CN105567719A - cTnⅠ主要表位区的重组表达及其抗体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明选取cTnⅠ的三个主要的抗原表位区，分别构建其表达载体，在大肠杆菌表达系统中大量制备人cTnⅠ的三种重组蛋白：cTnⅠ-N、cTnⅠ-S和cTnⅠ-C。三种重组蛋白具有天然cTnⅠ蛋白的免疫原性，可作为抗原免疫动物，制备针对cTnⅠ不同表位区的单抗或多抗，也可偶联载体蛋白后免疫动物，制备cTnⅠ特定区域的单抗或者多抗。

Description

cTnⅠ主要表位区的重组表达及其抗体的制备方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及人肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)的三个主要表位区的重组表达及其相应抗体的制备方法。
背景技术
急性心肌梗塞（AMI）是临床常见急性多发病，是威胁人类生命的主要疾病之一。在AMI生化诊断指标方面，肌酸激酶同工酶（CK-MB）一度被认为是诊断的“金标准”，但CK-MB非心脏特有，非心脏手术或骨骼肌损伤病人也常出现CK-MB增高，造成AMI诊断假阳性。近年来的研究表明，人心肌肌钙蛋白Ⅰ(cardiactroponinⅠ,cTnⅠ)具有高度心肌特异性，当心肌细胞受损时，血液中的cTnⅠ出现时间早，持续时间长，与心肌损伤程度及预后密切相关，可作为心肌损伤诊断的一项特异性指标，正逐步取代CK-MB成为判断心肌损伤的新的特异性标准物。
肌钙蛋白（Troponin，Tn）由肌钙蛋白Ⅰ（TnⅠ）、肌钙蛋白C（TnC）和肌钙蛋白T(TnT)三个亚单位组成。TnⅠ有三种亚型：快型骨骼肌亚型，慢型骨骼肌亚型和心肌亚型。心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ）在心肌组织中表达，在骨骼肌中不表达，具有心肌的高度特异性。正常情况下cTnⅠ与TnT和TnC结合，以三元复合物的形式存在，AMI后cTnⅠ释放入血，其在血清中大部分以复合物的形式存在，其中4.1%为游离型，还可能以氧化型、还原型、磷酸化、去磷酸化及蛋白降解片段等多种形式存在。
cTnⅠ共有210个氨基酸，含2个半胱氨酸，原核表达系统中表达的重组蛋白均为包涵体，较难复性，且复性后的蛋白易被蛋白酶降解，难以保存。目前cTnⅠ蛋白主要从人心肌组织提取，来源有限，成本昂贵，很难大量制备，所以表达高免疫原性的人cTnⅠ蛋白，并制备其特异性抗体具有很好的市场前景。
发明内容
本发明公开了一种cTnⅠ主要表位区的重组表达方法。根据cTnⅠ表位图谱和蛋白结构，本发明选取了位于cTnⅠ的N端、C端和中间稳定区的三个表位区，在大肠杆菌表达系统中均获得可溶性表达。本发明还公开了使用三种重组蛋白制备cTnⅠ单克隆抗体、多抗血清的方法。
附图说明
图1是本发明制备人cTnⅠ主要表位区重组蛋白的流程示意图；
图2是本发明制备重组cTnⅠ主要表位区的SDS-PAGE电泳图：
1、Ni2+螯合亲和柱纯化cTnⅠ-N融合蛋白；
2、Ni2+螯合亲和柱纯化cTnⅠ-S融合蛋白；
3、Ni2+螯合亲和柱纯化cTnⅠ-C融合蛋白；
4、酶切纯化后cTnⅠ-N蛋白；
5、酶切纯化后cTnⅠ-S蛋白；
6、酶切纯化后cTnⅠ-C蛋白；
7、TF蛋白；
图3是使用本发明的方法获得的重组cTnⅠ-N、cTnⅠ-S和cTnⅠ-C蛋白免疫原性的检测；
图4是使用本发明的方法获得的重组蛋白cTnⅠ-N、cTnⅠ-S和cTnⅠ-C偶联载体蛋白后，免疫兔子，对所制备的多抗血清进行效价检测；
图5是使用本发明的方法获得的重组蛋白cTnⅠ-N、cTnⅠ-S和cTnⅠ-C免疫小鼠，对所制备单抗腹水进行效价检测。
具体实施方式
实施例1：cTnⅠ-N编码序列的扩增
cTnⅠ-N包含了全长cTnⅠN端的特征性表位区。使用PCR方法从质粒pUC57-cTnⅠ（由南京金斯瑞公司合成cTnⅠ编码序列所构建的重组质粒）扩增出cTnⅠN端1-79位氨基酸的编码序列，所用的引物N5的5’端添加了NdeⅠ的酶切位点，引物N3的3’端添加了XbaⅠ的酶切位点
cTnN5：5’-aagcatatggccgatggttcttccgatg-3’
cTnN3:5’-aagtctagagcaacgcgtgctcagtgc-3’
100μl的PCR反应体系中加入1μl的VentDNA聚合酶（NEB），20μmol/L的cTnN5和cTnN3各2μl，2.5mmol/L的dNTP加入8μl，10×PCR反应缓冲液加入10μl，PCR的反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸50秒，然后回到预变性，共进行25个循环，最后延伸7分钟。通过琼脂糖凝胶电泳分离出PCR产物中的目的条带，然后将目的条带切下、纯化。
实施例2：cTnⅠ-S编码序列的扩增
cTnⅠ-S是指cTnⅠ序列中部的稳定区。使用PCR方法从质粒pUC57-cTnⅠ（由南京金斯瑞公司合成cTnⅠ编码序列所构建质粒）扩增出cTnⅠ稳定区28-110位氨基酸的编码序列，所用的引物cTnS5的5’端添加了NdeⅠ的酶切位点，引物cTnS3的3’端添加了XbaⅠ的酶切位点
cTnS5：5’-aagcatatggcgtatgccaccgaaccg-3’
cTnS3:5’-aagtctagattcttcgtcaactttatccacgcg-3’
100μl的PCR反应体系中加入1μl的VentDNA聚合酶（NEB），20μmol/L的cTnS5和cTnS3各2μl，2.5mmol/L的dNTP加入8μl，10×PCR反应缓冲液加入10μl，PCR的反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸50秒，然后回到预变性，共进行25个循环，最后延伸7分钟。通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的目的条带，然后将目的条带切下、纯化。
实施例3：cTnⅠ-C编码序列的扩增
cTnⅠ-C包含了全长cTnⅠC端区域的序列。使用PCR方法从质粒pUC57-cTnⅠ（由南京金斯瑞公司合成cTnⅠ编码序列所构建质粒）扩增出cTnⅠC端150-210位氨基酸的编码序列，所用的引物C5的5’端添加了NdeⅠ的酶切位点，引物N3的3’端添加了XbaⅠ的酶切位点
cTnC5：5’-aagcatatggcggatgccatgatgcag-3’
cTnC3:5’-aagtctagacgattcaaatttctttttacgacc-3’
100μl的PCR反应体系中加入1μl的VentDNA聚合酶（NEB），20μmol/L的cTnC5和cTnC3各2μl，2.5mmol/L的dNTP加入8μl，10×PCR反应缓冲液加入10μl，PCR的反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸40秒，然后回到预变性，共进行25个循环，最后延伸7分钟。通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的目的条带，然后将目的条带切下、纯化。
实施例4:重组cTnⅠ-N、cTnⅠ-S和cTnⅠ-C融合蛋白表达载体的构建
分别取3μgcTnⅠ-N、cTnⅠ-S和cTnⅠ-C编码序列的PCR回收产物，分别建立50μl的双酶切体系，具体如下：3μg的PCR回收产物，5μl10×T酶切反应缓冲液，1.5μlNdeⅠ和1.5μlXbaⅠ，加双蒸水至总体积50μl，37℃水浴中反应6小时。使用凝胶回收试剂盒（OMEGABIO-TEK）进行回收。
取600ng的pColdTMTFDNA（Takara），建立50μl的双酶切体系，具体如下：600ng的pColdTMTFDNA质粒，5μl的10×T酶切反应缓冲液，1.5μlNdeⅠ和1.5μlXbaⅠ，加双蒸水至总体积50μl，37℃水浴中反应6小时，核酸凝胶电泳，切胶，使用凝胶回收试剂盒（OMEGABIO-TEK）纯化pColdTMTFDNA质粒的双酶切产物。
连接反应：取4μl经过纯化的pColdTMTFDNA的NdeⅠ和XbaⅠ双酶切产物，加入6μl经过纯化的NGAL双酶切产物，1μl的T4DNA连接酶（TaKaRa）和1μl的10×T4DNA连接酶反应缓冲液，16℃水浴中连接过夜。
连接产物转化大肠杆菌DH5α，然后挑取单克隆菌落送公司测序（感受态DH5α的制备方法及转化方法依照“分子克隆实验指南”第二版所述。J.萨姆布鲁克著）。所得重组质粒分别命名为pColdTF-cTnⅠN、pColdTF-cTnⅠS和pColdTF-cTnⅠC。
实施例5：cTnⅠ-N、cTnⅠ-S和cTnⅠ-C融合蛋白的表达及纯化
分别将pColdTF-cTnⅠN、pColdTF-cTnⅠS和pColdTF-cTnⅠC质粒转化E.coliBL21（DE3）（Novagen公司）感受态细胞。工程菌的诱导表达如下所示：挑取单克隆接种于100ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃、250rpm条件下培养过夜，制备种子液。
取10ml种子液接种入装有1LLB-Amp培养基的3L锥形瓶中，37℃培养至OD600为0.5左右，然后加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，将温度降为18℃诱导18h，8000g离心获得菌体。制备全菌电泳样品，蛋白电泳分析目的蛋白表达情况。具体操作如下：超声破菌，12000g离心收集超声上清，Ni2+螯合亲和柱(GE）纯化蛋白：用平衡缓冲液（20mmol/LTris，0.5mol/lNaCl、80mmol/Limidazole，pH8.0）平衡柱子，先用冲洗缓冲液（20mmol/LTris，0.5mol/LNaCl、80mmol/Limidazole，pH8.0）洗脱杂蛋白，然后用洗脱缓冲液（20mmol/LTris，0.5MNaCl、300mmol/Limidazole，pH8.0）洗脱目的蛋白。SDS-PAGE电泳的样品制备方法、电泳电压、凝胶染色和脱色的方法见“分子克隆实验指南”第二版所述。J.萨姆布鲁克著。
实施例3：cTnⅠ-N、cTnⅠ-S和cTnⅠ-C融合蛋白的蛋白酶酶切
在本发明的一个实施例中，优选本公司自制的重组HRV3C蛋白酶。具体方法：分别在高纯度的cTnⅠ-N、cTnⅠ-S和cTnⅠ-C融合蛋白样品中加入HRV3C蛋白酶（蛋白酶与融合蛋白质量比为1:200-1:2000），4℃切割24-48h。
实施例6：cTnⅠ-N、cTnⅠ-S和cTnⅠ-C融合蛋白酶切后去除标签蛋白
标签蛋白TF的等电点为5.3，cTnⅠ-N、cTnⅠ-S和cTnⅠ-C蛋白的等电点为9左右，利用SPFF阳离子交换柱分离两个蛋白，具体方法：cTnⅠ融合蛋白的蛋白酶切样品于透析缓冲液（20mmol/LNaAC，pH4.8）中透析过夜，平衡缓冲液（20mmol/LNaAC，pH4.8）平衡柱子，样品上样，流穿蛋白峰为TF蛋白，洗脱缓冲液（20mmol/LNaAC，pH4.8，1mol/LNaCl，pH4.8）洗脱蛋白为cTnⅠ重组蛋白。
实施例7：cTnⅠ-N、cTnⅠ-S和cTnⅠ-C蛋白免疫原活性检测
cTnⅠ-N、cTnⅠ-S和cTnⅠ-C蛋白均以50ng/ml为起始检测浓度，分别进行连续对半稀释，用全自动生化分析仪（Roche检测试剂）分别测定不同浓度的cTnⅠ-N、cTnⅠ-S和cTnⅠ-C蛋白的cTnⅠ含量。
实施例8：cTnⅠ-N、cTnⅠ-S和cTnⅠ-C蛋白与载体蛋白的偶联、免疫兔子及制备兔血清
cTnⅠ-N、cTnⅠ-S和cTnⅠ-C蛋白分别偶联载体蛋白，各免疫2只新西兰兔。免疫方法：初次免疫，300μg蛋白量加入等体积的弗氏完全佐剂，充分乳化，在背上皮下多点注射；3周后，取蛋白加弗氏不完全佐剂乳化后进行皮下多点注射；每2周加强免疫一次。从加强免疫第3次开始，在每次免疫后第七天采血检测效价，第4次免疫后，获得高效价的抗体。
实施例9：cTnⅠ-N、cTnⅠ-S和cTnⅠ-C免疫小鼠，制备单克隆抗体
免疫小鼠：cTnⅠ-N、cTnⅠ-S和cTnⅠ-C蛋白分别按每只小鼠100μg蛋白量与弗氏完全佐剂等体积混匀乳化，皮下免疫；3周后，二次免疫，50μg蛋白量与弗氏不完全佐剂等体积混匀，乳化后，腹腔注射免疫；2周后，三次免疫，方法同二次免疫；7天后，采尾静脉血检测效价。
单克隆抗体制备及效价检测：取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，进行HAT选择性培养，利用ELISA方法筛选出阳性细胞株，进行三次单克隆化培养，得到稳定分泌抗体的单克隆细胞株，将每株单克隆抗体杂交瘤细胞株进行扩大培养后，制备腹水。分别包被5μg/mlcTnⅠ-N、cTnⅠ-S和cTnⅠ-C蛋白，ELISA检测制备的腹水抗体效价。

Claims (7)

1.一种cTnⅠ主要抗原表位区的重组表达方法，其特征在于，选取cTnⅠ蛋白的三段表位区，分别构建表达载体pColdTF-cTnⅠN、pColdTF-cTnⅠS和pColdTF-cTnⅠC，转化表达菌株后，诱导菌体表达cTnⅠ-N、cTnⅠ-S和cTnⅠ-C融合蛋白。
2.根据权利要求1所述重组表达的人cTnⅠ-N、cTnⅠ-S和cTnⅠ-C融合蛋白，其特征在于：cTnⅠ-N融合蛋白具有位于cTnⅠ天然蛋白的氨基端的一段表位区，具有序列表中SEQIDNo1氨基酸序列；cTnⅠ-S融合蛋白含有cTnⅠ天然蛋白的中心稳定区，具有序列表中SEQIDNo2氨基酸序列；cTnⅠ-C具有位于cTnⅠ天然蛋白的羧基端的一段表位区，具有序列表中SEQIDNo3氨基酸序列，上述cTnⅠ-N、cTnⅠ-S和cTnⅠ-C融合蛋白氨基端均融合有蛋白TF，TF具有序列表中SEQIDNo4氨基酸序列。
3.根据权利要求1-2所述的cTnⅠ主要抗原表位区重组蛋白的制备方法，其特征在于，表达质粒为pColdTF原核表达载体，诱导表达的cTnⅠ-N、cTnⅠ-S和cTnⅠ-C融合蛋白可利用金属螯合亲和层析柱进行纯化。
4.根据权利要求1-3所述表达的cTnⅠ主要表位区重组蛋白，其特征在于纯化获得重组表达cTnⅠ-N、cTnⅠ-S和cTnⅠ-C融合蛋白后，再将融合蛋白进行蛋白酶酶切处理；酶切后蛋白经过离子柱纯化后获得cTnⅠ-N、cTnⅠ-S和cTnⅠ-C蛋白。
5.根据权利要求4所述的制备方法，所用的蛋白酶的特征在于，蛋白酶选自胰蛋白酶，凝血酶、FactorXa、3C酶中的任何一种；上述蛋白酶包括天然提取及基因工程重组蛋白酶，本发明中优选蛋白酶为3C蛋白酶。
6.使用上述蛋白酶进行酶切时，重组cTnⅠ-N、cTnⅠ-S和cTnⅠ-C融合蛋白与蛋白酶质量比为2000:1至200:1，酶切温度为4℃，作用时间为24h-48h。
7.根据权利要求1-6所述的方法制备的cTnⅠ-N、cTnⅠ-S和cTnⅠ-C重组蛋白，可作为抗原免疫动物，制备cTnⅠ特定区域的单抗或多抗；也可以偶联载体蛋白后进行免疫，制备cTnⅠ特定区域的单抗或多抗，载体蛋白可选择BSA、KLH、OVA中任一种。
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