JP2014504510A - 細胞の保存及び細胞培養のための方法 - Google Patents

Abstract

有核細胞において、アポトーシスを低減する方法を提供する。発明は、有核細胞を容器内に保持すること、キセノンを含むガスを容器に導入して、大気圧の０．５〜４．０Ａｔｍ上に達するようにすること；大気圧の０．５〜４．０Ａｔｍ上で、容器内の温度が２２℃〜３７℃である所定の時間、容器を保持すること；大気圧の０．５〜４．０Ａｔｍ上である圧力を維持しながら、温度を０．１℃〜１０℃に下げ、所定時間保持すること；及び、容器内の圧力を大気圧に下げ、温度を２２℃〜３７℃に上げること；を要件とする。これらのステップを行うことで、細胞はリファレンスに比べてアポトーシスが少なくなる。
【選択図】図１

Description

本願は、参照によってここに引用される開示、２０１１年２月７日に提出された米国出願番号６１／４３６，４４１に優先権を主張する。

本発明は一般的に細胞の保存、より詳細にはインビトロでの真核性の有核細胞の保存に関する。

短期間及び長期間のどちらでも、生細胞を含む生物学的材料を貯蔵することは、現代医学における最も意義深い挑戦の一つである。抗凍結剤の存在下で、−２０℃〜−１７６℃の温度範囲に冷却することは、生細胞の貯蔵のために今なお最も広く使用されている方法である。抗凍結の機構は、細胞及び／又は細胞成分を破壊する氷結晶の形成を抑止することによる。しかしながら、これら或いは他の従来の細胞保存方法は、貯蔵される細胞にストレスを与え、ほとんどいつも、貯蔵に関わって操作される細胞の一部に、アポトーシスを引き起こす。（例えば、de Boer F, et al. J Hematother Stem Cell Res. 2002 Dec;1l(6):95l-63; Shapiro AM, et al. Diabetes Technol Ther. 2000 Autumn;2(3):449-52; Cookson P, et al. Transfus Med. 2010 Dec;20(6):392-402を参照のこと。）さらに、器官や組織から直接得られた、培養されていない細胞はしばしば、貯蔵と運搬のうちに損傷する。つまり、細胞を保存するための方法や、貯蔵及び／又は運搬の間に細胞をアポトーシスなどの致死的な事象から守ることについては、現存し、満たされていないニーズが存在する。本発明はこれ及び他のニーズを満たす。

本発明は、アポトーシスを低減するための方法を提供する。本方法は全体的に次のステップを含む：ｉ）容器の中に有核細胞を保持し、当該容器にキセノンを含有するガスを添加して、内部圧が大気圧より０．５〜４．０ａｔｍ上に達するようにすること；ii）大気圧より０．５〜４．０Ａｔｍ上で、容器内の温度が２２℃〜３７℃である所定の時間、ｉ）の容器を保持すること；iii）大気圧より０．５〜４．０ａｔｍ上の圧力を維持しながら、容器内の温度を０．１〜１０℃に下げること；iv）所定の時間、０．１℃〜１０℃で、大気圧より０．５〜４．０ａｔｍ上の圧力で、容器を保持すること；及び、ｖ）容器内の圧力を順次大気圧に下げ、温度を２２〜３７℃に上げること。このプロセスに従って取り扱われる細胞は、リファレンスよりもアポトーシスが少ない。

様々な態様において、２２℃〜３７℃、大気圧より０．５〜４．０ａｔｍ上の圧力で容器が保持される所定の時間は、１５分〜２４時間である。０．１℃〜１０℃、大気圧より０．５〜４．０ａｔｍ上の圧力で容器が保持される所定の時間は、２時間〜３週間である。この所定時間は２時間と２４時間、又は少なくとも２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日等から３週間の間を含み、またそれに必ずしも制限されない。本方法は、ヒト細胞でありうる哺乳類細胞におけるアポトーシスを低減することを含む。

本発明はまた、有核細胞を含む冷却された組成物であって、細胞が容器内に存在し、０．１℃〜１０℃の間の温度に保持されており、容器の内部の圧力は、容器内にキセノンを含むガスを導入することによって大気圧よりも０．５〜４．０Ａｔｍ高いものに関する。

図１は、示された温度、圧力４Ａｔｍでの貯蔵の２４時間（図１Ａ）及び７日（図１Ｂ）後の、フローサイトメトリーによる測定にもとづく、ヒト白血病単球リンパ腫細胞株Ｕ−９３７細胞のパーセンテージである。細胞は示された期間、容器において、或いは、細胞培養のために設定されている３７℃の標準的なＣＯ_２インキュベータ（“コントロール”）中において、それぞれペトリ皿で貯蔵された。貯蔵から取り出した後、細胞は６０分間以上徐々に減圧され、抗ＣＤ１４抗体で染色され、フローサイトメトリーによって選別された。抗ＣＤ１４抗体は、単球及びマクロファージのマーカーである。抗ＣＤ１４抗体にポジティブな全細胞のパーセンテージがプロットされている。

図２は、キセノン過剰４Ａｔｍの圧力で２４時間貯蔵された、全細胞数に対する、生白血病単球リンパ腫細胞株ジャーカット（Jurkat）細胞のパーセンテージを示す。細胞は図１で説明されたように取り扱われた。細胞は、示された温度で、アポトーシス誘導ドキソルビシン（doxo）の存在下／非存在下で貯蔵された。生細胞は、標準トリパンブルー排出アッセイを用いて死細胞と区別された。

図３は、細胞を貯蔵条件から移動して、標準的な培養条件（５％ＣＯ_２、３７℃）に置いた後の生ジャーカット細胞の数の変化を示す。細胞数を測定するため、細胞は標準条件下で２４時間培養の前後においてトリパンブルー染料で染色された。コントロール群の細胞は、貯蔵期間も含めて大気圧条件で標準的な培養条件で生育された。コントロール細胞は実験０日に同じフラスコから実験細胞として採取され、ペトリ皿に載置された。 図４は、容器中にキセノンを含むガスを導入することによる４Ａｔｍの過剰圧が、ジャーカット細胞における自然発生的（表中の「Doxo無し」）及び誘導的（表中の「Doxo」）アポトーシスの両方の進行を抑制することを示す。２４時間後のカスパーゼ３の活性が、一連の実験でモニターされた。 図５は、染色剤ＪＣ−１での白血病単球リンパ腫細胞株Ｕ−９３７細胞（上述の方法に従って、大気圧より４Ａｔｍ上の圧力で、２４時間（図５Ａ）及び７日間（図５Ｂ）貯蔵されたもの）の染色を示す。ＪＣ−１は、フローサイトメトリーによって、ミトコンドリアの状態を測定することを可能にする。

図６は、本発明の方法に従って、１、１４及び２８日間貯蔵された白血病単球リンパ腫細胞株Ｕ−９３７細胞の染色を示す。細胞は、アネキシン−ＦＩＴＣ／ヨウ化プロピジウム染色キットを用いて染色された。当該キットは、生細胞、壊死細胞、初期アポトーシス細胞及び後期アポトーシス細胞を区別することができる。貯蔵期間の終了後、培地が交換され、回復割合をみるために細胞はさらに１日所定の条件で培養された。“Ｘｅ＋４”：９５％Ｘｅ＋５％ＣＯ_２の混合ガス（４ａｔｍ過剰圧）、４℃。“ＮＧ＋４”：大気圧貯蔵、４℃。“ＮＧ＋３７”：３７℃、５％ＣＯ_２で培養された対照サンプル、３日毎に培地交換。

発明の詳細な説明

本発明は、アポトーシスを阻害するための方法を提供する。当該方法は、ここでさらに詳細に説明されるように、特定の圧力及び温度下でキセノンを含有する雰囲気に収容された有核細胞の取り扱いが、細胞のアポトーシスを低減する結果になるという我々の発見に基づく。本発明は、貯蔵及び／又は運搬の間の細胞のアポトーシスを低減するために特に適している。様々な態様において、本発明の方法を用いて処理される細胞は、２週間までの期間、０．１℃〜１０℃の温度で加圧下に貯蔵されうる。本発明は、従来の抗凍結剤を用いることなく実行されうる。

一般的に、本発明は次の順次のステップを含む：ｉ）容器中に有核細胞を保持し、キセノン又はキセノンを含む混合ガスを当該容器に導入して、容器内の圧力が大気圧の０．５〜４．０Ａｔｍ上（絶対圧が１．５〜５．０Ａｔｍ）に達するようにすること；ii）容器の温度が２２℃〜３７℃の間である所定の時間、大気圧の０．５〜４．０Ａｔｍ上でｉ）の容器を保持すること；iii）大気圧の０．５〜４．０Ａｔｍ上の圧力を維持しながら、容器内の温度を０．１〜１０℃に下げること；iv）大気圧の０．５〜４．０Ａｔｍ上の圧力、０．１℃〜１０℃の温度で、所定の期間容器を保持すること；及び、ｖ）iv）の容器の圧力を大気圧に下げ、温度を２２℃〜３７℃に上げること。これらのステップを実行することで、ｖ）の細胞は、リファレンスよりもアポトーシスが少なくなる。

本発明の方法によって処理される細胞が比較されうるリファレンスは、どのような適切なリファレンスであってもよい。例えば、リファレンスは、本発明の方法を用いて細胞を処理するために用いられるパラメータのうち、１又は複数のパラメータを用いられなかったコントロール細胞であってもよい。リファレンスは、それによって本発明の方法の効果の比較がされうるもので、標準カーブ、カーブ下面積、図、表、或いは他のどのようなデータ表示であってもよい。

ある態様において、細胞を保持するための圧力は、大気圧の０．５〜４．０Ａｔｍ上の間であり、それらの間の少数第１０位までの全ての圧力を含む。ここで言及される全ての圧力は、特に示されない限り、過剰のＡｔｍ（高圧又は過圧）を意味する。大気圧とは、追加的な圧力の無い、標準的な大気圧を意味し、典型的には０．８４〜１．０７Ａｔｍの範囲であり、平均的な大気圧は１Ａｔｍと考えられる。

本発明は、あらゆる有核細胞におけるアポトーシスを阻止するために好適と考えられる。様々な態様において、本発明の方法に用いられる細胞は増殖能を有する。細胞は、１又は複数の系統に沿って分化する能力を有してもよい。つまり細胞は、分化全能性、多能性（pluripotency）、多能性（multipotency）、又は単能性を有しうる。従って細胞は、成体幹細胞、組織特異的幹細胞、胎生幹細胞、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞又はがん幹細胞を含み、またそれに制限されない幹細胞でありうる。さまざまな態様において、細胞は例えば間葉系幹細胞や造血幹細胞などの多能性細胞に由来する細胞でありえる。例えば、間葉系幹細胞から筋芽細胞や心筋芽細胞が誘導され、骨髄幹細胞から造血幹細胞が誘導される。一つの態様において、細胞は、例えば未授精の卵母細胞などの半数体でありえる。

ある態様において細胞は、例えば、典型的にはオリジナルの原料から分離された増殖及び／又は継代細胞によって樹立される細胞株のように不死化されてもよい。他の態様では、本発明の方法は、一次組織のサンプルから得られる単一細胞の懸濁液のように、一次組織から脱凝集された細胞におけるアポトーシスを阻害するために用いられる。他の態様では、本発明の方法で取り扱われる細胞は、組織生検、組織切片、又は組織培養を含み、それに制限されない、組織の部分でありえる。一つの態様では、本発明の方法を用いて取り扱われる細胞は、血小板を含まない。他の態様では、本発明の方法を用いて取り扱われる細胞は、器官に存在しない。細胞はいかなる動物から獲得され、由来するものでもよい。一つの態様において、動物は哺乳類である。一つの態様において、哺乳類はヒトである。

上述のように、本発明の方法は、初めに、有核細胞を容器に保持すること及びキセノン（又はキセノンを含む混合ガス）を容器に添加して、容器内の圧力が大気圧の０．５〜４Ａｔｍ（包括的であり、その間の少数第１０位までの全ての桁を含む）上に達するようにすることに関する。その際、容器は、その中で細胞がインビトロで生育され及び／又は貯蔵されるベッセルを保持するために適切ないかなる容器でもありうる。特に、例えば、細胞が存在する試験管、フラスコ、ペトリ皿、エッペンドルフチューブ、組織培養ディッシュ、マルチウェル培養プレート等のあらゆるベッセルが、容器内に載置されうる。細胞が存在しているベッセルが容器内に置かれるとき、ベッセルは、その中の細胞が容器内のキセノン及び圧力に暴露するように載置されることが認識されるだろう。例えば、細胞が存在するベッセルが試験管であるとき、試験管は密封されない。このことによって、加圧状態で容器に導入されているキセノンが細胞に触れ、取り込まれる。

キセノンが添加され、細胞が存在するベッセルを保持する容器は、いかなる適切な容器でもよい。適切な容器は、ジャー、フラスコ、チャンバー又は試験管のような硬質のものであってもよい。容器は、気密性の環境を維持することができねばならない。つまり、容器は密封されうる。容器はまた、一例としてバッグを含みまたこれに制限されない、柔軟な、封止可能な容器でもよい。容器及びそこに添加されるキセノン（又はキセノンを含む混合ガス）は滅菌されていることが好ましい。本発明の方法を実行する時、細胞がその環境に供されるように保持される環境を、所望のキセノン分圧又は全圧に調整するために、どのような適切なシステムが用いられてもよい。このようなシステムの一般的な特徴は、ガス貯蔵部を含み、ガス貯蔵部は好ましくは容器に操作可能に接続されている。適切なガスシステムは、バルブ、ポンプ、ファン、ベント及びそれらの組み合わせ、並びに、システムの要素や容器に送出されるガスの量、ガスの送出レートを制御するためのコントローラーを含み、またこれらに制限されない要素を含むことができる。システムは付加的に、容器から空気を含むキセノンを排出するため、及び／又は、容器内を真空にするために用いられる一又は複数の要素を含んでもよい。システム全体又はいかなる要素、或いは、要素の部分は、手動で操作されてもよく、コンピュータ及びコンピュータプログラムで操作されるように自動化されていてもよい。

ある態様において、細胞は、キセノン、ＣＯ_２及び付加的に窒素の混合ガスに貯蔵され又は暴露される。つまり混合ガスは、９％キセノン・５％ＣＯ_２・残余分Ｎ_２から、９５％キセノン・５％ＣＯ_２までありうる。ある態様において、容器内の気体におけるキセノンの濃度が少なくとも９％になるまで、キセノン（又はキセノンを含む混合ガス）が容器内の空気に導入される。存在する気体／空気を付随して除去してもよいし、しなくてもよい。ある態様において、容器内の空気はキセノンからなる。別の態様において、空気はキセノンと微量の不純物とからなる。つまり、ある態様において、空気は実質的にキセノンと少なくとも５％のＣＯ_２とからなりうる。

キセノンが初めに添加される温度は多様であり、取り扱われる細胞のタイプによるだろう。一般的に、温度は２２℃〜３７℃の間であり、これらを含み、これらの間の全ての整数値、小数点以下１０桁までの全ての値を含む。キセノン又はキセノンを含有する混合ガスの導入の間の温度に関わらず、ひとたび容器内の圧力が大気圧より０．５〜４Ａｔｍ上に達すると、細胞は、加圧容器内で所定の時間保持され、その間容器内の温度は２２℃〜３７℃であり、それらの値を含み、それらの間の小数点以下１０桁までの全ての数字を含む。細胞が、この温度及び圧力の範囲に保持される所定時間は、１５分間〜２４時間の間であり、これらの間の全ての時間を含む。この関係で、いかなる理論にも拘束されることを意図するものではないが、細胞を２２℃〜３７℃かつ大気圧よりも０．５〜４．０Ａｔｍ上に保持することは、細胞をキセノンで飽和せしめ、本発明の残りのステップを実行するに従って、このことが細胞のアポトーシスを阻止し、貯蔵及び／又は運搬の間の細胞の生存性を向上させると考えられている。

細胞が、大気圧よりも０．５〜４．０Ａｔｍ上、２２℃〜３７℃で１５分間〜２４時間保持された後、大気圧よりも０．５〜４．０Ａｔｍ上の圧力を維持しながら、容器内の温度が０．１℃〜１０℃に下げられる。温度は、これらの温度、これらの間の全ての整数値、これらの間の小数点以下１０桁までの全ての値を含んでよい。ある態様において、容器内の温度は、冷却された筐体に容器を載置することで下げられる。この温度及び圧力の範囲は、所定の時間維持され、それは２時間〜３週間、それらの間の全ての時間間隔でありえ、容器の中の細胞が０．１℃〜１０℃の間に達するために必要な時間以下ではない。つまり、本発明は、低温・高圧で、７、８、９、１０、１１、１２，１３、１４日間又はそれ以上の日数、細胞を貯蔵するために適している。

細胞を、大気圧よりも０．５〜４．０Ａｔｍ上、０．１℃〜＋１０℃に保持することに続いて、容器内の圧力が大気圧まで（例えばバルブや蓋の開放によって）下げられ、また、容器内の温度が２２℃〜３７℃の間に上げられるが、これらの値を含み、これらの間の全ての整数値、これらの間の小数点以下１０桁までの全ての数値を含む。これらの細胞は、リファレンスよりもアポトーシスが少ない。

本発明の方法に従って扱われる細胞を収容する容器は、多様な手段に用いられるために、場所及び／又は人又は物に運搬されてよく、その時も細胞は、リファレンスよりもアポトーシスが少ない。

本発明はまた、濃度が高められたキセノンに加圧下で暴露されていない細胞よりもアポトーシスがより少ない、濃度が高められたキセノン又はキセノンを含む混合ガスに暴露された有核細胞を含む、冷却された組成物を提供する。

続く実施例は本発明を描写するものであるが、本発明はこれに制限されない。

これらの実施例に示されるデータを得るために、白血病単球リンパ腫細胞Ｕ−９３７が、１５％ウシ胎仔血清と１０ｍｋｇ／ｍＬゲンタマイシンを添加されたＲＰＭＩ−１６４０培地で、５％ＣＯ_２、３７℃雰囲気で培養された。対数増殖期にある培養細胞を収容したペトリ皿が保持ラックに載置されて、高圧条件で貯蔵するように設計された、約１．５Ｌの内部容量を有する容器に移された。Ｘｅ−ＣＯ_２（其々９５％、５％）混合ガスが、図に示される特定のパラメータで、５〜１０分の間、大気圧より０．５〜４．０Ａｔｍ上の圧力にするために用いられた。この発明の態様において、温度は２２℃〜３７℃に保持された。ガスは、それぞれの分圧の計算に基づいて、分離されたタンクで（又は、容器／管で）混合された。ペトリ皿を収容した容器はこの温度・圧力で２時間保持された。その後、容器は、圧力を維持しながら、温度が下げられた（０．１℃〜＋５℃）冷蔵庫に移された。容器はこれらの条件下で約４週間保持された。その後、圧力は開放され、細胞を保持した容器は７日間、通常条件で＋４℃〜＋１０℃、大気圧に保持された。

我々は、前述の方法でジャーカット細胞及びＵ−９３７細胞を扱うことを選択した。なぜならそれらは核を有し、完全なアポトーシスのカスケード機構を有しているからである。すなわち、これらの細胞は多数の細胞外および細胞内のプロアポトーシスシグナルに応答し、アポトーシスの分析のためにモデル細胞として用いられてきた。(Pimentel-Muifios FX, Seed B. Regulated commitment of TNF receptor signaling: a molecular switch for death or activation. Immunity. 1999 Dec;11(6):783-93; Karas M, Zaks TZ, Liu JL, LeRoith D.T cell receptor-induced activation and apoptosis in cycling human T cells occur throughout the cell cycle. Mol BioI Cell. 1999 Dec;10(l2):4441-50; Valavanis C, Hu Y, Yang Y, Osborne BA, Chouaib S, Greene L, Ashwell JD, Schwartz LM. Model cell lines for the study of apoptosis in vitro. Methods Cell BioI. 2001;66:417-36)

本発明の方法に細胞を供した後、我々は生細胞の数（図１）、アポトーシスの強度を示唆するカスパーゼ３活性（図２）を分析した。図１及び２に表されたデータは、本発明の方法は細胞の自然発生的な死を阻害することを示している。

キセノンでの処理はまた、ドキソルビシンへの暴露の後の細胞生育を増強した（図３）。特に、リファレンス（コントロール）細胞はドキソルビシン誘導死を受け続けた一方、キセノンで処理されたサンプル（Xe+37doxo、Xe+4doxo）では生細胞数の増加が観察された。キセノンは、自然発生的（「Doxo無し」及び「処理無し」）及び誘導された（「Doxo」）アポトーシスの両方を、ジャーカット（図４）とＵ−９３７細胞（図５）の両方において、抑止した。

アポトーシス誘導物質として公知であるドキソルビシンは、ミトコンドリア膜電位差にダメージを与える。キセノン（冷却との組み合わせも、冷却なしでも）は、細胞のミトコンドリアに保護的な作用を及ぼした。例えば、キセノンの存在下で、ダメージを受けていないミトコンドリアを有するドキソルビシン処理細胞のパーセンテージは、貯蔵２４時間後と７日後のどちらでも、キセノン無しで貯蔵された細胞よりも明らかに高かった（図５）。貯蔵７日後、キセノンはまた、コントロール（ガスなし、３７℃）に対してミトコンドリアのダメージを明らかに減少させた。これは、培地における細胞分裂のない細胞成長による‐通常、これらの細胞は２−３日毎に分裂する。ミトコンドリアの保護は、キセノンの存在が冷却の作用からオルガネラを保護することのためであると考えられている（図２、doxoあり／無しのXe+4及びNG+4群）。

本発明は描写の目的のために詳細が説明されたが、これらの詳細は単に目的のためであり、当業者によって、続くクレームによって定義される本発明の精神および目的から離れることなく、多様なバリエーションが作られることが理解される。

Claims (13)

1. 細胞のアポトーシスを低減する方法であって：
   ｉ）有核細胞を容器内に保持すること、及びキセノンを含むガスを当該容器に導入して容器内の圧力が大気圧よりも０．５〜４．０Ａｔｍ上に達するようにすること；
   ii）前記圧力で、容器内の温度が２２℃〜３７℃である所定の時間、ｉ）の容器を保持すること；
   iii）圧力を維持しながら、容器内の温度を０．１℃〜１０℃に下げること；
   iv）所定時間、iii）の温度と圧力で容器を保持すること；
   v）iv）の容器の圧力を順次大気圧まで下げ、温度を２２℃〜３７℃に上げること；
   ｖ）の容器内の細胞はリファレンスよりもアポトーシスが少ない、方法。
2. ii）の所定時間が、１５分〜２４時間であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. iv）の所定時間が、２時間〜３週間であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
4. iv）の所定時間が少なくとも２日間であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
5. iv）の所定時間が少なくとも７日間であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
6. iv）の所定時間が少なくとも１４日間であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
7. iii）の圧力が大気圧の３Ａｔｍ及び４Ａｔｍ上の間であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
8. iv）の圧力が大気圧の３Ａｔｍ及び４Ａｔｍ上の間であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
9. iv）の温度が、４℃〜１０℃であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
10. 細胞が哺乳類細胞である、請求項１に記載の方法。
11. 細胞がヒト細胞である、請求項１０に記載の方法。
12. 有核細胞を含む冷却された組成物であって、当該細胞は容器内に存在し、０．１℃〜１０℃の間の温度に保持されており、容器内部の圧力は、キセノンを含むガスを容器内に導入することで、大気圧の０．５〜４．０Ａｔｍ上の間になっている、組成物。
13. 細胞がヒト細胞である請求項１２に記載の組成物。

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