CN114540274A - 无血清培养基及其制备方法和用其培养2bs细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种无血清培养基及其制备方法和用其培养2BS细胞的方法。该无血清培养基包含水以及氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素和其他添加成分。采用该无血清培养基培养2BS细胞，能突破2BS细胞传代极限、增加2BS细胞传代的代次。并且，发明人还发现，所得2BS细胞形态更好、生长密度更高、活率高。同时，本发明提供的无血清培养基配方成分明确，配方简单，低成本，低蛋白，易于配制，利于2BS细胞后续生产病毒的下游纯化，提高产品品质。本发明提供的无血清培养基，适用范围广，不仅适用于细胞工厂、微载体工艺上的无血清传代、扩增和放大，还可支持传统培养基中10％血清用量的2BS细胞在低血清或无血清条件下生产疫苗。

Description

无血清培养基及其制备方法和用其培养2BS细胞的方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，更具体地说，尤其涉及一种无血清培养基及其制备方法和用其培养2BS细胞的方法。
背景技术
2BS细胞株(人胚肺细胞、二倍体细胞)是世界卫生组织推荐的可以用于人用疫苗生产的标准人二倍体细胞株，其免疫原性好，具有良好的耐受性，无异种移植致癌性，无外源因子污染，可规模化生产多种病毒性疫苗。到目前为止，使用2BS细胞制备的疫苗已被广泛使用，如人狂犬疫苗、麻疹病毒疫苗、腮腺炎病毒疫苗、甲肝病毒疫苗、脊髓灰质炎病毒疫苗、风疹病毒疫苗等。
传统的2BS细胞株均采用贴壁培养，贴壁培养所采用的培养基为基础培养基添加高比例血清或者人血白蛋白得到的培养液。但是，血清及人血白蛋白成分不明、价格昂贵、批次稳定性差、来源困难，并且存在可能引入外源污染的风险。而无血清培养既可以降低产品成本，又可以降低人为引入的外源污染风险，保证了终产品的质量和安全性，已成为包括疫苗在内的生物技术药物生产的总趋势。传统的无血清培养基例如CN 106754634 A公开的无血清培养基。
然而人们逐渐意识到，2BS细胞具有一个普遍的缺陷，采用传统的无血清培养基对2BS细胞进行培养的过程中，其生命周期及使用代次是非常有限的，这也使得该细胞资源弥足珍贵。因此，如何延长2BS细胞的生命代次，是亟待解决的技术问题。
发明内容
基于上述技术问题，本发明的目的之一是提供一种无血清培养基，采用该无血清培养基培养2BS细胞，能突破2BS细胞传代极限、增加2BS细胞传代的代次。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种无血清培养基，所述无血清培养基包含水以及如下浓度的各组分：甘氨酸2mg/L～50mg/L、丙氨酸1mg/L～20mg/L、天冬氨酸3g/L～45mg/L、天冬酰胺1mg/L～25mg/L、谷氨酸2.5mg/L～40mg/L、脯氨酸3mg/L～60mg/L、精氨酸25mg/L～200mg/L、半胱氨酸3mg/L～50mg/L、谷氨酰胺20mg/L～800mg/L、组氨酸20mg/L～600mg/L、异亮氨酸5mg/L～100mg/L、亮氨酸4mg/L～80mg/L、赖氨酸6mg/L～140mg/L、甲硫氨酸1mg/L～30mg/L、苯丙氨酸0.5mg/L～15mg/L、丝氨酸3mg/L～60mg/L、苏氨酸2mg/L～50mg/L、色氨酸5mg/L～150mg/L、酪氨酸2mg/L～50mg/L、缬氨酸4mg/L～80mg/L、维生素H0.001mg/L～0.08mg/L、VB120.05mg/L～1mg/L、泛酸钙0.5mg/L～50mg/L、叶酸1mg/L～25mg/L、烟酰胺2mg/L～60mg/L、核黄素0.1mg/L～5mg/L、氯化钙3mg/L～140mg/L、硫酸镁4mg/L～88mg/L、氯化钾10mg/L～250mg/L、氯化钠100mg/L～7500mg/L、磷酸氢二钠5mg/L～100mg/L、亚油酸0.02mg/L～0.6mg/L、生育酚醋酸酯0.005mg/L～0.5mg/L、硫酸亚铁0.5mg/L～10mg/L、硫酸铜0.001mg/L～0.005mg/L、硫酸锌0.03mg/L～6mg/L、硫酸锰0.0005mg/L～0.01mg/L、氯化镍0.000001mg/L～0.00012mg/L、碳酸氢钠2000mg/L～5000mg/L、葡萄糖1000mg/L～8000mg/L、丙酮酸钠3mg/L～70mg/L、胰岛素0.1mg/L～10mg/L、氢化可的松0.001mg/L～0.5mg/L，和成纤维细胞生长因子0.003mg/L～0.1mg/L。
在其中一个实施例中，所述无血清培养基包含水以及如下浓度的各组分：甘氨酸15mg/L～25mg/L、丙氨酸3mg/L～10mg/L、天冬氨酸30mg/L～40mg/L、天冬酰胺5mg/L～10mg/L、谷氨酸5mg/L～10mg/L、脯氨酸10mg/L～20mg/L、精氨酸120mg/L～140mg/L、半胱氨酸10mg/L～25mg/L、谷氨酰胺300mg/L～400mg/L、组氨酸35mg/L～50mg/L、异亮氨酸60mg/L～80mg/L、亮氨酸50mg/L～65mg/L、赖氨酸85mg/L～100mg/L、甲硫氨酸10mg/L～20mg/L、苯丙氨酸5mg/L～10mg/L、丝氨酸30mg/L～40mg/L、苏氨酸25mg/L～40mg/L、色氨酸8mg/L～20mg/L、酪氨酸30mg/L～40mg/L、缬氨酸50mg/L～70mg/L、维生素H0.005mg/L～0.009mg/L、VB12 0.5mg/L～0.85mg/L、泛酸钙1mg/L～5mg/L、叶酸2mg/L～6mg/L、烟酰胺3mg/L～5mg/L、核黄素0.2mg/L～1mg/L、氯化钙110mg/L～120mg/L、硫酸镁50mg/L～65mg/L、氯化钾210mg/L～230mg/L、氯化钠6800mg/L～7100mg/L、磷酸氢二钠65mg/L～80mg/L、亚油酸0.03mg/L～0.06mg/L、生育酚醋酸酯0.006mg/L～0.009mg/L、硫酸亚铁0.7mg/L～1.5mg/L、硫酸铜0.002mg/L～0.003mg/L、硫酸锌0.3mg/L～0.8mg/L、硫酸锰0.00075mg/L～0.001mg/L、氯化镍0.0000012mg/L～0.0000015mg/L、碳酸氢钠2200mg/L～2600mg/L、葡萄糖3000mg/L～4000mg/L、丙酮酸钠50mg/L～60mg/L、胰岛素4mg/L～6mg/L、氢化可的松0.003mg/L～0.005mg/L，和成纤维细胞生长因子0.03mg/L～0.07mg/L。
在其中一个实施例中，所述无血清培养基的pH值为6.5～7.5。
如上所述的无血清培养基的制备方法，所述制备方法包括混合所述水和所述组分制备混合物的步骤。
在其中一个实施例中，所述制备方法还包括对所述混合物进行除菌的步骤。
在其中一个实施例中，除菌的方式采用过滤除菌。
在其中一个实施例中，所述制备方法还包括对所述混合物的pH值进行调节然后再对其进行除菌的步骤。
一种2BS细胞的培养方法，所述培养方法包括采用所述的无血清培养基对2BS细胞进行培养的步骤。
在其中一个实施例中，培养采用的条件包括：温度为36.5℃～37.5℃，环境湿度＞60％，环境气体包含体积浓度为4.5％～5.5％的CO2。
在其中一个实施例中，所述2BS细胞在所述无血清培养基中的接种浓度为3×106cells/mL～7×106cells/mL。
与传统技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过对无血清培养基配方的整体优化，包括添加合适的氨基酸种类和调整氨基酸含量、调整盐类的含量、添加合适种类的酯类和微量元素以及调整其他添加成分例如丙酮酸钠的含量，形成特定的无血清培养基配方，采用该配方的无血清培养基培养2BS细胞，能突破2BS细胞传代极限、增加2BS细胞传代的代次。并且，发明人还发现，所得2BS细胞形态更好、生长密度更高、活率高。同时，本发明提供的无血清培养基配方成分明确，配方简单，低成本，低蛋白，易于配制，利于2BS细胞后续生产病毒的下游纯化，提高产品品质。本发明提供的无血清培养基，适用范围广，不仅适用于细胞工厂、微载体工艺上的无血清传代、扩增和放大，还可支持传统培养基中10％血清用量的2BS细胞在低血清或无血清条件下生产疫苗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为使用本发明实施例3的无血清培养基培养细胞的图片；
图2为使用对比例6培养基培养细胞的图片。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更详细的描述。但是，应当理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式或实施例。相反地，提供这些实施方式或实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式或实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，则包括数值区间的两个端点。
本发明中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相-固相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。
本发明中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
第一方面，本发明提供一种无血清培养基，所述无血清培养基包含水以及如下浓度的各组分：甘氨酸2mg/L～50mg/L、丙氨酸1mg/L～20mg/L、天冬氨酸3g/L～45mg/L、天冬酰胺1mg/L～25mg/L、谷氨酸2.5mg/L～40mg/L、脯氨酸3mg/L～60mg/L、精氨酸25mg/L～200mg/L、半胱氨酸3mg/L～50mg/L、谷氨酰胺20mg/L～800mg/L、组氨酸20mg/L～600mg/L、异亮氨酸5mg/L～100mg/L、亮氨酸4mg/L～80mg/L、赖氨酸6mg/L～140mg/L、甲硫氨酸1mg/L～30mg/L、苯丙氨酸0.5mg/L～15mg/L、丝氨酸3mg/L～60mg/L、苏氨酸2mg/L～50mg/L、色氨酸5mg/L～150mg/L、酪氨酸2mg/L～50mg/L、缬氨酸4mg/L～80mg/L、维生素H0.001mg/L～0.08mg/L、VB120.05mg/L～1mg/L、泛酸钙0.5mg/L～50mg/L、叶酸1mg/L～25mg/L、烟酰胺2mg/L～60mg/L、核黄素0.1mg/L～5mg/L、氯化钙3mg/L～140mg/L、硫酸镁4mg/L～88mg/L、氯化钾10mg/L～250mg/L、氯化钠100mg/L～7500mg/L、磷酸氢二钠5mg/L～100mg/L、亚油酸0.02mg/L～0.6mg/L、生育酚醋酸酯0.005mg/L～0.5mg/L、硫酸亚铁0.5mg/L～10mg/L、硫酸铜0.001mg/L～0.005mg/L、硫酸锌0.03mg/L～6mg/L、硫酸锰0.0005mg/L～0.01mg/L、氯化镍0.000001mg/L～0.00012mg/L、碳酸氢钠2000mg/L～5000mg/L、葡萄糖1000mg/L～8000mg/L、丙酮酸钠3mg/L～70mg/L、胰岛素0.1mg/L～10mg/L、氢化可的松0.001mg/L～0.5mg/L，和成纤维细胞生长因子0.003mg/L～0.1mg/L。
本发明提供的无血清培养基，包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、缓冲剂和其他添加成分；其中，
所述氨基酸含：甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、脯氨酸、精氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸；
所述维生素含：维生素H、VB12、泛酸钙、叶酸、烟酰胺、核黄素；
所述盐类含：氯化钙、硫酸镁、氯化钾、氯化钠、磷酸氢二钠；
所述脂类含：亚油酸、生育酚醋酸酯；
所述微量元素含：硫酸亚铁、硫酸铜、硫酸锌、硫酸锰、氯化镍；
所述缓冲剂含：碳酸氢钠；
所述其他添加成分含：葡萄糖、丙酮酸钠、胰岛素、氢化可的松、成纤维细胞生长因子。
本发明通过对无血清培养基配方的整体优化，包括添加合适的氨基酸种类和调整氨基酸含量、调整盐类的含量、添加合适种类的酯类和微量元素以及调整其他添加成分例如丙酮酸钠的含量，形成特定的无血清培养基配方，采用该配方的无血清培养基培养2BS细胞，能突破2BS细胞传代极限、增加2BS细胞传代的代次。并且，发明人还发现，所得2BS细胞形态更好、生长密度更高、活率高。同时，本发明提供的无血清培养基配方成分明确，配方简单，低成本，低蛋白，易于配制，利于2BS细胞后续生产病毒的下游纯化，提高产品品质。本发明提供的无血清培养基，适用范围广，不仅适用于细胞工厂、微载体工艺上的无血清传代、扩增和放大，还可支持传统培养基中10％血清用量的2BS细胞在低血清或无血清条件下生产疫苗。
应该理解，本领域技术人员根据需要，可以加入任何其他一种或多种适宜的组分，而不超出本发明的保护范围。
在其中一个示例中，所述无血清培养基包含水以及如下浓度的各组分：甘氨酸15mg/L～25mg/L、丙氨酸3mg/L～10mg/L、天冬氨酸30mg/L～40mg/L、天冬酰胺5mg/L～10mg/L、谷氨酸5mg/L～10mg/L、脯氨酸10mg/L～20mg/L、精氨酸120mg/L～140mg/L、半胱氨酸10mg/L～25mg/L、谷氨酰胺300mg/L～400mg/L、组氨酸35mg/L～50mg/L、异亮氨酸60mg/L～80mg/L、亮氨酸50mg/L～65mg/L、赖氨酸85mg/L～100mg/L、甲硫氨酸10mg/L～20mg/L、苯丙氨酸5mg/L～10mg/L、丝氨酸30mg/L～40mg/L、苏氨酸25mg/L～40mg/L、色氨酸8mg/L～20mg/L、酪氨酸30mg/L～40mg/L、缬氨酸50mg/L～70mg/L、维生素H0.005mg/L～0.009mg/L、VB12 0.5mg/L～0.85mg/L、泛酸钙1mg/L～5mg/L、叶酸2mg/L～6mg/L、烟酰胺3mg/L～5mg/L、核黄素0.2mg/L～1mg/L、氯化钙110mg/L～120mg/L、硫酸镁50mg/L～65mg/L、氯化钾210mg/L～230mg/L、氯化钠6800mg/L～7100mg/L、磷酸氢二钠65mg/L～80mg/L、亚油酸0.03mg/L～0.06mg/L、生育酚醋酸酯0.006mg/L～0.009mg/L、硫酸亚铁0.7mg/L～1.5mg/L、硫酸铜0.002mg/L～0.003mg/L、硫酸锌0.3mg/L～0.8mg/L、硫酸锰0.00075mg/L～0.001mg/L、氯化镍0.0000012mg/L～0.0000015mg/L、碳酸氢钠2200mg/L～2600mg/L、葡萄糖3000mg/L～4000mg/L、丙酮酸钠50mg/L～60mg/L、胰岛素4mg/L～6mg/L、氢化可的松0.003mg/L～0.005mg/L，和成纤维细胞生长因子0.03mg/L～0.07mg/L。
在其中一个示例中，所述无血清培养基的pH值为6.5～7.5。本发明所述无血清培养基的pH值可以选自，包括但不限于如下pH值或这些pH值之间的范围：6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1.、7.2、7.3、7.4、7.5。
第二方面，本发明提供一种如上所述的无血清培养基的制备方法，所述制备方法包括混合所述水和所述组分制备混合物的步骤。
在其中一个示例中，所述制备方法还包括对所述混合物进行除菌的步骤。
在其中一个示例中，除菌的方式采用过滤除菌。例如采用0.22μm滤器过滤除菌。
在其中一个示例中，所述制备方法还包括对所述混合物的pH值进行调节然后再对其进行除菌的步骤。本发明提供的无血清培养基，其pH值根据具体无血清培养基所含化学成分浓度的不同而有变动，可以酌情添加酸性调节剂或者碱性调节剂进行pH值调节。
第三方面，本发明提供一种2BS细胞的培养方法，所述培养方法包括采用如上所述的无血清培养基对2BS细胞进行培养的步骤。
本发明所述的培养，其方式可以是静态悬浮培养。
本发明所述的培养，可以根据具体需求选择在方瓶、转瓶、细胞工厂、Spinner、反应器等中进行。应该理解，本发明不限于上述列举的培养容器，任何适用于2BS细胞生长的培养容器都在本发明的保护范围之内。
本发明所述的培养可以是人用疫苗规模化研发及生产中对2BS细胞进行的培养。所述人用疫苗规模化研发及生产，包含人狂犬疫苗、麻疹病毒疫苗、腮腺炎病毒疫苗、甲肝病毒疫苗、脊髓灰质炎病毒疫苗、风疹病毒疫苗等。应该理解，本发明不限于上述列举的疫苗，任何适用于2BS细胞研发或生产的疫苗都在本发明的保护范围之内。
在其中一个示例中，培养采用的温度为36.5℃～37.5℃。本发明培养采用的温度可以选自，包括但不限于如下温度或这些温度之间的范围：36.5℃、36.6℃、36.7℃、36.8℃、36.9℃、37℃、37.1℃、37.2℃、37.3℃、37.4℃、37.5℃。
在其中一个示例中，培养采用的环境湿度＞60％。本发明培养采用的环境湿度可以选自，包括但不限于如下湿度或这些湿度之间的范围：61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％。
在其中一个示例中，培养采用的环境气体包含体积浓度为4.5％～5.5％的CO2。本发明培养采用的环境气体中的CO2体积浓度，可以选自，包括但不限于如下浓度或这些浓度之间的范围：4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％、5.0％、5.1％、5.2％、5.3％、5.4％、5.5％。
在其中一个示例中，所述2BS细胞在所述无血清培养基中的接种浓度为3×106cells/mL～7×106cells/mL。本发明所述2BS细胞在所述无血清培养基中的接种浓度，可以选自，包括但不限于如下接种浓度或这些接种浓度之间的范围：3×106cells/mL、3.5×106cells/mL、4×106cells/mL、4.5×106cells/mL、5×106cells/mL、5.5×106cells/mL、6×106cells/mL、6.5×106cells/mL、7×106cells/mL。
实施例1
本实施例提供了一种无血清培养基，该无血清培养基用于培养2BS细胞，包含水以及下表所示的化学成分及其浓度：
表1
化合物名称 单位mg/L 化合物名称 单位mg/L
甘氨酸 2 泛酸钙 0.5
丙氨酸 1 叶酸 1
天冬氨酸 3 烟酰胺 2
天冬酰胺 1 核黄素 0.1
谷氨酸 2.5 氯化钙 3
脯氨酸 3 硫酸镁 4
精氨酸 25 氯化钾 10
半胱氨酸 3 氯化钠 100
谷氨酰胺 20 磷酸氢二钠 5
组氨酸 20 亚油酸 0.02
异亮氨酸 5 生育酚醋酸酯 0.005
亮氨酸 4 硫酸亚铁 0.5
赖氨酸 6 硫酸铜 1E-3
甲硫氨酸 1 硫酸锌 0.03
苯丙氨酸 0.5 硫酸锰 0.0005
丝氨酸 3 氯化镍 0.000001
苏氨酸 2 碳酸氢钠 2000
色氨酸 5 葡萄糖 1000
酪氨酸 2 丙酮酸钠 3
缬氨酸 4 胰岛素 0.1
维生素H 0.001 氢化可的松 0.001
VB<sub>12</sub> 0.05 成纤维细胞生长因子 0.003
本实施例无血清培养基的制备方法包括：
(1)准备常温水以及表1所示无血清培养基组分；
(2)将表1所示无血清培养基组分溶于所述常温水中，调节pH至6.9左右，加水定容；
(3)使用0.22μm滤器过滤除菌。
实施例2
本实施例提供了一种无血清培养基，该无血清培养基用于培养2BS细胞，包含水以及下表所示的化学成分及其浓度：
表2
化合物名称 单位mg/L 化合物名称 单位mg/L
甘氨酸 50 泛酸钙 50
丙氨酸 20 叶酸 25
天冬氨酸 45 烟酰胺 60
天冬酰胺 25 核黄素 5
谷氨酸 40 氯化钙 140
脯氨酸 60 硫酸镁 88
精氨酸 200 氯化钾 250
半胱氨酸 50 氯化钠 7500
谷氨酰胺 800 磷酸氢二钠 100
组氨酸 600 亚油酸 0.6
异亮氨酸 100 生育酚醋酸酯 0.5
亮氨酸 80 硫酸亚铁 10
赖氨酸 140 硫酸铜 0.5
甲硫氨酸 30 硫酸锌 6
苯丙氨酸 15 硫酸锰 0.01
丝氨酸 60 氯化镍 0.00012
苏氨酸 50 碳酸氢钠 5000
色氨酸 150 葡萄糖 8000
酪氨酸 50 丙酮酸钠 70
缬氨酸 80 胰岛素 10
维生素H 0.08 氢化可的松 0.5
VB12 1 成纤维细胞生长因子 0.1
本实施例无血清培养基的制备方法包括：
(1)准备常温水以及表2所示无血清培养基组分；
(2)将表2所示无血清培养基组分溶于所述常温水中，调节pH至6.9左右，加水定容；
(3)使用0.22μm滤器过滤除菌。
实施例3
本实施例提供了一种无血清培养基，该无血清培养基用于培养2BS细胞，包含水以及下表所示的化组分及其浓度：
表3
化合物名称 单位mg/L 化合物名称 单位mg/L
甘氨酸 20.7 泛酸钙 2.2
丙氨酸 5.7 叶酸 2.1
天冬氨酸 35 烟酰胺 4
天冬酰胺 7.2 核黄素 0.21
谷氨酸 7.3 氯化钙 116
脯氨酸 15.7 硫酸镁 57.4
精氨酸 136 氯化钾 223
半胱氨酸 17.3 氯化钠 6995
谷氨酰胺 365 磷酸氢二钠 71
组氨酸 42 亚油酸 0.042
异亮氨酸 70.8 生育酚醋酸酯 0.0072
亮氨酸 59 硫酸亚铁 0.83
赖氨酸 91 硫酸铜 0.0026
甲硫氨酸 17.8 硫酸锌 0.43
苯丙氨酸 7 硫酸锰 0.00075
丝氨酸 38.7 氯化镍 0.0000012
苏氨酸 31 碳酸氢钠 2400
色氨酸 11 葡萄糖 3063
酪氨酸 37 丙酮酸钠 55
缬氨酸 62 胰岛素 5
维生素H 0.0084 氢化可的松 0.003
VB12 0.8 成纤维细胞生长因子 0.05
本实施例无血清培养基的制备方法包括：
(1)准备常温水以及表1所示无血清培养基组分；
(2)将表1所示无血清培养基组分溶于所述常温水中，调节pH至6.9左右，加水定容；
(3)使用0.22μm滤器过滤除菌。
对比例1
本对比例是实施例3的对比例，相对于实施例3的主要差别包括无血清培养基中的氨基酸类组分种类及浓度不同，具体地，本对比例提供的无血清培养基包含水以及如下表所示的各组分及浓度。
表4
化合物名称 单位mg/L 化合物名称 单位mg/L
甘氨酸 20.7 泛酸钙 2.2
丙氨酸 5.7 叶酸 2.1
天冬氨酸 0 烟酰胺 4
天冬酰胺 7.2 核黄素 0.21
谷氨酸 7.3 氯化钙 116
脯氨酸 15.7 硫酸镁 57.4
精氨酸 136 氯化钾 223
半胱氨酸 52.3 氯化钠 6995
谷氨酰胺 365 磷酸氢二钠 71
组氨酸 42 亚油酸 0.042
异亮氨酸 70.8 生育酚醋酸酯 0.0072
亮氨酸 59 硫酸亚铁 0.83
赖氨酸 91 硫酸铜 0.0026
甲硫氨酸 17.8 硫酸锌 0.43
苯丙氨酸 37 硫酸锰 0.00075
丝氨酸 38.7 氯化镍 0.0000012
苏氨酸 31 碳酸氢钠 2400
色氨酸 11 葡萄糖 3063
酪氨酸 37 丙酮酸钠 55
缬氨酸 62 胰岛素 5
维生素H 0.0084 氢化可的松 0.003
VB12 0.8 成纤维细胞生长因子 0.05
无血清培养基的制备方法同实施例3。
对比例2
本对比例是实施例3的对比例，相对于实施例3的主要差别包括无血清培养基中的盐类组分浓度不同，具体地，本对比例提供的无血清培养基包含水以及如下表所示的各组分及浓度。
表5
化合物名称 单位mg/L 化合物名称 单位mg/L
甘氨酸 20.7 泛酸钙 2.2
丙氨酸 5.7 叶酸 2.1
天冬氨酸 35 烟酰胺 4
天冬酰胺 7.2 核黄素 0.21
谷氨酸 7.3 氯化钙 160
脯氨酸 15.7 硫酸镁 17.4
精氨酸 136 氯化钾 223
半胱氨酸 17.3 氯化钠 6995
谷氨酰胺 365 磷酸氢二钠 71
组氨酸 42 亚油酸 0.042
异亮氨酸 70.8 生育酚醋酸酯 0.0072
亮氨酸 59 硫酸亚铁 0.83
赖氨酸 91 硫酸铜 0.0026
甲硫氨酸 17.8 硫酸锌 0.43
苯丙氨酸 7 硫酸锰 0.00075
丝氨酸 38.7 氯化镍 0.0000012
苏氨酸 31 碳酸氢钠 2400
色氨酸 11 葡萄糖 3063
酪氨酸 37 丙酮酸钠 55
缬氨酸 62 胰岛素 5
维生素H 0.0084 氢化可的松 0.003
VB<sub>12</sub> 0.8 成纤维细胞生长因子 0.05
无血清培养基的制备方法同实施例3。
对比例3
本对比例是实施例3的对比例，相对于实施例3的主要差别包括无血清培养基中的脂类组分种类不同，具体地，本对比例提供的无血清培养基包含水以及如下表所示的各组分及浓度。
表6
化合物名称 单位mg/L 化合物名称 单位mg/L
甘氨酸 20.7 泛酸钙 2.2
丙氨酸 5.7 叶酸 2.1
天冬氨酸 35 烟酰胺 4
天冬酰胺 7.2 核黄素 0.21
谷氨酸 7.3 氯化钙 116
脯氨酸 15.7 硫酸镁 57.4
精氨酸 136 氯化钾 223
半胱氨酸 17.3 氯化钠 6995
谷氨酰胺 365 磷酸氢二钠 71
组氨酸 42 亚麻酸 0.042
异亮氨酸 70.8 豆蔻酸 0.0072
亮氨酸 59 硫酸亚铁 0.83
赖氨酸 91 硫酸铜 0.0026
甲硫氨酸 17.8 硫酸锌 0.43
苯丙氨酸 7 硫酸锰 0.00075
丝氨酸 38.7 氯化镍 0.0000012
苏氨酸 31 碳酸氢钠 2400
色氨酸 11 葡萄糖 3063
酪氨酸 37 丙酮酸钠 55
缬氨酸 62 胰岛素 5
维生素H 0.0084 氢化可的松 0.003
VB<sub>12</sub> 0.8 成纤维细胞生长因子 0.05
对比例4
本对比例是实施例3的对比例，相对于实施例3的主要差别包括无血清培养基中的盐类组分浓度不同，具体地，本对比例提供的无血清培养基包含水以及如下表所示的各组分及浓度。
表7
化合物名称 单位mg/L 化合物名称 单位mg/L
甘氨酸 20.7 泛酸钙 2.2
丙氨酸 5.7 叶酸 2.1
天冬氨酸 35 烟酰胺 4
天冬酰胺 7.2 核黄素 0.21
谷氨酸 7.3 氯化钙 116
脯氨酸 15.7 硫酸镁 57.4
精氨酸 136 氯化钾 223
半胱氨酸 17.3 氯化钠 6995
谷氨酰胺 365 磷酸氢二钠 71
组氨酸 42 亚油酸 0.042
异亮氨酸 70.8 生育酚醋酸酯 0.0072
亮氨酸 59 硫酸亚铁 0.83
赖氨酸 91 硫酸铜 0
甲硫氨酸 17.8 硫酸锌 0.43
苯丙氨酸 7 硫酸锰 0
丝氨酸 38.7 氯化镍 0
苏氨酸 31 碳酸氢钠 2400
色氨酸 11 葡萄糖 3063
酪氨酸 37 丙酮酸钠 55
缬氨酸 62 胰岛素 5
维生素H 0.0084 氢化可的松 0.003
VB12 0.8 成纤维细胞生长因子 0.05
无血清培养基的制备方法同实施例3。
对比例5
本对比例是实施例3的对比例，相对于实施例3的主要差别包括无血清培养基中的丙酮酸钠浓度不同，具体地，本对比例提供的无血清培养基包含水以及如下表所示的各组分及浓度。
表8
化合物名称 单位mg/L 化合物名称 单位mg/L
甘氨酸 20.7 泛酸钙 2.2
丙氨酸 5.7 叶酸 2.1
天冬氨酸 35 烟酰胺 4
天冬酰胺 7.2 核黄素 0.21
谷氨酸 7.3 氯化钙 116
脯氨酸 15.7 硫酸镁 57.4
精氨酸 136 氯化钾 223
半胱氨酸 17.3 氯化钠 6995
谷氨酰胺 365 磷酸氢二钠 71
组氨酸 42 亚油酸 0.042
异亮氨酸 70.8 生育酚醋酸酯 0.0072
亮氨酸 59 硫酸亚铁 0.83
赖氨酸 91 硫酸铜 0.0026
甲硫氨酸 17.8 硫酸锌 0.43
苯丙氨酸 7 硫酸锰 0.00075
丝氨酸 38.7 氯化镍 0.0000012
苏氨酸 31 碳酸氢钠 2400
色氨酸 11 葡萄糖 3063
酪氨酸 37 丙酮酸钠 80
缬氨酸 62 胰岛素 5
维生素H 0.0084 氢化可的松 0.003
VB<sub>12</sub> 0.8 成纤维细胞生长因子 0.05
无血清培养基的制备方法同实施例3。
对比例6：市售Gibco公司的MEM基础培养基(目录号11095080)，添加来自Gibco公司FBS(目录号10099141C)使用，添加量为10％体积比。
性能测试
采用上述实施例和对比例提供的无血清培养基，培养2BS细胞生长，主要步骤包括：
按照实施例1～3以及对比例1～5配制的培养基、对比例6的培养基进行细胞生长对比实验，实验分为两个阶段：
对比例6培养基中复苏的2BS细胞在无血清培养基中进行适应(阶段I)和细胞生长对比实验(阶段II)。
阶段I：将在对比例6中复苏培养的2BS细胞采用逐步适应法适应无血清培养基，为保证2BS细胞的成功适应，建议选择在对数生长中期且2BS细胞活率保持在90％以上的健康2BS细胞。适应前期，2BS细胞接种密度或传代比例可调整为正常传代时的1.2倍。通过逐步降低血清浓度，选择实施例1～3以及对比例1～5的无需血清培养基，按10％→5％→2％→1％→0％(体积百分比)血清的方案，逐步进行无血清细胞培养驯化。2BS细胞在无血清条件下正常生长2～3代后，建立适量的研究细胞库。
阶段Ⅱ：将对比例6中培养的细胞以及阶段Ⅰ驯化得到的2BS细胞(分别采用实施例1～3以及对比例1～5的无血清培养基驯化)，以5×106cells/mL的密度接种于T75方瓶中，工作体积15mL，温度设置为37℃，CO2浓度设置为5％，湿度控制为＞60％，静置培养。每三天进行细胞常规传代。
实验结果如下：
2BS细胞在生长对比阶段的活细胞密度数据如下表1和表2所述所示：
表9、2BS细胞生长对比实验各代次活细胞密度和细胞活率统计
Figure BDA0003507967450000181
表10、2BS细胞生长对比实验各代次活细胞密度和细胞活率统计
Figure BDA0003507967450000191
上述表9可见，本发明的培养基比市售培养基对细胞的生长效果更好，细胞生长密度更高、活率更好，而且可以有效延长细胞极限传代代次。
上述表10可见，本发明的培养基较对比例1～5对细胞生长效果更好，细胞生长密度更高、活率更好，而且可以有效延长细胞极限传代代次。
本发明的实施例3无血清培养基与对比例6培养的细胞形态分别如图1、图2所示。可见细胞在无血清培养基中形态更好。具体表现为：细胞形态呈长梭形，多个漩涡状区域分布，并且各漩涡内细胞排列极性更强、轮廓更清晰、无细胞碎片。
综上，本发明的无血清培养基适用于2BS细胞生长，支持2BS细胞更高的生长密度、更高的细胞活率、更长的极限增殖代次。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所述附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.一种无血清培养基，其特征在于，所述无血清培养基包含水以及如下浓度的各组分：甘氨酸2mg/L～50mg/L、丙氨酸1mg/L～20mg/L、天冬氨酸3g/L～45mg/L、天冬酰胺1mg/L～25mg/L、谷氨酸2.5mg/L～40mg/L、脯氨酸3mg/L～60mg/L、精氨酸25mg/L～200mg/L、半胱氨酸3mg/L～50mg/L、谷氨酰胺20mg/L～800mg/L、组氨酸20mg/L～600mg/L、异亮氨酸5mg/L～100mg/L、亮氨酸4mg/L～80mg/L、赖氨酸6mg/L～140mg/L、甲硫氨酸1mg/L～30mg/L、苯丙氨酸0.5mg/L～15mg/L、丝氨酸3mg/L～60mg/L、苏氨酸2mg/L～50mg/L、色氨酸5mg/L～150mg/L、酪氨酸2mg/L～50mg/L、缬氨酸4mg/L～80mg/L、维生素H0.001mg/L～0.08mg/L、VB120.05mg/L～1mg/L、泛酸钙0.5mg/L～50mg/L、叶酸1mg/L～25mg/L、烟酰胺2mg/L～60mg/L、核黄素0.1mg/L～5mg/L、氯化钙3mg/L～140mg/L、硫酸镁4mg/L～88mg/L、氯化钾10mg/L～250mg/L、氯化钠100mg/L～7500mg/L、磷酸氢二钠5mg/L～100mg/L、亚油酸0.02mg/L～0.6mg/L、生育酚醋酸酯0.005mg/L～0.5mg/L、硫酸亚铁0.5mg/L～10mg/L、硫酸铜0.001mg/L～0.005mg/L、硫酸锌0.03mg/L～6mg/L、硫酸锰0.0005mg/L～0.01mg/L、氯化镍0.000001mg/L～0.00012mg/L、碳酸氢钠2000mg/L～5000mg/L、葡萄糖1000mg/L～8000mg/L、丙酮酸钠3mg/L～70mg/L、胰岛素0.1mg/L～10mg/L、氢化可的松0.001mg/L～0.5mg/L，和成纤维细胞生长因子0.003mg/L～0.1mg/L。
2.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述无血清培养基包含水以及如下浓度的各组分：甘氨酸15mg/L～25mg/L、丙氨酸3mg/L～10mg/L、天冬氨酸30mg/L～40mg/L、天冬酰胺5mg/L～10mg/L、谷氨酸5mg/L～10mg/L、脯氨酸10mg/L～20mg/L、精氨酸120mg/L～140mg/L、半胱氨酸10mg/L～25mg/L、谷氨酰胺300mg/L～400mg/L、组氨酸35mg/L～50mg/L、异亮氨酸60mg/L～80mg/L、亮氨酸50mg/L～65mg/L、赖氨酸85mg/L～100mg/L、甲硫氨酸10mg/L～20mg/L、苯丙氨酸5mg/L～10mg/L、丝氨酸30mg/L～40mg/L、苏氨酸25mg/L～40mg/L、色氨酸8mg/L～20mg/L、酪氨酸30mg/L～40mg/L、缬氨酸50mg/L～70mg/L、维生素H0.005mg/L～0.009mg/L、VB12 0.5mg/L～0.85mg/L、泛酸钙1mg/L～5mg/L、叶酸2mg/L～6mg/L、烟酰胺3mg/L～5mg/L、核黄素0.2mg/L～1mg/L、氯化钙110mg/L～120mg/L、硫酸镁50mg/L～65mg/L、氯化钾210mg/L～230mg/L、氯化钠6800mg/L～7100mg/L、磷酸氢二钠65mg/L～80mg/L、亚油酸0.03mg/L～0.06mg/L、生育酚醋酸酯0.006mg/L～0.009mg/L、硫酸亚铁0.7mg/L～1.5mg/L、硫酸铜0.002mg/L～0.003mg/L、硫酸锌0.3mg/L～0.8mg/L、硫酸锰0.00075mg/L～0.001mg/L、氯化镍0.0000012mg/L～
0.0000015mg/L、碳酸氢钠2200mg/L～2600mg/L、葡萄糖3000mg/L～4000mg/L、丙酮酸钠50mg/L～60mg/L、胰岛素4mg/L～6mg/L、氢化可的松0.003mg/L～0.005mg/L，和成纤维细胞生长因子0.03mg/L～0.07mg/L。
3.根据权利要求1或者2所述的无血清培养基，其特征在于，所述无血清培养基的pH值为6.5～7.5。
4.权利要求1至3任一项所述的无血清培养基的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括混合所述水和所述组分制备混合物的步骤。
5.根据权利要求4所述的无血清培养基的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括对所述混合物进行除菌的步骤。
6.根据权利要求5所述的无血清培养基的制备方法，其特征在于，除菌的方式采用过滤除菌。
7.根据权利要求5或者6所述的无血清培养基的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括对所述混合物的pH值进行调节然后再对其进行除菌的步骤。
8.一种2BS细胞的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括采用权利要求1至3任一项所述的无血清培养基对2BS细胞进行培养的步骤。
9.根据权利要求8所述的2BS细胞的培养方法，其特征在于，培养采用的条件包括：温度为36.5℃～37.5℃，环境湿度＞60％，环境气体包含体积浓度为4.5％～5.5％的CO2。
10.根据权利要求8至9任一项所述的2BS细胞的培养方法，其特征在于，所述2BS细胞在所述无血清培养基中的接种浓度为3×106cells/mL～7×106cells/mL。
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