CN116590245B - 一种非洲猪瘟病毒灭活剂、病毒灭活方法以及灭活病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种非洲猪瘟病毒灭活剂、病毒灭活方法以及灭活病毒疫苗，属于生物技术领域，所述非洲猪瘟病毒灭活剂，包括去污剂、有机溶剂和油包水佐剂；所述去污剂、有机溶剂和油包水佐剂的质量比为1～50：0.3～15：35～98.7；所述病毒灭活方法包括以下步骤：将所述非洲猪瘟病毒灭活剂与非洲猪瘟病毒液混合1min～16h获得灭活病毒；所述非洲猪瘟灭活病毒疫苗，包括所述方法制备获得的灭活病毒和佐剂。本发明所述非洲猪瘟病毒灭活剂能有效灭活非洲猪瘟病毒，使其失去感染活性，同时又能保持免疫原性，为非洲猪瘟病毒的安全性提供了新的保障。

Description

一种非洲猪瘟病毒灭活剂、病毒灭活方法以及灭活病毒疫苗
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种非洲猪瘟病毒灭活剂、病毒灭活方法以及灭活病毒疫苗。
背景技术
灭活剂是指破坏或致死细菌或病毒，使其失去复制能力和/或致病力(毒力)的化学物质。生物制品意义上的灭活是指利用物理或化学方法，破坏微生物生物学活性，使其丧失繁殖能力和致病能力，但仍然保留反应原性和免疫原性的过程。接种后即可产生相应的抗体，避免感染相应病原体引起疾病。在制备灭活苗时常用的灭活剂有甲醛、β-丙内酯(β-propionolactone，BPL)、烷化剂和双氧水、S/D灭活剂等。
非洲猪瘟病毒是唯一一种通过虫媒(蜱类)传播的DNA病毒，是一种有囊膜的多层包被结构，具双链DNA的大型正二十面体病毒。径长约250-260纳米，由囊膜、衣壳、内膜、基质、核心五层结构，编码150～200个基因，包括54种结构蛋白和100多种非结构蛋白。其精巧的结构像“俄罗斯套娃”一样层层嵌套。
非洲猪瘟病毒最初也尝试利用经典的疫苗制备灭活手段，但遗憾的是，利用感染ASFV的猪肺泡巨噬细胞或者感染脾脏匀浆所制备的灭活疫苗既无法检测到血清学反应，也未能产生针对同源病毒的保护性免疫。而接种经纯化或超声处理的感染细胞所制备的灭活疫苗后，虽然确实能够诱导接种动物产生抗体，且可以从血清中检测到，但是依然无法保护接种动物免受病毒侵害(Revilla Y,Perez-Nunez D,Richt JA.African swine fevervirus biology andvaccine approaches[J].Adv Virus Res,2018,100:41-74.；FormanAJ,Wardley RC,Wilkinson PJ.The immunological response ofpigs andguineapigs to antigens ofAfrican swine fever virus[J].Arch Virol,1982,74(2-3):91-100.)。Blome等利用最先进的免疫佐剂Polygen TM与Emulsigen重新分别与灭活ASF疫苗联用，评估结果仍然与之前类似，即虽然可以诱导实验动物产生相应的抗体，但是却不能与ASFV发生中和反应，自然也无法使接种动物获得免疫性保护，同时在实验的过程中发现过高的抗体水平反而可能会影响疫苗的功效(BlomeS,Gabriel C,Beer M.Modernadjuvants do not enhance the efficacy of aninactivated African swine fevervirus vaccine preparation[J].Vaccine,2014,32(31):3879-3882.)。
目前看来，尚未有非洲猪瘟病毒可完全灭活的方法报道(何洋,康桦华,冯锈华,等.非洲猪瘟疫苗研究进展[J].传染病信息,2019,32(1):5.)。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种既能对非洲猪瘟病毒有良好的灭活作用，同时又能保证其免疫原性的非洲猪瘟病毒灭活剂、病毒灭活方法以及灭活病毒疫苗。
本发明提供了一种非洲猪瘟病毒灭活剂，包括去污剂、有机溶剂和油包水佐剂；所述去污剂、有机溶剂和油包水佐剂的质量比为1～50：0.3～15：35～98.7。
优选的，所述去污剂包括聚山梨醇酯。
优选的，所述聚山梨醇酯包括聚山梨醇酯80。
优选的，所述有机溶剂包括磷酸三丁酯。
优选的，所述油包水佐剂包括高分子量聚丙烯酸。
本发明提供了利用所述的非洲猪瘟病毒灭活剂进行病毒灭活的方法，包括以下步骤：
将所述非洲猪瘟病毒灭活剂与非洲猪瘟病毒液混合，灭活1min～16h获得灭活病毒。
优选的，所述非洲猪瘟病毒灭活剂与非洲猪瘟病毒液混合的体积比为1：(8～11)。
本发明提供了一种非洲猪瘟灭活病毒疫苗，包括所述方法制备获得的灭活病毒和佐剂。
优选的，每头份非洲猪瘟灭活病毒疫苗包括灭活前病毒含量为102.0～107.0TCID50的灭活病毒和100～500μg的佐剂。
优选的，所述的灭活病毒疫苗还包括冻干保护剂。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明所述非洲猪瘟病毒灭活剂，包括去污剂、有机溶剂和油包水佐剂；所述非洲猪瘟病毒灭活剂能有效灭活非洲猪瘟病毒，使其失去感染活性，同时又能保持免疫原性，为非洲猪瘟病毒的安全性提供了新的保障。同时，本发明提供的病毒灭活的方法操作简单，无需特殊设备，大规模生产容易实现；制备获得的灭活病毒能够用于制备非洲猪瘟灭活病毒疫苗。
附图说明
图1为稀释后灭活疫苗的扩增曲线；
图2为使用透射电镜对灭活处理前后的非洲猪瘟病毒鉴定结果。
具体实施方式
本发明提供了一种非洲猪瘟病毒灭活剂，包括去污剂、有机溶剂和油包水佐剂；所述去污剂、有机溶剂和油包水佐剂的质量比为1～50：0.3～15：35～98.7。
在本发明中，所述去污剂优选的包括聚山梨醇酯，更优选的包括聚山梨醇酯80(吐温-80)；所述有机溶剂优选的包括磷酸三丁酯(TNBP)；所述油包水佐剂包括高分子量聚丙烯酸。
在本发明中，所述非洲猪瘟病毒灭活剂中表面活性剂可使囊膜病毒表面的类脂脱落，破坏囊膜结构，使病毒不能与宿主细胞结合，从而失去感染活性。病毒混于油包水佐剂中固定，油包水佐剂可将被破坏囊膜结构的病毒包被，保护其病毒形状和外壳蛋白，从而保证了病毒的免疫原性。
本发明提供了利用所述的非洲猪瘟病毒灭活剂进行病毒灭活的方法，包括以下步骤：将所述非洲猪瘟病毒灭活剂与非洲猪瘟病毒液混合，灭活1min～16h获得灭活病毒。
在本发明中，所述非洲猪瘟病毒灭活剂与非洲猪瘟病毒液混合的体积比优选为1：(8～11)，更优选为1：(8.5～9.5)，最优选为1：9。本发明对所述混合的具体条件没有特殊限定，采用本领域常规的混合方法即可，所述混合过程中优选的伴随搅拌，所述搅拌是为了将所述非洲猪瘟病毒灭活剂与非洲猪瘟病毒液快速混合均匀。本发明在所述混合后，进行均质包被；所述均质包被优选的在均质机内进行，机器参数优选的设置为流速100-150每小时；压力优选为700～900pa；温度优选的小于25℃。
在本发明中，所述灭活的时间可选为2min～15h；所述灭活的温度在0～30℃范围内均可。
本发明还提供了一种非洲猪瘟灭活病毒疫苗，包括所述方法制备获得的灭活病毒和佐剂。
在本发明中，每头份非洲猪瘟灭活病毒疫苗优选的包括灭活前病毒含量为102.0～107.0TCID50的灭活病毒和100～500μg的佐剂，进一步优选为103.0～106.0TCID50的灭活病毒和200～400μg的佐剂，更进一步优选为104.0～105.0TCID50的灭活病毒和250～350μg的佐剂。在本发明中，所述佐剂采用本领域常规的疫苗佐剂即可，在本发明具体实施过程中，优选的采用G佐剂，所述G佐剂的主要成分为孢子虫G糖蛋白，能够产生Th1型和CTL型细胞(细胞毒性T淋巴细胞)免疫应答(具有抗免疫逃避作用)，抵抗胞内病毒的感染。在本发明中，所述G佐剂的制备方法，包括以下步骤：将孢子虫接种在vero细胞上进行增殖，40～60h后，取上清液即为G佐剂。本发明对上清液进行蛋白含量测定，依据测定结果进行配比；本发明中，所述G佐剂的用量以上清液中的蛋白质量计。在本发明中，所述的灭活病毒疫苗优选的还包括冻干保护剂，所述冻干保护剂为蔗糖明胶冻干保护剂，所述冻干保护剂在所述灭活病毒疫苗中的体积比例优选为8～12％，更优选为9～11％，最优选为10％。在本发明中，所述非洲猪瘟灭活病毒疫苗的制备方法优选的包括以下步骤：将所述灭活病毒、佐剂和冻干保护剂混合后，进行冻干。本发明对所述冻干的参数没有特殊限定，能够实现冻干效果即可。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
野猪肺WSL细胞，购自上海莼试生物技术有限公司。
RPMI 1640培养基，美国GIBCO产品，购自英潍捷基(上海)贸易有限公司。
新生牛血清，购自呼和浩特市草原绿野生物工程材料有限公司。
实施例1
1、分别在BMDM细胞中加入含1％～2％SY18ΔMGF/CD2v株种毒(由军事科学院军事兽医研究院军事兽医研究所鉴定、保管和供应)的细胞维持液(含5％新生牛血清、100IU青霉素、100μg链霉素/mL的RPMI 1640，pH7.2～7.4)，36℃～37℃培养4～5日，当80％以上细胞出现荧光时收获，置-20℃下冻融一次，分装后置-40℃以下保存。进行病毒含量、纯净和鉴别检验。
2、从液氮罐中取出一支WSL细胞，37℃水浴复苏后，将细胞加入装有50mL悬浮培养基的摇瓶中，置37℃、120r/min、5％CO2环境中培养。60小时以后取样计数，当细胞密度达到3.0×106个/mL以上时，补加悬浮培养基，使细胞数密度达到1.0×106个/mL，放大培养。
3、取适宜摇瓶培养的种细胞加入接种瓶，经管道转移至已有适宜体积培养基的生物反应器中，设定生物反应器培养参数为37℃、转速60r/min，pH值7.2，溶氧(DO)值50％进行培养，待细胞密度达3.0×106个/mL以上时，进行二级生物反应器扩大培养。
4、将一级生物反应器细胞培养至密度达3.0×106个/mL以上时，转移至已有适宜体积培养基的二级生物反应器中扩大培养，使培养初期细胞密度稀释至0.5×106个/mL，同时设定生物反应器培养参数为37℃、转速60r/min，pH值7.2，DO值50％进行培养，至细胞密度达到2.5×106个/mL～3.5×106个/mL。
5、补加悬浮培养基将细胞密度稀释至1.0×106个/mL，以1％(v/v)的比例将SY18ΔMGF/CD2v株种毒接种于其中。37℃、转速60r/min，pH值7.2，DO值50％进行培养。
6、接毒48小时后逐日取细胞样观察荧光，4～5日荧光达到80％以上时收获病毒细胞培养液。取病毒液进行病毒含量测定。
7、首先将总体积8.7％的油包水佐剂、总体积0.3％的TNBP和总体积1％的吐温-80混合，后加入到总体积90％的抗原，24℃灭活10min～8h，均质包被。均质包被在均质机内进行，机器参数设置为流速100-150每小时；压力800pa；温度小于25℃。
8、将灭活的病毒液，稀释至每头份灭活前病毒含量为107.0TCID50。按每头份加入300μg G佐剂，搅拌均匀。按配苗总量的10％加入蔗糖-明胶冻干保护剂，搅拌均匀后定量分装冻干。
蔗糖-明胶冻干保护剂原料组成：明胶10g，蔗糖40g，注射用水100ml。
制备方法：取部分注射用水将明胶加热溶解后，加入蔗糖，补足注射用水，混合均匀，调整pH6.8～7.0。按照需要量分装于玻璃瓶，以116℃高压灭菌40min，取出备用。
9、检验
(1)PCR检验分别取640×、1280×、2560×、5120×、10240×稀释的疫苗，用OIE推荐ASFV实时PCR检测方法(附注1)进行检测并记录CT值，CT值检验结果分别应为640×≤30、1280×≤31、2560×≤32、5120×≤33、10240×≤34。检验结果见表1，扩增曲线见图1。
表1抗原PCR检测结果
稀释倍数 样品号 CT值
640× 1 26.48
1280× 2 28.66
2560× 3 28.67
5120× 4 30.08
10240× 5 31.11
阳性对照 6 26.83
阴性对照 7 ——
从上述实验数据中可以看出，从640x倍稀释到10240x倍稀释，PCR检测结果均有数值，说明疫苗中含有非洲猪瘟病毒DNA片段，且随着稀释倍数的增加，CT值也数值增大，符合变化趋势。
(2)细胞检验
用注射用水复溶冻干疫苗为1头份/mL，取1mL用RPMI 1640培养基对疫苗进行稀释，分别取640×、1280×、2560×、5120×、10240×稀释的疫苗100μL/孔接种于96孔细胞培养板中，每个稀释度8个重复，同时设未灭活病毒(从107.0TCID50/mL开始稀释倍数同上)接种对照和正常细胞对照，每孔补加10％新生牛血清的RPMI 1640培养液，36℃～37℃5％CO2培养5日，若观察不到荧光，冻融后取一半冻融液再接种BMDM细胞继代一次，36℃～37℃5％CO2培养并观察5日。病毒对照均应出现荧光，正常细胞和灭活疫苗接种的BMDM细胞均应不出现荧光。检验结果见表2。
表2稀释后灭活疫苗和稀释后病毒液稀释液荧光观察结果
表2中：“+”表示有荧光；“-”表示无荧光；“/”表示不适用
(3)透射电镜观察
使用透射电镜对灭活处理的非洲猪瘟病毒和未经灭活处理的非洲猪瘟病毒进行鉴定，在透射电镜观察下结果见图2。
从实验结果可以看出，加入1％吐温-80、0.3％磷酸三丁酯、8.7％油包水佐剂处理后，非洲猪瘟病毒的通透性改变，双层脂质膜消失。本发明提供的非洲猪瘟病毒灭活剂灭活效果良好，同时没有影响灭活病毒的免疫原性。
实施例2
采用不同灭活时间、不同灭活温度非洲猪瘟病毒
重复实施例1步骤1～6，在收获的病毒液中按体积比加入灭活剂，即最终体积百分含量为1％的吐温-80、0.3％磷酸三丁酯、8.7％油包水佐剂。在常温下，分别在25℃±1℃和4℃条件下，灭活1min、4h、8h、12h、16h时，将灭活的病毒液，稀释至每头份灭活前病毒含量为107.0TCID50。按每头份加入300μg G佐剂，搅拌均匀。按配苗总量的10％加入蔗糖-明胶冻干保护剂，搅拌均匀后定量分装冻干。进行灭活效果检验。
G佐剂的主要成分为孢子虫G糖蛋白，能够产生Th1型和CTL型细胞(细胞毒性T淋巴细胞)免疫应答(具有抗免疫逃避作用)，抵抗胞内病毒的感染。G佐剂的制备方法：将孢子虫接种在vero细胞上进行增殖，48h后，取上清液，对上清液进行蛋白含量测定，依据测定结果进行配比；上述300μg的G佐剂的用量以上清液中的蛋白质量计的。
(1)PCR检验分别取640×、1280×、2560×、5120×、10240×稀释的疫苗，用OIE推荐ASFV实时PCR检测方法(附注1)进行检测并记录CT值，CT值检验结果分别应为640×≤30、1280×≤31、2560×≤32、5120×≤33、10240×≤34。检验结果见表3。
表3 25±1℃常温、4℃灭活后抗原PCR检测结果
(2)细胞检验
用注射用水复溶冻干疫苗为1头份/mL，取1mL用RPMI 1640培养基对疫苗进行稀释，分别取640×、1280×、2560×、5120×、10240×稀释的疫苗100μL/孔接种于96孔细胞培养板中，每个稀释度8个重复，同时设未灭活病毒(从107.0TCID50/mL开始稀释倍数同上)接种对照和正常细胞对照，每孔补加10％新生牛血清的RPMI 1640培养液，36℃～37℃5％CO2培养5日，若观察不到荧光，冻融后取一半冻融液再接种BMDM细胞继代一次，36℃～37℃5％CO2培养并观察5日。病毒对照均应出现荧光，正常细胞和灭活疫苗接种的BMDM细胞均应不出现荧光。检验结果见表4、表5。
表4 25±1℃常温灭活后荧光观察结果
表5 4℃常温灭活后荧光观察结果
/>
表4和5中：“+”表示有荧光；“-”表示无荧光；“/”表示不适用
可以看出在1min～16h的时间内，灭活温度为25±1℃室温和4℃条件下混匀均质都可以完成灭活非洲猪瘟病毒。说明采用本发明方法灭活非洲猪瘟病毒的灭活温度在常温和4℃低温均有很好的灭活效果。
实施例3
采用不同灭活剂浓度灭活非洲猪瘟病毒
重复实施例1步骤1～6，不同的是将加入灭活剂前的样品平均分成7份，每份灭活剂的吐温-80、磷酸三丁酯、油包水佐剂组成和最终体积百分含量不同。将灭活的病毒液，稀释至每头份灭活前病毒含量为107.0TCID50。按每头份加入300μg G佐剂，搅拌均匀。按配苗总量的10％加入蔗糖-明胶冻干保护剂，搅拌均匀后定量分装冻干。不同灭活温度常温进行灭活效果检验。
(1)PCR检验分别取640×、1280×、2560×、5120×、10240×稀释的疫苗，用OIE推荐ASFV实时PCR检测方法(附注1)进行检测并记录CT值，CT值检验结果分别应为640×≤30、1280×≤31、2560×≤32、5120×≤33、10240×≤34。检验结果见表6。
表6不同灭活剂浓度灭活后抗原PCR检测结果
/>
(2)细胞检验
用注射用水复溶冻干疫苗为1头份/mL，取1mL用RPMI 1640培养基对疫苗进行稀释，分别取640×、1280×、2560×、5120×、10240×稀释的疫苗100μL/孔接种于96孔细胞培养板中，每个稀释度8个重复，同时设未灭活病毒(从107.0TCID50/mL开始稀释倍数同上)接种对照和正常细胞对照，每孔补加10％新生牛血清的RPMI 1640培养液，36℃～37℃5％CO2培养5日，若观察不到荧光，冻融后取一半冻融液再接种BMDM细胞继代一次，36℃～37℃5％CO2培养并观察5日。病毒对照均应出现荧光，正常细胞和灭活疫苗接种的BMDM细胞均应不出现荧光。检验结果见表7。
表7不同灭活剂浓度灭活后荧光观测结果
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表7中：“+”表示有荧光；“-”表示无荧光；“/”表示不适用
可以说明，所述非洲猪瘟病毒灭活剂中吐温-80可以按0.1～5％任一浓度加入；磷酸三丁酯可以按0.03～1.5％任一浓度加入；油包水佐剂可以按3.5～9.87％任一浓度加入，对于非洲猪瘟病毒均有很好的灭活效果。
附注1
非洲猪瘟病毒抗原(核酸)检测法
1.1材料
1.1.1DNA提取选取商品化的病毒DNA提取试剂盒并参照说明书进行DNA提取。应采用高纯度DNA提取试剂盒提取各类样本中的病毒核酸，或用自动化核酸提取仪器提取各类样本中的病毒核酸。如在2小时内诊断则提取的核酸置于冰上保存，否则置于-20℃冰箱保存。每次抽提核酸，都要包括至少一个阳性对照和一个阴性对照。阳性对照样品为ASFV核酸阳性样本(血清、EDTA-血液、1/10组织匀浆或细胞培养上清液)；阴性对照样品为无核酸酶水或者ASFV核酸阴性样本(血清、EDTA-血液、1/10组织匀浆或细胞培养上清液)。
1.1.2引物、探针使用世界动物卫生组织(OIE)在陆生动物诊断技术和疫苗手册(Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals)第2.8.1章African Swine Fever中提供的引物和探针(表8)，并按照手册中规定的检测程序操作和判定标准进行判定。
表8引物探针序列
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1.1.3PCR检测试剂盒Takara Premix Ex Taq(Probe qPCR)(Cat NoRR390A)或其他试剂盒-20℃保存。或PCR预混液：Premix Ex TaqTM(ProbeqPCR)或其他。
1.1.4荧光定量PCR仪
1.1.5扩增体系配制每个检测反应体系需使用22μL实时荧光PCR反应液。配制按照表9进行，该配制过程需要在冰盒上完成。
表9反应体系配制
1.1.6分装和模板加入将每22μLPCR反应混合液加入PCR管；将3μL待检样品DNA模板加入到每个PCR管，使每管总体积达到25μL，同时，每次进行荧光PCR扩增时均设标准阳性、阴性及空白对照。标准阳性用阳性对照样品所提取核酸作为模板，标准阴性用阴性对照样品所提取核酸作为模板，空白对照用无核酸酶水作为模板。记录反应管对应的样品编号。加入模板后，盖紧管盖后，瞬时离心至管中液体全部在管底部，并无气泡。
1.1.7扩增条件将所有PCR管放入实时荧光PCR检测仪内，记录反应管摆放顺序。选定FAM作为报告基团，TAMRA为淬灭基团，反应参数设置如下：50℃2min，1个循环；95℃10min，1个循环；95℃/10s，58℃1min，40个循环；在每次循环的58℃退火延伸时收集荧光信号。试验结束后，根据样品的Ct值和扩增曲线判定结果。
1.1.8结果判定
1.1.8.1结果分析条件设定实时荧光PCR检测阈值设定原则:阈值线超过阴性对照扩增曲线的最高点，且相交于阳性对照扩增曲线进入指数增长期的拐点，或根据仪器噪声情况进行调整。每个样品反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数即为Ct值。
1.1.8.2结果描述及判定
1.1.8.2.1阳性对照Ct值≤28.0且出现典型扩增曲线，阴性对照无Ct值时，试验成立。
1.1.8.2.2被检样品Ct值≤38且出现典型扩增曲线，则结果判定为非洲猪瘟病毒核酸阳性。Ct值＞38时且出现特异性扩增曲线，判为可疑；对疑似样品，模板量加倍(4μL)进行复检2次，如果重测有1次结果仍出现上述结果，则判定为非洲猪瘟病毒核酸阳性。否则，判为阴性。
1.1.8.2.3被检样品无Ct值，则判为非洲猪瘟病毒核酸阴性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种非洲猪瘟病毒灭活剂，其特征在于，由去污剂、有机溶剂和油包水佐剂组成；所述去污剂、有机溶剂和油包水佐剂的质量比为1～50：0.3～15：35～98.7；所述去污剂为聚山梨醇酯80；所述有机溶剂为磷酸三丁酯；所述油包水佐剂为高分子量聚丙烯酸。
2.利用权利要求1所述的非洲猪瘟病毒灭活剂进行病毒灭活的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将所述非洲猪瘟病毒灭活剂与非洲猪瘟病毒液混合，灭活1min～16h获得灭活病毒。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒灭活剂与非洲猪瘟病毒液混合的体积比为1：(8～11)。
4.一种非洲猪瘟灭活病毒疫苗，其特征在于，包括权利要求2或3所述方法制备获得的灭活病毒和佐剂。
5.根据权利要求4所述的灭活病毒疫苗，其特征在于，每头份非洲猪瘟灭活病毒疫苗包括灭活前病毒含量为102.0～107.0TCID50的灭活病毒和100～500μg的佐剂。
6.根据权利要求4所述的灭活病毒疫苗，其特征在于，所述的灭活病毒疫苗还包括冻干保护剂。
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Resistance of vaccinia virus to inactivation by solvent/detergent treatment of blood products;P Roberts;Biologicals.;第28卷(第1期);参见摘要 *

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