CN103063841A - 一种流行性出血热病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒及其制备和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种流行性出血热病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒及其制备和使用方法，包括盒体，所述盒体内设有EHF酶标板、封板膜、EHF酶结合物溶液瓶、底物A溶液瓶、底物B溶液瓶、EHF阴性对照溶液瓶、EHF阳性对照溶液瓶和终止液溶液瓶。本发明采用IgM捕获ELISA法检测EHF IgM抗体，以减少假阳性或假阴性现像对临床诊断带来的干扰，并且使该试剂盒能够对流行性出血热进行快速、准确的检测，同时误差小、检测灵敏度高、对检测设备要求低。
Description
技术领域
本发明涉及生物学检测技术领域，具体涉及一种流行性出血热病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒及其制备和使用方法。
背景技术
流行性出血热（EHF）又称肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renalsyndrome,HFRS），是由布尼亚病毒科（Bunyaviridae）汉坦病毒属（Hantavirus）中某些病毒引起，并以鼠类为主要传染源的自然疫源性疾病。临床上以发热、休克、充血性出血和急性肾功能衰竭为主要表现，并常伴有腔道出血、中枢神经系统并发症、肺水肿等多种并发症。肾综合征出血热分布于全世界30多个国家，疫源地分布于五大洲70多个国家，已成为世界公共卫生问题。我国是受肾综合征出血热危害最为严重的国家，年报告发病人数约为4～6万，占世界报告病例总数的90%以上，高发疫区发病率在50/10万左右，偶有暴发流行，病死率高达30%。该病在我国分布范围广、疫区类型复杂，是我国最严重的虫媒传染病之一。
汉坦病毒为分节段的负链RNA病毒，其基因组由大（L）、中（M）和小（S）三个RNA片段组成，分别编码依赖RNA的RNA多聚酶、包膜糖蛋白（G1和G2）和核壳体蛋白。汉坦病毒基因组RNA的5’端和3’端的15～30个碱基互补，这些互补序列可以保持RNA的稳定性，并可能在转录或复制的过程中被RNA聚合酶识别，启动合成新的RNA。11个碱基的最末端序列“TAGTAGTAGAC”为所有汉坦病毒所共有，是汉坦病毒的重要基因特征之一，是区分汉坦病毒和布尼亚病毒科其它病毒的重要依据。汉坦属病毒和布尼亚病毒科其它病毒在血清学上没有交叉反应。
目前流行性出血热病毒抗体传统的检测方法是采用血清学诊断方法，包括间接酶免吸附试验检测EHF IgG抗体、胶体金法、免疫荧光试验检测双份血清IgG抗体等，这些方法均在一定程度上易出现假阳性或假阴性现象，给流行性出血热的临床诊断带来一定干扰。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种流行性出血热病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒及其制备和使用方法，使之具有以下优点：一、应用IgM捕获ELISA法检测EHF IgM抗体，以减少假阳性或假阴性现象对临床诊断带来的干扰，并且使该试剂盒能够对流行性出血热进行快速、准确的检测，同时误差小、检测灵敏度高、对检测设备要求低；二、提高试剂盒的使用安全性；三、提高反应板条的使用期限。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种流行性出血热病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，其特征在于：所述盒体内设有EHF酶标板、封板膜、EHF酶结合物溶液瓶、底物A溶液瓶、底物B溶液瓶、EHF阴性对照溶液瓶、EHF阳性对照溶液瓶和终止液溶液瓶；
所述EHF酶标板上设有五个以上包被有固相抗人IgM单克隆抗体的透明反应孔；
每1000ml所述底物A溶液内含有柠檬酸三钠4.16g～6.24g、柠檬酸7.76g～11.64g、乙酸钠7.13g～10.70g、冰乙酸1.52ml～2.28ml、双氧水0.8ml～1.2ml；
每1000ml所述底物B溶液内含有无水乙醇520ml～780ml、乙二醇272ml～408ml、二甲基甲酰胺8ml～12ml、3，3'，5，5'-四甲基联苯胺0.8g～1.2g；
每1000ml所述EHF阴性对照溶液内含有氯化钠6g～8g、Na2HPO4·12H2O2.2g～3.4g、KH2PO40.16g～0.24g、氯化钾0.16g～0.24g、蔗糖40g～60g、叠氮化钠0.08g～0.12g；
所述EHF阳性对照溶液是在每1ml所述EHF阴性对照溶液中加入24μg～36μg羊抗兔抗体配置而成；
所述终止液是在900ml纯水中加入80ml～120ml硫酸配置而成的。
优选的，所述EHF酶标板上设有5~95个反应孔。
优选的，所述EHF酶标板包括板架和多个可拆卸安装在所述板架上的反应板条，所述反应孔设置在所述反应板条上。
优选的，所述盒体内部设有隔断，使所述盒体内部具有多个空腔。
优选的，所述盒体内部设有一个横向隔断，使所述盒体分成一个上部用于容纳所述EHF酶结合物溶液瓶、底物A溶液瓶、底物B溶液瓶、EHF阴性对照溶液瓶、EHF阳性对照溶液瓶和终止液溶液瓶的空腔和一个底部用于容纳所述EHF酶标板的空腔。
所述流行性出血热IgM抗体酶联免疫检测试剂盒的制备方法：
（1）EHF酶标板的制备：
1.1配制EHF包被液：用碳酸钠－碳酸氢钠缓冲溶液将抗人IgM单克隆抗体溶液稀释成浓度为0.8μg/ml、PH=9.6的溶液；
1.2包被：用步骤1.1制得的EHF包被液按100μl/孔进行包被，并在2～8℃温度下静置40～50小时；
1.3洗涤液制备：将含有0.05%吐温－20、pH=7.5的PBS溶液与蒸馏水按体积比1:40混合均匀，制得洗涤液；
1.4洗涤：用洗涤液连续洗涤包被后的酶标板2次，拍干；
1.5封闭：向洗涤后的透明反应孔内按130μl/孔加入封闭液，所述封闭液为每1000ml纯水溶液中含NaHCO32.93g、Na2CO31.59g、牛血清白蛋白10g，并在20～25℃条件下，封闭2.8～3.2小时；
1.6甩出孔中的封闭液，加入保护液将反应孔密封，所述保护液组成为：9.5wt%～10.5wt%小牛血清和89wt%～91wt%甘油，制得EHF酶标板；
（2）EHF酶结合物溶液的配制：
2.1将5mg辣根过氧化物酶溶解在1ml双蒸水中，再加入21.4mg/ml的高碘酸钠溶液200μl，在室温18℃～25℃条件下混合均匀制备得到辣根过氧化物酶溶液；
2.2再将辣根过氧化物酶溶液加入PH4.4的醋酸-冰乙酸缓冲液，在2℃～8℃条件下透析16～20小时；
2.3取EHF抗原加入pH=9.6、碳酸钠含量为0.05mol/L的碳酸钠－碳酸氢钠缓冲溶液，在4℃条件下透析16～20小时；
2.4将透析后的辣根过氧化物酶溶液和EHF抗原溶液混匀，放入pH=9.6、碳酸钠含量为0.05mol/L的碳酸盐缓冲液中搅拌透析3～3.5小时，再加入4mg/ml的硼氢化钠溶液，加入量为50μl/0.5mg EHF抗原，并充分混匀；
2.5使步骤2.4得到的混合溶液通过葡聚糖凝胶G-200柱，同时用PH=7.1的PBS溶液洗脱；
2.6用小试管依次分段接收流出物，用事先包被好的羊抗鼠板条进行检测，收集试管内的羊抗鼠板条显兰色的试管内产物，制得酶结合物初溶液；
2.7将6g～8g氯化钠、140ml～160ml小牛血清和0.8g～1.2g叠氮钠溶解在1000ml纯水中，混匀制得酶结合物稀释液；
2.8将酶结合物初溶液用酶结合物稀释液按1:700稀释，并在2℃～8℃静置24小时，再按兔抗羊IgG－HRP溶液与稀释后的酶结合物初溶液体积比为1:5000加入兔抗羊IgG－HRP溶液，制得EHF酶结合物溶液；
（3）底物A溶液的配制
先将柠檬酸三钠4.16g～6.24g、柠檬酸7.76g～11.64g和乙酸钠7.13g～10.70g用纯水完全溶解，再加入1.52ml～2.28ml的冰乙酸和0.8ml～1.2ml的双氧水，最后用纯水定容至1000ml，制得底物A溶液；
（4）底物B溶液的配制
将0.95g～1.05g3，3'，5，5'-四甲基联苯胺溶解在10ml二甲基甲酰胺中，再加入650ml无水乙醇和340ml乙二醇，混匀，制得底物B溶液；
（5）终止液的配制
向900ml纯水中加入100ml硫酸，混匀，制得终止液；
（6）EHF阴性对照溶液的配制
将氯化钠6g～8g、Na2HPO4·12H2O2.2g～3.4g、KH2PO40.16g～0.24g、氯化钾0.16g～0.24g和蔗糖40g～60g完全溶解在纯水中，再加入0.8g～1.2g叠氮化钠，用纯水定容至1000ml，制得EHF阴性对照溶液；
（7）EHF阳性对照溶液的配制
向步骤（6）制得的EHF阴性对照溶液中加入羊抗兔抗体，加入量为每1mL阴性对照溶液中加入羊抗兔抗体24μg～36μg，制得EHF阳性对照溶液。
所述流行性出血热IgM抗体酶联免疫检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
（1）样品收集
静置待测血清30min，对所述待测血清进行离心处理10～20分钟，即可进行检测。
（2）加样检测
a.将在冷藏环境中贮藏的所述EHF酶结合物溶液瓶、底物A溶液瓶、底物B溶液瓶、EHF阴性对照溶液瓶、EHF阳性对照溶液瓶和终止液溶液瓶平衡至室温20℃～25℃；
b.将所述EHF酶标板用生理盐水洗3次；
c.采用生理盐水作为稀释液，按照1:100的比例稀释待检血清；
d．将所述酶标板上的至少一个反应孔作为空白孔；取稀释后的待检血清按100μl/孔加入到所述酶标板上的至少一个反应孔内，作为样品孔；取EHF阳性对照溶液按100μl/孔加入到所述酶标板上的至少一个反应孔内，作为阳性对照孔；取EHF阴性对照液按100μl/孔加入到所述酶标板上的至少两个反应孔内，作为阴性对照孔；
e.将所述EHF酶标板贴上封板膜，震荡混匀，置于36℃～38℃恒温水浴中反应29min～31min；
f.取出所述EHF酶标板，揭下封板膜，向样品孔、阳性对照孔和阴性对照孔内各加入50μl酶结合物溶液，混匀，贴上封板膜，置于36℃～38℃恒温水浴中反应58min～62min；
g.取出所述EHF酶标板，并揭下封板膜，用生理盐水洗涤各反应孔5次，每次间隔15秒～25秒，拍干；
h.依次向样品孔、阳性对照孔和阴性对照孔内各加入50μl底物溶液A和30μl底物溶液B，混匀，贴上封板膜，室温20℃～25℃避光放置10~30分钟，揭下封板膜，观察结果：若只判断检测样的阴阳性，采用目测方法，分别对比样品孔与阳性对照孔、阴性对照孔的颜色，即可得出检测结果；若需读出准确的检测数值，在步骤g后，向所述空白孔、样品孔、阳性对照孔和阴性对照孔内再分别加入50μl终止液，混匀后，使用酶标仪读取结果。
优选的，如待测血清不能及时检测，应将待测血清在-20℃～-15℃条件冻存。
采用上述技术方案后，本发明的有益效果是：由于本发明采用ELISA法IgM捕获法检测EHF IgM抗体，若待测血清中含有流行性出血热病毒，则流行性出血热病毒IgM抗体即与EHF酶结合物、抗人-IgM单抗结合，并结合在微孔壁表面，通过底物作用显色，用以特异性的检测待测血清中的流行性出血热IgM抗体，检测出流行性出血热病毒，与ELISA法间接法等其他方法相比，本发明灵敏度高、特异性强，实验操作仅需一步即可出结果，因此，本发明不但减少了假阳性或假阴性现象对临床诊断带来的干扰，使该试剂盒能够对流行性出血热进行快速、准确的检测，而且误差小、检测灵敏度高、对检测设备要求低；还由于本发明采用了所述酶标板和各种溶液的配方，使得本发明试剂盒的检测结果的准确程度是目前市场上其它出血热检测试剂所达不到的；本发明试剂盒阳性对照溶液为非传染性EHF阳性血清，对实验操作者安全；另外，本发明酶标板反应板条内含有甘油，因而无需干燥储存，也不会因其储存过程中受潮而失效，大大提高了反应板条储存的有效期。
附图说明
图1为本发明实施例打开后俯视图；
图2为本发明实施例内部正视示意图；
图3为本发明实施例酶标板的示意图；
其中，1、盒体；2、EHF酶结合物溶液瓶；3、底物A溶液瓶；4、底物B溶液瓶；5、EHF阴性对照溶液瓶；6、EHF阳性对照溶液瓶；7、终止液溶液瓶；8、透明反应孔；9、板架；10、反应板条；11、横向隔断；12、纵向隔断。
具体实施例
实施例1
一种流行性出血热病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒
如图1、图2和图3所示，本实施例试剂盒包括盒体1，盒体1内设有EHF酶标板（如图3所示）、封板膜、EHF酶结合物溶液瓶2、底物A溶液瓶3、底物B溶液瓶4、EHF阴性对照溶液瓶5、EHF阳性对照溶液瓶6和终止液溶液瓶7；
EHF酶标板上设有多个包被有固相抗人IgM单克隆抗体的透明反应孔8；
每1000ml底物A溶液内含有柠檬酸三钠5.2g、柠檬酸9.7g、乙酸钠8.92g、冰乙酸1.9ml、双氧水1ml；
每1000ml底物B溶液内含有无水乙醇650ml、乙二醇340ml、二甲基甲酰胺10ml、3，3'，5，5'-四甲基联苯胺（简称TMB）1g；
每1000mlEHF阴性对照溶液内含有氯化钠7g、Na2HPO4·12H2O2.8g、KH2PO40.2g、KCL0.2g、蔗糖50g，叠氮化钠0.1g；
EHF阳性对照溶液是在每1ml所述EHF阴性对照溶液中加入30μg的羊抗兔抗体配制而成的；
终止液是在900ml纯水中加入硫酸100ml配制而成的，所用硫酸为质量百分比为98%的浓硫酸。
EHF酶标板上设有48个反应孔。
EHF酶标板包括板架9和多个可拆卸安装在板架9上的反应板条10，透明反应孔8设置在反应板条10上。盒体1内部设有一个横向隔断11，使盒体分成一个上部用于容纳EHF酶结合物溶液瓶2、底物A溶液瓶3、底物B溶液瓶4、EHF阴性对照溶液瓶5、EHF阳性对照溶液瓶6和终止液溶液瓶7的空腔和一个底部用于容纳板架9的空腔，横向隔断11为硬质材料，盒体1上部空腔设有还一个纵向隔断12，底物A溶液瓶3和底物B溶液瓶4放入其中的一个空腔，其他溶液瓶放置于另一个空腔。
实施例2
一种流行性出血热病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒
本实施例中：
每1000ml底物A溶液内含有柠檬酸三钠4.16g、柠檬酸7.76g、乙酸钠7.13g、冰乙酸1.52ml、双氧水0.8ml；
每1000ml底物B溶液内含有无水乙醇520ml、乙二醇272ml、二甲基甲酰胺8ml、3，3'，5，5'-四甲基联苯胺0.8g；
每1000mlEHF阴性对照溶液内含有氯化钠6g、Na2HPO4·12H2O2.2g、KH2PO40.16g、氯化钾0.16g、蔗糖40g，叠氮化钠0.08g；
EHF阳性对照溶液是在每1ml所述EHF阴性对照溶液中加入24μg的羊抗兔抗体配制而成的；
终止液是在900ml纯水中加入硫酸80ml配制而成的，所用硫酸为质量百分比为98%的浓硫酸；
EHF酶标板上设有5个反应孔。
其余同实施例1。
实施例3
一种流行性出血热病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒
本实施例中：
每1000ml底物A溶液内含有柠檬酸三钠6.24g、柠檬酸11.64g、乙酸钠10.70g、冰乙酸2.28ml、双氧水1.2ml；
每1000ml底物B溶液内含有无水乙醇780ml、乙二醇408ml、二甲基甲酰胺12ml、3，3'，5，5'-四甲基联苯胺1.2g；
每1000mlEHF阴性对照溶液内含有氯化钠8g、Na2HPO4·12H2O3.4g、KH2PO40.24g、氯化钾0.24g、蔗糖60g，叠氮化钠0.12g；
EHF阳性对照溶液是在每1ml所述EHF阴性对照溶液中加入36μg的羊抗兔抗体配制而成的；
终止液是在900ml纯水中加入硫酸120ml配制而成的，所用硫酸为质量百分比为98%的浓硫酸。
EHF酶标板上设有95个反应孔。
其余同实施例1。
实施例4
流行性出血热病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒制备方法
本实施例中微孔板中所包被的兔抗人-IgM单抗在碱性环境下可以很好的结合在微孔板塑料表面上，采用的包被抗原浓度为0.8μg/mL，本实施例中EHF酶标板由板架和多个可拆卸安装在板架上的反应板条组成。
制备如实施例1所述的流行性出血热病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒，具体制备步骤如下：
（1）EHF反应板条的制备：
1.1EHF包被液的配制：用0.05mol/L碳酸盐缓冲液（配方：0.159g Na2CO3+0.293g Na2HCO3定容至100ml）将3.42mg/ml的兔抗人-IgM单抗溶液稀释成0.8μg/ml，PH=9.6；
1.2包被量：EHF反应板条均按100μl/孔包被，待全部包被完毕，置2～8℃静置、吸附48小时；
1.3洗涤液制备：将含有0.05%（体积含量）吐温－20、pH=7.5的PBS溶液与蒸馏水按体积比1:40混合均匀，制得洗涤液。
1.4洗涤：用洗涤液连续洗涤包被后的反应板条2次，拍干。
1.5封闭：分别将上述洗涤后的反应板条加封闭液130μl/孔，室温20～25℃封闭3小时；封闭液组成配方为：NaHCO32.93g+Na2CO31.59g+BSA10g，纯水定容1000ml；
1.6甩出孔中的封闭液，加入保护液将反应孔密封，所述保护液组成为：10wt%小牛血清和90wt%甘油，制得EHF反应板条；
分别将上述处理后的板条装入铝箔袋，封口，2～8℃保存备用。
（2）EHF酶结合物的制备包括以下步骤：
2.1称取辣根过氧化物酶倒入一棕色小玻璃瓶内，取1ml双蒸水溶解，用加样器取200μl高碘酸钠溶液，滴入盛辣根过氧化物酶的小瓶内，将5mg辣根过氧化物酶溶解在1ml双蒸水中，再加入21.4mg/ml的高碘酸钠溶液200μl，在室温18℃～25℃振荡20min制备得到辣根过氧化物酶溶液；
2.2振荡好的辣根过氧化物酶溶液取入透析袋，放入配制好的PH4.4醋酸缓冲液中，4℃冰箱透析18小时；
2.3取EHF抗原放入另一透析袋中，加入pH=9.6、碳酸钠含量为0.05mol/L的碳酸钠－碳酸氢钠缓冲溶液，在4℃条件下透析18小时；
2.4将透析后的辣根过氧化物酶溶液和EHF抗原溶液混匀，放入pH=9.6、碳酸钠含量为0.05mol/L的碳酸盐缓冲液中搅拌透析3小时，再加入4mg/ml的硼氢化钠溶液，加入量为50μl/0.5mg EHF抗原，并充分混匀；
2.5使步骤2.4得到的混合溶液通过葡聚糖凝胶G-200柱，同时用PH=7.1的PBS溶液洗脱；
2.6用小试管依次分段接收流出物，用事先包被好的羊抗鼠板条进行检测，收集试管内的羊抗鼠板条显兰色的试管内产物，制得酶结合物初溶液。
也可将收集的酶结合物加入等量甘油混匀（甘油能更好的稳定酶结合物活性），放置于-20℃冰箱保存。
2.7将7g氯化钠、150ml小牛血清和1.0g叠氮钠溶解在1000ml纯水中，混匀制得酶结合物稀释液；
2.8将酶结合物初溶液用酶结合物稀释液按1:700稀释，并在6℃静置24小时，再按兔抗羊IgG－HRP溶液与稀释后的酶结合物初溶液体积比为1:5000加入兔抗羊IgG－HRP溶液，制得EHF酶结合物溶液，装入试剂瓶冷藏备用。
（3）底物A的配制
用电子天平准确称量柠檬酸三钠5.2g、柠檬酸9.7g、乙酸钠8.92g加入容量瓶中；先加适量纯水，轻摇使之完全溶解；再用移液器准确量取冰乙酸1.9ml、双氧水1ml加入容量瓶中，轻摇混匀；以纯水定容至1000ml。
（4）底物B的配制
用电子天平准确称取TMB1g，倒入有色广口瓶中；用移液器准确量取二甲基甲酰胺10ml，加入有色广口瓶中，轻摇使TMB混匀；用量筒准确量取无水乙醇650ml、乙二醇340ml，倒入广口瓶中，摇匀，定容至1000ml。
（5）终止液的配制
用量筒准确量取所需的纯水900ml，倒入广口瓶中；再用量筒准确量取浓硫酸（质量百分比为98%以上）100ml，边搅拌边慢慢倒入广口瓶中；扣上瓶盖，轻摇广口瓶，使液体混匀。
（6）EHF阴性对照的配制
用电子天平准确称量NaCL7g、Na2HPO4·12H2O2.8g、KH2PO40.2g、KCL0.2g、蔗糖50g，加入容量瓶；先加适量纯水，轻摇使之溶解完全；再用电子天平准确称量叠氮化钠0.1g，加入容量瓶，搅拌使之完全溶解，轻摇混匀；以纯水定容，混匀备用。
（7）EHF阳性对照的配制
向步骤（6）制得的EHF阴性对照溶液中加入羊抗兔抗体，加入量为每1mLEHF阴性对照溶液中加入羊抗兔抗体30μg，制得阳性对照溶液。
实施例5
流行性出血热病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒制备方法
本实施例同实施例4，不同之处在于：
（1）EHF反应板条的制备：
1.2包被量：EHF反应板条均按100μl/孔包被，待全部包被完毕，置2～8℃静置、吸附40小时；
1.5封闭：分别将上述洗涤后的反应板条加封闭液130μl/孔，室温20～25℃封闭2.8小时；封闭液组成配方为：NaHCO32.93g+Na2CO31.59g+BSA10g，纯水定容1000ml；
1.6甩出孔中的封闭液，加入保护液将反应孔密封，所述保护液组成为：9.5wt%小牛血清和91wt%甘油，制得EHF反应板条；
（2）EHF酶结合物的制备包括以下步骤：
2.2振荡好的辣根过氧化物酶溶液取入透析袋，放入配制好的PH4.4醋酸缓冲液中，4℃冰箱透析16小时；
2.3取EHF抗原放入另一透析袋中，加入pH=9.6、碳酸钠含量为0.05mol/L的碳酸钠－碳酸氢钠缓冲溶液，在4℃条件下透析18小时；
2.7将6g氯化钠、140ml小牛血清和0.8g叠氮钠溶解在1000ml纯水中，混匀制得酶结合物稀释液；
2.8将酶结合物初溶液用酶结合物稀释液按1:700稀释，并在2℃静置24小时，再按兔抗羊IgG－HRP溶液与稀释后的酶结合物初溶液体积比为1:5000加入兔抗羊IgG－HRP溶液，制得EHF酶结合物溶液，装入试剂瓶冷藏备用。
（3）底物A的配制
用电子天平准确称量柠檬酸三钠4.16g、柠檬酸7.76g、乙酸钠7.13g加入容量瓶中；先加适量纯水，轻摇使之完全溶解；再用移液器准确量取冰乙酸1.52ml、双氧水0.8ml加入容量瓶中，轻摇混匀；以纯水定容至1000ml。
（6）阴性对照的配制
用电子天平准确称量NaCL6g、Na2HPO4·12H2O2.2g、KH2PO40.16g、KCL0.16g、蔗糖40g，加入容量瓶；先加适量纯水，轻摇使之溶解完全；再用电子天平准确称量叠氮化钠0.8g，加入容量瓶，搅拌使之完全溶解，轻摇混匀；以纯水定容，混匀备用。
（7）阳性对照的配制
向步骤（6）制得的阴性对照溶液中加入羊抗兔抗体，加入量为每1mL阴性对照溶液中加入羊抗兔抗体24μg，制得阳性对照溶液。
实施例6
流行性出血热病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒制备方法
本实施例同实施例4，不同之处在于：
（1）EHF反应板条的制备：
1.2包被量：EHF反应板条均按100μl/孔包被，待全部包被完毕，置8℃静置、吸附50小时；
1.5封闭：分别将上述洗涤后的反应板条加封闭液130μl/孔，室温20～25℃封闭3.2小时；封闭液组成配方为：NaHCO32.93g+Na2CO31.59g+BSA10g，纯水定容1000ml；
1.6甩出孔中的封闭液，加入保护液将反应孔密封，所述保护液组成为：10.5wt%小牛血清和89.5wt%甘油，制得EHF反应板条；
（2）EHF酶结合物的制备包括以下步骤：
2.2振荡好的辣根过氧化物酶溶液取入透析袋，放入配制好的PH4.4醋酸缓冲液中，4℃冰箱透析20小时；
2.3取EHF抗原放入另一透析袋中，加入pH=9.6、碳酸钠含量为0.05mol/L的碳酸钠－碳酸氢钠缓冲溶液，在4℃条件下透析20小时；
2.7将8g氯化钠、160ml小牛血清和1.2g叠氮钠溶解在1000ml纯水中，混匀制得酶结合物稀释液；
2.8将酶结合物初溶液用酶结合物稀释液按1:700稀释，并在8℃静置24小时，再按兔抗羊IgG－HRP溶液与稀释后的酶结合物初溶液体积比为1:5000加入兔抗羊IgG－HRP溶液，制得EHF酶结合物溶液，装入试剂瓶冷藏备用。
（3）底物A的配制
用电子天平准确称量柠檬酸三钠6.24g、柠檬酸11.64g、乙酸钠10.7g加入容量瓶中；先加适量纯水，轻摇使之完全溶解；再用移液器准确量取冰乙酸2.28ml、双氧水1.2ml加入容量瓶中，轻摇混匀；以纯水定容至1000ml。
（6）阴性对照的配制
用电子天平准确称量氯化钠8g、Na2HPO4·12H2O3.4g、KH2PO40.24g、氯化钾0.24g、蔗糖60g，加入容量瓶；先加适量纯水，轻摇使之溶解完全；再用电子天平准确称量叠氮化钠1.2g，加入容量瓶，搅拌使之完全溶解，轻摇混匀；以纯水定容，混匀备用。
（7）阳性对照的配制
向步骤（6）制得的阴性对照溶液中加入羊抗兔抗体，加入量为每1mL阴性对照溶液中加入羊抗兔抗体36μg，制得阳性对照溶液。
实施例8
流行性出血热病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒使用方法
实施例1所述的流行性出血热病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒的使用方法：
（1）样品收集
静置待测血清30min，对所述待测血清进行离心处理10～20分钟，进行检测。
（2）加样检测
a.将在冷藏环境中贮藏的EHF酶结合物溶液瓶、底物A溶液瓶、底物B溶液瓶、EHF阴性对照溶液瓶、EHF阳性对照溶液瓶和终止液溶液瓶等试剂平衡至室温20℃～25℃；
b.将所述EHF酶标板用生理盐水洗3次；
c.采用生理盐水作为稀释液，按照1:100的比例分别稀释待检血清、阴性对照溶液和阳性对照溶液；
d．将所述酶标板上的一个反应孔作为空白孔；取稀释后的待检血清按100μl/孔加入到所述酶标板上的一个反应孔内，作为样品孔；取稀释后的阳性对照溶液按100μl/孔加入到所述酶标板上的一个反应孔内，作为阳性对照孔；取稀释后的待检血清按100μl/孔加入到所述酶标板上的两个反应孔内，作为阴性对照孔；
e.将所述EHF酶标板贴上封板膜，震荡混匀，置于36℃～38℃恒温水浴中反应30min；
f.取出所述EHF酶标板，揭下封板膜，向样品孔、阳性对照孔和阴性对照孔内各加入50μl酶结合物溶液，混匀，贴上封板膜，置于36℃～38℃恒温水浴中反应60min；
g.取出所述EHF酶标板，并揭下封板膜，用生理盐水洗涤各反应孔5次，每次间隔20秒，拍干；
h.依次向样品孔、阳性对照孔和阴性对照孔内各加入50μl底物溶液A，30μl底物溶液B，混匀，贴上封板膜，室温20℃～25℃避光放置20分钟，揭下封板膜，观察结果：若只判断检测样的阴阳性，采用目测方法，分别对比样品孔与阳性对照孔、阴性对照孔的颜色，即可得出检测结果；若需读出准确的检测数值，在步骤f后，向样品孔内再加入50μl终止液，混匀后，使用酶标仪读取结果；
（3）检测结果分析
在450nm波长下用空白孔调零读取各孔的吸光度值，并按如下计算方法，得出检测结果：
当阴性对照孔的平均吸光度值小于0.10时，临界值为0.10；当阴性对照孔平均吸光度值大于0.10时，临界值=3×阴性对照计算平均吸光度值；
a．比色法：
若样品孔吸光度值≥临界值，检测结果为阳性；
若样品孔吸光度值<临界值，检测结果为阴性；
b．比值法
若样品孔吸光度值/临界值≥1，检测结果为阳性；
若样品孔吸光度值/临界值<1，检测结果为阴性；
当阴性对照孔平均吸光度值/临界吸光度值<0.33，并且阳性对照孔平均吸光度值/临界吸光度值≥6.0时，则检测结果有效，否则应当重复试验。
本发明流行性出血热酶联免疫检测试剂盒的性能指标测试：
（1）阴性参考品符合率：用10份该试剂阴性参考品检测，检测结果全部成阴性。
（2）阳性参考品符合率：用10份该试剂阳性参考品检测（包括强、中、弱）检测，检测结果全部成阳性。
（3）精密性：用1份精密性参考品做10个测试，CV值不高于10%。
（4）临床实验结果：用本试剂盒检测已确诊的临床样本1000例（其中EHF阳性50例），检测结果显示，阴性符合率100%，阳性符合率100%，总符合率100%。
检测实例：共检测临床血清样本1000例（其中EHF阳性50例），使用本发明方法进行检测，其特异性和敏感性均为100%。
表1本发明EHF试剂盒检测结果与临床诊断结果比较
本发明不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所作出的种种变换，均落在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种流行性出血热病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，其特征在于：所述盒体内设有EHF酶标板、封板膜、EHF酶结合物溶液瓶、底物A溶液瓶、底物B溶液瓶、EHF阴性对照溶液瓶、EHF阳性对照溶液瓶和终止液溶液瓶；
所述EHF酶标板上设有五个以上的包被有固相抗人IgM单克隆抗体的透明反应孔；
每1000ml所述底物A溶液内含有柠檬酸三钠4.16g～6.24g、柠檬酸7.76g～11.64g、乙酸钠7.13g～10.70g、冰乙酸1.52ml～2.28ml、双氧水0.8ml～1.2ml；
每1000ml所述底物B溶液内含有无水乙醇520ml～780ml、乙二醇272ml～408ml、二甲基甲酰胺8ml～12ml、3，3'，5，5'-四甲基联苯胺0.8g～1.2g；
每1000ml所述EHF阴性对照溶液内含有氯化钠6g～8g、Na2HPO4·12H2O2.2g～3.4g、KH2PO40.16g～0.24g、氯化钾0.16g～0.24g、蔗糖40g～60g、叠氮化钠0.08g～0.12g；
所述EHF阳性对照溶液是在每1ml所述EHF阴性对照溶液中加入24μg～36μg的羊抗兔抗体配制而成的；
所述终止液是在900ml纯水中加入硫酸80ml～120ml配制而成的。
2.如权利要求1所述的一种流行性出血热病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述EHF酶标板上设有5~95个反应孔。
3.如权利要求1所述的一种流行性出血热病毒IgM抗体酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述EHF酶标板包括板架和多个可拆卸安装在所述板架上的反应板条，所述反应孔设置在所述反应板条上。
4.如权利要求1所述的一种流行性出血热IgM抗体酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述盒体内部设有隔断，使所述盒体内部具有多个空腔。
5.如权利要求4所述的一种流行性出血热IgM抗体酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述盒体内部设有一个横向隔断，使所述盒体分成一个上部用于容纳所述EHF酶结合物溶液瓶、底物A溶液瓶、底物B溶液瓶、EHF阴性对照溶液瓶、EHF阳性对照溶液瓶和终止液溶液瓶的空腔和一个底部用于容纳所述EHF酶标板的空腔。
6.权利要求1所述流行性出血热IgM抗体酶联免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于：
（1）EHF酶标板的制备：
1.1配制EHF包被液：用碳酸钠－碳酸氢钠缓冲溶液将抗人IgM单克隆抗体溶液稀释成浓度为0.8μg/ml、PH=9.5～9.7的溶液；
1.2包被：用步骤1.1制得的EHF包被液按100μl/孔对所述透明反应孔进行包被，并在2～8℃温度下静置40～50小时；
1.3洗涤液制备：将含有0.05%吐温－20、pH=7.5的PBS溶液与蒸馏水按体积比1:40混合均匀，制得洗涤液；
1.4洗涤：用洗涤液连续洗涤包被后的酶标板2次，拍干；
1.5封闭：向洗涤后的透明反应孔内按130μl/孔加入封闭液，所述封闭液为每1000ml纯水溶液中含NaHCO32.93g、Na2CO31.59g、牛血清白蛋白10g，并在20～25℃条件下，封闭2.8～3.2小时；
1.6甩出孔中的封闭液，加入保护液将反应孔密封，所述保护液组成为：9wt%～11wt%小牛血清和89wt%～91wt%甘油，制得EHF酶标板；
（2）EHF酶结合物溶液的配制：
2.1将5mg辣根过氧化物酶溶解在1ml双蒸水中，再加入21.4mg/ml的高碘酸钠溶液200μl，在室温18℃～25℃条件下混合均匀制备得到辣根过氧化物酶溶液；
2.2再将辣根过氧化物酶溶液加入PH4.4的醋酸-冰乙酸缓冲液，在2℃～8℃条件下透析16～20小时；
2.3取EHF抗原加入pH=9.6、碳酸钠含量为0.05mol/L的碳酸钠－碳酸氢钠缓冲溶液，在4℃条件下透析16～20小时；
2.4将透析后的辣根过氧化物酶溶液和EHF抗原溶液混匀，放入pH=9.6、碳酸钠含量为0.05mol/L的碳酸盐缓冲液中搅拌透析3～3.5小时，再加入4mg/ml的硼氢化钠溶液，加入量为50μl/0.5mg EHF抗原，并充分混匀；
2.5使步骤2.4得到的混合溶液通过葡聚糖凝胶G-200柱，同时用PH=7.1的PBS溶液洗脱；
2.6用小试管依次分段接收流出物，用事先包被好的羊抗鼠板条进行检测，收集试管内的羊抗鼠板条显兰色的试管内产物，制得酶结合物初溶液；
2.7将6g～8g氯化钠、140ml～160ml小牛血清和0.8g～1.2g叠氮钠溶解在1000ml纯水中，混匀制得酶结合物稀释液；
2.8将酶结合物初溶液用酶结合物稀释液按1:700稀释，并在2℃～8℃静置24小时，再按兔抗羊IgG－HRP溶液与稀释后的酶结合物初溶液体积比为1:5000加入兔抗羊IgG－HRP溶液，制得EHF酶结合物溶液；
（3）底物A溶液的配制
先将柠檬酸三钠4.16g～6.24g、柠檬酸7.76g～11.64g和乙酸钠7.13g～10.70g用纯水完全溶解，再加入1.52ml～2.28ml的冰乙酸和0.8ml～1.2ml的双氧水，最后用纯水定容至1000ml，制得底物A溶液；
（4）底物B溶液的配制
将0.95g～1.05g3，3'，5，5'-四甲基联苯胺溶解在10ml二甲基甲酰胺中，再加入650ml无水乙醇和340ml乙二醇，混匀，制得底物B溶液；
（5）终止液的配制
向900ml纯水中加入100ml硫酸，混匀，制得终止液；
（6）EHF阴性对照溶液的配制
将氯化钠6g～8g、Na2HPO4·12H2O2.2g～3.4g、KH2PO40.16g～0.24g、氯化钾0.16g～0.24g和蔗糖40g～60g完全溶解在纯水中，再加入0.8g～1.2g叠氮化钠，用纯水定容至1000ml，制得EHF阴性对照溶液；
（7）EHF阳性对照溶液的配制
向步骤（6）制得的EHF阴性对照溶液中加入羊抗兔抗体，加入量为每1mL阴性对照溶液中加入羊抗兔抗体24μg～36μg，制得EHF阳性对照溶液。
7.如权利要求1所述的流行性出血热IgM抗体酶联免疫检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）样品收集
静置待测血清30min，对所述待测血清进行离心处理10～20分钟，即可进行检测；
（2）加样检测
a.将在冷藏环境中贮藏的所述EHF酶结合物溶液瓶、底物A溶液瓶、底物B溶液瓶、EHF阴性对照溶液瓶、EHF阳性对照溶液瓶和终止液溶液瓶平衡至室温20℃～25℃；
b.将所述EHF酶标板用生理盐水洗3次；
c.采用生理盐水作为稀释液，按照1:100的比例稀释待检血清；
d．将所述酶标板上的至少一个反应孔作为空白孔；取稀释后的待检血清按100μl/孔加入到所述酶标板上的至少一个反应孔内，作为样品孔；取EHF阳性对照溶液按100μl/孔加入到所述酶标板上的至少一个反应孔内，作为阳性对照孔；取EHF阴性对照液按100μl/孔加入到所述酶标板上的至少两个反应孔内，作为阴性对照孔；
e.将所述EHF酶标板贴上封板膜，震荡混匀，置于36℃～38℃恒温水浴中反应29min～31min；
f.取出所述EHF酶标板，揭下封板膜，向样品孔、阳性对照孔和阴性对照孔内各加入50μl酶结合物溶液，混匀，贴上封板膜，置于36℃～38℃恒温水浴中反应58min～62min；
g.取出所述EHF酶标板，并揭下封板膜，用生理盐水洗涤各反应孔5次，每次间隔15秒～25秒，拍干；
h.依次向样品孔、阳性对照孔和阴性对照孔内各加入50μl底物溶液A和30μl底物溶液B，混匀，贴上封板膜，室温20℃～25℃避光放置10~30分钟，揭下封板膜，观察结果：若只判断检测样的阴阳性，采用目测方法，分别对比样品孔与阳性对照孔、阴性对照孔的颜色，即可得出检测结果；若需读出准确的检测数值，在步骤g后，向所述空白孔、样品孔、阳性对照孔和阴性对照孔内再分别加入50μl终止液，混匀后，使用酶标仪读取结果。
8.如权利要求7所述的流行性出血热IgM抗体酶联免疫检测试剂盒的使用方法，其特征在于，如待测血清不能及时检测，应将待测血清在-20℃～-15℃条件冻存。
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