CN103585627B - 一种利用猪源生产犬用多联高免血清的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用猪源生产犬用多联高免血清的制备方法。本发明的技术方案要点是，一种利用猪源生产犬用多联高免血清的制备方法，选择健康状况良好的母猪，对其使用含有黄芪多糖的犬五联活疫苗多次强化免疫，接种的方法为皮下或肌肉多点注射，接种的部位为颈部两侧或臀部两侧，接种剂量从首次的3-5头份逐次递增至15-20头份，最后一次免疫剂量增加至20头份，每次免疫间隔2-4周，最后一次免疫后2-4周，然后进行心脏采血，分离血清，再将血清灭活除菌，然后检测抗体效价，其中犬瘟热及狂犬病病毒中和抗体效价得到1:256以上，其余病毒血凝抑制抗体效价达到1:256以上为适用。本发明所述的制备方法简单易行，成本低廉，经济实用，可广泛用于犬主要疫病的紧急预防和治疗。
Description
技术领域：
本发明涉及犬用多联高免血清的制备，特别是一种利用猪源生产犬用多联高免血清的制备方法。
背景技术：
随着人民生活水平的提高，人们饲养犬的数量与日俱增，相应的犬病大量增加，如犬瘟热、犬细小病毒病、犬传染性肝炎、犬传染性喉气管炎、犬流感、犬副流感等严重影响犬的健康，一些人兽共患的疾病如狂犬病直接威胁人类健康。
目前，国内外已有多种抗病毒血清、抗细菌毒素或免疫球蛋白制剂应用于临诊实践，用于疾病的紧急预防与治疗，如抗狂犬病血清、破伤风抗毒素血清等，这些抗血清多数是使用马属动物或犬制备的，这些生物制品一方面工艺复杂，成本很高，另一方面用犬生产的抗血清由于来自于本种动物，不可避免会导致垂直传播或水平传播某种传染病的可能。
发明内容：
本发明的是设计一种生产工艺简单、产品效果好的利用猪源生产犬用多联高免血清的制备方法。
本发明的技术方案是，一种利用猪源生产犬用多联高免血清的制备方法，其特征在于：选择健康状况良好的母猪，对其使用含有黄芪多糖的犬五联活疫苗多次强化免疫，接种的方法为皮下或肌肉多点注射，接种的部位为颈部两侧或臀部两侧，接种剂量从首次的3-5头份逐次递增至15-20头份，最后一次免疫剂量增加至20头份，每次免疫间隔2-4周，最后一次免疫后2-4周，然后进行心脏采血，分离血清，再将血清灭活除菌，然后检测抗体效价，其中犬瘟热及狂犬病病毒中和抗体效价得到1:256以上，其余病毒血凝抑制抗体效价达到1:256以上为适用。所述的血清灭活除菌步骤为：收集的血清混合均匀，加入终浓度为0.3%-0.5%的TNBP（磷酸三丁脂）和1%-3%的吐温-80或1%-3%Triton-100，24℃6-8h；再经60Co-γ 射线辐照灭菌，辐照温度为20℃，辐照剂量率为14.0Gy/min，辐照吸收剂量为12kGy。所述的含有黄芪多糖的犬五联活疫苗，其黄芪多糖含量为80-320ug/ml。
本发明所述的制备方法简单易行，成本低廉，经济实用，可广泛用于犬主要疫病的紧急预防和治疗。
本发明的技术方案由如下过程组成：
1.免疫原：市售的犬五联活疫苗;①美国辉瑞生产，预防犬瘟热、犬腺病毒1型引起的传染性肝炎、犬腺病毒2型引起的呼吸道病、犬副流感和犬细小病毒肠炎;②吉林五星药厂生产,用于预防狂犬病、犬瘟热、犬副流感、腺病毒感染及犬细小病毒感染。
2.动物免疫：
选择体格较大，健康状况良好，产仔6胎以上，繁殖力下降，无种用价值的淘汰母猪。在卫生状况良好，专人管理的条件下饲养，对其使用上述添加黄芪多糖重量份数为80-320ug/ml的疫苗进行多次强化免疫。接种的方法为皮下或肌肉多点注射，接种的部位为颈部两侧或臀部两侧。
接种剂量从首次的3-5头份逐次递增至15-20头份，最后一次免疫剂量增加至20头份。每次免疫间隔2-4周，最后一次免疫后2-4周，检测抗体效价。依据抗体效价确定强化免疫时间及采血时间。
3.血液采集及血清分离：
强化免疫后14-30d之间检测抗体效价，达到规定的效价水平要求后即可采血。采血最好在上午空腹时进行，禁食时间在6h以上，可避免血中乳糜的发生从而获得澄清的血清。将待采血母猪用清水冲洗干净后固定在“X”型的保定架上，使猪仰卧，将猪尾部垫高，将位于胸前口左侧的被毛刮除干净，并用3%碘酒消毒，后用75%酒精脱碘，将事先消毒完好的空心铜管（一端尖、一端平，长40cm、直径约1cm）平头一端套上消毒完好的硅橡胶管，经消毒的胸前口捅入猪的心脏（不宜深入太长防止完全穿透心脏），将胶管游离端插入预先装有少量灭菌生理盐水的离心管中收集血液，室温放置,待血块收缩完全后置4℃过夜，4000rpm离心20min收集血清。
4.血清灭活除菌
将上述收集的血清混合均匀，加入终浓度为0.3%-0.5%的TNBP（磷酸三丁脂）和1%-3%的吐温-80或1%-3%Triton-100,24℃6-8h；再经60Co-γ 射线辐照灭菌，辐照温度为20℃，辐照剂量率为14.0Gy/min，辐照吸收剂量为12kGy。
5.效价测定
犬瘟热及狂犬病病毒抗体通过微量中和试验测定，犬副流感、腺病毒I型和2型及犬细小病毒病毒抗体均通过微量血凝抑制病毒试验测定，犬瘟热及狂犬病病毒中和抗体效价得到1:256以上，其余病毒血凝抑制抗体效价达到1:256以上为合格。
6.无菌检查
血清通过接种琼脂平板，37℃培养48-72h看是否有菌落生长。
7.安全试验
将上述无细菌生长的血清注射犬约10头（5日龄-10日龄）（腹腔注射）5-10ml/头，观察一周（每日量体温，观察是否发病），一切正常者为合格。
其它项按照中华人民共和国兽用生物制品质量标准（2001年版）中抗血清成品有关规定进行。
将合格的血清制品分装，5ml/瓶，-18℃以下冷冻保存。
所述的黄芪多糖为广西南宁市桃源兽药厂生产的黄芪多糖注射液，含量为0.2g /10ml。
具体实施方式：
详细描述实施例，
实施例1
1.免疫原：由美国辉瑞生产的犬五联活疫苗。
2.动物免疫：
选择体格较大，健康状况良好，产仔6胎以上，繁殖力下降，无种用价值的淘汰母猪。在卫生状况良好，专人管理的条件下饲养。对其使用上述添加黄芪多糖含量为80ug/ml的疫苗进行多次强化免疫。接种的方法为肌肉多点注射，接种的部位为颈部两侧。接种剂量首次5头份/头，第二次10头份/头，第三次免疫15头份/头，每次间隔2周，最后一次免疫剂量增加至20头份/头。最后一次免疫后2周，检测抗体效价，犬瘟热病毒中和抗体效价得到1:256以上，其余病毒血凝抑制抗体效价达到1:256以上为合格。
3.血液采集及血清分离：
强化免疫后14-30d之间检测抗体效价，达到规定的效价水平要求后即可采血。采血最好在上午空腹时进行，禁食时间在6h以上，可避免血中乳糜的发生从而获得澄清的血清。将待采血母猪用清水冲洗干净后固定在“X”型的保定架上，使猪仰卧，将猪尾部垫高，将位于胸前口左侧的被毛刮除干净，并用3%碘酒消毒，后用75%酒精脱碘，将事先消毒完好的空心铜管（一端尖、一端平，长40cm、直径约1cm）平头一端套上消毒完好的硅橡胶管，经消毒的胸前口捅入猪的心脏（不宜深入太长防止完全穿透心脏），将胶管游离端插入预先装有少量灭菌生理盐水的离心管中收集血液，室温放置,待血块收缩完全后置4℃过夜，4000rpm离心20min收集血清。
4.血清灭活除菌
将上述收集的血清混合均匀，加入终浓度为0.5%的TNBP和1%的吐温-80，24℃6h；再经60Co-γ 射线辐照灭菌，辐照温度为20℃，辐照剂量率为14.0Gy/min，辐照吸收剂量为12kGy。
5.效价测定
犬瘟热病毒抗体通过微量中和试验测定，犬副流感、腺病毒I型和2型及犬细小病毒病毒抗体均通过微量血凝抑制病毒试验测定，犬瘟热病毒中和抗体效价得到1:256以上，其余病毒血凝抑制抗体效价达到1:256以上为合格。
6.无菌检查
血清通过接种琼脂平板，37℃培养48h无菌落生长为合格。
7.安全试验
将上述无细菌生长的血清注射犬约10头（5日龄-10日龄）（腹腔注射）5-10ml/头，观察一周（每日量体温，观察是否发病），一切正常者为合格。
其它项按照中华人民共和国兽用生物制品质量标准（2001年版）中抗血清成品有关规定进行。
将合格的血清制品分装，5ml/瓶，-18℃以下冷冻保存。
所述的黄芪多糖为广西南宁市桃源兽药厂生产的黄芪多糖注射液，含量为0.2g /10ml。
实施例2
1.免疫原：由吉林五星药厂生产的犬五联活疫苗。
2.动物免疫：
选择体格较大，健康状况良好，产仔6胎以上，繁殖力下降，无种用价值的淘汰母猪。在卫生状况良好，专人管理的条件下饲养。对其使用上述添加黄芪多糖重量份数为160ug/ml的疫苗进行多次强化免疫。接种的方法为肌肉多点注射，接种的部位为颈部两侧。接种剂量首次5头份/头，第二次10头份/头，第三次免疫15头份/头，每次间隔2周，最后一次免疫剂量增加至20头份/头。最后一次免疫后2周，检测抗体效价，犬瘟热及狂犬病病毒中和抗体效价得到1:256以上，其余病毒血凝抑制抗体效价达到1:256以上为合格。
3.血液采集及血清分离：
强化免疫后14-30d之间检测抗体效价，达到规定的效价水平要求后即可采血。采血最好在上午空腹时进行，禁食时间在6h以上，可避免血中乳糜的发生从而获得澄清的血清。将待采血母猪用清水冲洗干净后固定在“X”型的保定架上，使猪仰卧，将猪尾部垫高，将位于胸前口左侧的被毛刮除干净，并用3%碘酒消毒，后用75%酒精脱碘，将事先消毒完好的空心铜管（一端尖、一端平，长40cm、直径约1cm）平头一端套上消毒完好的硅橡胶管，经消毒的胸前口捅入猪的心脏（不宜深入太长防止完全穿透心脏），将胶管游离端插入预先装有少量灭菌生理盐水的离心管中收集血液，室温放置,待血块收缩完全后置4℃过夜，4000rpm离心20min收集血清。
4.血清灭活除菌
将上述收集的血清混合均匀，加入终浓度为0.4%的TNBP和2%的吐温-80，24℃6h；再经60Co-γ 射线辐照灭菌，辐照温度为20℃，辐照剂量率为14.0Gy/min，辐照吸收剂量为12kGy。
5.效价测定
犬瘟热及狂犬病病毒抗体通过微量中和试验测定，犬副流感、腺病毒I型和2型及犬细小病毒病毒抗体均通过微量血凝抑制病毒试验测定，犬瘟热及狂犬病病毒中和抗体效价得到1:256以上，其余病毒血凝抑制抗体效价达到1:256以上为合格。
6.无菌检查
血清通过接种琼脂平板，37℃培养48h无菌落生长为合格。
7.安全试验
将上述无细菌生长的血清注射犬约10头（5日龄-10日龄）（腹腔注射）5-10ml/头，观察一周（每日量体温，观察是否发病），一切正常者为合格。
其它项按照中华人民共和国兽用生物制品质量标准（2001年版）中抗血清成品有关规定进行。
将合格的血清制品分装，5ml/瓶，-18℃以下冷冻保存。
所述的黄芪多糖为广西南宁市桃源兽药厂生产的黄芪多糖注射液，含量为0.2g /10ml。
实施例3
1.免疫原：由美国辉瑞生产的犬五联活疫苗。
2.动物免疫：
选择体格较大，健康状况良好，产仔6胎以上，繁殖力下降，无种用价值的淘汰母猪。在卫生状况良好，专人管理的条件下饲养。对其使用上述添加黄芪多糖重量份数为320ug/ml的疫苗进行多次强化免疫。接种的方法为肌肉多点注射，接种的部位为颈部两侧。接种剂量首次5头份/头，第二次10头份/头，第三次免疫15头份/头，每次间隔2周，最后一次免疫剂量增加至20头份/头。最后一次免疫后2周，检测抗体效价，犬瘟热病毒中和抗体效价得到1:256以上，其余病毒血凝抑制抗体效价达到1:256以上为合格。
3.血液采集及血清分离：
强化免疫后14-30d之间检测抗体效价，达到规定的效价水平要求后即可采血。采血最好在上午空腹时进行，禁食时间在6h以上，可避免血中乳糜的发生从而获得澄清的血清。将待采血母猪用清水冲洗干净后固定在“X”型的保定架上，使猪仰卧，将猪尾部垫高，将位于胸前口左侧的被毛刮除干净，并用3%碘酒消毒，后用75%酒精脱碘，将事先消毒完好的空心铜管（一端尖、一端平，长40cm、直径约1cm）平头一端套上消毒完好的硅橡胶管，经消毒的胸前口捅入猪的心脏（不宜深入太长防止完全穿透心脏），将胶管游离端插入预先装有少量灭菌生理盐水的离心管中收集血液，室温放置,待血块收缩完全后置4℃过夜，4000rpm离心20min收集血清。
4.血清灭活除菌
将上述收集的血清混合均匀，加入终浓度为0.3%的TNBP和3%的吐温-80，24℃6h；再经60Co-γ 射线辐照灭菌，辐照温度为20℃，辐照剂量率为14.0Gy/min，辐照吸收剂量为12kGy。
5.效价测定
犬瘟热抗体通过微量中和试验测定，犬副流感、腺病毒I型和2型及犬细小病毒病毒抗体均通过微量血凝抑制病毒试验测定，犬瘟热病毒中和抗体效价得到1:256以上，其余病毒血凝抑制抗体效价达到1:256以上为合格。
6.无菌检查
血清通过接种琼脂平板，37℃培养48h无菌落生长为合格。
7.安全试验
将上述无细菌生长的血清注射犬约10头（5日龄-10日龄）（腹腔注射）5-10ml/头，观察一周（每日量体温，观察是否发病），一切正常者为合格。
其它项按照中华人民共和国兽用生物制品质量标准（2001年版）中抗血清成品有关规定进行。
将合格的血清制品分装，5ml/瓶，-18℃以下冷冻保存。
所述的黄芪多糖为广西南宁市桃源兽药厂生产的黄芪多糖注射液，含量为0.2g /10ml。
应用例：
1、新乡市郊区一农户，患犬初期粪便稀薄，体温４0.5℃，2d后，粪便呈番茄酱色或咖啡色，味腥臭，排便次数不定，有里急后重的症状，连续注射0.5-1.0l2-3d，K3，3d后症状明显减轻，一周后症状消失，基本康复。
2.2011年以来，河南科技学院兽医院对前来就诊的表现高烧、下痢、便中带血、咳嗽气喘等症诊断为犬细小病毒病及犬瘟热的患犬376只，肌肉注射或皮下注射本产品2-5ml/头，同时配合K3及安乃近等进行对症治疗，每天一次，连用2-3天，3天后症状消失，治愈率达85%，有效率达90%，疗效显著。
本发明的猪源犬用多联高免血清对治疗早期的犬瘟热、犬细小病毒病等疫病效果极好，与其它犬用多联高免血清效果相当，而制备工艺简单，价格低廉，优势明显。
Claims (1)
1.一种利用猪源生产犬用多联高免血清的制备方法，其特征在于：选择健康状况良好的母猪，对其使用含有黄芪多糖的犬五联活疫苗多次强化免疫，接种的方法为皮下或肌肉多点注射，接种的部位为颈部两侧或臀部两侧，接种剂量从首次的3-5头份逐次递增至15-20头份，最后一次免疫剂量增加至20头份，每次免疫间隔2-4周，最后一次免疫后2-4周，然后进行心脏采血，分离血清，再将血清灭活除菌，然后检测抗体效价，其中犬瘟热及狂犬病病毒中和抗体效价得到1:256以上，其余病毒血凝抑制抗体效价达到1:256以上为适用；血清灭活除菌步骤为：收集的血清混合均匀，加入终浓度为0.3%-0.5%的TNBP（磷酸三丁脂）和1%-3%的吐温-80或1%-3%Triton-100,24℃6-8h；再经60Co-γ 射线辐照灭菌，辐照温度为20℃，辐照剂量率为14.0Gy/min，辐照吸收剂量为12kGy；所述的含有黄芪多糖的犬五联活疫苗，其黄芪多糖含量为80-320ug/ml。
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