CN111454882A - 用微载体培养Marc-145细胞生产蓝耳病毒的工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用微载体培养Marc‑145细胞生产蓝耳病毒的工艺,包括如下技术步骤:选择生物反应器作为培养的手段:选择能够自动控制温度、PH、溶氧、搅拌速度等参数,适用于微载体悬浮培养的生物反应器。选择微载体作为细胞贴附生长的载体:Cytodex系列微载体;微载体的清洗、灭菌;本发明的目的在于克服现有转瓶法技术存在的不足之处,提供一种应用生物反应器微载体培养Marc‑145细胞生产猪蓝耳病病毒的生产工艺。该工艺方法能够大量降低生产成本,占用场地小,易于快速扩大生产规模,环境污染少且易于处理,自动化程度高,用人少,质量易于实现均衡稳定。可显著提高疫苗产量和质量。
Description
技术领域
本发明涉及一种应用生物反应器微载体细胞培养生产疫苗的生产工艺。可用于工业化生产猪蓝耳病病毒疫苗包括高致病性蓝耳和低致病性蓝耳病病毒疫苗的灭活疫苗以及活疫苗的生产工艺,替代传统转瓶生产培养法;具体涉及一种应用生物反应器微载体培养Marc-145细胞生产猪蓝耳病病毒的生产工艺。
背景技术
目前,猪蓝耳病,又称猪繁殖与呼吸综合征,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的一种高度接触性传染病,不同年龄、品种和性别的猪均能感染,但以妊娠母猪和1月龄以内的仔猪最易感;该病以母猪流产、死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔猪呼吸困难、败血症、高死亡率等为主要特征。
对该病的目前没有好的治疗手段,而主要是通过对敏感猪群接种疫苗进行预防。目前国内该疫苗的生产方式为转瓶培养,该传统工艺劳动强度大,耗时长、效率低,生产成本高;容易被环境污染;批间差异大;难以扩大生产。
发明内容
本发明的目的在于克服现有转瓶法技术存在的不足之处,提供一种应用生物反应器微载体培养Marc-145细胞生产猪蓝耳病病毒的生产工艺。该工艺方法能够大量降低生产成本,占用场地小,易于快速扩大生产规模,环境污染少且易于处理,自动化程度高,用人少,质量易于实现均衡稳定。可显著提高疫苗产量和质量。
为达到上述目的,本发明采取了如下的技术方案:一种应用生物反应器微载体培养Marc-145细胞生产猪蓝耳病病毒的生产工艺,包括如下技术步骤:
(1)、选择生物反应器作为培养的手段:选择能够自动控制温度、PH、溶氧、搅拌速度等参数,适用于微载体悬浮培养的生物反应器。
(2)、选择微载体作为细胞贴附生长的载体:Cytodex系列微载体
(3)、微载体的清洗、灭菌方法:1)微载体称量、PBS浸泡三小时以上。2)PBS清洗3遍。3)微载体用PBS浸泡,121℃蒸汽灭菌三十分钟。
(4)、选择Marc-145细胞作为制苗用细胞:
(5)、制苗用细胞的传代与培养:上述细胞经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代,以细胞生长液继续培养,培养温度为35-38℃。形成良好单层时,用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养。
(6)、细胞毒种的繁殖:用细胞维持液,将来源于鸡胚培养的种毒稀释接种生长良好的上述细胞单层,继续培养,培养温度为35-38℃。至细胞50~100%以上病变时收获病毒液;再将此病毒液作为种毒,在细胞上进行细胞适应性连续传代,每次传代产物进行病毒TCID50检测,判断其对Marc-145细胞的适应性和毒力变化情况。至病毒TCID50稳定时停止驯化。
(7)、Marc-145细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养:取转瓶上生长良好的Marc-145细胞,经EDTA-胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液,细胞计数后按一定比例接种反应器中。设定适合的温度、PH、搅拌速度、溶氧含量等培养参数,进行反应器自动控制培养。
(8)、制苗毒液的繁殖:待观察微载体上细胞基本长满,且细胞计数结果达到要求密度和状态后进行接毒操作。设定适合的温度、PH、搅拌速度、溶氧含量等培养参数,进行反应器自动控制培养。接毒后每隔一定时间取反应器中微载体,用显微镜观察细胞病变情况,并检测上清液的和TCID50。待观察微载体上细胞基本全部脱落,且DO值呈明显上升趋势,停止反应器搅拌,待微载体全部沉到反应器底部后,收获上清液。
(9)、收获病毒液的处理:经离心或过滤去除细胞碎片后-20℃冷冻保存备用。
作为优选地,步骤(1)中的反应器为能够自动控制温度、PH、溶氧、搅拌速度等参数,适用于微载体悬浮培养的生物反应器。
作为优选地,步骤(2)、(3)中的微载体为Cytodex系列微载体。
作为优选地,步骤(5)中的EDTA-胰酶细胞分散液配方为:含0.25%胰酶(1:250)、0.02%EDTA的Hank's液;细胞生长液的配方为:90%-98%DMEM液、2.0%-10%牛血清、加适量的抗菌素,PH调整为6.8-7.6,培养温度为35-38℃。
作为优选地,步骤(6)中的种毒繁殖需在Marc-145细胞上进行细胞适应性连续传代,至病毒HA效价和TCID50稳定时停止驯化。
作为优选地,步骤(7)中的种毒接种量为0.01~5MOI、病毒培养液配方为:含1-2%血清,DMEM液、加适量的抗菌素,PH调整为6.8-7.6。培养温度为33-38℃。其中,MOI(multiplicity of infection)是指每个细胞上感染病毒的数量;MOI=有感染力病毒量/细胞总数。
作为优选地,步骤(8)中的生物反应器设定参数为:培养温度35-38℃,ph6.8-7.6,溶氧40%-60%、搅拌速度40-60rpm。
作为优选地,步骤(9)1200rpm离心或过滤去除细胞碎片后-20℃冷冻保存备用。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
(1)、用微载体培养方法代替转瓶法培养制造猪蓝耳病病毒,可更好控制生产环节中产品被外源病毒,细菌等污染的问题,通过原材料和培养条件的严格控制,保证生产出来的疫苗纯粹,确保疫苗的安全性。
(2)、本发明可以大量降低生产成本。
(3)、应用生物反应器进行疫苗生产,具有自动化程度高,用人少,生产工艺简单稳定。易操作、产量大占用场地小,易于快速扩大生产规模。质量易于实现均衡稳定。
(4)、应用本方法生产疫苗,环境污染少且易于处理。
附图说明:
图1为本发明的制备流程图。
具体实施方式:
以下结合说明书附图及具体实施例来对本发明作进一步的描述。
如图1所示,本发明提供一种用微载体培养Marc-145细胞生产蓝耳病毒的工艺的具体实施例,包括如下具体步骤:
(1)选择生物反应器作为培养的手段:选用容量15L-50L-250L—1000L的生物反应器。
(2)选择微载体作为细胞贴附生长的载体:微载体,可以用Cytodex1,Cytodex2,Cytodex3及相应的产品
(3)微载体的清洗、灭菌方法:1)称量Cytodex1微载体2.5~10g/L、使用2LPBS液浸泡三小时。2)每次用2LPBS液清洗3遍。3)加入2LPBS液浸泡微载体,121℃蒸汽灭菌三十分钟。
(4)选择Marc-145细胞作为制苗用细胞。
(5)制苗用细胞的传代与培养:上述细胞经EDTA-胰酶细胞分散液(含0.25%胰酶(1:250)、0.02%EDTA的Hank's液)消化传代,以含90%DMEM液、10%牛血清、200单位/ml的青霉素钠和硫酸链霉素,PH调整为7.2的细胞生长液继续培养,培养温度为37℃。形成良好单层时,用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养。
(6)细胞毒种的繁殖:用病毒培养液,将种毒按0.01-5MOI稀释接种到生长良好的上述细胞单层,继续培养,培养温度为33~38℃。至细胞50~100%以上病变时收获病毒液;再将此病毒液作为种毒,在细胞上进行细胞适应性连续传代2-4代作为生产种子。
(7)Marc-145细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养:取转瓶上生长良好的Marc-145细胞,经EDTA-胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液,按每个球10-50个细胞计数后接种反应器中。生物反应器设定如下参数温度37℃,ph PH7.2,搅拌速度30~60rpm、溶氧含量35~60%进行反应器自动控制培养。
(8)Marc-145细胞在生物反应器中的微载体多级悬浮培养:上一级反应器中的微载体上细胞长满后,停止搅拌,让微载体自然沉降到罐底,吸取上清,用PBS洗载体2-3次,加入消化液进行消化;待细胞完全分离后计数,按下一级培养体积中微载体的量每球按10-50细胞接种。生物反应器设定如下参数温度37℃,ph7.2、搅拌速度30~60rpm,溶氧含量35~60%进行反应器自动控制培养。
(9)制苗毒液的繁殖:培养后第三日待观察微载体上细胞基本长满,且细胞计数结果达9.6×105/ml以上后进行接毒操作。设定温度33-38℃,pH6.8~7.6,搅拌速度30~60rpm、溶氧含量30~60等培养参数,进行反应器自动控制培养。接毒后每隔一定时间取反应器中微载体,用显微镜观察细胞病变情况,并检测上清液的TCID50。待观察微载体上细胞基本全部脱落,且DO值呈明显上升趋势,停止反应器搅拌,待微载体全部沉到反应器底部后,收获上清液。
(10)收获病毒液的处理:经离心续流离心或过滤去除细胞碎片后-20℃冷冻保存备用。
上述实施例是本发明较佳的实施方式,但是本发明的实施方式不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.用微载体培养Marc-145细胞生产蓝耳病毒的工艺,其特征在于,包括如下步骤:
(1)、选择生物反应器作为培养的手段,选用容量3L—3000L的生物反应器:
(2)、选择微载体作为细胞贴附生长的载体:
(3)、微载体的清洗、灭菌方法:1)微载体称量、PBS浸泡三小时以上;2)PBS清洗3遍;3)微载体用PBS浸泡,121℃蒸汽灭菌三十分钟;微载体的用量为2.0-6.5克每升培养液;
(4)、选择Marc-145细胞作为制苗用细胞;
(5)、制苗用细胞的传代与培养:Marc-145细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养,取转瓶上生长良好的Marc-145细胞,经EDTA-胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液,细胞计数后按每个微载体10-50个细胞接种到生物反应器中;
(6)、微载体细胞的消化及多级培养;
(7)、毒种的繁殖:用病毒培养液,将来源于转瓶培养的种毒稀释接种生长良好的上述细胞单层,继续培养;至细胞50%--100%病变时收获病毒液;再将此病毒液作为种毒,在细胞上进行细胞适应性连续传代,每次传代产物进行病毒TCID50检测,判断其对Marc-145细胞的适应性和毒力变化情况;
(8)、制苗毒液的繁殖:待观察微载体上细胞基本长满,细胞计数结果达到(5-70)×105/ml后进行接毒操作;对生物反应器设定相应的温度、pH、搅拌速度、溶氧含量,进行生物反应器自动控制培养;接毒后每隔相应时间取生物反应器中微载体,用显微镜观察细胞病变情况,并检测上清液的TCID50;待观察微载体上细胞基本全部脱落,且DO值呈明显上升趋势,停止生物反应器搅拌,待微载体全部沉到生物反应器底部后,收获上清液;
(9)、收获病毒液的处理:病毒液经离心或过滤去除细胞碎片后-20℃冷冻保存备用。
2.根据权利要求1所述的用微载体培养Marc-145细胞生产蓝耳病毒的工艺,其特征在于:步骤(1)中的生物反应器的参数包括温度、pH、溶氧浓度、搅拌速度。
3.根据权利要求1所述的用微载体培养Marc-145细胞生产蓝耳病毒的工艺,其特征在于:步骤(2)、(3)中的微载体为Cytodex系列微载体。
4.根据权利要求1所述的用微载体培养Marc-145细胞生产蓝耳病毒的工艺,其特征在于:步骤(5)中的EDTA-胰酶细胞分散液配方为:含0.25%胰酶、0.02%EDTA的Hank's液;细胞生长液的配方为:90%-98%DMEM液、2%-10%牛血清、加适量的抗菌素,pH为6.8-7.6,培养温度为35-38℃。
5.根据权利要求1所述的用微载体培养Marc-145细胞生产蓝耳病毒的工艺,其特征在于:步骤(6)中的微载体培养Marc-145细胞的消化过程如下:显微镜下观察细胞在微载体上基本长满,停止生物反应器的搅拌,让微载体自然沉降到罐体底部,汲取上清液,加入PBS将微载体清洗1-3次,加入EDTA-胰酶细胞分散液消化微载体上的细胞,细胞完全分散后计数,按每个球10-50个细胞计数后接种到下一级生物反应器中。
6.根据权利要求1所述的用微载体培养Marc-145细胞生产蓝耳病毒的工艺,其特征在于:步骤(7)中的种毒繁殖需在Marc-145细胞上进行细胞适应性连续传代。
7.根据权利要求1所述的用微载体培养Marc-145细胞生产蓝耳病毒的工艺,其特征在于:步骤(7)中的种毒接种量为0.01~5MOI、MOI是指每个细胞上感染病毒的数量;MOI=有感染力病毒量/细胞总数,病毒培养液配方为:含1-2%血清,DMEM液、加适量的抗菌素,pH调整为6.8-7.6,培养温度为33-38℃。
8.根据权利要求1所述的用微载体培养Marc-145细胞生产蓝耳病毒的工艺,其特征在于:步骤(8)中的生物反应器设定参数为:培养温度33-38℃、pH6.8-7.6、溶氧40%-60%、搅拌速度30-80rpm。
9.根据权利要求1所述的用微载体培养Marc-145细胞生产蓝耳病毒的工艺,其特征在于:所述Marc-145细胞为上皮样细胞,来源于猴肾细胞。
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