CN1748713A - 鸡胚胎素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有较高生物活性的鸡胚胎素的制备方法。本发明的高生物活性鸡胚胎素的制备方法是将精选鸡受精卵常规孵化10～13天后，将其表面进行消毒，去除蛋壳取出鸡胚胎，在低温下将鸡胚胎粉碎，加入无菌纯水打浆，4℃条件下离心，获取上清夜，后将此上清液过截留量为800000道尔顿以上的中空纤维超滤器，得超滤液，将此超滤液冷冻干燥后得到类白色疏松团块即为鸡胚胎素，或将上述超滤液经超滤浓缩至一定浓度后直接无菌分装保存，即为鸡胚胎素溶液。本发明所制备出来的鸡胚胎素含有氨基酸、小分子多肽、生长调节因子、核酸及核酸衍生物等多种营养成分，由于采用了低温生产过程和现代生物分离技术，保持了鸡胚胎中很多活性物质的较高生物活性。
Description
一.技术领域：本发明涉及一种胚胎素的制备方法，特别是涉及一种具有较高生物活性的鸡胚胎素的制备方法。
二.背景技术：鸡胚胎素是一组具有高生物活性的生长刺激因子、神经生长因子、活性多糖、活性多肽、多种氨基酸和丰富的其他营养物质的小分子混合物，它们具有促生长和活化生理功能的精华成分，能激活人体组织细胞，活化组织器官功能，调节人体各种免疫力，提高人体抵抗疾病的能力，并可延缓衰老，其中所含的生长刺激因子可以增加皮肤含水量、促进上皮细胞的新陈代谢，经过一定时间的应用，可延缓真皮层衰老、萎缩，使皮肤真皮层饱满，并可增加表皮含水量，使表皮光滑滋润。
鸡胚胎素的主要原料是鸡胚胎，是用受精鸡蛋(即鸡受精卵)，通过人工或鸡本身的孵化而培育出来的一种动物胚胎。根据《鸡胚发育图谱》(蒋唏东著、科学出版社1983年出版)中介绍了鸡胚胎的发育过程：“一日起了珠，鱼眼黄中游；二日‘樱桃’起，心脏开始动；三日血管成，‘蚊子’在黄中；四日定了位，样似小蜘蛛，五日长软骨，眼部显单珠；六日胎盘动，头尾成双珠；七日离了壳，沉入蛋白中；八日边口硬，胎在蛋中游；九日嘴不分，头尾来回动；十日显毛管，血管始加粗；十一腹毛全，尿囊全合拢；十二毛长齐，上下鹗分明；直到二一小鸡出”，鸡受精卵在短短的21天内即可由一个单细胞发育成为一个成熟的小鸡个体，在此期间鸡受精卵发生了巨大的变化，在此变化过程中伴随产生大量的生长刺激因子、神经生长因子、活性多糖、活性多肽、多种氨基酸和丰富的其他营养物质，借以支持新生生命个体的生长和发育。
鸡胚胎在血管全部形成后，似肉非肉，似蛋非蛋，是营养最高的活性胚胎，自古以来被称为“大众的补养品”，它含有丰富的蛋白质、人体所需的十八种氨基酸、维生素和对人体有益的微量元素。鸡胚胎的食疗价值虽然很高，但人们的食用方法却很不科学，鸡胚胎的来源往往是从鸡蛋孵化过程中被清理下来的死胎蛋、死毛蛋，弃之可惜，废物利用，比如：将死胚胎(即毛蛋)煮着吃，有的还加上中药煮着吃用于治病、防病，还有人将它加工成罐头。据测定，死胎蛋和死毛蛋几乎百分之百可查出大肠杆菌、葡萄球菌等病菌，不宜食用，于是人们便将目光投向了制备鸡胚胎素的研究上。中国发明专利CN 1226401A，申请号为98100528.4，发明名称为：“‘凤凰胎’保健食品及其制作方法”中就公开了一种以鲜活的鸡胚胎、蛋黄为主要原料的保健食品，它是由活的、胚龄为7～9日的鸡胚胎、蛋黄填加一定比例的蒸馏水和适量盐，搅拌、蒸煮、定量分装、封盖、杀菌、包装而成；中国发明专利CN 1324625A，申请号为00107555.1，发明名称为：“鸡胚胎精华素的制作方法”中就公开了一种鸡胚胎素的制备工艺，它是将活性鸡胚胎加中药转化成为液体，通过浓缩所得到的精华素系列产品。这两种专利方法以及现有其他技术制备的胚胎类制剂，多采用常温分离提取方法，所提取的有效成分只是氨基酸、微量元素等所谓的“营养物质”，由于在室温的温度下，甚至酶解、高温消毒等方法，多肽、蛋白质大多因空间结构破怀、链断裂、酶水解等因素而失去活性，从而成为“死物质”。目前还没有可以保持较高生物活性的鸡胚胎素的有关技术的报道。
三.发明内容：
本发明的目的是：克服现有技术的不足，提供一种采用低温生产过程和现代生物分离技术来保持较高生物活性的鸡胚胎素的制备方法。
本发明的技术方案是：
一种鸡胚胎素的制备方法，包括鸡受精卵的精选和孵化，包括下列步骤：
a.精选鸡受精卵，表面常规去污，依常规孵化方法孵化10～13天；
b.将孵化好的受精卵表面进行常规消毒，去除蛋壳取出鸡胚胎，在≤4℃的温度条件下将鸡胚胎粉碎；
c.将粉碎后的鸡胚胎加入3～5倍鸡胚胎体积的无菌纯水进行打浆；
d.将打成浆的鸡胚胎在-26～-28℃的温度条件下进行反复冻融；
e.将反复冻融的鸡胚胎浆在≤4℃温度条件下倒入离心机中，在3000～10000转/分的转速条件下离心10～30分钟，获取上清夜；
f.将上清液过截留分子量在800000道尔顿以上的超滤柱，得超滤液；
g.将超滤液冷冻干燥后得到类白色疏松团块状物质，即为所述的鸡胚胎素，或将上述超滤液经超滤浓缩后直接无菌分装保存，即为鸡胚胎素溶液；
h.在相对湿度小于30％的环境中，将所得到的鸡胚胎素或鸡胚胎素溶液置入密闭容器中进行避光保存，以备用。
所述的精选鸡受精卵是选用蛋用型鸡鸡蛋，产后3～7天以内，蛋重在110～120克，外形规则、无损伤。
所述的常规孵化方法是：
①.孵化温度：第1～10天37.8℃，第10～13天37.6℃；
②.孵化湿度：相对湿度为60％左右；
③.通风换气：保持孵蛋箱空气中的氧含量在21％以上；
④.翻蛋：每1～2小时翻蛋1次；
⑤.孵化至11～13天，取出孵化蛋后去除蛋壳取出鸡胚胎。
所述粉碎鸡胚胎的方法是：将新鲜鸡胚胎置于低温冰柜中，在鸡胚胎中间放置温度传感器探头，当所有样品温度冻至-26～-28℃后，再冰冻0.5～5小时，然后使用粉碎机械将其粉碎至40～100目。
所述的打浆方法是将粉碎后的鸡胚胎在适当的容器中加入3～5倍体积预冷至0～4℃的无菌注射用水，在60～80转/分的搅拌速度下搅拌5～10分钟。
所述的反复冻融方法是将打浆后的鸡胚胎浆置于-30℃的低温冰柜中，将样品冷冻至-26～-28℃后，冰冻0.5～5小时，然后置于室温条件下自然融化至冰水共存时，再置于-30℃低温冰柜，将样品冷冻至-26～-28℃，冰冻0.5～5小时，如此反复冻融3～5次。
所述的超滤方法是将离心后的鸡胚胎浆上清液过截分子量800000道尔顿以上的中空纤维超滤器，留取分子量大于800000道尔顿部分的成分，获得分子量小于等于800000道尔顿的超滤液。
所述的超滤液冷冻干燥的方法是将所得到的超滤液置于无菌不锈钢托盘中，装料厚度≤1.5厘米，放入预先消毒、预冷后的冻干机冻干舱内，调节冻干参数，将上述超滤液均匀冷冻至-40℃以下，然后依次开动冻干机真空系统中的真空泵和罗茨泵，调节真空度在6.5～13Pa以下，保持2～3小时，然后开动冻干机中的加热系统，加热过程中注意并保持真空度在6.5～13Pa以下，加热时物料最高温度不得超过35℃，当加热至物料温度稳定在35℃，真空度稳定在8Pa以下时，保持1～3小时，即可关机、出料，所得到的黄白色疏松团块状物即为鸡胚胎素。
所述的鸡胚胎素填加医学上的常规辅料制成片剂，或胶囊，或软胶囊，或口服液，或美容化妆品，或保健品。
本发明的积极有益效果是：
1.本发明的鸡胚胎素的制备方法，保持了鸡胚胎中的各种生物活性物质。现有其他技术制备的胚胎类制剂，多采用常温分离提取方法，所提取的有效成分只是氨基酸、微量元素等所谓的“营养物质”，由于在室温的温度下，甚至酶解、高温消毒等方法，多肽、蛋白质大多因空间结构破怀、链断裂、酶水解等因素而失去活性，从而成为“死物质”，由于采用了低温生产过程和现代生物分离技术，不但保留了鸡胚胎中的各种营养物质，还保留了鸡胚胎中各种生物活性物质，所生产的鸡胚胎素是“活物质”，不但营养机体，还能促进机体组织的代谢，对机体的免疫起到调节作用。
2.本发明鸡胚胎素的制备方法所获得的鸡胚胎素是一组具有高生物活性的生长刺激因子、神经生长因子、活性多糖、活性多肽、多种氨基酸和丰富的其他营养物质的小分子混合物，它们具有促生长和活化生理功能的精华成分，能激活人体组织细胞，活化组织器官功能，调节人体各种免疫力，提高人体抵抗疾病的能力，并可延缓衰老，其中所含的“尿囊素”和生长刺激因子可以增加皮肤含水量、促进上皮细胞的新陈代谢，经过一定时间的应用，可延缓真皮层衰老、萎缩，使皮肤真皮层饱满，并可增加表皮含水量，使表皮光滑滋润。由于采用了低温生产过程和现代生物分离技术保持了较高生物活性，所获得的高生物活性鸡胚胎素可以被广泛用于制备高活性生物药品、功能性食品和化妆品等行业。
3.本发明鸡胚胎素的制备方法所获得的鸡胚胎素具有较好的抗氧化能力，能显著地提高D-半乳糖亚急性衰老模型小鼠血液中SOD的活性，降低血清中MDA浓度，抑制肝脏脂褐素的形成。
4.本发明鸡胚胎素的制备方法所获得的鸡胚胎素能显著改善或调整衰老细胞的新陈代谢，提高细胞的生命力，延缓机体和皮肤衰老的进程。
A.本发明鸡胚胎素的制备方法所获得的鸡胚胎素的理化性质与质量标准：
1.来源：鸡胚胎素是从鸡受精卵常规孵化10～13天的鸡胚胎中，采用低温提取、分离方法所得到的分子量小于10×106的蛋白、多肽、氨基酸、调节机体生长的激素、常量与微量元素等等。
2.性状：
2.1.冻干鸡胚胎素粉：类白色、微黄粉末，有引湿性，有鸡胚胎特殊气味；液体鸡胚胎素：黄色或微黄色澄明液体，有鸡胚胎特殊气味。
2.2.本品溶于水，不溶于各种有机溶剂。
3.鉴别：取冻干鸡胚胎素粉约10mg，用50ml蒸馏水溶解，或取鸡胚胎素溶液适量，稀释至0.2mg/ml，此两种溶液作为待测样品溶液。
3.1.取待测样品溶液1ml与pH5.0，0.2mol/L柠檬酸缓冲液充分混合，然后加茚三酮试剂1ml，充分混合，100℃加热10min，应显蓝紫色。
3.2.取待测样品溶液适量，用紫外分光光度计进行波长—吸收度扫描，在280nm附近应有最大吸收峰。
4.重金属含量：
4.1.重金属含量(ppm)：≤20
4.2.砷盐含量(ppm)：≤2
5.干燥失重：
取冻干鸡胚胎素粉0.5g，精密称定，在P2O5存在下减压(2.67～5.34Pa)干燥24h后再精密称定，减失重量不得超过4％。
6.含量测定：
取冻干鸡胚胎素粉或鸡胚胎素液体适量，用微量凯氏定氮法测定含氮量，换算为蛋白含量，应大于标示量的90％。
7.微生物检查：
7.1.细菌数：每1g冻干鸡胚胎素粉内细菌数：＜1000个；每1ml鸡胚胎素原液内细菌数：＜100个/ml
7.2.酵母菌：每1g冻干鸡胚胎素粉内霉菌、酵母菌：＜100个/g；每1ml鸡胚胎素原液内霉菌、酵母菌：＜100个/ml
7.3.大肠埃希：不得检出/g(固体)，或：不得检出/ml(液体)
7.4.大肠菌群：＜100个/g(固体)
大肠菌群：＜10个/ml(液体)
8.活性测定：
8.1.取昆明种小鼠30只，雌雄各半，体重16～18g，随机分为三组，第一组(鸡胚胎素组)小鼠每日以10.0g/kg剂量灌服鸡胚胎素，第二组(模型组)和第三组(正常组)小鼠均灌服等体积生理盐水，连续灌胃14天。于给鸡胚胎素第10天开始，第一、二组小鼠腹腔注射60mg/kg的环磷酰胺(Cy)，连续4天，第三组小鼠同途径注射等量生理盐水作为空白对照。于最后一天灌胃和注射Cy2小时后，处死动物，称体重，迅速剖取胸腺、脾脏组织，用滤纸吸去其表面附着的血液，立即在精密扭力天平上称其湿重，以每10g体重对胸腺和脾脏的mg数作为胸腺指数和脾脏指数，比较鸡胚胎素组与模型组的胸腺指数和脾脏指数，鸡胚胎素组应比模型组的胸腺指数高出20％以上，鸡胚胎素组应比模型组的脾脏指数高出30％以上。
8.2.取小鼠30只，雌雄各半，随机分为鸡胚胎素组、模型组和正常组。前两组动物每日每鼠颈背皮下注射5％D-半乳糖0.5ml，后者同途径注射等体积生理盐水，作为空白对照，连续注射10天。于第11天开始(继续注射D-半乳糖)，鸡胚胎素组小鼠按体重10g/kg灌服鸡胚胎素，模型组和正常组均灌服等体积生理盐水，再连续给药和造模30天。末次灌胃和注射D-半乳糖2小时后，称体重，眼眶取血，按照SOD、MDA试剂盒操作要求测定血液SOD、MDA。鸡胚胎素组小鼠血液SOD平均活性应比模型组高20％以上；鸡胚胎素组小鼠血液MDA平均水平应比模型组低30％以上。
B.鸡胚胎素美容抗衰老调节免疫的实验研究：
鸡胚胎素具有补肾填精、益气健脾、补血养血、美容养颜、提高处于抑制状态的免疫能力等功效。采用人工衰老动物模型，观察鸡胚胎素对某些衰老指标、免疫调节的影响。
1.实验材料
1.1.药物与试剂：鸡胚胎素，符合研究者提出的质量标准；
四乙氧基丙烷(TAP)，瑞士FluKa产品；
SOD，MDA测定试剂盒，南京建成生物工程研究所提供；
D-半乳糖(D-gal)及其余试剂均为市售国产生化试剂或分析纯化学试剂。
1.2.动物：健康昆明种小鼠，体重20±2g，雌雄各半，由河南医科大学动物实验中心提供。
2.方法与结果
2.1.D-半乳糖亚急性衰老模型制作法：取小鼠30只，雌雄各半，随机分为鸡胚胎素组、模型组和正常组。前两组动物每日每鼠颈背皮下注射5％D-半乳糖0.5ml，后者同途径注射等体积生理盐水，作为空白对照，连续注射10天。于第11天开始(继续注射D-半乳糖)，鸡胚胎素组小鼠按体重5g/kg灌服鸡胚胎素，模型组和正常组均灌服等体积生理盐水，再连续给药和造模30天。末次灌胃和注射D-半乳糖2小时后，称体重，眼眶取血，用于生化测定；取肝脏称重，制作匀浆，备用；剥离皮肤和尾腱，备用。
2.2.血液中超氧化物歧化酶(SOD)活性测定：SOD测定按照试剂盒说明书操作要求及计算方法进行，详细结果参见表1：
表1：鸡胚胎素对衰老模型小鼠血液中SOD活性的影响(x±s)
| 组别 | 动物数(n) | 5％D-gal(ml/只) | 鸡胚胎素(g/kg) | 全血SOD(μ/ml) |
| 鸡胚胎素组 | 10 | 0.5 | 5.0 | 397.44±52.46** |
| 模型组 | 10 | 0.5 | - | 301.3610±48.52 |
| 正常组 | 10 | - | - | 516.88±73.42 |
与模型组比较：**P＜0.01
由表1可知，鸡胚胎素可明显升高小鼠血液中SOD的活力，与模型组比较差异极显著(P＜0.01)，其上升率达22.75％。
2.3.血清丙二醛(MDA)测定：眼眶取血，分离血清，按照试剂盒说明书操作要求及计算方法进行，详细结果参见表2：
表2：鸡胚胎素对衰老模型小鼠血清中MDA含量的影响(x±s)
| 组别 | 动物数(n) | 5％D-gal(ml/只) | 鸡胚胎素(g/kg) | MDA浓度(MDAnM/ml) |
| 鸡胚胎素组 | 10 | 0.5 | 5.0 | 4.78±0.93** |
| 模型组 | 10 | 0.5 | - | 11.62±0.94 |
| 正常组 | 10 | - | - | 3.64±0.51 |
与模型组比较：**P＜0.01
结果显示，模型组小鼠血清中MDA含量显著高于正常组水平(P＜0.01)，经口服鸡胚胎素40天后，血清中MDA含量明显下降(P＜0.01)，说明鸡胚胎素对MDA的形成有明显的抑制作用。
2.4.肝脏脂褐素(LF)含量的测定：以氯仿—甲醇(2∶1)制备肝匀浆，参照Sohal等人方法用荧光分光光度计在激发波长360nm，发射波长430nm处测其荧光值，以硫酸奎宁作为标准对照，计算其LF的含量，详细结果参见表3：
表3：鸡胚胎素对衰老模型小鼠肝脏LF含量的影响(x±s)
| 组别 | 动物数(n) | 剂量(g/kg) | 5％D-gal(ml/只) | 肝脏LF含量(μ/g湿组织) |
| 鸡胚胎素组 | 10 | 0.5 | 5.0 | 135.07±9.77** |
| 模型组 | 10 | 0.5 | - | 177.71±9.55 |
| 正常组 | 10 | - | - | 132.43±8.34 |
与模型组比较：**P＜0.01
结果说明，模型组小鼠与正常组比较，其肝脏脂褐素含量显著上升(P＜0.01)，而经口服鸡胚胎素40天后，其脂褐素含量下降明显(P＜0.01)，可见，鸡胚胎素具有抑制脂褐素形成的作用。
2.5.皮肤和尾腱中羟脯氨酸含量的测定：取小鼠的皮肤或尾腱，剪碎，混合。精密称取10mg，以6MHCl溶解制成样品液，在721分光光度计561nm波长处测录OD值，羟脯氨酸含量以每百毫克组织所含羟脯氨酸毫克数表示，详细结果参见表4：
表4：鸡胚胎素对衰老模型小鼠皮肤和尾腱中羟脯氨酸含量的影响(x±s)
| 组别 | 动物数(n) | 5％D-gal(ml/只) | 鸡胚胎素(g/kg) | 羟脯氨酸(mg/100mg组织) | |
| 皮肤 | 尾腱 | ||||
| 鸡胚胎素组 | 10 | 0.5 | 5.0 | 1.77±0.61* | 2.96±0.44** |
| 模型组 | 10 | 0.5 | - | 1.42±0.37 | 1.66±0.35 |
| 正常组 | 10 | - | - | 2.71±0.51 | 2.79±0.63 |
与模型组比较：**P＜0.01
结果表明，鸡胚胎素组与模型组比较，皮肤和尾腱中羟脯氨酸含量明显升高(P＜0.05，P＜0.01)，提示鸡胚胎素能显著增加羟脯氨酸含量和皮肤的弹性。
2.6.对免疫功能低下小鼠免疫器官重量的影响：取昆明种小鼠30只，雌雄各半，体重16～18g，随机分为三组，第一组(鸡胚胎素组)小鼠每日以5.0g/kg剂量灌服鸡胚胎素，第二组(模型组)和第三组(正常组)小鼠均灌服等体积生理盐水，连续灌胃14天，在给鸡胚胎素第10天开始，第一、二组小鼠腹腔注射60mg/kg的环磷酰胺(Cy)，连续4天，第三组小鼠同途径注射等量生理盐水作为空白对照。于最后一天灌胃和注射Cy2小时后，处死动物，称体重，迅速剖取胸腺、脾脏组织，用滤纸吸去其表面附着的血液，立即在精密扭力天平上称其湿重，详细结果参见表5：
表5：鸡胚胎素对免疫功能低下小鼠免疫器官重量的影响(x±s)、(n＝10)
| 组别 | 5％D-gal(ml/只) | 鸡胚胎素(g/kg) | 胸腺指数(mg/10g) | 脾指数(mg/10g) |
| 鸡胚胎素组 | 0.5 | 5.0 | 18.25±2.14** | 47.22±5.97** |
| Cy组 | 0.5 | - | 12.87±1.42 | 31.74±5.02 |
| 正常组 | - | - | 20.89±2.49 | 50.33±6.76 |
与Cy组比较：**P＜0.01
从表5可知，鸡胚胎素组与Cy组比较，其胸腺指数和脾指数明显升高(P＜0.01，P＜0.01)，说明鸡胚胎素对于环磷酰胺造成的免疫器官重量及其免疫功能下降具有明显的改善作用。
2.7.对血虚模型小鼠红细胞及血红蛋白的影响：取昆明种小鼠20只，体重18～22g，雌雄各半，随机分为二组，先测出各鼠给药前红细胞(RBC)和血红蛋白(Hb)值，然后尾部放血法造成失血性血虚模型(RBC、Hb均明显低于正常值)后，分别每天灌胃鸡胚胎素或生理盐水，连续给药14天，末次给鸡胚胎素2小时后，尾部采血测RBC和Hb值，详细结果参见表6：
表6：鸡胚胎素对血虚模型小鼠红细胞和血红蛋白的影响(x±s)
| 组别 | 动物数(n) | 剂量(g/kg或ml/kg) | RBC增值(万/mm3) | Hb增值(g％) |
| 鸡胚胎素组 | 10 | 5.0 | 366.41±37.78** | 4.45±0.61** |
| 生理盐水组 | 10 | 10.0 | 224.73±39.32 | 3.21±0.49 |
与生理盐水比较：**P＜0.01
由表6可看出，服用鸡胚胎素14天后的血虚小鼠RBC和Hb值显著高于生理盐水组(P均＜0.01)，说明本品具有较好的补血作用。
3.结论与讨论：
3.1.本实验证明鸡胚胎素具有较好的抗氧化能力，能显著地提高D-半乳糖亚急性衰老模型小鼠血液中SOD的活性，降低血清中MDA浓度，抑制肝脏脂褐素的形成。结果提示鸡胚胎素能显著改善或调整衰老细胞的新陈代谢，提高细胞的生命力，延缓机体和皮肤衰老的进程。脂褐素(LF)和MDA是体内自由基反应的老化产物，它们随着年龄的增长而增加，超氧化物歧化酶(SOD)则是机体清除自由基的主要酶类，它随着年龄增长而活性降低，因此两者均是人类衰老的重要生化指标之一。此外，自由基还是引起皮肤胶原聚合、降低弹性等衰老的重要原因。
3.2.本实验结果表明，连续给小鼠皮下注射大剂量D-半乳糖40天，可使小鼠皮肤和尾腱中的羟脯氨酸显著低于正常小鼠，经服用鸡胚胎素后其羟脯氨酸含量明显回升，这提示鸡胚胎素具有防止皮肤衰老的作用，这可能与提高胶原蛋白含量、增加皮肤弹性的作用有关。现代研究证实，随着增龄，机体内胶原蛋白溶解度显著下降，由于衰老，机体胶原蛋白多肽链问的共价交联程度增加，使得皮肤变得僵硬少弹性，通透性低，胶原代谢率降低，使胶原组织中的游离肽或结合肽的羟脯氨酸含量降低。
3.3.本实验观察到，环磷酰胺(Cy)可造成小鼠免疫功能低下，并可使免疫器官重量指数下降。鸡胚胎素可以拮抗Cy的免疫抑制作用，保护小鼠胸腺和脾脏免受Cy的损害，说明本品具有增强免疫功能的效应。伴随着年龄的增长，人类的免疫功能也在逐渐减退。对去胸腺鼠衰老动物模型观察证明，免疫功能下降是机体衰老的一个重要因素，提高机体免疫力，就使机体免除许多病原体的侵袭，就使机体加强了对突变细胞的监控和清除，从而减少了疾病的发生。其结果为强体和抗衰老。
3.4.本实验采用鼠尾放血法造成小鼠失血性血虚模型，观察了鸡胚胎素对血虚小鼠红细胞(RBC)和血红蛋白(Hb)的影响，结果表明，本品能显著地改善血虚小鼠的贫血症状。提示鸡胚胎素具有补益气血、养颜美肤的作用。中医认为，气血是生命活动的物质基础。气血充盛，不但可表现为精神饱满、容光焕发、肤色亮丽，而且还能健康长寿，一旦气血亏损，则必然面色枯槁、皮肤粗糙、皱纹增加、体弱多病。故气血与寿命、皮肤的关系极为密切。
C.本发明所制备的鸡胚胎素的常规制剂为：
1.片剂：以鸡胚胎素为主料，辅以有关片剂常规辅料，每片含鸡胚胎素0.5g，成人每次1～2片，每天1～2次；
2.胶囊：以鸡胚胎素为主料，辅以有关胶囊剂常规辅料，每粒胶囊含鸡胚胎素0.5g，成人每次1～2粒，每天1～2次；
3.软胶囊：以鸡胚胎素为主料，辅以不饱和植物油，每粒软胶囊含鸡胚胎素0.5g，成人每次1～2粒，每天1～2次；
4.口服液：以鸡胚胎素为主料，辅以防腐剂、矫味剂，配制成500mg：10ml/瓶浓度口服液，成人每次1～2瓶，每日1～2次。
5.美容化妆品：以鸡胚胎素为主料，在适当化妆品乳膏基材中乳化，辅以适当防腐剂和香料，即可制作不同香型的乳膏型鸡胚胎素美容化妆品；亦可将鸡胚胎素溶于适当液体，辅以相关辅料、香料、防腐剂制作出液体剂型美容护肤液。
D.鸡胚胎素口服剂量：
实验证明本发明所制备的鸡胚胎素无毒性，安全范围达到食品级，根据动物实验有效量推算，成人每天0.5g即可产生效果，加大剂量至每天2g，效果将更好；根据成分推理，对鸡蛋过敏者，勿用鸡胚胎素口服制剂。
四.具体实施方式：
实施例一：精选无违规添加剂的新鲜鸡受精卵，置于市售全自动孵蛋机内托盘中，然后调节各项参数：①孵化温度：第1～10天37.8℃，第10～13天37.6℃；②孵化湿度：相对湿度60％；③通风换气系数4～6；④翻蛋：每1.5小时翻蛋1次；⑤孵化至14天落盘。取出孵化蛋后迅速去除蛋壳取出鸡胚胎，将此新鲜鸡胚胎用切碎机切碎至1～3厘米大小碎块，放入清洁不锈钢托盘中，置于低温冰柜，在鸡胚中间放置温度传感器探头，当所有样品温度冻至-26～-28℃后，再冰冻1小时，然后使用高效万能粉碎机粉碎至80目；将粉碎后的鸡胚胎在适当的容器中加入3倍体积预冷至2℃左右的纯水，60转/分搅拌5分钟混悬制浆；将此鸡胚胎浆置于低温冰柜，当样品温度冻至-26～-28℃后，再冰冻1小时，然后置室温条件下自然融化至冰水共存时，再置低温冰柜，当样品温度冻至-26～-28℃后，再冰冻1小时，如此反复冻融5次；将反复冻融后的鸡胚胎浆融化后，置于低温离心机中，调节温度控制使转子室温度保持在+4℃，10000转/分离心10分钟；将离心后的鸡胚胎浆上清液小心吸出，置于无菌不锈钢容器中，迅速通过截留分子量800,000道尔顿以上的中空纤维超滤器，获得超滤液；将此超滤液置于无菌不锈钢托盘中，装料厚度1.5厘米，放入预先消毒、预冷后的冻干机冻干舱内；调节冻干参数、设定冻干曲线；将上述超滤液均匀冷冻至-40℃；然后开动冻干机，真空系统的真空泵、罗茨泵依次打开，调节真空度在13Pa以下，当真空度保持在13Pa以下恒定1小时后，开动冻干机加热系统，加热过程中注意并保持真空度仍在13Pa以下，加热时物料最高温度不得超过35℃，当加热至物料温度稳定在35℃，真空度稳定在8Pa以下时，保持2小时，即可关机、出料，所得到的黄白色疏松团块状物即为鸡胚胎素，将此鸡胚胎素立即置入密闭容器中避光冷藏保存，备用。
实施例二：精选无违规添加剂的新鲜鸡受精卵，置于市售全自动孵蛋机内托盘中，然后调节各项参数：①孵化温度：第1～10天37.8℃，第10～13天37.6℃；②孵化湿度：相对湿度60％；③通风换气系数4～6；④翻蛋：每1小时翻蛋1次；⑤孵化至12天落盘取出；取出孵化蛋后迅速去除蛋壳取出鸡胚胎；将此新鲜鸡胚胎用切碎机切碎至1～3厘米大小碎块，放入清洁不锈钢托盘中，置于低温冰柜，在鸡胚中间放置温度传感器探头，当所有样品温度冻至-26～-28℃后，再冰冻2.5小时，然后使用高效万能粉碎机粉碎至80目；将粉碎后的鸡胚胎在适当的容器中加入4倍体积预冷至1℃左右的纯水，80转/分搅拌8分钟混悬制浆；将此鸡胚胎浆置于低温冰柜，当样品温度冻至-26～-28℃后，再冰冻2.5小时，然后置室温条件下自然融化至冰水共存时，再置低温冰柜，当样品温度冻至-26～-28℃后，再冰冻2.5小时，如此反复冻融3次；将反复冻融后的鸡胚胎浆融化后，置于低温离心机中，调节温度控制使转子室温度保持在+1℃～+4℃，3000转/分离心30分钟：将离心后的鸡胚胎浆上清液小心吸出，置于无菌不锈钢容器中，迅速通过截留分子量800000道尔顿以上的中空纤维超滤器，获得超滤液；将此超滤液置于无菌不锈钢托盘中，装料厚度小于1.2厘米，放入预先消毒、预冷后的冻干机冻干舱内；调节冻干参数：将上述超滤液均匀冷冻至-40℃；然后开动冻干机真空系统的真空泵真空度在30Pa以下开动罗茨泵，保持系统真空度5.6Pa～13Pa约1.5小时；然后开动冻干机加热系统，加热时物料最高温度不得超过35℃，并保持真空度在13Pa以下，当加热至物料温度稳定在35℃，真空度稳定在8Pa以下时，保持2.5小时，关机、出料，所得到的黄白色疏松团块状物即为鸡胚胎素，将此鸡胚胎素立即置入密闭容器中避光冷藏保存，备用。
实施例三：精选无违规添加剂饲料喂养的种鸡的新鲜受精卵，置于市售全自动孵蛋机内托盘中，然后调节各项参数：①孵化温度：第1～10天37.8℃，第10～13天37.6℃；②孵化湿度：相对湿度60％；③通风换气系数4；④翻蛋：每1小时翻蛋1次；⑤孵化至13天落盘取出；取出孵化蛋后迅速去除蛋壳取出鸡胚胎；将此新鲜鸡胚胎放入冰柜冷冻至-1℃左右，切碎至1～3厘米大小碎块，放入清洁不锈钢托盘中，置于低温冰柜冷冻至-20℃左右，再冰冻3小时，然后使用高效万能粉碎机粉碎至100目；将粉碎后的鸡胚胎在适当的容器中加入5倍体积预冷至1℃左右的无菌蒸馏水，70转/分搅拌10分钟混悬制浆；将此鸡胚胎浆置于低温冰柜中冷冻至-28℃左右，再冰冻3小时，后置室温自然融化至冰水共存时，再置低温冰柜冷冻至-28℃左右，再冰冻3小时，反复冻融4次；将反复冻融后的鸡胚胎浆融化后，置于大容量低温离心机中，调节转子室温度在+4℃，8000转/分离心20分钟；将离心后的鸡胚胎浆上清液小心吸出，置于无菌不锈钢容器中，迅速通过截留分子量800000道尔顿以上的中空纤维超滤器，获得超滤液；将此超滤液再通过结冰法浓缩，浓缩为原体积的1/3量时，置入密闭无菌容器冰冻(-26℃～-40℃)保存，备用。
Claims (9)
1.一种鸡胚胎素的制备方法，包括鸡受精卵的精选和孵化，其特征是，包括下列具体步骤：
a.精选鸡受精卵，表面常规去污，依常规孵化方法孵化10～13天；
b.将孵化好的受精卵表面进行常规消毒，去除蛋壳取出鸡胚胎，在≤4℃的温度条件下将鸡胚胎粉碎；
c.将粉碎后的鸡胚胎加入3～5倍鸡胚胎体积的无菌纯水进行打浆；
d.将打成浆的鸡胚胎在-26～-28℃的温度条件下进行反复冻融；
e.将反复冻融的鸡胚胎浆在≤4℃温度条件下倒入离心机中，在3000～10000转/分的转速条件下离心10～30分钟，获取上清夜；
f.将上清液过截留分子量在800000道尔顿以上的超滤柱，得超滤液；
g.将超滤液冷冻干燥后得到类白色疏松团块状物质，即为所述的鸡胚胎素，或将上述超滤液经超滤浓缩后直接无菌分装保存，即为鸡胚胎素溶液；
h.在相对湿度小于30％的环境中，将所得到的鸡胚胎素或鸡胚胎素溶液置入密闭容器中进行避光保存，以备用。
2.根据权利要求1所述的鸡胚胎素的制备方法，其特征是：所述的精选鸡受精卵是选用蛋用型鸡鸡蛋，产后3～7天以内，蛋重在110～120克，外形规则、无损伤。
3.根据权利要求1所述的鸡胚胎素的制备方法，其特征是：所述的常规孵化方法是：
①.孵化温度：第1～10天37.8℃，第10～13天37.6℃；
②.孵化湿度：相对湿度为60％左右；
③.通风换气：保持孵蛋箱空气中的氧含量在21％以上；
④.翻蛋：每1～2小时翻蛋1次；
⑤.孵化至11～13天，取出孵化蛋后去除蛋壳取出鸡胚胎。
4.根据权利要求1所述的鸡胚胎素的制备方法，其特征是：所述粉碎鸡胚胎的方法是：将新鲜鸡胚胎置于低温冰柜中，在鸡胚胎中间放置温度传感器探头，当所有样品温度冻至-26～-28℃后，再冰冻0.5～5小时，然后使用粉碎机械将其粉碎至40～100目。
5.根据权利要求1所述的鸡胚胎素的制备方法，其特征是：所述的打浆方法是将粉碎后的鸡胚胎在适当的容器中加入3～5倍体积预冷至0～4℃的无菌注射用水，在60～80转/分的搅拌速度下搅拌5～10分钟。
6.根据权利要求1所述的鸡胚胎素的制备方法，其特征是：所述的反复冻融方法是将打浆后的鸡胚胎浆置于-30℃的低温冰柜中，将样品冷冻至-26～-28℃后，冰冻0.5～5小时，然后置于室温条件下自然融化至冰水共存时，再置于-30℃低温冰柜，将样品冷冻至-26～-28℃，冰冻0.5～5小时，如此反复冻融3～5次。
7.根据权利要求1所述的鸡胚胎素的制备方法，其特征是：所述的超滤方法是将离心后的鸡胚胎浆上清液过截留分子量800000道尔顿以上的中空纤维超滤器，留取分子量大于800000道尔顿部分的成分，获得分子量小于等于800000道尔顿的超滤液。
8.根据权利要求1所述的鸡胚胎素的制备方法，其特征是：所述的超滤液冷冻干燥的方法是将所得到的超滤液置于无菌不锈钢托盘中，装料厚度≤1.5厘米，放入预先消毒、预冷后的冻干机冻干舱内，调节冻干参数，将上述超滤液均匀冷冻至-40℃以下，然后依次开动冻干机真空系统中的真空泵和罗茨泵，调节真空度在6.5～13Pa以下，保持2～3小时，然后开动冻干机中的加热系统，加热过程中注意并保持真空度在6.5～13Pa以下，加热时物料最高温度不得超过35℃，当加热至物料温度稳定在35℃，真空度稳定在8Pa以下时，保持1～3小时，即可关机、出料，所得到的黄白色疏松团块状物即为鸡胚胎素。
9.根据权利要求1～8任一权利所述的鸡胚胎素的制备方法，其特征是：所述的鸡胚胎素填加医学上的常规辅料制成片剂，或胶囊，或软胶囊，或口服液，或美容化妆品，或保健品。
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