CN102981000B - 一种基于合成肽检测羊痘病毒血清抗体的试剂盒 - Google Patents
一种基于合成肽检测羊痘病毒血清抗体的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
一种基于合成肽检测羊痘病毒血清抗体的试剂盒，包括以下步骤：(1)设计针对羊痘病毒主要免疫基因P32的短肽；(2)常规合成肽技术合成肽段；(3)基于合成肽检测羊痘病毒血清抗体的试剂盒；(4)优化条件，最终制备出检测羊痘病毒血清抗体的试剂盒。本发明包被用抗原属于体外人工合成的免疫肽片段，减少了使用全病毒的危险性，避免病毒的扩散和逃逸。合成肽纯度高，免疫学特性与羊痘病毒粒子相似，可替代羊痘病毒粒子作为检测用抗原，从而制备出敏感、特异、安全和可靠的羊痘病毒血清抗体检测试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测羊痘病毒血清抗体的试剂盒，具体说是一种应用合成肽抗原包被ELISA板，并在此基础上制备的检测羊痘病毒血清抗体的试剂盒。
背景技术
羊痘(Capripox)是由羊痘病毒(Capripoxvirus，CPV)引起可以感染山羊、绵羊及牛的导致山羊痘(variolacaprin，Goatpox)、绵羊痘(variolacaprin，Sheeppox)和牛的疙瘩皮肤病(Lumpy shindisease)的一种急性、热性、接触性传染病。主要表现为发热，无毛或少毛部位的皮肤或黏膜发生丘疹和疱疹。羊痘是所有动物痘病中最为严重的一种，有较高的病死率，能造成巨大的经济损失，严重影响国际贸易和养羊业的发展。其中羊痘在非洲，土耳其、印度、亚洲部分国家流行广泛，希腊也有零星分布。所以世界动物卫生组织(OIE) 将该病列为A 类疾病，我国将其列为一类动物疫病。此外，本病在公共卫生方面也有重要意义，中国、瑞典、印度依据流行病学和临床症状都有人类感染羊痘病毒的报道。世界各国都高度重视本病，有本病的国家和地区的易感动物及其有关的产品被世界各国列为严格限制进出口的对象。
目前该病缺乏有效的治疗药物，给该病的防控造成了很大的困难，因此羊痘的早期诊断就显得尤为重要。并且鉴于羊痘病毒对养羊业健康发展的巨大危害，开发一种操作简单、结果可靠、敏感性高、特异性好、方便基层应用并可产业化生产的血清抗体检测试剂是预防羊痘传播的可靠途径之一。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种以羊痘病毒合成肽抗原包被ELISA板为基础的检测羊痘病毒血清抗体试剂盒，此试剂盒可快速、特异、准确的检测羊痘病毒血清抗体，为羊痘病毒的临床诊断与预防提供参考依据，以克服现有检测方法存在的特异性不强，敏感性低等不足。
本发明的技术问题采用以下技术方案解决：
一种基于合成肽检测羊痘病毒血清抗体的试剂盒，包括以下步骤：
a.利用DNAstar(序列分析软件)软件设计针对羊痘病毒主要免疫蛋白P32的两条短肽片段；
b.将步骤a所设计序列采用常规合成肽方法合成肽段；
c.采用方正滴定方法，确定合成肽抗原包被ELISA(enzyme-linked immuno sorbent assay)板的浓度；
d.将阴性、阳性血清用PBS(Phosphate Buffer Solution,磷酸盐缓冲液)稀释为1:10，1:20，1:40，1:80，1:160 5个稀释度，进行ELISA检测，取P/N(阳性/阳性)值最大，OD(optical delnsity,光密度)值接近1的血清最大稀释倍数为最适稀释度，确定阳性血清、阴性血清及待检血清稀释度和反应时间；
e.利用棋盘滴定法选择工作浓度，根据“阳性血清OD值接近1”和“阳性值/阴性值最大”的原则，确定酶标记抗体工作浓度及反应时间。
f. 采集未免疫过羊痘病毒疫苗的健康羊血清，测其OD值并除以标准阴性血清的OD值(S/N，样品/阴性), 将所得到比值的平均值加标准差作为判定阴/阳性的临界值。
所述肽段序列如下：
A：PELKSDNDIFYKKVDTVKDFKNSDVNFFLKDKKDDI
B: YKLEKELKLNRQVLNDSSKYILHNTKYLSKKRANEMKN。
所述步骤c确定合成肽最佳包被浓度为0.3ug/孔，其中A:B的比例为1:1(A为0.15ug/孔，B为0.15ug/孔)。
所述步骤d的标准阳性血清、标准阴性血清和待检血清样品稀释度的体积比均为1:20；标准阳性血清、标准阴性血清和待检血清最佳反应时间为45min。
所述步骤e酶标抗体工作浓度为：用PBS将兔抗羊IgG-HRP(辣根过氧化物酶标记免疫球蛋白G)作1:400体积比稀释为酶标记抗体的最佳稀释度；酶标抗体最佳反应时间为45 min。
所述步骤f确定的判定标准为：S/N值≥2.20为阳性，S/N值≤1.65为阴性，S/N值介于2.20和1.65之间者为可疑，应重测，重测后S/N≥2.20判为阳性，S/N值＜2.20判为阴性。
本发明的有益效果在于设计并合成了针对羊痘病毒P32蛋白的肽段，该合成肽的生物学活性接近于羊痘病毒天然蛋白，并且比天然蛋白更易操作，可替代羊痘病毒直接作为检测用抗原，在此基础上制备检测羊痘病毒血清抗体的ELISA方法，该方法具有快速、敏感、特异等特点，为大规模的羊痘流行病学调查提供可靠的技术支持。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步详细叙述：
实施例1
1、利用DNAstar软件设计针对羊痘病毒主要免疫蛋白P32的两条短肽，采用常规合成肽方法合成肽段，所述肽段序列为：
A：PELKSDNDIFYKKVDTVKDFKNSDVNFFLKDKKDDI
B: YKLEKELKLNRQVLNDSSKYILHNTKYLSKKRANEMKN
2、将合成的两条短肽均用0.5M的PBS缓冲液稀释成6μg/ml, 之后A和B等体积混匀，ELISA板每孔加入50μL A和B的混合液, 4℃过夜，其中A为0.15μg/孔，B为0.15μg/孔。
3、弃去孔内液体，每孔加入220μL 1×PBST(磷酸盐吐温)洗涤液，洗3次，最后一次甩干。之后，每孔加入50μL封闭液(1%的明胶)，37℃温育45分钟，用PBST洗3次，最后一次甩干。
4、将阴性、阳性血清用PBS稀释为5个稀释度，即：1:10，将10μL血清加到90μLPBS中；1:20，将50μL1:10稀释的血清加到50μLPBS中；1:40，将50μL1:20稀释的血清加到50μLPBS中；1:80，将50μL1:40稀释的血清加到50μLPBS中；1:160，将50μL1:80稀释的血清加到50μLPBS中,进行ELISA检测,取P/N值最大,OD值接近1的血清最大稀释倍数为最适稀释度。最终确定阳性血清，阴性血清及待检血清稀释度为1:20体积比，反应时间为45min。
5. 连续梯度稀释兔抗羊IgG-HRP (即：1:100，将4μL兔抗羊IgG-HRP加到396μLPBS中；1:200，将2μL兔抗羊IgG-HRP加到398μLPBS中；1:300，将3μL兔抗羊IgG-HRP加到397μLPBS中；1:400，将1μL兔抗羊IgG-HRP加到399μLPBS中；1:500，将1μL兔抗羊IgG-HRP加到499μLPBS中；1:600，将1μL兔抗羊IgG-HRP加到599μLPBS中)，用稀释好的兔抗羊IgG-HRP测定标准阳性及阴性血清，读取OD值，结果1:400稀释的酶标抗体测定的阳性血清OD 值接近1，并且阳性值/阴性值最大，故最终确定酶标记抗体工作浓度1:400，反应时间为45min。
6.取51份未免疫过羊痘疫苗的健康羊血清的OD值分别除以标准阴性血清的OD值（S/N）(具体数值见表1)，得到51份比值，计算得出这些比值的平均值（X）=1.102925，标准差（SD）=0.551546。取X+2SD=2.206017，取2.20，X+SD=1.654471，取1.65。据此本实验确立了阴阳性判定标准：S/N值≥2.20为阳性，S/N值≤1.65为阴性，S/N值介于2.20和1.65之间者为可疑，应重测，重测后S/N≥2.20判为阳性，S/N值＜2.20判为阴性。
表1. 51份健康羊血清的OD值除以标准阴性血清的OD值（及S/N值）
7、样品1(羊痘阳性血清、羊痘阴性血清、小反刍兽疫阳性血清、羊口蹄疫阳性血清及羊口疮阳性血清)的制备
分别取羊痘阳性血清、羊痘阴性血清、小反刍兽疫阳性血清、羊口蹄疫阳性血清及羊口疮阳性血清样品各5μL，分别加入95μL磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Solution, PBS)，总体积100μL（1:20稀释），-20℃保存备用。
8、试剂盒特异性分析
8.1将步骤7中制备的样品1各取50μL 加到ELISA板中，37℃温育45分钟，PBST洗板3次，最后一次甩干。
8.2 每孔加入50μL1:400稀释的兔抗羊酶标记二抗，37℃温育45分钟，PBST洗板3次，最后一次甩干。
8.3 加入50μL底物(TMB，四甲基联苯胺)缓冲液，37℃闭光作用15分钟，加入50μL 2M硫酸终止反应，吸光度450nm处读取OD值。
9、结果
根据检测结果分析，除羊痘病毒阳性血清外，其他检测样品均为阴性( 表1) 。这些数据表明, 合成的多肽抗原与这些病毒产生的血清抗体之间不存在交叉反应。
表1. 特异性实验
实施例2
1-6步骤同实施例1。
7、样品2(羊痘阳性血清、羊痘阴性血清)的制备
对已知5只不同来源抗体阳性羊的5份血清样品和2只不同来源抗体阴性羊的2份血清样品，每份取5μL，再分别加入95μLPBS，稀释后的每份血清总体积100μL（1:20稀释），-20℃保存备用。
8、对同一批制备的检测试剂进行批内重复性试验, 每份血清样品做5孔重复，进行批内重复试验。
8.1将步骤7中制备阳性及阴性血清样品各取50μL 加到ELISA板中，重复5孔，37℃温育45分钟，PBST洗板3次，最后一次甩干(批内重复)。
8.2 每孔加入50μL1:400稀释的兔抗羊酶标记二抗，37℃温育45分钟，PBST洗板3次，最后一次甩干。
8.3 加入50μL底物(TMB，四甲基联苯胺)缓冲液，37℃闭光作用15分钟，加入50μL 2M硫酸终止反应，吸光度450nm处读取OD值。
9、结果
对已知的羊痘抗体阳性的5 份血清样品和2份羊痘抗体阴性血清样品进行重复性试验, 结果如表2所示, 批内重复的变异系数均值为4.36%，表明重复性较好。
表2. 批内重复
实施例3
1-6步骤同实施例1。
7. 样品3(羊痘疫苗免疫血清)的制备。
采购市售羊痘疫苗，按疫苗使用说明书免疫5只山羊，在免疫后2月采集免疫羊全血，并分离血清；同时采集一只未接受任何疫苗免疫的山羊全血，并分离血清，所有制备样品-20℃保存备用。
8、制备的检测试剂检测免疫羊血清抗体。
取分离的每只山羊各1份5μL羊痘免疫血清及1份5μL羊痘非免疫血清，分别加入95μL PBS, 各自总体积100μL（1:20稀释），按所制备的ELISA 试剂检测并分析。
8.1将制备的5份羊痘免疫及1份非免疫血清样品各取50μL 加到ELISA板中，37℃温育45分钟，PBST洗板3次，最后一次甩干。
8.2 每孔加入50μL1:400稀释的兔抗羊酶标记二抗，37℃温育45分钟，PBST洗板3次，最后一次甩干。
8.3 加入50μL底物(TMB，四甲基联苯胺)缓冲液，37℃闭光作用15分钟，加入50μL 2M硫酸终止反应，吸光度450nm处读取OD值。
9、结果
如表3所示，5只免疫山羊在用羊痘疫苗免疫后2个月，血清抗体均为阳性。
表3.羊痘疫苗免疫羊血清抗体检测结果
*表示市售羊痘疫苗免疫羊编号。
序列表
Organization Applicant
----------------------
Street : 兰州市城关区盐场堡徐家坪1号
City : 兰州
State : 甘肃
Country : 中国
PostalCode :
PhoneNumber : 0931-8343385
FaxNumber : 0931-8340977
EmailAddress : hnxiangtaohotmail.com；ltth1977163.com
<110> OrganizationName : 中国农业科学院兰州兽医研究所
Organization Applicant
----------------------
Street : 兰州市城关区盐场堡徐家坪1号
City : 兰州
State : 甘肃
Country : 中国
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PhoneNumber : 0931-8343385
FaxNumber : 0931-8340977
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<110> OrganizationName : 中国农业科学院兰州兽医研究所
Application Project
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<120> Title : 一种基于合成肽检测羊痘病毒血清抗体的试剂盒
<130> AppFileReference : 以合成肽为抗原检测O型口蹄疫病毒抗体ELISA方法的建立和评价
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<213> OrganismName : Sus scrofa
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PELKSDNDIF YKKVDTVKDF KNSDVNFFLK DKKDDI
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YKLEKELKLN RQVLNDSSKY ILHNTKYLSK KRANEMKN
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Organization Applicant
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City : 兰州
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PhoneNumber : 0931-8343385
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Claims (5)
1. 一种基于合成肽检测羊痘病毒血清抗体的试剂盒，其特征在于包括以下步骤制备而成：
a.利用DNAstar软件设计针对羊痘病毒主要免疫蛋白P32的两条短肽片段；
b.将步骤a所设计序列采用常规合成肽方法合成肽段，肽段序列如下：
A：PELKSDNDIFYKKVDTVKDFKNSDVNFFLKDKKDDI
B: YKLEKELKLNRQVLNDSSKYILHNTKYLSKKRANEMKN；
c.采用方正滴定方法，确定合成肽抗原包被ELISA板的浓度；
d. 将阴性、阳性血清用PBS稀释为1:10，1:20，1:40，1:80，1:160 5个稀释度，进行ELISA检测，取P/N值最大、OD值接近1的血清最大稀释倍数为最适稀释度，确定阳性血清、阴性血清及待检血清稀释度和反应时间；
e.利用棋盘滴定法选择工作浓度，根据“阳性血清OD值接近1”和“阳性值/阴性值最大”的原则，确定酶标记抗体工作浓度及反应时间；
f. 采集未免疫过羊痘病毒疫苗的健康羊血清，测其OD值并除以标准阴性血清的OD值, 将所得到比值的平均值加标准差作为判定阴/阳性的临界值。
2. 根据权利要求1所述一种基于合成肽检测羊痘病毒血清抗体的试剂盒，其特征在于:所述步骤c确定合成肽最佳包被浓度为0.3ug/孔，其中A:B的比例为1:1。
3. 根据权利要求1所述一种基于合成肽检测羊痘病毒血清抗体的试剂盒，其特征在于：所述步骤d的标准阳性血清、标准阴性血清和待检血清样品稀释度的体积比均为1:20；标准阳性血清、标准阴性血清和待检血清最佳反应时间为45min。
4. 根据权利要求1或2所述一种基于合成肽检测羊痘病毒血清抗体的试剂盒，其特征在于：所述步骤e酶标抗体工作浓度为：用PBS将兔抗羊IgG-HRP作1:400体积比稀释为酶标记抗体的最佳稀释度；酶标抗体最佳反应时间为45 min。
5. 根据权利要求1所述一种基于合成肽检测羊痘病毒血清抗体的试剂盒，其特征在于：所述步骤f确定的判定标准为：S/N值≥2.20为阳性，S/N值≤1.65为阴性，S/N值介于2.20和1.65之间者为可疑，应重测，重测后S/N≥2.20判为阳性，S/N值＜2.20判为阴性。
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