JP2014040447A

JP2014040447A - 受精卵の構成成分の調製方法

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Publication number: JP2014040447A
Application number: JP2013207040A
Authority: JP
Inventors: Bain Jerald; バイン，ジェラルド
Original assignee: United Paragon Assoc Inc
Current assignee: United Paragon Assoc Inc
Priority date: 2006-10-12
Filing date: 2013-10-02
Publication date: 2014-03-06
Also published as: CA2666113A1; JP2010505884A; EP2073822A4; US20100163792A1; AU2007312906B2; AU2007312906A1; WO2008046195A1; CN101583368B; CN101583368A; EP2073822A1

Abstract

【課題】凍結乾燥法および／または抽出法を用いて受精卵の構成成分を調製する方法を提供する。
【解決手段】下記の工程を含む、少なくとも１個の受精卵の内容物の一部または内容物全体から粉末状サンプルを調製する方法：（ｉ）少なくとも１個の受精卵の内容物を卵殻から実質的に分離する工程、（ｉｉ）任意で実施する、上記の内容物を濾過し、固形残渣、または固形と半固形が混合した残渣を得る工程、（ｉｉｉ）上記の内容物または残渣を凍結する工程、（ｉｖ）上記の内容物または残渣を凍結乾燥する工程、（ｖ）任意で実施する、１つ以上の凍結乾燥した内容物または残渣を合わせる工程、および（ｖｉ）上記の内容物または残渣を粉砕して粉末化する工程。
【選択図】図１

Description

本発明は、凍結乾燥法および抽出法などの技術を用いて受精卵の構成成分を調製する方法に関する。

特定の物質もしくは成分、またはそれらのサブセットを単離して、保存用、輸送用またはすぐに使用する目的でそれらを調製するために、抽出技術および凍結乾燥技術などの物質調製技術が、様々な産業分野において慣例的に用いられている。収率、純度および貯蔵適性のような指標を最適化するために、このような技術を改善し、向上させることが望ましい。

本発明の第１の態様において、少なくとも１個の受精卵の内容物から粉末状サンプルを調製する方法を提供する。該方法は下記の工程を含む。
（ｉ）少なくとも１個の受精卵の内容物を卵殻から実質的に分離する工程、
（ｉｉ）任意で実施する、上記の内容物を濾過し、固形残渣、または固形と半固形が混合した残渣を得る工程、
（ｉｉｉ）上記の内容物または残渣を凍結する工程、
（ｉｖ）上記の内容物または残渣を凍結乾燥する工程、
（ｖ）任意で実施する、１つ以上の凍結乾燥した内容物または残渣を合わせる工程、および
（ｖｉ）上記の内容物または残渣を粉砕して粉末化する工程。
この粉末に防腐剤を加えてもよい。

本発明の第２の態様において、本発明の実施形態において調製されたスラリーから粉末状の水性抽出物を調製する方法を提供する。該方法は下記の工程を含む。
（ｉ）スラリーと水溶液を一定時間混合する工程、
（ｉｉ）上記の混合液を清澄化し、実質的に固形物を含まない水溶液を得る工程、
（ｉｉｉ）上記の水溶液を固形物から分離する工程、
（ｉｖ）上記の水溶液を凍結する工程、および
（ｖ）上記の水溶液を凍結乾燥して粉末化する工程。
この粉末に防腐剤を加えてもよい。

本発明の第３の態様において、本発明の実施形態において調製されたスラリーから溶媒抽出濃縮物を調製する方法を提供する。該方法は下記の工程を含む。
（ｉ）スラリーと疎水性溶媒を一定時間混合する工程、
（ｉｉ）上記の混合液を清澄化し、実質的に固形物を含まない溶液を得る工程、
（ｉｉｉ）上記の溶液を固形物から分離する工程、
（ｉｖ）疎水性溶媒部分を水性溶媒部分から完全に分離する工程、および
（ｖ）上記の疎水性溶媒部分を濃縮する工程。

本発明の第４の態様において、少なくとも１つの胚から粉末状サンプルを調製する方法を提供する。該方法は下記の工程を含む。
（ｉ）少なくとも１個の受精卵から少なくとも１つの胚を実質的に分離する工程、
（ｉｉ）任意で実施する、上記少なくとも１つの胚を洗浄する工程、
（ｉｉｉ）上記少なくとも１つの胚を凍結する工程、
（ｉｖ）上記少なくとも１つの凍結胚を凍結乾燥する工程、および
（ｖ）上記少なくとも１つの凍結乾燥した胚を粉砕して粉末化する工程。
この粉末に防腐剤を加えてもよい。本方法において、胚とともに卵白部分の一部または卵白部分全体を用いてもよい。その場合には、洗浄工程を変更または省略してもよい。

本発明の第５の態様において、少なくとも１つの胚のスラリー、または少なくとも１つの胚および卵白部分の一部もしくは卵白部分全体のスラリーから、粉末状の水性抽出物を調製する方法を提供する。該方法は下記の工程を含む。
（ｉ）スラリーと水溶液を一定時間混合する工程、
（ｉｉ）上記の混合液を清澄化し、実質的に固形物を含まない水溶液を得る工程、
（ｉｉｉ）上記の水溶液を固形物から分離する工程、
（ｉｖ）上記の水溶液を凍結する工程、および
（ｖ）上記の水溶液を凍結乾燥して粉末化する工程。
この粉末に防腐剤を加えてもよい。

本発明の第６の態様において、少なくとも１つの胚のスラリーから溶媒抽出濃縮物を調製する方法を提供する。該方法は下記の工程を含む。
（ｉ）スラリーと疎水性溶媒を一定時間混合する工程、
（ｉｉ）上記の混合液を清澄化し、実質的に固形物を含まない溶液を得る工程、
（ｉｉｉ）上記の溶液を固形物から分離する工程、
（ｉｖ）疎水性溶媒部分を水性溶媒部分から完全に分離する工程、および
（ｖ）上記の疎水性溶媒部分を濃縮する工程。

本発明の第７の態様において、少なくとも１個の受精卵の内容物の一部または内容物全体のスラリーを調製する方法を提供する。該方法は下記の工程を含む。
（ｉ）少なくとも１個の受精卵の内容物を卵殻から実質的に分離する工程、
（ｉｉ）任意で実施する、上記の内容物を濾過して残渣を得る工程、
（ｉｉｉ）上記の内容物または残渣を容器内で合わせる工程、
（ｉｖ）溶媒を加えまたは加えずに、上記の内容物または残渣を混合してスラリーを調製する工程、および
（ｖ）任意で実施する、さらなる処理に備えて上記のスラリーを凍結して保存する工程。
上記の濾過工程で２個以上の受精卵の内容物を合わせてもよい。その場合は、工程（ｉｉｉ）は任意で実施すればよい。

当該技術分野の当業者は、以下に記載の図が単に本発明を説明するためのものであることを理解するだろう。これらの図は、決して本発明の範囲を限定するものではない。
本発明の実施形態による、１個の卵から摘出した胚の写真である。本発明の実施形態による凍結乾燥した１つの胚の写真である。本発明の実施形態による凍結乾燥した胚の写真である。本発明の実施形態による凍結乾燥して粉砕した胚の写真である。本発明の実施形態による複数の胚のスラリーの写真である。

本発明の１つの態様において、少なくとも１つの胚から粉末状サンプルを調製する方法、または１個の受精卵の内容物の一部もしくは内容物全体から粉末状サンプルを調製する方法を提供する。少なくとも１個の受精卵を、受精した日から約３〜１５日間、より好ましくは約３〜５日間または約６〜１２日間、さらに好ましくは約７〜９日間の範囲で培養する。一般的に、受精卵は、血管形成が起こり、および／または胚が発達して肉眼で確認できるようになるまでの期間培養する。受精卵は、例えば鳥類や爬虫類などの様々な種類に由来してもよいし、または卵生哺乳類に由来してもよい。一般的に、胚または胚に付随する血管を摘出することが可能であれば、いずれの卵も適当である。上記の卵は、鳥類の卵が好ましく、ニワトリ、ガチョウ、アヒルなど、卵の生産を目的として飼育されている任意の鳥から得ることができる。入手のしやすさや大量生産が可能であることなどから、ニワトリの卵が好ましい。胚が発達するまでの長い期間、卵を一定の温度に保つことができれば、どのような環境下で培養を行ってもよい。培養に好適な温度は、約２０〜６０℃、より好ましくは約２５〜５５℃、さらに好ましくは約３５〜４５℃の範囲である。卵を一定期間培養した後、卵殻表面に存在する微生物相を減らすための処理を行うか、または任意の適当な方法により殺菌を行ってもよい。殺菌方法としては、エタノールなどの溶媒、例えば約５０〜９５％のエタノール溶液で卵殻を洗浄した後放置して、溶媒を蒸発または乾燥させる方法、または紫外線（ＵＶ）源の下で適当な時間卵を回転させる方法などが挙げられる。いずれの溶媒も、卵に対してさらに別の操作を加える前に蒸発していることが好ましい。次いで、卵内の内容物を得るために卵を割る。卵は、無菌環境下において、手作業でまたは適当な機器を用いて割ってもよい。この操作、および／または以上や以下に記載の操作の大部分もしくは全操作は、例えば５℃程度の冷却下で行なってもよい。

本発明の１つの態様において、ステンレス容器などの容器、好ましくは滅菌および／または冷却した容器に卵内容物を回収する。容器に回収された卵内容物、または卵内にある内容物を、例えばメッシュ上に載せて濾過工程を行ってもよい。メッシュの目開きは、約０．５〜４ミリメートル、より好ましくは約１ミリメートルであるのがよい。メッシュは滅菌されていることが好ましい。卵内容物および／または割れた卵殻の一部もしくは全部を直接メッシュ上に載せてもよい。卵内容物および／または割れた卵殻の一部もしくは全部を上記のメッシュ上に載せて、メッシュから液が実質的に落ちなくなるまで、一定時間濾過する。濾過工程前、その工程中またはその工程後に、卵内容物から割れた卵殻を取り除いてもよい。濾過工程後、固形残渣、または固形および半固形の混合した残渣は、胚、卵黄の大部分または全量、血管結合組織、卵白の大部分または全量、カラザの大部分または全量、および破れていなければ透明な嚢を含み得る。半固形残渣は、固形物だけでなく、例えば卵白のようなゼラチン状物質などの粘性物質を含み得る。残渣または半固形残渣を、緩衝液、滅菌脱イオン水または任意の適当な塩溶液などの適切な溶媒で少なくとも１回洗浄してもよい。例えば、滅菌リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いることができる。

１個の卵から回収した残渣を、次いで本明細書に記載の方法に従って凍結乾燥してもよい。

本発明の別の態様において、卵白部分および胚を、他の卵内容物から実質的に分離してもよい。卵白部分を、デカンテーションなどの任意の適当な方法、または吸引により他の卵内容物から実質的に分離してもよい。胚を、手作業でまたは当業者が選択する他の適当な方法によって、卵白部分から実質的に分離することができる。図１に、１個の卵から摘出し緩衝液で洗浄した１つの胚の例を示す。当業者は、胚を一度に卵白部分と他の卵内容物から実質的に分離できることを理解するだろう。例えば、ピンセットなどの適当な器具を用いて、胚を卵白部分および他の卵内容物から手作業で分離してもよい。場合によっては、胚を他の卵内容物の一部である卵黄嚢から手作業で剥がしてもよい。

胚を卵白部分および他の卵内容物から実質的に分離した後、胚を緩衝液、滅菌脱イオン水または任意の適当な塩溶液などの適切な溶媒で少なくとも１回洗浄してもよい。例えば、滅菌リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いることができる。

卵内容物を濾過工程に供した場合、下記方法における卵内容物に関する記載は、残渣に関する記載に実際あてはまることが理解されるだろう。また、以上および以下に記載の操作のうち、いずれかの操作に従って、１個の受精卵を割って卵殻を取り除き、卵殻を取り除いた卵全体を凍結して凍結乾燥することが可能であることも理解されるだろう。さらに、以上および以下に記載の操作のうち、いずれかの操作に従って、２個以上の受精卵を割って卵殻を取り除き、卵殻を取り除いた卵全体を合わせて混合してスラリーを調製し、これを凍結して凍結乾燥することも可能である。

少なくとも１つの凍結可能な容器に卵内容物または胚を入れる。容器としては、例えば試験管、ペトリ皿、ビーカー、ステンレストレーまたはプラスチック容器が挙げられる。卵内容物または胚を卵殻から分離した後速やかに、例えば約２時間以内、より好ましくは約１時間以内、さらに好ましくは約０．５時間以内またはできるだけ速やかにこれらを凍結することが好ましい。卵内容物または胚が凍結するのに要する時間に応じて、凍結温度は、約−５０〜１０℃、より好ましくは約−４０〜５℃、さらに好ましくは約−３５〜−２５℃の範囲にあることが望ましい。卵内容物または胚を、少なくとも約６時間、より好ましくは少なくとも約１２時間、さらに好ましくは少なくとも約２４時間凍結することが好ましい。一定時間経過した後に、凍結した卵内容物または凍結胚を凍結乾燥してもよい。卵内容物または胚は、凍結乾燥工程前に完全に凍結していてよい。図２および図３に、凍結乾燥した胚の例を示す。凍結乾燥は、終温度が好ましくは約−８０〜−１０℃、より好ましくは約−６５〜−１５℃、さらに好ましくは約−４０〜−２０℃の範囲で、かつ約５００ミリトル（ｍｉｌｌｉｔｏｒｒ）または当業者が設定する他の適切な値の圧力下で行う。凍結乾燥工程において、上記の終温度が、好ましくは約１〜６時間、より好ましくは約２〜５時間、さらに好ましくは約３〜４時間の範囲で保たれる。凍結乾燥工程は、全体で一般的に約１５〜４５時間、より一般的には約２５〜３５時間、さらに一般的には約２８〜３２時間かけて行われる。

本発明の別の態様において、必要であれば、凍結乾燥した卵内容物または凍結乾燥した胚を分散および／または粉砕し、実質的に均質な粉末にしてもよい。粉砕工程前に、またはその工程後に、個々にまたはいくつかをまとめて凍結乾燥した卵内容物を合わせて、実質的に均質な粉末にしてもよい。例えばコーヒーミルまたはハンマーミルなどの適当な機器を使用して機械的に、またはガラス棒などの適当な器具を使用して手作業で、粉砕を行うことができる。図４に、凍結乾燥後粉砕した胚の例を示す。粉末を保存前および／または使用前に滅菌してもよい。滅菌方法は、凍結乾燥したいずれの構成成分にも悪影響を及ぼさないことが望ましい。場合によっては、滅菌方法として、例えば粉末への放射線照射を含んでもよい。

本明細書で開示された方法によって調製した粉末を保存する前に、微生物の増殖を抑制するためにこの粉末に防腐剤を混合してもよい。適当な防腐剤としては、０．５％ｗ／ｗ安息香酸ナトリウム、および０．２％ｗ／ｗソルビン酸カリウムなどの一般的な食品防腐剤が挙げられる。その他にも適当な防腐剤が当業者によって選択されるだろう。

本明細書に開示された方法によって調製した粉末を実質的な気密性を有する適当な容器に保存してもよい。容器としては、ビニール袋、樽、プラスチック容器、ボトル、およびそれらの組み合わせなどが好ましい。例えば、制御管理下にある無菌環境下で、粉末を不正開封防止セキュリティシール付の滅菌ポリエチレン／ポリプロピレンボトルへ詰めることができる。窒素などの実質的に乾燥した不活性ガス存在下で粉末を保存してもよい。粉末を室温以下の温度、例えば約１０〜２５℃、より好ましくは約１５〜２０℃の範囲の温度で保存することが好ましい。長期間保存する場合は、粉末を約−１０℃以下、より好ましくは−２０℃以下の温度で保存することが好ましい。粉末を実質的に乾燥した環境下で一定期間保存できる。粉末を真空パックしてもよい。

本発明の別の実施形態において、ビーカーなどの適当な容器またはプラスチック容器に凍結した卵内容物もしくは非凍結の卵内容物、または凍結した胚もしくは非凍結の胚を集めてこれを混合し、必要であれば適当な溶媒を加えて混合して、スラリーを調製してもよい。この工程の一部でまたはこの工程を通して、分離した卵内容物または胚を冷却してもよい。冷却できるように、例えば容器を氷上に置いてもよい。溶媒は、混合した卵内容物または胚を湿らせ、実験室にある標準の冷凍庫で凍結するように水性であることが好ましい。溶媒としては、水および水性緩衝液などが好ましい。例えばハンドミキサーなどを用いた適当な方法で、卵内容物または胚を混合するかまたはホモジナイズすることができる。図５に、胚のスラリーの入った容器の例を示す。スラリーを部分的にまたは全量、以下の抽出操作に供するか、またはさらに別の処理に備えて凍結することができる。

スラリーを水溶液と一定時間混合することによって、水性抽出操作を実施できる。水溶液は、水、水性緩衝液またはその他の水性溶媒を含んでもよい。水溶液が水を含む場合、その水は使用前に蒸留されていることが好ましく、さらに脱イオン化されていることがより好ましい。例えば、水を逆浸透（ＲＯ）処理してもよい。スラリーと水溶液を、例えば約５〜６０分間、より好ましくは約１０〜４５分間、さらに好ましくは約１５〜４０分間の範囲で一定時間撹拌することによりこれらを混合できる。溶液中に含まれる実質的に親水性であるいずれの分子も水溶液に溶解するように、水溶液がスラリーの内容物に十分に接することが望ましい。水溶液はスラリーと実質的に同量であってよいが、スラリーの１．５倍量または２倍量、さらに３倍量であってもよい。混合工程の間、混合液を多少温めてもよい。混合した後、遠心分離または濾過などの適当な方法を用いて、混合液中のあらゆる固形物を実質的に除去することにより、水溶液を実質的に清澄化できる。次いで、清澄化した水性部分を凍結および凍結乾燥して粉末を得るが、必要に応じて本明細書に記載の方法に従ってこの粉末を滅菌してもよい。

本発明の別の態様において、前述のいずれかの方法によって調製したスラリーを実質的に疎水性の溶媒と混合してもよい。実質的に疎水性の溶媒は冷却されていることが好ましい。疎水性溶媒としては、例えば、エーテル、クロロホルム、ヘキサン、石油エーテルまたはアセトニトリルなどが好ましい。例えばエーテル、特にジエチルエーテルを使用することができる。スラリーを上記と同様に、一定時間疎水性溶媒と混合する。当該技術分野の当業者にとっては当然のことであるが、実質的に疎水性の溶媒を使用する方法では、いずれの工程もドラフト内または同様の装置内で行い、溶媒を直火または熱源から離しておく必要がある。混合工程が終了した後、遠心分離または濾過などの適当な方法によって、混合液の固形部分を溶媒部分から実質的に取り除くことができる。溶媒部分は、疎水性溶媒部分を実質的に含むが、水性部分を含んでいてもよい。溶媒部分を分液漏斗またはこれと本質的に同等の装置に移して、疎水性溶媒部分と水性部分を分離させることができる。エーテルを用いた場合は、上層が疎水性溶媒部分である。エーテルベースの部分は、上部からサイフォン式で吸い上げるか、または下層である水層を除去した後分液漏斗から回収することができる。あるいは、下層である水性部分を凍結することによって、上層のエーテルベースの層をデカントしてもよい。上記の水性部分を、複数回、例えば３回程度疎水性溶媒で抽出してもよい。この疎水性溶媒は水性部分と実質的に同量であってよいが、水性溶媒の１．５倍量または２倍量、さらに３倍量であってもよい。抽出工程が終了した後、疎水性の抽出液をすべて集めて、適当な方法によって濃縮する。濃縮した抽出物は、密封したバイアル瓶などの外気を実質的に遮断するような適当な容器に入れて、例えば５℃程度の室温より低い温度で保存してもよい。

本発明の別の態様において、上記のいずれかの方法によって調製したスラリーを抽出操作の前に清澄化してもよい。好ましい清澄化工程としては、ふるい、濾紙またはフィルターパッドなどのフィルターを使用した濾過方法が挙げられる。清澄化工程として、他に遠心分離法も挙げられる。濾過工程で生じた濾液にＳｕｐｅｒｆｌｏｗＤＥ（登録商標）などの濾過助剤を加えて、さらに清澄化を行ってもよい。得られた濾液の一部を凍結乾燥に適した容器に入れて凍結することができる。得られた濾液の一部を上記と同様に、疎水性溶媒と混合して、水層および疎水性層を形成することもできる。本明細書の記載に従って、これらの層を分離、濃縮して保存することができる。

上記の詳細な記述より、当業者には本発明のさらに他の目的および利点が容易にわかるだろう。しかし、ここでは本発明を実施する上で考えられる最良の形態を単に説明する目的で、好ましい実施形態のみを記載している。本発明においては他にも様々な実施形態が可能であり、また本発明のいくつかの詳細部分について、本発明から一切逸脱することなく、例えば工程順序の自明な再編成などの種々の自明な点に関して変更が可能であることは理解されるだろう。従って、以下の記述および実施例は、本来本発明を説明するものであって、本発明を限定するものとみなすべきではない。

（実施例１）
８〜９日目の雌ニワトリの受精卵を選択した。受精卵ごと７０％エタノールで殺菌し、ドラフト内に置いて７０％エタノールを蒸発させた。これらの受精卵を割って、内容物を滅菌済みの１．０ｍｍメッシュに通した。卵殻と濾液は廃棄した。固形および液状のいずれの残渣も回収し、氷上で冷却した。この残渣を５℃でホモジナイズした。このホモジネート（スラリー）をステンレス製の滅菌トレーへ注ぎ、さらなる処理に備えて凍結した。

（実施例２）
雌ニワトリの受精卵から、下記の方法によってニワトリの８日胚を摘出した。
（ｉ）２４個の褐色卵を得た。
（ｉｉ）上記の卵を割ったところ、２４個のうち２２個のみが受精しており、発達した胚を含んでいた（受精率９１．６％）。
（ｉｉｉ）胚を摘出して、滅菌ＰＢＳで軽く２回洗浄し、それぞれ５０ｍＬ試験管に入れて直ちに−２０℃で凍結した。
（ｉｖ）次いで１０本の試験管を真空凍結乾燥機（棚温度：−４０℃、コンデンサー温度：−５２℃）に入れて凍結乾燥した。
（ｖ）凍結乾燥サイクルが終了したところで、試験管内の胚をそれぞれ滅菌ガラス棒で粉砕し、得られた粉末（１．７ｇ）を放射線照射用に包装した。
（ｖｉ）完成した粉末を２〜８℃（短期）または−２０℃（長期）で保存した。
残った１２つの胚を小さなビーカーに集め、ハンドミキサーを用いて少量の水と混合した。

結果
乾燥後、粉末（１．７ｇ）を分散し、ガラス棒を用いて均質化して放射線照射用に準備した（ロット番号ＥＭ２００６０１とした）。この粉末の胚１つあたりの収量は０．１７ｇである。
乾燥したスラリー（１．６ｇ）を分散し、ガラス棒を用いて均質化して放射線照射用に準備した（ロット番号ＥＭ２００６０２とした）。この粉末の胚１つあたりの収量は０．１４ｇである（水分量は不明）。

（実施例３）
６０個の受精卵（８日胚）を得た。水性抽出物とエーテル抽出物の調製方法について下記に説明する。
すべての受精卵に７０％（ｖ／ｖ）エタノールを噴霧して卵殻表面を殺菌し、層流式のドラフト内に卵を置いてアルコールを蒸発させた。
卵を割り、胚と、胚に付随し、透明な水様性内容物を含む透明な嚢とを、卵黄の残りの部分および血管成分から注意深く分離した。次いでこれらの試料、すなわち胚および透明な嚢をすべて、あらかじめ氷上で冷却したビーカーに集めた。摘出が終了した後、これらの試料を上記と同じハンドミキサーを用いて混合し、スラリーを得た。
得られたスラリー（約２００ｍＬ）を同量ずつ半分に分けて、一方を水性抽出用に、もう一方をエーテル抽出用に用いた。

水性抽出物
１００ｍＬのスラリーに１００ｍＬのＲＯ水を加えて、これを３０分間室温で撹拌した。この液を遠心分離によって清澄化し、上層にある水層を回収した（２００ｍＬ、固形分１．１％）。次いでこの水層を凍結し、続いて凍結乾燥した。この乾燥粉末１．０ｇをロット番号ＥＭ２００６０３とし、放射線照射して滅菌した。

エーテル抽出物
１００ｍＬのスラリーにあらかじめ冷却したエーテルを１００ｍＬ加えた。この混合液を室温で振とうさせて、次いで遠心分離した。５℃で１５分間遠心分離した後、上部の水／エーテル層を分液漏斗に移した。上層にあるエーテル層をサイフォン式で回収するか、または−２０℃で一定時間冷凍して下層にある不透明な水層を凍結させ、この温度で凍結しない上層にある透明な黄色のエーテル層をデカントして回収した。
下層にある水層を上記と同様に、同量のエーテルで再度抽出し、これを３回繰り返した。次いで、得られたエーテル抽出液をＲｏｔａｖａｐ（登録商標）を用いて少量（約１ｍＬ）になるまで濃縮乾燥した。このサンプルを５℃で保存したが、出荷するまでに何ら別の処理をする必要はなかった。このサンプルをロット番号ＥＭ２００６０４とした。

（実施例４）
先に出荷した水性抽出物（ＥＭ２００６０３）の１０倍量およびエーテル抽出物（ＥＭ２００６０４）の５倍量を用意するためには、さらに多くの卵が必要であった。４２０個の受精卵（８〜９日胚）を得た。水性抽出物とエーテル抽出物の調製方法について下記に説明する。
すべての受精卵に７０％（ｖ／ｖ）エタノールを噴霧して卵殻表面を可能な限り殺菌し、ドラフト内に卵を置いてアルコールを蒸発させた。
卵を割ったところ、４２０個のうち６２個が未受精卵であった（受精率８５．２％）。胚と、胚に付随し、透明な水様性内容物を含む透明な嚢とを、卵黄の残りの部分および血管成分から注意深く分離した。これらの試料、すなわち胚および透明な嚢をすべて、あらかじめ氷上で冷却したビーカーに集めた。受精卵を得た日の翌日に使用するまで、この摘出した試料（約２Ｌ）を５℃で保存した。

水性抽出物
摘出が終了した後、これらの試料をハンドミキサーを用いて混合し、スラリーを得た。得られたスラリー（約２Ｌ）を金属ふるい（ＭＥＳＨＮｏ．２０）に通した。さらに濾液を紙製のフィルターパッドとＤＥ６０００を用いて清澄化した。フィルターパッドに残った固形物は廃棄した。濾液にＳｕｐｅｒｆｌｏｗＤＥ（登録商標）を加えて、これをフィルターパッドに通し、さらに清澄化した。濾過はすべて、ベンチスケールレベルでブフナー漏斗を使用して行った。得られた濾液の大部分（約１２００〜１３００ｍＬ）をトレーに取り、凍結乾燥用に直ちに凍結した（固形分１．９％）。残りの濾液５００ｍＬを１Ｌのボトルに入れて、あらかじめ冷却した同量のエチルエーテルと混合し、２層に分離するまで５℃で保存した。得られた乾燥粉末をロット番号ＥＭ２００６０５とし、放射線照射した。

エーテル抽出物：
５００ｍＬのスラリーにあらかじめ冷却したエーテルを５００ｍＬ加え、この混合液を室温で振とうした後、遠心分離した。５℃で１５分間遠心分離した後、上部の水／エーテル層を分液漏斗に移した。上層にあるエーテル層をサイフォン式で回収するか、または−２０℃で一定時間冷凍して下層にある不透明な水層を凍結させ、上層にある透明な黄色のエーテル層をデカントして回収した。
下層にある水層を上記と同様に、３００ｍＬのエーテルで再び抽出し、抽出液をあらかじめ冷却した丸底フラスコに集めた。次いで、得られたエーテル抽出液をＲｏｔａｖａｐ（登録商標）を用いて少量になるまで濃縮乾燥した。このサンプルを５℃で保存したが、出荷するまでに何ら別の処理をする必要はなかった。このサンプルをロット番号ＥＭ２００６０６とした。

本発明における上記の実施形態は、単に本発明の原理を記載しているに過ぎず、本発明を限定するものとみなされるべきではない。本明細書に開示された本発明のさらなる変更がそれぞれの技術分野の当業者が想定できるものであれば、そのような変更はすべて、以下の請求項で規定される本発明の範囲内であるとみなされる。

Claims

下記の工程を含む、少なくとも１個の受精卵の内容物の一部または内容物全体から粉末状サンプルを調製する方法：
（ｉ）少なくとも１個の受精卵の内容物を卵殻から実質的に分離する工程、
（ｉｉ）任意で実施する、上記の内容物を濾過し、固形残渣、または固形と半固形が混合した残渣を得る工程、
（ｉｉｉ）上記の内容物または残渣を凍結する工程、
（ｉｖ）上記の内容物または残渣を凍結乾燥する工程、
（ｖ）任意で実施する、１つ以上の凍結乾燥した内容物または残渣を合わせる工程、および
（ｖｉ）上記の内容物または残渣を粉砕して粉末化する工程。
粉末に防腐剤を加えることをさらに含む請求項１に記載の方法。
下記の工程を含む、少なくとも１個の受精卵の内容物の一部または内容物全体からスラリーを調製する方法：
（ｉ）少なくとも１個の受精卵の内容物を卵殻から実質的に分離する工程、
（ｉｉ）任意で実施する、上記の内容物を濾過して残渣を得る工程、
（ｉｉｉ）上記の内容物または残渣を容器内で合わせる工程、
（ｉｖ）溶媒を加えまたは加えずに、上記の内容物または残渣を混合してスラリーを調製する工程、および
（ｖ）任意で実施する、さらなる処理に備えて上記のスラリーを凍結して保存する工程。
下記の工程を含む、請求項３に従って調製されたスラリーから粉末状の水性抽出物を調製する方法：
（ｉ）スラリーと水溶液を一定時間混合する工程、
（ｉｉ）上記の混合液を清澄化し、実質的に固形物を含まない水溶液を得る工程、
（ｉｉｉ）上記の水溶液を固形物から分離する工程、
（ｉｖ）上記の水溶液を凍結する工程、および
（ｖ）上記の水溶液を凍結乾燥して粉末化する工程。
粉末に防腐剤を加えることをさらに含む請求項４に記載の方法。
下記の工程を含む、請求項３に従って調製されたスラリーから溶媒抽出濃縮物を調製する方法：
（ｉ）スラリーと疎水性溶媒を一定時間混合する工程、
（ｉｉ）上記の混合液を清澄化し、実質的に固形物を含まない溶液を得る工程、
（ｉｉｉ）上記の溶液を固形物から分離する工程、
（ｉｖ）疎水性溶媒部分を水性溶媒部分から完全に分離する工程、および
（ｖ）上記の疎水性溶媒部分を濃縮する工程。
疎水性溶媒が、エーテルであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
下記の工程を含む、少なくとも１つの胚から粉末状サンプルを調製する方法：
（ｉ）少なくとも１個の受精卵から少なくとも１つの胚を実質的に分離する工程、
（ｉｉ）任意で実施する、上記少なくとも１つの胚を洗浄する工程、
（ｉｉｉ）上記少なくとも１つの胚を凍結する工程、
（ｉｖ）上記少なくとも１つの凍結胚を凍結乾燥する工程、および
（ｖ）上記少なくとも１つの凍結乾燥した胚を粉砕して粉末化する工程。
粉末に防腐剤を加えることをさらに含む請求項８に記載の方法。
下記の工程を含む、少なくとも１つの胚のスラリー、または少なくとも１つの胚および卵白部分の一部もしくは卵白部分全体のスラリーから粉末状の水性抽出物を調製する方法：
（ｉ）スラリーと水溶液を一定時間混合する工程、
（ｉｉ）上記の混合液を清澄化し、実質的に固形物を含まない水溶液を得る工程、
（ｉｉｉ）上記の水溶液を固形物から分離する工程、
（ｉｖ）上記の水溶液を凍結する工程、および
（ｖ）上記の水溶液を凍結乾燥して粉末化する工程。
粉末に防腐剤を加えることをさらに含む請求項１０に記載の方法。