation phase)로 구분할 수 있다 (Rifai et al., Nat. Biotech. 24, 971-983, 2006). 이 중 검증단계는 많은 수의 후보마커들 중 선별작업 (qualification, verification)을 거쳐 통과된 유망 후보마커들을 다수의 임상시료를 통해 검증해내는 작업으로서, 많은 시간과 임상시료를 요할 뿐만 아니라, 정확하게 후보마커를 검증해 낼 수 있는 민감하고 정밀한 검증기법을 필요로 한다. 하지만, 아직까지 변이 당질을 민감하고 정확하게, 그리고 다수의 시료에서 동시에 추적해 낼 수 있는 검증기법은 없는 상황이다.
최근 고체상 지지체(solid support)에 다양한 종류의 렉틴을 부착하여 당단백질의 변화를 관찰하는 렉틴 에레이(lectin array) 기술들이 개발되어 있다. 하지만, 이 기술은 수차례의 세척과정에서 렉틴-당질 결합의 손실을 가져와 많은 정보의 손실이 생기며, 기계적 민감도가 매우 낮다는 단점과 함께, 당질의 변화를 보이는 당단백질의 정체 (identity)를 알 수 없다는 결정적 단점이 작용한다.
또한, 렉틴과 당의 비교적 약한 결합력을 극복하기 위해 항체를 추가적으로 이용하여 ELISA 방법을 응용한 렉틴-ELISA 방법이 시도되고 있다. 이 경우 당단백질을 포획하는데 사용되는 항체 자체가 당단백질이어서 항체의 당질구조가 분석물질인 당단백질의 당질변화를 추적하는 과정을 간섭하게 된다. 이를 극복하기 위해 항체의 Fc 부분을 파파인으로 절단한 Fab만을 사용하거나, 당쇄에 다른 화학그룹을 결합시키는 시도들이 시행되고 있으나, 변형된 항체의 안정성과 특이성의 변화 등이 문제로 발생하고 있으며 Fc의 당질이 파파인의 작용을 저해하여 절단이 완전히 이루어지지 않았다는 보고도 있다 (Raju et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 341, 797-803, 2006). 질량분석기를 통한 당질 분석방법은 가장 직접적인 당질구조의 정보를 제공한다는 면에서는 장점이 있으나, 초정밀고속처리(High-throughput)가 불가능하고 항체를 기반으로 하는 방법보다 민감도가 훨씬 떨어진다는 단점이 있다. 이와 같은 상황에서 당질변이 기반 암 바이오마커의 개발을 위해서는 민감하고 빠르며, 다수의 당단백질의 당질변화를 추적, 검증할 수 있는 기술은 필수적이라고 할 수 있다.
한국등록특허 제12195616호에 당단백질의 비정상적인 당쇄화에 대한 정보를 이용하여 암을 진단하는 펩티드 마커 및 이를 이용한 암 진단방법에 관한 것이 알려져 있고, 한국등록특허 제0475642호에 암 발생 및 전이에 관여하는 단백질의 당쇄 변화를 측정하여 암을 진단하는 방법 및 이를 이용한 진단 킷트에 관한 것이 알려져 있으며, 미국등록특허 제8623608호에 당단백을 측정하기 위한 방법, 간질환을 검사하기 위한 방법, 당단백의 정량적 결정을 위한 반응제와 간질환의 임상 조건을 위한 인덱스로서의 글리칸 마커 당단백질에 관해 개시되어 있으나, 부담 없이 검진받을 수 있도록 비침습적 임상시료(혈액, 소변 등)를 대상으로 진단이 가능하며, 민감도뿐만 아니라 특이도가 높은 간암을 예측하는 방법으로, 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin)의 발현량과 당질화(glycosylation)를 이용하는 간암의 예측 방법에 관한 것은 알려진 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 생체 시료 내에 포함된 당단백질인 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin)의 발현량 및 당질변이(aberrant glycosylation)를 이용하는 간암의 예측방법을 제공함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 생체 시료 내에 포함된 당단백질인 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin)의 발현량 및 당질변이(aberrant glycosylation)를 이용하는 간암의 예측방법에 있어서,
1) 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 각각에 대하여, 특이적인 항체의 N-형 당쇄를 산화시키는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 산화된 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 각각의 특이적인 항체에, 프로모터를 포함하고 각각 서로 다른 서열을 갖는 이중가닥 DNA를 공유결합시켜 DNA-태깅된 당단백질의 특이적인 항체를 생성하는 단계;
3) 상기 단계 2)에서 생성된, DNA-태깅된 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 항체 각각에 대하여 1차 렉틴 친화 크로마토그래피를 수행하여 특이적인 항체를 정제하는 단계;
4) 상기 단계 3)에서 정제된, DNA-태깅된 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 항체와 생체시료를 반응시키는 단계;
5) 상기 단계 4)에서 생체시료와 반응된, DNA-태깅된 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 항체와 생체시료의 결합물질에 대하여 2차 렉틴 친화 크로마토그래피를 수행하는 단계;
6) 상기 단계 5)에서 렉틴에 결합된, DNA-태깅된 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 항체로부터 각각의 전사체(transcript)를 생산하는 단계;
7) 상기 생산된 전사체의 양을 DNA 칩에서 측정하여 간암 특이적 푸코실화 당질변이를 측정하는 단계;
8) 상기 측정된 간암 특이적 푸코실화 당질변이를 생체 시료 내에 포함된 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 단백질의 발현량으로 정규화(normalization)하는 단계; 및
9) 상기 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 단백질의 발현량으로 정규화한 값(Normalized fuco-form)으로부터 퓨코스화-인덱스(Fuco-index)를 구하고, 이로부터 간암을 예측하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 간암의 예측방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 특이적 항체의 산화된 N-형 당쇄에, 프로모터를 포함하며 알려진 서열로 이루어지고, 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 항체 각각에 대해 서로 다른 서열을 갖는 이중가닥 DNA를 공유결합시켜 DNA-태깅된, 간암 예측용 DNA-태깅된 당단백질 특이적 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 특이적 항체의 산화된 N-형 당쇄에, 프로모터를 포함하며 알려진 서열로 이루어지고, 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 항체 각각에 대해 서로 다른 서열을 갖는 이중가닥 DNA를 공유결합시켜 DNA-태깅된, 간암 예측용 DNA-태깅된 당단백질 특이적 항체;
지지체에 결합된 렉틴;
상기 DNA-태깅된 간암예측용 DNA-태깅된 당단백질 특이적 항체의 DNA로부터 전사체를 제조하기 위한 RNA 폴리머라아제;
상기 RNA 폴리머라아제의 기질; 및
상기 전사체를 인식할 수 있는 서열을 포함하는 핵산 칩;을 포함하는 간암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명은 혈액 내 AFP, HPX 및 A2M의 당단백질의 발현량과 간암 특이적인 당질화(glycosylation)인 푸코실화(fucosylation)를 측정하는 간암의 예측방법에 관한 것이다. 본 발명의 간암 예측방법은 현재 임상에서 사용되고 있는 단일 단백질 마커인 AFP의 혈액 내 발현량을 측정하는 방법에 비해 높은 민감도(sensitivity) 및 특이도(specificity)를 갖는 간암의 예측을 가능케 하였다. 따라서 간암의 예측에서 매우 효과적일 것일 뿐만 아니라, 당질 변이를 측정하는 간암의 예측 방법은 새롭게 발굴되는 다른 암 종의 후보 마커에 적용할 수 있다.
도 1은 DNA-태깅된 항체를 이용하여 정상인과 간암환자의 혈청(bio-fluid)에 포함된 특이적인 당화형태(glycoform)의 항원을 검출하는 과정을 나타낸 도면이다. (A)는 항체의 당쇄를 산화시켜, 항체와 T7 프로모터 서열을 포함하는 이중나선 DNAfmf 결합시킨 DNA-항체 복합체 제작과정이며, (B)는 항체의 산화된 N-glycan에 포함된 알데히드 그룹과 올리고뉴클레오티드의 5'에서 히드라진 그룹이 공유결합을 형성하는 것을 나타낸 것이며, (C)는 프로브 칵테일이 혈청 등의 체액에 혼합하여 바이오 마커-항체 복합체 형성 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1에서 AFP의 항체를 산화시킨 후, 비오틴 또는 항체를 결합시키고, 결합 여부를 아비딘-HRP를 이용한 웨스턴블랏으로 확인한 결과이다.
도 3은 실시예 2에서 개시한 DNA-항체 복합체가 콘카나발린 A(Concanavalin A)가 인식할 수 없는 구조로 당쇄의 변형이 일어난 것을 나타낸 것이다.
도 4는 AFP를 결합시킨 DNA-항체-항원 복합체의 경우, 복합체 내에 존재하는 항원인 AFP에 의해 콘카나발린 A(Con-A)에 의해 결합되고 이를 정제에 이용할 수 있음을 보여주는 도면이다.
도 5는 DNA-항체 복합체가 렉틴과 결합하는지 여부를 다양한 렉틴과의 결합반응 정도를 나타낸 그래프로, Con A(Concanavalin A), LCA(Lens culinaris lectin), AAL(Aleuria aurantia lectin), L-PHA(phytohemagglutinin L4), E-PHA(phytohemagglutinin E4), DSA(Datura stramonium), SSA(Sambucus sieboldiana lectin) 및 E-셀렉틴(E-selectin)의 렉틴에 대하여 상대적인 결합정도를 확인한 도면이다.
도 6은 실시예 3에서 얻어진 산물이 RNA 전사체임을 나타내주는 도면이다. A는 DNA-태깅된 항체가 NTP 존재 유무에 따라 T7 폴리머라아제와의 반응여부를 확인한 도면으로 2%(w/v)의 아가로스 겔에서 실시한 결과이고, B는 DNase, RNase 또는 RNase 저해제와 함께 처리되었을 때의 RNA 전사체 생산을 확인한 것으로, 여기에서 "DNA-Ab"는 항원이 결합된 상태의 DNA-항체-항원 복합체를 의미한다. C는 전사체와의 반응 시간을 확인한 것으로 20분 이상에서 포화되는 것을 확인한 그래프이다.
도 7은 Hep3B 세포에서 FUT8의 발현에 따른 알파-2-마크로글로블린(A2M)의 푸코실화 형태(Fuco-form)의 고감도 정량검출을 확인한 도면이다. A와 B는 FUT8 및 shFUT8의 처리에 따른 FUT8(Fucosyltransferase 8)의 발현량을 RT-PCR로 확인한 젤사진(A)과 그래프(B)이고, C는 A2M 발현을 면역침강법으로 확인한 것이고, D는 DNA-태깅된 항A2M 항체와 결합을 통해 확인한 것이다.
도 8은 DNA-태깅된 항체 기반의 방법이 면역침강법의 면역블랏(immunoblot)에 비교하여 민감도가 증진된 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다. A는 FUT8 발현의 내생적인(endogenous) 발현(mock) 또는 간섭된 Hep3B 세포로부터 획득된 매체 및 야생형(FUT8+/+)과 넉아웃(FUT8-/-) FUT8을 포함하는 MEF 세포로부터 획득한 매체를 확인한 것을 나타냈으며, B는 MEF 세포에서 hAFP 유전자가 동일하게 과발현되지만, AFP-L3의 경우는 FUT8의 넉아웃(FUT8-/-) 세포주에서 발현되지 못하고, 야생형(FUT8+/+)에서만 강력하게 발현하는 것을 AAL을 이용하여 확인한 결과이다. C는 푸코스화 검출의 민감도를 확인하기 위하여, 면역침강(IP)-렉틴 블랏 방식으로 분석 결과를 나타낸 것이고, D는 푸코스화 검출의 민감도를 확인하기 위하여 상기 C와 동일한 조건으로 분석한 항 DNA-태깅 항체 기반의 결과를 나타낸 것이다. E는 IP-렉틴 블랏 방법과 DNA-태깅 항체 기반의 검출 민감도를 그래프로 비교하여 나타낸 것이다.
도 9는 DNA-태깅된 항체 기반의 당단백질 분석 방법으로 임상시료(혈청)을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다. A는 두개의 바이얼에 cy3 또는 cy5-표지된 UTP를 각각 10:0 내지 0:10의 비율 범위 내에서 생성된 전사체를 DNA 마이크로 어레이 칩에서 3번 반복하여 정량화한 것이다. B는 상기 A로부터 획득한 형광 강도를 이용하여 작성한 표준 곡선이다. 1:9~9:1의 범위의 두 템플릿 비율에 대응하는 532nm와 635nm 파장에서의 형광강도의 log2 비율로 작성된 것이다. C는 간암환자 임상시료로부터 푸코실화 AFP, HPX 및 A2M을 동시에 분석한 것이다. D는 log2 비율로 AFP, HPX 및 A2M의 푸코실화 정도, 발현량 및 정규화시킨 푸코실화 정도(Normalized Fuco-form = Log2(Fuc-BHCC/Fuc-BNor)-Log2([B]HCC/[B]Nor))를 그래프로 나타낸 것이다.
도 10은 41명의 건강한 정상인, 29명의 간염이 있는 정상인, 34명의 간경변이 있는 정상인 및 92명의 간암환자에 대하여, 측정된 AFP, HPX 및 A2M의 당질변이(푸코실화)를 기준군(reference group; 건강한 사람으로 확인된 그룹)에 대하여 각각 정규화(normalization)한 결과를 그룹별로 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명의 간암 예측방법으로 획득한 인덱스 값(If)을 나타낸 것으로, A는 정상인 92명, 간암환자 104명에 대한 테스트 군의 결과이고, B는 상기 테스트 군의 결과를 검증하기 위하여 측정한 정상인 27명(13명 정상, 6명 간염 및 8명의 간경변)으로 구성된 군과, 간암환자 23에 대한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 간암(HCC)와 정상인(Normal individual) 사이를 구별하기 위한, 다중 바이오마커인 Fuc-{AFP, HPX, A2M}, Fuc-AFP 및 AFP의 ROC 그래프이다. Fuc-{AFP, HPX, A2M}의 AUROC는 0.889이며, Fuc-AFP 및 AFP의 AUROC는 각각 0.809 및 0.723이다.
도 2는 실시예 1에서 AFP의 항체를 산화시킨 후, 비오틴 또는 항체를 결합시키고, 결합 여부를 아비딘-HRP를 이용한 웨스턴블랏으로 확인한 결과이다.
도 3은 실시예 2에서 개시한 DNA-항체 복합체가 콘카나발린 A(Concanavalin A)가 인식할 수 없는 구조로 당쇄의 변형이 일어난 것을 나타낸 것이다.
도 4는 AFP를 결합시킨 DNA-항체-항원 복합체의 경우, 복합체 내에 존재하는 항원인 AFP에 의해 콘카나발린 A(Con-A)에 의해 결합되고 이를 정제에 이용할 수 있음을 보여주는 도면이다.
도 5는 DNA-항체 복합체가 렉틴과 결합하는지 여부를 다양한 렉틴과의 결합반응 정도를 나타낸 그래프로, Con A(Concanavalin A), LCA(Lens culinaris lectin), AAL(Aleuria aurantia lectin), L-PHA(phytohemagglutinin L4), E-PHA(phytohemagglutinin E4), DSA(Datura stramonium), SSA(Sambucus sieboldiana lectin) 및 E-셀렉틴(E-selectin)의 렉틴에 대하여 상대적인 결합정도를 확인한 도면이다.
도 6은 실시예 3에서 얻어진 산물이 RNA 전사체임을 나타내주는 도면이다. A는 DNA-태깅된 항체가 NTP 존재 유무에 따라 T7 폴리머라아제와의 반응여부를 확인한 도면으로 2%(w/v)의 아가로스 겔에서 실시한 결과이고, B는 DNase, RNase 또는 RNase 저해제와 함께 처리되었을 때의 RNA 전사체 생산을 확인한 것으로, 여기에서 "DNA-Ab"는 항원이 결합된 상태의 DNA-항체-항원 복합체를 의미한다. C는 전사체와의 반응 시간을 확인한 것으로 20분 이상에서 포화되는 것을 확인한 그래프이다.
도 7은 Hep3B 세포에서 FUT8의 발현에 따른 알파-2-마크로글로블린(A2M)의 푸코실화 형태(Fuco-form)의 고감도 정량검출을 확인한 도면이다. A와 B는 FUT8 및 shFUT8의 처리에 따른 FUT8(Fucosyltransferase 8)의 발현량을 RT-PCR로 확인한 젤사진(A)과 그래프(B)이고, C는 A2M 발현을 면역침강법으로 확인한 것이고, D는 DNA-태깅된 항A2M 항체와 결합을 통해 확인한 것이다.
도 8은 DNA-태깅된 항체 기반의 방법이 면역침강법의 면역블랏(immunoblot)에 비교하여 민감도가 증진된 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다. A는 FUT8 발현의 내생적인(endogenous) 발현(mock) 또는 간섭된 Hep3B 세포로부터 획득된 매체 및 야생형(FUT8+/+)과 넉아웃(FUT8-/-) FUT8을 포함하는 MEF 세포로부터 획득한 매체를 확인한 것을 나타냈으며, B는 MEF 세포에서 hAFP 유전자가 동일하게 과발현되지만, AFP-L3의 경우는 FUT8의 넉아웃(FUT8-/-) 세포주에서 발현되지 못하고, 야생형(FUT8+/+)에서만 강력하게 발현하는 것을 AAL을 이용하여 확인한 결과이다. C는 푸코스화 검출의 민감도를 확인하기 위하여, 면역침강(IP)-렉틴 블랏 방식으로 분석 결과를 나타낸 것이고, D는 푸코스화 검출의 민감도를 확인하기 위하여 상기 C와 동일한 조건으로 분석한 항 DNA-태깅 항체 기반의 결과를 나타낸 것이다. E는 IP-렉틴 블랏 방법과 DNA-태깅 항체 기반의 검출 민감도를 그래프로 비교하여 나타낸 것이다.
도 9는 DNA-태깅된 항체 기반의 당단백질 분석 방법으로 임상시료(혈청)을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다. A는 두개의 바이얼에 cy3 또는 cy5-표지된 UTP를 각각 10:0 내지 0:10의 비율 범위 내에서 생성된 전사체를 DNA 마이크로 어레이 칩에서 3번 반복하여 정량화한 것이다. B는 상기 A로부터 획득한 형광 강도를 이용하여 작성한 표준 곡선이다. 1:9~9:1의 범위의 두 템플릿 비율에 대응하는 532nm와 635nm 파장에서의 형광강도의 log2 비율로 작성된 것이다. C는 간암환자 임상시료로부터 푸코실화 AFP, HPX 및 A2M을 동시에 분석한 것이다. D는 log2 비율로 AFP, HPX 및 A2M의 푸코실화 정도, 발현량 및 정규화시킨 푸코실화 정도(Normalized Fuco-form = Log2(Fuc-BHCC/Fuc-BNor)-Log2([B]HCC/[B]Nor))를 그래프로 나타낸 것이다.
도 10은 41명의 건강한 정상인, 29명의 간염이 있는 정상인, 34명의 간경변이 있는 정상인 및 92명의 간암환자에 대하여, 측정된 AFP, HPX 및 A2M의 당질변이(푸코실화)를 기준군(reference group; 건강한 사람으로 확인된 그룹)에 대하여 각각 정규화(normalization)한 결과를 그룹별로 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명의 간암 예측방법으로 획득한 인덱스 값(If)을 나타낸 것으로, A는 정상인 92명, 간암환자 104명에 대한 테스트 군의 결과이고, B는 상기 테스트 군의 결과를 검증하기 위하여 측정한 정상인 27명(13명 정상, 6명 간염 및 8명의 간경변)으로 구성된 군과, 간암환자 23에 대한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 간암(HCC)와 정상인(Normal individual) 사이를 구별하기 위한, 다중 바이오마커인 Fuc-{AFP, HPX, A2M}, Fuc-AFP 및 AFP의 ROC 그래프이다. Fuc-{AFP, HPX, A2M}의 AUROC는 0.889이며, Fuc-AFP 및 AFP의 AUROC는 각각 0.809 및 0.723이다.
본 발명은 생체 시료 내에 포함된 당단백질인 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin)의 발현량 및 당질변이(aberrant glycosylation)를 이용하는 간암의 예측방법에 있어서,
1) 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 각각에 대하여, 특이적인 항체의 N-형 당쇄를 산화시키는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 산화된 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 항체 각각의 특이적인 항체에, 프로모터를 포함하고 알려진 서열로 이루어지며, 각각 서로 다른 서열을 갖는 이중가닥 DNA를 공유결합시켜 DNA-태깅된 당단백질의 특이적인 항체를 생성하는 단계;
3) 상기 단계 2)에서 생성된, DNA-태깅된 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 각각에 대하여 1차 렉틴 친화 크로마토그래피를 수행하여 특이적인 항체를 정제하는 단계;
4) 상기 단계 3)에서 정제된, DNA-태깅된 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 항체와 생체시료를 반응시키는 단계;
5) 상기 단계 4)에서 생체시료와 반응된, DNA-태깅된 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 항체와 생체시료의 결합물질에 대하여 2차 렉틴 친화 크로마토그래피를 수행하는 단계;
6) 상기 단계 5)에서 렉틴에 결합된, DNA-태깅된 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 항체로부터 각각의 전사체(transcript)를 생산하는 단계;
7) 상기 생산된 전사체의 양을 DNA 칩에서 측정하여 간암 특이적 푸코실화 당질변이를 측정하는 단계;
8) 상기 측정된 간암 특이적 푸코실화 당질변이를 생체 시료 내에 포함된 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 단백질의 발현량으로 정규화(normalization)하는 단계; 및
9) 상기 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 단백질의 발현량으로 정규화한 값(Normalized fuco-form)으로부터 퓨코스화-인덱스(Fuco-index)를 구하고, 이로부터 간암을 예측하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 간암의 예측방법에 관한 것이다.
상기 단계 1)에서 항체의 당쇄를 NaIO4로 산화시키는 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 2)에서, DNA는 5' 말단을 히드라진 그룹으로 공유 결합시킨 DNA인 것이 바람직하고, T7 프로모터 및 전사체를 코딩하는 서열을 포함하는 센스가닥의 DNA 및 상기 DNA와 상보적인 서열을 갖는 안티센스 가닥의 DNA를 혼성화하여 획득한 이중가닥의 DNA인 것이 바람직하다.
상기 단계 2)와 단계 3) 사이에, NaBH4를 이용하여 상기 DNA와 각각의 당단백질 특이적 항체의 결합을 안정화시키는 과정을 부가하는 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 단계 3)에서 렉틴 친화 크로마토그래피는 L4-PHA(Phytohemagglutinin-L4), LCA(lens culinaris agglutinin), DSA(Datura stramonium agglutinin), AAL(Aleuria aurantia agglutinin), 셀렉틴(Selectin), Con A(Concanavalin-A), WGA(Wheat germ agglutinin), 자칼린(Jacalin), SNA (Sambucus Nigra agglutinin) 및 갈렉틴 (galectin) 중에서 선택된 하나 이상의 렉틴을 이용하여 DNA-태깅 당단백질을 정제하는 것이 바람직하지만, 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 5)에서 렉틴 친화 크로마토그래피는 L4-PHA(Phytohemagglutinin-L4), LCA(lens culinaris agglutinin), DSA(Datura stramonium agglutinin), AAL(Aleuria aurantia agglutinin), 셀렉틴(Selectin), Con A(Concanavalin-A), WGA(Wheat germ agglutinin), 자칼린(Jacalin), SNA(Sambucus Nigra agglutinin) 및 갈렉틴 (galectin) 중에서 선택된 하나 이상의 렉틴을 이용하여 DNA-태깅 당단백질 특이적 항체-항원 결합체를 포집하는 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 6)에서 형광 표지된 기질을 사용하여 형광을 띠는 전사체를 생산하는 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 8)에서 정규화(normalization)는 하기 식(1)을 이용하여 정규화하는 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.
식(1)
Normalized Fuco-form = Log2(Fuc-BHCC/Fuc-BNor)-Log2([B]HCC/[B]Nor)
[상기 식(1)에서 Fuc-BHCC는 간암환자(HCC)의 시료에서 획득한 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin)의 푸코실화(fucosylation) 정도를 나타내고, Fuc-BNor는 정상인(Normal individual)의 시료에서 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin)의 푸코실화(fucosylation) 정도를 나타내고, [B]HCC는 간암환자(HCC)의 시료에서 획득한 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin)의 발현량을 나타내고, [B]Nor는 정상인(Normal individual)의 시료에서 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin)의 발현량을 나타낸다.]
또한, 상기 식(1)에 사용된 정상군은 추적에 의해 완벽하게 정상임을 입증 받은 기준군(reference group)으로부터 획득된 각각의 결과에 대한 평균값을 이용하는 것이 바람직하다.
상기 단계 9)에서 정규화된 당질변이(Normalized Fuco-Form)는 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin)에 대하여, 가중치(weighted values)를 하기 식(2)와 같이 적용한 푸코실화-인덱스(Fuco-Index; If)으로부터 간암을 예측하는 것이 바람직하다.
식(2)
푸코실화-인덱스(If) = 0.53Log2(RAFP)+0.29Log2(RHPX)+0.18Log2(RA2M)
상기 RAFP는 정규화한 AFP의 당질변이 값이고, RHPX는 정규화한 HPX의 당질변이 값이며, RA2M은 정규화한 A2M의 당질변이 값이다.
상기 푸코실화-인덱스(Fuco-Index; If)의 범위는 -0.5 내지 2.5이고, 상기 푸코실화-인덱스가 0.38 이상인 경우 간암으로 예측하며, 0.38 미만인 경우 정상으로 예측하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 특이적 항체의 산화된 N-형 당쇄에, 프로모터를 포함하며 알려진 서열로 이루어지고, 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 각각에 대해 서로 다른 서열을 갖는 이중가닥 DNA를 공유결합시켜 DNA-태깅된, 간암 예측용 DNA-태깅된 당단백질 특이적 항체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 특이적 항체의 산화된 N-형 당쇄에, 프로모터를 포함하며 알려진 서열로 이루어지고, 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 각각에 대해 서로 다른 서열을 갖는 이중가닥 DNA를 공유결합시켜 DNA-태깅된, 간암 예측용 DNA-태깅된 당단백질 특이적 항체인 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 각각에 대하여 1종 이상의 항체를 포함하고; 지지체에 결합된 렉틴; 상기 DNA-태깅된 간암예측용 DNA-태깅된 당단백질 특이적 항체의 DNA로부터 전사체를 제조하기 위한 RNA 폴리머라아제; 상기 RNA 폴리머라아제의 기질; 및 상기 전사체를 인식할 수 있는 서열을 포함하는 핵산 칩;을 포함하는 간암 진단용 키트에 관한 것이다.
상기 기질은 발색 또는 발광 기질을 추가적으로 포함할 수 있으며, 추가적으로 포함되는 기질은 UTP인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다. 상기 렉틴은 L4-PHA(Phytohemagglutinin-L4), LCA(lens culinaris agglutinin), DSA(Datura stramonium agglutinin), AAL(Aleuria aurantia agglutinin), 셀렉틴(Selectin), Con A(Concanavalin-A), WGA(Wheat germ agglutinin), 자칼린(Jacalin), SNA(Sambucus Nigra agglutinin) 및 갈렉틴(galectin) 중에서 선택된 하나 이상인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
[실험방법 및 시료준비]
1. 세포의 형질전환
Hep3B 세포를 제조사의 지시에 따라, 인간 FUT8 유전자 또는 shRNA에 해당하는 유전자를 전기충격기(electroporator)를 이용하여 플라스미드 벡터에 형질전환시켰다. RT-PCR과 렉틴 블랏 분석을 이용하여 스크리닝함으로써, 안정한 클론을 선별하였으며, shRNA에 대한 DNA 서열은 표 1에 개시하였다.
| 5'-3' sequence(서열번호) | ||
| T7 promoter | Hydrazine-ATGGAATTCCTAATACGACTCACTATAGGG (1) | |
| DNA-tag sequence |
AFP | GTTCTCATAAAATTGCCGCCGGTCCATAGCTTTTTTTTTT-Biotin (2) |
| HPX | ATTACCACCCCTATCTCACCGAGTTCGATGTTTTTTTTTT-Biotin (3) | |
| A2M | GTATTCTAATGCACCCAACCCTGAGCGTCTTTTTTTTTTT-Biotin (4) | |
| DNA microarray probes sequence |
AFP | GCTATGGACCGGCGGCAATTTTATGAGAAC (5) |
| HPX | CATCGAACTCGGTGAGATAGGGGTGGTAAT (6) | |
| A2M | AGACGCTCAGGGTTGGGTGCATTAGAATAC (7) | |
| FUT8 shRNA | CCGGGTCTATAATGACGGATCTATACTCGAGTATAGATCCGTCATTATAGACTTTTTG (8) | |
각각의 클론은 10% fetalbovine serum과 1% 페니실린과 스트렙토마이신의 항생제 용액을 포함하는 RPMI 배지에서 37℃, 5% CO2 조건 하에서 보관하였다. MEF(Mouse embryonic fibroblast) 및 Fut8-/- 변형세포는 RIKEN 연구소의 Taniguchi 그룹으로부터 제공받았으며, AFP 유전자를 그대로 또는 넉아웃 시킨 상기 세포에 형질전환하였다.
2. 임상시료
혈청 시료는 부산대학교 양산병원으로부터 제공받았으며, 한국생명공학연구원의 생명윤리위원회(KRIBB-IRB-20110808-04)로부터 승인을 받았다. HCV, 알코올 중독, 비알코올성 지방간이 있는 경우는 결과의 혼선을 최소화하기 위해 배제하였다. HCC 환자의 혈액 시료는 채취하기 전에 어떠한 종류의 약물처방을 하지 않은 것을 취하였다.
혈액 시료는 Clot-activator 처리된 폴리프로필렌(polypropylene) 진공모세관 튜브로 채취한 다음 상온에서 30분간 인큐베이션 하였다. 이후, 1,100g에서 1분동안 원심분리하여 피브리노겐(fibrinogen) 응집체 및 다른 세포성분을 제거하고 상등액만을 수집하여 분주하고 -80℃에서 사용할 때까지 보관하였다. 해동 후에 혈액 시료를 사용하고, 사용하고 남은 시료도 두번 사용하지 않았다.
3.
웨스턴
및 렉틴
블랏
분석
단백질은 10~12% SDS-PAGE 젤에서 전기영동법으로 분리하고, PVDF 멤브레인(Immobilon-P, Millipore)에 이동시켰다. 웨스턴블랏의 멤브레인은 0.05%(v/v) Tween 20과 5% (w/v) 스킴밀크(skim milk)를 포함하는 TBS 완충용액으로 블로킹하였고, 렉틴 블랏의 멤브레인은 3%(w/v) BSA를 포함하는 TBS 완충용액으로 블로킹하였다.
항-A2M(Santa Cruz Biotechnology)와 항-AFP(Abcam) 항체를 1차 항체로 사용하였고, 비오틴-컨쥬게이션된 AAL(Aleuria aurantia lectin)과 LCL(Lens culinaris lectin)을 글리칸 모이어티의 프로브로 사용하였다. HRP-라벨된 2차 항체(Cell Signaling) 또는 HRP-아비딘(avidin) 컨쥬게이트(Vector Laboratories)로 인큐베이션 한 후, 멤브레인에 웨스턴 블랏 검출 시약인 ECL 용액(GE Healthcare)으로 반응시키고, 1~2분 동안 X-ray 필름으로 감광하였다.
4.
역전사
중합효소 연쇄 반응(
Reverse
-
transcription
PCR
)
RNeasy Miniprep kit (Qiagen)를 이용하여 세포로부터 총 RNA를 추출하고 정량한 후, 역전사 키트(reverse-transcription kit; Nanohelix)를 이용하여 역전사 연쇄중합반응(RT-PCR)으로 cDNA를 합성하였다.
2㎍의 cDNA를 이용하여 FUT8 유전자의 mRNA 유전자 수준을 측정하였다. 이때 사용한 프라이머는 정방향 5'-TGATGCCTCTGCAAACTTCC-3'(서열번호 9)와 역방향 5'-CGTCCTTCCCAATTTCCTGT-3'(서열번호 10)를 이용하였다.
5. 항체에 올리고뉴클레오티드의 접합
T7 프로모터 서열을 포함하고, 40-mer는 특유한(unique) 서열이고, 30-mer는 히드라진(hydraine) 변형된 서열로 이루어진 70-mer의 비오틴화된 올리고뉴클레오티드(100pM) 10㎕를 유전자증폭장치(thermocycler)에서 인큐베이션하여 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 준비하였다. 10㎍의 항체를 암 조건에서 1M의 NaIO4를 포함하는 PBS 완충용액에 처리하였다. 산화된 항체는 이중가닥 올리고뉴클레오티드와 함께 12시간 동안 상온에서 인큐베이션하여 알데히드-히드라진 링크를 형성하였다. 형성된 알데히드-히드라진 링크는 상온에서 1시간 동안 5mM의 NaBH4를 처리하여 안정화시켰다.
Zeba desalting 칼럼(Thermo Scientific)을 이용하여 DNA-태깅된 항체 부분(fraction)에 포함된 분자량 5kDa 이하를 제거하였다.
6.
면역침강(Immunoprecipitation, IP)과
렉틴 크로마토그래피(
lectin
chromatography
)
분자량 10kDa 이하를 컷오프(제거)하는 Centricon 필터(Millipore)를 이용하여 Hep3B 또는 HepG2 세포를 포함하는 배지로부터 분비된 프로테옴(단백체)을 회수하였다.
혈청 내 타겟을 검출하기 위해, 혈청 시료는 4℃에 단백질 G-커플링된 Sepharose 비드로 미리 세척하였고, 상등액은 면역침강을 위해 회수되었다. 100㎕의 혈청에 대하여, 5㎍의 올리코뉴클레오티드-태깅된 항-A2M(Santa Cruz Biotechnology), 항-AFP(Abcam) 및 항-hemopexin(Abcam) 모노클로날 항체와 함께 2시간동안 4℃에서 인큐베이션을 실시하고, 항체-항원 복합체는 다양한 렉틴 칼럼으로 분리하였다. 비드들은 4℃에서 1㎖의 PBS 완충용액으로 세척하고, 렉틴 크로마토그래피 항체-항원 복합체는 렉틴 비드에 결합한 형태로 T7 폴리머라아제 반응과 렉틴/웨스턴블랏 분석을 수행하였다.
7.
RNA
전사체(
transcripts)
의 합성
RNA 전사체는 T7 RNA 폴리머라아제 키트(Promega)를 이용하여 합성하였다. 간략하게는 37℃에서, 20unit의 T7 폴리머라아제를 넣은 40mM Tris(pH 7.9), 6mM MgCl2, 2 mM spermidine, 10mM DTT, 10mM NaCl 및 0.25mM UTP-제거된 NTPs를 포함하며, 0.25mM Cyanine3-UTP 또는 Cyanine5-UTP(Enzo Life Sciences)를 포함하는 50㎕의 반응 완충용액에서 DNA-태깅된 항체 단독 또는 항원이 결합된 항체 복합체를 인큐베이션하였다.
8.
DNA
마이크로어레이
아민 코팅된 슬라이드(Luminano)는 PBS 완충용액에 용해시킨 1%(w/v)의 글루타르알데히드(glutaraldehyde)에 2시간 동안 인큐베이션하고, 물로 세척하고 공기로 건조하였다.
표 1에 개시한 올리고뉴클레오티드 프로브들은 0.05%의 SDS를 포함하는 50pM의 3X SSC(saline sodium citrate) 완충용액에 녹여 준비하였고 마이크로어레이 장치(Proteogen)를 이용하여 슬라이드 위에 스팟팅하였다. 스팟팅한 후에, 슬라이드는 60%의 습도가 유지되는 챔버 안에서 12시간 동안 상온 조건으로 인큐베이션 하였고, 2mg/㎖의 NaBH4으로 5분 동안 블로킹하였다. 이후 0.2% SDS로 5분 동안 세척하고, 공기로 건조하였다.
RNA 전사체는 혼성화 용액(0.5% SDS를 포함하는 5X SSC)으로 희석하였고, 55℃에서 12시간 동안 마이크로어레이 칩 위에 고정된 프로브와 혼성화시켰다. 커버슬립을 제거하고, 0.1% SDS를 포함하는 2X SSC로 10분 동안 슬라이드를 세척하고 공기로 건조하였다. 이후, 슬라이드는 형광스캐너(GenePix 4200 professional, Axon)로 스캔하고, 형광 강도는 GenePix Pro 6.1 software(Axon)를 이용하여 측정하였다.
9.
ELISA
(
Enzyme
-
linked
immunosorbent
assay
)
분석
AFP와 A2M의 ELISA kit는 Abcam에서 구입하였고, HPX는 USCN로부터 구입하였다. 모든 어세이는 기본적으로 제조사의 요구에 따라 실시하였다.
혈청(Sera)은 AFP, HPX 및 A2M에 대하여 PBS 완충용액으로 2배, 50배, 200배로 희석하여 어세이를 수행하였다.
10. 통계 분석
본 발명의 통계분석은 MedCalc 소프트웨어를 이용하여 ROC(receiver operating characteristic) 분석과 AUROC(area under the ROC) 값의 분석을 수행하였다. ROC의 AUROC 값으로부터 정상군(non-HCC)과 환자군(HCC)을 구별하는 민감도(sensitivity) 및 특이도(specificity)를 계산하였고, p값이 0.05 미만일 때, 통계적으로 유의한 것으로 하였다.
실시예
1.
DNA
-태깅된 항체 복합체의 생산
알파태아단백질(AFP) 항체에 결합되어 있는 당쇄를 산화시키기 위해 10㎍의 IgG 2a형 AFP 항체를 50mM의 NaIO4를 포함하는 PBS 완충용액에서 산화시켰다. 반응은 빛을 차단한 암 조건으로, 상온에서 10분간 이루어졌다. 제염 칼럼으로 산화제 및 염을 제거한 후, 0.2nmole의 올리고뉴클레오티드를 결합시켰다. 결합될 올리고뉴클레오티드는 5' 말단에 히드라진이 결합된 30bp의 T7 프로모터 DNA, 40bp의 코딩 DNA, 5' 말단에 비오틴(biotin)을 표지한 상보적 서열의 70bp DNA를 어닐링 (annealing)하여 얻어졌으며, 올리고뉴클레오티드에 결합된 히드라진과 산화 항체의 알데히드기를 결합시켜 DNA-항체 복합체를 형성시켰다(도 1).
형성된 DNA와 항체 간의 결합을 안정화시켜주기 위해 13 mM의 NaBH4로 1분간 환원시켜주었다. 반응이 끝난 후 제염 칼럼을 이용하여 염을 제거하였다. 또한, 올리고뉴클레오티드 대신에 히드라진 비오틴과 산화항체를 반응시켜 결합을 비교하였다. 산화된 항체에 올리고뉴클레오티드 또는 히드라진 비오틴이 결합되었는지 알아보기 위해 웨스턴블랏을 수행하였다. 아비딘-HRP(HorseRadish Peroxidase)를 처리하여 비오틴의 결합 여부를 통하여 검증하였다.
도 2에 개시한 바와 같이, 산화된 항체에서는 볼 수 없었던 비오틴 결합이 히드라진 비오틴과 올리고뉴클레오티드가 결합된 항체에서 관찰되었다. 또한, 뉴클레오티드 결합에 의한 분자량의 증가도 관찰되어, 항체에 올리고뉴클레오티드가 결합되어 DNA-항체 복합체가 생성되었음을 확인하였다.
실시예
2. 렉틴을 이용한
AFP
-
DNA
-항체 복합체 정제
다중 항체와 렉틴을 이용하여 간암의 예측에 있어서, 문제점은 각각의 항체가 당쇄를 보유하는 당단백질이라는 점이다. 따라서 본 발명에서는 DNA를 태깅함으로써, 당쇄 구조가 파괴되도록 하였고, 당쇄 구조의 파괴 여부를 확인하기 위하여, 'DNA-항체 복합체'를 분석물질로 하여 렉틴의 일종인 콘카나발린 A 칼럼 상에서 렉틴 친화 크로마토그래피를 수행하였다.
평형화 완충용액은 1mM의 CaCl2를 포함하는 PBS 완충용액이다. 이동속도를 0.2 ㎖/min로 고정하고 용출 완충용액(0.4M methylpyranomannoside in PBS, pH 7.2)을 이용하여 용출하였으며, 흘러나온 분획(flow-through fraction, 도면에서 "F" 로 표시함), 세척한 분획(washing fraction, 도면에서 "W"로 표시함), 용출 분획(elution fraction, 도면에서 "E"로 표시함)으로 분리하였다. 분획의 일부분을 취하여 전기영동을 실시한 후 아비딘-HRP를 이용하여 웨스턴블랏 분석하였다 (도 3).
그 결과, 대부분의 항체가 콘카나발린 A 칼럼에 결합되지 않고 흘러나왔다. 이는 DNA-항체 복합체의 당쇄구조가 콘카나발린 A에 의해 인식되지 않는 구조로 변형되었고, 또한 추가적으로 당쇄에 결합한 DNA가 콘카나발린 A의 결합을 방해하는 인자로 작용하는 것으로 해석되었다.
본 발명의 방법을 위해서 또 하나의 필수 확인사항으로서, 당쇄구조가 파괴된 DNA-항체 복합체와 그 항원의 일종인 AFP를 반응시켜 얻어지는 DNA-항체-항원 복합체가 항원에 있는 당쇄에 의해 렉틴의 일종인 콘카나발린 A칼럼에서 결합되는지의 여부를 조사하였다. 상온에서 같은 mole수의 항원(본 실시예에서는 AFP를 이용함)과 DNA-항체 복합체를 PBS 완충용액에 넣고 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후 세척하고, 상기 조건에서 콘카나발린 A 칼럼을 이용한 렉틴 친화 크로마토그래피를 실시하였다. 그 결과 일부 항원(AFP)과 DNA-항체 복합체가 흘러나온 분획(flow-through fraction, 도면에서 "F"로 표시함)에서 검출되었으나, 상당수의 AFP와 DNA-항체가 용출 분획(elution fraction, 도면에서 "E"로 표시함)에서 발견되었다 (도 4).
DNA-항체 복합체 자체만으로는 렉틴에 결합하지 않는 도 3의 결과로부터 DNA-항체 복합체에 반응하여 결합된 항원의 당쇄가 렉틴(즉, 콘카나발린 A)에 부착되었음을 알 수 있었다. 즉, 본 실시예 2를 통하여 DNA-항체-항원 복합체는 항원에 존재하는 당쇄구조에 의해서만 렉틴과 결합할 수 있음을 확인할 수 있었다.
또한, DNA-항체 복합체가 렉틴과 결합하는지 여부를 다양한 렉틴과의 결합반응 정도를 Con A(Concanavalin A), LCA(Lens culinaris lectin), AAL(Aleuria aurantia lectin), L-PHA(phytohemagglutinin L4), E-PHA(phytohemagglutinin E4), DSA(Datura stramonium), SSA(Sambucus sieboldiana lectin) 및 E-셀렉틴(E-selectin)의 렉틴에 대하여 확인하였다(도 5).
실시예
3.
DNA
-항체-항원 복합체를 주형으로 한
전사체
생산
상기 실시예 2에서 용출한 DNA-항체-항원 복합체에 존재하는 DNA를 주형(E1 또는 E3)으로 T7 전사반응을 진행하였다. 용출된 DNA-항체-항원 복합체에 전사용 혼합용액(200 Unit T7 RNA 폴리머라아제, 전사 완충용액, 0.5mM NTPs)을 넣고 최종 부피를 50㎕로 하였다. 반응은 37℃에서 60분 동안 진행시켰다. 실험의 목적에 따라 NTP를 결여하거나 DNase, RNase를 첨가하였다. 그 결과 RNase 저해제가 존재하는 조건에서 RNA 전사체를 확인할 수 있었다. NTP를 넣지 않거나 DNA-항체 결합체를 넣지 않고 반응을 진행시킨 결과에서는 RNA 전사체를 확인할 수 없었다. 이 RNA 전사체는 DNase의 영향을 받지 않았으며, RNase 처리시 분해됨도 확인하였다. 이상의 결과로부터 항원과 결합한 채로 용출된 DNA-항체 복합체는 T7 전사반응을 위한 주형으로 사용될 수 있었으며, 반응 후 생성된 산물이 RNA 전사체임도 확인하였고(도 6A 및 도 6B), 전사체 생성 시간이 20분 이상에서는 포화되는 것을 확인할 수 있었다(도 6C).
실시예
4.
DNA
-항체-항원 복합체의 분석 가능성 확인
본 발명의 방법에 대한 타당성을 확인하기 위하여, Hep3B 세포에서 hFUT8 또는 shRNA를 이용하여 푸코실트랜스퍼라아제(fucosyltransferase 8; hFUT8)의 과발현 또는 하향조절(downregulation)한 후, real-time PCR을 이용하여 확인하였다(도 7A). real-time PCR 결과부터 정량분석한 결과 상향 조절된 경우, 8.39±1.70배로 유전자의 발현이 증가하였고, 하향조절된 경우, 0.47±0.12배 감소하는 효과를 확인할 수 있었다(도 7B). 도 7C는 면역블랏 분석에 따른 A2M 발현을 면역침강법으로 확인한 것이고, D는 DNA-태깅된 항A2M 항체와 결합을 통해 확인한 것이다. 또한, A2M(alpha-2-macroglobulin)에 대한 발현에 대하여 면역블랏 방법으로 분석하였다. A2M의 발현에 대하여 면역침강법으로 면역블랏을 실시하였고, 항-A2M 및 AAL을 이용하여 블랏팅한 결과, A2M의 발현은 확인되었으나, A2M의 푸코실화 형태가 검출되지 않았다(도 7C). 반면에, DNA-태깅된 항체를 이용하는 본 발명의 방법의 경우, 푸코실화 정도를 확인할 수 있었다(도 7D).
또한, FUT8 발현의 내생적인(endogenous) 발현(mock) 또는 간섭된 Hep3B 세포로부터 획득된 매체 및 야생형(FUT8+/+)과 넉아웃(FUT8-/-) FUT8을 포함하는 MEF 세포로부터 획득한 매체를 확인하였으며, MEF 세포에서 hAFP 유전자가 동일하게 과발현되지만 AFP-L3의 경우는 FUT8의 넉아웃(FUT8-/-) 세포주에서 발현되지 못하고, 야생형(FUT8+/+)에서만 강력하게 발현하는 것을 AAL을 이용하여 확인하였고(도 8A 및 도 8B), 푸코스화 검출의 민감도를 확인하기 위하여, 면역침강(IP)-렉틴 블랏 방식으로 분석한 결과를 나타냈다(도 8C).
또한, 당화 형태(glycoform)의 정량 방법으로 알려진 면역침강/렉틴 블랏 분석, Fab fragment 항체를 이용하는 ELISA 기법, PMGase-F 처리된 캡처 항체를 이용하는 ELISA 기법 및 화학적 표지 방법 등에 비교하여 본원 발명의 측정방법이 보다 분석 민감도가 우수하다는 것을 확인하였다(도 8D 및 도 8E). 종래의 방법으로 측정하기 위한 단백질의 최소 필요한 양은 약 50㎍이었고, 본 발명의 경우, 약 0.5㎍ 이상의 단백질 양으로도 측정할 수 있다는 것을 확인하였다. 따라서, 검출 민감도가 약 100배 이상 증가된 방법임을 확인하였다. 본 발명의 방법으로 푸코실화를 측정한 형광강도 값을 하기 표 2에 개시하였다.
| 단백질(㎍) | 0.5 | 1 | 2 | 3 | 5 | 10 |
| 형광강도(Fluorescence Intensity) (×104) |
0.34 | 0.84 | 2.61 | 3.41 | 6.91 | 13.4 |
| 0.31 | 0.79 | 2.33 | 2.94 | 6.33 | 12.7 | |
| 0.29 | 0.75 | 2.37 | 2.99 | 6.78 | 13.1 | |
| 0.39 | 1.11 | 2.77 | 3.05 | 6.45 | 12.9 | |
| 0.41 | 0.73 | 2.45 | 3.74 | 7.43 | 14.3 | |
| 0.43 | 0.82 | 2.91 | 3.88 | 7.02 | 15.1 | |
| 0.33 | 0.87 | 2.67 | 3.48 | 7.23 | 12.4 | |
| 0.37 | 0.84 | 2.23 | 3.65 | 6.42 | 13.9 | |
| 0.39 | 0.89 | 2.19 | 3.42 | 6.88 | 13.7 | |
| 평균 | 0.36 | 0.85 | 2.50 | 3.39 | 6.83 | 13.5 |
| 표준편차 | 0.047 | 0.111 | 0.249 | 0.339 | 0.376 | 0.850 |
| CV (%) | 13.08 | 13.08 | 9.98 | 9.97 | 5.50 | 6.30 |
| Ave. CV (%) | 9.65 | |||||
실시예
5.
DNA
-태깅된 항체 및 임상시료(항원)를 이용한 시험분석 및 검증분석
본 발명의 푸코실화 형태의 바이오마커를 정량분석하기 위하여, 태깅된 DNA template로부터 생산된 Cy3(HCC)와 cy5(non-HCC) 표지된 RNA 전사체를 분석하여 표준곡선을 작성하였다. 상기 전사체는 AAL-conugated 칼럼을 이용하여 분리하였다. 상기 템플레이트의 비율은 10:0 내지 0:10의 범위 내에서 각 템플레이트로부터 생산된 전사체를 혼합하였고, 상기 혼합한 RNA의 형광강도는 DNA 마이크로어레이 칩으로 분석하였다(도 9A). 또한, 로그값의 크기로, 1:9 내지 9:1의 템플레이트 비율에 대한 532nm 및 635nm에서 형광강도의 log2 비율 사이의 직선성이 관찰되었으며(R2=0.99), AFP, 헤모펙신(HPX) 및 알파 2-마크로글로블린(A2M)의 푸코실화가 비간암환자(non-HCC)에 비교하여 간암환자(HCC)에서 증가된 것을 확인할 수 있었다(도 9B).
상기 결과를 바탕으로 본 발명자들은 하기 식(1)과 같이 푸코실화 정도를 간암 환자군에서 획득한 값에서 정상군 값으로 나눠줌으로써 간암에 의해 증가한 푸코실화 정도를 계산하였으며, 또한, 하기 식(1)에 개시한 바와 같이, 본 발명에서는 푸코실화의 변화가 간암의 발생에 의해 각각의 단백질 발현량의 변화에 따른 단순한 차이를 배제하기 위하여 정규화하였다. 상기 정규화는 발현량의 변화에 의해 푸코실화 정도가 차이가 나는 위양성(false positivity)를 최소화함으로써 특이도(specificity)를 증진시킨 것이다.
즉, 본 발명은 단순하게 AFP, HPX 및 A2M의 발현량의 차이에 따른 간암의 예측이 아니라, 상기 항원 단백질이 간암에서 특이적으로 일어나는 당질변이인 푸코실화의 차이만을 측정함으로써 간암을 예측하는 것이다.
식(1)
Normalized Fuco-form = Log2(Fuc-BHCC/[B]HCC/Fuc-BNor/[B]Nor)
= Log2(Fuc-BHCC/Fuc-BNor)-Log2([B]HCC/[B]Nor)
상기 식(1)에서 Fuc-BHCC는 간암환자(HCC)의 시료에서 획득한 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin)의 푸코실화(fucosylation) 정도를 나타내고, Fuc-BNor는 정상인(Normal individual)의 시료에서 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin)의 푸코실화(fucosylation) 정도를 나타낸다. 또한, [B]HCC는 간암환자(HCC)의 시료에서 획득한 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin)의 발현량을 나타내고, [B]Nor는 정상인(Normal individual)의 시료에서 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin)의 발현량을 나타낸다.
104명의 비간암환자(정상 41명, 간염 29명, 간경변 34명으로 구성됨)와 92명의 간암환자로부터 채취한 혈청을 이용하여 본 발명의 방법으로 푸코실화 및 발현량을 측정하였다. 상기 196개의 임상표본은 데이터의 혼선을 방지하기 위하여, HCV의 감염, 비알코올성 지방간(NASH) 및 알코올중독 등이 있는 환자는 임상표본의 선정에서 제외하였다. B형 간염 환자 수는 비간암군과 간암환자군에서 동일하게 선정하였다(p<0.05)
도 9C 및 도 9D에 상기 169개의 임상표본으로부터 획득한 푸코실화 정도와 발현량의 변화를 개시하였고, 상기 결과로부터 발현량의 변화에 비해 푸코실화 변화의 정도가 크다는 것을 확인할 수 있었다.
도 10에 AFP, HPX 및 A2M의 정규화시킨 푸코실화 형태의 비율에 대하여 개시하였고, 정규화시킨 푸코실화 형태의 비율은 정상에서 간암환자로 갈수록 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 푸코실화는 마이크로어레이 칩을 이용하여 측정하였고, 단백질의 발현량은 ELISA 기법으로 측정하였다. 본 실시예에서 사용된 기준의 임상 표본은 비 간암환자로서, 5년간 추적하여 상기 표 3에 개시한 바와 같이, 매우 건강한 성인 3명의 지원자로부터 채취한 혈액을 이용하여 기준(reference)하였다.
| 기준 | Control 1 | Control 2 | Control 3 |
| 나이 | 56 | 54 | 59 |
| 성별 | M | M | F |
| 병인(Etiology) | - | - | - |
| HBV | - | - | - |
| HCV | - | - | - |
| 알코올 | - | - | - |
| 빈혈 | - | - | - |
| 염증(Inflammation) | - | - | - |
| AFP level | 3.7ng/㎖ | 3.3ng/㎖ | 2.6ng/㎖ |
| HPX level | 713㎍/㎖ | 811/㎖ | 734㎍/㎖ |
| A2M level | 2.4mg/㎖ | 2.6mg/㎖ | 2.5mg/㎖ |
실시예
6.
AFP
/
HPX
/A2M의
푸코실화
-인덱스(
Fuco
-
Index
)를 이용한 통계처리에 대한 임상적 검증
체외진단 다지표검사(in vitro diagnosis multivariate index assay; IVDMIA)는 질병의 진단 또는 다른 상태, 또는 질병의 치유, 경감, 치료 또는 예방에 사용하기 위하여 해석되는 환자-고유의 결과를 수득하고 해석하는 기능을 이용하는 다수의 변수 값을 조합하는 검사로 정의하며, 다중 바이오마커로부터 유도되는 조합 정보(combined information)는 단일 바이오마커의 상호 보완적이고, 단일 바이오마커의 성능보다 우수하다는 것을 전제로 하는 것이다.
본 실시예 6은 상기 실시예 5에서 92개의 간암환자 표본과 104개의 비 간암환자 표본을 이용하여 분석한 결과로부터 본 발명의 간암예측 방법이 증진된 진단효과가 있는지를 검증하고자 하였다.
본 발명의 간암 예측방법에 따라 분석된 AFP, HPX 및 A2M의 당질변이 값을 기준 군(Reference group)의 발현량으로 각각 정규화하고, 각각 정규화한 푸코실화 형태에 대하여 가중치를 다양하게 적용하였고, 이들 가중치 값의 합으로부터 푸코실화-인덱스를 계산하였다.
이와 같은 다양한 계산으로부터 AFP, HPX 및 A2M에 대하여 각각 0.53, 0.29 및 0.18의 가중치를 적용하였을 때, 진단에서 민감도 및 특이도가 모두 우수한 푸코실화-인덱스(If)를 획득할 수 있었다.
따라서, 하기 식(2)와 같이 푸코실화-인덱스(If) 식으로부터 유도된 값을 적용하는 간암의 예측방법을 확립하였다.
식(2)
푸코실화-인덱스(If)=0.53Log2(RAFP) + 0.29Log2(RHPX) + 0.18Log2(RA2M)
도 11A에 196개의 임상표본으로부터 푸코실화-인덱스(If) 값을 그래프로 나타내었으며, 상기 푸코실화-인덱스(If) 값의 범위는 -0.5 내지 2.5이고, 푸코실화-인덱스(If) 값을 0.38으로 했을 때, 진단에서 간암환자 표본 92개 중에서 77개의 표본이 양성으로 나타났고, 비간암환자 표본 104개 중에서 90개의 표본이 음성으로 나타났다. 이에 따라, 민감도 및 특이도가 각각 83.7% 및 86.5%로 계산되었고, 본 분석의 정확도가 89.8%임을 알 수 있었다.
도 12에 개시된 수신자 조작 특성(receiver operating curve; ROC)로부터 본 발명의 간암 예측방법이 종래의 AFP 또는 AFP에 비해 진단 성능이 통계적으로 의미있게 향상되었다는 확인할 수 있었다(p<0.001). 또한, 푸코실화-인덱스(If)에 대한 AUROC(area under ROC)는 0.889이고, AFP에 대한 AUROC는 0.809이며, AFP level에 대한 AUROC는 0.723으로 계산되었다.
즉, 상대적으로 본 발명의 간암 예측방법인 당질변이를 이용하는 푸코실화-인덱스(If)에 의한 정확도가 AFP 및 AFP보다 우수하다는 것을 확인하였다.
또한, 상기 196개의 임상표본을 이용하여 확립한 본 발명의 푸코실화-인덱스(If) 식(2)를 검증하기 위하여, 별도의 임상표본 50개를 대상으로 본 발명의 간암 예측방법을 검증하였다.
상기 새로운 임상표본 50개 중에서 간암환자 유래의 임상표본은 23개이고, 비간암환자 유래는 27개의 표본으로 나뉘는데, 비간암환자 유래의 임상 표본은 정상군 13개, 간염 6개, 간경변 8개로 구성된다.
이와 같이 독립적인 표본을 이용한 검증에서 민감도가 82.6%이고 특이도가 81.4%임을 확인할 수 있었다(도 11B). 또한, AUROC 값도 0.857으로 본 발명의 간암 예측방법이 매우 효과적임을 확인할 수 있었다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
<120> Method for measuring aberrant glycosylation and total level of
multiple glycoprotein and diagnosis of liver cancer thereof
<130> P2015-006-KR_PN15014
<160> 10
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T7 promoter
<400> 1
atggaattcc taatacgact cactataggg 30
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AFP_DNA tag
<400> 2
gttctcataa aattgccgcc ggtccatagc tttttttttt 40
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HPX_DNA tag
<400> 3
attaccaccc ctatctcacc gagttcgatg tttttttttt 40
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A2M_DNA tag
<400> 4
gtattctaat gcacccaacc ctgagcgtct tttttttttt 40
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A2M_probe
<400> 5
gctatggacc ggcggcaatt ttatgagaac 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HPX_probe
<400> 6
catcgaactc ggtgagatag gggtggtaat 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A2M_probe
<400> 7
agacgctcag ggttgggtgc attagaatac 30
<210> 8
<211> 58
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FUT8 shRNA
<400> 8
ccgggtctat aatgacggat ctatactcga gtatagatcc gtcattatag actttttg 58
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
tgatgcctct gcaaacttcc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 10
cgtccttccc aatttcctgt 20
Claims (17)
- 생체 시료 내에 포함된 당단백질인 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin)의 발현량 및 당질변이(aberrant glycosylation)를 이용하는 간암의 예측방법에 있어서,
1) 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 각각에 대하여, 특이적인 항체의 N-형 당쇄를 산화시키는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 산화된 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 각각의 특이적인 항체에, 프로모터를 포함하고 알려진 서열로 이루어지며, 각각 서로 다른 서열을 갖는 이중가닥 DNA를 공유결합시켜 DNA-태깅된 당단백질의 특이적인 항체를 생성하는 단계;
3) 상기 단계 2)에서 생성된, DNA-태깅된 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 항체 각각에 대하여 1차 렉틴 친화 크로마토그래피를 수행하여 특이적인 항체를 정제하는 단계;
4) 상기 단계 3)에서 정제된, DNA-태깅된 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 항체와 생체시료를 반응시키는 단계;
5) 상기 단계 4)에서 생체시료와 반응된, DNA-태깅된 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 항체와 생체시료의 결합물질에 대하여 2차 렉틴 친화 크로마토그래피를 수행하는 단계;
6) 상기 단계 5)에서 렉틴에 결합된, DNA-태깅된 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 항체로부터 각각의 전사체(transcript)를 생산하는 단계;
7) 상기 생산된 전사체의 양을 DNA 칩에서 측정하여 간암 특이적 푸코실화 당질변이를 측정하는 단계;
8) 상기 측정된 간암 특이적 푸코실화 당질변이를 생체 시료 내에 포함된 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 단백질의 발현량으로 정규화(normalization)하는 단계; 및
9) 상기 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 단백질의 발현량으로 정규화한 값(Normalized fuco-form)으로부터 퓨코스화-인덱스(Fuco-index)를 구하고, 이로부터 간암을 예측하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 간암의 예측방법. - 제1항에 있어서, 상기 단계 1)에서 항체의 당쇄를 NaIO4로 산화시키는 것을 특징으로 하는 간암의 예측방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 2)에서, DNA는 5' 말단을 히드라진 그룹으로 공유 결합시킨 DNA인 것을 특징으로 하는 간암의 예측방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 2)에서, DNA는 T7 프로모터 및 전사체를 코딩하는 서열을 포함하는 센스가닥의 DNA 및 상기 DNA에 상보적인 서열을 갖는 안티센스가닥의 DNA를 혼성화하여 획득한 이중가닥의 DNA인 것을 특징으로 하는 간암의 예측방법.
- 제1항에 있어서, 단계 2)와 단계 3) 사이에, NaBH4를 이용하여 상기 DNA와 각각의 당단백질 특이적 항체의 결합을 안정화시키는 과정을 부가하는 것을 특징으로 하는 간암의 예측방법.
- 제1항에 있어서, 단계 3)에서 렉틴 친화 크로마토그래피는 L4-PHA(Phytohemagglutinin-L4), LCA(lens culinaris agglutinin), DSA(Datura stramonium agglutinin), AAL(Aleuria aurantia agglutinin), 셀렉틴(Selectin), Con A(Concanavalin-A), WGA(Wheat germ agglutinin), 자칼린(Jacalin), SNA(Sambucus Nigra agglutinin) 및 갈렉틴(galectin) 중에서 선택된 하나 이상의 렉틴을 이용하여 DNA-태깅 항체를 정제하는 것을 특징으로 하는 간암의 예측방법.
- 제1항에 있어서, 단계 5)에서 렉틴 친화 크로마토그래피는 L4-PHA(Phytohemagglutinin-L4), LCA(lens culinaris agglutinin), DSA(Datura stramonium agglutinin), AAL(Aleuria aurantia agglutinin), 셀렉틴(Selectin), Con A(Concanavalin-A), WGA(Wheat germ agglutinin), 자칼린(Jacalin), SNA(Sambucus Nigra agglutinin) 및 갈렉틴(galectin) 중에서 선택된 하나 이상의 렉틴을 이용하여 DNA-태깅 당단백질 특이적 항체-항원 결합체를 포집하는 것을 특징으로 하는 간암의 예측방법.
- 제1항에 있어서, 단계 6)에서 형광 표지된 기질을 사용하여 형광을 띠는 전사체를 생산하는 것을 특징으로 하는 간암의 예측 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 8)에서 정규화(normalization)는 하기 식(1)을 이용하여 정규화하는 것을 특징으로 하는 간암의 예측 방법:
식(1)
Normalized Fuco-form = Log2(Fuc-BHCC/Fuc-BNor)-Log2([B]HCC/[B]Nor)
(상기 Fuc-BHCC는 간암환자(HCC)의 시료에서 획득한 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin)의 푸코실화(fucosylation) 정도를 나타내고, Fuc-BNor는 정상인(Normal individual)의 시료에서 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin)의 푸코실화(fucosylation) 정도를 나타내고, [B]HCC는 간암환자(HCC)의 시료에서 획득한 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin)의 발현량을 나타내고, [B]Nor는 정상인(Normal individual)의 시료에서 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin)의 발현량을 나타낸다.) - 제1항에 있어서, 상기 단계 9)에서 정규화된 당질변이(Normalized Fuco-Form)는 알파태아단백질(AFP), 헤모펙신(hemopexin) 및 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin)에 대하여, 가중치(weighted values)를 하기 식(2)와 같이 적용한 푸코실화-인덱스(Fuco-Index; If)으로부터 간암을 예측하는 것을 특징으로 하는 간암의 예측방법:
식(2)
푸코실화-인덱스(If) = 0.53Log2(RAFP)+0.29Log2(RHPX)+0.18Log2(RA2M)
(상기 RAFP는 정규화한 AFP의 당질변이 값, RHPX는 정규화한 HPX의 당질변이 값, RA2M은 정규화한 A2M의 당질변이 값을 나타낸다). - 제10항에 있어서, 상기 푸코실화-인덱스(Fuco-Index; If)이 0.38 이상인 경우 간암으로 예측하며, 0.38 미만인 경우 정상으로 예측하는 것을 특징으로 하는 간암의 예측방법.
- 알파태아단백질(AFP) 특이적 항체의 산화된 N-형 당쇄에, 프로모터를 포함하며 알려진 서열로 이루어지고, 알파태아단백질(AFP) 항체에 대해 서로 다른 서열을 갖는 이중가닥 DNA를 공유결합시켜 DNA-태깅된, 간암 예측용 DNA-태깅된 당단백질 특이적 항체.
- 헤모펙신(hemopexin) 특이적 항체의 산화된 N-형 당쇄에, 프로모터를 포함하며 알려진 서열로 이루어지고, 헤모펙신(hemopexin) 항체에 대해 서로 다른 서열을 갖는 이중가닥 DNA를 공유결합시켜 DNA-태깅된, 간암 예측용 DNA-태깅된 당단백질 특이적 항체.
- 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 특이적 항체의 산화된 N-형 당쇄에, 프로모터를 포함하며 알려진 서열로 이루어지고, 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 항체에 대해 서로 다른 서열을 갖는 이중가닥 DNA를 공유결합시켜 DNA-태깅된, 간암 예측용 DNA-태깅된 당단백질 특이적 항체.
- 알파태아단백질(AFP) 특이적 항체의 산화된 N-형 당쇄에, 프로모터를 포함하며 알려진 서열로 이루어지고, 알파태아단백질(AFP) 항체에 대해 서로 다른 서열을 갖는 이중가닥 DNA를 공유결합시켜 DNA-태깅된, 간암 예측용 DNA-태깅된 당단백질 특이적 제1항체;
헤모펙신(hemopexin) 특이적 항체의 산화된 N-형 당쇄에, 프로모터를 포함하며 알려진 서열로 이루어지고, 헤모펙신(hemopexin) 항체에 대해 서로 다른 서열을 갖는 이중가닥 DNA를 공유결합시켜 DNA-태깅된, 간암 예측용 DNA-태깅된 당단백질 특이적 제2항체;
알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 특이적 항체의 산화된 N-형 당쇄에, 프로모터를 포함하며 알려진 서열로 이루어지고, 알파 2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 항체에 대해 서로 다른 서열을 갖는 이중가닥 DNA를 공유결합시켜 DNA-태깅된, 간암 예측용 DNA-태깅된 당단백질 특이적 제3항체;
지지체에 결합된 렉틴;
상기 DNA-태깅된 간암예측용 DNA-태깅된 당단백질 특이적 항체의 DNA로부터 전사체를 제조하기 위한 RNA 폴리머라아제;
상기 RNA 폴리머라아제의 기질; 및
상기 전사체를 인식할 수 있는 서열을 포함하는 핵산 칩;을 포함하는 간암 진단용 키트. - 제15항에 있어서, 상기 기질은 발색 또는 발광 기질을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 진단용 키트.
- 제15항에 있어서, 상기 렉틴은 L4-PHA(Phytohemagglutinin-L4), LCA(lens culinaris agglutinin), DSA(Datura stramonium agglutinin), AAL(Aleuria aurantia agglutinin), 셀렉틴(Selectin), Con A(Concanavalin-A), WGA(Wheat germ agglutinin), 자칼린(Jacalin), SNA(Sambucus Nigra agglutinin) 및 갈렉틴(galectin) 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 간암 진단용 키트.
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| KR1020150068635A KR101583457B1 (ko) | 2015-05-18 | 2015-05-18 | 다중 당단백질의 발현량 및 당질변이의 측정을 통한 간암의 예측방법 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020150068635A KR101583457B1 (ko) | 2015-05-18 | 2015-05-18 | 다중 당단백질의 발현량 및 당질변이의 측정을 통한 간암의 예측방법 |
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| KR101583457B1 true KR101583457B1 (ko) | 2016-01-08 |
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|---|---|
| KR (1) | KR101583457B1 (ko) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3415918A4 (en) * | 2017-04-20 | 2019-01-16 | Korea Basic Science Institute | METHOD FOR DIAGNOSIS OF LIVER CANCER BY MASS SPECTROMETRY OF GLYCOPEPTIDE FROM ALPHA-FETOPROTEIN |
| CN113466456A (zh) * | 2020-03-31 | 2021-10-01 | 中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院 | 用于肝癌早期诊断的检测甲胎蛋白异质体afp-l3的elisa试剂盒及检测方法 |
| EP3877408A4 (en) * | 2018-11-06 | 2022-08-24 | University of Miami | COMPOSITIONS AND PRODUCTION OF RECOMBINANT AAV VIRUS VECTORS CAPABLE OF IN VIVO GLYCOENGINEERING |
-
2015
- 2015-05-18 KR KR1020150068635A patent/KR101583457B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Mol. Cell. Proteomics 14.3: 782 (2015) * |
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| CN113466456A (zh) * | 2020-03-31 | 2021-10-01 | 中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院 | 用于肝癌早期诊断的检测甲胎蛋白异质体afp-l3的elisa试剂盒及检测方法 |
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