JP4847962B2 - 動物タンパク質を含まない細胞培養培地 - Google Patents
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Description
本発明は、ポリアミン並びに植物動物および/または酵母由来の加水分解産物を含み、動物のタンパク質を含まない、細胞培養培地に関する。本発明はまた、動物タンパク質を含まない細胞培養プロセスに関し、ここで、培養培地中に補完的な動物タンパク質を添加することなく、細胞は、培養、増殖および継代され得る。これらのプロセスは、組換え細胞またはウイルス感染細胞のような細胞の培養、および細胞培養プロセスによる生物学的産物の産生に有用である。
細胞、特に真核細胞、およびより具体的には哺乳類細胞の培養には、効率的な細胞増殖、および所望されるタンパク質またはウイルスの産生に必要な、増殖栄養物質を利用可能とする特別な培地の使用が絶えず必要とされている。ウイルスまたは組換えタンパク質のような生物学的産物の効率的な産生にとって、最大の産生物収量を得るために、タンパク質の発現自体が増加するだけでなく、最適な細胞密度が達成されることが重要である。
本発明の目的は、動物供給源由来のいずれの添加された補充タンパク質も、および/または組換え動物タンパク質も含まない、動物タンパク質非含有細胞培養培地を提供することである。このことは、効率的な細胞増殖、および特に細胞1個当りの発現量に関して、連続的な質のタンパク質の産生を許容する。本発明のさらなる目的は、動物タンパク質を含まない、細胞の培養方法および動物タンパク質を含まない組換えタンパク質の効率的な発現方法を提供することである。
本発明の一局面は、少なくとも一つのポリアミン並びに植物および/または酵母由来の加水分解産物を、この加水分解産物の潜在的な阻害効果を避けるために十分に減少された濃度で含む、動物タンパク質を含まない細胞培養培地に関する。
(a)本発明による、動物タンパク質を含まない細胞培養培地を提供する工程、および
(b)この培地中にて細胞を増殖させて、細胞培養物を形成する工程
を包含する。
a)本発明による、動物タンパク質を含まない細胞培養培地中にて増殖させた細胞の培養物を提供する工程;および
b)この細胞に、標的タンパク質をコードする配列を含む核酸配列を導入する工程;
c)その核酸配列を保有する細胞を選択する工程;および
d)細胞内における標的タンパク質の発現を選択的に誘導する工程
を包含する。
a)本発明による、動物タンパク質を含まない細胞培養培地中にて増殖させた細胞の培養物を提供する工程;および
b)この細胞にウイルスを感染させる工程;
c)ウイルス感染細胞を選択する工程;および
d)細胞をインキュベートしてウイルスを増殖させる工程
を包含する。
動物タンパク質を含まない培地を、無機塩、アミノ酸、ビタミンおよび他の成分を補った基本DMEM/HAMのF12(1:1)培地(Life technologies、32500 Powder)を用いて調製した。また、L−グルタミン(600mg/L)、アスコルビン酸(20μM)、エタノールアミン(25μM)、Synperonic(登録商標)(SERVA)(0.25g/L)、亜セレン酸ナトリウム(50nM)を添加した。さらに、必須アミノ酸をこの細胞培養培地に補った。その上さらに、0.0〜1.0%の範囲における多様な濃度のダイズ加水分解産物(Quest Technologies、NYまたはDMV Intl.,NY)および多様な濃度(0〜10mg/L)のポリアミンを添加した(図1〜9)。
組換え型の哺乳類細胞(例えば、第VIII因子を安定して発現しているCHO細胞、すなわちGD8/6細胞)の細胞培養液を、10lのバイオリアクター中で1つのケモスタット培養において懸濁状態で増殖させた。37℃、酸素飽和度20%およびpH7.0〜7.1という培養条件を定常的に保った。この培養液に、0.1〜1.0%の範囲におけるダイズ加水分解産物および/または0〜1mg/Lの範囲におけるプトレシン・2HClの添加物をさらに補った、実施例1で規定したBAV培地の定常的補給物を供給した(図1〜5を参照)。
懸濁細胞または固定された細胞の細胞数を、Schaerfeら(Biotechnologie in LaborPraxis 10:1096−1103(1988))により記載の通り、CASY(登録商標)細胞計数器を用いて計数するか、または、クエン酸の抽出および核の蛍光染色を行い、その後NucleoCounter(登録商標)(Chemometec、DK)を用いて計数するかのいずれかにより、決定した。比増殖速度(μ)を、細胞密度の増加(Xt)および/または一定の時間間隔(t)での懸濁細胞のケモスタット培養の定常状態の希釈速度(D)から算出した:
μ=D+ln(Xt/X0)/t
(実施例4)
第VIII因子(FVIII)(図1〜5および9を参照)の活性を、色素形成アッセイ(Chromogenic、Sweden)により測定した。エリスロポエチン(図8参照)の活性およびモノクローナル抗体の力価(図7参照)をELISA試験システムにより測定した。
GD8/6細胞に、0.4%(w/v)の異なるロットのダイズ加水分解産物を含むBAV培地を供給した。FVIIIの容量生産性は約600から1800U/L/dまで変化し、GD8/6細胞の比増殖速度は異なるロット間において、0.35から0.52μ[d−1]まで変化した(図1参照)。このことは、0.4%の濃度のダイズ加水分解産物のロットは、GD8/6細胞の一貫した増殖を許さず、それはおそらく、ダイズ加水分解産物に含まれる、比増殖速度(μ)に影響を与える阻害的な物質に起因することを示している。
GD8/6細胞に、異なる濃度(0.15〜1.0% w/vの範囲において)のダイズ加水分解産物(ロットM022257)を含むBAV培地を供給した。FVIIIの容量生産性は500から1,100U/L/dまで変化し、0.4%(w/v)というダイズ加水分解産物濃度では、1,100U/L/dという最適生産性に達した(図2参照)。
GD8/6細胞に、それぞれ、実施例5で記載したのと同じ5つの異なるダイズ加水分解産物のロットのダイズ加水分解産物(0.25%(w/v))を含むBAV培地(図3Aおよび4A)、および、さらに1mg/Lのプトレシン・2HClを補った、同じダイズ加水分解産物のロットのダイズ加水分解産物(0.25%(w/v))(図3Bおよび4B)を供給した。FVIIIの容量生産性は、異なるダイズ加水分解産物のロットのダイズ加水分解産物(0.25%(w/v))を含むBAV−SP培地で増殖させた細胞では、1700U/L/dから500U/L/dまで変化した(図3A)。比増殖速度は、0.58から0.24μ[d−1]まで変化した。このことは、ダイズ加水分解産物の濃度の減少により、細胞の増殖速度がより改善されるわけでも、より一貫したものになるわけでもないことを示している(図4A)。
図5は、図1、2および4に示された実施例の統計解析を含む。GD8/6細胞に、0.4%(w/v)のダイズ加水分解産物、または0.25%(w/v)のダイズ加水分解産物、または0.25%(w/v)のダイズ加水分解産物および1mg/Lのプトレシン・2HClを含むBAV培地を供給した。標準偏差を、5つの選択されたダイズ加水分解産物のロット(K119−1、K138−1、M022963、M024423、M022453)に基づいて算出する。0.25%(w/v)のダイズ加水分解産物における、FVIIIの容量生産性および細胞比生産性、ならびに比増殖速度は、0.4%(w/v)のダイズ加水分解産物における値よりも低かった。このことは図2に描写した最適条件を確認する。しかしながら、FVIIIの容量生産性および細胞比生産性、ならびに比増殖速度は、0.25%(w/v)のダイズ加水分解産物および1mg/Lのプトレシン・2HClを含む細胞培養培地中では増加する。さらに、5つの異なるダイズ加水分解産物のロットから算出された標準偏差は有意に減少する(図5[QP[U/L/D]]=容量生産性;qp[mU/106細胞/日]=細胞比生産性を参照)。
実施例7および8は、プトレシンが細胞増殖、より具体的にはタンパク質の発現を支える活性な化合物であることを示す。従って、2つの異なる供給者(QuestおよびDMV)からの、異なるダイズ加水分解産物のロットの、プトレシンの濃度を、HPLC法により定量的に解析し、統計学的に評価した。両供給者からのダイズ加水分解産物を用いて調製した細胞培養培地における濃度は、ダイズ加水分解産物を培地に0.4%(w/v)という濃度で添加した場合、おおよそプトレシン2.3mg/Lであった(図6参照)。
ARH77細胞(安定してhIgGを発現している、ヒトのリンパ芽球様細胞株)を、0.4%(w/v)のダイズ加水分解産物または、0.25%(w/v)のダイズ加水分解産物および1.8mg/Lのプトレシン・2HClを含むBAV培地を供給した、80Lの攪拌タンクバイオリアクター内で、37℃にて、pH7.0〜7.2、pO2 20〜80%空気飽和度の条件下で、マクロ孔質のマイクロキャリアに固定化した後、灌流培養において増殖させた。相加平均および標準偏差を、各培地配合の定常状態を表すデータの点から、算出した。hIgGの容量生産性/細胞比生産性は、0.4%(w/v)のダイズ加水分解産物を補ったBAV培地においては、0.25%(w/v)のダイズ加水分解産物および1.8mg/Lのプトレシン・2HClを補ったBAV培地における値よりも低かった。この実験は、本発明による培地の組成が、形質転換された細胞株からのモノクローナル抗体の発現をも促進し得ることを示している。さらに、この特定の培地の組成はまた、灌流培養に使用することができる(図7参照)。
組換えBHK細胞を、ウシ胎仔血清5%(v/v)を含む培地中にて、コンフルエントになるまで増殖させた。この細胞を、タンパク質を含まない培地で洗い、0.25%(w/v)のダイズ加水分解産物、または0.25%(w/v)のダイズ加水分解産物および1.8mg/Lのプトレシン・2HClを補ったBAV培地中にて、3日間インキュベートした(図8)。この実験では、細胞計数を行わなかったため、培養システムにおける等価な生物体量を証明することを目的とし、グルコース消費速度(g/L)を3日間測定した。EPOの活性(mU/ml)を3日間のグルコース消費速度(g/L)と相関させた。プトレシンの添加は、0.25%(w/v)のダイズペプトンのみを補ったBAV培地と比較して、EPO生産性を16%増加させる。この実験は、本発明による培地の組成が、異なる組換えタンパク質の発現を促進する能力を有することをも示している。
プトレシン、オルニチンおよびスペルミンの特定の影響をより広範囲の濃度(−・HClを含まない0〜10mg/Lのポリアミンに相当する、0〜18mg/L)にわたり証明するため、GD8/6細胞をTechne攪拌フラスコ内に、1〜1.5×106細胞/mlで、ポリアミンを含まない0.25%および0.4%のダイズ加水分解産物を含むBAV培地、および上記の濃度範囲のポリアミンを含む、0.25%という減少した濃度のダイズ加水分解産物を含むBAV培地中にてインキュベートするという実験を行った。3つ全てのポリアミンは調べた濃度範囲において、0.25%または濃度を増した0.4%のダイズ加水分解産物を含み、ポリアミンを補わない培地配合と比較して有意な細胞比生産性(mU/106細胞/日として表現)の増加をもたらした。この細胞比生産性の増加は明確に、増加した比増殖速度と相関していない。このことは、GD8/6細胞の組換え型FVIIIの発現速度に対する特定の影響を確認している(図9)。
Claims (14)
- 少なくとも一つのポリアミン、および少なくとも一つのタンパク質加水分解産物を含む、動物タンパク質を含まない細胞培養培地であって、ここで、該ポリアミンは、0.5mg/Lから10mg/Lまでの範囲における濃度のプトレシンであり、該タンパク質加水分解産物は、0.05%(w/v)から0.5%(w/v)までの範囲における濃度のダイズ加水分解産物である、細胞培養培地。
- 請求項1に記載の、動物タンパク質を含まない細胞培養培地であって、ここで、前記ポリアミンはタンパク質加水分解産物以外の供給源に由来する、細胞培養培地。
- 請求項1に記載の、動物タンパク質を含まない細胞培養培地であって、ここで、前記タンパク質加水分解産物は該培養培地中にて、全てのタンパク質加水分解産物が0.05%(w/v)から5%(w/v)までの範囲における、合計の濃度で存在する、細胞培養培地。
- 細胞を培養するための方法であって、以下の工程:
(a)請求項1に記載の、動物タンパク質を含まない細胞培養培地を提供する工程、および
(b)該細胞を該培地中にて増殖させて細胞培養物を形成する工程
を包含する、方法。 - 請求項4に記載の方法であって、ここで、前記細胞は、哺乳類細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、細菌細胞および酵母細胞からなる群から選択される、方法。
- 請求項5に記載の方法であって、ここで、前記細胞は、バッチ培養、流加培養、灌流培養およびケモスタット培養からなる群から選択した方法により培養される、方法。
- 標的タンパク質を発現させるための方法であって、以下の工程:
a)請求項1に記載の、動物タンパク質を含まない細胞培養培地中にて増殖させた細胞の培養物を提供する工程;
b)該標的タンパク質をコードする配列を含む核酸配列を、該細胞に導入する工程;
c)該核酸配列を保有する該細胞を選択する工程;および
d)該細胞内における該標的タンパク質の発現を選択的に誘導する工程
を包含する、方法。 - 請求項7に記載の方法であって、ここで、前記細胞は、哺乳類細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、細菌細胞および酵母細胞からなる群から選択される、方法。
- 請求項7に記載の方法であって、ここで、前記細胞/前記標的タンパク質の組合せは、CHO細胞/第VIII凝固因子、BHK細胞/エリスロポエチン、エプステイン−バーウイルスで形質転換されて不死化されたヒトB細胞/ヒト抗体からなる群から選択される、方法。
- 請求項7に記載の方法であって、ここで、前記細胞は、バッチ培養、流加培養、灌流培養およびケモスタット培養からなる群から選択した方法により培養される、方法。
- ウイルスを産生するための方法であって、以下の工程:
a)請求項1に記載の、動物タンパク質を含まない細胞培養培地中にて増殖させた細胞の培養物を提供する工程;
b)該細胞に該ウイルスを感染させる工程;
c)該ウイルス感染細胞を選択する工程;および
d)該細胞をインキュベートして該ウイルスを増殖させる工程
を包含する、方法。 - 請求項11に記載の方法であって、ここで、前記細胞は、哺乳類細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、細菌細胞および酵母細胞からなる群から選択される、方法。
- 請求項11に記載の方法であって、ここで、前記細胞/前記ウイルスの組合せは、Vero細胞/弱毒化ワクシニア、Vero細胞/ワクシニア、Vero細胞/A型肝炎ウイルス、Vero細胞/インフルエンザウイルス、Vero細胞/西ナイルウイルス、Vero細胞/SARSウイルス、および鶏の胚細胞/FSMEウイルスからなる群から選択される、方法。
- 請求項11に記載の方法であって、ここで、前記細胞は、バッチ培養、流加培養、灌流培養およびケモスタット培養からなる群から選択した方法により培養される、方法。
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