CN101250507A - 利用重组大肠杆菌高效生产丙酮酸氧化酶的分批式补料发酵工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种发酵生产丙酮酸氧化酶的分批式补料发酵工艺，所述的方法包括：在约37℃的培养温度下，培养含有丙酮酸氧化酶表达盒的重组大肠杆菌，从而表达丙酮酸氧化酶；和当所述的重组大肠杆菌初始生长阶段结束后，将温度由约37℃降低至约32℃，并开始补料，控制溶氧水平在30－40％之间，以后每隔4小时降温约1℃，到32℃后保持恒温，至发酵结束。本发明的方法在成本不变的情况下，大大提高了丙酮酸氧化酶的产量，且发酵过程易于控制，因而具有极好的产业应用价值。

Description

利用重组大肠杆菌高效生产丙酮酸氧化酶的分批式补料发酵工艺

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及重组大肠杆菌高效表达丙酮酸氧化酶的分批式补料发酵工艺。

背景技术

丙酮酸氧化酶(Pyruvate oxidase，EC 1.2.3.3)是一种非常重要的临床诊断用酶，其最重要的应用是用于血液中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的活力测定；此外还可以用于丙酮酸测定、丙酮酸激酶活性测定等。

目前商业化生产的丙酮酸氧化酶主要来源于野生型植物乳杆菌和绿色气球菌，酶产量仅有120U/L，发酵水平低下，导致丙酮酸氧化酶市场价格高居不下。

由于丙酮酸氧化酶具有广泛的应用价值，因此进一步提高其产量是非常有意义的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生产丙酮酸氧化酶的方法，所述方法可大大提高丙酮酸氧化酶的产量，成本低廉。

在本发明的第一方面，提供一种发酵生产丙酮酸氧化酶的方法，所述的方法包括：

(1)在37±1℃的培养温度下，培养含有丙酮酸氧化酶表达盒的重组大肠杆菌，从而表达丙酮酸氧化酶；和

(2)当所述的重组大肠杆菌初始生长阶段结束后，将温度由37±1℃降低到32±2℃(优选32±1℃)，保持该温度至发酵结束。

在本发明的优选例中，所述的生产丙酮酸氧化酶的方法是一种分批式补料发酵的工艺。

在另一优选例中，在步骤(2)中，当所述的重组大肠杆菌初始生长阶段结束后，采用梯级降温的方式将温度由37±1℃逐渐降低到32±2℃(优选32±1℃)，至发酵结束。

在另一优选例中，当所述的重组大肠杆菌初始生长阶段结束后，降温1±0.2℃；之后每隔4±1小时降1±0.2℃，直至温度为32±1℃后保持恒温，至发酵结束。

在另一优选例中，当所述的重组大肠杆菌初始生长阶段结束后，降温1℃；之后每隔4小时降1℃，直至温度为32℃后保持恒温，至发酵结束。

在另一优选例中，所述的重组大肠杆菌是E.coli DH5α/pSMLPyOD。

在另一优选例中，培养含有丙酮酸氧化酶表达盒的重组大肠杆菌所用的初始培养基含有：

甘油6-18ml/L；蛋白胨12-20g/L；酵母提取物10-16g/L；硫酸铵3-7g/L；硫酸镁1-4g/L；磷酸盐4-8g/L；氯化钠6-15g/L。

在另一优选例中，所述的磷酸盐组成为：磷酸二氢钾∶磷酸氢二钠∶磷酸氢二钾＝1∶2∶1。

在另一优选例中，所述的培养基中还含有微量元素1-2.2ml/L；其中所述的微量元素含有：FeSO₄·7H₂O 12.8±3g/L；ZnSO₄·7H₂O 2.84±1g/L；CuSO₄.5H₂O1.6±0.5g/L；MnSO₄·H₂O 3.2±1g/L；CaCl₂0.28±0.08g/L；CoCl₂·6H₂O 1.6±0.5g/L；H₃BO₄ 0.24±0.08g/L；Na₂MoO₄12.8±3g/L；和KI 0.16±0.05g/L。

在另一优选例中，当所述的重组大肠杆菌初始生长阶段结束后，开始补充补料培养基。

在另一优选例中，所述的补料培养基含有：甘油，20±5％，蛋白胨，4±1％，酵母提取物，3±1％，硫酸铵，1±0.3％，磷酸盐，1.4±0.4％，微量元素母液，0.125±0.03％。

在另一优选例中，补料培养基的补充速率为0.2±0.1ml/min/L。

在另一优选例中，在重组大肠杆菌发酵过程中，以氨水控制pH在6.5-7.1。

在另一优选例中，发酵的时间是40±10小时(较佳的为40±5小时)。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1.实施例1发酵过程及产酶曲线。其中，

图1A显示了发酵过程中的生物量，甘油剩余量和温度的变化。

图1B显示了发酵过程中丙酮酸氧化酶(PyOD)的产量。

图2.实施例2发酵过程及产酶曲线。

图2A显示了发酵过程中的生物量，甘油剩余量和温度的变化。

图2B显示了发酵过程中丙酮酸氧化酶(PyOD)的产量。

图3.实施例3的产酶曲线，显示了发酵过程中丙酮酸氧化酶(PyOD)的产量。

具体实施方式

本发明在利用组成型大肠杆菌工程菌发酵生产丙酮酸氧化酶的过程中，发现一种有效提高丙酮酸氧化酶产量的发酵方法，即通过在发酵过程的不同阶段中控制发酵液不同温度的方法，使得大肠杆菌工程菌菌体的生长、代谢和生产处于理想的状态，从而大大提高了丙酮酸氧化酶的产量。

如本发明所用，“组成型大肠杆菌工程菌”指构成表达系统的宿主菌和表达质粒均不含lac I^q基因，不产生阻遏蛋白，不需要IPTG诱导或温度诱导就可以持续地表达外源蛋白；其不同于“诱导型大肠杆菌工程菌”。

如本发明所用，“发酵”即指培养所述携带表达载体(所述载体中含有丙酮酸氧化酶基因)的大肠杆菌，使其生产丙酮酸氧化酶。更特别的，“发酵”为一种较大规模的生产过程，如发酵规模为0.5-10000升，更特别的，发酵规模为0.5-1000升，如发酵规模可以是1升、2升、5升、10升、100升、1000升等。

因此本发明提供一种发酵生产丙酮酸氧化酶的方法，所述的方法包括：(1)在优选37±1℃的培养温度下，培养含有丙酮酸氧化酶表达盒的重组大肠杆菌，从而表达丙酮酸氧化酶；和(2)当所述的重组大肠杆菌初始生长阶段结束后，将温度由37±1℃降低到32±2℃(优选32±1℃)，保持该温度至发酵结束。

本发明人发现，在重组大肠杆菌的发酵过程中，质粒稳定性对于产物表达非常重要。进一步的研究发现，在较高的温度(如约37℃)下，重组大肠杆菌质粒稳定性较高；而与此相反，在较低的温度下(如约28-32℃)，则更有利于丙酮酸氧化酶的表达。因此，本发明人采用以下策略来优化表达：使重组大肠杆菌初始生长阶段控制在较高温度，初始生长阶段后降低发酵温度，结果发现，与恒温(如一直在约37℃；或一直在约32℃)发酵相比，该策略下生产丙酮酸氧化酶的产量可有较大的提高(可超过1000U/L)。

进一步地，由于批发酵菌体浓度总体较低，丙酮酸氧化酶发酵单位很难得到提高。在发酵过程中，当所述的重组大肠杆菌初始生长阶段结束后，在补料阶段，本发明人采用阶段式逐步降温的方式，逐渐将温度从约37℃降低到约32℃，结果发现，采用该工艺能够避免因温度骤降引起的细胞生长代谢停止，使细胞保持较快的比生长速度和较高的表达水平。采用阶段式逐步降温的方式，可以在一个发酵周期内，将重组大肠杆菌的菌体浓度提高到140(OD₆₀₀)以上；并且，与一次性降温相比，丙酮酸氧化酶产量有非常显著的提高(可超过3000U/L)。

因此，作为本发明的优选方式，在步骤(2)中，当所述的重组大肠杆菌初始生长阶段结束后，在补料阶段采用梯级降温的方式将温度由37±1℃逐渐降低到32±2℃(优选32±1℃)，保持该温度直至发酵结束。更优选的，当所述的重组大肠杆菌初始生长阶段结束后，降温1±0.2℃，开始补料；之后每隔4±1小时降1±0.2℃，直至温度为32±1℃后恒温至发酵结束。最优选的，当所述的重组大肠杆菌初始生长阶段结束后，降温1℃，开始补料；之后每隔4小时降1℃，直至温度为32℃后恒温至发酵结束。

所述的初始生长阶段是指重组大肠杆菌菌体以初始培养基为营养源生长的阶段，在该阶段不补加任何营养源，主要控制发酵温度为37±1℃，溶氧水平为30-40％，和pH为6.5-7.1，而当初始生长阶段结束时，菌体耗氧量快速降低，从而培养液中溶氧迅速上升，从30-40％上升到70-80％。因此，在转速及通气量不变条件下，且溶氧从30-40％快速上升到70-80％时可代表初始生长阶段的结束。

作为本发明的优选方式，在发酵起始后10-15小时初始生长阶段结束，更特别的，在发酵起始后11-12小时初始生长阶段结束。

可用于生产丙酮酸氧化酶的重组大肠杆菌中含有至少一个表达载体(质粒)，并且，所述的表达载体中含有丙酮酸氧化酶的表达盒。所述的表达盒含有与启动子操作性相连的丙酮酸氧化酶基因，本领域人员了解如何在适当的表达载体中构建可表达丙酮酸氧化酶的基因表达盒。

在本发明中，对用于表达丙酮酸氧化酶的表达载体没有限制，可以是任何适于转化进入大肠杆菌并且表达丙酮酸氧化酶的组成型表达载体。优选的表达载体是pSML。可采用常规的技术，将丙酮酸氧化酶基因克隆入表达载体的多克隆位点中，构建含有丙酮酸氧化酶表达盒的重组表达载体；再通过常规方法，将重组表达载体转化宿主菌。

在本发明的一种优选方式中，使用的重组大肠杆菌是E.coli DH5α/pSMLPyOD。本领域人员易于理解的是，采用其它一些组成型表达载体构建的表达丙酮酸氧化酶的重组大肠杆菌也可被用于本发明。

用于配制发酵培养基的原料(如碳源、磷源、有机氮源、无机盐、微量元素)及其使用量可根据本领域常规利用重组大肠杆菌生产丙酮酸氧化酶时所用的原料及使用量而定，只要所述的发酵培养基能够为重组大肠杆菌生长、代谢和生产提高足够的营养成分，且不带来不良影响(如阻遏作用)或副作用(或产生副产物)。

作为本发明的优选方式，培养含有丙酮酸氧化酶表达盒的重组大肠杆菌所用的初始培养基含有：甘油6-18ml/L；蛋白胨12-20g/L；酵母提取物10-16g/L；硫酸铵3-7g/L；硫酸镁1-4g/L；磷酸盐4-8g/L；氯化钠6-15g/L。其中，较佳的磷酸盐的组成为：磷酸二氢钾∶磷酸氢二钠∶磷酸氢二钾＝1∶2∶1。更佳的，所述的培养基中还含有微量元素。

在重组大肠杆菌初始生长阶段结束后，营养源消耗殆尽，发酵进入补料阶段。补料培养基可通过流加或批加的方式补充，补料速率以能够维持菌体生长及表达丙酮酸氧化酶所需，且以维持发酵系统中较稳定的溶氧和pH值为依据。作为本发明的一种优选方式，补料的补充速率0.2±0.1ml/min/L，所述的补料培养基含有：甘油，20±5％，蛋白胨，4±1％，酵母提取物，3±1％，硫酸铵，1±0.3％，磷酸盐，1.4±0.4％，微量元素母液，0.125±0.03％。

培养重组大肠杆菌的其它条件，可采用本领域已知的条件。对于通气量、搅拌速度等条件，本领域人员也可根据经验以及发酵的规模来进行适当的变通。

在重组大肠杆菌发酵过程中，通常控制pH在6.5-7.1。

作为本发明的优选方式，在发酵过程的大部分时间内，发酵系统中的溶氧水平控制在30-40％。

作为本发明的一种较为优选的实施方式，在37±1℃的培养温度下，培养含有丙酮酸氧化酶表达盒的重组大肠杆菌，通过调节搅拌转速及通气量控制发酵过程溶氧水平在30-40％之间，控制pH6.8±0.2。发酵11-12小时后，初始生长阶段结束，温度调至35℃，开始补料，补料速率为0.2ml/min/L，4小时后温度调至34℃，以后每隔4小时降1℃，直至温度降为32℃后保持恒定。控制发酵过程溶氧水平在30-40％之间，控制pH6.7±0.1。

在发酵培养结束后，还可包括步骤：从发酵培养基中分离或纯化丙酮酸氧化酶。从培养产物中分离或纯化丙酮酸氧化酶可采用本领域技术人员熟知的蛋白分离纯化技术。例如可采用硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose离子交换、凝胶过滤法纯化；或采用亲和层析法纯化。

本发明的主要优点在于：

(1)首次发现可通过在初始生长阶段结束后梯级降温的方式来显著增加组成型大肠杆菌发酵生产丙酮酸氧化酶的产量。

(2)本发明的方法在成本不变的情况下，大大提高了丙酮酸氧化酶的产量，且发酵过程易于控制，因而具有极好的产业应用价值。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

I.材料与方法

1.菌株

大肠杆菌基因工程菌DH5d/pSMLPyOD。该工程菌能够组成型表达丙酮酸氧化酶。

从绿色气球菌(Aerococcus viridans)ATCC 10400基因组中扩增得到丙酮酸氧化酶基因。

上游引物(SEQ ID NO：1)：

5-CATGCCATGGGAATGCATCACCATCACCATCACTCAGATAACAAAATTAACATC-3(划线部分为NcoI酶切位点，同时添加对应9个氨基酸残基MGMHHHHHH(SEQ ID NO：3)的核苷酸序列，可用于Ni亲和层析)；

下游引物(SEQ ID NO：2)：

5-CGCGGATCCTTATCATTTGATGTATTTAGATTCTAAGCCTTCAGC-3(划线部分为BamHI酶切位点)。

以Aerococcus viridans ATCC 10400基因组为模板，采用以上引物对，PCR扩增得到AvPyOD基因，鉴定PCR扩增产物，经鉴定获得序列正确的AvPyOD扩增产物。常规方法纯化该PCR扩增产物。

用限制性内切酶NcoI和BamHI酶切上述PCR扩增产物，将酶切后的产物连接入经过NcoI和BglII酶切的质粒pSML104(购自中国科学院生化细胞所)中，获得重组表达质粒pSMLPyOD。

采用常规的方法，将重组质粒pSMLPyOD转化E.coli DH5α感受态细胞。由于转化有重组表达质粒pSMLPyOD的目的转化子表达丙酮酸氧化酶，丙酮酸氧化酶催化丙酮酸产生过氧化氢，过氧化氢从菌体细胞渗透到胞外，在辣根过氧化物酶的酶催化下，过氧化氢与联大茴香胺作用产生棕褐色色素物质，从而使阳性转化子形成棕褐色的菌落。因此，将上述转化后的细胞在含四环素的选择性指示平板上生长的菌落置4℃显色，具有四环素抗性又呈现棕褐色的菌落即为含有表达质粒pSMLPyOD的细胞，经验证该重组细胞能够组成型表达丙酮酸氧化酶。

2.生物反应器

本实验使用的发酵罐为上海国强生化工程装备有限公司生产的FMG-5L发酵罐。

3.培养基

(1)种子培养基(LB)

1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，调节pH 7.0，121℃灭菌20分钟。

(2)发酵罐初始培养基

蛋白胨2％，酵母提取物1.5％，甘油1％，硫酸铵0.5％，磷酸盐0.7％，微量元素母液0.125％，NaCl 1％，调节pH至7.2，加泡敌(0.1mL/L)，121℃灭菌30分钟。MgSO₄2％，单独灭菌。初始装液量2.5升。

其中，磷酸盐组成为：

磷酸二氢钾∶磷酸氢二钠∶磷酸氢二钾＝1∶2∶1；

微量元素母液组成为：

FeSO₄·7H₂O 6.4g，ZnSO₄·7H₂O 1.42g，CuSO₄·5H₂O 0.8g，MnSO₄·H₂O1.6g，CaCl₂0.14g，CoCl₂·6H₂O 0.8g，H₃BO₄0.12g，Na₂MoO₄6.4g，KI 0.08g，浓硫酸调节至溶解，去离子水定容至500ml。

(3)补料培养基

甘油，20％，蛋白胨，4％，酵母提取物，3％，硫酸铵，1％，磷酸盐，1.4％，微量元素母液，0.125％。

实施例1发酵至初始生长阶段结束时梯度降温的发酵工艺

甘油管保存的E.coli DH5d/pSMLPyOD种子经LB培养基活化12小时后，按10％接种量接入发酵罐。发酵罐参数设置：温度为37℃，初始通气量为5L/min，初始搅拌转速300rpm，初始溶氧(DO)为100％。通过调节搅拌转速及通气量控制发酵过程溶氧水平在30-40％之间，氨水控制pH7。

发酵11-12小时左右，溶氧开始上升，当上升至70-80％时，表明初始生长阶段结束，此时温度调至35℃，开始补料，补料速率为0.2ml/min/L，4小时后温度调至34℃，以后每隔4小时降1℃，直至温度降为32℃后保持恒定。通过调节搅拌转速及通气量控制发酵过程溶氧水平在30-40％之间，氨水控制pH6.7±0.1。

采用此发酵工艺，40小时发酵终了时，菌体浓度(OD₆₀₀)达到140，丙酮酸氧化酶产量可以达到3100U/L。发酵过程曲线见图1。

实施例2发酵至初始生长阶段结束时一次性降温的发酵工艺

培养基及初始发酵阶段同实施例1。

发酵至11-12小时，溶氧开始上升，当上升至70-80％时，表明初始生长阶段结束，此时发酵温度调节至32℃。搅拌转速降至450RPM，补入少量补料培养基(5-10ml)，2-3小时后，细胞开始生长代谢，溶氧下降，当溶氧再次回升时，开始补料，补料速率0.1mL/min/L，溶氧降至30％以下时，通过增加转速和通气量控制到30-40％。氨水控制pH6.7±0.1，若pH自发上升至7，说明补料速率过低，此时适当提高补料速率。转速达到600RPM，通气量15L/min，补料速率达0.2mL/min/L时，保持稳定状态，直至发酵终了。

采用此发酵工艺，34小时后菌体浓度不再增加，发酵终了，OD₆₀₀达到60，丙酮酸氧化酶产量可以达到1600U/L。发酵过程曲线见图2。

实施例3发酵过程中均采用37℃的发酵工艺

培养基同实施例1。发酵11-12小时，初始生长阶段结束，溶氧开始上升，保持发酵温度37℃不变，当溶氧上升至60％以上时，开始补料，补料速率为1ml/min，恒速补料，直至发酵结束。通过调节搅拌转速及通气量控制发酵过程溶氧水平在30-40％之间，氨水控制pH6.7±0.2。

采用此发酵工艺，24小时后，菌浓不在增加，发酵终了，菌体浓度(OD₆₀₀)达到60，丙酮酸氧化酶产量在12小时达到最高1200U/L，之后又有下降。发酵过程曲线见图3。

实施例4采用初始发酵培养基2的培养

本发明人还设计了另一组发酵培养基如下：

初始发酵培养基2：甘油10ml/l；蛋白胨15g/L；酵母提取物12g/L；硫酸铵5g/L；硫酸镁2g/L；复合磷酸盐5g/L；微量元素母液1.25ml/L；NaCl10g/L。

利用该培养基重复以上实施例1的试验。

结果发现，在温度控制策略不变的情况下，该发酵培养基也可良好地用于发酵。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>华东理工大学

<120>利用重组大肠杆菌高效生产丙酮酸氧化酶的分批式补料发酵工艺

<130>081813

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>1

catgccatgg gaatgcatca ccatcaccat cactcagata acaaaattaa catc    54

<210>2

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>2

cgcggatcct tatcatttga tgtatttaga ttctaagcct tcagc 45

<210>3

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<400>3

Met Gly Met His His His His His His

1               5

Claims (10)

1.一种发酵生产丙酮酸氧化酶的方法，其特征在于，所述的方法包括：

(1)在37±1℃的培养温度下，培养含有丙酮酸氧化酶表达盒的重组大肠杆菌，从而表达丙酮酸氧化酶；和

(2)当所述的重组大肠杆菌初始生长阶段结束后，将温度由37±1℃降低到32±2℃，保持该温度至发酵结束。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，

当所述的重组大肠杆菌初始生长阶段结束后，采用梯级降温的方式将温度由37±1℃逐渐降低到32±2℃，至发酵结束。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，当所述的重组大肠杆菌初始生长阶段结束后，降温1±0.2℃；之后每隔4±1小时降1±0.2℃，直至温度为32±1℃后保持恒温，至发酵结束。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，当所述的重组大肠杆菌初始生长阶段结束后，降温1℃；之后每隔4小时降1℃，直至温度为32℃后保持恒温，至发酵结束。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述的重组大肠杆菌初始生长阶段结束后，开始补料。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的补料培养基含有：甘油20±5％，蛋白胨4±1％，酵母提取物3±1％，硫酸铵1±0.3％，磷酸盐1.4±0.4％，微量元素母液0.125±0.03％。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，补料培养基的补料速率为0.2±01ml/min/L。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重组大肠杆菌是E.coliDH5α/pSMLPyOD。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，培养含有丙酮酸氧化酶表达盒的重组大肠杆菌所用的初始培养基含有：

甘油6-18ml/L；蛋白胨12-20g/L；酵母提取物10-16g/L；硫酸铵3-7g/L；硫酸镁1-4g/L；磷酸盐4-8g/L；氯化钠6-15g/L。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在重组大肠杆菌发酵过程中，以氨水控制pH在6.5-7.1。

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