CN104988171A - 一种人ngal蛋白重组表达及制备方法 - Google Patents

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孔毅荣
李小红
刘强
于海双
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Abstract

本发明公开了一种具有天然免疫原活性的人源中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)的重组表达及制备方法，属于生物工程技术领域的发明。本发明利用大肠杆菌表达系统能够稳定、大量表达重组NGAL融合蛋白，然后利用蛋白酶切割NGAL融合蛋白后获得具有天然免疫原活性的NGAL重组蛋白。制备的NGAL重组蛋白可用作免疫原制备单克隆抗体和多抗血清，也可用于检测急性肾损伤的NGAL检测试剂。

Description

一种人NGAL蛋白重组表达及制备方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)的重组表达及制备方法。
背景技术
NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin)蛋白首先由Kjelden等人于1993年在中性粒细胞内发现，其与炎症、免疫应答、胚胎发育、信号转导及多种肿瘤的发生与发展过程相关。越来越多的研究结果提示NGAL可能是一种重要的炎症或肿瘤标志物。
研究表明，在一些炎症性疾病中，NGAL表达上调，是一种急性期反应蛋白。尤其NGAL与肾脏的一些炎症性疾病相关，是诊断急性肾损伤的重要生物学指标，对判断与监测病情变化有显著的意义。血液与尿液中的NGAL的检测对判断急性肾损伤是预测性的生物学指标。
NGAL蛋白是由一条多肽链构成的糖蛋白，其分子量为25kD，在大肠杆菌表达系统中以大部分包涵体形式表达。在本发明中，将NGAL与TF(Trigger factor)蛋白融合表达，融合蛋白以可以溶性形式表达，为避免大的标签蛋白对NGAL免疫原性的影响，采用蛋白酶酶切后纯化的方法去除标签蛋白，所得的重组NGAL蛋白仍以可溶性形式存在，并且具有很好的免疫原性。
发明内容
本发明公开了一种具有天然活性的重组NGAL蛋白的表达及制备方法。该方法通过构建重组NGAL原核表达载体，转化表达宿主菌，诱导菌体表达，收集菌体及纯化获得重组表达的NGAL融合蛋白。NGAL融合蛋白含有蛋白的的酶切位点，将获得的NGAL融合蛋白进行蛋白酶酶切处理，然后用阴离子交换柱纯化，从而最终获得天然NGAL大小的目的蛋白。本发明利用大肠杆菌表达系统进行重组表达，制备的重组NGAL融合蛋白具有很好的可溶性，可以大量生产，经过蛋白酶酶切处理后获得的天然NGAL大小的重组蛋白具有与天然NGAL一致的免疫原活性，其为人NGAL枪测试剂盒的研发提供了原料。
本发明还公开了使用上述方法获得的重组人NGAL蛋白在制备NGAL单克降抗体、多抗血清及人NGAL枪测试剂中的应用。
附图说明
图1是本发明制备人重组NGAL蛋白的流程示意图；
图2是本发明制备重组NGAL融合蛋白过程的SDS-PAGE电泳图：1、菌体超声沉淀；2、菌体超声上清；3、Ni2+螯合亲和柱纯化NGAL融合蛋白；4、蛋白酶酶切NGAL融合蛋白；5、Q离子柱洗脱TF蛋白；6、Q离子柱流穿NGAL蛋白；
图3是使用本发明的方法获得的重组NGAL蛋白免疫兔子所制备的兔多抗的效价检测；
图4是制备兔多抗配制的人NGAL枪测试剂的检测结果；
图5是使用本发明的方法获得的重组NGAL蛋白免疫兔子所制备的单克降抗体的效价枪测。
具体实施方式
实施例1：重组NGAL融合蛋白表达载体的构建
取5μg pUC57-NGAL质粒(由南京金斯瑞公司合成基因所构建质粒)，建立50μl的双酶切体系，具体如下：5μg的质粒，5μl的10×T酶切反应缓冲液，1.5μl Nde I和1.5μl XbaI，加双蒸水至总体积50μl，37℃水浴中反应6小时。琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，切下NGAL片段，使用凝胶回收试剂盒(OMEGA BIO-TEK)进行回收。
取600ng的pColdTM TF DNA(Takara)，建立50μl的双酶切体系，具体如下：600ng的pColdTM TF DNA质粒，5μl的10×T酶切反应缓冲液，1.5μl Nde I和1.5μl Xba I，加双蒸水至总体积50μl，37℃水浴中反应6小时。使用凝胶回收试剂盒(OMEGA BIO-TEK)纯化pColdTM TF DNA质粒的双酶切产物。
连接反应：取4μl经过纯化的pColdTM TF DNA的Nde I和Xba I双酶切产物，加入6μl经过纯化的NGAL双酶切产物，1μl的T4 DNA连接酶(TaKaRa)和1μl的10×T4 DNA连接酶反应缓冲液，16℃水浴中连接过夜。
连接产物转化大肠杆菌DH5α，然后挑取单克隆送公司测序(感受态DH5α的制备方法及转化方法依照“分子克降实验指南”第二版所述。J.萨姆布鲁克著)。所得重组质粒命名为pCold TF-NGAL。
实施例2：NGAL融合蛋白的表达及纯化
将pCold TF-NGAL质粒转化E.coli BL21(DE3)(Novagen公司)感受态细胞。工程菌的诱导表达：挑取单克降接种于100ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃、250rpm条件下培养过夜，制备种子液。
取10ml种子液接种入装有1L LB-Amp培养基的3L锥形瓶中，37℃培养至OD600为0.5左右，然后加入终浓度为0.5mM的IPTG，将温度降为18℃诱导18h，8000g离心获得菌体。制备全菌电泳样品，蛋白电泳分析目的蛋白表达情况。具体操作如下：超声破菌，12000g离心收集超声上清，Ni2+螯合亲和柱(GE)纯化蛋白：用平衡缓冲液(20mM Tris，0.5MNaCl、80mMimidazole，pH8.0)平衡柱子，先用冲洗缓冲液(20mM Tris，0.5MNaCl、80mM imidazole，pH8.0)洗脱杂蛋白，然后用洗脱缓冲液(20mM Tris，0.5MNaCl、300mM imidazole，pH8.0)洗脱目的蛋白。SDS-PAGE电泳的样品制备方法、电泳电压、凝胶染色和脱色的方法见“分子克隆实验指南”第二版所述。J.萨姆布鲁克著。
实施例3：NGAL融合蛋白的蛋白酶酶切
在本发明的一个实施例中，优选本公司白制的重组HRV 3C蛋白酶。具体方法：在高纯度的NGAL融合蛋白样品中加入HRV 3C蛋白酶(蛋白酶与NGAL融合蛋白质量比为1∶100-1∶1000)，4℃切割24-48h。
实施例4：NGAL融合蛋白酶切后纯化去除标签蛋白
标签蛋白TF的等电点为5.3，NGAL蛋白的等电点为9左右，利用QFF阴离子交换柱分离两个蛋白，具体方法：NGAL蛋白的蛋白酶切样品于透析缓冲液(20mM Tris，pH8.0)中透析过夜，平衡缓冲液(20mM Tris，pH8.0)平衡柱子，样品上样，QFF流穿蛋白峰为NGAL蛋白，洗脱缓冲液(20mM Tris，1M NaCl，pH8.0)洗脱蛋白为标签蛋白TF。
实施例5：双向免疫扩散评价重组NGAL蛋白免疫原活性
琼脂板制备：将1％琼脂糖置于沸水中溶化，水平铺制琼脂板。待琼脂凝固后，用打孔器打梅花形小孔(中间1孔，周围6孔)，通过火焰封底。
加样：中间孔加入兔抗NGAL多抗(LSBio)5mg/ml，将未经酶切的重组NGAL融合蛋白、酶切后的重组NGAL蛋白均以起始浓度0.5mg/ml，连续对半稀释5个蛋白浓度，分别加入相应的周围6孔中。
扩散：将琼脂板放入湿盒内置37℃水浴箱中12-24h取出观察结果(表一)。
表一：蛋白酶酶切前后活性比较
双向免疫扩散
酶切前 1∶2
酶切后 1∶32
实施例7：重组NGAL蛋白免疫兔子，制备兔血清
以制备的重组人NGAL蛋白为免疫原，免疫5只新西兰兔。免疫方法：初次免疫，300μg蛋白量加入等体积的弗氏完全佐剂，充分乳化，在背上皮下多点注射；3周后，取蛋白加弗氏不完全佐剂乳化后进行皮下多点注射；每2周加强免疫一次。从加强免疫第3次开始，在每次免疫后第七天采血检测效价，第5次免疫后，获得高效价的抗体，重组蛋白免疫抗血清滴度为800×104。以此兔多抗配制的人NGAL检测试剂结果见图4，从图中可见用重组人NGAL制备的兔多抗可以用于NGAL的检测试剂的应用。
实施例8：重组NGAL蛋白免疫小鼠，制备单克降抗体
免疫小鼠：制备的重组NGAL蛋白按每只小鼠100μg蛋白量与弗氏完全佐剂等体积混匀乳化，皮下免疫；3周后，二次免疫，50μg蛋白最与弗氏不完全佐剂等体积混匀，乳化后，腹腔注射免疫；2周后，三次免疫，方法同二次免疫；7天后，采尾静脉血检测，效价大于24W。
单克降抗体制备：取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，进行HAT选择性培养，利用ELISA方法筛选出阳性细胞株，进行三次单克降化培养，得到稳定分泌抗体的单克隆细胞株，将每株单克降抗体杂交瘤细胞株进行扩大培养后，制备腹水。
抗体纯化及效价枪测：采集的腹水经过protein A柱纯化，获得高纯度的小鼠单抗蛋白。包被5μg/ml NGAL蛋白，利用ELISA检测制备的腹水抗体效价。

Claims (6)

1.一种人NGAL蛋白的重组表达方法，其特征在于，构建pColdTF-NGAL的表达载体，转化表达菌株后，诱导菌体表达重组NGAL融合蛋白。
2.根据权利要求1所述NGAL融合蛋白的制备方法，其特征在于，表达质粒为pColdTFTMDNA原核表达载体，该原核表达载体表达的NGAL融合蛋白可利用金属离子螯合亲和柱进行纯化。
3.根据权利要求1-2所述重组表达的NGAL融合蛋白，将其用于制备天然蛋白大小的重组NGAL的方法，其特征在于纯化获得重组表达的NGAL融合蛋白后，再将该融合蛋白进行蛋白酶酶切处理。
4.根据权利要求3所述的制备方法，所用的蛋白酶的特征在于，蛋白酶选自胰蛋白酶，凝血酶、Factor Xa、HRV 3C酶中的任一种；所述蛋白酶包括天然提取及基因工程重组蛋白酶；本发明中优选蛋白酶为HRV 3C酶。
5.所述HRV 3C酶的酶切方法，其特征在于重组人NAGL融合蛋白与蛋白酶质量比为100∶1-1000∶1，酶切条件为4℃，作用时间为24-48h。
6.根据权利要求1-5所述的制备的重组NGAL蛋白在制备单克隆抗体、多抗血清及其在人NGAL检测试剂中的应用。
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