PT2213724E

PT2213724E - Meios sem proteínas animais para a cultura de células

Info

Publication number: PT2213724E
Application number: PT10004392T
Authority: PT
Inventors: Manfred Reiter; Wolfgang Mundt; Friedrich Dorner; Leopold Grillberger
Original assignee: Baxter Int; Baxter Healthcare Sa
Priority date: 2004-10-29
Filing date: 2005-10-12
Publication date: 2012-10-09
Also published as: EP2213725B2; US10655099B2; EP2213726B1; PT2213726E; PT2218776E; MX2007005132A; US20150104867A1; FI2213725T4; PT2213725E; US20060094104A1; KR20070073930A; HK1147284A1; KR101043547B1; RU2383616C2; JP4847962B2; WO2006045438A1; US20110081722A1; SI2218776T1; DK2213724T3; CN101065480A

Description

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DESCRIÇÃO "MEIOS SEM PROTEÍNAS ANIMAIS PARA A CULTURA DE CÉLULAS"

DOMÍNIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a meios de cultura de células sem proteínas animais compreendendo uma poliamina e um hidrolisado derivado de planta e/ou levedura. A invenção também se refere a processos de cultura sem proteínas animais, em que as células podem ser cultivadas, propagadas e submetidas a passagem sem a adição de proteínas animais suplementares ao meio de cultura. Estes processos são úteis na cultura de células, como células recombinantes ou células infetadas com um vírus, e para a preparação de produtos biológicos por processos de cultura de células.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Para a cultura de células, particularmente células eucarióticas, e mais especificamente células de mamífero, há uma necessidade constante de utilizar meios de cultura especiais que disponibilizem as substâncias nutrientes de crescimento que são requeridas para o crescimento eficiente das células e para a produção das proteínas ou vírus que são desejados. Para a produção eficiente de produtos biológicos, como vírus ou proteínas recombinantes, é importante obter uma densidade celular ótima, bem como aumentar a própria expressão proteica para se obter um rendimento máximo de produto.

Formulações de meios de cultura de células têm sido suplementadas com uma gama de aditivos, incluindo componentes indefinidos, como soro fetal de vitelo (FCS), 2 várias proteínas derivadas de animais e/ou hidrolisados proteicos de origem bovina.

Em geral, soro ou substâncias derivadas do soro, como albumina, transferrina ou insulina, podem conter agentes indesejados que podem contaminar as culturas de células e os produtos biológicos daí obtidos. Além disso, aditivos derivados de soro humano têm de ser testados quanto a todos os vírus conhecidos, incluindo hepatite e HIV, que possam ser transmitidos pelo soro. Adicionalmente, soro bovino e produtos daí derivados têm o risco de contaminação por BSE. Além disso, todos os produtos derivados do soro podem estar contaminados por constituintes desconhecidos. No caso do soro ou aditivos proteicos que são derivados de fontes humanas ou de outros animais em cultura de células, há numerosos problemas (por exemplo, a qualidade variável da composição dos diferentes lotes e o risco de contaminação com micoplasma, vírus ou BSE), particularmente se as células forem utilizadas para a produção de fármacos ou vacinas para administração humana.

Em consequência, têm sido feitas muitas tentativas para proporcionar sistemas hospedeiros e condições de cultura eficientes, que não requeiram soro ou outros compostos de proteínas animais. Um meio sem soro simples inclui tipicamente meio basal, vitaminas, aminoácidos, sais orgânicos ou inorgânicos, e opcionalmente componentes adicionais para tornar o meio nutricionalmente complexo. É conhecido que hidrolisados de soja são úteis para processos de fermentação e podem intensificar o crescimento de muitos organismos exigentes, leveduras e fungos. 0 documento WO 96/26266 descreve que digestos papaicos de 3 soja triturada são uma fonte de hidratos de carbono e azoto e muitos dos componentes podem ser utilizados em cultura de tecidos. Franek et al. (Biotechnology Progress (2000) 16, 688 - 692) descrevem efeitos promotores do crescimento e produtividade de frações peptidicas definidas de hidrolisados de soja. O documento WO 96/15231 divulga um meio sem soro composto pelo meio essencial minimo sintético e extrato de levedura para a propagação de células de vertebrados e processo de produção de virus. Uma formulação de meio composta por um meio basal de cultura de células compreendendo um péptido do arroz e um extrato de levedura e seu digesto enzimático, e/ou um lípido vegetal para o crescimento de células animais, é divulgada em WO 98/15614. Um meio compreendendo hidrolisado de soja purificado para a cultura de células recombinantes é divulgado em WO 01/23527. O documento WO 00/03000 divulga um meio que compreende um hidrolisado de soja e um extrato de levedura, mas também requer a presença de formas recombinantes de proteínas animais, como fatores de crescimento. O documento W02004/005493 descreve meios de cultura de células sem proteinas animais compreendendo uma combinação de péptidos não derivados de animais derivados de hidrolisado de soja e hidrolisado de levedura. O documento W001/11021 refere-se a um clone celular recombinante estável que é estável num meio não contendo soro e proteinas ao longo de pelo menos 40 gerações. O documento FR72.29396 descreve um meio de cultura para a seleção de bactérias, em que o meio não tem proteinas animais. O documento WO02/24876 refere-se a um processo para o isolamento de virus a partir de várias fontes e para a 4 produção de vacinas de influenza atenuadas vivas numa cultura de células Vero sem soro sob condições em que alterações nos antigénios de superfície do virus, devido a seleção adaptativa, são minimizadas ou prevenidas. 0 documento EP-A-0 481 791 descreve um meio de cultura bioquimicamente definido para a cultura de células CHO manipuladas, que não tem proteínas, lípidos e hidratos de carbono isolados de uma fonte animal, também compreendendo uma insulina ou análogo de insulina recombinante, 1 % até 0,025 % p/v de peptona de soja digerida com papaína e putrescina. O documento WO 98/08934 descreve uma cultura de células eucarióticas sem soro compreendendo péptidos de soja hidrolisados (1 - 1000 mg/L) , 0,01 até 1 mg/L de putrescina e uma variedade de componentes derivados de animais, incluindo albumina, fetuína, várias hormonas e outras proteínas. Neste contexto, também deve ser notado que também é conhecido que a putrescina está contida em meios comuns, como DMEM/F12 de Ham, numa concentração de 0,08 mg/L.

No entanto, os meios conhecidos na técnica atual são muitas vezes insuficientes do ponto de vista nutricional e/ou devem ser suplementados com suplementos proteicos ou versões recombinantes de proteínas derivados de animais, como insulina, fator de crescimento do tipo insulina ou outros fatores de crescimento.

Em consequência, é presentemente necessário aumentar o rendimento de proteínas recombinantes expressas ou de qualquer outro produto de expressão, e a velocidade de crescimento específica de células, e proporcionar um meio ótimo de cultura de células completamente desprovido de 5 proteínas animais para a preparação de produtos biológicos, como os utilizados em produtos farmacêuticos ou vacinas em humanos.

Com base em extratos de peptona de soja (também denominados "hidrolisados de soja") têm sido desenvolvidos meios que não contêm proteínas animais. No entanto, a qualidade de lotes comercialmente disponíveis de hidrolisados de soja varia de modo extremo e, em resultado, verificam-se grandes variações na produção de proteínas recombinantes ou produtos virais (uma variação de até um fator de 3) em função dos lotes utilizados ("variação de lote para lote") de hidrolisados de soja. Esta desvantagem afeta a proliferação das células, bem como a expressão proteica de cada célula.

Em consequência, é necessário um meio de cultura de células sem proteinas animais que esteja completamente desprovido de proteinas animais e ultrapasse pelo menos um dos problemas acima mencionados.

RESUMO DA INVENÇÃO

Um objetivo da presente invenção é proporcionar um meio de cultura de células sem proteinas animais que não contenha quaisquer proteinas suplementares adicionadas derivadas de uma fonte animal e/ou proteinas animais recombinantes, que permita um crescimento eficiente de células e, em particular, a produção de proteinas com uma qualidade continua no que se refere à quantidade de expressão por célula. Outro objetivo da presente invenção é proporcionar um método para a cultura de células e um método para a expressão eficiente de proteinas recombinantes que estejam desprovidas de proteinas animais. 6

Outro objetivo da presente invenção consiste em reduzir hidrolisados derivados de planta e/ou levedura para ultrapassar efeitos inibidores que teriam um impacto negativo no rendimento produtivo de um produto recombinante ou virai desejado. Foi surpreendentemente descoberto que os hidrolisados são a causa das variações de lote para lote na produção. 0 meio de cultura de células sem proteínas animais de acordo com a invenção compreende pelo menos uma poliamina e um hidrolisado derivado de planta e/ou levedura, em que a poliamina é preferivelmente originária de uma fonte diferente do hidrolisado de proteína.

Surpreendentemente, a adição de pelo menos uma poliamina, em particular a adição de putrescina, ao meio de cultura de células sem proteínas animais proporciona o efeito vantajoso de não só promover o crescimento celular mas também, em particular, de aumentar a expressão proteica por célula e, em particular, a expressão de proteínas recombinantes por célula.

Além disso, o meio sem proteínas animais de acordo com a presente invenção permite um crescimento celular consistente e rendimento aumentado de produtos desejados, particularmente de proteínas alvo, como proteínas recombinantes, independentemente da qualidade ou de variações entre lotes do hidrolisado de proteína, em particular dos hidrolisados vegetais, no meio de cultura de células sem proteínas animais. A suplementação específica de meios de cultura de células com poliaminas e um hidrolisado derivado de planta e/ou levedura atua de modo 7 sinergético, aumentando o crescimento celular, a produtividade especifica de células e a densidade celular final.

Em consequência, o meio sem proteinas animais de acordo com a presente invenção é mais favorável para a expressão de proteinas recombinantes e velocidade de crescimento celular em comparação com os meios conhecidos na área. Além disso, o meio sem proteinas animais de acordo com a presente invenção permite a redução da quantidade de hidrolisado de proteina a ser adicionada a um dado volume do meio de cultura de células.

DESCRIÇÃO BREVE DAS FIGURAS A Figura 1 mostra um gráfico que compara (A) a produtividade volumétrica de FVIII-CoA (expressa em [U/L/D] = Unidades de FVIII COA por L do volume do reator por dia) e (B) a velocidade de crescimento especifica (μ expressa em [d-1] = 1 por dia) de células GD8/6 em função dos meios utilizados para a cultura, que foram suplementados com diferentes lotes (K119-1, K138-1, M022963, M024423, M022453) de hidrolisados de soja (0,4 % (p/v)). A Figura 2 mostra uma tabela que compara a produtividade volumétrica de FVIII-CoA de células GD8/6 que cresceram em meios com diferentes concentrações de hidrolisado de soja. A Figura 3 mostra um gráfico que compara a produtividade volumétrica de FVIII-CoA de células GD8/6 em função dos meios utilizados para a cultura, que foram suplementados com 5 lotes diferentes (K119-1, K138-1, M022963, M024423, M022453) de hidrolisados de soja (0,25 % (p/v)) (A) na ausência de putrescina e (B) na presença de 1 mg/L de putrescina.2HC1. A Figura 4 mostra um gráfico gue compara as velocidades de crescimento especificas de células GD8/6 em função dos meios utilizados para a cultura, gue foram suplementados com 5 lotes diferentes (K119-1, K138-1, M022963, M024423, M022453) de hidrolisados de soja (0,25 % (p/v) ) (A) na ausência de putrescina e (B) na presença de 1 mg/L de putrescina.2HC1. A Figura 5 mostra uma tabela gue compara a produtividade volumétrica de FVIII-CoA (QP [U/L/D]) e a velocidade de crescimento especifica (p. [d—1]) de células GD8/6, e o seu desvio padrão, gue cresceram em meios com 5 lotes diferentes selecionados (K119-1, K138-1, M022963, M024423, M022453) de hidrolisados de soja (0,4 % (p/v) ou 0,25 % (p/v)) com os mesmos hidrolisados de soja (0,25 % (p/v)) com e sem putrescina.2HC1 a 1 mg/L. A Figura 6 mostra uma tabela gue descreve as concentrações médias de putrescina encontradas em hidrolisados de soja (0,4 % (p/v) em meio de cultura de células) de fabricantes diferentes. A Figura 7 mostra uma tabela gue compara o efeito de hidrolisado de soja (0,4% (p/v)) e hidrolisado de soja (0,25 % (p/v)) + 1,8 mg/L de putrescina. 2HC1 na produtividade volumétrica (QP expressa em [mg IgGl / L do volume do reator / dia]) e produtividade especifica de células (gp [pg IgGl/10E06 Células/d]) em células ARH77 gue segregam um anticorpo monoclonal. 9 A Figura 8 mostra um gráfico que compara o efeito de hidrolisado de soja (0,25 % (p/v) ) e hidrolisado de soja (0,25 % (p/v)) + 1 mg/L de putrescina (1,8 mg/L de putrescina.2HC1) na produtividade de eritropoietina (EPO) especifica de células de células BHK recombinantes (produção de EPO (Unidades)/consumo de glucose (g)). A Figura 9 mostra uma tabela que compara o efeito de putrescina, ornitina e espermina, numa gama larga de concentrações (0-18 mg/L), no crescimento específico (μ absoluto, μ relativo) e na produtividade específica de células (Qp absoluto, Qp relativo) de células GD8/6 cultivadas em meio BAV contendo 0,0% de hidrolisado de soja e sem aminas, ou meio BAV contendo uma concentração reduzida de hidrolisado de soja de 0,25% suplementado com poliaminas na gama de concentrações indicada acima. BAV -SP 0,25% = meio BAV contendo 0,25% de hidrolisado de soja; BAV - SP 0,4% = meio BAV contendo 0,4% de hidrolisado de soja; BAV sem soja sem poliaminas = meio BAV não contendo hidrolisado de soja nem poliaminas.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO A invenção é apresentada nas reivindicações.

Um aspeto da presente divulgação refere-se a um meio de cultura de células sem proteínas animais compreendendo pelo menos uma poliamina e um hidrolisado derivado de planta e/ou levedura numa concentração suficientemente reduzida para evitar potenciais efeitos inibidores do hidrolisado. O termo "poliamina" refere-se a qualquer de um grupo de compostos orgânicos compreendidos por carbono, azoto, e hidrogénio, e contendo dois ou mais grupos amino. Por 10 exemplo, o termo abrange moléculas selecionadas do grupo que consiste em cadaverina, putrescina, espermidina, espermina, agmatina, e ornitina. A menos que afirmado de modo diferente, os valores de concentração indicados ao longo deste documento referem-se à forma de base livre do(s) componente(s).

No meio de cultura de células sem proteínas animais descrito aqui, a concentração da poliamina está presente numa concentração que varia desde cerca de 0,5 mg/L até cerca de 30 mg/L, mais preferivelmente desde cerca de 0,5 mg/L até cerca de 20 mg/L, ainda mais preferivelmente desde cerca de 0,5 mg/L até cerca de 10 mg/L, mais preferivelmente desde cerca de 2 mg/L até cerca de 8 mg/L, muito preferivelmente desde cerca de 2 até cerca de 5 mg/L no meio. A concentração total do hidrolisado de proteína derivado de planta e/ou levedura no meio de cultura de células sem proteínas animais descrito aqui é cerca de 0,05 % até cerca de 5 % (p/v) , mais preferivelmente cerca de 0,05 % até cerca de 2 % (p/v), mais preferivelmente cerca de 0,05 % até cerca de 1 % (p/v), mais preferivelmente cerca de 0,05 % até cerca de 0,5 % (p/v), muito preferivelmente cerca de 0,05 % até cerca de 0,25 % (p/v); isto é, se o meio contiver um hidrolisado de proteína derivado de planta e de levedura, a concentração total é calculada somando os valores de concentração de cada um dos componentes de hidrolisado de proteína contidos no meio. 0 termo "meio de cultura de células sem proteínas animais" de acordo com a invenção refere-se a um meio que não contém 11 proteínas e/ou componentes proteicos de eucariotas superiores multicelulares diferentes de plantas. Proteínas típicas que são evitadas são as que estão presentes em soro e substâncias derivadas do soro, como albumina, transferrina, insulina e outros fatores de crescimento. 0 meio de cultura de células sem proteínas animais também está desprovido de quaisquer produtos purificados derivados de animais e produtos recombinantes derivados de animais, bem como digestos de proteínas e seus extratos ou extratos de lípidos ou seus componentes purificados. Proteínas e componentes de proteínas animais devem ser distinguidos de proteínas não de animais, pequenos péptidos e oligopéptidos que podem ser obtidos de plantas (habitualmente com 10 - 30 aminoácidos de comprimento), como soja, e eucariotas inferiores, como levedura, que podem ser incluídos no meio de cultura de células sem proteínas animais de acordo com a invenção. O meio de cultura sem proteínas animais de acordo com a invenção pode basear-se em qualquer meio basal, como DMEM, F12 de Ham, meio 199, McCoy ou RPMI, geralmente conhecidos do profissional. O meio basal pode compreender alguns ingredientes, incluindo aminoácidos, vitaminas, sais orgânicos e inorgânicos, e fontes de hidratos de carbono, em que cada ingrediente está presente numa quantidade que suporta a cultura de uma célula que é geralmente conhecida do profissional. O meio pode conter substâncias auxiliares, tais como substâncias tampão, como bicarbonato de sódio, antioxidantes, estabilizadores para contrariar tensões mecânicas, ou inibidores de proteases. Se for requerido, um surfactante não iónico, como misturas de polietilenoglicóis e polipropilenoglicóis (por exemplo, Pluronic F68 ®, SERVA), pode ser adicionado como agente antiespumante. 12 A poliamina empregue para o meio de cultura sem proteínas animais de acordo com a invenção pode ser selecionada do grupo que consiste em cadaverina, putrescina, espermidina, espermina, agmatina, ornitina, e combinações dessas. Muito preferivelmente, o meio de cultura sem proteínas animais contém ornitina, putrescina e espermina.

Numa forma de realização preferida do meio de cultura sem proteínas animais, a poliamina controla a síntese de DNA e RNA, proliferação celular, diferenciação celular, estabilização membranar, e/ou proteção de DNA antioxidativa. Putrescina, espermidina, espermina, e ornitina são exemplos de poliaminas que exibem estas funções. Outro exemplo de uma poliamina é cadaverina. A poliamina pode ser originária de uma fonte diferente do hidrolisado de proteína.

No meio de cultura de células sem proteínas animais como descrito aqui, a poliamina está presente numa concentração que varia desde cerca de 0,5 até cerca de 30 mg/L, mais preferivelmente desde cerca de 0,5 mg/L até cerca de 20 mg/L, ainda mais preferivelmente desde cerca de 0,5 mg/L até cerca de 10 mg/L, mais preferivelmente desde cerca de 2 mg/L até cerca de 8 mg/L, muito preferivelmente desde cerca de 2 até cerca de 5 mg/L no meio, e o hidrolisado de proteína derivado de planta e/ou levedura está presente no meio numa concentração que varia desde cerca de 0,05 % até cerca de 5 % (p/v) , mais preferivelmente cerca de 0,05 % até cerca de 2 % (p/v), mais preferivelmente cerca de 0,05 % até cerca de 1 % (p/v), mais preferivelmente cerca de 13 0,05 % até cerca de 0,5 % (p/v) , muito preferivelmente cerca de 0,05 % até cerca de 0,25 % (p/v). O hidrolisado de proteina derivado de planta utilizado para o meio de cultura de células sem proteinas animais de acordo com a presente divulgação é preferivelmente selecionado do grupo que consiste num hidrolisado de cereal e/ou um hidrolisado de soja. O hidrolisado de soja pode ser um hidrolisado de soja altamente purificado, um hidrolisado de soja purificado ou hidrolisado de soja em bruto. O termo "hidrolisado" inclui qualquer digesto enzimático de um extrato vegetal ou de levedura. O "hidrolisado" pode ser adicionalmente digerido de modo enzimático, por exemplo, por papaina, e/ou formado por autólise, termólise e/ou plasmólise. Hidrolisados a serem utilizados de acordo com a presente invenção também estão disponíveis no mercado, tais como HyPep 1510 ®, Hy-Soy®, Hy-Yeast 412® e Hi-Yeast 444®, de fontes tais como a Quest International, Norwich, NI, OrganoTechnie, S.A. França, Deutsche Hefewerke GmbH, Alemanha, ou DMV Intl. Delhi, NI. Fontes de extratos de levedura e hidrolisados de soja também são divulgadas em WO 98/15614, WO 00/03000, WO 01/23527 e US 5,741,705.

Os hidrolisados são preferivelmente purificados da fração em bruto, uma vez que impurezas podem interferir numa cultura eficiente. A purificação pode ser efetuada por ultrafiltração ou cromatografia com Sefadex, por exemplo, com Sefadex 25 ou Sefadex G10 ou materiais equivalentes, cromatografia de permuta iónica, cromatografia de afinidade, cromatografia de exclusão por tamanhos ou cromatografia de fase reversa. As frações podem conter hidrolisados com peso molecular definido, preferivelmente 14 até cerca de 1000 Dalton, mais preferivelmente até cerca de 500 Dalton, muito preferivelmente até cerca de 350 Dalton. Pelo menos cerca de 90% do hidrolisado tem, preferivelmente, um peso molecular de até cerca de 1000 Dalton. O peso molecular médio dos hidrolisados situa-se, preferivelmente, entre cerca de 220 e cerca de 375 Dalton. O valor de pH do hidrolisado deve situar-se no intervalo desde cerca de 6,5 até cerca de 7,5. O teor total de azoto é, preferivelmente, entre cerca de 5 e cerca de 15%, e o teor de cinzas é, preferivelmente, até cerca de 20%. O teor de aminoácidos livres é, preferivelmente, entre cerca de 5% e cerca de 30%. O teor de endotoxinas é, preferivelmente, menor do que cerca de 500 U/g.

Também é proporcionado aqui um método de utilização de pelo menos uma poliamina para adição a um meio de cultura de células sem proteínas animais contendo um hidrolisado de proteina derivado de planta e/ou levedura, para aumentar o rendimento da expressão proteica nas células cultivadas. A poliamina pode estar presente no meio de cultura descrito aqui numa concentração total que varia desde cerca de 0,5 até cerca de 30 mg/L, mais preferivelmente desde cerca de 0,5 mg/L até cerca de 20 mg/L, ainda mais preferivelmente desde cerca de 0,5 mg/L até cerca de 10 mg/L, mais preferivelmente desde cerca de 2 mg/L até cerca de 8 mg/L, muito preferivelmente desde cerca de 2 até cerca de 5 mg/L no meio. Preferivelmente, a poliamina é selecionada do grupo que consiste em cadaverina, putrescina, espermidina, espermina, agmatina, ornitina, e combinações dessas. Preferivelmente, o hidrolisado de proteina derivado de planta e/ou levedura está presente no meio numa concentração que varia desde cerca de 0,05 % até cerca de 5 % (p/v), mais preferivelmente cerca de 0,05 % até cerca de 15 2 % (ρ/ν) , mais preferivelmente cerca de 0,05 % até cerca de 1 % (p/v) , mais preferivelmente cerca de 0,05 % até cerca de 0,5 % (p/v), muito preferivelmente cerca de 0,05 % até cerca de 0,25 % (p/v). A presente invenção também se refere a um método para a cultura de células, que compreende os passos seguintes: (a) proporcionar um meio de cultura de células sem proteínas animais de acordo com a invenção, e (b) propagar as células no meio, para formar uma cultura de células.

Numa forma de realização preferida, o meio de cultura de células sem proteínas animais compreende pelo menos uma poliamina e um hidrolisado derivado de planta e/ou levedura. Preferivelmente, a poliamina é originária de uma fonte diferente do hidrolisado de proteína. A presente invenção não está limitada a qualquer tipo de células. Numa forma de realização preferida da invenção, as células utilizadas são, por exemplo, células de mamífero, células de inseto, células aviárias, células bacterianas, células de levedura. As células podem ser, por exemplo, células estaminais ou células recombinantes transformadas com um vetor para expressão genética recombinante, ou células transfetadas com um vírus para a preparação de produtos virais. As células também podem ser, por exemplo, células produtoras de uma proteína de interesse sem transformação recombinante, por exemplo, uma célula B produtora de um anticorpo, que pode ser transformada num estado imortalizado, por exemplo, por infeção virai, como infeção pelo Vírus Epstein Barr. As células também podem 16 ser, por exemplo, células primárias, por exemplo, células de embrião de galinha, ou linhas de células primárias. São preferidas células que são utilizadas para a produção de virus in vitro. Numa forma de realização preferida, as células podem ser células BSC, células LLC-MK, células CV- 1, células COS, células VERO , células MDBK, células MDCK, células CRFK, células RAF, células RK, células TCMK-1, células LLCPK, células PK15, células LLC-RK, células MDOK, células BHK-21, células CHO, células NS-1, células MRC-5, células WI-38, células BHK, células 293, células RK, e células de embrião de galinha.

As células que podem ser utilizadas de acordo com a presente invenção podem ser cultivadas por um método selecionado do grupo que consiste em cultura descontínua, cultura semidescontínua, cultura por perfusão e cultura em quimiostato, todas elas sendo genericamente conhecidas na técnica. A presente invenção também se refere a um método para a expressão de uma proteína alvo, como uma proteína heteróloga ou autóloga ou uma proteína recombinante, que compreende os passos seguintes: a) fazer crescer uma cultura de células num meio de cultura de células sem proteínas animais de acordo com a invenção; e b) introduzir uma sequência de ácido nucleico compreendendo uma sequência que codifica a proteína alvo nas células; c) selecionar as células contendo a sequência de ácido nucleico; e 17 d) induzir de modo seletivo a expressão da proteina alvo nas células. 0 meio de cultura de células sem proteínas animais compreende putrescina e hidrolisado de soja. Preferivelmente, a putrescina é originária de uma fonte diferente do hidrolisado de proteina. A sequência de ácido nucleico compreendendo uma sequência que codifica a proteina alvo pode ser um vetor. 0 vetor pode ser um virus ou um plasmideo. A sequência que codifica uma proteina alvo pode ser um gene especifico ou uma sua parte funcional biológica. Numa forma de realização preferida, a proteina alvo é pelo menos uma parte biologicamente ativa de um fator de coagulação do sangue, como o Fator VIII, ou pelo menos uma parte biologicamente ativa de uma proteina envolvida na produção de glóbulos vermelhos e angiogénese, como eritropoietina, ou um anticorpo monoclonal.

Preferivelmente, o ácido nucleico também compreende outras sequências adequadas para a expressão controlada de uma proteina alvo, como sequências promotoras, como intensificadores, caixas TATA, sitios de iniciação da transcrição, poliligadores, sitios de restrição, sequências poli-A, sequências de processamento proteico, marcadores de seleção, e afins, que são geralmente conhecidas do profissional. São muito preferidas as seguintes linhas de células transformadas com um vetor recombinante para a expressão dos produtos respetivos: células CHO para a produção do fator VIII de coagulação recombinante, células BHK para a 18 produção de eritropoietina recombinante, células B humanas transformadas com o vírus Epstein Barr e imortalizadas para a produção de anticorpos humanos. A presente invenção também se refere a um método para a produção de um vírus ou parte de um vírus, que compreende os passos seguintes: a) fazer crescer uma cultura de células num meio de cultura de células sem proteínas animais de acordo com a invenção; e b) infetar as células com um vírus; c) selecionar as células infetadas com o vírus; e d) incubar as células, para propagar o vírus.

Numa forma de realização preferida, o meio de cultura de células sem proteínas animais compreende pelo menos uma poliamina e um hidrolisado derivado de planta e/ou levedura. Mais preferivelmente, a poliamina é originária de uma fonte diferente do hidrolisado de proteína. 0 vírus utilizado no método de acordo com a invenção pode ser qualquer vírus patogénico, vírus de mamífero, preferivelmente humano, como um vírus vacínia ou vacínia atenuado, por exemplo, para vacinas contra a varíola, coronavírus, preferivelmente vírus SARS, por exemplo, para a produção de vacinas contra SARS, ortomioxivírus, para a produção das vacinas preferivelmente vírus influenza, por exemplo, para a produção de vacinas contra influenza, paramixovírus, retrovírus, vírus influenza A ou B, vírus Ross River, flavivírus, preferivelmente vírus do Nilo Ocidental ou vírus FSME (isto é, vírus da encefalite transmitida pela carraça), por exemplo, 19 respetivas, picornavírus, vírus arena, vírus herpes, poxvírus ou adenovírus. 0 vírus pode ser um vírus do tipo selvagem, um vírus atenuado, um vírus rearranjado ("reassortant"), ou um vírus recombinante ou combinações desses, por exemplo, atenuado e recombinante. Adicionalmente, em vez de serem utilizados viriões reais para infetar células com um vírus, pode ser utilizado um clone de ácido nucleico infecioso. Também podem ser utilizados viriões fragmentados. 0 método para a expressão de uma proteína ou produção de um vírus pode ser utilizado para produzir composições imunogénicas compreendendo um vírus ou um antigénio de vírus.

As células utilizadas para o método de produção de um vírus podem ser selecionadas do grupo que consiste em células de mamífero, células de inseto, células aviárias, células bacterianas, e células de levedura. Preferivelmente, as células são cultivadas por um método selecionado do grupo que consiste em cultura descontínua, cultura semidescontínua, cultura por perfusão e cultura em quimiostato.

Combinações preferidas de células com vírus para a produção de um vírus ou parte de um vírus são célula Vero/vacínia atenuado, célula Vero/Vacínia, célula Vero/Hepatite A, célula Vero/Vírus Influenza, célula Vero/Vírus do Nilo Ocidental, célula Vero/Vírus SARS, células de embrião de galinha/vírus FSME. 20 A presente invenção também se refere a um método de utilização do meio de cultura de células sem proteinas animais de acordo com a invenção para a cultura de células que expressam uma proteina alvo. A presente invenção será agora adicionalmente ilustrada nos exemplos seguintes, sem a eles ficar limitada.

EXEMPLOS

Exemplo 1 (meio BAV)

Meio sem proteinas animais foi preparado com meio basal DMEM/F12 de Ham (1:1) suplementado com sais inorgânicos, aminoácidos, vitaminas e outros componentes (Life technologies, Pó 32500). Também foram adicionados L-glutamina (600 mg/L), ácido ascórbico (20 μΜ) , etanolamina (25 μΜ), Synperonic ® (SERVA) (0,25 g/L), selenito de sódio (50 nM) . Adicionalmente, o meio de cultura de células foi suplementado com aminoácidos essenciais. Além disso, foram adicionadas concentrações variáveis de hidrolisado de soja (Quest Technologies, NI ou DMV Intl., NI) no intervalo de 0,0-1,0% e concentrações variáveis de poliaminas (0-10 mg/L) (Figuras 1-9).

Exemplo 2

Culturas celulares de células recombinantes de mamifero (por exemplo, células CHO que expressam de modo estável o Fator VIII = células GD8/6) cresceram em suspensão numa cultura em quimiostato em biorreatores de 10 L. As condições de cultura de 37 °C, saturação de oxigénio 20% e pH 7,0 até 7,1 foram mantidas constantes. As culturas foram dotadas de uma alimentação constante de meio BAV como definido no Exemplo 1 adicionalmente suplementado com 21 hidrolisados de soja no intervalo de 0,1-1,0% e/ou adição de putrescina.2HC1 no intervalo de 0-1 mg/L (ver Figuras 1-5) .

Foram realizadas experiências em pequena escala com células GD8/6 em cultura em suspensão em balões com agitação Techne a 200 mL de volume de trabalho num modo de realimentação descontinua a 37°C, sem controlo de pH e p02. As culturas foram dotadas de meio BAV como definido no Exemplo 1 sem suplementação de hidrolisado de soja e poliaminas, ou suplementado com hidrolisado de soja no intervalo de 0, ΙΟ, 4% e/ou putrescina.2HC1, ornitina.HC1, espermina.4HC1 no intervalo de 0-18 mg/L (equivalente a 0-10 mg/L da poliamina sem .HC1 (ver Figura 9).

Exemplo 3 (ver Figuras 1 até 5, 7, e 9)

Contagens celulares de suspensões de células ou células imobilizadas foram determinadas por contagem com um contador de células CASY®, como descrito por Schárfe et al., (Biotechnologie in LaborPraxis 1_0: 1096 - 1103 (1988)) ou por extração com ácido cítrico e coloração fluorescente dos núcleos, seguido de contagem com um NucleoCounter ® (Chemometec, DK) . A velocidade de crescimento específica (μ) é calculada a partir do aumento das densidades celulares (Xt) e/ou da taxa de diluição (D) do estado estacionário das culturas em quimiostato de suspensões de células ao longo de um certo intervalo de tempo (t): μ»Ρ + in (Xt/X0)/t

Exemplo 4 A atividade do Fator VIII (FVIII) (ver Figuras 1 até 5 e 9) foi medida com um ensaio cromogénico (Chromogenic, Suécia). 22 A atividade da eritropoietina (ver Figura 8) e o título do anticorpo monoclonal (ver Figura 7) foram medidos por sistemas de teste de ELISA. A produtividade volumétrica é calculada a partir da quantidade de unidades de atividade ou títulos de antigénio originados por litro do volume do reator por dia (U/L/d ou mg/L/d) nos respetivos sistemas de produção. A produtividade específica de células é definida como a quantidade específica de proteína produzida (U ou pg) por número de células por dia (ver Figuras 7 e 9) ou como a quantidade específica de proteína produzida (U) produzida por quantidade de D-glucose consumida pelas células (ver Figura 8).

Exemplo 5 Células GD8/6 foram dotadas de meio BAV contendo 0,4% (p/v) de diferentes lotes de hidrolisado de soja. A produtividade volumétrica de FVIII variou desde cerca de 600 até 1800 U/L/d e as velocidades de crescimento específicas variaram desde 0,35 até 0,52 [μ][d—1] entre os diferentes lotes (ver Figura 1) . Isto indica que os lotes de hidrolisado de soja à concentração de 0,4% não permitem um crescimento consistente das células GD8/6, possivelmente devido a substâncias inibidoras, que afetam a velocidade de crescimento específica (μ) , que estão contidas nos hidrolisados de soja.

Exemplo 6 Células GD8/6 foram dotadas de meio BAV contendo diferentes concentrações do lote de hidrolisado de soja M022257 (no intervalo de 0,15 - 1,0% p/v). A produtividade volumétrica 23 de FVIII variou desde 500 até 1,100 U/L/d e atingiu uma produtividade ótima de 1,100 U/L/d a uma concentração do hidrolisado de soja de 0,4% (p/v) (ver Figura 2).

Exemplo 7 Células GD8/6 foram dotadas de meio BAV contendo 0,25 % (p/v) dos mesmos 5 lotes diferentes de hidrolisado de soja como descrito no Exemplo 5 (Figuras 3A e 4A) e 0,25 % (p/v) de hidrolisado de soja dos mesmos lotes de hidrolisado de soja adicionalmente suplementado com 1 mg/L de putrescina.2 HC1 (Figuras 3B e 4B), respetivamente. A produtividade volumétrica de FVIII variou desde 1700 U/L/d até 500 U/L/d nas células que cresceram em meio BAV-SP contendo 0,25 % (p/v) de hidrolisado de soja de diferentes lotes de hidrolisado de soja (Figura 3A) . A velocidade de crescimento especifica variou desde 0,58 até 0,24 p[d-l], indicando que a redução da concentração do hidrolisado de soja não conduz a uma velocidade de crescimento melhorada ou mais consistente das células (Figura 4A).

Em contraste, somente variações muito pequenas da produtividade volumétrica de FVIII (Figura 3B) e velocidades de crescimento especificas (Figura 4B) entre os mesmos lotes de hidrolisado de soja são observadas nas células que cresceram em meio BAV contendo 0,25 % (p/v) de hidrolisado de soja quando suplementado com 1 mq/L de putrescina.2HC1. A adição de 1 mg/L de putrescina.2HC1 compensa aproximadamente a redução desta poliamina pela redução da concentração de hidrolisado de soja de 0,4% (p/v) para 0,25% (p/v). Daqui pode concluir-se que não é a concentração da própria poliamina, mas a adição da poliamina em combinação com a redução das concentrações do hidrolisado de soja, que conduz a uma redução de 24 substâncias inibidoras que reduzem o crescimento e a produtividade (ver Exemplo 5) . Além disso, a adição de putrescina também conduz a uma produtividade volumétrica aumentada para além do proporcional de FVIII devido a um aumento da produtividade especifica de FVIII pelas células (Figura 5).

Assim, a adição de putrescina a meios de cultura de células sem proteínas animais não só promove a taxa de expressão proteica de células cultivadas mas também reduz a quantidade de hidrolisado de planta a ser incluida nos meios de cultura para se obter o mesmo crescimento celular. Em resultado, os meios de cultura são menos afetados pela variação de lote para lote da qualidade do hidrolisado de planta e, desse modo, obtém-se uma melhoria global das condições de cultura de células.

Exemplo 8 A Figura 5 compreende a análise estatística dos Exemplos mostrados nas Figuras 1, 2 e 4: células GD8/6 foram dotadas de meio BAV contendo 0,4% (p/v) de hidrolisado de soja ou 0,25% (p/v) de hidrolisado de soja ou 0,25 % (p/v) de hidrolisado de soja e 1 mg/L de putrescina.2HC1. Os desvios padrão são calculados com base em cinco lotes selecionados de hidrolisados de soja (K119-1, K138-1, M022963, M024423, M022453). A produtividade volumétrica e específica de células de FVIII e a velocidade de crescimento específica com 0,25% (p/v) de hidrolisado de soja foram menores do que com 0,4 % (p/v) de hidrolisado de soja, o que confirma o ótimo representado na Figura 2. No entanto, a produtividade volumétrica e específica de células de FVIII e a velocidade de crescimento específica aumentam em meio de cultura de células contendo 0,25% (p/v) de hidrolisado de soja + 1 25 mg/L de putrescina.2HC1. Adicionalmente, o desvio padrão calculado a partir de cinco lotes diferentes de hidrolisados de soja é significativamente reduzido (ver Figura 5 [QP [U/L/D] = produtividade volumétrica; qp [mU/106 células / dia] = produtividade especifica de células) .

Exemplo 9

Os Exemplos 7 e 8 mostram que a putrescina é um composto ativo que suporta o crescimento celular e, mais especificamente, a expressão proteica. Em consequência, a concentração de putrescina de diferentes lotes de hidrolisado de soja de 2 fornecedores diferentes (Quest e DMV) foi analisada quantitativamente por um método de HPLC e foi avaliada de modo estatístico. A concentração nos meios de cultura de células preparados com hidrolisado de soja de ambos os fornecedores foi aproximadamente 2,3 mg/L de putrescina, quando hidrolisado de soja foi adicionado ao meio numa concentração de 0,4% (p/v) (ver Figura 6).

Exemplo 10 Células ARH77 (linha de células linfoblastoides humanas que expressam de modo estável hlgG) cresceram numa cultura de perfusão após imobilização em microtransportadores macroporosos num biorreator de reservatório agitado de 80 L a 37°C, pH 7,0-7,2 e p02 20-80% de saturação no ar, dotada de meio BAV contendo 0,4% (p/v) de hidrolisado de soja ou 0,25 % (p/v) de hidrolisado de soja + 1,8 mg/L de putrescina.2HC1. Calcularam-se médias aritméticas e desvios padrão a partir de dados representando os estados estacionários para as respetivas formulações do meio. A produtividade volumétrica de hlgG volumétrica/produtividade específica de células em meio BAV suplementado com 0,4% 26 (p/v) de hidrolisado de soja foi menor do que em meio BAV suplementado com 0,25% (p/v) de hidrolisado de soja + 1,8 mg/L de putrescina.2HC1. Esta experiência indica que a composição do meio de acordo com a presente invenção também é capaz de promover a expressão de anticorpos monoclonais a partir de uma linha de células transformadas. Além disso, a composição especifica do meio também pode ser utilizada em culturas de perfusão (ver Figura 7).

Exemplo 11 Células BHK recombinantes cresceram até à confluência em meio contendo 5% (v/v) de soro fetal de vitelo. As células foram lavadas com meio sem proteinas e foram incubadas durante 3 dias em meio BAV suplementado com 0,25% (p/v) de hidrolisado de soja ou 0,25% (p/v) de hidrolisado de soja + 1,8 mg/L de putrescina.2HC1 (Figura 8). Uma vez que não foi realizada nenhuma contagem de células nesta experiência, a taxa de consumo de glucose (g/L) foi medida ao longo de três dias, para demonstrar uma biomassa equivalente no sistema de cultura. A atividade da EPO (mU/mL) estava correlacionada com a taxa de consumo de glucose (g/L) ao longo de três dias. A adição de putrescina origina um aumento de 16% da produtividade de EPO em comparação com meio BAV meramente suplementado com 0,25% (p/v) de peptona de soja. Esta experiência também indica que a composição do meio de acordo com a presente invenção é capaz de promover a expressão de diferentes proteinas recombinantes.

Exemplo 12

Para demonstrar o efeito especifico da putrescina, ornitina e espermina numa gama maior de concentrações (0-18 mg/L, equivalente a 0-10 mg/L da poliamina sem -.HC1), realizou-se uma experiência na qual células GD8/6 foram incubadas em 27 balões com agitação Techne, a 1-1,5 E06 células/mL, em meio BAV contendo 0,25% e 0,4% de hidrolisado de soja sem poliaminas, e meio BAV contendo a concentração reduzida de hidrolisado de soja de 0,25% com as poliaminas na gama de concentrações acima mencionada. Todas as três poliaminas, na gama de concentrações investigada, originaram um aumento significativo da produtividade especifica de células (expressa em mU/106 células/dia) em comparação com a formulação de meio não suplementado com 0,25% de hidrolisado de soja, ou a concentração aumentada de 0,4%. O aumento da produtividade especifica de células claramente não está correlacionado com uma velocidade de crescimento especifica aumentada, o que confirma o efeito especifico na taxa de expressão de FVIII recombinante das células GD8/6 (Figura 9).

Por exemplo, a presente divulgação refere-se aos seguintes itens: 1. Um meio de cultura de células sem proteinas animais, compreendendo pelo menos uma poliamina e pelo menos um hidrolisado de proteína derivado do grupo que consiste em plantas e levedura. 2. O meio de cultura de células sem proteínas animais de acordo com o item 1, em que a poliamina está presente no meio de cultura numa concentração que varia desde cerca de 0,5 até cerca de 10 mg/L. 3. O meio de cultura de células sem proteínas animais de acordo com o item 1, em que a poliamina é selecionada do grupo que consiste em cadaverina, putrescina, espermidina, espermina, agmatina, ornitina, e uma combinação dessas. 28 4. 0 meio de cultura de células sem proteínas animais de acordo com o item 1, em que a poliamina é putrescina numa concentração que varia desde cerca de 0,5 até cerca de 10 mg/L, e o hidrolisado de proteína é hidrolisado de soja numa concentração que varia desde cerca de 0,05 % (p/v) até cerca de 5 % (p/v). 5. O meio de cultura de células sem proteínas animais de acordo com o item 1, em que a poliamina é originária de uma fonte diferente de um hidrolisado de proteína. 6. O meio de cultura de células sem proteínas animais de acordo com o item 1, em que a poliamina está presente no meio de cultura numa concentração que varia desde cerca de 0,5 até 30 mg/L. 7. O meio de cultura de células sem proteínas animais de acordo com o item 1, em que o hidrolisado de proteína está presente no meio de cultura numa concentração total que varia desde cerca de 0,05 % (p/v) até cerca de 5 % (p/v) para todos os hidrolisados de proteína. 8. O meio de cultura de células sem proteínas animais de acordo com o item 1, em que o hidrolisado de proteína é derivado de uma planta selecionada do grupo que consiste em cereais e soja. 9. Um método de cultura de células, que compreende os passos seguintes: (a) proporcionar um meio de cultura de células sem proteínas animais de acordo com o item 1, e 29 (b) propagar as células no meio, para formar uma cultura de células. 10. O método de acordo com o item 9, em que as células são selecionadas do grupo que consiste em células de mamifero, células de inseto, células aviárias, células bacterianas, e células de levedura. 11. O método de acordo com o item 9, em que as células são cultivadas por um método selecionado do grupo que consiste em cultura descontinua, cultura semidescontinua, cultura por perfusão, e cultura em quimiostato. 12. Um método de expressão de uma proteína alvo, que compreende os passos seguintes: a) proporcionar uma cultura de células que cresceram num meio de cultura de células sem proteínas animais de acordo com o item 1; b) introduzir nas células uma sequência de ácido nucleico compreendendo uma sequência que codifica a proteína alvo; c) selecionar as células que contêm a sequência de ácido nucleico; e d) induzir de modo seletivo a expressão da proteína alvo nas células. 13. O método de acordo com o item 12, em que as células são selecionadas do grupo que consiste em células de mamífero, células de inseto, células aviárias, células bacterianas, e células de levedura. 14. O método de acordo com o item 12, em que a combinação 30 célula/proteína alvo é selecionada do grupo que consiste em células CHO / fator de coagulação VIII, células BHK / eritropoietina, células B humanas transformadas com o virus Epstein Barr e imortalizadas / anticorpos humanos. 15. O método de acordo com o item 12, em que as células são cultivadas por um método selecionado do grupo que consiste em cultura descontinua, cultura semidescontinua, cultura por perfusão, e cultura em quimiostato. 16. Um método de produção de um vírus, que compreende os passos seguintes: a) proporcionar uma cultura de células que cresceram num meio de cultura de células sem proteínas animais de acordo com o item 1; b) infetar as células com o vírus; c) selecionar as células infetadas com o vírus; e d) incubar as células, para propagar o vírus. 17. 0 método de acordo com o item 16, em que as células são selecionadas do grupo que consiste em células de mamífero, células de inseto, células aviárias, células bacterianas, e células de levedura. 18. 0 método de acordo com o item 16, em que a combinação célula/vírus é selecionada do grupo que consiste em célula Vero/vacínia atenuado, célula Vero/vacínia, célula

Vero/Hepatite A, célula Vero/vírus influenza, célula

Vero/vírus do Nilo Ocidental, célula Vero/vírus SARS, e células de embrião de galinha/vírus FSME. 19. 0 método de acordo com o item 16, em que as células são 31 31 consiste cultura cultivadas por um método selecionado do grupo que em cultura descontinua, cultura semidescontinua, por perfusão, e cultura em quimiostato.

Lisboa, 28 de Setembro de 2012

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Meio de cultura de células sem proteínas animais, que compreende putrescina e hidrolisado de soja, em que a putrescina está presente no meio de cultura numa concentração que varia desde 0,5 até 10 mq/L e o hidrolisado de soja está presente numa concentração que varia desde 0,05 % (p/v) até cerca de 5 % (p/v).

2. Meio de cultura de células sem proteínas animais de acordo com a reivindicação 1, em que a putrescina é originária de uma fonte diferente de um hidrolisado de so j a.

3. Método de cultura de células, que compreende os passos seguintes: (a) proporcionar um meio de cultura de células sem proteínas animais de acordo com a reivindicação 1, e (b) propagar as células no meio, para formar uma cultura de células.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que as células são selecionadas do grupo que consiste em células de mamífero, células de inseto, células aviárias, células bacterianas, e células de levedura.

5. Método de acordo com a reivindicação 3, em que as células são cultivadas por um método selecionado do grupo que consiste em cultura descontínua, cultura semidescontínua, cultura por perfusão, e cultura em quimiostato. 2

6. Método de expressão de uma proteína alvo, que compreende os passos seguintes: a) fazer crescer uma cultura de células num meio de cultura de células sem proteínas animais de acordo com a reivindicação 1; b) introduzir nas células uma sequência de ácido nucleico compreendendo uma sequência que codifica a proteína alvo; c) selecionar as células que contêm a sequência de ácido nucleico; e d) induzir de modo seletivo a expressão da proteína alvo nas células.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que as células são selecionadas do grupo que consiste em células de mamífero, células de inseto, células aviárias, células bacterianas, e células de levedura.

8. Método de acordo com a reivindicação 6, em que a combinação célula/proteína alvo é selecionada do grupo que consiste em células CHO / fator de coagulação VIII, células BHK / eritropoietina, células B humanas transformadas com o vírus Epstein Barr e imortalizadas / anticorpos humanos.

9. Método de acordo com a reivindicação 6, em que as células são cultivadas por um método selecionado do grupo que consiste em cultura descontínua, cultura semidescontínua, cultura por perfusão, e cultura em quimiostato. 3

10. Método de produção de um vírus, que compreende os passos seguintes: a) fazer crescer uma cultura de células num meio de cultura de células sem proteínas animais de acordo com a reivindicação 1; b) infetar as células com o vírus; c) selecionar as células infetadas com o vírus; e d) incubar as células, para propagar o vírus.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que as células são selecionadas do grupo que consiste em células de mamífero, células de inseto, células aviárias, células bacterianas, e células de levedura.

12. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a combinação célula/vírus é selecionada do grupo que consiste em célula Vero/vacínia atenuado, célula Vero/vacínia, célula Vero/hepatite A, célula Vero/vírus Influenza, célula Vero/vírus do Nilo Ocidental, célula Vero/vírus SARS, células de embrião de galinha/vírus FSME .

13. Método de acordo com a reivindicação 10, em que as células são cultivadas por um método selecionado do grupo que consiste em cultura descontínua, cultura semidescontínua, cultura por perfusão, e cultura em quimiostato. Lisboa, 28 de Setembro de 2012