CN112877280A - 一种大周龄雌鼠卵细胞体外受精营养液及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种大周龄雌鼠卵细胞体外受精营养液及其应用，属于小鼠体外受精技术领域。本发明的大周龄雌鼠卵细胞体外受精营养液，由小周龄雌鼠卵细胞体外受精液和褪黑素组成。本发明在用于小周龄雌鼠卵细胞体外受精液中添加一定剂量的褪黑素，能够延缓大周龄雌鼠卵子在体外的衰老进程，延长保持受精能力的时间，从而提高受精能力，提高微生物学净化和品系重建成功率。

Description

一种大周龄雌鼠卵细胞体外受精营养液及其应用
技术领域
本发明属于小鼠体外受精技术领域，尤其涉及一种大周龄雌鼠卵细胞体外受精营养液及其应用。
背景技术
随着基因修饰技术的应用，世界各地实验室中产生成千上万基因修饰小鼠模型，使用基因修饰小鼠模型在世界各地实验室中进行交流已成为一种常态，因而基因修饰小鼠模型的微生物学净化、精子冻存复苏进行品系异地重建也成为常态。体外受精则成为支持这些常态化小鼠模型净化和品系重建的重要技术。
体外受精是模拟体内环境，在体外条件下让精子和卵子结合受精发育，但跟体内环境毕竟有差别，研究表明，卵细胞从母体释放后，在体外如果不能及时受精，则会老化，失去受精能力。本领域技术人员知晓，3-4周龄小鼠对促排卵处理的反应能力和卵细胞的受精能力最强，常常作为开展体外受精技术的卵细胞来源，但在小鼠模型交流的过程中，所提供模型雌小鼠数量有限，从计划交流共享到启动运输到达目的地动物房，雌鼠周龄已经偏大，已经失去了最佳采卵时间。随着周龄的增加，小鼠卵巢功能和卵母细胞的质量随着周龄的增长而降低，超排效果和卵细胞的受精能力降低。但科学研究过程中，不可能提供整齐划一的3-4周龄供卵雌鼠用于微生物学净化和精子复苏操作，如何提高体外条件下大周龄雌鼠所提供卵细胞的受精发育能力成为小鼠辅助生殖技术急需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种大周龄雌鼠卵细胞体外受精营养液，能够延缓大周龄雌鼠卵子在体外的衰老进程，延长保持受精能力的时间，提高受精能力，提高微生物学净化和品系重建成功率。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种大周龄雌鼠卵细胞体外受精营养液，包括小周龄雌鼠卵细胞体外受精液和褪黑素。
优选的，所述小周龄雌鼠卵细胞体外受精液包含如下组分：NaCl 5.5-6.2g/L，KCl0.3-0.4g/L，KH2PO4 0.045-0.05g/L，MgSO4·7H2O 0.045-0.05g/L，乳酸钠2.35-2.43g/L，丙酮酸钠0.03-0.04g/L，葡萄糖0.4-0.6g/L，NaHCO3 2.0-2.2g/L，CaCl2·2H2O 0.25-0.35g/L，BSA 3.0-5.0g/L。
优选的，所述小周龄雌鼠卵细胞体外受精液的溶剂为超纯水。
优选的，所述褪黑素的添加量为1×10-10-1×10-8mol/L。
优选的，所述褪黑素的添加量为4×10-9-8×10-9mol/L。
优选的，所述大周龄雌鼠的周龄≥10周。
本发明还提供了一种上述大周龄雌鼠卵细胞体外受精营养液在小鼠品系重建中的应用。
优选的，包括如下步骤：将小鼠精子和卵细胞添加到所述体外受精营养液中，完成受精过程。
优选的，所述体外受精营养液为预热的体外受精营养液。
优选的，所述预热的温度为36-38℃。
本发明的有益效果：
本发明通过在小周龄雌鼠卵细胞体外受精液中添加一定剂量的褪黑素，能够有效延缓大周龄雌鼠卵子在体外的衰老进程，延长了保持受精能力的时间，从而提高了受精能力，提高了微生物学净化和品系重建的成功率。
附图说明
图1为不同月龄雌鼠供卵体外受精率对比结果；
图2为不同月龄、不同处理浓度体外受精率变化，其中系列1、2、3、4、5、6对应的褪黑素浓度分别为1×10-7Mol、1×10-8Mol、1×10-9Mol、1×10-10Mol、1×10-11Mol、1×10- 12Mol；
图3为不同月龄、不同处理浓度体外受精率变化。
具体实施方式
本发明提供了一种大周龄雌鼠卵细胞体外受精营养液，包括小周龄雌鼠卵细胞体外受精液和褪黑素。
本发明对于小周龄雌鼠卵细胞体外受精液和褪黑素的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品均可。在本发明中，所述小周龄雌鼠卵细胞体外受精液优选的包含如下组分：NaCl 5.5-6.2g/L，KCl 0.3-0.4g/L，KH2PO4 0.045-0.05g/L，MgSO4·7H2O 0.045-0.05g/L，乳酸钠2.35-2.43g/L，丙酮酸钠0.03-0.04g/L，葡萄糖0.4-0.6g/L，NaHCO3 2.0-2.2g/L，CaCl2·2H2O 0.25-0.35g/L，BSA 3.0-5.0g/L，更优选的包含如下组分：NaCl 5.7-6.0g/L，KCl 0.32-0.38g/L，KH2PO40.047-0.048g/L，MgSO4·7H2O 0.047-0.048g/L，乳酸钠2.38-2.40g/L，丙酮酸钠0.034-0.036g/L，葡萄糖0.45-0.55g/L，NaHCO3 2.1-2.18g/L，CaCl2·2H2O 0.28-0.32g/L，BSA 3.5-4.5g/L。在本发明中，所述小周龄雌鼠卵细胞体外受精液的溶剂优选为超纯水。本发明对于超纯水的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品均可。在本发明中，所述褪黑素的添加量优选为1×10-10-1×10-8mol/L，更优选为4×10-9-8×10-9mol/L。在本发明中，所述大周龄雌鼠的周龄优选为10周及以上。
本发明还提供了一种上述大周龄雌鼠卵细胞体外受精营养液在小鼠品系重建中的应用。
本发明对于大周龄雌鼠的品种及来源没有特殊限定。在本发明所述应用中，优选的，包括如下步骤：将小鼠精子和卵细胞添加到所述体外受精营养液中，完成受精过程。
在本发明中，小鼠精子、卵细胞的获取和精子的获能均可在所述大周龄雌鼠卵细胞体外受精营养液中进行，其中所述体外受精营养液优选为预热的体外受精营养液，所述预热的温度优选为36-38℃，更优选为37℃。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种大周龄雌鼠卵细胞体外受精营养液，由以下组分组成：NaCl 5.5g，KCl 0.3g，KH2PO4 0.045g，MgSO4·7H2O 0.045g，乳酸钠2.35g，丙酮酸钠0.03g，葡萄糖0.4g，NaHCO32.0g，CaCl2·2H2O 0.25g，BSA3.0g，褪黑素1×10-10mol，超纯水补足至1L。
实施例2
一种大周龄雌鼠卵细胞体外受精营养液，由以下组分组成：NaCl 6.2g，KCl 0.4g，KH2PO4 0.05g，MgSO4·7H2O 0.05g，乳酸钠2.43g，丙酮酸钠0.04g，葡萄糖0.6g，NaHCO32.2g，CaCl2·2H2O 0.35g，BSA 5.0g，褪黑素1×10-8mol，超纯水补足至1L。
实施例3
一种大周龄雌鼠卵细胞体外受精营养液，由以下组分组成：NaCl 5.7g，KCl0.32g，KH2PO4 0.047g，MgSO4·7H2O 0.047g，乳酸钠2.38g，丙酮酸钠0.034g，葡萄糖0.45g，NaHCO3 2.1g，CaCl2·2H2O 0.28g，BSA 3.5g，褪黑素6×10-9mol，超纯水补足至1L。
实施例4
一种大周龄雌鼠卵细胞体外受精营养液，由以下组分组成：NaCl 6.0g，KCl0.38g，KH2PO4 0.048g，MgSO4·7H2O 0.048g，乳酸钠2.40g，丙酮酸钠0.036g，葡萄糖0.55g，NaHCO3 2.18g，CaCl2·2H2O 0.32g，BSA4.5g，褪黑素8×10-9mol，超纯水补足至1L。
实施例5
精子获取：取12-14周龄的近交系小鼠C57BL/6小鼠，颈椎脱臼处死，无菌取出附睾尾，在附睾尾上用眼科剪剪碎，分别浸入1ml平衡至37℃的雌鼠卵细胞体外受精营养液中，让精子充分游出。
精子获能：6min后，将附睾组织块剔除，加油覆盖，放入37℃二氧化碳培养箱中进入获能阶段，获能1h。
卵子的获得：分别选择0.75月龄(3周龄)，2.5月龄(10周龄)，4.5月龄，7月龄，8月龄，9月龄，10月龄，11月龄，12月龄共9个年龄段的供卵的SPF级雌鼠，实验前3天注射PMSG(孕妈血清激素)40IU，48h后注射HCG(人绒毛膜促性腺激素)30IU，15h后，颈椎脱臼处死，打开腹腔，分离输卵管，体视显微镜下找到膨大部，释放卵团，将卵团分别挑入100ul预热的37℃雌鼠卵细胞体外受精营养液中，并洗涤3次，用矿物油覆盖。置于37℃，二氧化碳5％的培养箱中。
受精过程：取获能的精子液10ul置于卵团液中，置于37℃，二氧化碳5％的培养箱中继续培养，完成受精过程。
受精卵的挑选：6h后，将受精液滴置于显微镜下挑选，选得分散下沉的卵子，移入矿物油覆盖的100ul预热至37℃的KSOM培养液(早期胚胎发育培养液)中，继续培养20h后，挑选发育至2-4细胞期胚胎进行移植，并计算受精发育率。
受精发育率＝(所选分散下沉卵数量/发育到2-4细胞胚胎数量)×100％。
上述实验过程中的雌鼠卵细胞体外受精液为NaCl 5.5g，KCl 0.3g，KH2PO40.045g，MgSO4·7H2O 0.045g，乳酸钠2.35g，丙酮酸钠0.03g，葡萄糖0.4g，NaHCO3 2.0g，CaCl2·2H2O 0.25g，BSA 3.0g，超纯水补足至1L。
结果如图1所示。体外受精是模拟体内环境，在体外条件让精子和卵子结合受精发育，但跟体内环境毕竟有差别，研究表明，卵细胞从母体释放后，在体外如果不能及时受精，则会老化，失去受精能力。由图1可见，10周龄以下的雌鼠来源的卵体外受精率能够达到60％以上，这是由于幼龄鼠对超排卵处理的反应明显，能够排出足够数量的卵，基因修饰后的小鼠很容易用辅助生殖的方式进行扩大繁殖，用于实验研究。但随着供卵雌鼠年龄的增加，小鼠卵巢功能和卵母细胞的质量随着周龄的增长而降低，超排效果和卵细胞的受精能力降低，进而体外受精率逐步下降，4.5-8月龄雌鼠来源的卵的受精率下降到50-55％，9月龄-12月龄雌鼠来源的卵的受精率下降到50％以下，这是由于老龄鼠本来超排效果低，使用自然交配的方法，很难让这些基因得到修饰的小鼠繁殖下来。
实施例6
在实施例5所述雌鼠卵细胞体外受精液中分别添加10-7Mol、10-8Mol、10-9Mol、10- 10Mol、10-11Mol、10-12Mol的褪黑素，对每个年龄段的供卵雌鼠分别设置一个对照组，即不添加褪黑素，其余步骤均同实施例5。实验设计如表1所示。
表1实验设计
Figure BDA0002921475800000061
各组实验结果如表2和图2所示。
表2各组别体外受精率情况
鼠龄/月 对照组 1组 2组 3组 4组 5组 6组
0.75 80 78 78 80 79 78 78
2.5 62 73 73 77.8 75.7 66 66
4.5 52.5 58.7 65 75.7 69.5 59.4 60
7 55.6 57 65 73.7 69.5 57 57
8 55.6 55 64.3 72.5 70 63.4 62.7
9 47 57.6 61.4 72.5 69.3 62.8 50.5
10 51 50.4 60.7 70 55.1 53.4 50.8
11 43 51.9 58.9 71.2 61.3 52.3 50.3
12 45 52.1 59.2 71.3 60.5 54.7 50.1
由表2可以看出，在雌鼠卵细胞体外受精液中添加褪黑激素能够促进精卵结合，提高受精率，但对于0.75月龄(3周龄)雌鼠卵的受精能力的促进作用是有限的，对于10周龄及其以上的雌鼠卵细胞的受精能力的促进作用明显。由图2可以看出，对于不同月龄的雌鼠而言，褪黑素的添加浓度为10-9Mol/L时，效果最佳。
实施例7
在实施例5所述雌鼠(不包含0.75月龄组别)卵细胞体外受精液中分别添加1×10- 9Mol、2×10-9Mol、4×10-9Mol、6×10-9Mol、8×10-9Mol、10×10-9Mol的褪黑素，其余步骤均同实施例5。实验设计如表3所示。
表3实验设计
Figure BDA0002921475800000081
结果如图3所示。由图3可以看出，对于不同月龄的雌鼠而言，褪黑素的添加浓度为6×10-9-8×10-9Mol/L时，效果最佳。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种大周龄雌鼠卵细胞体外受精营养液，其特征在于，包括小周龄雌鼠卵细胞体外受精液和褪黑素。
2.根据权利要求1所述大周龄雌鼠卵细胞体外受精营养液，其特征在于，所述小周龄雌鼠卵细胞体外受精液包含如下组分：NaCl 5.5-6.2g/L，KCl 0.3-0.4g/L，KH2PO4 0.045-0.05g/L，MgSO4·7H2O 0.045-0.05g/L，乳酸钠2.35-2.43g/L，丙酮酸钠0.03-0.04g/L，葡萄糖0.4-0.6g/L，NaHCO32.0-2.2g/L，CaCl2·2H2O 0.25-0.35g/L，BSA 3.0-5.0g/L。
3.根据权利要求2所述大周龄雌鼠卵细胞体外受精营养液，其特征在于，所述小周龄雌鼠卵细胞体外受精液的溶剂为超纯水。
4.根据权利要求1所述大周龄雌鼠卵细胞体外受精营养液，其特征在于，所述褪黑素的添加量为1×10-10-1×10-8mol/L。
5.根据权利要求4所述大周龄雌鼠卵细胞体外受精营养液，其特征在于，所述褪黑素的添加量为4×10-9-8×10-9mol/L。
6.根据权利要求1所述大周龄雌鼠卵细胞体外受精营养液，其特征在于，所述大周龄雌鼠的周龄≥10周。
7.权利要求1-6任意一项所述大周龄雌鼠卵细胞体外受精营养液在小鼠品系重建中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：将小鼠精子和卵细胞添加到所述体外受精营养液中，完成受精过程。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述体外受精营养液为预热的体外受精营养液。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述预热的温度为36-38℃。
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