CN114762500A - 一种高存活率的细胞冻存方法 - Google Patents

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CN114762500A CN202110529923.6A CN202110529923A CN114762500A CN 114762500 A CN114762500 A CN 114762500A CN 202110529923 A CN202110529923 A CN 202110529923A CN 114762500 A CN114762500 A CN 114762500A
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    • A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients

Abstract

本发明涉及生物技术领域，一种高存活率的细胞冻存方法。所述高存活率的细胞冻存方法，包括以下步骤：S1：取细胞悬浮液离心、弃上清得到细胞，将细胞与冻存液混合均匀得到细胞原液；S2：将细胞原液迅速转入冻存管中，将冻存管放入程序降温仪中进行程序降温；S3：程序降温完成后，转入液氮罐中保存；所述程序降温的步骤包括：(1)8℃等待10‑30min；(2)降温阶段‑1；(3)升温阶段；(4)降温阶段‑2。本发明经过的程序降温经过低温等待、降温阶段‑1、升温阶段、降温阶段‑2可以有效的减少此阶段细胞内冰晶释放潜热对细胞的损伤，增加了细胞的存活率。

Description

一种高存活率的细胞冻存方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，一种高存活率的细胞冻存方法。
背景技术
间充质干细胞【mesenchymal stem cells,MSC】是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞具有可以大量扩增的特点，被广泛使用到临床中和科学研究中，扩增后的干细胞有时需要被冻存起来，其目的是在低温环境下减缓细胞的代谢活动并维持生命，以备用于科研及临床随时复苏使用。传统的间充质干细胞是直接使用其与保护剂在液氮中冻存，，继而又发展了玻璃化冻存法：将细胞悬液和玻璃化溶液分别预冷后，在冻存管，向细胞悬液滴加玻璃化溶液，将冻存管两端以火焰封口，将冻存管投入液氮中保存。，但是这两种方法使用制备得到的细胞的存活率和增值能力较差。又发展了先将细胞与冻存液混合后先将其进行程序降温再转入液氮中保存，这种方法与玻璃化冻存法相比虽然效果较好，但是因为程序降温和冻存液的选择不佳，也达不到很好的效果。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的第一个方面提供了一种高存活率的细胞冻存方法，包括以下步骤：
S1：取细胞悬浮液离心、弃上清得到细胞，将细胞与冻存液混合均匀得到细胞原液；
S2：将细胞原液迅速转入冻存管中，将冻存管放入程序降温仪中进行程序降温；
S3：程序降温完成后，转入液氮罐中保存；
所述程序降温的步骤包括：
(1)8℃等待10-30min；
(2)降温阶段-1；
(3)升温阶段；
(4)降温阶段-2。
作为本发明一种优选的技术方案，所述降温阶段-1包括低速率降温-1和高速率降温-1。
作为本发明一种优选的技术方案，所述低速率降温-1中的降温速率为0.9-1.5℃/min；所述高速率降温-1中的降温速率为20-24℃/min。
作为本发明一种优选的技术方案，所述高速率降温-1降温至-59--55℃。
作为本发明一种优选的技术方案，所述升温阶段升温至-29.5--28℃。
作为本发明一种优选的技术方案，所述降温阶段-2包括低速率降温-2和高速率降温-2。
作为本发明一种优选的技术方案，所述高速率降温-2降温至-90℃，等待5-10min。
作为本发明一种优选的技术方案，所述冻存液包括以下组分，按体积分数计，人血白蛋白溶液10-20份、DMSO5-10份、右旋糖酐40葡萄糖注射液25-40份、离子缓冲溶剂30-50份。
作为本发明一种优选的技术方案，所述离子缓冲溶剂为勃脉力A注射液和/或林格氏液。
作为本发明一种优选的技术方案，所述细胞：冻存液＝1×107-1.3×107：1ml。
有益效果：
1.本发明经过的程序降温经过低温等待、降温阶段-1、升温阶段、降温阶段-2可以有效的减少此阶段细胞内冰晶释放潜热对细胞的损伤，增加了细胞的存活率；
2.本发明通过选择能够使用该程序降温并保护细胞的冻存液，使得细胞具有良好的增值力；
3.冻存液中的离子缓冲溶剂可提高细胞外的渗透压，减少细胞内的自由水，减少冻存过程中的冰晶形成造成的细胞损伤；
4.在本发明中，人血白蛋白溶液与右旋糖酐40葡萄糖注射液能够为细胞提供良好的营养，使得细胞保持良好的增值能力。
具体实施方式
参选以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。
如本文所用术语“由…制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
连接词“由…组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由…组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
单数形式包括复数讨论对象，除非上下文中另外清楚地指明。“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。
说明书和权利要求书中的近似用语用来修饰数量，表示本发明并不限定于该具体数量，还包括与该数量接近的可接受的而不会导致相关基本功能的改变的修正的部分。相应的，用“大约”、“约”等修饰一个数值，意为本发明不限于该精确数值。在某些例子中，近似用语可能对应于测量数值的仪器的精度。在本申请说明书和权利要求书中，范围限定可以组合和/或互换，如果没有另外说明这些范围包括其间所含有的所有子范围。
此外，本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨指单数形式。
一种高存活率的细胞冻存方法，包括以下步骤：
S1：取细胞悬浮液离心、弃上清得到细胞，将细胞与冻存液混合均匀得到细胞原液；
S2：将细胞原液迅速转入冻存管中，将冻存管放入程序降温仪中进行程序降温；
S3：程序降温完成后，转入液氮罐中保存；
所述程序降温的步骤包括：
(1)8℃等待10-30min；
(2)降温阶段-1；
(3)升温阶段；
(4)降温阶段-2。
在一种优选的实施方式中，所述程序降温的步骤包括：
(1)8℃等待23min；
(2)降温阶段-1；
(3)升温阶段；
(4)降温阶段-2。
在一种实施方式中，所述降温阶段-1包括低速率降温-1和高速率降温-1。
在一种实施方式中，低速率降温-1降至-24--22℃时再进行高速率降温-1；进一步优选的，所述低速率降温-1降至-23℃时再进行高速率降温-1。
在一种实施方式中，所述低速率降温-1中的降温速率为0.9-1.5℃/min；进一步优选的，所述低速率降温-1中的降温速率为1.3℃/min。
在一种实施方式中，所述高速率降温-1中的降温速率为20-24℃/min；进一步优选的，所述高速率降温-1中的降温速率为22.6℃/min。
在本发明中程序降先在8℃等待10-30min，使其细胞原液先在低于室温的条件下进行预冷平衡，然后在降温阶段-1控制了阶段降温的速率，降低了细胞冰晶的形成，但在本发明中，申请人发现，步骤(2)中的降温阶段-1包括低速率降温-1和高速率降温-1，并且低速率降温-1需降至-23℃时再进行高速率降温-1，可能是因为在-23℃后是本发明中细胞冷藏的较为危险的区域，比较容易发生细胞的损伤。
在一种实施方式中，所述高速率降温-1降温至-59--55℃；进一步优选的，所述高速率降温-1降温至-58℃。
在一种实施方式中，所述升温阶段的升温速率为8.6-10.5℃；进一步优选的，所述升温阶段的升温速率为9.6℃。
在一种实施方式中，所述升温阶段升温至-29.5--28℃；进一步优选的，所述升温阶段的升温速率为-28.7℃。
在一种实施方式中，所述降温阶段-2包括低速率降温-2和高速率降温-2。
在一种实施方式中，低速率降温-2降至-60℃时再进行高速率降温-2。
在一种实施方式中，所述低速率降温-2中的降温速率为与高速率降温-1相同。
在一种实施方式中，所述高速率降温-1中的降温速率与升温阶段的升温速率相同。
在一种优选的实施方式中，所述高速率降温-2降温至-90℃，等待5-10min；进一步优选的，所述高速率降温-2降温至-90℃，等待8min。
申请人发现，在本发明体系中的程序降温过程中有一个升温阶段，这样能够更好的提高细胞的存活率，可能是因为在本发明的冻存液的条件下，有一个升温程序能够减少细胞内冰晶对细胞的损伤，使细胞处于比较平衡的状态。并且在本发明中使用低速率降温-1和高速率降温-1、低速率降温-2和高速率降温-2减少了细胞内冰晶释放潜热对细胞的损伤并且使得细胞在危险温度的停留时间较短。
在一种实施方式中，所述冻存液包括以下组分，按体积分数计，人血白蛋白溶液10-20份、DMSO5-10份、右旋糖酐40葡萄糖注射液25-40份、离子缓冲溶剂30-50份。
在一种优选的实施方式中，所述冻存液包括以下组分，按体积分数计，人血白蛋白溶液150份、DMSO8份、右旋糖酐40葡萄糖注射液28份、离子缓冲溶剂40份。
在一种实施方式中，所述冻存液液的组分还包括麦冬皂苷D。
在一种实施方式中，所述麦冬皂苷D的重量为冻存液重量的0.85-1.3％；进一步优选的，所述麦冬皂苷D的重量为冻存液重量的1.18％。
申请人意外发现，在本发明的冻存液中加入麦冬皂苷D可以增加冻存后细胞复苏的存活率，可能是因为在本发明的程序降温的步骤下其可以产生，抑制氧化应激的作用，并且与离子缓冲溶剂协同作用于细胞时减少了对细胞的损伤，增加了细胞的存活率。
在一种实施方式中，所述离子缓冲溶剂为勃脉力A注射液和/或林格氏液；进一步优选的，所述离子缓冲溶剂为勃脉力A注射液和林格氏液。
在一种实施方式中，所述离子缓冲溶剂为勃脉力A注射液和林格氏液的体积比为(5-6.8)：1；进一步优选的，所述离子缓冲溶剂为勃脉力A注射液和林格氏液的体积比为5.6：1。
在一种实施方式中，所述人血白蛋白溶液为的体积浓度为25％。
在本发明中，体积浓度为25％的人血白蛋白溶液能够更好的与右旋糖酐40葡萄糖注射液协同作用使得细胞具有较好的增殖能力。
在一种实施方式中，所述人血白蛋白溶液采购于奥克特珐玛AB公司。
右旋糖酐40葡萄糖注射液是一种无色、稍带粘性的澄明液体，有时显轻微的乳光，为右旋糖酐40与5％葡萄糖的灭菌水溶液，其平均分子量为40000。
在一种实施方式中，所述右旋糖酐40葡萄糖注射液采购于湖北科伦药业有限公司。
勃脉力A注射液是一种复方电解质注射液，每1000ml含氯化钠5.26g、葡萄糖酸钠5.02g、醋酸钠3.68g、氯化钾0.37g、氯化镁0.30g。其可作为水、电解质的补充源和碱化剂，可用于静脉内施用的无菌无热源等渗溶液，能较好地维持细胞内外的渗透压。
在一种实施方式中，所述勃脉力A注射液采购于上海百特医疗用品有限公司。
林格氏液比生理盐水成分完全，可代替生理盐水使用，以调节体液、电解质及酸碱平衡。
在一种实施方式中，所述林格氏液采购于上海远慕生物科技有限公司。
在一种实施方式中，所述麦冬皂苷D采购于成都瑞芬思生物科技有限公司。
在一种实施方式中，所述细胞悬浮液为原代或传代培养后的人脐间充质细胞悬浮液。
本发明中使用的是传代培养得到的P3代人脐间充质干细胞悬浮液。
本发明中使用细胞悬浮液是传代培养得到的P3代人脐间充质干细胞悬浮液。
在一种实施方式中，所述细胞：冻存液＝1×107-1.3×107：1ml；进一步优选的，所述细胞：冻存液＝1.1×107：1ml。
申请人研究发现，使用本发明的中的冻存液程序降温，细胞：冻存液＝1×107-1.3×107：1ml时，冻存液能够更好的起到保护细胞的作用。
下面通过实施例对本发明进行具体描述。有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的专业技术人员根据上述本发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例
实施例1
一种高存活率的细胞冻存方法，包括以下步骤S1：取细胞悬浮液离心、弃上清得到细胞，将细胞与冻存液混合均匀得到细胞原液；S2：将细胞原液迅速转入冻存管中，将冻存管放入程序降温仪中进行程序降温；S3：程序降温完成后，转入液氮罐中保存；所述程序降温的步骤包括：(1)8℃等待10min；(2)降温阶段-1；(3)升温阶段；(4)降温阶段-2；
所述降温阶段-1包括低速率降温-1和高速率降温-1；所述低速率降温-1降至-23℃时再进行高速率降温-1；所述低速率降温-1中的降温速率为1.3℃/min；所述高速率降温-1中的降温速率为22.6℃/min；所述高速率降温-1降温至-58℃；所述升温阶段的升温速率为9.6℃；所述升温阶段的升温速率为-28.7℃；所述降温阶段-2包括低速率降温-2和高速率降温-2；低速率降温-2降至-60℃时再进行高速率降温-2；所述低速率降温-2中的降温速率为与高速率降温-1相同；所述高速率降温-1中的降温速率与升温阶段的升温速率相同；所述高速率降温-2降温至-90℃，等待8min；
所述冻存液包括以下组分，按体积分数计，人血白蛋白溶液10份、DMSO5-10份、右旋糖酐40葡萄糖注射液25份、离子缓冲溶剂30份；所述冻存液液的组分还包括麦冬皂苷D；所述麦冬皂苷D的重量为冻存液重量的0.85％；所述离子缓冲溶剂为勃脉力A注射液和林格氏液；所述离子缓冲溶剂为勃脉力A注射液和林格氏液的体积比为5：1；所述人血白蛋白溶液为的体积浓度为25％；所述细胞悬浮液为原代或传代培养后的人脐间充质细胞悬浮液；所述细胞悬浮液是传代培养得到的P3代人脐间充质干细胞悬浮液；所述细胞：冻存液＝1×107：1ml。
所述人血白蛋白溶液采购于奥克特珐玛AB公司。所述勃脉力A注射液采购于上海百特医疗用品有限公司；所述林格氏液采购于上海远慕生物科技有限公司；所述麦冬皂苷D采购于成都瑞芬思生物科技有限公司。
实施例2
一种高存活率的细胞冻存方法，包括以下步骤S1：取细胞悬浮液离心、弃上清得到细胞，将细胞与冻存液混合均匀得到细胞原液；S2：将细胞原液迅速转入冻存管中，将冻存管放入程序降温仪中进行程序降温；S3：程序降温完成后，转入液氮罐中保存；所述程序降温的步骤包括：(1)8℃等待30min；(2)降温阶段-1；(3)升温阶段；(4)降温阶段-2；
所述降温阶段-1包括低速率降温-1和高速率降温-1；所述低速率降温-1降至-23℃时再进行高速率降温-1；所述低速率降温-1中的降温速率为1.3℃/min；所述高速率降温-1中的降温速率为22.6℃/min；所述高速率降温-1降温至-58℃；所述升温阶段的升温速率为9.6℃；所述升温阶段的升温速率为-28.7℃；所述降温阶段-2包括低速率降温-2和高速率降温-2；低速率降温-2降至-60℃时再进行高速率降温-2；所述低速率降温-2中的降温速率为与高速率降温-1相同；所述高速率降温-1中的降温速率与升温阶段的升温速率相同；所述高速率降温-2降温至-90℃，等待8min；
所述冻存液包括以下组分，按体积分数计，人血白蛋白溶液20份、DMSO5-10份、右旋糖酐40葡萄糖注射液40份、离子缓冲溶剂50份；所述冻存液液的组分还包括麦冬皂苷D；所述麦冬皂苷D的重量为冻存液重量的1.3％；所述离子缓冲溶剂为勃脉力A注射液和林格氏液；所述离子缓冲溶剂为勃脉力A注射液和林格氏液的体积比为6.8：1；所述人血白蛋白溶液为的体积浓度为25％；所述细胞悬浮液为原代或传代培养后的人脐间充质细胞悬浮液；所述细胞悬浮液是传代培养得到的P3代人脐间充质干细胞悬浮液；所述细胞：冻存液＝1.3×107：1ml；
所述人血白蛋白溶液采购于奥克特珐玛AB公司。所述勃脉力A注射液采购于上海百特医疗用品有限公司；所述林格氏液采购于上海远慕生物科技有限公司；所述麦冬皂苷D采购于成都瑞芬思生物科技有限公司。
实施例3
一种高存活率的细胞冻存方法，包括以下步骤S1：取细胞悬浮液离心、弃上清得到细胞，将细胞与冻存液混合均匀得到细胞原液；S2：将细胞原液迅速转入冻存管中，将冻存管放入程序降温仪中进行程序降温；S3：程序降温完成后，转入液氮罐中保存；所述程序降温的步骤包括：(1)8℃等待23min；(2)降温阶段-1；(3)升温阶段；(4)降温阶段-2；
所述降温阶段-1包括低速率降温-1和高速率降温-1；所述低速率降温-1降至-23℃时再进行高速率降温-1；所述低速率降温-1中的降温速率为1.3℃/min；所述高速率降温-1中的降温速率为22.6℃/min；所述高速率降温-1降温至-58℃；所述升温阶段的升温速率为9.6℃；所述升温阶段的升温速率为-28.7℃；所述降温阶段-2包括低速率降温-2和高速率降温-2；低速率降温-2降至-60℃时再进行高速率降温-2；所述低速率降温-2中的降温速率为与高速率降温-1相同；所述高速率降温-1中的降温速率与升温阶段的升温速率相同；所述高速率降温-2降温至-90℃，等待8min；
所述冻存液包括以下组分，按体积分数计，人血白蛋白溶液150份、DMSO8份、右旋糖酐40葡萄糖注射液28份、离子缓冲溶剂40份；所述冻存液液的组分还包括麦冬皂苷D；所述麦冬皂苷D的重量为冻存液重量的1.18％；所述离子缓冲溶剂为勃脉力A注射液和林格氏液；所述离子缓冲溶剂为勃脉力A注射液和林格氏液的体积比为5.6：1；所述人血白蛋白溶液为的体积浓度为25％；所述细胞悬浮液为原代或传代培养后的人脐间充质细胞悬浮液；所述细胞悬浮液是传代培养得到的P3代人脐间充质干细胞悬浮液；所述细胞：冻存液＝1.1×107：1ml。
所述人血白蛋白溶液采购于奥克特珐玛AB公司。所述勃脉力A注射液采购于上海百特医疗用品有限公司；所述林格氏液采购于上海远慕生物科技有限公司；所述麦冬皂苷D采购于成都瑞芬思生物科技有限公司。
实施例4
一种高存活率的细胞冻存方法，其冻存方法同实施例3，不同之处在于，低速率降温-1降至-30℃时再进行高速率降温-1。
实施例5
一种高存活率的细胞冻存方法，包括以下步骤S1：取细胞悬浮液离心、弃上清得到细胞，将细胞与冻存液混合均匀得到细胞原液；S2：将细胞原液迅速转入冻存管中，将冻存管放入程序降温仪中进行程序降温；S3：程序降温完成后，转入液氮罐中保存；所述程序降温的步骤包括：(1)8℃等待23min；(2)降温阶段-1；(3)升温阶段；(4)降温阶段-2；
所述降温阶段-1的降温速率为1.3℃/min；所述降温阶段-1降温至-58℃；所述升温阶段的升温速率为9.6℃；所述升温阶段的升温速率为-28.7℃；所述降温阶段-2包括低速率降温-2和高速率降温-2；低速率降温-2降至-60℃时再进行高速率降温-2；所述低速率降温-2中的降温速率为与高速率降温-1相同；所述高速率降温-1中的降温速率与升温阶段的升温速率相同；所述高速率降温-2降温至-90℃，等待8min；
所述冻存液同实施例3。
实施例6
一种高存活率的细胞冻存方法，包括以下步骤S1：取细胞悬浮液离心、弃上清得到细胞，将细胞与冻存液混合均匀得到细胞原液；S2：将细胞原液迅速转入冻存管中，将冻存管放入程序降温仪中进行程序降温；S3：程序降温完成后，转入液氮罐中保存；所述程序降温的步骤包括：(1)8℃等待23min；(2)降温阶段-1；(3)升温阶段；(4)降温阶段-2；
所述降温阶段-1包括低速率降温-1和高速率降温-1；所述低速率降温-1降至-23℃时再进行高速率降温-1；所述低速率降温-1中的降温速率为1.3℃/min；所述高速率降温-1中的降温速率为10.6℃/min；所述高速率降温-1降温至-58℃；所述升温阶段的升温速率为9.6℃；所述升温阶段的升温速率为-28.7℃；所述降温阶段-2包括低速率降温-2和高速率降温-2；低速率降温-2降至-60℃时再进行高速率降温-2；所述低速率降温-2中的降温速率为与高速率降温-1相同；所述高速率降温-1中的降温速率与升温阶段的升温速率相同；所述高速率降温-2降温至-90℃，等待8min；
所述冻存液同实施例3。
实施例7
一种高存活率的细胞冻存方法，其冻存方法同实施例3，不同之处在于，所述冻存液的组分中无麦冬皂苷D。
实施例8
一种高存活率的细胞冻存方法，其冻存方法同实施例3，不同之处在于，所述麦冬皂苷D的重量为冻存液重量的0.5％。
性能测试
取出实施例1-8中的冻存管(在液氮下冻存了6个月)快速置于37℃水浴，震荡置细胞悬浮完全融化，然后用用5倍培养液稀释，1000r/min离心5min，离心去除上清液，重复3次实验，使用Countstar细胞荧光分析仪，由机器计算得到细胞数、存活率。
测试结果如表1所示：
表1
Figure BDA0003067027090000111
前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。

Claims (10)

1.一种高存活率的细胞冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：取细胞悬浮液离心、弃上清得到细胞，将细胞与冻存液混合均匀得到细胞原液；
S2：将细胞原液迅速转入冻存管中，将冻存管放入程序降温仪中进行程序降温；
S3：程序降温完成后，转入液氮罐中保存；
所述程序降温的步骤包括：
(1)8℃等待10-30min；
(2)降温阶段-1；
(3)升温阶段；
(4)降温阶段-2。
2.根据权利要求1所述的一种高存活率的细胞冻存方法，其特征在于，所述降温阶段-1包括低速率降温-1和高速率降温-1。
3.根据权利要求2所述的一种高存活率的细胞冻存方法，所述低速率降温-1中的降温速率为0.9-1.5℃/min；所述高速率降温-1中的降温速率为20-24℃/min。
4.根据权利要求2或3所述的一种高存活率的细胞冻存方法，其特征在于，所述高速率降温-1降温至-59--55℃。
5.根据权利要求1所述的一种高存活率的细胞冻存方法，其特征在于，所述升温阶段升温至-29.5--28℃。
6.根据权利要求1所述的一种高存活率的细胞冻存方法，其特征在于，所述降温阶段-2包括低速率降温-2和高速率降温-2。
7.根据权利要求6所述的一种高存活率的细胞冻存方法，其特征在于，所述高速率降温-2降温至-90℃，等待5-10min。
8.根据权利要求1所述的一种高存活率的细胞冻存方法，其特征在于，所述冻存液包括以下组分，按体积分数计，人血白蛋白溶液10-20份、DMSO5-10份、右旋糖酐40葡萄糖注射液25-40份、离子缓冲溶剂30-50份。
9.根据权利要求1所述的一种高存活率的细胞冻存方法，其特征在于，所述离子缓冲溶剂为勃脉力A注射液和/或林格氏液。
10.根据权利要求1所述的一种高存活率的细胞冻存方法，其特征在于，所述细胞：冻存液＝1×107-1.3×107：1ml。
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