CN101703771B

CN101703771B - 一种水包油型复方疫苗佐剂及其制备方法

Info

Publication number: CN101703771B
Application number: CN2009101939302A
Authority: CN
Inventors: 宋延华; 杨明柳; 佘晓彬; 邓雨修
Original assignee: Guangdong Wens Foodstuff Group Co Ltd
Current assignee: Wens Foodstuff Group Co Ltd
Priority date: 2009-11-13
Filing date: 2009-11-13
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2029-11-13
Also published as: CN101703771A

Abstract

本发明公开了一种水包油型复方疫苗佐剂及其制备方法，包括油相和水相两部分，其中，油相部分包含维生素E、卵磷脂、蜂胶、矿物油和表面活性剂，水相部分为水性载体；其中，水性载体包括磷酸缓冲液和亲水性表面活性剂。本发明水包油型复方疫苗佐剂可以降低灭活疫苗的黏度，使疫苗注射更容易，可使动物快速产生免疫保护作用且局部反应小；本发明水包油型复方疫苗佐剂的制备方法简单，成本低廉，便于疫苗的大量生产。

Description

一种水包油型复方疫苗佐剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及疫苗领域，具体涉及一种水包油型复方疫苗佐剂及其制备方法。

背景技术

已知如何通过使用疫苗来给予特定的抗原，从而故意刺激机体免疫反应，该程序可使机体产生一种免疫应答状态，使机体与抗原接触时可产生更为迅速而有效的应答。有些抗原只有微弱的免疫原性，它们不能引发充足的免疫应答生物体获得有效保护。然而，通过与一种称为佐剂的物质的混合使用，可以增加抗原的免疫原性。佐剂通过直接对免疫系统作用，或者通过修饰抗原的药物动力学特性来增加对抗原的应答，这样就增加了抗原与免疫系统相互作用的时间。

当前，国内兽用疫苗以油佐剂为主，即以非离子型表面活性剂(Tween-80、Span-80)作为剂型稳定剂和抗原在高剪切力作用下制备成油包水型乳剂疫苗，该疫苗黏度大、注射困难，产生免疫保护慢且易对动物胴体品质造成不良影响。近年来，国外也有成功制备出水包油型疫苗佐剂的案例(US 6733754 B2，US7371395 B2)，前者以卵磷脂-矿物油为油相，以表面活性剂(Tween、Span)作为剂型稳定剂制备出水包油型佐剂，后者以矿物油为油相，通过改变表面活性剂(Tween、Span)的比例制备出水包油型佐剂，但是价格昂贵，很少见到有国内疫苗厂家应用推广。

维生素E本身是一种很好的抗氧化剂，它可以进入皮肤细胞具有抗自由基链式反应，缺乏对人类或动物的免疫功能均有影响，适量摄取维生素E对细胞免疫也有很大帮助。

蜂胶是一种稀有珍贵的蜂产品，一般情况下每群蜂几万只每天只能生产生0.2克左右。蜂胶具有天然的防腐、抑菌、杀菌、抗病毒作用，且有提高机体免疫能力，抑制肿瘤细胞，镇痛，降低血糖等功能，所以有着广泛的医疗和保健作用。因此，我国权威药典《中华本草》列举蜂胶有八大功效：抗病原微生物；增强免疫功能；调节神经机能；促进组织修复；改善血液循环；保护肝功；清除自由基；无毒副作用。蜂胶在溶解后超声波破碎，能加速其中有效物质的溶解。

目前，科技工作者已经基本搞清了蜂胶的组成成份，其有效成分是树脂(55％)、蜂蜡(30％)、精油(10％)与花粉所组成的混合物(5％)。树脂是植物的分泌物，含有许多具有抗氧化作用的类黄酮素。蜂胶中主要作用的功效成份是黄酮类化合物，目前已经分离确认的就有30多种。还有阿魏酸等10多种芳香酸，香豆酸苯乙醋等30多种芳香醋，当归酸等30多种脂肪酸及醋类化合物，赖氨酸等20多种氨基酸，没药醇等10多种菇烯类化合物，锌等30多种矿物质，维生素P等多种维生素，胰蛋白酶等多种活性酶。蜂胶里含有其特有的芳香味，就是来自植物的精油，而这些香精亦具有疗效。

蜂胶佐剂在人用疫苗上研究较多(申请号2005100459649)，通常是先制成浸膏，再和抗原混合制备成纳米疫苗，但由于其制备过程极其复杂，导致成本较高。

因此，研制有效的可用于动物疫苗，且能够解决上述问题的佐剂是非常有意义的。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种水包油型复方疫苗佐剂，该佐剂可以降低灭活疫苗的黏度，使疫苗注射更简单，可使注射动物快速产生免疫保护作用。

本发明另一目的在于提供上述水包油型复方疫苗佐剂的制备方法，该方法操作简单，成本低廉。

本发明上述目的是通过以下方案予以实现的：

本发明水包油型复方疫苗佐剂包括油相部分和水相部分，其中油相部分包含维生素E、卵磷脂、蜂胶、矿物油和表面活性剂；水相部分为水性载体；其中，水性载体包括磷酸缓冲液和亲水性表面活性剂。

其中，所述油相部分中各组分在水包油型复方疫苗佐剂总体积中，按体积百分数计分别为：0.5～2％维生素E、1～6％卵磷脂、2～8％蜂胶、15～30％矿物油、9～15％表面活性剂；水相部分的体积为余量。所述水相部分的体积为油相部分体积的1～2倍。

所述维生素E优选注射用α生育酚。

所述卵磷脂优选磷脂酰胆碱含量≥90％的注射用大豆或蛋黄卵磷脂。

所述矿物油为医用白油。

所述水性载体为磷酸缓冲液和亲水性表面活性剂，磷酸缓冲液优选pH＝7.2的等渗磷酸缓冲盐水。

所述表面活性剂包括亲油性表面活性剂、亲水性表面活性剂中的一种或两种的混合物；其中，亲油性表面活性剂为Span，亲水性表面活性剂为Tween，二者的HLB值为9～12；其中，油相部分所用表面活性剂优选亲油性表面活性剂，如Span-20、Span-40、Span-60、Span-65、Span-80或Span-85，最优选为Span-80；还可在水相部分加入亲水性表面活性剂，如Tween-20、Tween-21、Tween-40、Tween-60、Tween-61、Tween-65、Tween-80、Tween-81或Tween-85，优选Tween-80。

表面活性剂的浓度取决于很多因素，如佐剂中油的浓度越高，乳化佐剂所需要的表面活性剂就越多；佐剂中卵磷脂的浓度越高，乳化所需要的表面活性剂就越少；表面活性剂的浓度还取决于用于佐剂的集中表面活性剂的HLB值和佐剂在疫苗组合物中的浓度。本发明中对表面活性剂的选用中，在油相部分的表面活性剂组分中，既可以选择亲油性表面活性剂，也可以选择亲水性表面活性剂，而水相部分的表面活性剂就只可以选择亲水性表面活性剂。当油相部分选择亲油性表面活性剂时，油相与水相的两种表面活性剂相混合，二者的HLB值为9～12时，可以达到很好的乳化效果；当油相部分选择亲水性表面活性剂时，油相与水相的亲水性表面活性剂相混合，乳化效果相对于油相部分选择亲油性表面活性剂时的乳化效果稍差。

上述水包油型复方疫苗佐剂的制备方法步骤如下：

(1)将蜂胶和70％酒精按照1∶1～1∶4的体积比混合溶解，破碎蜂胶得到蜂胶溶液；

(2)卵磷脂和医用酒精按1∶1～1∶4的体积比混合溶解，得到卵磷脂溶液；

(3)将维生素E、蜂胶溶液和卵磷脂溶液混合后，加至灭菌Span和矿物油中，得到油相部分；

(4)将pH为7.2的等渗磷酸缓冲盐水和Tween-80灭菌后混合，得到水相部分；

(5)将油相倒入水相中搅拌，得到乳液；

(6)将乳液通过均质机处理，即得。

水包油型复方疫苗佐剂的制备方法优选为：

(1)无菌条件下，将蜂胶和70体积％酒精按照1∶1～1∶4的体积比混合溶解，超声破碎法破碎蜂胶得到蜂胶溶液；

(4)将pH为7.2的磷酸缓冲液和Tween灭菌后混合，得到水相部分；

(5)将油相倒入水相中缓慢搅拌，充分混匀成为乳液；

(6)将乳液通过均质机处理，即得。

制备油相过程中，由于卵磷脂的溶解速度较慢，而蜂胶几乎不溶，因此选用酒精作为助溶剂，在后续的动物免疫试验过程中，佐剂中酒精含量过高会加大动物的应激反应，因此，通过多次试验，确定上述制备方法中的步骤(1)和步骤(2)中酒精的加入量。

本发明将几种具有免疫增强作用的药剂结合起来制备出复方水包油型佐剂，使其优势互补，与抗原简单混合后即可以充分包被抗原，能显著增强免疫系统识别抗原的效力和抗原递呈作用，特别在动物饲养的关键时期，如免疫系统未发育完善、免疫紊乱或免疫功能低下及应激时，起着更强大的免疫刺激作用，有效改善体液免疫及细胞免疫应答功能，加强抗体水平，诱导IgA、IgG和IgM的产生。

与现有技术相比，本发明水包油型复方疫苗佐剂具有如下有益效果：

本发明水包油型复方疫苗佐剂比传统油佐剂疫苗能更早诱导更高的免疫反应，可以使实验动物获得更早的攻毒保护，且疫苗吸收完全，在接种部位几乎不引起炎症反应，不会对机体胴体造成影响。

本发明方法简单易行，降低了生产成本。

附图说明

图1为实施例8中的1号佐剂所制备的新城疫灭活疫苗粒度分布；

图2为实施例8中的2号佐剂所制备的新城疫灭活疫苗粒度分布；

图3为实施例8中的3号佐剂所制备的新城疫灭活疫苗粒度分布；

图4为实施例8中的5号佐剂所制备的新城疫灭活疫苗粒度分布。

具体实施方式

以下就具体实施例来进一步解释本发明，但并不对本发明做任何限定。

实施例1～5 佐剂的配方

表1佐剂的配方

上述佐剂的制备方法如下：

(1)无菌条件下，将蜂胶和70体积％酒精按照1∶4的体积比混合溶解，超声破碎法破碎蜂胶得到蜂胶溶液；

(2)卵磷脂和医用酒精按1∶1的体积比混合溶解，得到卵磷脂溶液；

(3)将维生素E、蜂胶溶液和卵磷脂溶液按比例混合后，加至灭菌Span和矿物油中，得到油相部分；

(4)将pH为7.2的等渗磷酸缓冲盐水和Tween灭菌后混合，得到水相部分；

(5)将油相倒入水相中缓慢搅拌，充分混匀成为乳液；

(6)将乳液通过均质机处理，即得。

实施例1～5中制备得到的疫苗佐剂分别为1～5号。

实施例6 不同配方佐剂的稳定性测定

实施例1中制备的佐剂，分别置4℃冰箱及培养箱25℃恒温保存，定期抽样观察乳剂的稳定性(试验结果如表2和表3)。结果表明佐剂在4℃条件下保存，稳定性较好，在25℃保存也有较好的稳定性，尤其以两种表面活性剂联合运用效果最佳。4号佐剂由于分散剂和分散相的比例相近，表现出一定的相的转换，最终分离成了两相。

表2不同配方佐剂4℃保存稳定性

--表示均匀的乳剂，显微镜下观察无可见的油滴；

-表示在水相中有小油滴，显微镜下观察有少量的油滴；

±表示在水相中有小油滴，肉眼可见；

+表示两相，油相和水相彻底分开；

±/+表示两相，水相上有一层棕黄色的物质。

表3不同配方佐剂25℃保存稳定性

--表示均匀的乳剂，显微镜下观察无可见的油滴；

-表示在水相中有小油滴，显微镜下观察有少量的油滴；

±表示在水相中有小油滴，肉眼可见；

+表示两相，油相和水相彻底分开；

±/+表示两相，水相上有一层棕黄色的物质。

实施例7 不同配方佐剂制备新城疫灭活疫苗安全性及免疫效果试验

灭活新城疫病毒和相应的佐剂按(体积比)2∶1混合后制备出新城疫灭活疫苗，同时制备出普通油包水型疫苗，使得同体积的疫苗抗原含量相同。分别肌肉注射免疫7日龄SPF鸡(0.2mL/只)，设置无佐剂抗原组和PBS对照组，14天后加强免疫1次，最后一次免疫后20天进行攻毒保护试验，统计各组SPF鸡的死亡情况(结果详见表4)。

表4新城疫灭活疫苗对SPF鸡的攻毒保护

*表示不同油包水型佐剂，制备出油包水型疫苗；

/表示不添加佐剂；

m/n表示各组SPF鸡的死亡数/总数。

各实验组SPF鸡免疫后均未出现精神状况差、食欲减退等不良反应，说明各佐剂制备的新城疫疫苗对实验动物SPF鸡是安全的。攻毒后各组SPF鸡的死亡情况可以反应出不加佐剂的抗原不足以抵抗同源强毒的攻击，各种佐剂制备的新城疫疫苗均可以使免疫动物获得较好的保护，说明本案佐剂和普通油包水型疫苗佐剂均具备较好的佐剂效果。

实施例8 不同配方佐剂制备新城疫疫苗粒度测定

对实施例7制备的水包油型新城疫灭活疫苗进行粒度测定，结果(详见图1～4)表明两种表面活性剂联合运用制备的水包油型疫苗粒径较单一的亲水性表面活性剂制得疫苗的粒径小，且颗粒分布相对集中。尤其以5号佐剂最佳，粒径0.22um以下的占所有颗粒的99.96％，粒径约0.08um～0.22um之间的占所有颗粒的90％以上。

实施例9 不同配方佐剂制备新城疫灭活疫苗免疫SPF鸡后抗体消长及对胴体的影响

同实施例7的方法，以灭活新城疫病毒抗原和相应的佐剂按(体积比)2∶1混合后制备出新城疫灭活疫苗，同时制备出普通油包水型疫苗，使得同体积的疫苗抗原含量相同。分别肌肉注射免疫7日龄SPF鸡(0.2mL/只)，设置抗原及PBS对照组，14天后加强免疫1次，分别于第一次免疫前及最后一次免疫后每10天采血，分离血清，-20℃保存(试验结束后一起检测HI抗体，试验结果详见表5)；最后一次免疫后60天，扑杀各组SPF鸡，剖检，统计各组实验鸡注射部位组织病变情况(试验结果详见表6)。

表5不同佐剂制备的新城疫灭活疫苗在SPF鸡中的佐剂效应

每组20只SPF鸡，m代表各实验组鸡免疫疫苗所用的佐剂序号，n代表免疫后的天数，×代表免疫前；

AVE代表抗体的平均值，STD代表离平均值的标准差；

*代表油包水型佐剂，能制备出普通油包水型疫苗；/代表无佐剂，抗原对照组，//代表PBS对照组。

如表5所示，各疫苗组与单抗原对照组比，均可以有效地刺激SPF鸡使其获得较高的特异性抗体。第二次免疫后，以水包油型疫苗产生抗体较快，充分体现了剂型优势。5号佐剂制备的疫苗产生的抗体均匀度最高，且在二免后60天，还具有同油苗相近的抗体水平。

表6不同佐剂制备的新城疫灭活疫苗在SPF鸡注射部位的残留情况

m代表各实验组鸡免疫疫苗后，注射部位存在肉眼可见病变的只数，n代表各实验组鸡的总数；

*代表油包水型佐剂，能制备出普通油包水型疫苗；

/代表无佐剂，抗原对照组，//代表PBS对照组。

如表6所示，各疫苗组在免疫60天后，单抗原及PBS对照组，没有发现注射对实验动物SPF鸡胴体造成影响，可以排除抗原在注射部位残留的可能。各实验组中，以油苗对免疫动物SPF鸡的影响最大(20只鸡中，18有残留及无菌脓肿)，5号佐剂制备的新城疫灭活疫苗效果最好，没有发现注射部位有肉眼可见的残留及病变。

Claims

1.一种水包油型复方疫苗佐剂，其特征在于该佐剂包括油相和水相两部分，其中，油相部分包含维生素E、卵磷脂、蜂胶、矿物油和表面活性剂，水相部分为水性载体；其中，水性载体包括磷酸缓冲液和亲水性表面活性剂；

其中，所述油相部分中各组分在水包油型复方疫苗佐剂总体积中，按体积百分数计分别为：0.5～2％维生素E、1～6％卵磷脂、2～8％蜂胶、15～30％矿物油、9～15％表面活性剂；水相部分的体积为余量；

所述维生素E为注射用α生育酚；

所述卵磷脂为磷脂酰胆碱质量含量≥90％的注射用大豆或蛋黄卵磷脂；

所述表面活性剂包括亲油性表面活性剂、亲水性表面活性剂中的一种或两种的混合物；其中，亲油性表面活性剂为Span-80，亲水性表面活性剂为Tween-80。

2.权利要求1所述的水包油型复方疫苗佐剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(4)将pH为7.2的磷酸缓冲液和Tween灭菌后混合，得到水相部分；

(5)将油相倒入水相中缓慢搅拌，充分混匀成为乳液；

(6)将乳液通过均质机处理，即得。