TWI610622B - 活組織保存方法 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種用於血小板保存之方法，該方法包括將包含血小板的組合物置於約0至10巴壓力下約18℃至37℃之第一溫度下之包含氙氣及氧氣的氣體混合物中達第一時段，然後，接著將該組合物冷卻至約0.1℃至6℃之第二溫度，並且將該組合物保持在該壓力及該第二溫度下達第二時段。

Description

活組織保存方法

本發明大體而言係關於活組織保存的領域，更特定言之係關於血小板之保存，及甚至更特定言之係關於血小板於氙氣及氧氣氣氛中之保存。

本發明主張2011年9月26日申請之美國臨時專利申請案序號61/539,009之優先權，該案以引用的方式併入本文中。

目前用於血小板儲存之標準方法包括將血小板保存在持續搖動的袋子中。該方法受限於5天的儲存時間及必須將血小板保持在室溫下，因為血小板無法耐受冷凍。因此，針對可以增加血小板儲存時間的方法有持續性的需求。本發明滿足該等及其他需求。

本發明提供一種用於將可用的血小板壽命延長超過五(5)天的血小板保存方法。該方法概括而言是包括得到一包含血小板之組合物及將該組合物暴露於氣體混合物，並將該組合物保持在冷卻的溫度下。該包含血小板之組合物一般而言係保持於壓力條件下；然而，此並非必須的。

本文所揭示包括(但非必然受限於)氣體百分率、溫度及壓力單位的所有範圍包括每一範圍的本數及介於其間的所有整數及十分位及百分位小數點之數值。

本發明一個非限制性態樣中，該氣體混合物包含氙氣及 氧氣。該氣體混合物可包含微量的其他氣體。一般而言，該氣體混合物包含至少約95%氙氣及氧氣，典型地，該氣體混合物包含至少約98%氙氣及氧氣，又更特定言之，該氣體混合物包含至少約99%氙氣及氧氣，然又更特定言之，該氣體混合物包含至少約99.5%氙氣及氧氣，及甚至更特定言之，該氣體混合物包含至少約99.9%氙氣及氧氣。該氣體混合物所包含的氙氣多於氧氣。本發明一個非限制性實施例中，該氣體混合物包含約79%至95%氙氣。本發明另一非限制性實施例中，該氣體混合物包含約80%至92%氙氣。本發明又一非限制性實施例中，該氣體混合物包含約82%至91%氙氣。本發明又一非限制性實施例中，該氣體混合物包含約85%至90%氙氣。本發明又一非限制性實施例中，該氣體混合物包含約86%至88%氙氣。本發明另一非限制性實施例中，該氣體混合物包含約5%至21%氧氣。本發明又一非限制性實施例中，該氣體混合物包含高於5%且小於21%之氧氣。本發明又一非限制性實施例中，該氣體混合物包含約6%至18%氧氣。本發明又一非限制性實施例中，該氣體混合物包含約10%至16%氧氣。本發明另一非限制性實施例中，該氣體混合物包含約12%至14%氧氣。

本發明另一及/或替代性的非限制性態樣中，該方法包括將包括血小板的組合物暴露於特定壓力下氣體混合物之步驟。本發明一個非限制性實施例中，將包含血小板的組合物暴露於約0至10巴氣體壓力下之氣體混合物。本發明 另一非限制性實施例中，將包含血小板的組合物暴露於約1至8巴氣體壓力下之氣體混合物。本發明又一非限制性實施例中，將包含血小板的組合物暴露於約2至6巴氣體壓力下之氣體混合物。本發明又一非限制性實施例中，將包含血小板的組合物暴露於約3至5巴氣體壓力下之氣體混合物。本發明又一非限制性實施例中，將包含血小板的組合物暴露於約3.5至5巴氣體壓力下之氣體混合物。

本發明另一及/或替代性的非限制性態樣中，該方法包括將包含血小板的組合物在氣體混合物存在下維持在第一溫度達第一時段之步驟。本發明一個非限制性實施例中，該包含血小板的組合物是在氣體混合物存在下維持在第一溫度約18℃至37℃達第一時段的時間。於一個非限制性實施例中，該包含血小板的組合物是在氣體混合物存在下在約18℃至23℃之第一溫度下維持達第一時段。於又一個非限制性實施例中，該包含血小板的組合物是在氣體混合物存在下在約20℃至22℃之第一溫度下維持達第一時段。所選擇的第一時段是能讓氣體混合物中的氙氣在包含血小板的組合物中部分或完全飽和。本發明一個非限制性實施例中，第一時段可使氣體混合物中的氙氣在包含血小板的組合物中達到完全飽和的至少約60%。本發明另一非限制性實施例中，第一時段可使氣體混合物中的氙氣在包含血小板的組合物中達到完全飽和的至少約75%。本發明又一非限制性實施例中，第一時段可使氣體混合物中的氙氣在包含血小板的組合物中達到完全飽和的至少約90%。本發明 又一非限制性實施例中，第一時段可使氣體混合物中的氙氣在包含血小板的組合物中達到完全飽和的約95%至100%。一般而言，在第一時段期間，該氣體混合物中氙氣的約2至20%溶解至包含血小板的組合物中，及典型地，在第一時段期間，該氣體混合物中氙氣的約5至18%溶解至包含血小板的組合物中，及更典型地，在第一時段期間，該氣體混合物中氙氣的約8至15%溶解至包含血小板的組合物中。本發明另一非限制性實施例中，該第一時段係約5秒至10小時。本發明又一非限制性實施例中，該第一時段係約60秒至5小時。本發明又一非限制性實施例中，該第一時段係約60秒至4小時。本發明又一非限制性實施例中，該第一時段係約60秒至3.5小時。本發明又一非限制性實施例中，該第一時段係約3至3.5小時。如可明瞭，當該包含血小板的組合物經氣體混合物中的氙氣部分或完全飽和時，溫度及/或壓力可係恆定或變化的。

又於本發明另一及/或替代性的非限制性態樣中，該方法包括在包含血小板之組合物經氣體混合物中之氙氣部分或完全飽和後，將該包含血小板之組合物冷卻至第二溫度之步驟。通常地，該包含血小板之組合物是冷卻至高於包含血小板之組合物之凍結點的第二溫度達第二時段的時間。本發明一個非限制性實施例中，該包含血小板之組合物是冷卻至第二溫度約0.1℃-6℃達第二時段。本發明另一非限制性實施例中，該包含血小板之組合物是冷卻至第二溫度約3℃至6℃達第二時段。第二時段通常至少5天及至 多達約一個月。於一個非限制性實施例中，第二時段長於5天且至多達約21天。於另一非限制性實施例中，第二時段長於5天及至多達約14天。

又於本發明另一及/或替代性的非限制性態樣中，該方法包括將包含血小板之組合物置於可讓容器中大多數血小板平坦或實質上平坦鋪放的容器中，同時該包含血小板之組合物1)經以氙氣部分或完全飽和化及/或2)隨後在經氙氣部分或完全飽和化後冷卻至第二溫度的步驟。於一個非限制性實施例中，該容器係設計成使包含血小板之組合物經以氙氣部分或完全飽和化後冷卻至第二溫度的同時，使容器中大多數血小板平坦或實質上平坦鋪放。

本發明一個非限制性特定實施例中，係提供一種用於血小板保存之方法，該方法包括在18℃至23℃時，將包含血小板之組合物置於壓力為3.5至5巴之包含79%至95%氙氣及5%至21%氧氣或由該等組成之氣體混合物中達一段時間，然後將該組合物冷卻至冷卻溫度3℃至6℃，並將該組合物在該壓力及該冷卻溫度下保持一段時間。該組合物在該壓力及該冷卻溫度下可儲存於冰箱中5天至14天。冷房可作為冷卻組合物之用，而其後該冷房可用於儲存該組合物。該組合物是置於氣體混合物可穿透過的容器中，及該組合物可暴露於氣密式密封室中之氣體混合物。該容器包括配備有可讓氣體混合物穿透的蓋子之氣密式密封容器。以氣體混合物可穿透的材料所製成之袋子可作為容器之用。將至少200 ml之包含血小板之組合物置於該袋子中， 及隨後將該組合物保持在該氣體混合物中及該壓力下達至少3小時。該組合物保持在氣體混合物中及該壓力下而無需額外泵送氣體混合物至氣密式密封室中，並且該組合物的冷卻是從氣密式密封室中氣體混合物壓力之穩定的時間點開始，而該穩定起因於氣體混合物之血小板血漿飽和化。輸注包含血小板之組合物之前，該組合物可保持在不超過1大氣壓之壓力及18℃至23℃之溫度下至少一段足以將該組合物周圍溫度溫熱至該溫度之時間。

本發明適用於保存血小板，諸如存在於血漿中的血小板。該方法可使用設計用於儲存血液產品之傳統式袋子或經特殊造型之容器。該袋子或容器係經過設計且材料係經挑選，如此可使得該袋子或容器為氙氣及氧氣不可穿透或可穿透的。該方法係使用能夠將氣體混合物供應給該袋子或容器(諸如但不限於氣密式密封室)之市售設備進行的。氣密式密封室可設計成可耐受至少5至10巴之內部氣體壓力；然而，此並非係必須的。包含血小板之組合物的冷卻可使用目前的冷凍設備(例如，傳統式冰箱等)進行，其中所保存血液產品可於其中冷卻並儲存；然而，此並非係必須的。

在無意受任何特定理論約束下，咸認為該方法有助於將氙氣及氧氣擴散至包含血小板之組合物中(包括擴散至血小板本身中)，且認為此係發生在將血小板保持於第一溫度約18℃至37℃及0至10巴壓力下具有79%至95%氙氣含量及5%至21%氧氣含量之氣體混合物中。咸認為以氙氣部分 或完全飽和化血小板有助於其後將血小板儲存於0.1℃至6℃溫度下，並保有該等血小板之活力及功能性。

該方法可用於包含血小板之任何組合物，其等包括(但不一定限於)含有血漿、富血小板血漿或經分離血小板或由該等物質所組成之組合物。該等血小板可利用習知技術從諸如任何哺乳動物(包括人類)的任何動物獲得。

與先前公開的方法對比，本發明不需將澱粉添加至包含血小板的組合物中。此外，與本發明相關的數據顯示，為保存血小板活力，血小板所暴露之氣體混合物中需含特定量的氧氣。特定言之，因為某些代謝過程在冷藏溫度下仍會在血小板中發生，因此需要氧氣來進行有氧呼吸作用。當保存大體積血小板血漿時(諸如體積高於200 ml)，血小板對氧氣的需求最為顯著，而在該等情況下，氙氣/氧氣氣體混合物中需存在5%至21%氧氣。於各種不同實施例中，袋子或容器中包含血小板之組合物的體積為約5 ml至400 ml或更多。於某些實施例中，包含血小板的組合物係經攪動及/或輕輕搖動，以增加與該組合物中氧氣之接觸；然而，此並非必須。通常，包含血小板之組合物當於第二溫度下冷卻時並不搖動或攪動；然而，此並非必須。

於本發明又一非限制性態樣中，為進行本發明方法，將該血小板組合物置於氣體可穿透的袋子或容器中，且將該氣體可穿透的袋子或容器置於其中經添加氣體混合物之氣密式密封室中。特定言之，可使用配備有氣體混合物可穿透的蓋子之氣密式密封容器或由氣體混合物可穿透的材料 製成之袋子或容器(例如，習知用於儲存血小板血漿的袋子)作為此等袋子或容器。

於各種不同實施例中，將包含血小板之組合物保持在0至10巴壓力下之氣體混合物中的第一時段可基於在未額外泵送氣體混合物至氣密式密封室中的情況下，測定該密封室中之氣體混合物壓力停止增加來決定。例如，可將氙氣及氧氣添加至容器中達到介於0至10巴之間的壓力。於一個非限制性實施例中，壓力為約3至4巴。可停止添加氣體混合物，及若需要，可將該密封室與氣體混合物來源分離，並保持(例如)搖動狀態。於搖動期間，壓力會減小且穩定。例如，若包含血小板之組合物總壓力約4巴，袋子或容器中的壓力則會減小且穩定在約3.5至3.9巴水平，咸信此是氙氣已適當地滲入血小板的指標。於此壓力減降之後，將容器冷卻至根據本發明方法之第二溫度。由於氣體混合物在較低溫度下的溶解度較高，因此袋子或容器內部的壓力可能在冷卻期間會進一步降低。一如一個非限制性實例，於環境溫度下容器內部壓力約3.8巴經冷卻至第二溫度期間可能會下降至約3.6巴。

於一個非限制性實施例中，當使用由氣體混合物可穿透的材料所製成且裝納200至400 ml血小板組合物之袋子或容器之情況下，可採用約2至5小時之暴露於約0至10巴壓力下第一溫度時之氣體混合物之第一時期；然而，此並非係必須的。

於各種不同實施例中，將血小板組合物冷卻至第二溫度 可以開始於氣密式密封室中發生氣體混合物壓力穩定的時間點之前、期間或之後。

使用保存輸注用的血小板之前，袋子或容器中的壓力係經釋放，如此使得血小板處於大氣壓下，而溫度則可藉由例如從第二溫度之冰藏狀態移出該組合物且使其升至約18℃至37℃溫度來升高溫度。特定言之，該氣密式密封室可從第二溫度之冷房取出，其後該氣密式密封解封，然後從容器移出具有血小板組合物之該容器，且在室溫及大氣壓下保持一段足以將該組合物周圍溫度溫熱至室溫及平衡壓力及/或釋放氣體混合物至周圍環境的時間。為了縮短釋放氣體混合物之時間，該袋子或容器可置於經降低壓力之條件下(相較於大氣壓)，即，真空；然而，此並非係必須的。

本發明與先前已公開方法之特定屬性的比較說明如下列實例。

實例1

進行實驗時係使用下述設備及材料。

血小板血漿(經由單一個體採樣捐血所得)係置於Baxter製造之塑膠袋中(Baxter塑膠袋PL 1813/1)。

該等實驗係使用氣密式密封室，內有血小板血漿之袋子置於其中，以便儲存。此密封室設計成可耐受至少5巴之內部壓力且經過特別製造，使其配備意欲用於在壓力下可供應氙氣及氧氣之管道及配備意欲用於控制供應於該密封 室中氣體含量及比率及該密封室內部氣體壓力之流量計及壓力計。氙氣及氧氣係藉由個別的高壓瓶供應。

預設溫度為4℃之醫用冰箱作為冷房之用。

保存及儲存之後，就下列的參數進行血小板血漿之適合性評估。

細胞數-顯示儲存後之細胞群保存程度之參數。該參數是以實驗開始時之細胞數-開始血小板血漿保存前之細胞數的百分比計算。

pH水平-決定血小板活力及功能性之參數其中之一(理想pH值為7.4)。pH值低於6.2或高於7.8，血小板(輸注給患者)很快會被人體淨化的系統自血流移除。在6.2至7.8範圍之pH水平被認為是保存的良好結果。就pH值方面而論，最佳結果是pH等於7.4。

乳酸含量-顯示在氧氣缺乏條件下，儲存期間細胞活力之參數。於儲存期間，乳酸含量因為代謝過程會增加，較高濃度之乳酸對血小板具有毒性。此外，當乳酸濃度高於20 mM/l時，血漿pH值會減降至6.2及更低。血小板活力及功能性會由於此pH減降的結果而劣化。所儲存血小板血漿中乳酸之可接受含量不應超過已在室溫下儲存至多5天之血小板血漿之乳酸含量值。

葡萄糖含量-亦與代謝相關且反映「細胞儲備食物」之參數。若血小板血漿中葡萄糖含量經儲存後明顯減低，特定百分率之血小板可能為無活力的，且在輸注後，此等血小板將無法發揮其功能並會從血液被消除。

根據以上所述之參數評估本發明一個非限制性實施例所獲得之血小板儲存結果。為了比較目的，亦就此等參數進行評估人類血小板製備品之三個對照樣本，如下：

樣本1(新製)-藉由單一個體採樣術所得之60 ms新鮮人類血小板血漿濃縮物。

樣本2(對照組RT)-於室溫儲存5天後之血小板血漿(標準存儲方法)。

樣本3(對照組+4)-在4℃溫度及大氣壓下之冰箱中儲存14天後之血小板血漿。

獲得下述實驗結果。

表中樣本4至7係以所指出的氣體百分率使用0至21%氧氣及其中氣體混合物之剩餘百分比為氙氣進行保存及儲存。

實驗結果顯示：

1)就血小板細胞數量而言，約13%氧氣濃度(樣本6)會得到最佳結果。

2)就pH水平而言，13%及21%氧氣濃度(樣本6及7)會得到最佳結果。

3)就乳酸含量而言，21%氧氣濃度(樣本7)會得到最佳結果。然而，相較於最佳結果(樣本7)，13%氧氣濃度得到的結果僅稍微不同，而其他樣本之結果相差25至50%。

4)就葡萄糖含量而言，所有樣本均得到可接受的結果，其中氧氣係存在於氣體混合物之組成中。13%氧氣濃度(樣本6)會得到最佳結果。

實驗結果說明，相較於先前所述之方法，本發明方法可以提供保存血小板血漿之長期儲存。此外，較長時間儲存相較已於先前論述者能夠實現明顯較大體積之血小板血漿，其中可使用本發明與習知用於血小板血漿存儲之袋子。

該等實驗證明，使用最低氧氣濃度5%即可得到適合的結果，而濃度高於21%氧氣對於血小板細胞而言具有毒性。

因此，咸理解從前述說明書中顯而易見的目標之中可有效達成前面設定的目標，且因為在不脫離本發明精神及範疇下可針對所提出的解釋作特定的改變，咸意欲以上說明書所包括及附圖所示之所有內容應理解為示例而不具限制意義。本發明已參考較佳及替代實施例進行闡述。熟習此項技藝者在閱讀及理解本文所提供詳細發明論述時可清楚的瞭解修改及變動。本發明意欲包括彼等屬於本發明範疇之所有修改及變動。咸亦應明瞭後述請求項申請專利範圍欲涵蓋本文所述該發明之所有一般及特殊特徵及本發明範疇(因語言之故，可稱為介於其間)之所有概述。本發明已 參考較佳實施例進行闡述。從本文揭示可明瞭本發明之較佳實施例以及其他實施例之該等及其他修改，其中前述論述內容應理解為僅僅例示本發明而非限制。咸意欲包括彼等介於附屬請求項申請專利範圍之所有該等修改及變動。

Claims (19)

1. 一種用於將可用的血小板壽命延長超過五天之血小板保存方法，其包括以下步驟：a)將包含血小板之組合物置於包含氙氣及氧氣之氣體混合物中，該氣體混合物包含79%至95%氙氣及5%至21%氧氣，該氣體混合物中氙氣及氧氣總和之含量係至少95%；b)將該包含血小板之組合物在該氣體混合物之存在下維持第一時段及維持於第一溫度下，直到該氣體混合物中之該氙氣已至少部分地使該包含血小板之組合物飽和為止；c)將經氙氣至少部分飽和之該包含血小板之組合物冷卻至第二溫度，該第二溫度係低於該第一溫度；及d)將該包含血小板之組合物保持在該第二溫度下達第二時段，該第一時段係小於該第二時段。
2. 如請求項1之方法，其中該氣體混合物包含86%至88%氙氣及12%至14%氧氣。
3. 如請求項1或2之方法，其中該第一溫度為18℃至37℃。
4. 如請求項3之方法，其中該第一溫度為18℃至23℃。
5. 如請求項1或2之方法，其中將該包含血小板之組合物在該氣體混合物之存在下維持第一時段及維持在第一溫度下之步驟包括使該包含血小板之組合物經受至少2巴之壓力。
6. 如請求項3之方法，其中將該包含血小板之組合物在該 氣體混合物之存在下維持第一時段及維持在第一溫度下之步驟包括使該包含血小板之組合物經受至少2巴之壓力。
7. 如請求項4之方法，其中將該包含血小板之組合物在該氣體混合物之存在下維持第一時段及維持在第一溫度下之步驟包括使該包含血小板之組合物經受至少2巴且不大於10巴之壓力。
8. 如請求項1或2之方法，其中該第一時段係5秒至10小時。
9. 如請求項7之方法，其中該第一時段係5秒至10小時。
10. 如請求項9之方法，其中該第一時段係60秒至5小時。
11. 如請求項1或2之方法，其中該第二溫度為0.1℃至6℃。
12. 如請求項9之方法，其中該第二溫度為0.1℃至6℃。
13. 如請求項12之方法，其中該第二溫度為3℃至6℃。
14. 如請求項1或2之方法，其中該第二時段係5天至21天。
15. 如請求項12之方法，其中該第二時段為5天至21天。
16. 如請求項1或2之方法，該包含血小板之組合物於該第一時段期間及在該第一溫度下經該氙氣達到完全飽和的至少80%。
17. 如請求項15之方法，該包含血小板之組合物於該第一時段期間及在該第一溫度下經該氙氣達到完全飽和的至少80%。
18. 如請求項1或2之方法，其中該組合物係置於該氣體混合物可穿過的袋子或容器中，且該組合物係暴露於氣密式 密封室內之該氣體混合物。
19. 如請求項17之方法，其中該組合物係置於該氣體混合物可穿過的袋子或容器中，且該組合物係暴露於氣密式密封室內之該氣體混合物。