CN102007207A

CN102007207A - 一种浓缩培养液及其使用方法

Info

Publication number: CN102007207A
Application number: CN2008801287054A
Authority: CN
Inventors: 郭亚军; 王皓; 寇庚; 胡辉; 侯盛; 谈珉
Original assignee: Shanghai CP Guojian Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Antibodies National Engineering Research Center
Priority date: 2008-04-18
Filing date: 2008-04-18
Publication date: 2011-04-06
Anticipated expiration: 2028-04-18
Also published as: EP2345713A1; CA2721585A1; JP2011516086A; EP2345713A4; US20110111495A1; BRPI0822597A2; CN102007207B; WO2009127098A1

Abstract

本发明公开了一种用于大规模培养中国仓鼠卵巢细胞的浓缩培养液，所述的培养液包括基础培养基和高剂量添加物。本发明还公开了在大规模流加补液批次培养CHO细胞中添加所述浓缩培养液的方法。

Description

一种浓缩培养液及其使用方法技术领域

本发明涉及细胞培养领域。更具体地，本发明涉及一种适合大规模动物细胞培养的浓缩培养液及其添加方法。背景技术

动物细胞大规模培养己经被广泛应用于生产各类生物活性物质如单克隆抗体、病毒疫苗、免疫调节因子、生长因子、特定肿瘤抗原以及各种基因重组蛋白质药物。动物细胞同微生物相比具有转录后修饰的能力，能够高效地表达和生产各类高质量的蛋白质。

动物细胞培养无论是贴壁细胞还是悬浮细胞，就操作方式而言，主要分为分批式（Batch ) ，流加补液批次（Fed— batch ) 和灌流式（Perfus ion ) 三种操作方式。目前，流加补液批次（Fed— batch ) 培养是动物细胞大规模培养生产分泌型重组蛋白药物较为推崇的一种操作方式。在动物细胞中，中国仓鼠卵巢细胞 CH0 细胞（Chinese hamster ovary ce l l)目前被广泛用作生产各种基因工程蛋白产品的宿主细胞，这些基因工程蛋白产品如单克隆抗体、融合蛋白、疫苗、细胞因子、特定肿瘤抗原以及各种基因重组蛋白质药物。适合细胞培养的培养基，根据它的来源及成分的明确程度来划分，其发展大致可分为三个阶段：即天然培养基阶段、合成培养基阶段和无血清培养基阶段。国内外关于无血清培养基的开发涉及多个方面，其中，姚伟公开了一种 "国产改良型 DMEM培养基" 用来培养 CH0-C28细胞（《中国生物制品学杂志》 2003， 16 ( 6 ) ： 380-383 ) ，解决了 CH0-C28细胞大规模培养过程中易增厚、脱落和不易维持的难题。赵国胜公开了一种 "纯化人 CD34⁺细胞的无动物血清培养" 方法（《国外医学输血及血液学分册》 1998， 21 ( 4 ) ： 263-264 ) ，介绍了无动物血清基质液 ( ASF ) 培养人骨髓和外周血分离的 CD₃₄ ⁺细胞，在这 ASF系统中，应用不同的生长因子的组合，培养 CD₃₄ ⁺细胞。与含有 10%胎牛血清培养基进行比较， ASF培养细胞和祖细胞，同样生长良好。 CN 00816020 (发明名称为：用于无蛋白无血清培养细胞的培养基）描述了一种培养基，所述培养基用于无蛋白无血清培养细胞，尤其是哺乳动物细胞，该培养基含有一定比例的大豆水解产物。 W0200123527公开了一种包含大豆水解物的无血清、无蛋白培养基。该培养基组成为不超过 10%干重的大豆水解物，内毒素的含量不超过 500U/g。培养基内还含有氨基酸（半胱氨酸、脯氨酸、色氨酸）或氨基酸混合物。培养基内还含有其它辅助成分、缓冲因子、抗氧化物及蛋白酶抑制剂等。还有一种适合 CH0细胞大规模培养的无血清、无动物组分的培养基，解决了大规模动物细胞培养过程中细胞密度和蛋白表达量低的问题。申请人在 CN 200710085142. 2 中所公开的一种适合 CH0细胞大规模培养的无血清、无动物组分的培养基，解决了大规模动物细胞培养过程中细胞密度和蛋白表达量低的问题。上述培养基在连续灌注培养工艺中得到应用并取得良好的效果。但同时在流加式培养工艺（fed-batch) 中，细胞进行补液批次培养，培养效果的关键问题还在于细胞培养后期营养成分的补充。因此，本领域迫切需要提供一种在细胞培养后期可进行补充的，含有营养成分的培养基，这中培养基对于 fed-batch培养工艺的细胞培养结果至关重要。发明内容

本发明旨在提供一种用于大规模培养 CH0细胞的浓缩培养液。

本发明的另一个目的是提供所述浓缩培养液的制备方法。

本发明的再一个目的是提供一种所述浓缩培养液的使用方法。在本发明的第一方面，提供了一种用于大规模培养中国仓鼠卵巢（CH0) 细胞的浓缩培养液，它由基础培养基和添加物构成，按浓缩培养液的总体积计，所述的添加物由以下成分组成：

维生素 c 10- -25mg/L

转铁蛋白 5- 18mg/L

乙醇胺 1— 10mg/L

亚硒酸盐 0.01- 0.045 mg/L

羟基丁酸钠 0.5- - 1.5mg/L

A1C1 6¾0 0.5- - 2.5mgv'L

AgN0₃ 0.02- 0.045mg/L

CoCl₃«6H₂0 0.05- — 0.3mg/L

CuS0₄*5H₂0 0.002- - 0.004mg/L

KBr 0.0005- - 0.0008mg/L

FeS0₄«7¾0 0.5- - 1.5mgv'L

Na₂Si0₃ 0.005- -0.045mg/L

LiCl 0.0005. — 0. OOlmg/L

NiCl₂«6H₂0 0.02- -0.25 mg/L

SnCl₂«2H₂0 2.00- -8. OOmg/L

ZnS0₄«7¾0 0.5- -2.5mgv'L

维生素 B6 0.01 - 0.2mg/L

维生素 B12 0.01 -0.5mg/L

生物素 0.05- - 0.18mg/L

叶酸 0.02- -8. OOmg/L

核黄素 0.1- 0.15mgv'L

还原型谷胱甘肽 0.5- - 2.5mg/L

腺嘌吟 5.5- -8.5 mg/L

鸟嘌吟 5.5- -8.5 mg/L

尿嘧啶 5.5- -8.5 mg/L W 胸腺嘧啶 0.25-1.5mg/L

胞嘧啶 5.5— 8.5mg/L

核糖 2.0— 8.5mg/L

脱氧核糖 2.0— 8.5mg/L

Primatone 500-3500mg/L

4-羟乙基哌嗪乙磺酸

500- 3000mg/L

(HEPES)

β -巯基乙醇 0.2-2mg/L,

所述浓缩液中如下所示的成分的浓度为:

1000-9000mg/L 氯化钠

200-4000 mg/L 天冬氨酸

200-9000 mg/L 天丝色苏缬精泛生冬酰胺

100-5000 mg/L 谷氨氨氨氨氨氨物酸酸

酸酸酸酸酸素

200-3000 mg/L

300-4500 mg/L

50-1000 mg/L

100-2000 mg/L 苯丙氨酸

500— 10000 mg/L

50-1500 mg/L

25-1000 mg/L

40-1000 mg/L

150-2000 mg/L

0.01— 0.5 mg/L

2- 100 mg/L

3- 270 mg/L 氯化胆碱

1-30 mg/L 叶酸

5-900 mg/L 肌醇

0.1-10 mg/L 烟酸胺

0.01-1 mg/L 核黄素

1-100 mg/L 硫胺素

禾口 0.01-5 mg/L 维生素 B6。

在另一优选例中，所述浓缩液中如下所示的成分的浓度为:

1500- -6599 mg/L 氯化钠

350- 2000 mg/L 天冬氨酸

550- 5000 mg/L 天冬酰胺

250- 3000 mg/L 谷氨酸

500- 2500 mg/L 异亮氨酸

500- 2500 mg/L ¾ ¾

80- 700 mg/L 蛋氨酸 200-1250 mg/L 苯丙氨酸

2000-7000 mg/L

100-700 mg/L

80-350 mg/L

80— 400 mg/L

300-1200 mg/L

0.05-0.2 mg/L 生物素

10-70 mg/L 泛酸钙

10-120 mg/L 氯化胆碱

2-15 mg/L 叶酸

25-500 mg/L 肌醇

0.5-5 mg/L 烟酸胺

0.1-0.5 mg/L

5-50 mg/L 硫胺素

禾口 0.卜 2 mg/L 维生素 B6。

在另一优选例中，所述浓缩液中如下所示的成分的浓度为:

2000-4500 mg/L 氯化钠

450-1200 mg/L 天冬氨酸

1000-4500 mg/L 天冬酰胺

700— 2200 mg/L

900—1800 mg/L

700-1400 mg/L

300-500 mg/L

250-500 mg/L 苯丙氨酸

3000— 5500 mg/L

250-500 mg/L 苏氨酸

90-270 mg/L

120-350 mg/L

400— 700 mg/L

0.07-0.12 mg/L 生物素

20-60 mg/L 泛酸钙

20-90 mg/L 氯化胆碱

3-12 mg/L 叶酸

65-300 mg/L 肌醇

0.8-3 mg/L 烟酸胺

0.12-0.3 mg/L

10-35 mg/L 硫胺素

禾口 0.2_1.5 mg/L 维生素 B6。

在另一优选例中，所述的基础培养基是 Dulbecco' s 改良 Eagl e， s 培养基 (DMEM) 。在本发明的第二方面，提供了一种如上所述的浓缩培养液的制备方法，所述的方法包括以下步骤：将基础培养基和添加物混合，按浓缩培养液的总体积计，所述的添加物由以下成分组成：

维生素 C 10-25mg/L

转铁蛋白 5— 18mg/L

乙醇胺 l— 10mg/L

亚硒酸盐 0· 01-0.045 mg/L

羟基丁酸钠 0.5— 1.5mg/L

A1C1₃»6H₂0 0.5-2.5mg/L

AgN0₃ 0.02 - 0.045mg/L

CoCl₃*6H₂0 0.05-0.3mg/L

CuSO 5H₂0 0.002-0.004mg/L

0.0005-

KBr ,

0.0008mg/L

FeS0₄*7H₂0 0.5- - 1.5mg/L

Na₂Si0₃ 0.005- - 0.045mg/

LiCl 0.0005- — 0. OOlmg/

NiCl₂«6H₂0 0.02- 0.25 mg/L

SnCl₂«2H₂0 2.00- -8. OOmg/L

ZnS0₄*7¾0 0.5- -2.5mg/L

维生素 B6 0.01 - 0.2mg/L

维生素 B12 0.01 -0.5mg/L

生物素 0.05- -0.18mg/L

叶酸 0.02- -8. OOmg/L

核黄素 0.1- 0.15mg/L

还原型谷胱甘肽 0.5- -2.5mg/L

腺嘌吟 5.5- ■8.5 mg/L

鸟嘌吟 5.5- ■8.5 mg/L

尿嘧啶 5.5- ■8.5 mg/L

胸腺嘧啶 0.25 -1.5mg/L

胞嘧啶 5.5- -8.5mg/L

核糖 2.0- -8.5mg/L

脱氧核糖 2.0- -8.5mg/L

Primatone 500- 3500mg/L

4-羟乙基哌嗪乙磺

500- 3000mg/L

酸 (HEPES)

β-巯基乙醇 0.2- -2mg/L, 得如下所示的成分的浓度调整为:

o

o 氯化钠

200- 14000 mg/ 'L 天冬氨酸

200-90 o00 mg/ 'L 天冬酰胺

100-5000 mg/ 'L 谷氨酸

200-3000 mg/ 'L 异亮氨酸

300-4500 mg/ 'L 亮氨酸

50-1000 mg/ L 蛋氨酸

100-2000 mg/ 'L 苯丙氨酸

500-10000 mg /L 丝氨酸

50-1500 mg/ L 苏氨酸

25—1000 mg/ L 色氨酸

40—1000 mg/ L 缬氨酸

150-2000 mg/ 'L 精氨酸

'L 生物素

2-100 mg/L 泛酸钙

3-270 mg/L 氯化胆碱

1-30 mg/L 叶酸

5-900 mg/L 肌醇

0.1-10 mg/L 烟酸胺

0.01-1 mg/L 核黄素

1-100 mg/L 硫胺素

禾口 0.01_5 mg/ Ί 维生素 B6。

优选地，所述的基础培养基是 Dulbecco' s改良 Eagle' s培养基（DMEM) 。在本发明的第三方面，提供了一种如上所述的本发明浓缩培养液的使用方法，所述的方法包括步骤：

在细胞接种 1一 5天后添加如上所述的浓缩培养液，添加的总剂量为初始培养体积的 10— 100%; 所述的细胞是中国仓鼠卵巢（CH0) 细胞。

在另一优选例中，所述的细胞接种密度为 2X10⁵/ml— 2X10⁶/ml。

在另一优选例中，所述的 CH0 细胞株选自 sTNFR 融合基因 CH0 细胞、表达 SCTLA4融合蛋白的 CH0细胞、或表达人源化抗 HER2单克隆抗体的 CH0细胞。

在另一优选例中，添加的总剂量为初始培养体积的 15— 60%

在另一优选例中，每日添加浓缩培养液 1一 5次或每 1一 5 日添加浓缩培养液 1 次；更佳地每日添加浓缩液 2— 4次或每 2— 4 日添加浓缩培养液 1次。

在另一优选例中，共添加浓缩培养液 5— 20 天；更佳地共添加浓缩培养液 8 一 16天。

在另一优选例中，每次添加的浓缩培养液体积相同，或在刚开始的 1一 5天添加所添加的浓缩培养液的重量的 15— 25%，中间 3— 9天添加所添加的浓缩培养液的重量的 50— 70%，最后 1一 5天添加所添加的浓缩培养液的重量的 15— 25%。据此，本发明提供了一种在细胞培养后期可进行补充的，含有营养成分的培养基，这中培养基对于 fed-batch培养工艺的细胞培养结果至关重要。附图说明

图 1: 添加不同补充液的 5L罐内细胞批次培养生长曲线。分别是每天添加 2 %本底体积的 300F、 300S、 300S1、 300S2、 300S3及无特殊添加的情况。

图 2: 添加不同补充液的 5L罐内细胞批次培养表达结果。分别是每天添加 2 %本底体积的 300F、 300S、 300S1、 300S2、 300S3及无特殊添加的情况。

图 3: 添加不同剂量 300S的 5L罐内细胞批次培养生长曲线。每天添加剂量为本底培养体积的 1%、 2%、 3%、 4%和 5%。

图 4: 添加不同剂量 300S的 5L罐内细胞批次培养表达结果。每天添加剂量为本底培养体积的 1%、 2%、 3%、 4%和 5%。

图 5: 不同时间起始添加 300S的 5L罐内细胞批次培养生长曲线。分别在培养第 1一 5天开始添加，每日的添加剂量为本底培养体积的 3%。

图 6: 不同时间起始添加 300S的 5L罐内细胞批次培养表达结果。分别在培养第 1一 5天开始添加，每日的添加剂量为本底培养体积的 3%。

图 7: 不同频率添加 300S的 5L罐内细胞批次培养生长曲线。添加总剂量为本底培养体积的 36%，每次添加量相同。 A: 每日 2次； B: 每日 1次； C: 每 2 日 1 次； D每 3 日 1次； E: 每 4 日 1次。

图 8: 不同频率添加 300S的 5L罐内细胞批次培养表达结果。添加总剂量为本底培养体积的 36%，每次添加量相同。 A: 每日 2次； B: 每日 1次； C: 每 2 日 1 次； D每 3 日 1次； E: 每 4 日 1次。

图 9: 不同方案添加 300S的 5L罐内细胞批次培养生长曲线。每次添加剂量相同，添加总剂量为本底培养体积的 36%。添加时间均为培养开始的第 3、 6、 9、 12 天，添加剂量分别为本底体积的： A: 9%(d3) -9%(d6)一 9%(d9)— 9%(dl2)； B: 6%(d3) -12%(d6) -12%(d9)— 6%(dl2)； C: 12% (d3)— 12%(d6)一 6%(d9)— 6%(dl2)； D6%(d3) -6%(d6) -12%(d9)一 12%(dl2)。

图 10: 不同方案添加 300S的 5L罐内细胞批次培养表达结果。每次添加剂量相同，添加总剂量为本底培养体积的 36%。添加时间均为培养开始的第 3、 6、 9、 12天，添加剂量分别为本底体积的： A: 9%(d3) -9%(d6) -9%(d9) -9%(dl2)； B: 6%(d3) -12%(d6)— 12%(d9)— 6%(dl2)； C: 12% (d3)— 12%(d6)— 6%(d9)— 6%(dl2)； D6%(d3) -6%(d6)— 12%(d9)一 12% (d 12)。

图 11:不同培养规模的细胞生长曲线。细胞分别在 5L、 30L和 500L罐内培养，按以下方案添加 300S: 接种后 72小时开始补充 300S, 每 3天补充一次，每次添加剂量分别为本底体积的 6%(d3) -12%(d6) -12%(d9)— 6%(dl2)。

图 12:不同培养规模的细胞表达结果。细胞分别在 5L、 30L和 500L罐内培养，按以下方案添加 300S: 接种后 72小时开始补充 300S, 每 3天补充一次，每次添加剂量分别为本底体积的 6%(d3) -12%(d6) -12%(d9)— 6%(dl2)。具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，发现了一种含有高剂量营养成分的培养基，进一步地，发明人发现如果在大规模流加补液批次（Fed— batch)培养 CH0细胞的过程中，以一定的方式补充这种培养基，可以使细胞生长情况有非常显著地改善和提高。如本文所用， "浓缩培养液" 和 "含有高剂量营养成分的培养基" 可以互换使用，都是指在中国专利申请 CN200710085142.2所公开的用于大规模培养 CH0细胞的培养基的基础上，对某些成分的浓度进行了调整后所得到的培养基。在此，申请人也将中国专利申请 CN200710085142.2全文并入作为参考。

如本文所用， "普通培养基"是指上述中国专利申请 CN200710085142.2所公开的用于大规模培养 CH0细胞的培养基，它由以下成分组成：

维生素 C 10-25mg/L

转铁蛋白 5-18mg/L

乙醇胺 l-10mg/L

亚硒酸盐 0.01-0.045 mg/L

羟基丁酸钠 0.5-1.5mg/L

A1C1₃«6H₂0 0.5-2.5mg/L

AgN0₃ 0.02-0.045mg/L

CoCl₃«6H₂0 0.05-0.3mg/L

CuS0₄*5H₂0 0.002-0.004mg/L

KBr 0.0005-0.0008mg/L

FeS0₄*7H₂0 0.5-1.5mg/L

Na₂Si0₃ 0.005-0.045mg/L

LiCl 0.0005-0. OOlmg/L

NiCl₂«6H₂0 0.02-0.25 mg/L

SnCl₂«2H₂0 2.00-8. OOmg/L

ZnS0₄*7H₂0 0.5-2.5mg/L

维生素 B6 0.01-0.2mg/L

维生素 B12 0.01-0.5mg/L

生物素 0.05-0.18mg/L

叶酸 0.02-8. OOmg/L

核黄素 0.1-0.15mg/L

还原型谷胱甘肽 0.5-2.5mg/L

腺嘌吟 5.5-8.5 mg/L

鸟嘌吟 5.5-8.5 mg/L

尿嘧啶 5.5-8.5 mg/L 胸腺嘧啶 0.25-1.5mg/ '

胞嘧啶 5.5― 8.5mg/ 'L

核糖 2.0-8.5mg/ 'L

脱氧核糖 2.0-8.5mg/ 'L

Primatone 500-3500mg/ 'L

4-羟乙基哌嗪乙磺酸

500-3000mg/ '

(HEPES)

β-巯基乙醇 0.2_2mg/L。发明人在上述普通培养基的基础上，将以下表 1 成分剂量调整，构成本发明的浓缩培养液。配制方法同中国专利申请 CN 200710085142.2中所公开的方法，配制后调整 pH至 6.8-7.2，渗透压在 300-1000m0sm/kg之间。

表 1 浓缩培养液所需调整的成分及剂量

细胞培养过程中还要受到诸如细胞接种密度、浓缩培养液添加的方式和时间、 pH值、葡萄糖、通气等因素的影响和控制。 1. 细胞接种密度的影响

大规模细胞培养的起点非常重要。过高的起始密度会导致后续培养过程中没有更好的扩增空间，培养液中的营养供应及氧气的供应障碍，代谢废物积累严重，细胞活率提前下降，培养周期缩短，表达降低。过低的密度会使得后续培养无法达到需要的细胞数，培养周期长，密度低，表达少。我们的研究发现， 2X10⁵/ml— 2 X10⁶/ml 的密度是合适的密度，尤其是 3X10⁵/ml— lX10⁶/ml，最好是 5X10⁵/ml 的起始密度。以合适的密度接种后， 4一 7天后，细胞可达到最高密度，在 6X10⁶/ml 一 lX107ml左右，细胞活率在 90— 95%，可继续放大或进入批次培养。

2.浓缩培养液添加的方式和时间

在细胞接种 1一 5天后，细胞密度在 1一 5X10⁶/ml，开始添加浓缩培养液，该液体分次添加，添加总剂量为初始培养体积的 10%— 100%，尤其是 15— 60%，最佳的补充体积为初始培养体积的 30 %— 40 %。

补充的次数为每天 2次或每天 1次一每 5天一次，最佳的补液方式为每 3天 1 次。

每次补液量可以相同，也可以各不相同。补液时间总共 12天左右，前、后 3 天，补液量略少，补液剂量为补液总量的 30%— 50%，中间 6天的补液量为总量的 50%— 70%，优化的补液分布为 17%— 64%— 17% (前 3天一中间 6天一后期 3天）。

3. pH的控制

培养过程中， pH的控制至关重要，合适的 pH为 6.5-7.5之间，尤其是 6.7-7.3 之间，最佳的为 6.8-7.1之间。上罐初期，控制在 6.9— 7.1之间，控制的方式为补充（0₂或 ^11(0₃。在添加浓缩培养液后，细胞培养过程中 pH控制在 6.8-7.0之间，在培养后期，改回 6.9— 7.1之间。

4. 葡萄糖的控制

在批次培养中，合适的葡萄糖浓度非常重要，过低的糖浓度会导致细胞因 "饥饿" 死亡，过高的糖浓度会抑制细胞生长，增加渗透压，导致过多乳酸产生。每天通过补充 20%— 50%的葡萄糖溶液，使培养物中的葡萄糖浓度达到合适的范围至关重要。合适的葡萄糖浓度为 0.5-10g/L，尤其是 1一 5g/L，最佳的浓度为 2.5— 3.5g/L。

5.通气的调整

培养过程中可采用无泡通气或微泡通气。所通气体包括空气、氧气和二氧化碳。发酵罐自动调整空气和氧气的比例以维持溶氧在设定值周围。二氧化碳与发酵液的 pH相关联。在无泡通气时，通气量控制在每分钟 0.5-2个罐体积左右。在微泡通气情况下，通气量控制每分钟 0.001-0.01个罐体积，在有效控制 pH及溶氧的情况下，尽量减少通气量。本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。本发明的主要优点在于：

1、发现了一种可用于大规模培养 CH0细胞的浓缩培养液的配方；

2、将本发明提供的浓缩培养液有效应用于 Fed-batch大规模培养 CH0细胞过程中。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例 1

培养基 300F和 4种浓缩培养液的配制

在基础培养基 DMEM/F12培养基（购自 Sigma公司），在该培养基基础上，添加以下物质得到培养基 300F: 维生素 C

转铁蛋白

乙醇胺

亚硒酸盐

羟基丁酸钠

维生素：维生素 B12 0.38 mg/L

生物素 0. 12 mg/L

叶酸 3. 12 mg/L

核黄素 0. 12 mg/L

和以下物质：

还原型谷胱甘肽 0. 68 mg/L

腺嘌吟 6. 5 mg/L

鸟嘌吟 6. 5mg/L

尿嘧啶 6. 5 mg/L

胸腺嘧啶 0. 7 mg/L

胞嘧啶 6. 5 mg/L

核糖 2. 0 mg/L

脱氧核糖 2. Omg/L

HEPES (4-羟乙基哌嗪乙磺酸）

β -巯基乙醇 1. 5mg/L 在 300F的基础上，对以下成分进行调整，剂量如下表 2，形成浓缩培养液，共 4种，分别命名为 300S， 300S1, 300S2及 300S3。配制过程如下，以 80%— 90 %终体积的注射用水将粉剂溶解，充分搅拌 3— 4小时，测定 pH，以 lmol/L氢氧化钠或 lmol/L稀盐酸调整至 6.8-7.2，用注射用水定容至终体积。

表 2 4禾 f f¹浓缩培养液所需调整的成分及剂量

300S剂量 300S1剂量 300S2剂量 300S3剂量成分

(mg/L) (mg/L) (mg/L) (mg/L) 氯化钠 3000 1500 6599 2500 天冬氨酸 800 350 2000 500 天冬酰胺 2000 550 5000 4000 谷氨酸 1200 250 3000 2000 异亮氨酸 1500 500 500 1000 亮氨酸 1250 500 500 750 蛋氨酸 350 80 700 450 苯丙氨酸 450 200 1250 300 丝氨酸 5000 2000 7000 3500 苏氨酸 300 700 100 450 色氨酸 150 350 80 125 缬氨酸 200 400 400 300 精氨酸 450 300 1200 600 生物素 0. 1 0. 2 0. 05 0. 075 泛酸钙 35 10 70 50 氯化胆碱 30 90 10 30

叶酸 4 15 2 7 肌醇 200 25 500 75 烟酸胺 2 0. 5 5 1 核黄素 0. 2 0. 1 0. 5 0. 15 硫胺素 20 50 5 30 维生素 B6 0. 5 0. 1 2 1 实施例 2

补充添加 300S、 300SU 300S2、 300S3对细胞生长及表达的影响

细胞：若无特别说明，实施例中的细胞选自 sTNFR融合基因 CH0细胞（按中国发明专利 01 132074. 5实施例中公开的方法制备），下同。

细胞在种子罐内生长至对数生长期，以 5 X 10⁵/ml接种至 5L发酵罐，液体为 300F , 起始体积为罐工作体积的 60%，开始 fed-batch细胞培养过程。细胞培养过程的通气为无泡通气。细胞培养过程中 pH控制在 6. 8-7. 1之间，通过补充 7. 5%碳酸氢钠或通二氧化碳气体。每日测定培养液内的残糖浓度，并补充 30%的葡萄糖使罐内残糖至 2. 5-3. 5 克 /升。溶氧控制在 40— 60%，以氧气与压缩空气进行调节。后续补液分六种情况：一是只按需要补充葡萄糖和碱溶液，不额外补充其他营养成分；二是自接种后 72小时，每日补充 300F , 剂量为初始体积的 2%; 三是自接种后 72小时，每日补充 300S , 剂量为初始体积的 2%; 四是自接种后 72小时，每日补充 300S 1 , 剂量为初始体积的 2%; 五是自接种后 72小时，每日补充 300S2 , 剂量为初始体积的 2%;六是自接种后 72小时，每日补充 300S3 ,剂量为初始体积的 2%;。每日对罐内活细胞进行计数。细胞培养终点为完成细胞培养 15天或活细胞低于 10 X 10⁵/ml。细胞培养结束后取培养上清，经 ELI SA方法对表达蛋白进行浓度测定。

结果：如图 1所示，不进行任何液体补充，细胞无法维持至第 15天，补充 300F 后，细胞能维持到第 15 天，但不能达到高水平，而补充 300S、 300S 1、 300S2 及 300S3后，活细胞的密度增加明显，维持时间显著延长，其中补充 300S 的效果最佳。图 2结果显示补充 300S、 300S 1、 300S2、 300S3后，细胞的表达量结果，其中 300S对该细胞 fed-batch细胞培养过程帮助效果最佳。实施例 3

300S剂量与细胞生长及表达比较

细胞在种子罐内生长至对数生长期，以 5 X 10⁵/ml接种至 5L发酵罐，液体为 300F , 起始体积为罐工作体积的 60%，开始 fed-batch细胞培养过程。细胞培养过程的通气为无泡通气。细胞培养过程中 pH控制在 6. 8-7. 1之间，通过补充 7. 5%碳酸氢钠或通二氧化碳气体。每日测定培养液内的残糖浓度，并补充 30%的葡萄糖使罐内残糖至 2. 5-3. 5 克 /升。溶氧控制在 40— 60%，以氧气与压缩空气进行调节。自接种后 72小时，每日补充 300S , 每日补充剂量分别为初始罐体积的 1%， 2%， 3%， 4%和 5%，每日对罐内活细胞进行计数。细胞培养终点为完成细胞培养 15天或活细胞低于 10 X 10⁵/ml。细胞培养结束后取培养上清，经 ELI SA方法对表达蛋白进行浓度测定。

结果：如图 3所示，按 3%比例补充 300S , 活细胞的密度最高，图 4结果显示其表达量也最高，因此，按初始细胞培养体积 3%的比例每日补充 300S 对该细胞 fed-batch细胞培养过程的帮助最显著。实施例 4

300S初始补充时间与细胞生长及表达的关系

细胞在种子罐内生长至对数生长期，以 5 X 10⁵/ml接种至 5L发酵罐，液体为 300F , 起始体积为罐工作体积的 60%，开始 fed-batch细胞培养过程。细胞培养过程的通气为无泡通气。细胞培养过程中 pH控制在 6. 8-7. 1之间，通过补充 7. 5%碳酸氢钠或通二氧化碳气体。每日测定培养液内的残糖浓度，并补充 30%的葡萄糖使罐内残糖至 2. 5-3. 5 克 /升。溶氧控制在 40— 60%，以氧气与压缩空气进行调节。分别在自接种后 1天， 2天， 3天， 4天和 5天开始每日补充 300S , 每日补充剂量分别为初始罐体积的 3%，每日对罐内活细胞进行计数。细胞培养终点为完成细胞培养 15天或活细胞低于 10 X 10⁵/ml。细胞培养结束后取培养上清，经 ELI SA方法对表达蛋白进行浓度测定。

结果：如图 5所示，自第 3天开始补充 300S , 活细胞的密度最高，图 6结果显示其表达量也最高，因此，自第 3天开始补充 300S对该细胞 fed-batch细胞培养过程的帮助最显著。实施例 5

300S补充间隔时间与细胞生长及表达的关系

细胞在种子罐内生长至对数生长期，以 5 X 10⁵/ml接种至 5L发酵罐，液体为 300F , 起始体积为罐工作体积的 60%，开始 fed-batch细胞培养过程。细胞培养过程的通气为无泡通气。细胞培养过程中 pH控制在 6. 8-7. 1之间，通过补充 7. 5%碳酸氢钠或通二氧化碳气体。每日测定培养液内的残糖浓度，并补充 30%的葡萄糖使罐内残糖至 2. 5-3. 5 克 /升。溶氧控制在 40— 60%，以氧气与压缩空气进行调节。分别在自接种后 72小时开始补充 300S , 共分五种不同补充方法，分别为：一是每 12小时补液一次，每次补充量为初始罐内液体量的 1. 5%; 二是每日补液一次，每次补充量为初始罐内液体量的 3%; 三是每 2 日补液一次，每次补充量为初始罐内液体量的 6%; 四是每 3天补液一次，每次补充量为初始罐内液体量的 9%; —是每 4天补液一次，每次补充量为初始罐内液体量的 12%。每日对罐内活细胞进行计数。细胞培养终点为完成细胞培养 15天或活细胞低于 10 X 10⁵/ml。细胞培养结束后取培养上清，经 ELI SA方法对表达蛋白进行浓度测定。结果：如图 7所示， 72小时后开始补充 300S，每日补液二次、每日一次，每二日补液一次及每三日补液一次，四种情况下活细胞的密度接近，图 8结果显示四组表达量也差异不大，只有每四日补液一次的情况下，细胞密度明显降低，表达明显下降。结合操作以简单为佳，因此，自接种后 72 小时开始，每三天补充 300S 一次是最佳的补充方式。实施例 6

300S不同补充方案与细胞生长及表达的关系

细胞在种子罐内生长至对数生长期，以 5 X 10⁵/ml接种至 5L发酵罐，液体为 300F , 起始体积为罐工作体积的 60%，开始 fed-batch细胞培养过程。细胞培养过程的通气为无泡通气。细胞培养过程中 pH控制在 6. 8-7. 1之间，通过补充 7. 5%碳酸氢钠或通二氧化碳气体。每日测定培养液内的残糖浓度，并补充 30%的葡萄糖使罐内残糖至 2. 5-3. 5 克 /升。溶氧控制在 40— 60%，以氧气与压缩空气进行调节。自接种后 72小时开始补充 300S，每 3天补充一次，补充的总量一致，均为初始体积的 36 %，共有四种不同补充方法，如下表 3所示。每日对罐内活细胞进行计数。细胞培养终点为完成细胞培养 15天或活细胞低于 10 X 10⁵/ml。细胞培养结束后取培养上清，经 ELI SA方法对表达蛋白进行浓度测定。

表 3 300S的 4种补充方案

结果：如图 9所示， 72小时后开始补充 300S , 每 3 日补液一次、方案一及方案二的活细胞的密度接近，方案三及方案四的密度较低，图 10结果显示方案二的表达最高。实施例 7

细胞培养过程的放大

为进一步验证 300S对细胞的作用，我们在不同规模的发酵罐中对上述过程进行了放大，主要是 5 30L和 500L。细胞在种子罐内生长至对数生长期，以 5 X 10⁵/ml 接种至发酵罐，液体为 300F , 起始体积为罐工作体积的 60%，开始 fed-batch细胞培养过程。 5L罐细胞培养过程的通气为无泡通气， 30L和 250L罐为微泡通气。细胞培养过程中 pH控制在 6. 8-7. 1之间，通过补充 7. 5%碳酸氢钠或通二氧化碳气体。每日测定培养液内的残糖浓度，并补充 30%的葡萄糖使罐内残糖至 2. 5-3. 5克 /升。溶氧控制在 40— 60%，以氧气与压缩空气进行调节。自接种后 72小时开始补充 300S , 每 3天补充一次，第三天的补充量为初始体积的 6 %，第六天的补充量为初始体积的 12 %，第九天的补充量为初始体积的 12 %，第十二天的补充量为初始体积的 6 %。每日对罐内活细胞进行计数。细胞培养终点为完成细胞培养 15天或活细胞低于 10 X 10⁵/ml。细胞培养结束后取培养上清，经 ELI SA方法对表达蛋白进行浓度测定。

结果：如图 1 1及图 12所示，不同的细胞培养规模及不同的通气方式均获得了相似的生长曲线及表达量，对于该细胞，该浓缩培养液及其补充添加方式可放大至中试或生产规模中应用。本发明的发明人还选用另外 2种细胞：表达 SCTLA4融合蛋白的 CH0细胞和表达人源化抗 HER2 单克隆抗体的 CH0 细胞（分别按中国发明专利 01 132075. 3 和 01 132225. X 的实施例中公开的方法制备），并根据上述两种细胞的代谢特性分别配制了 300S-1 (替换 300S用于培养表达 SCTLA4融合蛋白的 CH0细胞）和 300S-2 (替换 300S用于培养表达人源化抗 HER2单克隆抗体的 CH0细胞）的浓缩培养液，见表 4。然后，用 300S-1和 300S-2分别替换 300S , 按照上述实施例 2_7中的方法重复验证，并得到了相同的实验结果。说明本发明中的浓缩培养液及其添加方式同样可以将其他 CH0细胞放大至中试或生产规模中应用。

表 4 2种浓缩培养液所需调整的成分及剂量

肌醇 120 150 烟酸胺 1. 5 2

核黄素 0. 2 0. 15

硫胺素 24 12

维生素 B6 0. 25 0. 25 无论是细胞培养过程中的普通培养基，还是细胞进行补液批次培养过程中需要添加的浓缩培养液，其成分和浓度的变化都与培养的特定细胞株相关。针对特定细胞株配制的普通培养基和 /或浓缩培养液当然对该细胞具有更优的培养效果，例如上述实施例中针对 sTNFR融合基因 CH0细胞的 300S、针对表达 sCTLA4融合蛋白的 CH0细胞的 300S- 1和针对表达人源化抗 HER2单克隆抗体的 CH0细胞的 300S_2。本发明的浓缩培养液由于含有一般细胞生长所必备的组分，因此用于一般细胞株的细胞培养，细胞生长情况也可以得到显著地改善和提高。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

权利要求

1.一种用于大规模培养中国仓鼠卵巢细胞的浓缩培养液，它由基础培养基和添加物构成，按浓縮培养液的总体积计，所述的添加物由以下成分组成：

维生素 c 10-25mg/L

转铁蛋白 5-18mg/L

乙醇胺 l-10mg/L

亚硒酸盐 0.01-0.045 mg/L

羟基丁酸钠 0.5-1.5mg/L

A1C1₃«6H₂0 0.5-2.5mg/L

AgN0₃ 0.02-0.045mg/L

CoCl₃«6H₂0 0.05-0.3mg/L

CuS0₄*5H₂0 0.002-0.004mg/L

KBr 0.0005-0.0008mg/L

FeS0₄*7H₂0 0.5-1.5mg/L

Na₂Si0₃ 0.005-0.045mg/L

LiCl 0.0005-0. OOlmg/L

NiCl₂»6H₂0 0.02-0.25 mg/L

SnCl₂«2H₂0 2.00-8. OOmg/L

ZnS0₄*7H₂0 0.5-2.5mg/L

维生素 B6 0.01-0.2mg/L

维生素 B12 0.01-0.5mg/L

生物素 0.05-0.18mg/L

叶酸 0.02-8. OOmg/L

核黄素 0.1-0.15mg/L

还原型谷胱甘肽 0.5-2.5mg/L

腺嘌吟 5.5— 8.5 mg/L

鸟嘌吟 5.5-8.5 mg/L

尿嘧啶 5.5-8.5 mg/L

胸腺嘧啶 0.25-1.5mg/L

胞嘧啶 5.5— 8.5mg/L

核糖 2.0-8.5mg/L

脱氧核糖 2.0-8.5mg/L

Primatone 500- 3500mg/L
4-羟乙基哌嗪乙磺酸

500- 3000mg/L

(HEPES)

β -巯基乙醇 0.2-2mg/L,

其特征在于，所述浓缩液中如下所示的成分的浓度为:

1000— 9000mg/L 氯化钠 200-4000 mg/L 天冬氨酸

200-9000 mg/L 天冬酰胺

o

o

1 谷氨酸

200-3 o000 mg/L 异亮氨酸

300— 4500 mg/L 亮氨酸

50-1000 mg/L 蛋氨酸

100-2000 mg/L 苯丙氨酸

500—10000 mg/L 丝氨酸

50-1500 mg/L 苏氨酸

25-1000 mg/L 色氨酸

40-1000 mg/L 缬氨酸

150-2000 mg/L 精氨酸

0.01-0.5 mg/L 生物素

2-100 mg/L 泛酸钙

3-270 mg/L 氯化胆碱

1-30 mg/L 叶酸

5-900 mg/L 肌醇

0.1-10 mg/L 烟酸胺

0.01-1 mg/L 核黄素

1-100 mg/L 硫胺素

禾口 0.01_5 mg/L 维生素 B6。
2.如权利要求 1所述的浓缩培养液，其特征在于，所述浓缩液中如下所示的成分的浓度为：

1500- -6599 mg/L 氯化钠

350- 2000 mg/L 天冬氨酸

550— 5000 mg/L 天冬酰胺

250- 3000 mg/L 谷氨酸

500- 2500 mg/L 异亮氨酸

500- 2500 mg/L 壳 ¾ @¾

80- 700 mg/L 蛋氨酸

200- 1250 mg/L 苯丙氨酸

2000- -7000 mg/L 丝氨酸

100- -700 mg/L 苏氨酸

80- 350 mg/L 色氨酸

80- 400 mg/L 缬氨酸

300- 1200 mg/L 精氨酸

0.05 - 0.2 mg/L 生物素

10- -70 rag/L 泛酸钙

10- 120 mg/L 氯化胆碱 2-15 mg/L 叶酸

25-500 mg/L 肌醇

0.5-5 rag/L 烟酸胺

0.1-0.5 mg/L

5-50 mg/L 硫胺素

禾口 0.1_2 mg/L 维生素 B6。
3.—种如权利要求 1所述的浓缩培养液的制备方法，它包括以下步骤：将基础培养基和添加物混合，按浓缩培养液的总体积计，所述的添加物由以下成分组成：维生素 c 10-25mg/L

转铁蛋白 5— 18mg/L

乙醇胺 l-10mg/L

亚硒酸盐 0.01-0.045 mg/L

羟基丁酸钠 0.5—1.5mg/L

A1C1₃«6H₂0 0.5-2.5mg/L

AgN0₃ 0.02-0.045mg/L

CoCl₃«6¾0 0.05-0.3mg/L

CuS0₄*5H₂0 0.002-0.004mg/L

0.0005-

KBr

0.0008mg/L

FeS0₄*7H₂0 0.5-1.5mg/L

Na₂Si0₃ 0.005-0.045mg/L

LiCl 0.0005-0. OOlmg/L

NiCl₂«6H₂0 0.02-0.25 mg/L

SnCL«2H₂0 2.00-8. OOmg/L

ZnS0₄*7H₂0 0.5-2.5mg/L

维生素 B6 0.01-0.2mg/L

维生素 B12 0.01-0.5mg/L

生物素 0.05-0.18mg/L

叶酸 0.02-8. OOmg/L

核黄素 0.1-0.15mg/L

还原型谷胱甘肽 0.5-2.5mg/L

腺嘌吟 5.5-8.5 mg/L

鸟嘌呤 5.5— 8.5 mgv'L

尿嘧啶 5.5— 8.5 mg/L

胸腺嘧啶 0.25-1.5mg/L

胞嘧啶 5.5-8.5mg/L

核糖 2.0-8.5mg/L

脱氧核糖 2.0-8.5mg/L

Primatone 500-3500mg/L 4-羟乙基哌嗪乙磺

o 500-3000mg/L

酸 (HEPES)

o

β-巯 1基乙醇 0.2-2mg/L，

o

其特征在于，将如下所示的成分的浓度调整为:

1000— 9000mg/ /L 氯化钠

200-4000 mg/ 'L 天冬氨酸

200-9000 mg/ 'L 天冬酰胺

100-5000 mg/ 'L 谷氨酸

200-3000 mg/ 'L 异亮氨酸

300-4500 mg/ 'L 亮氨酸

50-1000 mg/ L 蛋氨酸

100-2000 mg/ 'L 苯丙氨酸

500-10000 mg /L 丝氨酸

50-1500 mg/ L 苏氨酸

25—1000 mg/ L 色氨酸

40—1000 mg/ L 缬氨酸

150-2000 mg/ 'L 精氨酸

'L 生物素

2-100 mg/L 泛酸钙

3-270 mg/L 氯化胆碱

1-30 mg/L 叶酸

5-900 mg/L 肌醇

0.1-10 mg/L 烟酸胺

0.01-1 mg/L 核黄素

1-100 mg/L 硫胺素

禾口 0.01_5 mg/ Ί 维生素 B6;

优选地，所述的基础培养基是 Dulbecco' s改良 Eagle' s培养基（DMEM) 。
4.一种如权利要求 1所述的浓缩培养液的使用方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

在细胞接种 1一 5天后添加如权利要求 1所述的浓缩培养液，添加的总剂量为初始培养体积的 10— 100%; 所述的细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
5.如权利要求 4所述的方法，其特征在于，所述的细胞接种密度为 2X10<sup>5</sup>/ml —2X 10<sup>6</sup>/ml。
6.如权利要求 4 所述的方法，其特征在于，所述的中国仓鼠卵巢细胞株选自 sTNFR融合基因中国仓鼠卵巢细胞、表达 SCTLA4融合蛋白的中国仓鼠卵巢细胞、或表达人源化抗 HER2单克隆抗体的中国仓鼠卵巢细胞。
7.如权利要求 4 所述的方法，其特征在于，添加的总剂量为初始培养体积的 15-60%
8.如权利要求 4所述的方法，其特征在于，每日添加浓缩培养液 1一 5次或每 1 - 5 日添加浓缩培养液 1次；优选每日添加浓缩液 2— 4次或每 2— 4 日添加浓缩培养液 1次。
9.如权利要求 4所述的方法，其特征在于，共添加浓缩培养液 5— 20天；优选共添加浓缩培养液 8— 16天。
10.如权利要求 4所述的方法，其特征在于，每次添加的浓缩培养液体积相同，或在刚开始的 1一 5天添加所添加的浓缩培养液的重量的 15— 25 %，中间 3— 9天添加所添加的浓缩培养液的重量的 50— 70 %，最后 1一 5天添加所添加的浓缩培养液的重量的 15— 25 %。