CN102058884B - 一种草鱼注射疫苗增效剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种草鱼注射疫苗增效剂，每毫升增效剂有效成分为酵母β-1,3葡聚糖0.1～0.2g，半乳甘露寡糖0.05～0.1g，枯草芽孢杆菌3×108CFU～3×1010CFU。本发明还公开了上述增效剂的制备方法，是将1～2g酵母β-1,3葡聚糖，0.5～1g半乳甘露寡糖加入到10mL枯草芽孢杆菌菌液中，充分混和均匀。本发明还公开了上述草鱼注射疫苗增效剂在免疫草鱼中的应用。与现有技术相比，本发明增效剂组分较少，制备方法简单，且对草鱼疫苗具有明显的增效作用，能够提高疫苗对草鱼的保护效果，延长免疫保护期。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于草鱼的注射疫苗增效剂及其制备方法。
背景技术
目前，草鱼病害问题仍是决定养殖成功与否的重要因素之一。传统的化学药物防治虽可起到一定的作用，但也引起了病原体产生耐药性、病原变异频率加快、养殖环境失衡等问题，严重威胁人类健康，不利于水产养殖可持续发展。免疫防治是通过免疫接种的方式提高水产动物对病原的特异性抗体水平，从而减少疾病的发生。免疫防治无毒副作用，绿色环保，且能从根本上提高机体的抵抗力，是将来水产动物疾病防治的必然趋势。国内从上世纪70年代开始，先后开展了草鱼组织浆疫苗、出血病疫苗及草鱼细菌性烂鳃、赤皮、肠炎等疫苗方面的工作，但免疫效果不稳定，因此一直没有得到广泛推广应用。佐剂能一定程度上提高水产疫苗的免疫效果，如铝胶、矿物油等，但这些常用的佐剂对很多抗原效果不确定，或对鱼体有较大的副作用。
β-葡聚糖具有较强的免疫调节作用，能促进机体巨噬细胞吞噬和杀菌活性，刺激机体B细胞、T细胞的生成，提高机体对抗原的免疫应答水平，β-葡聚糖作为非特异性的免疫调节剂,不仅能激活免疫细胞,还能促进细胞因子生成,激活补体系统,促进抗体产生,对免疫系统发挥多方面的调节作用。与其他免疫增强剂不同，β-葡聚糖对免疫系统不会造成过度刺激，因此体弱和免疫机能受损的鱼体同样可以使用。
半乳甘露寡糖不仅能够激活巨噬细胞，诱导机体体液免疫反应，增强动物体的非特异性免疫功能，且具有特殊的抗菌效果，能显著增强动物对各种环境的应激机能。
枯草芽孢杆菌外膜蛋白和多糖能刺激机体免疫细胞，促进细胞活力，起到佐剂的作用，且枯草芽孢杆菌可作为一种“自然微粒”佐剂使机体免疫相关的组织处于高度的“免疫准备状态”，从而促进机体较快的产生相应的抗体，促进T、B淋巴细胞的产生，提高机体体液和细胞免疫水平。
中国专利申请公开号CN101390925A（公开日2009年3月25日）公开了一种淡水鱼苗用复合免疫增强剂，由β-葡聚糖、壳聚糖、枯草芽孢杆菌、维生素C、柴胡、黄芪和杜仲所组成，重量百分数范围分别为25～35、20～30、15～25、10～15、8～13、7～11和5～8。主要在鱼苗饲料中作为饲料添加剂使用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中免疫注射剂佐剂效果不稳定、对动物体副作用大等缺陷，提供一种用于草鱼的注射疫苗增效剂。
本发明的另一目的在于提供上述用于草鱼的注射疫苗增效剂的制备方法。
本发明的又一目的是提供上述用于草鱼的注射疫苗增效剂在免疫草鱼中的应用。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
一种草鱼注射疫苗增效剂，每毫升增效剂有效成分为酵母β-1,3葡聚糖0.1～0.2g，半乳甘露寡糖0.05～0.1g，枯草芽孢杆菌3×108CFU～3×1010CFU。优选方案为酵母β-1,3葡聚糖0.2g，半乳甘露寡糖0.1g，枯草芽孢杆菌3×1010CFU。
上述增效剂中，酵母β-1,3葡聚糖为水溶性的，能够激活机体免疫细胞，增强和刺激动物体的非特异性免疫功能和产生特异性免疫功能，提高机体的免疫能力。
上述增效剂中半乳甘露寡糖激活巨噬细胞，诱导机体体液免疫反应，且具有特殊的抗菌效果，能显著增强动物对各种环境的应激机能。
上述增效剂中，枯草芽孢杆菌作为一种“自然微粒”佐剂使机体免疫相关的组织处于高度的“免疫准备状态”，从而促进机体较快的产生相应的抗体，促进T、B淋巴细胞的产生，提高机体体液和细胞免疫水平。
上述草鱼注射疫苗增效剂的制备方法，包括以下步骤：
称取1～2g酵母β-1,3葡聚糖，0.5～1g半乳甘露寡糖加入到10mL枯草芽孢杆菌菌液中，充分混和均匀。
优选方案为将枯草芽孢杆菌用0.01 M PBS，pH7.2的磷酸盐缓冲液调整到3×108 CFU/mL～3×1010CFU/mL，4℃保存；称取酵母β-1,3葡聚糖和半乳甘露寡糖加入到上述枯草芽孢杆菌菌液中，用0.01M，pH7.2的无菌PBS调节浓度，使酵母β-1,3葡聚糖终浓度为0.1～0.2g /mL，更优选0.2g/mL；半乳甘露寡糖终浓度为0.05～0.1g /mL，优选0.1g /mL，充分混和均匀。
上述草鱼注射疫苗增效剂在免疫草鱼中的应用，是在注射疫苗前配制增效剂，现配现用，然后与注射疫苗按1:50～100的体积比混合，最大体积比为1：100，注射剂量为按鱼体重注射0.1～0.3ml。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
在疫苗口服和浸泡效果不稳定的情况下，疫苗注射仍为首选的免疫方式，本发明将酵母β-1,3葡聚糖、半乳甘露寡糖及枯草芽孢杆菌联合制成免疫增效剂，是专门针对草鱼的生物学特性制备而成的。该增效剂对注射用疫苗具有明显的增强作用，起到较好的免疫效果，提高疫苗的保护期，能够满足生产需求。枯草芽孢杆菌与现有的注射用佐剂相比，这种天然的微粒佐剂对鱼体没有副作用，且能刺激细胞活性，产生快速、持久的免疫应答反应。酵母β-1,3葡聚糖和半乳甘露寡糖作为免疫增强剂在注射疫苗方面未见应用。
本发明增效剂组分较少，制备方法简单易操作，成本低廉，增效作用明显，适于广泛应用。
具体实施方式
实施例1 ：增效剂的制备
培养基配方：20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化钠+0.5g牛肉膏+20g琼脂 ，溶于1L蒸馏水后高压灭菌。将枯草芽孢杆菌在上述液体培养基中培养12小时后，用0.01 M PBS，pH7.2的磷酸盐缓冲液洗涤3次，然后用PBS调整到3×1010CFU/mL，4℃保存。注射前根据菌液体积称量酵母β-1,3葡聚糖、半乳甘露寡糖，使其在增效剂中的终浓度分别为0.2g/mL、0.1 g/mL，将增效剂按1：50加入疫苗中，现配现用。
实施例2：增效剂的制备
培养基配方：20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化钠+0.5g牛肉膏+20g琼脂 ，溶于1L蒸馏水后高压灭菌。将枯草芽孢杆菌在上述液体培养基中培养12小时后，用0.01 M PBS，pH7.2的磷酸盐缓冲液洗涤3次，然后用PBS调整到3×1010CFU/mL，4℃保存。注射前根据菌液体积称量酵母β-1,3葡聚糖、半乳甘露寡糖，使其在增效剂中的终浓度分别为0.2g/mL、0.1 g/mL，将增效剂按1：100加入疫苗中，现配现用。
实施例3：本发明增效剂对草鱼弱毒疫苗的增效作用
选取实施例1和2中的增效剂对草鱼弱毒疫苗增效。草鱼弱毒疫苗为珠江水产研究所生产的草鱼冻干细胞弱毒苗。选择体质健壮的草鱼种，体重50±5g，共600尾，放养于3个3m×2m×2m的网箱中，水温28±2℃，暂养7d确定无病后进行免疫注射，分别为增效组、正常疫苗组、对照组（PBS），背鳍基部注射0.2mL/尾，免疫28天后，随机抽取网箱内的试验鱼30尾，注射1：10病毒组织浆0.3mL进行攻毒，连续观察14d，统计死亡率，按下列公式计算成活率和相对免疫保护率，实验结果见表1。
成活率=（攻毒数-死亡数）/攻毒数×100%
相对保护率=（PBS对照组死亡数-实验组死亡数）/PBS对照组死亡数×100%
表1 本发明对草鱼疫苗的免疫增强效果
从实验结果可以看出，增效组相对保护率明显高于正常疫苗组，因此说明本发明的增效剂对草鱼弱毒疫苗具有较好的增效效果。
实施例4：本发明增效剂对草鱼土法疫苗的增效作用
实施例1和2方法制备的增效剂于2009-2010年在番禺、中山等地池塘养殖草鱼种时结合当地土法疫苗推广应用，共免疫鱼种50万尾以上，草鱼苗种养殖阶段保护率达80%以上（表2），有效期达5个月，完全满足草鱼种阶段的生产需求，取得了较好的预防效果。
表2 本发明在池塘养殖中对草鱼疫苗的应用效果
| 池塘编号 | 池塘面积（亩） | 放养密度（尾/亩） | 疫苗种类 | 成活率 |
| 1 | 30 | 8000 | 土法疫苗 | 46.3% |
| 2 | 8 | 7000 | 土法疫苗 | 71.4% |
| 3 | 8 | 7000 | 土法疫苗+增效剂 | 89.3% |
| 4 | 8 | 9300 | 土法疫苗+增效剂 | 84.9% |
| 5 | 10 | 13500 | 土法疫苗+增效剂 | 88.9% |
| 6 | 12 | 8000 | 土法疫苗+增效剂 | 81.3% |
| 7 | 12 | 8000 | 土法疫苗+增效剂 | 86.7% |
| 8 | 10 | 8000 | 土法疫苗+增效剂 | 85.4% |
| 9 | 10 | 8000 | 草鱼出血病弱毒疫苗+增效剂 | 91.2% |
Claims (4)
1.一种草鱼注射疫苗增效剂，其特征在于每毫升增效剂组成为酵母β-1,3葡聚糖0.1～0.2g，半乳甘露寡糖0.05～0.1g，枯草芽孢杆菌3×108CFU～3×1010CFU。
2.根据权利要求1所述草鱼注射疫苗增效剂，其特征在于每毫升增效剂组成为酵母β-1,3葡聚糖0.2g，半乳甘露寡糖0.1g，枯草芽孢杆菌3×1010CFU。
3.根据权利要求1所述草鱼注射疫苗增效剂，其特征在于所述酵母β-1,3葡聚糖为水溶性的。
4.权利要求1~3任一所述草鱼注射疫苗增效剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：称取需要量的酵母β-1,3葡聚糖和半乳甘露寡糖加入到枯草芽孢杆菌菌液中，充分混和均匀。
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