CN110950950B - 一种大熊猫犬瘟热病毒的异源抗体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种针对大熊猫的犬瘟热病毒的异源抗体，尤其是马源抗体，旨在能够作为异源抗体用于大熊猫犬瘟热的治疗和预防。所述马源抗体来源于健康、不曾患过任何传染性疾病的马匹，优选1岁龄左右的幼龄马匹。同时，本发明涉及一种犬瘟热病毒的马源抗体的制备方法，该方法通过利用来源、背景清楚的大熊猫犬瘟热病毒强毒株制备免疫用灭活疫苗，使用该灭活疫苗多次免疫健康马匹获得马的免疫血清，进一步通过盐析、酶切、层析等纯化方法，获得纯化抗体，用于大熊猫犬瘟热的预防和治疗。

Description

一种大熊猫犬瘟热病毒的异源抗体及其制备方法

【技术领域】

本发明涉及抗体及其抗体的制备方法，进一步涉及犬瘟热病毒的异源抗体及其制备方法。

【背景技术】

犬瘟热(Canine distemper，CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)引起的一种急性、高度接触性传染病，有较高发病率和病死率,临床上以厌食、双相热、结膜炎、严重的胃肠炎和神经症状为典型特征。随着犬瘟热感染宿主范围的日益扩大，从1983年开始，享有“活化石”之称的我国国宝大熊猫也相继有感染犬瘟热死亡的报道。1997年，胡贵学等报道犬瘟热病毒感染大熊猫且引起死亡。2014年12月-2015年5月楼观台陕西秦岭大熊猫繁育基地相继有5只大熊猫因感染犬瘟热病毒死亡，造成重大经济损失和不良影响。因此，动物专家认为犬瘟热是威胁大熊猫生命安全的第一大烈性传染病。

目前，国内外尚无专门针对大熊猫犬瘟热的有效疫苗、预防或治疗性药物，国内外用于免疫预防大熊猫犬瘟热的疫苗主要有：弱毒疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗及基因重组疫苗，然而国内外大熊猫繁育机构对犬瘟热疫苗的使用非常谨慎，既担心灭活苗无法产生有效的抗体，又担心弱毒疫苗诱发大熊猫犬瘟热的发生，另外，Harder等报道CDV野生型分离物与疫苗株有明显差异。因此，通过疫苗接种来预防大熊猫犬瘟热的发生目前存在着较大的风险，大熊猫繁育机构对于疫苗接种的方式预防犬瘟热持谨慎态度。

抗体治疗是调动机体免疫系统的另一种方式，有研究表明，犬瘟热抗体在感染初期对患畜有较好的治疗效果，但鉴于大熊猫的珍稀性，大熊猫源的犬瘟热抗体不易获得，制备异源抗体则成为必然。然而我国抗体产业在表达水平、生产规模和纯化能力等方面滞后，市售犬瘟热单克隆抗体和异源多克隆抗体纯化水平低，异源蛋白的排斥作用极易引起严重的过敏反应，无法用于大熊猫等珍稀动物的疾病治疗。因此，研制一种安全、有效的可用于大熊猫犬瘟热的精制异源抗体是十分必要的。

我们在多种动物筛选后意外的发现犬瘟热病毒的马源抗体其安全性呈现出出乎意料的效果，因此成就了本发明。

【发明内容】

本发明的目的在于提供一种针对犬瘟热病毒的马源抗体，旨在能够作为异源抗体用于大熊猫犬瘟热的治疗和预防。

进一步本发明提供的马源抗体来源于健康、不曾患过任何传染性疾病或注射过任何疫苗和药物的马匹，优选1岁龄左右的幼龄马匹。

进一步，本发明通过大熊猫犬瘟热病毒强毒株制备的免疫用灭活疫苗来免疫马匹获得马源抗体。

同时，本发明提供一种犬瘟热病毒的马源抗体制备方法，该方法通过利用来源、背景清楚的大熊猫犬瘟热病毒强毒株制备免疫用灭活疫苗，使用该灭活疫苗多次免疫健康马匹获得马的免疫血清，进一步通过盐析、酶切、层析等纯化方法，获得纯化抗体，用于大熊猫犬瘟热的预防和治疗。

进一步所述制备方法具体包括以下步骤：

(1)对大熊猫犬瘟热病毒强毒株进行扩增、灭活制备犬瘟热灭活疫苗原液。

(2)按佐剂：犬瘟热灭活疫苗原液＝1:3-5的比例加入帕米卡佐剂，制备获得免疫原。

(3)对健康马匹在背部皮下分点注射进行免疫，获得犬瘟热高免疫血清。

(4)对所述血清抗体进行纯化处理，获得马源抗体。

本发明提供的马源抗体经过精制后效价高，安全性好，显著高于其他动物，有望能够真正用于预防和治疗大熊猫犬瘟热。

本发明所用犬瘟热病毒已于2019年7月24日于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所进行了保藏，生物材料命名为犬瘟热病毒CDV-PA-1421，保藏号：CGMCCNo：18179。

【附图说明】

图1大熊猫犬瘟热病毒LG株导致细胞病变，A正常vero细胞对照，B接种LG株后病变vero细胞。

图2大熊猫犬瘟热病毒LG株N蛋白基因与GenBank参考序列KP738610.1比对。

图3 SDS-PAGE检测大熊猫犬瘟热病毒高免血清，1-Maker；2-第3次免疫后大熊猫犬瘟热病毒免血清；3-第4次免疫后大熊猫犬瘟热病毒高免血清。

图4 SDS-PAGE检测酶切纯化后的F(ab’)2抗体片段，1-Maker；2-IgG；3-F(ab’)2片段。

【具体实施方式】

在本发明中，重要的是选择何种动物进行免疫，所免疫动物与大熊猫的亲缘关系远近如何，对于大熊猫来说是否容易引入外源病毒等都是选择免疫动物需要关键考虑的因素，本发明在经过严格实验筛选后确定所免疫的动物是马匹，所述马匹优选低龄健康的1岁内马匹，且该马匹未经任何免疫接种。

本发明中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中原始毒种：即分离自陕西某野生动物保护中心，取发病大熊猫肠组织，经研磨过滤处理后，接种于Vero细胞，并经过传代得到。细胞：Vero细胞工作种子，批号Vero-B0402-002，130代，由唐山怡安生物工程有限公司制备。试剂：MEM培养基、胰蛋白酶为GIBCO公司产品，新生牛血清为兰州民海生物公司产品，谷氨酰胺为Invitrogen公司产品，微载体Cytodex 1为GE公司产品。

在本发明的马源抗体制备过程中，以Vero细胞为细胞基质，对犬瘟热病毒毒株进行病毒发酵培养，经浓缩、灭活、与佐剂配比、成品分装检验等步骤制备大熊猫犬瘟热灭活疫苗。其中所述佐剂选择帕米卡佐剂，具体按佐剂：犬瘟热灭活疫苗原液＝1:3的比例加入帕米卡佐剂，制备获得免疫原。帕米卡主要成分为人工合成的模拟病毒双链RNA的类似物，作为疫苗佐剂不仅能够大大提高疫苗免疫效力，而且更重要地是改变免疫反应类型。

进一步，将上述制备的检验合格后的免疫原进行动物免疫，即健康马匹经过背部皮下分点注射的方法进行多次免疫，获得犬瘟热高免疫血清，首先对免疫血清进行抗CDV血清中和抗体效价进行测定，当抗体效价达1：10000以上时采血使用；进一步采用硫酸铵沉淀法分离纯化抗体蛋白，然后用胃蛋白酶进行酶切，酶切产物经亲和层析去除fc抗体片段，收集洗脱液，过滤，冻干，即得大熊猫犬瘟热病毒精制异源抗体。

为进一步说明本发明，通过下述实施例来进一步阐述。

实施例1：大熊猫犬瘟热灭活疫苗的制备

(1)大熊猫犬瘟热病毒毒株种子批的制备与检验

将大熊猫犬瘟热病毒毒株按0.5％接种在单层的Vero细胞上，在37℃进行病毒培养，培养至细胞病变达到80％～90％时收获病毒上清液，代次为1代，以此类推。传代到第5代时出现明显的细胞病变(见图1)。按照上述方法，将大熊猫犬瘟热病毒毒株在Vero细胞中连续传代至30代。对每代进行病毒含量测定(见表1)，对1、10、15、20、24代进行无菌检验、支原体检验、外源性病毒检验、毒力检验、特异性检验和免疫原性检验，检验结果均合格。最终确定大熊猫犬瘟热病毒毒株最高使用代次不超过22代，原始种子为10代，基础种子为14～16代，生产种子为17～19代。

参考Genbank上犬瘟热病毒(CDV)N蛋白序列，设计一段引物，对出现CPE的细胞毒，用RT-PCR方法扩增，对扩增产物进行测序，测序结果与GeneBank上发表的CDV SD(14)11株(亚洲-I型)的同源性为98％，证明分离得到的病毒确实为犬瘟热病毒(见图2)

表1不同代次大熊猫犬瘟热病毒Vero细胞培养物病毒含量

①原始种子的制备

将大熊猫犬瘟热病毒毒株第9代按0.1M.O.I.接种到搅拌瓶中，悬浮培养96h，待细胞病变达到80％～90％时收获病毒液，定量分装，冻干，制成第10代原始种子批。

②基础种子批的制备

待微载体上培养的细胞长成单层，将大熊猫犬瘟热病毒毒株第10代原始种子按0.1M.O.I.接种到搅拌瓶中，悬浮培养96～120h，待细胞病变达到80％～90％时收获病毒液。按照上述方法将毒株进行传代，制成第14和16代毒株，并进行病毒含量和免疫抗原性检验。

③生产用种子批的制备

待微载体上培养的细胞长成单层，将大熊猫犬瘟热病毒毒株第14代和16代基础毒种按0.1M.O.I.接种到搅拌瓶中，悬浮培养96～120h，待细胞病变达到80％～90％时收获病毒液。制成17和19代毒株，并进行病毒含量和免疫原性检验。

将上述制备的原始种子批、基础种子批和生产种子批用于疫苗的制备。

(2)Vero细胞的制备

取第130代Vero细胞工作种子速溶后，用含10％新生牛血清的MEM培养基接种到T25细胞培养瓶中，37±0.5℃条件下培养24h，更换含5％新生牛血清的MEM培养基，继续培养7日，待长成单层后，以相同的方法进行细胞传代。

将长成单层的Vero细胞用细胞消化液消化，接种到生物反应器中，细胞接种浓度为0.40×10⁶个/ml，微载体浓度为6.0g/L，加入含10％新生牛血清的MEM细胞生长液至工作体积，在温度37±0.5℃，PH为7.20±0.05条件下培养待用。

(3)犬瘟热病毒灭活疫苗的制备

本发明以Vero细胞为细胞基质，以犬瘟热病毒为毒株，在搅拌瓶或生物反应器中进行病毒培养。

在生物反应器中待细胞长成单层后，按0.1MOI(病毒感染复数)接种病毒，培养温度为37±0.5℃，PH为7.20±0.05条件下，含0.2％牛血清蛋白的MEM病毒维持液，培养至120h，且待细胞病变(CPE)达80％～90时收获病毒上清液，取样进行病毒含量测定，病毒含量达10^7.5TCID₅₀/0.1ml。

疫苗制备步骤如下：

(1)澄清

将犬瘟热病毒收获液采用0.65μm滤芯澄清过滤去除细胞碎片。

(2)超滤浓缩

步骤(1)过滤后的犬瘟热病毒毒株收获液采用截留分子量为300KDa膜包被超滤浓缩10倍左右。

(3)灭活

将犬瘟热病毒毒株浓缩液加入终浓度为1/4000的β-丙内酯，置2～8℃条件下灭活24h，37±0.5℃水解2h，取样进行无菌和灭活检验。

(4)配比

按佐剂：犬瘟热灭活疫苗原液＝1:3的比例加入帕米卡佐剂，制备免疫原。

(5)成品分装

在无菌条件下分装至西林瓶和注射器中，加盖密封标签，抽样进行成品检验。

(6)犬瘟热活疫苗的检验

犬瘟热疫苗成品检定项目有：性状、装量检查、无菌检验、pH值、安全检验、效力检验，其中性状、装量检查、无菌检验、pH值为常规检定项目，参照《中国兽药典》及《兽药生物制品质量标准汇编》进行检验。

性状

每批成品抽取10瓶，采用目测法，在特制的灯检仪下进行结果判定，本发明的犬瘟热灭活疫苗呈乳白色至淡红色液体，静置后底部有白色沉淀，轻轻振摇，呈均匀悬液。

pH值测定

经检测本发明的犬瘟热灭活疫苗pH指为7.20。

安全检验

比格犬安全检验

使用6周龄的犬瘟热病毒抗体阴性、健康的比格犬2只，后退肌肉注射，每只2头份疫苗，观察21天，2只犬全部健活，没有出现任何局部和全身不良反应。

小鼠安全检验

使用18～22g小鼠10只，腹腔注射，每只0.5ml，观察21天。小鼠全部健活，没有出现任何的局部和全身不良反应。

效力检验

取本发明犬瘟热疫苗成品分别作不稀释、2倍稀释、4倍稀释、8倍稀释，得到原始剂量、1/2剂量、1/4剂量、1/8剂量共4种剂量疫苗，每种疫苗采用0日、7日2针免疫程序分别免疫抗体阴性的比格犬各25只，1ml/只/次，第一次免疫后28日采集血液，分离血清，进行抗体效价测定，同时分别使用攻击用犬瘟热病毒，观察21日，统计不同剂量、不同抗体与攻毒保护率之间的关系。

结果显示，当确定犬瘟热病毒抗体效价为1:64的抗体效价为犬的最小保护时，原始剂量、1/2剂量、1/4剂量疫苗免疫动物均可以使动物获得100％保护，而1/8剂量疫苗免疫犬，不能100％保护，为确保疫苗的良好效果，确定能使至少4/5犬瘟热中和效价≧1:64的剂量为最小免疫剂量。

实施例2：马抗、猫抗、犬抗大熊猫犬瘟热病毒高免疫血清的制备和采集

按照相关标准进行检疫，选择4匹体质健康的抗体阴性马匹，5只体质健康的抗体阴性4-6个月幼猫和5只体质健康的抗体阴性的1岁龄比格犬，分别经过背部皮下分点注射的方法进行初免、多次加强免疫，共免疫4次，每次间隔时间14d，免疫原剂量依次0.5mg、1.5mg、2mg、3mg、5mg/匹马，0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg/只猫，0.2mg、1.0mg、1.5mg、2mg、3mg/只犬。每次免疫前静脉采血，分离血清，检测中和抗体效价，当中和抗体效价达1：10000以上时符合高免疫血清的采血，无菌分离血清，-20℃冻存备用。

抗CDV血清中和抗体效价的测定：

在96孔微型培养板中加入100μL DMEM培养基，将待测血清56℃灭活30min后，吸取100μL待测血清加入第1列孔内，进行倍比稀释，设立4个重复，6个梯度。每孔加入100TCID₅₀CDV(50μL)，37℃中和1h后，每孔加20 000个(50μL)Vero细胞，继续培养120h，观察细胞病变情况。设立正常Vero细胞为阴性对照，阳性对照为接毒Vero细胞。具体结果见表2.

表2三种动物多次免疫血清中和抗体效价

1、粗制抗体酶切反应

无菌条件下将1体积高免疫血清与2体积无热原水进行混合，1M HCl调pH至3.4，然后向稀释血清中加入终浓度为10000IU/mL胃蛋白酶，混匀后30℃消化2.5h，期间不断搅拌，4℃保存备用。

2、盐析沉淀

经过酶切处理后先用NaOH调节pH至4.5,之后缓慢加入硫酸铵至终浓度为12％(w:v)。除去产生的沉淀后，在56℃下对酶解液进行1h的热变性处理。在这个过程中，具有较差热稳定性的Fc片段将会凝结，并可以在随后的离心或者超滤过程中除去，而热稳定性较好的F(ab’)2或者Fab则会在溶液中保持稳定。随后，上清通过30℃的冷水对流冷却处理，接着去除掉随之产生的沉淀。下一步，调节上清pH至7.0，加硫酸铵至终浓度23％(w:v)以沉淀F(ab’)2。之后，用0.01M PBS重溶F(ab’)2并进行超滤，除掉剩余硫酸铵并浓缩。最后，添加NaCl、防腐剂与一些赋形剂，再次调节pH至中性，经0.22μm滤膜过滤除菌分装。

3、Fab片段疏水层析

步骤2获得的F(ab’)2经30KD膜包超滤浓缩置换至0.01M PBS(pH7.2)中。室温下，Sephacryl-100以相同缓冲液平衡3个柱体积后上样。上样后，以0.01M PBS(pH7.2)持续洗涤柱子，同时检测OD280数值变化并分段收集流穿液。经9％浓度分离胶的非还原SDS-PAGE鉴定后，合并含有绝大多数F(ab’)2成分的流穿液，经30KD MWCO超滤管进行浓缩，分别获得精制的纯化马源、猫源和犬源大熊猫犬瘟热病毒抗体(见图4)。

4.SDS-PAGE检测

(1)用SDS-PAGE对大熊猫犬瘟热高免血清进行检测，可见IgG片段(见图3)；

(2)用SDS-PAGE对酶切后的F(ab’)2片段进行检测，获得预期大小的蛋白片段(见图4)。

实施例3：大熊猫犬瘟热病毒精制异源抗体的安全性试验

1、对犬1次单剂量免疫的安全试验

比格犬15只分成3组，每组5只，分别肌肉注射纯化后的马源抗体、猫源抗体和犬源抗体，每次1头份/只，同时设另外的15只比格犬三组作为对照组，不进行免疫，观察14日。免疫前1日和免疫14日内进行犬的一般症状、体重、体温及注射部位等观察。结果显示，比格犬1次单剂量免疫后，马源和犬源抗体注射后局部和全身无异常临床表现，增重正常，体温无异常，与对照组比格犬无明显差异。猫源抗体注射后第二天有2只比格犬体温有升高，一只比格犬的体温是38.8℃，持续发热3天后转为正常，另一只比格犬体温38.6℃，持续发热2天后体温转为正常，其余3只体温正常，5只体重增重正常。说明1次单剂量免疫比格犬马源和犬源抗体是安全的，但猫源抗体出现了体温异常的表现。

2、对犬单剂量重复免疫的安全性试验

上述三组比格犬15只分别肌肉注射纯化后的马源抗体、猫源抗体和犬源抗体后，间隔14日再次接种1次，1头份/只，观察至重复给药后14日。同时，设15只比格犬作为对照组，不进行免疫。每次给药前和给药后14日分别进行犬的一般症状、体重、体温等的观察。结果显示，比格犬单剂量重复免疫后，局部和全身无异常临床表现，体重正常增加，体温无异常，与对照组比格犬无明显差异。说明重复给药对比格犬是安全的。

3、对犬1次超剂量免疫的安全试验

比格犬15只分三组每组5只分别肌肉注射纯化后的马源抗体、猫源抗体和犬源抗体，接种1次，2头份/只，观察14日；另比格犬15只分三组每组5只分别肌肉注射比格犬，每批15只，接种1次，5头份/只，观察14日；设对照组30只比格犬，不接受注射。注射前和注射后14日分别进行犬的一般症状、体重、体温及注射部位的观察。结果，比格犬2头份和5头份分别给药后，马源抗体和犬源抗体注射局部和全身无异常临床表现，体重正常增加，体温无异常，与对照组比格犬无明显差异。但是猫源抗体注射的10只比格犬2头份和5头份均出现了体温升高，2头份的5只犬体温分别为38.4℃、38.9℃、38.8℃、38.8℃、38.6℃，5头份的5只犬体温分别为38.8℃、38.3℃、38.5℃、38.6℃、38.8℃，持续时间在2-7天，免疫后犬的体重与对照组相比有下降。这说明超剂量给予马源抗体和犬源抗体对比格犬也是安全的，但是猫源抗体出现了体温明显异常的反应。

4、对怀孕犬的安全性试验

对怀孕20天、21天、30天、30天的不同怀孕期的比格犬4只分为2组，一组为怀孕20天和30天的比格犬，另一组为怀孕21天和30天的比格犬，分别肌肉注射纯化后的马源抗体和猫源抗体，接种1次，1头份/只，观察至仔犬出生后30日。给药前至分娩后30日分别进行怀孕犬的一般症状、体重、体温、分娩情况的观察和检测；对出生后仔犬体重等进行检测。结果，怀孕犬马源抗体单剂量给药后，从给药起至分娩后30日，孕犬行为活动正常，无任何异常临床症状，均无死亡、无早产、流产，免疫后采食、饮水正常，注射部位局部未见红肿、引起的不良反应；各孕犬免疫后增重正常；体温无异常；所产仔犬外观均无畸形，行为活动正常，采食、饮水正常；仔犬增重正常；体温无异常变化。说明马源抗体给药怀孕犬也是安全的。

怀孕犬猫源抗体单剂量给药后，在给药后的20小时一只犬体温升至38.9度，持续发热5天，有阴道出血的流产症状，在体温恢复后流产症状消失，另一只犬从给药起至分娩后30日，孕犬行为活动正常，无任何异常临床症状，仔犬增重正常；体温无异常变化。说明马源抗体给药怀孕犬也是安全的，但猫源抗体给药怀孕犬有体温升高、流产征兆出现。

5、对豚鼠和小鼠的安全性试验

对制备的马源抗体、猫源抗体和犬源抗体分别腹腔接种豚鼠4只和昆明小鼠10只，给药1次，豚鼠每只5ml，昆明小鼠每只0.5ml；同时设对照豚鼠4只和昆明小鼠10只，不进行免疫抗体，观察21日。观察记录给药后豚鼠和小鼠精神、行为等一般状况；于免疫当日和免疫后21日称量豚鼠和小鼠的体重。结果，给药的豚鼠和小鼠精神良好，局部及全身无异常临床反应，增重正常，与对照组比较无明显差异。说明马源抗体、猫源抗体和犬源抗体对豚鼠和小鼠是安全的。

以上实验表明，马源的大熊猫犬瘟热精制抗体对于异源的比格犬以及豚鼠和小鼠均是安全的，其有望用于预防和治疗大熊猫的犬瘟热疾病。

Claims (2)

1.一种大熊猫犬瘟热病毒的马源抗体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)对大熊猫犬瘟热病毒强毒株进行扩增，建立免疫用疫苗制备毒株:

①大熊猫犬瘟热病毒毒株种子批的制备:

a原始种子批的制备

具体方法为将大熊猫犬瘟热病毒毒株,其保藏编号为CGMCCNo.18179，按0.5％接种在单层的Vero细胞上，在37℃进行病毒培养，培养至细胞病变达到80％～90％时收获病毒上清液，代次为1代，以此类推，将大熊猫犬瘟热病毒毒株第9代按0.1M.O.I.接种到搅拌瓶中，悬浮培养96h，待细胞病变达到80％～90％时收获病毒液，定量分装，冻干，制成第10代原始种子批；

b基础种子批的制备

待微载体上培养的细胞长成单层，将大熊猫犬瘟热病毒毒株第10代原始种子按0.1M.O.I.接种到搅拌瓶中，悬浮培养96～120h，待细胞病变达到80％～90％时收获病毒液,按照上述方法将毒株进行传代，制成第14和16代毒株，并进行病毒含量和免疫抗原性检验；

c生产用种子批的制备

待微载体上培养的细胞长成单层，将大熊猫犬瘟热病毒毒株第14代和16代基础毒种按0.1M.O.I.接种到搅拌瓶中，悬浮培养96～120h，待细胞病变达到80％～90％时收获病毒液，制成17和19代毒株，并进行病毒含量和免疫原性检验；

将上述制备的原始种子批、基础种子批和生产种子批用于疫苗的制备；

②Vero细胞的制备

取第130代Vero细胞工作种子速溶后，用含10％新生牛血清的MEM培养基接种到T25细胞培养瓶中，37±0.5℃条件下培养24h，更换含5％新生牛血清的MEM培养基，继续培养7日，待长成单层后，以相同的方法进行细胞传代,将长成单层的Vero细胞用细胞消化液消化，接种到生物反应器中，细胞接种浓度为0.40×10⁶个/ml，微载体浓度为6.0g/L，加入含10％新生牛血清的MEM细胞生长液至工作体积，在温度37±0.5℃，pH为7.20±0.05条件下培养待用,

③犬瘟热病毒灭活疫苗的制备

以Vero细胞为细胞基质，以犬瘟热病毒为毒株，在搅拌瓶或生物反应器中进行病毒培养；在生物反应器中待细胞长成单层后，按0.1MOI接种病毒，培养温度为37±0.5℃，pH为7.20±0.05条件下，含0.2％牛血清蛋白的MEM病毒维持液，培养至120h，且待细胞病变CPE达80％～90％时收获病毒上清液，取样进行病毒含量测定，病毒含量达10^7.5TCID₅₀/0.1ml,

④疫苗制备步骤如下：

将犬瘟热病毒收获液采用0.65μm滤芯澄清过滤去除细胞碎片，过滤后的犬瘟热病毒毒株收获液采用截留分子量为300KDa膜包被超滤浓缩10倍，将犬瘟热病毒毒株浓缩液加入终浓度为1/4000的β-丙内酯，置2～8℃条件下灭活24h，37±0.5℃水解2h，按佐剂：犬瘟热灭活疫苗原液＝1:3的比例加入帕米卡佐剂，制备免疫原；

(2)对健康马匹在背部皮下分点注射进行免疫，获得大熊猫犬瘟热高免疫血清，

(3)对所述血清抗体进行纯化处理，获得精制马源抗体F(ab’)2；

具体方法为：无菌条件下将1体积高免疫血清与2体积无热原水进行混合，1M HCl调pH至3.4，然后，向稀释血清中加入终浓度为10000IU/mL胃蛋白酶，混匀后30℃消化2.5h，期间不断搅拌，经过酶切处理后先用NaOH调节pH至4.5，之后缓慢加入硫酸铵至终浓度为12％(w:v)；除去产生的沉淀后，在56℃下对酶解液进行1h的热变性处理，随后，上清通过30℃的冷水对流冷却处理，接着去除掉随之产生的沉淀，调节上清pH至7.0，加硫酸铵至终浓度23％(w:v)以沉淀F(ab’)2，用0.01M PBS重溶F(ab’)2并进行超滤，除掉剩余硫酸铵并浓缩，添加NaCl、防腐剂与一些赋形剂，再次调节pH至中性，经0.22μm滤膜过滤除菌分装，获得的F(ab’)2经30KD膜包超滤浓缩置换至pH7.2的0.01M PBS中，室温下，Sephacryl-100以相同缓冲液平衡3个柱体积后上样，上样后，以pH7.2的0.01M PBS持续洗涤柱子，同时检测OD280数值变化并分段收集流穿液，经9％浓度分离胶的非还原SDS-PAGE鉴定后，合并含有绝大多数F(ab’)2成分的流穿液，经30KD MWCO超滤管进行浓缩，获得精制的纯化马源大熊猫犬瘟热病毒抗体。

2.如权利要求1所述的制备方法，其中所述马匹为1岁龄的幼龄马匹，不曾患过任何传染性疾病的马匹。

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