CN113215087A - 采用阿戈美拉汀改进猪卵母细胞体外成熟发育率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了采用阿戈美拉汀改进猪卵母细胞体外成熟发育率的方法，具体是采用褪黑素受体激动剂阿戈美拉汀改进猪卵母细胞体外成熟发育率的方法，对猪卵丘细胞扩增、卵母细胞体外成熟(In Vitro Maturation，IVM)、卵母细胞发育相关基因表达以及孤雌胚胎发育能力有显著提高。
Description
【技术领域】
本发明涉及卵母细胞体外成熟培养技术领域，涉及采用阿戈美拉汀改进猪卵母细胞体外成熟发育率的方法，具体涉及采用褪黑素受体激动剂阿戈美拉汀改进猪卵母细胞体外成熟发育率的方法。
【背景技术】
我国是猪肉产业大国，猪是重要的农业经济动物，并且猪在解剖学、生理学、遗传背景及疾病特征等方面与人类相似，被认为是人体异种器官来源的首选动物，因此猪在生物医学研究中是重要的模式动物。体外生产技术和基因编辑技术的有效结合不仅促进了胚胎工程的发展及应用，而且带动了医学领域的发展。胚胎体外生产(In Vitro Production，IVP)需要大量高质量的卵母细胞。卵母细胞体外培养成熟是胚胎生物技术的基础和关键环节。目前，胚胎技术已极大地推畜牧业和医学的进程，如品种改良、转基因抗病品种培育、人类疾病模型的制备、动物生物反应器药用蛋白的生产及发育机理的探究等。
猪的体细胞克隆及疾病模型制备等都需要大量具有发育潜能的卵母细胞，但目前的猪卵母细胞体外成熟率不够理想。
目前，猪的卵母细胞培养有以下几种体外培养基础液，如北卡罗来纳州立大学研制的培养液(North Carolina State University(NCSU23/NCSU37)、PZM系列(PZM-3/PZM-4/PZM-5)培养液和TCM-199。其中TCM-199是公认的最成功的培养基础液，基本能满足猪卵母细胞体外发育代谢和营养需要。
相较体内环境而言，卵母细胞与胚胎体外培养过程中，细胞处于相对高氧环境，常常会由于抗氧化防御不足而导致氧化应激，使细胞在发育过程中积累大量的活性氧(ROS)，从而降低卵母细胞及胚胎的体外发育率。
阿戈美拉汀(Agomelatine)是一种MT1和MT2受体激动剂，比褪黑素有更长的半衰期，且亲和性高于褪黑素。目前，尚无在猪卵母细胞体外成熟过程中添加褪黑素受体激动剂阿戈美拉汀的研究。因此，探究阿戈美拉汀是否能显著提高卵母细胞的抗氧化能力、降低凋亡率，从而改善卵母细胞的体外成熟与胚胎的体外发育能力，具有重要的意义。
【发明内容】
针对现有技术的卵母细胞与胚胎体外培养过程中，细胞处于相对高氧环境，常常会由于抗氧化防御不足而导致氧化应激，使细胞在发育过程中积累大量的活性氧(ROS)，从而降低卵母细胞及胚胎的体外发育率的问题，本发明提供了采用阿戈美拉汀改进猪卵母细胞体外成熟发育率的方法，具体是采用褪黑素受体激动剂阿戈美拉汀改进猪卵母细胞体外成熟发育率的方法，对猪卵丘细胞扩增、卵母细胞体外成熟(In Vitro Maturation，IVM)、卵母细胞发育相关基因表达以及孤雌胚胎发育能力有显著提高。
采用阿戈美拉汀改进猪卵母细胞体外成熟发育率的方法，包括如下步骤：
1)准备卵母细胞的成熟培养液：
A培养液：80％体积的TCM199、10％体积的猪卵泡液、10％体积的胎牛血清、0.1g/L半胱氨酸、0.075g/L青霉素、0.05g/L链霉素、10ng/mL胰岛素样生长因子、50ng/mL表皮生长因子、2.2g/L NaHCO3、10IU/mL孕马血清促性腺激素、10IU/mL人绒毛膜促性腺激素，从10-11到10-8mol/L浓度的阿戈美拉汀；
B培养液：80％体积的TCM199、10％体积的猪卵泡液、10％体积的胎牛血清、0.1g/L半胱氨酸、0.075g/L青霉素、0.05g/L链霉素、10ng/mL胰岛素样生长因子、50ng/mL表皮生长因子、2.2g/L NaHCO3、从10-11到10-8mol/L浓度的阿戈美拉汀；
2)准备电激活液：0.3mmol/L甘露醇、0.1mmol/L CaCl2·H2O、0.1mmol/L MgSO4·7H2O、0.5mmol/L Hepes、0.01％(w/v)PVA；
3)准备胚胎胎培养液：采用PZM3胚胎培养液，具体成分为：6.31g/L NaCl、0.74g/LKCl、0.047g/L KH2PO4、2.1g/L NaHCO3、0.022g/L丙酮酸钠、0.62g/L乳酸钙、0.15g/L L-谷氨酰胺、0.55g/L亚牛磺酸、20ml/L必需氨基酸、10ml/L非必需氨基酸、0.065g/L青霉素、0.05g/L链霉素、4g/L BSA；
4)猪卵泡液的制备：从猪卵巢上抽出3-8mm大小的透亮卵泡，获取卵泡液，对该液体进行离心，收集上清液，用0.22μm过滤器进行过滤除杂，获得所需要的猪卵泡液；
5)卵母细胞的培养：猪卵巢采用75％乙醇清洗15s，然后用37℃加有青霉素和链霉素的生理盐水清洗3遍，用装12号针头的10mL注射器轻柔抽取2-6mm透亮卵泡，放入38.5℃恒温架中的试管中；在体视显微镜下挑选含有3层及3层以上颗粒、卵丘细胞包被、折光性良好的卵丘卵母细胞复合体(COCs)，将卵母细胞移入步骤1)的A培养液中，培养20-22h，再换至步骤1)的B培养液中培养20-22h；
6)孤雌(PA)胚胎生产：采用电激活法，用已平衡15min的激活液清洗融合槽3遍，将卵母细胞在激活液中清洗3遍后，移至盖满电激活液的融合槽中间，以1.00kV/cm、80μs的直流脉冲激活3次，电激活后的卵母细胞置于PZM3胚胎培养液中清洗3遍，移入胚胎培养液微滴中继续培养；上述继续培养条件为5％CO2、饱和湿度、39℃，将培养到144h的囊胚，置于Hoechst33342中染色15min，之后滴1-2滴甘油压片、封片，使其均匀铺散在载玻片上，再于荧光照射下进行细胞计数。
本发明中：
步骤1)所述的从10-11到10-8mol/L浓度的阿戈美拉汀，是浓度分别为10-11、10-10、10-9、10-8mol/L的阿戈美拉汀。
进一步的，步骤1)所述的阿戈美拉汀的浓度是10-10mol/L。
步骤4)所述的离心，转速3500r/min，时间15min。
步骤6)所述的Hoechst33342，用量是10μg/mL。
和现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明所述的采用阿戈美拉汀改进猪卵母细胞体外成熟发育率的方法，在卵母细胞的成熟培养液中加入褪黑素受体激动剂阿戈美拉汀能够通过促进胞质成熟，提高囊胚发育能力及囊胚质量。在促进卵母细胞体外成熟中，更低浓度的褪黑素受体激动剂阿戈美拉汀(10-10mol/L)，比最佳浓度的褪黑素(10-8mol/L)效果更优。
2、本发明所述的采用阿戈美拉汀改进猪卵母细胞体外成熟发育率的方法，添加阿戈美拉汀使卵丘细胞更好地扩散；卵母细胞内细胞成熟相关基因BMP15、GDF9以及抗氧化相关基因CAT的表达水平提升，促凋亡基因Caspase6、P53表达水平降低，从而提高了猪卵母细胞质量和PA胚胎体外发育能力。
【附图说明】
图1是本发明实施例2中最佳浓度10-10mol/L阿戈美拉汀处理组、对比例1空白对照组以及对比例2褪黑素处理组对卵母细胞发育相关基因BMP15的表达影响的图(从左到右分别是10-10mol/L阿戈美拉汀处理组、空白对照组及褪黑素组BMP15基因的相对表达量)。
图2是本发明实施例2中最佳浓度10-10mol/L阿戈美拉汀处理组、对比例1空白对照组以及对比例2褪黑素处理组对卵母细胞发育相关基因GDF9的表达影响的图(从左到右分别是10-10mol/L阿戈美拉汀处理组、空白对照组及褪黑素组GDF9基因的相对表达量)。
图3是本发明实施例2中最佳浓度10-10mol/L阿戈美拉汀处理组、对比例1空白对照组以及对比例2褪黑素处理组对卵母细胞发育相关基因Caspase6的表达影响的图(从左到右分别是10-10mol/L阿戈美拉汀处理组、空白对照组及褪黑素组Caspase6基因的相对表达量)。
图4是本发明实施例2中最佳浓度10-10mol/L阿戈美拉汀处理组、对比例1空白对照组以及对比例2褪黑素处理组对卵母细胞发育相关基因P53的表达影响的图(从左到右分别是10-10mol/L阿戈美拉汀处理组、空白对照组及褪黑素组P53基因的相对表达量)。
图5是本发明实施例2中最佳浓度10-10mol/L阿戈美拉汀处理组、对比例1空白对照组以及对比例2褪黑素处理组对卵母细胞发育相关基因CAT的表达影响的图(从左到右分别是10-10mol/L阿戈美拉汀处理组、空白对照组及褪黑素组CAT基因的相对表达量)。
【具体实施方式】
以下结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步说明。
实施例1：
采用阿戈美拉汀改进猪卵母细胞体外成熟发育率的方法，包括如下步骤：
1)准备卵母细胞的成熟培养液：
A培养液：80％体积的TCM199、10％体积的猪卵泡液、10％体积的胎牛血清、0.1g/L半胱氨酸、0.075g/L青霉素、0.05g/L链霉素、10ng/mL胰岛素样生长因子、50ng/mL表皮生长因子、2.2g/L NaHCO3、10IU/mL孕马血清促性腺激素、10IU/mL人绒毛膜促性腺激素、10- 11mol/L浓度的阿戈美拉汀；
B培养液：80％体积的TCM199、10％体积的猪卵泡液、10％体积的胎牛血清、0.1g/L半胱氨酸、0.075g/L青霉素、0.05g/L链霉素、10ng/mL胰岛素样生长因子、50ng/mL表皮生长因子、2.2g/L NaHCO3、10-11mol/L浓度的阿戈美拉汀；
2)准备电激活液：0.3mmol/L甘露醇、0.1mmol/L CaCl2.H2O、0.1mmol/L MgSO4·7H2O、0.5mmol/L Hepes、0.01％(w/v)PVA；
3)准备胚胎胎培养液：采用PZM3胚胎培养液，具体成分为：6.31g/L NaCl、0.74g/LKCl、0.047g/L KH2PO4、2.1g/L NaHCO3、0.022g/L丙酮酸钠、0.62g/L乳酸钙、0.15g/L L-谷氨酰胺、0.55g/L亚牛磺酸、20ml/L必需氨基酸、10ml/L非必需氨基酸、0.065g/L青霉素、0.05g/L链霉素、4g/L BSA；
4)猪卵泡液的制备：从猪卵巢上抽出3-8mm大小的透亮卵泡，获取卵泡液，对该液体进行离心，转速3500r/min，时间15min，收集上清液，用0.22μm过滤器进行过滤除杂，获得所需要的猪卵泡液；
5)卵母细胞的培养：猪卵巢采用75％乙醇清洗15s，然后用37℃加有青霉素和链霉素的生理盐水清洗3遍，用装12号针头的10mL注射器轻柔抽取2-6mm透亮卵泡，放入38.5℃恒温架中的试管中；在体视显微镜下挑选含有3层及3层以上颗粒、卵丘细胞包被、折光性良好的卵丘卵母细胞复合体(COCs)，将卵母细胞移入实施例1中的步骤1)的A培养液中，培养20-22h，再换至实施例1中的步骤1)的B培养液中培养20-22h；
6)孤雌(PA)胚胎生产：采用电激活法，用已平衡15min的激活液清洗融合槽3遍，将卵母细胞在激活液中清洗3遍后，移至盖满电激活液的电融合槽中间，以1.00kV/cm、80μs的直流脉冲激活3次，电激活后的卵母细胞置于PZM3胚胎培养液中清洗3遍，移入胚胎培养液微滴中继续培养；上述继续培养条件为5％CO2、饱和湿度、39℃，将培养到168h的囊胚，置于10μg/mL Hoechst33342中染色15min，之后滴1-2滴甘油压片、封片，使其均匀铺散在载玻片上，再于荧光照射下进行细胞计数。
实施例2：
采用阿戈美拉汀改进猪卵母细胞体外成熟发育率的方法，和实施例1相比，步骤1)中阿戈美拉汀的用量是1×10-10mol/L，其他同实施例1。
实施例3：
采用阿戈美拉汀改进猪卵母细胞体外成熟发育率的方法，和实施例1相比，步骤1)中阿戈美拉汀的用量是1×10-9mol/L，其他同实施例1。
实施例4：
采用阿戈美拉汀改进猪卵母细胞体外成熟发育率的方法，和实施例1相比，步骤1)中阿戈美拉汀的用量是1×10-8mol/L，其他同实施例1。
对比例1：
和实施例1相比，步骤1)中阿戈美拉汀的用量是0mol/L，其他同实施例1。
对比例2：
和实施例1相比，步骤1)中，用褪黑素代替阿戈美拉汀，褪黑素的用量是10-8mol/L，其中的：
A培养液：80％体积的TCM199、10％体积的猪卵泡液、10％体积的胎牛血清、0.1g/L半胱氨酸、0.075g/L青霉素、0.05g/L链霉素、10ng/mL胰岛素样生长因子、50ng/mL表皮生长因子、2.2g/L NaHCO3、10IU/mL孕马血清促性腺激素、10IU/mL人绒毛膜促性腺激素，10- 8mol/L褪黑素；
B培养液：80％体积的TCM199、10％体积的猪卵泡液、10％体积的胎牛血清、0.1g/L半胱氨酸、0.075g/L青霉素、0.05g/L链霉素、10ng/mL胰岛素样生长因子、50ng/mL表皮生长因子、2.2g/L NaHCO3、10-8mol/L褪黑素；
其他同实施例1。
实验例：
1、卵母细胞的卵丘扩展程度实验：
卵母细胞的卵丘扩展程度的标准为：
0级表明卵母细胞的卵丘细胞没有扩散；
1+级表明卵母细胞的卵丘细胞只有最外层扩散，颗粒细胞外层能看到闪闪发光；
2+级表明卵母细胞的卵丘细胞的外层出现扩散；
3+级表明卵母细胞的卵丘细胞除放射冠外全部扩散；4+级表明卵母细胞的卵丘细胞全部扩散。
结果：
观察处理组(实施例1-4)、对照组(对比例1)及褪黑素处理组(对比例2)的卵丘扩展情况，记录数据，计算卵丘扩展指数(卵丘扩展指数用以下算法计算：CEI＝(0级细胞数×0+1级细胞数×1+2级细胞数×2+3级细胞数×3+4级细胞数×4)÷总细胞数)，结果如表1：
表1不同浓度阿戈美拉汀处理组、空白对照组以及褪黑素处理组对猪卵丘细胞扩散指数的影响
注：同列数据肩标不同字母代表同列数据差异显著(P<0.05)，无字母或含相同字母表示差异不显著(P>0.05)。
由表1可知添加10-10mol/L阿戈美拉汀处理卵母细胞，其卵丘细胞的扩散指数显著高于其他浓度处理组、对照组及褪黑素处理组。
2、比较不同浓度阿戈美拉汀处理组、对照组及褪黑素处理组的卵母细胞凋亡率、第一极体排出率，结果如表2：
表2不同浓度阿戈美拉汀处理组、空白对照组以及褪黑素处理组对卵母细胞凋亡率、第一极体排出率的影响
注：同列数据肩标不同字母代表同列数据差异显著(P<0.05)，无字母或含相同字母表示差异不显著(P>0.05)。
由表2可知添加10-10mol/L阿戈美拉汀处理卵母细胞，其凋亡率显著低于其他浓度处理组、对照组及褪黑素处理组；对于第一极体排出率而言10-10mol/L阿戈美拉汀处理组显著高于其他浓度处理组、对照组及褪黑素处理组。
3、通过qRT-PCR技术检测最佳浓度处理组、对照组及褪黑素处理组的猪卵母细胞相关基因mRNA水平的表达。主要检测了卵母细胞成熟相关基因BMP15、GDF9；促凋亡基因Caspase6、P53；抗氧化相关基因CAT(详见表3、4及图1)。
表3实时荧光定量PCR引物序列
表4最佳浓度(10-10mol/L)阿戈美拉汀处理组、空白对照组以及褪黑素处理组对猪卵母细胞发育相关基因的表达影响
注：同列数据肩标不同字母代表同列数据差异显著(P<0.05)，无字母或含相同字母表示差异不显著(P>0.05)
图1-5是最佳浓度阿戈美拉汀处理组、空白对照组以及褪黑素处理组对卵母细胞发育相关基因的表达影响，同列数据肩标不同字母表示数据差异显著P<0.05。
由图1-2可知最佳浓度阿戈美拉汀处理组的卵母细胞成熟相关基因BMP15、GDF9的表达水平显著高于对照组及褪黑素处理组，褪黑素处理组显著高于对照组，说明最佳浓度阿戈美拉汀处理能促进卵母细胞的体外发育成熟；由图3-4可知促凋亡基因Caspase6、P53的表达水平显著低于对照组及褪黑素处理组，对照组显著高于褪黑素处理组，说明最佳浓度阿戈美拉汀处理能降低卵母细胞的体外发育的凋亡率；由图5可知抗氧化相关基因CAT的表达水平显著高于对照组及褪黑素处理组，说明最佳浓度阿戈美拉汀处理能提高卵母细胞的体外发育的抗氧化能力。
表5不同浓度阿戈美拉汀处理对PA胚胎发育能力的影响
由表5可知10-11mol/L阿戈美拉汀、10-10mol/L阿戈美拉汀以及10-8mol/L褪黑素处理组的PA胚胎的卵裂率较高，显著高于其他浓度处理组和对照组卵裂率；就囊胚率和囊胚细胞数而言，10-10mol/L阿戈美拉汀处理组的最高，显著高于其他浓度处理组、对照组以及褪黑素处理组的囊胚率和囊胚总细胞数。
分析和讨论：
阿戈美拉汀是一种褪黑素受体激动剂，对MT1和MT2受体有较强亲和力和内在活性，能通过受体兴奋发挥最大的效应。前期研究表明，褪黑素在小鼠、绵羊、牛等哺乳动物的卵母细胞成熟及胚胎发育方面均有促进作用。在猪卵母细胞体外成熟过程中添加到褪黑素，虽然未提高卵母细胞成熟率但GSH水平得到提升，同时增加了猪囊胚率及囊胚细胞数。本发明中，用阿戈美拉汀代替褪黑素，能够通过促进胞质成熟，提高囊胚发育能力及囊胚质量获得更好的效果。
另外，前期研究也发现，在猪卵母细胞体外成熟过程中添加10-8mol/L褪黑素，可提高囊胚发育能力，而在本研究中低浓度的褪黑素受体激动剂10-10mol/L阿戈美拉汀与高浓度的10-8mol/L褪黑素处理结果极为相似，这很可能与阿戈美拉汀的亲和性比褪黑素更高有关。
细胞成熟相关基因BMP15、GDF9及抗氧化相关基因CAT表达水平的提升，可能在卵母细胞成熟培养液中改善了卵母细胞的培养环境，提高了卵母细胞胞质的成熟；促凋亡基因Caspase6、P53表达水平降低，减少了卵母细胞的凋亡。
结论：
在猪卵母细胞体外成熟过程中，添加10-10mol/L阿戈美拉汀使卵丘细胞更好地扩散；卵母细胞内细胞成熟相关基因BMP15、GDF9以及抗氧化相关基因CAT的表达水平提升，促凋亡基因Caspase6、P53表达水平降低，从而提高了猪卵母细胞质量和PA胚胎体外发育能力。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
Claims (5)
1.采用阿戈美拉汀改进猪卵母细胞体外成熟发育率的方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)准备卵母细胞的成熟培养液：
A培养液：80％体积的TCM199、10％体积的猪卵泡液、10％体积的胎牛血清、0.1g/L半胱氨酸、0.075g/L青霉素、0.05g/L链霉素、10ng/mL胰岛素样生长因子、50ng/mL表皮生长因子、2.2g/L NaHCO3、10IU/mL孕马血清促性腺激素、10IU/mL人绒毛膜促性腺激素，从10-11到10-8mol/L浓度的阿戈美拉汀；
B培养液：80％体积的TCM199、10％体积的猪卵泡液、10％体积的胎牛血清、0.1g/L半胱氨酸、0.075g/L青霉素、0.05g/L链霉素、10ng/mL胰岛素样生长因子、50ng/mL表皮生长因子、2.2g/L NaHCO3、从10-11到10-8mol/L浓度的阿戈美拉汀；
2)准备电激活液：0.3mmol/L甘露醇、0.1mmol/L CaCl2·H2O、0.1mmol/L MgSO4·7H2O、0.5mmol/L Hepes、0.01％w/v PVA；
3)准备胚胎胎培养液：采用PZM3胚胎培养液，具体成分为：6.31g/L NaCl、0.74g/LKCl、0.047g/L KH2PO4、2.1g/L NaHCO3、0.022g/L丙酮酸钠、0.62g/L乳酸钙、0.15g/L L-谷氨酰胺、0.55g/L亚牛磺酸、20ml/L必需氨基酸、10ml/L非必需氨基酸、0.065g/L青霉素、0.05g/L链霉素、4g/L BSA；
4)猪卵泡液的制备：从猪卵巢上抽出3-8mm大小的透亮卵泡，获取卵泡液，对该液体进行离心，收集上清液，用0.22μm过滤器进行过滤除杂，获得所需要的猪卵泡液；
5)卵母细胞的培养：猪卵巢采用75％乙醇清洗15s，然后用37℃加有青霉素和链霉素的生理盐水清洗3遍，用装12号针头的10mL注射器轻柔抽取2-6mm透亮卵泡，放入38.5℃恒温架中的试管中；在体视显微镜下挑选含有3层及3层以上颗粒、卵丘细胞包被、折光性良好的卵丘卵母细胞复合体，将卵母细胞移入步骤1)的A培养液中，培养20-22h，再换至步骤1)的B培养液中培养20-22h；
6)孤雌胚胎生产：采用电激活法，用已平衡15min的激活液清洗融合槽3遍，将卵母细胞在激活液中清洗3遍后，移至盖满电激活液的融合槽中间，以1.00kV/cm、80μs的直流脉冲激活3次，电激活后的卵母细胞置于PZM3胚胎培养液中清洗3遍，移入胚胎培养液微滴中继续培养；上述继续培养条件为5％CO2、饱和湿度、39℃，将培养到144h的囊胚，置于Hoechst33342中染色15min，之后滴1-2滴甘油压片、封片，使其均匀铺散在载玻片上，再于荧光照射下进行细胞计数。
2.根据权利要求1所述的采用阿戈美拉汀改进猪卵母细胞体外成熟发育率的方法，其特征在于：步骤1)所述的从10-11到10-8mol/L浓度的阿戈美拉汀，是浓度分别为10-11、10-10、10-9、10-8mol/L的阿戈美拉汀。
3.根据权利要求2所述的采用阿戈美拉汀改进猪卵母细胞体外成熟发育率的方法，其特征在于：步骤1)所述的阿戈美拉汀的浓度是10-10mol/L。
4.根据权利要求1所述的采用阿戈美拉汀改进猪卵母细胞体外成熟发育率的方法，其特征在于：步骤4)所述的离心，转速3500r/min，时间15min。
5.根据权利要求1所述的采用阿戈美拉汀改进猪卵母细胞体外成熟发育率的方法，其特征在于：步骤6)所述的Hoechst33342，用量是10μg/mL。
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