CN106906185A - 一株抗托曲珠利单克隆抗体杂交瘤细胞株k‑5及其应用 - Google Patents

一株抗托曲珠利单克隆抗体杂交瘤细胞株k‑5及其应用 Download PDF

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Abstract

一株抗托曲珠利单克隆抗体杂交瘤细胞株K‑5及其应用,属于食品安全免疫检测领域。本发明一株抗托曲珠利单克隆抗体杂交瘤细胞株K‑5,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,简称CGMCC,保藏编号为CGMCC No.13095。此细胞株分泌的单克隆抗体,对托曲珠利具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50值为5.0 ng/mL),可以用于食品安全中托曲珠利的残留检测。

Description

一株抗托曲珠利单克隆抗体杂交瘤细胞株K-5及其应用
技术领域
本发明一株抗托曲珠利单克隆抗体杂交瘤细胞株K-5及其应用,属于食品安全免疫学检测领域,涉及杂交瘤细胞株K-5及其产生的抗托曲珠利单克隆抗体。
背景技术
托曲珠利(Toltrazuril,TOL)属于三嗪酮类新型广谱抗球虫药, 俗称托曲珠利可溶性粉。为类白色至淡黄色粉末,无臭,在醋酸乙酯及二氯甲烷中溶解,在甲醇中略溶,在水中不溶。其在预防和治疗家禽球虫病方面效果显著,对鸡堆型布氏巨裂和缓毒害柔嫩艾美耳球虫及火鸡腺状艾美耳球虫、大艾美耳球虫、小艾美耳球虫均有杀毒作用。在畜牧养殖业被广泛应用。其杀球虫机理为:通过干扰球虫细胞核分裂和线粒体,影响球虫的呼吸和代谢功能,并能够使细胞内质网庞大,发生严重的空泡化,从而使球虫死亡。但其对动物机体存在着一定的危害。
目前检测托曲珠利的方法主要有气相色谱法(GC),液相色谱法(HPLC),液质联用技术(LC-MS)、串联质谱法(LC-MS/MS)等仪器方法,其准确度和灵敏度均能很好的满足需求,但是这些方法存在操作繁琐,耗时,费用比较贵等缺点,不能实现大量样品的现场快速检测,因此建立一种快速简便的托曲珠利检测方法具有重要意义。酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、灵敏、快速的检测方法,检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便,适用于大量样本的现场快速检测。然而得到高灵敏度和强特异性的单克隆抗体是免疫学检测的前提,其中半抗原的设计是最重要的一环节。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对托曲珠利具有高灵敏度和强特异性的单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法。提供一株抗托曲珠利单克隆抗体杂交瘤细胞株,由该细胞株制备的抗体对托曲珠利具有较好特异性和检测灵敏度,可以用来建立托曲珠利的免疫学检测方法。
本发明的技术方案:一株抗托曲珠利单克隆抗体杂交瘤细胞株K-5,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,简称CGMCC,保藏编号为CGMCC No.13095。
托曲珠利单克隆抗体,它由所述保藏编号为CGMCC No.13095的托曲珠利单克隆抗体杂交瘤细胞株K-5分泌产生。
所述的托曲珠利单克隆抗体的应用,用于食品安全中托曲珠利的残留检测。
本发明提供的细胞株K-5的制备基本步骤为:
(1)免疫原(TOL-KLH)的制备:称取托曲珠利半抗原(TOLCOOH),其结构式如下:
TOLCOOH 4.6 mg,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC 4.4 mg和N-羟基丁二酰亚胺NHS 2.6 mg,溶于0.6 mL无水N,N-二甲基甲酰胺,室温搅拌反应4 h,称为A液;量取血蓝蛋白KLH 6.0 mg,用0.05 M、pH 9.6的碳酸盐缓冲溶液稀释至3.0 mg/mL,称为B液;在磁力搅拌作用下,逐滴将A液加入到B液中,室温反应过夜,即得完全抗原TOL-KLH,通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原,并通过紫外吸收扫描方法鉴定;包被原TOL-OVA的制备方法同免疫原的制备,将KLH换为鸡卵清蛋白OVA即可;
(2)小鼠的免疫:托曲珠利完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后,通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠,第一次免疫用完全弗氏佐剂,之后都用不完全弗氏佐剂,首免与加强免之间间隔一个月,加强免之间间隔21天。最后一次用托曲珠利完全抗原(不含佐剂)冲击免疫;通过间接ELISA检测血清效价和抑制;
(3)细胞融合与细胞株建立:通过聚乙二醇(PEG 4000)法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合,通过HAT培养基培养,利用间接ELISA检测阳性细胞孔,并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果,通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行3次亚克隆,最终筛选获得杂交瘤细胞株K-5;
(4)杂交瘤细胞株性质的鉴定:通过间接竞争ELISA法测定灵敏度和特异性。
本发明的优点在于:(1)设计出一种托曲珠利新型半抗原,并成功合成人工抗原;(2)本发明获得的抗托曲珠利单克隆抗体细胞株,对托曲珠利有很好的检测灵敏度和特异性(IC50值为5.0 ng/mL)。
生物材料样品保藏:一株单克隆细胞株K-5,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,简称CGMCC,地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,保藏编号为CGMCC No.13095,保藏日期为2016年10月31日。
附图说明
图1.K-5分泌的托曲珠利单克隆抗体的抑制标准曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明,不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
本发明通过将托曲珠利完全抗原免疫小鼠,通过细胞融合,HAT选择性培养基培养,通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清,最终得到了对托曲珠利有很好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。
实施例 1:杂交瘤细胞株K-5的制备
1、完全抗原的合成
称取托曲珠利半抗原(TOLCOOH)4.6 mg,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)4.4 mg和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)2.6 mg,溶于0.6 mL无水N,N-二甲基甲酰胺(混合液称为A液),室温搅拌反应4 h。量取血蓝蛋白(KLH)6.0 mg,用0.05 M、pH 9.6的碳酸盐缓冲溶液稀释至3.0 mg/mL(称为B液),在磁力搅拌作用下,逐滴将A液加入到B液中,室温反应过夜,即得完全抗原(TOL-KLH),通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原,并通过紫外吸收扫描方法鉴定;包被原(TOL-OVA)的制备方法同免疫原的制备,将KLH换为鸡卵清蛋白(OVA)即可。
2、动物免疫
选择健康的6~8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取托曲珠利完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后,通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂,之后都用不完全弗氏佐剂。首免与加强免之间间隔一个月,加强免之间间隔21天。三免后7天采血,使用间接竞争ELISA方法测定小鼠血清效价和抑制,选择效价高抑制好的小鼠,在四免后18天冲击免疫,不使用佐剂,腹腔注射。
3、细胞融合
在冲击免疫3天后,按照常规PEG(聚乙二醇,分子量为4000)方法进行细胞融合,具体步骤如下:(1)无菌取小鼠脾脏,研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液,并进行细胞计数;(2)收集SP2/0细胞,悬浮于RPMI-1640基础培养液中,进行细胞计数;(3)将脾细胞和SP2/0细胞按照计数比1︰10 的比例混合,离心后用50% PEG融合,时间1 min,之后按照从慢到快,加入RPMI-1640基础培养液,离心后悬浮于含20% 胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中,加到96孔细胞培养板,置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
4、细胞筛选与细胞株建立
在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液,第5天进行用含20%胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液,在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步:第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔,第二步选用托曲珠利为标准品,用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对托曲珠利标准品均有较好抑制的细胞孔,采用有限稀释法进行亚克隆,用同样的方法进行检测。重复3次,获得细胞株K-5。
5、单克隆抗体的制备与鉴定
取8~10周龄BALB/c小鼠,每只小鼠腹腔注射石蜡油1 mL;7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞,从第7天开始收集腹水,将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化,获得的单抗置于-20℃保存。
使用间接竞争ELISA,测定单克隆抗体托曲珠利的IC50分别为:5.0 ng/mL,说明对托曲珠利有很好的灵敏度,可用于托曲珠利免疫分析检测。K-5分泌的托曲珠利单克隆抗体的交叉反应率如表1所示。
表1 托曲珠利单克隆抗体K-5的交叉反应率
化学物质 CR(%)
托曲珠利 5.0 100
盐霉素 >1000 <0.05
拉沙菌素 >1000 <0.05
莫能菌素 >1000 <0.05
马杜霉素 >1000 <0.05
海南霉素 >1000 <0.05
地克珠利 >1000 <0.05
6、抗体应用
将杂交瘤细胞株K-5通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于托曲珠利的ELISA添加回收试验,具体步骤如下:
(1)包被:将包被原TOL-OVA用0.05M pH 9.6 碳酸盐缓冲液从2 µg/mL开始倍比稀释,100 µL/孔,37℃反应2 h;
(2)洗涤:将板内溶液倾去,甩干,并用洗涤液洗涤3次,每次3min;
(3)封闭:拍干后,加入200 µL/孔封闭液,37℃反应2 h。洗涤后烘干备用;
(4)加样:将抗血清从1︰1000开始倍比稀释,并加入到各稀释度的包被孔中,100 µL/孔,37℃反应1 h;充分洗涤后,加入1︰3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG,100 µL/孔,37℃反应1h;
(5)显色:将酶标板取出,充分洗涤后,每孔加入100 µL的TMB显色液,37℃避光反应15min;
(6)终止和测定:每孔加入50 µL2M H2SO4终止液以终止反应,然后用酶标仪测定各孔的OD450值;
(7)结果判读:以OD450值大于或等于阴性对照孔的2.1倍(即P/N≥2.1)所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价。
添加回收及样品前处理:
本实验选取阴性鸡肉组织为样本,经LC-MS鉴定选取的鸡肉样本中不含有托曲珠利。称取4份1 g鸡肉均质样品置入50 mL离心管中,分别添加2.0 ng/g、5.0 ng/g和10.0 ng/g托曲珠利,剩下一份鸡肉样品为空白样。向所有样品中加入含10 mL 1%的三氯乙酸的乙腈溶液(w/v)震荡均匀后,超声提取30 min,5000 r/min离心10 min,取5 mL上清液,氮气吹干后加入5 mL正已烷,超声15 min,5000 r/min离心15 min,取上清液,氮气吹干,加入0.5 mLPBS溶解,采用间接竞争ELISA法进行添加回收试验,样品稀释倍数为0。其回收率分别为94.6%,104.2%,106.0%。
溶液的配置:
碳酸盐缓冲液(CBS):称取Na2CO3 1.59 g,NaHCO3 2.93 g,分别溶于少量双蒸水后混合,加双蒸水至约800mL混匀,调pH值至9.6,加双蒸水定容至1000 mL,4℃贮存备用;
磷酸盐缓冲液(PBS):8.0 g NaCl,0.2 g KCl,0.2 g KH2PO4,2.9 g Na2HPO4·12 H2O,溶于800 mL纯水中,用NaOH或HCl调pH到7.2~7.4,定容至1000 mL;
PBST:含0.05%吐温20的PBS;
TMB显色液:A液:Na2HPO4·12H2O 18.43 g,柠檬酸 9.33 g,纯水定容至1000 mL;B液:60 mg TMB 溶于100 mL乙二醇中。A、B液按体积比1︰5混合即为TMB显色液,现用现混。
综上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰,都应为本发明的技术范畴。

Claims (3)

1.一株抗托曲珠利单克隆抗体杂交瘤细胞株K-5,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,简称CGMCC,保藏编号为CGMCC No.13095。
2.托曲珠利单克隆抗体,其特征在于:它由所述保藏编号为CGMCC No.13095的托曲珠利单克隆抗体杂交瘤细胞株K-5分泌产生。
3.权利要求2所述的托曲珠利单克隆抗体的应用,其特征在于:用于食品安全中托曲珠利的残留检测。
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