TWI600764B - 保存細胞及細胞培養物之方法 - Google Patents

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Description

保存細胞及細胞培養物之方法
本發明基本上係關於細胞之保存及更特定言之，關於真核有核細胞之體外保存。
本申請案主張2011年2月7日申請之美國申請案61/436,441之優先權，該案揭示內容係以引用之方式併入本文。
在短及長時間內保存包含活細胞之生物材料係現代醫學科學最為嚴峻之挑戰之一。在低溫保護物質存在下將溫度冷卻至-20℃至-176℃範圍內仍係保存活細胞最廣泛採用之方法。低溫保護機理涉及防止冰晶形成，冰晶會破壞細胞及/或細胞組分。然而，此等及其他用於細胞保存之方法會導致對儲存細胞之應力，及經受保存所涉及之操作之一部分細胞幾乎總是發生細胞凋亡。(參見，例如，de Boer F等人，J Hematother Stem Cell Res.2002 Dec；11(6)：951-63；Shapiro AM等人，Diabetes Technol Ther.2000 Autumn；2(3)：449-52；Cookson P等人，Transfus Med.2010 Dec；20(6)：392-402)。此外，直接自器官及組織獲得且未經培養之細胞常在保存及運輸期間受損。因此，仍不斷需求改良之方法用於保存細胞及防止其等在保存及/或運輸期間發生死亡，如細胞凋亡。本發明滿足此及其他需求。
本發明提供一種減少細胞凋亡之方法。該方法包含基本步驟：i)將有核細胞存放於一容器中及將含有氙氣之氣體添加至該容器以使該容器內之壓力高出環境壓力0.5至4.0 Atm；ii)將i)之容器存放於高出環境壓力0.5至4.0 Atm之壓力下一段時間，此期間容器中之溫度為22℃至37℃；iii)使該容器中之溫度降低至0.1℃至10℃，同時維持壓力高出環境壓力0.5至4.0 Atm；iv)將該容器存放在0.1℃至10℃之溫度及高出環境壓力0.5至4.0 Atm之壓力下一段時間；及v)依序使該容器中之壓力降低至環境壓力及使溫度升高至22℃-37℃。依照此方法處理之細胞相較於參照物發生較少細胞凋亡。
於各實施例中，容器存放在高出環境壓力0.5至4.0 Atm之壓力及22℃至37℃之溫度下之時間為15分鐘至24小時。容器存放在0.1℃至10℃之溫度及高出環境壓力0.5至4.0 Atm之壓力下之時間為2小時至三週，包括，但不限制於，2小時至24小時，或至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天等，至多三週。該方法包括減少哺乳動物細胞之細胞凋亡，該哺乳動物細胞可係人類細胞。
本發明亦提供一種冷藏組合物，其包含有核細胞，其中該等細胞存在於一容器中並存放在0.1℃與10℃之間之溫度下，及其中，由於將包含氙氣之氣體導入至該容器中，故該容器內之壓力高出環境壓力0.5至4.0 Atm。
本發明提供抑制細胞凋亡之方法。該方法係基於吾人以下發現：如下文進一步描述在特定壓力及溫度下處理包含於含氙氣之氛圍中之有核細胞導致細胞之細胞凋亡減少。本發明特別適宜用於減少細胞在保存及/或運輸期間之細胞凋亡。於各實施例中，利用本發明方法處理之細胞可在0.1℃至10℃之溫度及壓力下保存至多兩週。本發明可在不使用習知低溫保護劑下實施。
一般而言，本發明包含以下依序步驟：i)將有核細胞存放於一容器中及將氙氣或含有Xe之氣體混合物添加至該容器中以使該容器內之壓力高出環境壓力0.5至4.0 Atm(1.5至5.0 Atm絕對壓力)；ii)將i)之容器存放在高出環境壓力0.5至4 Atm之壓力下一段時間，期間該容器中之溫度係於22℃與37℃之間；iii)使該容器中之溫度降至0.1℃-10℃，同時維持壓力高出環境壓力0.5-4.0 Atm；iv)將該容器存放在0.1℃至10℃之溫度及高出環境壓力0.5至4.0 Atm之壓力下一段時間；及v)使iv)之容器中之壓力降至環境壓力及使溫度升至22℃-37℃。藉由實施此等步驟，v)之細胞相較於參照物發生較少細胞凋亡。
可用於與依照本發明方法處理之細胞對比之參照物可係任何適宜參照物。例如，該參照物可係未曾曝露於本發明方法用於處理細胞之參數中之一或多者之對照細胞。該參照物可係藉此可比較本發明方法之作用之標準化曲線、曲線下之面積、圖、表或數據之任何其他表現方式。
於一實施例中，用於存放細胞之壓力係高出環境壓力 0.5至4.0 Atm，及其中至十分位小數之所有壓力。除非另外說明，否則本文中所提及之所有壓力意指超過Atm之壓力(高壓或超大氣壓)。環境壓力意指無外加壓力之正常大氣壓力，其一般係於0.84至1.07 Atm之範圍內，將平均環境壓力視為1 Atm。
預期本發明適用於抑制任何有核細胞之細胞凋亡。於各實施例中，經本發明方法處理之細胞可增殖。該等細胞具有沿著一或多個細胞系分化之潛力。因此，該等細胞可具有全能性、複能性、多能性或單能性。因此該等細胞可係幹細胞，包括，但不限制於，成人幹細胞、組織特異幹細胞、胎兒幹細胞、胚胎幹細胞、誘導複能幹細胞或癌幹細胞。於各實施例中，該等細胞可自複能性細胞(如間葉幹細胞或造血幹細胞)產生。例如，肌胚細胞及心肌細胞可自間葉幹細胞產生，而造血幹細胞可自骨髓幹細胞產生。於一實施例中，該等細胞可係單倍體，如未受精卵細胞。
於特定實施例中，該等細胞可係永生化細胞，如一般由自原始源分離之繁殖及/或傳代細胞建立之細胞株。於其他實施例中，該方法係用於抑制自初生組織解離之細胞(如自初生組織樣品獲得之單細胞懸浮液)發生細胞凋亡。於另一實施例中，依照本發明方法處理之細胞可係組織中之一部分，包括，但不限制於，組織活體、組織切片或組織培養物。於一實施例中，利用本發明方法處理之細胞不含血小板。於另一實施例中，利用本發明方法處理之細胞不存在於器官中。該等細胞可自任何動物獲得或產生。於 一實施例中，該動物係哺乳動物。於一實施例中，該哺乳動物係人類。
如上所述，本發明之方法涉及先將有核細胞存放於一容器中及將氙氣(或包含Xe之氣體混合物)添加至該容器中，以使該容器內之壓力高出環境壓力0.5至4 Atm，及包括其間之帶有十分位小數之所有數值。就此而言，該容器可係適宜存放使細胞在體外生長及/或保存之一載具之任何容器。特定言之，可將裝有細胞之任何載具，如試管、燒瓶、培養皿、Eppendorf管、組織培養皿、多孔培養板等放置於該容器中。將瞭解，當將裝有細胞之載具放置於該容器中時，該載具係經配置以使其中之細胞曝露於所添加之氙氣及容器內之壓力。例如，若裝有細胞之載具係試管，則不密封該試管，以容許添加至該容器之氙氣對該等細胞施加壓力及併入其中。
添加有氙氣且存放裝有細胞之載具之容器可係任何適宜容器。適宜容器可呈剛性，如缸、燒瓶、箱或管。該容器應可維持氣密環境。因此，該容器可氣密密封。該容器亦可係可撓可密封容器，其實例包括，但不限制於，囊袋。該容器及待添加至該容器之氙氣(或含Xe之氣體混合物)宜無菌。當實施本發明之方法時，可將任何適宜系統用於調節存放細胞之氛圍以提供具有所需之氙氣分壓或總壓之氛圍。此等系統之基本特徵件包括一氣體儲集器，其中該儲集器較佳操作上可連接至該容器。適宜氣體系統可包含以下組件：包括，但不限制於，閥門、泵、風扇、通氣孔及 其等組合，及用於控制該等系統組件，及遞送至該容器之氣體之量及遞送該氣體之速率之控制器。該系統可另包含用於將含氙氣氛圍自該容器排空及/或在該容器中建立真空之一或多個組件。整個系統或任何組件或組件之任何部分可手工操作，或自動運行以由電腦及電腦程式操作。
於一實施例中，該等細胞係經保存或曝露於氙氣CO2及視需要含有氮氣之氣體混合物。因此，該氣體混合物可包含9%氙氣、5% CO2及其餘為N2至95%氙氣及5% CO2。於一實施例中，將氙氣(或包含氙氣之氣體混合物)導入至容器內之氛圍中，同時移除或不移除已有氣體/空氣，直至容器內之氣體氛圍中之氙氣濃度為至少9%。於一實施例中，容器內之氛圍係由氙氣組成。於另一實施例中，該氛圍可係由氙氣及痕量雜質組成。因此，於一實施例中，該氛圍可實質上由氙氣及至少5% CO2組成。
先將氙氣添加至該容器時之溫度可變化且將視待處理細胞之類型而定。一般而言，該溫度係於22℃與37℃之間，及包括其間之所有整數，及連續整數間帶有十分位小數之所有數。在不考量添加氙氣或含有Xe之氣體混合物期間之溫度下，一旦該容器內之壓力高出環境壓力0.5至4 Atm，則將細胞存放在該壓力下在該容器中一段時間，期間該容器中之溫度係於22℃與37℃之間，及包括其間帶有十分位小數之所有數值。細胞存放於此溫度及壓力範圍下之時間可為15分鐘至24小時，包括其間之所有時間間隔。就此而言且期望不受任何具體理論約束，預期將細胞存放在22℃ 至37℃及高出環境壓力0.5至4 Atm之壓力下會導致該等細胞浸透氙氣及實施本發明之餘下步驟將抑制該等細胞之細胞凋亡，進而增進細胞在保存及/或運輸期間之耐久性。
將細胞存放在高出環境壓力0.5至4.0 Atm之壓力及22℃至37℃下15分鐘至24小時之後，使容器中之溫度降至0.1℃與10℃之間，及包括其間之所有整數，及連續整數間帶有十分位小數之所有數，同時維持壓力高出環境壓力0.5至4.0 Atm。於一實施例中，藉由將該容器放置於冷藏庫中降低該容器中之溫度。將此溫度及壓力範圍維持一段時間，該段時間包括2小時至3週，包括其間之所有時間間隔，但不少於使該容器內之細胞達到0.1℃至10℃之溫度所需之時間。因此，本發明可用於在降低之溫度及增大之壓力下將細胞保存7、8、9、10、11、12、13、14或更多天。
將細胞存放在高出環境壓力0.5至4.0 Atm之壓力及0.1℃至10℃之溫度下之後，使該容器中之壓力降至環境壓力(如，藉由釋放閥門或蓋罩)及使該容器中之溫度升至22℃-37℃之間，及包括其間之所有整數，及連續整數間帶有十分位小數之所有數。此等細胞相較於參照物發生較少細胞凋亡。
可將裝有依照本發明方法處理之細胞之容器運送至某一位置及/或個別或整體地用於不同製程，且該等細胞相較於參照物仍發生較少細胞凋亡。
本發明亦提供一種包含有核細胞之冷藏組合物，該有核細胞係曝露於壓力下之高濃度氙氣或包含Xe之氣體混合 物，但相較於未曝露於壓力下之高濃度氙氣之細胞發生較少細胞凋亡。
以下實例意欲說明而非限制本發明。
為了獲得此等實例中顯示之數據，使白血病單核淋巴瘤細胞U-937在補充有15%胎牛血清及10 mkg/ml慶大黴素之RPMI-1640介質中，於5% CO2之氛圍及37℃下生長。將裝有處於指數生長階段之細胞培養物之培養皿放置於固定架中，並轉移至經設計在高壓條件下保存之具有約1.5 L內容積之容器中。在5至10分鐘內，使用Xe-CO2(各別係95%及5%)之氣體混合物建立高出環境壓力0.5至4.0 Atm之壓力，具體參數將結合本文中之圖示呈現。於本發明之此實施例中，使溫度維持在22℃-37℃。依據計算之其分壓，在另一個槽(或於容器/管)中混合該等氣體。將裝有培養皿之該容器維持在此溫度及壓力下2小時。隨後將該容器轉移至降低溫度(0.1℃至5℃)之冷藏庫，同時維持該壓力。將該容器維持於此等條件下持續約4週。此後，釋放壓力及將存放細胞之容器於4℃至10℃之溫度及環境壓力之室內放置7天。
吾人選擇根據以上製程處理Jrukat及U-937細胞，係因該等細胞具有核體及全程細胞凋亡級聯機制。因此，此等細胞對大量細胞外及細胞內促細胞凋亡信號產生反應，及且用作分析細胞凋亡用之模型細胞(Pimentel-Muiños FX，Seed B.Regulated commitment of TNF receptor signaling：a molecular switch for death or activation.Immunity.1999 Dec；11(6)：783-93；Karas M,Zaks TZ,Liu JL,LeRoith D.T cell receptor-induced activation and apoptosis in cycling human T cells occur throughout the cell cycle.Mol Biol Cell.1999 Dec；10(12)：4441-50；Valavanis C,Hu Y,Yang Y,Osborne BA,Chouaib S,Greene L,Ashwell JD,Schwartz LM.Model cell lines for the study of apoptosis in vitro.Methods Cell Biol.2001；66：417-36)。
在依照本發明方法處理細胞之後，吾人分析活細胞之數量(圖1)，及指出細胞凋亡強度之卡斯蛋白酶-3之活性(圖2)。圖1及2中出示之數據證實，本發明之方法抑制細胞之自發死亡。
藉由氙氣處理亦改良在曝露於阿黴素後之細胞生長(圖3)。特定言之，參照物(對照)細胞繼續發生由阿黴素誘導之死亡，同時觀察到在經氙氣(Xe+37doxo、Xe+4doxo)處理之樣品中，活細胞數量增大。氙氣防止Jurkat(圖4)及U-937細胞(圖5)發生自發(無Doxo及未經處理)及誘導(Doxo)細胞凋亡。
阿黴素係一種已知細胞凋亡誘導劑，其具有破壞粒腺體膜之能力。氙氣(冷卻及未冷卻時)對細胞粒腺體產生保護作用。例如，在氙氣存在下，在保存24小時及7天之後，經阿黴素處理且粒腺體未受損之細胞之百分比相較於不利用氙氣保存(圖5)之細胞顯著更高。在保存7天之後，氙氣亦相較於對照物(無氣體，37℃)顯著降低對粒腺體之破壞，此係因在介質中之細胞生長不發生細胞分裂，正常情 況下，此等細胞每2至3天分裂一次。據信，粒腺體得以保護係因氙氣之存在會保護細胞器免受低溫影響(圖2，使用及不使用doxo之Xe+4組及NG+4組)。
雖然本發明已針對說明之目的進行詳細描述，然而應理解，此等細節僅針對彼目的，且在不脫離由以下專利申請範圍定義之本發明精神及範圍下，熟習本項技術者可對此實施變化。
圖1顯示在4 Atm之壓力及指定溫度下保存24小時(圖1A)及7天(圖1B)之後基於流式細胞儀確定之人類白血病單核淋巴瘤細胞株U-937細胞之百分比。於一容器或經設計用於細胞培養之37℃標準CO2培養箱(對照)中，將細胞保存於培養皿(Petri dish)中指定時間。自保存狀態移出之後，使細胞在60分鐘內逐級減壓，以抗CD14抗體染色及藉由流式細胞儀分類。抗CD14抗體係單核球及巨噬細胞之標記物。繪製對於抗CD14呈染色陽性之總細胞之百分比。
圖2顯示在4 Atm過量氙氣之壓力下保存24小時期間活白血病單核淋巴瘤細胞株Jurkat細胞相對總細胞數量之百分比。細胞係如圖1所描述般處理。細胞係於細胞凋亡誘導劑阿黴素(doxo)存在或不存在下於指定壓力下保存。利用標準錐蟲藍排除法將活細胞與死細胞區分開。
圖3顯示將活Jurkat細胞自保存條件轉移並放置在標準培養條件(37℃含5% CO2之空氣)下之後培養物中之活Jurkat細胞數量之變化。在標準條件下培養24小時之前及之後以 錐蟲藍染料對細胞染色以確定細胞數。對照組之細胞係於標準培養條件、環境壓力下生長，包括保存期間。對照細胞係於實驗第0天時自實驗細胞之同一燒瓶獲得並塗佈於培養皿上。
圖4顯示，藉由將包含氙氣之氣體導入該容器中所獲得之4 Atm過高壓力防止Jurkat細胞發生自發(圖中之無Doxo系列)及誘導(圖中之Doxo系列)細胞凋亡。在此實驗組中監控保存24小時後之卡斯蛋白酶3之活性。
圖5顯示以染色劑JC-1對白血病單核淋巴瘤細胞株U-937細胞(依照上述方法在超過環境壓力4 Atm之壓力Xe下保存24小時(圖5A)及7天(圖5B))染色，該染色容許藉由流式細胞儀評估粒腺體之狀態。
圖6顯示對依照本發明方法保存1、14及28天時之白血病單核淋巴瘤細胞株U-937細胞之染色。該等細胞係使用連接素(Annexin)-FITC/碘化丙啶(Propidium Iodide)染色套組染色，該染色可區分活、壞死、早期及晚期細胞凋亡細胞。在保存結束之後，改變培養介質及在常規條件下將細胞再培養1天以估算回收率。「Xe+4」：在+4℃下之氣體混合物，95% Xe+5% CO2(4 atm過高壓力)，「NG+4」：在環境壓力及+4℃的溫度下保存；NG+37：指定用於參照樣品，該樣品係於37℃，5% CO2下培養，每三天更換培養介質。

Claims (21)

  1. 一種減少細胞之細胞凋亡之方法，其包括：i)將有核細胞存放於一容器中；ii)將包含氙氣之氣體添加至該容器，使該容器內之壓力高出環境壓力0.5至4Atm；iii)於第一段時間維持該容器中之該壓力，此期間該容器中之溫度為22℃至37℃；iv)在該第一段時間後使該容器中之溫度降至0.1℃-10℃，同時維持該壓力高出環境壓力0.5至4Atm；v)於第二段時間使該容器維持在該較低溫度及高出環境壓力0.5至4Atm之壓力，其中該第二段時間較第一段時間長；及vi)在該第二段時間後使容器中壓力降至環境壓力，及使該容器中之溫度升至22℃-37℃。
  2. 如請求項1之方法，其中該第一段時間為15分鐘至24小時。
  3. 如請求項1之方法，其中該第二段時間為2小時至三週。
  4. 如請求項2之方法，其中該第二段時間為2小時至三週。
  5. 如請求項1之方法，其中該第二段時間為至少2天。
  6. 如請求項4之方法，其中該第二段時間為至少2天。
  7. 如請求項5之方法，其中該第二段時間為至少7天。
  8. 如請求項6之方法，其中該第二段時間為至少14天。
  9. 如請求項1之方法，其中在該第二段時間內該容器中之該壓力係高出環境壓力3Atm至4Atm。
  10. 如請求項8之方法，其中在該第二段時間內該容器中之該壓力係高出環境壓力3Atm至4Atm。
  11. 如請求項1之方法，其中在該第二段時間內之溫度為4℃-10℃。
  12. 如請求項10之方法，其中在該第二段時間內之溫度為4℃-10℃。
  13. 如請求項1之方法，其中在第二段時間後，該壓力係在第三段時間於該容器中逐步降低，該第三段時間為至多60分鐘。
  14. 如請求項12之方法，其中在第二段時間後，該壓力係在第三段時間於該容器中逐步降低，該第三段時間為至多60分鐘。
  15. 如請求項1之方法，其中該氣體為氙氣。
  16. 如請求項12之方法，其中該氣體為氙氣。
  17. 如請求項1之方法，其中該氣體為包含氙氣、二氧化碳及氮氣之氣體混合物，該氙氣含量高於該二氧化碳含量且低於該氮氣含量。
  18. 如請求項12之方法，其中該氣體為包含氙氣、二氧化碳及氮氣之氣體混合物，該氙氣含量高於該二氧化碳含量且低於該氮氣含量。
  19. 如請求項1之方法，其中該氣體為包含氙氣及二氧化碳之氣體混合物，該氙氣含量高於該二氧化碳含量。
  20. 如請求項12之方法，其中該氣體為包含氙氣及二氧化碳之氣體混合物，該氙氣含量高於該二氧化碳含量。
  21. 如請求項1之方法，其中該等細胞係哺乳動物細胞或人類細胞。
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