CN108114275A - 一种虹鳟传染性造血器官坏死病毒（ihnv）灭活疫苗的制备方法及其应用 - Google Patents

一种虹鳟传染性造血器官坏死病毒（ihnv）灭活疫苗的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种虹鳟传染性造血器官坏死病毒（IHNV）灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：S1.FHM细胞复苏提纯；S2.FHM细胞基础培养；S3.FHM细胞扩大培养；S4.IHNV病毒培养；S5.IHNV病毒提纯；S6.IHNV病毒灭活。该方法制备得到IHNV灭活疫苗应用于预防传染性造血器官坏死病；通过该方法可成功制得IHNV灭活疫苗，灭活效果好，灭活疫苗安全性高，相对免疫保护率高，同时该制备方法工艺简单，有利于缩减疫苗大规模生产的周期和成本，可用于工业制备IHNV灭活疫苗用于预防传染性造血器官坏死病。

Description

一种虹鳟传染性造血器官坏死病毒（IHNV）灭活疫苗的制备方 法及其应用
技术领域
本发明涉及一种虹鳟传染性造血器官坏死病毒（IHNV）灭活疫苗的制备方法及其应用。
背景技术
虹鳟是一种名贵的冷水性鱼类，其肉质鲜嫩、味美，蛋白质和脂肪含量高，胆固醇含量几乎等于零，EPA含量高于其它鱼类数倍以上，具有“水中人参”的美誉，因此广受人们喜爱。我国自1959年起开始养殖虹鳟，主要品种包括硬头鳟、道纳尔逊氏超级虹鳟、Jalo品系虹鳟和金鳟（黄虹鳟）等。目前我国虹鳟养殖场400多家，分布于23个省、市、自治区的100个县内，养殖方式多为高密度流水养殖。然而，近年来由于虹鳟养殖规模逐步地扩大，苗种需求量增加，鱼卵、鱼苗流通性的增大，且高密度养殖，造成了虹鳟各种疾病频繁地发生，特别是传染性疾病，如传染性造血器官坏死病，给虹鳟的养殖带来极大经济损失，严重地制约着虹鳟养殖业的发展。
传染性造血器官坏死病（Infectious Hematopoietic Necrosis, IHN）是由传染性造血器官坏死病毒（Infectious Hematopoietic Necrosis Virus, IHNV）所引起的一种鲑科鱼类急性死亡的病毒性传染病，呈现快速传播与广泛发生的特征。该病被OIE列为必须申报的动物疫病，是鱼类进出口岸第1类检疫对象。2014年我国农业部将其列为《2014年国家水生动物疫情监测计划》的重点专项监测疫病之一。自1985年IHN疫情首次在中国出现以来，IHN已经先后在黑龙江、辽宁、青海、北京、甘肃、吉林、山东以及四川等地暴发，死亡率可高达100%，给水产养殖业造成了巨大的经济损失。
IHNV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae），诺拉弹状病毒属（Novirhabdovirus）。其外形为子弹状，含二十面立体对称型核衣壳，长150 nm-190 nm，直径65 nm-75nm，为单股负链RNA病毒。IHNV含有脂蛋白包膜，表面有纤细的刺突，与狂犬病毒的蛋白结构类似，能在多种细胞系上生长，包括大鳞大马哈鱼胚细胞系(Chinook salmon embryo, CHSE-14)、鲤鱼上皮瘤细胞系(Epithelioma papulossum of carp, EPC)、肥头鲦鱼细胞(Fatheadminnow, FHM)、虹鳟性腺细胞系(Rainbow trout gonad, RTG-2)、蓝鳃太阳鱼成纤维细胞系(Bluegill fry, BF-2)等。该病毒的增殖温度范围为4℃-20℃，其最适增殖温度为15℃，细胞病变主要表现为细胞变圆，细胞脱落，出现空斑且空斑边缘细胞牵拉，成葡萄状。
IHNV的易感对象主要为鲑、鳟鱼类的鱼苗或者幼鱼；IHNV敏感的宿主包括大麻哈鱼属的红大麻哈鱼、虹鳟、大鳞大麻哈鱼、细磷大麻哈鱼、大麻哈鱼、马苏大麻哈鱼、克氏鲑和玫瑰大麻哈鱼。成鱼感染通常不会出现死亡，而是成为病毒的传染宿主。当幼鱼和鱼苗感染后，其临床症状表现为眼球突出，鳃丝苍白，鳍条基部充血，体色发黑，腹部膨大，肛门处常拖着一条黄色的粘液粪便，解剖可见肝苍白，肾脏常呈现花斑状，胃、肠内有大量微黄、浑浊的粘液。幼鱼也常常变现出一些神经症状，包括打转，痉挛，时在剧烈抽搐后死亡。
现有养殖场等一般对感染IHN的病鱼采取的措施是全部销毁，并对养殖场地和设备进行全面消毒；但是此种方法不能从根源上有效降低虹鳟等感染IHN的发病率。同时现有IHNV病毒灭活疫苗的制备成本高，工艺复杂，灭活时间长，同时疫苗的灭活效果不佳，导致IHNV病毒灭活疫苗制备效率不高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种虹鳟传染性造血器官坏死病毒（IHNV）灭活疫苗的制备方法及其应用，用于制备安全、高效的虹鳟传染性造血器官坏死病毒（IHNV）灭活疫苗，并将该制备方法制得的IHNV灭活疫苗用于预防传染性造血器官坏死病。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种虹鳟传染性造血器官坏死病毒（IHNV）灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：
S1. FHM细胞复苏：将冻存的FHM细胞置于35℃-38℃下恒温水浴1-3min，然后再800-1000 r/min 离心4-6 min，去掉上清液，得到复苏的FHM细胞；离心去掉冻存FHM细胞时添加的添加剂；
S2. FHM细胞基础培养：往S1步骤所得的FHM细胞中加入培养基，然后转移至培养瓶I中培养；所述培养基中含有体积分数为8%-10%的FBS；
S3. FHM细胞扩大培养：待S2步骤中细胞长满90%-100%，去掉培养液，用D-PBS漂洗2-3次，然后取浓度为0.20%-0.30%的胰蛋白酶消化贴壁细胞，待1-2分钟后去掉胰蛋白酶；然后在细胞液中加入培养基，混匀之后将细胞液转入培养瓶II中，将培养瓶II置于25℃下培养；所述培养瓶II的生长面积是培养瓶I的3-4倍；所述培养基中含有体积分数为8%-10%的FBS；先使用生长面积较小的培养瓶I培养细胞，待细胞长满单层后，再转移至生长面积较大的培养瓶II中培养，细胞繁殖速度快；
S4. IHNV病毒培养：待S3步骤中FHM细胞在培养瓶II中长满90%-100%，去掉培养液，用D-PBS漂洗2-3次，然后加入IHNV毒液，13℃-17℃孵育1 h -2h；之后加入培养基维持液，13℃-17℃培养3-4天，收获IHNV病毒；所述培养基中含有体积分数为2%-5%的FBS；
S5. IHNV病毒提纯：将S4步骤得到的IHNV病毒液置于-80℃~-20℃下冻融，然后将病毒液4000~8000r/min离心10~15min，收集上清液得到IHNV活病毒液；冻融后离心，细胞破裂，细胞中的病毒释放到溶液中；
S6. IHNV病毒灭活：往S5步骤中得到的IHNV活病毒液中加入β-丙内酯，直至混合液中β-丙内酯的浓度为0.08-0.1%，静置灭活，然后将灭活后的混合液置于36℃-37.5℃恒温水浴2h-2.5h水解β-丙内酯，最后将水解后的混合液经配制得到IHNV病毒灭活疫苗；一般的，水解之后的混合液可加入弗氏完全佐剂或者弗氏不完全佐剂等配制得到IHNV病毒灭活疫苗；β-丙内酯(Beta-propiolactone, BPL)又名羟基丙酸-β-内酯，是一种杂环化合物，分子式为C3H4O2，常温下为无色有刺激性味的液体, 其灭活原理是通过对病毒核酸中的嘌呤和嘧啶的烷基化作用，使其发生变构，最终实现对病毒的灭活。 BPL是一种比甲醛作用强的病毒灭活剂，具有很好的灭活效果，因其直接与病毒核酸起作用，对病毒的蛋白质不直接起作用，制备的疫苗免疫原性好。BPL杀灭病毒的有效浓度为5~30 mg/L。BPL通过在37 ℃的温度中水浴作用2 h后，非常容易能水解成无毒的β-羟基丙酸，因此通过BPL灭活后能实现无灭活剂残留；
其中，所述S1步骤取用的冻存FHM细胞、S2步骤加入的培养基、S3步骤加入的胰蛋白酶、S3步骤加入的培养基、S4步骤加入的培养基维持液的体积比为（1-1.5）：（4-6）：（0.2-1）：（4-6）：（11-13）。
优选的，所述S2、S3和S4步骤中所使用的培养基为DMEM培养基，所述培养基在使用过程中加入了青霉素和链霉素，青霉素的工作浓度为95-105U/mL，链霉素的工作浓度为0.08-0.11mg/mL。
优选的，所述S4步骤中初始加入的IHNV毒液的滴度为105.5 TCID50/mL。
优选的，所述的S6步骤中将混合均匀的β-丙内酯和IHNV活病毒液置于3℃-5℃条件下，静置48-72h灭活。
优选的，所述的S6步骤中β-丙内酯和IHNV活病毒液混合后，β-丙内酯的浓度为0.1%。
根据以上所述制备方法得到的IHNV灭活疫苗在预防传染性造血器官坏死病的应用。该种方法得到的疫苗未对IHNV病毒的基因作任何改变，可以避免因基因改变对接种生物体产生副作用，疫苗安全性高。
本发明的有益效果是：通过该方法可成功制得IHNV灭活疫苗，灭活效果好，灭活疫苗安全性高，相对免疫保护率高，灭活疫苗可有效降低虹鳟鱼等IHN的发病率，同时该制备方法工艺简单，有利于缩减疫苗大规模生产的周期和成本，可用于工业制备IHNV灭活疫苗；该种制备方法制备得到的INV灭活疫苗可用于预防传染性造血器官坏死病。
附图说明
图1为IHNV灭活疫苗灭活效果检测图；
图2为PBS组和灭活苗组攻毒后虹鳟发病死亡率曲线图；
图3为死亡虹鳟RNA的RT-PCR产物的电泳图；
图4为三组虹鳟血清中总蛋白含量；
图5为三组虹鳟血清中白蛋白含量；
图6为三组虹鳟血清中球蛋白含量；
图7为三组虹鳟血清中谷丙转氨酶含量；
图8为三组虹鳟血清中谷草转氨酶含量；
图9为三组虹鳟血清中碱性磷酸酶含量；
图10为三组虹鳟血清中总胆红素含量；
图11为三组虹鳟血清中总胆汁酸含量；
图12为三组虹鳟血清中肌酐含量；
图13为三组虹鳟血清中尿素含量；
图14为三组虹鳟血清中葡萄糖含量；
图15为三组虹鳟血清中钾离子含量；
图16为三组虹鳟血清中钠离子含量；
图17为三组虹鳟血清中氯离子含量；
图18为三组虹鳟血清中钙离子含量；
图19为三组虹鳟血清中磷离子含量。
具体实施方式
下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一、IHNV灭活疫苗制备
1、试验材料：
胖头鳜肌肉细胞系（Fathead minnow muscle cell line，FHM），购自Zeta life公司；
胎牛血清（FBS），购自Zeta life公司；
DMEM培养基，购自Hyclone公司；
胰蛋白酶，购自索莱宝公司；
T25，T75康宁细胞培养瓶，购自康宁（Corning）公司；
β-丙内酯，购自默克（Merk）公司；
杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS），购自Hyclone公司；
IHNV毒液，从患传染性造血器官坏死病的虹鳟鱼的肝脏、肾脏中分离。
2、IHNV灭活疫苗制备过程
制备实施例1
IHNV病毒灭活疫苗制备方法如下：
S1. FHM细胞复苏：取液氮中冻存的FHM细胞1mL，将细胞液置于37℃下恒温水浴2min，然后再1000 r/min 离心5min，去掉上清液，得到复苏的FHM细胞；
S2. FHM细胞基础培养：往S1步骤所得的FHM细胞中加入5mL含有10%（体积分数）FBS的DMEM培养基，然后将细胞液转移至T25培养瓶中培养；
S3. FHM细胞扩大培养：待S2步骤中细胞长满90%-100%，去掉培养液，用D-PBS漂洗2次，每次使用D-PBS 2-5mL；然后取0.5mL浓度为0.25%的胰蛋白酶消化贴壁细胞1min，之后去掉胰蛋白酶；在细胞液中加入5mL含有10%（体积分数）FBS的DMEM培养基，混匀之后将细胞液转入T75培养瓶中，将培养瓶置于25℃培养箱中下培养；
S4. IHNV病毒培养：待S3步骤中FHM细胞在T75培养瓶中长满90%-100%，去掉培养液，用D-PBS漂洗2次，每次使用D-PBS液2mL-5mL，然后加入滴度为105.5 TCID50/mL IHNV毒液，15℃孵育1h；之后加入12mL含2%FBS的DMEM培养基维持液，15℃培养4天，收获IHNV病毒；
S5. IHNV病毒提纯：将S4步骤得到的IHNV病毒液置于-80℃下冻融1次，然后将病毒液4000r/min离心10min，收集上清液得到IHNV活病毒液；
S6. IHNV病毒灭活：往S5步骤中得到的IHNV活病毒液中加入β-丙内酯，混合液中β-丙内酯的浓度为0.1%，将混合液置于4℃下静置48h灭活，然后将灭活后的混合液置于37℃恒温水浴2h水解β-丙内酯，水解后直接得到IHNV病毒灭活疫苗。
S2、S3和S4步骤中用的DMEM培养基在使用过程中加入了青霉素和链霉素，其中青霉素的工作浓度为100U/mL，链霉素的工作浓度为0.1mg/mL。
制备实施例2
IHNV病毒灭活疫苗制备方法如下：
S1. FHM细胞复苏：取液氮中冻存的FHM细胞1mL，将细胞液置于37℃下恒温水浴2min，然后再850 r/min 离心6min，去掉上清液，得到复苏的FHM细胞；
S2. FHM细胞基础培养：往S1步骤所得的FHM细胞中加入4mL含有9%（体积分数）FBS的DMEM培养基，然后将细胞液转移至T25培养瓶中培养；
S3. FHM细胞扩大培养：待S2步骤中细胞长满90%-100%，去掉培养液，用D-PBS漂洗3次，每次使用D-PBS液2-5mL；然后取0.2mL浓度为0.25%的胰蛋白酶消化贴壁细胞2min，之后去掉胰蛋白酶；在细胞液中加入4mL含有9%（体积分数）FBS的DMEM培养基，混匀之后将细胞液转入T75培养瓶中，将培养瓶置于25℃培养箱中下培养；
S4. IHNV病毒培养：待S3步骤中FHM细胞在T75培养瓶中长满90%-100%，去掉培养液，用D-PBS漂洗2次，每次使用D-PBS液2mL-5mL，然后加入滴度为105.5 TCID50/mL IHNV毒液，17℃孵育1h；之后加入11mL含5%（体积分数）FBS的DMEM培养基维持液，15℃培养3天，收获IHNV病毒；
S5. IHNV病毒提纯：将S4步骤得到的IHNV病毒液置于-60℃下冻融1次，然后将病毒液8000r/min离心10min，收集上清液得到IHNV活病毒液；
S6. IHNV病毒灭活：往S5步骤中得到的IHNV活病毒液中加入β-丙内酯，混合液中β-丙内酯的浓度为0.1%，将混合液置于4℃下静置55h灭活，然后将灭活后的混合液置于37.5℃恒温水浴2h水解β-丙内酯，水解后直接得到IHNV病毒灭活疫苗。
S2、S3和S4步骤中用的DMEM培养基在使用过程中加入了青霉素和链霉素，其中青霉素的工作浓度为98U/mL，链霉素的工作浓度为0.11mg/mL。
制备实施例3
IHNV病毒灭活疫苗制备方法如下：
S1. FHM细胞复苏：取液氮中冻存的FHM细胞1.5mL，将细胞液置于38℃下恒温水浴1min，然后再800 r/min 离心6min，去掉上清液，得到复苏的FHM细胞；
S2. FHM细胞基础培养：往S1步骤所得的FHM细胞中加入6mL含有10%（体积分数）FBS的DMEM培养基，然后将细胞液转移至T25培养瓶中培养；
S3. FHM细胞扩大培养：待S2步骤中细胞长满90%-100%，去掉培养液，用D-PBS漂洗3次，每次使用D-PBS液2-5mL；然后取1mL浓度为0.3%的胰蛋白酶消化贴壁细胞2min，之后去掉胰蛋白酶；在细胞液中加入6mL含有10%（体积分数）FBS的DMEM培养基，混匀之后将细胞液转入T75培养瓶中，将培养瓶置于25℃培养箱中培养；
S4. IHNV病毒培养：待S3步骤中FHM细胞在T75培养瓶中长满90%-100%，去掉培养液，用D-PBS漂洗2次，每次使用D-PBS液2mL-5mL，然后加入滴度为105.5 TCID50/mL IHNV毒液，15℃孵育1.5h；之后加入12mL含4%FBS的DMEM培养基维持液，15℃培养4天，收获IHNV病毒；
S5. IHNV病毒提纯：将S4步骤得到的IHNV病毒液置于-50℃下冻融1次，然后将病毒液5000r/min离心12min，收集上清液得到IHNV活病毒液；
S6. IHNV病毒灭活：往S5步骤中得到的IHNV活病毒液中加入β-丙内酯，混合液中β-丙内酯的浓度为0.08%，将混合液置于5℃下静置60h灭活，然后将灭活后的混合液置于36℃恒温水浴2.5h水解β-丙内酯，水解后直接得到IHNV病毒灭活疫苗。
S2、S3和S4步骤中用的DMEM培养基在使用过程中加入了青霉素和链霉素，其中青霉素的工作浓度为105U/mL，链霉素的工作浓度为0.09mg/mL。
制备实施例4
IHNV病毒灭活疫苗制备方法如下：
S1. FHM细胞复苏：取液氮中冻存的FHM细胞1.3mL，将细胞液置于36℃下恒温水浴2min，然后再950 r/min 离心5min，去掉上清液，得到复苏的FHM细胞；
S2. FHM细胞基础培养：往S1步骤所得的FHM细胞中加入5mL含有10%（体积分数）FBS的DMEM培养基，然后将细胞液转移至T25培养瓶中培养；
S3. FHM细胞扩大培养：待S2步骤中细胞长满90%-100%，去掉培养液，用D-PBS漂洗3次，每次使用D-PBS液2-5mL；然后取0.6mL浓度为0.27%的胰蛋白酶消化贴壁细胞1min，之后去掉胰蛋白酶；在细胞液中加入6mL含有8%（体积分数）FBS的DMEM培养基，混匀之后将细胞液转入T75培养瓶中，将培养瓶置于25℃培养箱中下培养；
S4. IHNV病毒培养：待S3步骤中FHM细胞在T75培养瓶中长满90%-100%，去掉培养液，用D-PBS漂洗2次，每次使用D-PBS液2mL-5mL，然后加入滴度为105.5 TCID50/mL IHNV毒液，16℃孵育1h；之后加入11mL含3%FBS的DMEM培养基维持液，17℃培养3天，收获IHNV病毒；
S5. IHNV病毒提纯：将S4步骤得到的IHNV病毒液置于-20℃下冻融1次，然后将病毒液4000r/min离心15min，收集上清液得到IHNV活病毒液；
S6. IHNV病毒灭活：往S5步骤中得到的IHNV活病毒液中加入β-丙内酯，混合液中β-丙内酯的浓度为0.09%，将混合液置于3.8℃下静置72h灭活，然后将灭活后的混合液置于37℃恒温水浴2h水解β-丙内酯，水解后直接得到IHNV病毒灭活疫苗。
S2、S3和S4步骤中用的DMEM培养基在使用过程中加入了青霉素和链霉素，其中青霉素的工作浓度为95U/mL，链霉素的工作浓度为0.08mg/mL。
制备实施例5
IHNV病毒灭活疫苗制备方法如下：
S1. FHM细胞复苏：取液氮中冻存的FHM细胞1.2mL，将细胞液置于35℃下恒温水浴3min，然后再900 r/min 离心4 min，去掉上清液，得到复苏的FHM细胞；
S2. FHM细胞基础培养：往S1步骤所得的FHM细胞中加入5mL含有8%（体积分数）FBS的DMEM培养基，然后将细胞液转移至T25培养瓶中培养；
S3. FHM细胞扩大培养：待S2步骤中细胞长满90%-100%，去掉培养液，用D-PBS漂洗2次，每次使用D-PBS液2-5mL；然后取0.5mL浓度为0.2%的胰蛋白酶消化贴壁细胞1min，之后去掉胰蛋白酶；在细胞液中加入5mL含有10%（体积分数）FBS的DMEM培养基，为细胞提供充足的养分；混匀之后将细胞液转入T75培养瓶中，将培养瓶置于25℃培养箱中下培养；
S4. IHNV病毒培养：待S3步骤中FHM细胞在T75培养瓶中长满90%-100%，去掉培养液，用D-PBS漂洗3次，每次使用D-PBS液2mL-5mL，然后加入滴度为105.5 TCID50/mL IHNV毒液，13℃孵育2h；之后加入12mL含2%FBS的DMEM培养基维持液，13℃培养4天，收获IHNV病毒；
S5. IHNV病毒提纯：将S4步骤得到的IHNV病毒液置于-80℃下冻融1次，然后将病毒液7000r/min离心11min，收集上清液得到IHNV活病毒液；
S6. IHNV病毒灭活：往S5步骤中得到的IHNV活病毒液中加入β-丙内酯，混合液中β-丙内酯的浓度为0.08%，将混合液置于3℃下静置68h灭活，然后将灭活后的混合液置于36℃恒温水浴2.5h水解β-丙内酯，水解后直接得到IHNV病毒灭活疫苗。
S2、S3和S4步骤中用的DMEM培养基在使用过程中加入了青霉素和链霉素，其中青霉素的工作浓度为103U/mL，链霉素的工作浓度为0.11mg/mL。
二、疫苗效果检测
1、灭活效果检测
将实施例1中得到的灭活疫苗接种FHM细胞，对照组FHM细胞接种IHNV毒液，观察两组细胞，并盲传三代检测IHNV疫苗灭活效果（盲传三次均未出现细胞病变则表示该病毒灭活完全）。灭活效果见图1，图1中A表示接种IHNV灭活疫苗组，B表示接种IHNV毒液组。由图1可知，FHM细胞接种IHNV灭活苗后7天，并盲传三代均没有出现细胞病变效应，而对照组细胞则出现明显的致细胞病变效应（CPE，即病毒在宿主细胞内大量增殖，导致细胞病变甚至死亡的现象）。
2、免疫保护效果检测
健康虹鳟（35g±5g）分为三组即灭活苗组、PBS组和空白组，三组虹鳟暂养7天后，灭活苗组注射0.2 mL/尾的IHNV灭活疫苗，PBS组注射同样剂量的无菌PBS溶液，空白组注射同剂量的生理盐水。15℃饲养15天后，灭活苗组虹鳟和PBS组虹鳟注射IHNV毒液，空白组虹鳟注射同剂量的生理盐水；之后随机从灭活组、PBS组和空白组中各取三尾虹鳟采血，血液4℃静置过夜，4000r/min 离心10 min，取上清置于-20℃保存备用，用于对比各组虹鳟血液的各项指标。同时统计灭活苗组和PBS组虹鳟每日死亡数，计算死亡率以及相对保护率。相对保护率＝[1-（疫苗组死亡率/对照组死亡率）]。同时，攻毒后分别取濒死虹鳟的肝、脾、肾组织进行RT-PCR检测。
1）攻毒感染试验后，各组虹鳟发病死亡状况如图2所示。攻毒后第3天，PBS组虹鳟率先开始出现患病死亡，灭活苗组鱼体也先后出现相同的发病症状并死亡。患病鱼发病症状，与自然感染 IHNV病毒的发病症状相似。攻毒后14天，经计算IHNV灭活苗组的相对免疫保护率（RPS）为68%。灭活苗组鱼体的死亡率远低于PBS组。由该方法制备的IHNV灭活疫苗可有效降低虹鳟的IHN发病率，从而表明该制备方法制得的IHNV灭活疫苗可以用于预防传染性造血器官坏死病。
2）从攻毒后死亡虹鳟组织提取RNA，多重RT-PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，如图3所示，死亡虹鳟组织肝脏、脾脏和肾脏位于371 bp处均可见特异性的单一条带，与IHNV预期大小一致（IHNV预期扩增条带大小为371 bp），而阴性对照泳道无明显条带。将扩增条带测序结果与Genbank中已知核酸序列进行Blast比对，结果显示该序列与Genbank中IHNV基因99%的同源性；表明攻毒后灭活苗组和PBS组虹鳟的死亡原因均为感染IHNV病毒。
3)主要对灭活苗组、PBS组和空白组虹鳟的血清进行检测，检测了各组血清中总蛋白、白蛋白、球蛋白、白球比、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、总胆红素、总胆汁酸、肌酐、尿素、葡萄糖、钾、钠、氯、钙、磷的含量，分别如图4-图19所示。
血清中的白蛋白在血液中有重要的生理功能，和维持血液正常渗透压有关，是血液总渗透压的主要调节物质。血清球蛋白具有免疫作用，参与鱼体的特异性免疫反应；血清总蛋白在肝脏中合成，当肝脏发生病变时，肝细胞合成蛋白质的功能会减弱，血清中的蛋白质的种类和量就会发生改变。检测空白组、攻毒后灭活苗组和PBS组虹鳟的血液参数，如图4-图6所示，发现三组的总蛋白、球蛋白、白蛋白三种参数变化不大，但疫苗组和PBS组较空白组略低，而疫苗组又略高于PBS组，说明IHNV可以导致虹鳟肝脏损伤，导致蛋白质合成功能下降。
血清中酶类的变化反应了机体组织状况的变化，一般来说，酶浓度的变化常常由细胞坏死或者细胞膜通透性的改变所引起。谷草转氨酶(AST)与谷丙转氨酶(ALT)都是代谢活动中不可缺少的酶类。正常情况下，谷草转氨酶存在于细胞中，其中心肌细胞中含量最高，其次为肝脏，血清中含量极少。在肝脏中，谷草转氨酶(AST)主要存在于肝细胞的线粒体内，当肝脏发生严重坏死或破坏时，能引起谷草转氨酶在血清中浓度偏高。而谷丙转氨酶(ALT)主要存在肝细胞的胞浆内，细胞内浓度比血清高很多，因此，血清谷丙转氨酶是最能反映肝细胞是否损伤的指标。碱性磷酸酶(AKP)是一种磷酸单酯酶，可催化磷酸单酯的水解反应及磷酸基团的转移反应，广泛存在于动物血液和各种器官内，尤其以骨骼肌、肝脏、肠黏膜含量最高。它能加速物质的摄取和转运，为ADP磷酸化形成ATP提供更多所需的无机磷酸，它直接参与磷酸代谢，并与DNA、RNA、蛋白质、脂质等代谢有关，对钙质吸取、骨骼形成、磷酸钙沉积等都有重要作用，已成为动物生理活动和疾病诊断的一项重要指标。如图7-图9所示，通过检测三组虹鳟血清中的谷丙转氨酶和谷草转氨酶以及碱性磷酸酶，可以发现三组均呈现空白组>疫苗组>PBS组的趋势，说明了IHNV感染能够损伤虹鳟肝脏，而IHNV灭活疫苗可以显著减少肝脏的损害程度。
血液中的胆红素在肝脏的作用下随着胆汁的排泄下而被及时清除，当红细胞受到破坏或肝细胞功能异常时，能够引起血液中总胆红素的含量的升高。总胆汁酸是肝脏内以胆固醇为原料合成的一种有机酸，它的生成和代谢与肝脏有密切关系；因此血清中的胆汁酸是肝脏清除胆固醇的主要形式。血清总胆汁酸是可以反映肝脏细胞分泌、合成、肝细胞损伤状态的指标，因此当肝细胞损伤时会导致血清总胆汁酸浓度升高。血清中的糖分称为血糖，其主要成分为葡萄糖，鱼体各个器官、组织及细胞活动所需要的能量大多来自葡萄糖的分解，血糖必须维持在一定的水平才能保证鱼体的正常生理代谢。如图10、图11和图14所示，与空白组相比，IHNV感染虹鳟后总胆红素、总胆汁酸和葡萄糖都升高，说明虹鳟肝脏损伤严重，且鱼体不能正常维持的血糖水平；同时PBS组高于灭活苗组，说明IHNV灭活疫苗可以降低IHNV病毒对肝脏的损伤。
肌酐和尿素这两个指标是评价动物肾功能的重要指标。当机体发生肾小球病变，肾损伤可引起血液中尿素含量的增高，而肌酐能反映肾脏损害、肾小球滤过率等肾功能指标。IHNV感染后，如图12和图13所示，虹鳟血清中肌酐和尿素含量短时间内显著增高，说明虹鳟肾脏受到损伤，与IHNV能破坏虹鳟造血组织的研究一致，同时PBS组的肌酐和尿素含量高于灭活苗组，说明IHNV灭活疫苗可以降低IHNV病毒对肝脏的损伤。
血液中的电解质平衡对鱼体血液凝固、神经传导、肌肉伸缩等活动均产生重要影响，是维持鱼体各组织细胞渗透压平衡的基础。测定实验鱼血清中各种离子的含量变化，能够准确的反映IHNV对虹鳟血清电解质的影响规律。如图15-19所示，IHNV感染后，虹鳟的钙、钾、氯、钠和磷的水平显著升高，表明虹鳟不能维持自身渗透压平衡。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (6)

1.一种虹鳟传染性造血器官坏死病毒（IHNV）灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1. FHM细胞复苏：将冻存的FHM细胞置于35℃-38℃下恒温水浴1-3min，然后再800-1000 r/min 离心4-6 min，去掉上清液，得到复苏的FHM细胞；
S2. FHM细胞基础培养：往S1步骤所得的FHM细胞中加入培养基，然后转移至培养瓶I中培养； 所述培养基中含有体积分数为8%-10%的FBS；
S3. FHM细胞扩大培养：待S2步骤中细胞长满90%-100%，去掉培养液，用D-PBS漂洗2-3次，然后取浓度为0.20%-0.30%的胰蛋白酶消化贴壁细胞，待1-2分钟后去掉胰蛋白酶；然后在细胞液中加入培养基，混匀之后将细胞液转入培养瓶II中，将培养瓶II置于25℃下培养；所述培养瓶II的生长面积是培养瓶I的3-4倍；所述培养基中含有体积分数为8%-10%的FBS；
S4. IHNV病毒培养：待S3步骤中FHM细胞在培养瓶II中长满90%-100%，去掉培养液，用D-PBS漂洗2-3次，然后加入IHNV毒液，13℃-17℃孵育1 h -2h；之后加入培养基维持液，13℃-17℃培养3-4天，收获IHNV病毒；所述培养基中含有体积分数为2%-5%的FBS；
S5. IHNV病毒提纯：将S4步骤得到的IHNV病毒液置于-80℃~-20℃下冻融，然后将病毒液4000~8000r/min离心10~15min，收集上清液得到IHNV活病毒液；
S6. IHNV病毒灭活：往S5步骤中得到的IHNV活病毒液中加入β-丙内酯，直至混合液中β-丙内酯的浓度为0.08-0.1%，静置灭活，然后将灭活后的混合液置于36℃-37.5℃ 恒温水浴2h-2.5h水解β-丙内酯，最后将水解后的混合液经配制得到IHNV病毒灭活疫苗；
其中，所述S1步骤取用的冻存FHM细胞、S2步骤加入的培养基、S3步骤加入的胰蛋白酶、S3步骤加入的培养基、S4步骤加入的培养基维持液的体积比为（1-1.5）：（4-6）：（0.2-1）：（4-6）：（11-13）。
2.根据权利要求1所述的一种虹鳟传染性造血器官坏死病毒（IHNV）灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述S2、S3和S4步骤中所使用的培养基为DMEM培养基，所述培养基在使用过程中加入了青霉素和链霉素，青霉素的工作浓度为95-105U/mL，链霉素的工作浓度为0.08-0.11mg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种虹鳟传染性造血器官坏死病毒（IHNV）灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述S4步骤中初始加入的IHNV毒液的滴度为105.5 TCID50/mL。
4.根据权利要求1所述的一种虹鳟传染性造血器官坏死病毒（IHNV）灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述的S6步骤中将混合均匀的β-丙内酯和IHNV活病毒液置于3℃-5℃条件下，静置48h-72h灭活。
5.根据权利要求1所述的一种虹鳟传染性造血器官坏死病毒（IHNV）灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述的S6步骤中β-丙内酯和IHNV活病毒液混合后，β-丙内酯的浓度为0.1%。
6.根据权利要求1-5任一项所述制备方法得到的IHNV灭活疫苗在预防传染性造血器官坏死病的应用。
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